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TRAVAIL DE DIPLÔME Optimalisation de procédures analytiques en vue d’analyses en cytométrie de flux. Ecole Supérieure de la Santé, TAB 53ème
2013-
2014
Cindy Celeste & Réhane Delisle. Sous la supervision de M. Stéphane Quarroz CHUV | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois / Laboratoire Central
d’Hématologie – Laboratoire des moelles
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
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Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
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SOMMAIRE
La cytométrie de flux est une méthode de pointe permettant l’immunophénotypisation (mise en évidence des
antigènes cellulaires grâce à des anticorps fluoromarqués) de cellules, la plupart du temps d’origine
sanguine ou médullaire (leucocytes). La cytométrie de flux est une technique utilisée dans de nombreux
domaines du laboratoire dont celui de l’hématologie où elle permet le diagnostic et le suivi de certaines
hémopathies malignes. Cette méthode nécessite une préparation de l’échantillon qui consiste en une étape de
lyse des érythrocytes et une étape de marquage des leucocytes. L’étape de lyse peut précéder ou suivre l’étape
de marquage. Actuellement, au laboratoire central d’hématologie (LCH), le protocole consiste à d’abord lyser
les cellules avec du NH4Cl (réactif de lyse fabriqué par le LCH), puis à les marquer. Parallèlement, le LCH
effectue des cytocentrifugations de ces suspensions cellulaires afin d’observer la morphologie des cellules
typisées.
Le premier but de notre travail de diplôme a été de comparer les résultats obtenus avec différents protocoles de
préparation cellulaire. Plus précisément, nous avons testé 3 réactifs de lyse commerciaux ainsi que le réactif de
lyse actuellement utilisé au LCH. Nous avons testé 2 méthodes, l’une d’elles commence par la lyse et se
termine par le marquage. A l’inverse, l’autre débute par le marquage et finit par l’étape de lyse. Nous en
sommes venues à la conclusion qu’il n’y avait aucun avantage à changer le protocole actuellement en place.
Le deuxième but de notre travail de diplôme a été de comparer 2 méthodes de préparation cellulaire, afin de
définir laquelle permet de mettre en évidence le plus de plasmocytes dans le cas du myélome multiple. Là, il
s’avère que la nouvelle méthode testée est plus efficace que le protocole actuellement en place.
ABSTRACT
Flow cytometry is a sophisticated method allowing the immunophenotypisation mostly of blood or
medullary cells (leukocytes). This immunophenotypisation is possible thanks to the use of fluorochrome-
labeled antibodies managed against cellular antigens. Flow cytometry is a method used in numerous
domains of the laboratory, especially in hematology where it allows the diagnosis and the follow-up of some
hematopoietic tumors. This method requires a preparation of the sample, which consists of a step of lysis of
the erythrocytes and a step of staining of the leukocytes. The step of lysis can precede or follow the step of
staining. Today, the protocol of the Central Hematology Laboratory (LCH) consists in a lysis of the cells with
NH4Cl (lysing solution made by the LCH), and then a staining of the cells. At the same time, the LCH makes
cytocentrifugations of these cellular suspension to observe the morphology of typised cells.
The first goal of our work was to compare the results obtained with various protocols of cellular preparation.
More precisely, we tested 3 commercial lysing solutions and the lysing solutions actually used in the LCH. We
tested 2 methods, one beginning with the lysing step and finishing by the staining. The other one we began
with the staining and finished with the stage of lysis. We came to the conclusion that there isn’t any advantage
in changing the protocol actually used.
The second goal of our work was to compare 2 methods of cells preparation, to determine which one would
allow to show most of plasma cells in the case of the plasma cell myeloma. It turns out that the new method
tested allows to show more plasma cells that the protocol at present used.
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TABLE DES MATIÈRES
1. INTRODUCTION 5
1.1. PRÉSENTATION DU LABORATOIRE 5 1.2. INTÉRÊT DE CE SUJET 5
1.2.1. Méthodes de préparation cellulaires utilisées au LCH 6 1.3. CYTOMÉTRIE DE FLUX 7
1.3.1. Historique 7 1.3.2. Applications en hématologie 7 1.3.3. Introduction sur les hémopathies malignes 8
1.3.3.1. Les leucémies aiguës (LA) 9 1.3.3.2. Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) 9 1.3.3.3. Les syndromes myélodysplasiques (SMD) 10 1.3.3.4. Les néoplasies à cellules B/T matures et à cellules NK 10 1.3.3.5. Le myélome multiple 10 1.3.3.6. Les lymphomes 12
2. BUTS 13
3. DÉVELOPPEMENT : MATÉRIEL, PRINCIPES ET MÉTHODES 14
3.1. MATÉRIEL 14 3.2. PRINCIPE DE L’APPAREIL DE CYTOMÉTRIE DE FLUX 17
3.2.1. Préparation de l’échantillon 17 3.2.1.1. La lyse des érythrocytes ou la méthode Ficoll 17 3.2.1.2. Le marquage 18
3.2.2. Focalisation hydrodynamique 21 3.2.3. Le système optique (banc optique) 23
3.2.3.1. La cellule de lecture 24 3.2.3.2. Les filtres et les miroirs 25 3.2.3.3. La détection du signal 26 3.2.3.4. Les réglages de l’appareil 27 3.2.3.5. L’interprétation des histogrammes 28
3.3. PRINCIPE D’ACTION DES RÉACTIFS DE LYSE TESTÉS 32 3.4. MÉTHODES 32
3.4.1. Protocole n°1 : préparation du matériel 33 3.4.2. Protocole n°2 : Lysis Staining Washing (LSW) 34 3.4.3. Protocole n°3 : Staining Lysis Washing (SLW) 35 3.4.4. Protocole n°4 : cytospin 36 3.4.5. Protocole n°5 : coloration “Romanowsky” pour cytospin 36
4. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 37
4.1. RÉSULTATS DE LA COMPARAISON DES MFI DES DIFFÉRENTES MÉTHODES 37 4.2. DISCUSSION DES RÉSULTATS DE LA COMPARAISON DES MFI DES DIFFÉRENTES MÉTHODES 45 4.3. RÉSULTATS DE L’ANALYSE MORPHOLOGIQUE 47 4.4. DISCUSSION DES RÉSULTATS DE L’ANALYSE MORPHOLOGIQUE 48 4.5. RÉSULTATS STATISTIQUES 48 4.6. DISCUSSION DES RÉSULTATS STATISTIQUES 49 4.7. RÉSULTATS DE L’ANALYSE DE L’ASPECT FINANCIER 49 4.8. DISCUSSION DES RÉSULTATS DE L’ANALYSE DE L’ASPECT FINANCIER 50 4.9. RÉSULTATS DU MYÉLOME MULTIPLE 50
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4.10. DISCUSSION DES RÉSULTATS DU MYÉLOME MULTIPLE 51
5. CONCLUSIONS 51
5.1. CONCLUSIONS DE NOTRE TRAVAIL 51 5.2. SUITES POSSIBLES À NOTRE TRAVAIL 52 5.3. CONCLUSIONS PERSONNELLES 53
6. REMERCIEMENTS 54
7. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 55
8. ICONOGRAPHIE 57
9. LEXIQUE 60
10. ANNEXES 62
ANNEXE 1 : TRAÇABILITÉ 62 ANNEXE 2 : SOLUTIONS DE TRAVAIL 64 ANNEXE 3 : FACSLYSE 65 ANNEXE 4 : VERSALYSE 71 ANNEXE 5 : IOTEST 74 ANNEXE 6 : COLORATION ROMANOWSKY 76 ANNEXE 7 : GIEMSA 79 ANNEXE 8 : LA FABRICATION DES ANTICORPS 80 ANNEXE 9 : FLUOROCHROMES 81 ANNEXE 10 : PRÉPARATION POUR LA CMF 82 ANNEXE 11 : COMPTAGE 86 ANNEXE 12 : LISTE DES ÉCHANTILLONS TRAITÉS 87 ANNEXE 13 : DÉTAIL DES PANELS UTILISÉS 92 ANNEXE 14 : RÉSULTATS BRUTS 93 ANNEXE 15 : EXEMPLES KALUZA 99 ANNEXE 16 : DONNÉES DES GRAPHIQUES DE COMPARAISON DES MFI 109 ANNEXE 17 : DONNÉES UTILISÉES POUR LES CORRÉLATIONS 121
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1. INTRODUCTION
1.1. PRÉSENTATION DU LABORATOIRE
Notre stage s’est déroulé dans le laboratoire central d’hématologie (LCH) du CHUV. Outre la réalisation
d’analyses médicales, le LCH s’implique également dans les domaines de la formation, de l’enseignement
ainsi que dans la recherche.
Le LCH est divisé en 4 unités distinctes :
hématologie générale
hémostase (de routine et spécialisée)
hématologie spéciale
o moelle (cytologie et marqueurs)
o biologie moléculaire.
Les secteurs d’hématologie générale et d’hémostase assurent une prise en charge des échantillons en tout
temps, alors que les laboratoires d’hématologie spéciale ne fonctionnent que les jours ouvrables.
Les anémies, les cytopénies, les troubles de l’hémostase ainsi que les hémopathies malignes sont les 4
grands groupes de pathologies rencontrés au LCH. Les prélèvements proviennent principalement de la
cité hospitalière, mais peuvent aussi venir de demandeurs externes. Le LCH reçoit principalement deux
types de prélèvements : du sang et de la moelle osseuse.
Nous avons effectué notre travail de diplôme dans le laboratoire des moelles. Le personnel de ce
laboratoire assiste les médecins lors des ponctions et biopsies de moelle, prépare et colore les lames,
effectue une observation morphologique minutieuse des grumeaux et analyse les prélèvements à l’aide de
la cytométrie de flux (CMF). Plusieurs autres analyses moins fréquentes peuvent être effectuées dans ce
laboratoire (Pink test, test de falciformation). (cf. « 9. Lexique » page : 61). [1] et [2].
1.2. INTÉRÊT DE CE SUJET
Notre travail de diplôme (TD), proposé par Monsieur Stéphane Quarroz, s’inscrit dans le cadre d’une
remise en question permanente des techniques utilisées au laboratoire. Le but final d’une telle démarche
est l’optimalisation des techniques et ainsi l’obtention de meilleurs résultats.
Notre TD porte sur l’optimalisation de la préparation cellulaire précédant l’analyse sur l’appareil de CMF.
La CMF permet de détecter des antigènes présents à la surface cellulaire grâce à des anticorps
monoclonaux fluoromarqués (certaines méthodes permettent aussi la détection d’antigènes
cytoplasmiques ou nucléaires).
Dans la technique de la CMF, une suspension cellulaire (préalablement marquée avec des anticorps
fluoromarqués) passe dans un appareil de CMF (les cellules se présentant les unes derrière les autres).
Elles sont ensuite analysées par le biais d’un laser (cf. « 9. Lexique » page : 61) et d’un banc optique.
Plusieurs informations concernant la cellule sont alors obtenues : sa taille, sa complexité et, suivant le
marquage effectué, la présence ou l’absence de certains antigènes. Comme cette méthode nous fournit des
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informations phénotypiques (cf. « 9. Lexique » page : 61) sur chaque cellule, elle nous permet d’avoir une
vision globale de l’échantillon. Les antigènes mis en évidence permettent le plus souvent de rattacher les
cellules à une lignée cellulaire et parfois de définir leur stade de maturation. Cette technique permet donc
de préciser le diagnostic, d’effectuer le suivi de la maladie résiduelle et contribue à définir le pronostic.
[3] et [4] (pages : 1 à 2).
La CMF nécessite une étape de préparation des échantillons. Cette dernière a pour but, d’une part,
l’élimination des érythrocytes qui peuvent perturber l’analyse et, d’autre part, l’isolement des leucocytes
car ces derniers représentent la population d’intérêt. Pour cela, deux procédés existent : le Ficoll et la lyse
des érythrocytes (cf. « 3.2.1.1. La lyse des érythrocytes ou la méthode Ficoll » page : 17). Il existe
plusieurs réactifs de lyse sur le marché, avec chacun leurs avantages et leurs inconvénients. Une autre
étape de la préparation cellulaire est le marquage des cellules. C’est principalement sur cette préparation
de l’échantillon que nous avons travaillé. Plus précisément, nous avons comparé les différentes Mean
Fluorescence Intensity (MFI) (cf. « 3.2.3.5. Interprétation des histogrammes – Mean Fluorescence
Intensity (MFI) » page : 31) obtenues lors de l’analyse sur l’appareil de CMF après différentes techniques
de préparation.
Parallèlement à la préparation de l’échantillon, une cytospin (cf. « 9. Lexique » page : 60) est effectuée.
L’analyse microscopique de cet étalement cellulaire permet d’avoir une vue d’ensemble des cellules de
l’échantillon. Le choix des anticorps utilisés et la population leucocytaire à cibler pour l’analyse en CMF
peuvent, dans certains cas, être guidés par cette étude morphologique.
Un autre sujet qui nous a beaucoup intéressé dans le cadre de ce travail porte sur les myélomes multiples
(MM). En effet, le MM constitue un cas particulier. Au vu des images morphologiques régulièrement
obtenues par le laboratoire, ce dernier avait crainte que les plasmocytes soient détruits au cours de la
préparation cellulaire. Nous avons donc essayé d’éclaircir le sujet.
1.2.1. Méthodes de préparation cellulaires utilisées au LCH
Pendant longtemps, le LCH a utilisé la méthode Ficoll quel que soit le cas analysé. Il y a 5 ans environ,
pour les cas de maladies résiduelles et de myélome, un protocole différent a été introduit. Ce dernier
utilise la méthode de la lyse des érythrocytes. Dans un but de standardisation du traitement des analyses,
depuis 2013, la méthode de la lyse des érythrocytes a été adoptée pour tous les cas.
Actuellement, bien que les techniques employées semblent donner des résultats cohérents, plusieurs
questions, auxquelles nous avons essayé de répondre dans notre TD, se posent : y a-t-il un avantage à
faire le marquage avant la lyse ? Est-il préférable d’utiliser un autre agent de lyse ? Plusieurs articles
semblent favorables à ces idées. [5].
Cependant, la plupart des articles ne font pas mention d’une étude morphologique basée sur l’observation
de la cytospin. Selon le LCH, cette dernière semble peu intéresser les autres laboratoires pratiquant la
CMF.
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1.3. CYTOMÉTRIE DE FLUX
1.3.1. Historique
En 1934, la technique de la CMF est pour la première fois évoquée dans un article scientifique. Dans ce
papier, Moldavan décrit la méthode de comptage des cellules. Plus tard, en 1950, l’isothiocyanate de
fluorescéine (FITC) est lié à un anticorps. La découverte de ce couplage est loin d’être banale puisque le
FITC est un fluorochrome encore largement utilisé de nos jours. En 1970, on assiste à la naissance des
premiers appareils de CMF munis d’une source laser. Ces derniers permettent, en plus de la taille de la
cellule, de mesurer de la fluorescence verte et de la fluorescence rouge. Deux années plus tard, grâce au
travail d’Herzenberg, un nouvel appareil encore plus performant fait son apparition. Ce dernier, en plus
d’être muni d’un laser argon, est capable de trier les cellules. C’est en 1974 que le premier appareil de ce
type, produit par la firme Becton-Dickinson, fait son entrée sur le marché. En 1976, Shapiro imagine des
appareils de CMF pourvus de multiples sources lasers. Cette ingénieuse idée permettra, plus tard,
l’analyse simultanée de nombreuses fluorescences. En 1978, Schlossman débute la production d’anticorps
monoclonaux spécifiques d’antigènes de cellules lymphoïdes sanguines. En 1981, on pense à joindre un
système informatique à l’appareil de CMF. Cette étape est « révolutionnaire » puisqu’elle permet ainsi un
traitement des données. De nos jours, de multiples appareils de CMF sont commercialisés. Ces derniers
sont extrêmement performants. [4] (pages : 4 à 5).
1.3.2. Applications en hématologie
Aujourd’hui, en hématologie, la CMF est une technique de laboratoire largement utilisée, notamment
dans le cadre d’une immunophénotypisation des hémopathies malignes. Cette immunophénotypisation est
importante puisque, complétée par des données cliniques, morphologiques, cytogénétiques et
moléculaires, elle permet de définir précisément une hémopathie maligne (lignée, stade de maturation,
etc.). Ceci permet une prise en charge du patient plus aisée et plus adaptée. Le traitement et le suivi de
l’évolution de la maladie n’en seront que meilleurs.
On utilise aussi la CMF pour évaluer la maladie résiduelle. Celle-ci se définit par la persistance, dans la
moelle osseuse, de cellules hématopoïétiques malignes, ceci après un traitement à but éradicateur. En
CMF, on s’applique à rechercher/détecter un immunophénotype aberrant, spécifique à une pathologie
et/ou un immunophénotype précis, caractéristique au patient. La CMF permet d’estimer l’importance de
la persistance du clone. [6] (pages : 184 à 185).
Bien évidemment, il existe encore d’autres applications en hématologie, comme par exemple la
numération des cellules CD34 positives (cf. « 9. Lexique » page : 60) dans les cas de greffes de cellules
souches hématopoïétiques autologues ou encore pour le diagnostic de l’hémoglobinurie paroxystique
nocturne (HPN) (cf. « 9. Lexique » (page : 61) par exemple. [4].
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1.3.3. Introduction sur les hémopathies malignes
Les hémopathies malignes sont des maladies graves atteignant les cellules du système sanguin. Il en
existe une multitude. Chaque stade de maturation, à l’intérieur de chaque lignée, est susceptible d’être à
l’origine d’une telle maladie. Voici un tableau synthétique de l’hématopoïèse humaine.
Figure n°1 : hématopoïèse humaine
Les hémopathies malignes peuvent être classées dans différents groupes, selon de nombreux critères. A la
page suivante se trouve un tableau récapitulatif et non exhaustif de ces pathologies.
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Figure n°2 : classification OMS 2008 des hémopathies malignes (traduction personnelle)
1.3.3.1. Les leucémies aiguës (LA) On parle de leucémie lorsqu’on retrouve des cellules pathologiques simultanément dans la moelle osseuse
et dans le sang périphérique. La leucémie aigüe est définie par une population blastique présente à plus de
20% dans la moelle osseuse. [7] (diapositive : 4). Les cellules que l’on trouve dans le sang sont souvent
des cellules d’aspect jeune, présentant des altérations morphologiques.
Suivant la lignée cellulaire atteinte, on distingue deux grands groupes : les leucémies aigües lymphoïdes
et les leucémies aigües myéloïdes. [8] (page : 372).
1.3.3.2. Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) Ce groupe d’hémopathie maligne englobe plusieurs maladies, dont 4 principales : la leucémie myéloïde
chronique, la myélofibrose primaire, la thrombocytémie essentielle et la Polycythemia vera.
Ces anomalies hématologiques sont caractérisées par la prolifération démesurée d’une ou de plusieurs
lignées cellulaires à l’intérieur de la moelle osseuse. Naturellement, cette prolifération excessive peut
aboutir, dans le sang périphérique, soit à une polyglobulie, soit à une thrombocytose et/ou à une
augmentation significative des granulocytes. Les NMP sont des maladies présentant un risque d’évolution
vers une LA. [8] (page : 382).
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1.3.3.3. Les syndromes myélodysplasiques (SMD) Ce type de maladie est caractérisé par une hématopoïèse inefficace qui aboutit, dans le sang périphérique,
à des cytopénies. On observe des signes de dysplasie comme des anomalies de maturation. Les cellules
retrouvées dans le cadre d’un SMD ont une durée de vie inférieure aux cellules en bonne santé. Il existe
un risque important de transformation en leucémie aiguë. [8] (page : 387).
1.3.3.4. Les néoplasies à cellules B/T matures et à cellules NK Les néoplasies à cellules B/T matures et à cellules NK sont des hémopathies malignes touchant la lignée
lymphocytaire (B ou T) ou plasmocytaire (B). Ce type de maladie subit en général une évolution lente, de
type chronique. Les néoplasies de type plasmocytaire sont caractérisées par la sécrétion
d’immunoglobulines monoclonales, comme par exemple le myélome multiple, connu depuis la révision
de la classification OMS en 2008 sous le terme de myélome plasmocytaire, mais encore principalement
appelé myélome multiple. [8] (page : 391). Étant donné que cette pathologie fait l’objet d’un point
particulier de notre travail, nous en proposons un descriptif plus développé.
1.3.3.5. Le myélome multiple
Généralités Le myélome multiple (MM) est une hémopathie maligne ayant pour origine un clone issu d’un
lymphocyte B devenu malin. Ce clone, ayant évolué vers le plasmocyte, prolifère de manière anormale et
incontrôlée, produisant de conséquentes quantités d’immunoglobulines (Ig) ou de fragments d’Ig. En leur
présence, on parle de gammapathie monoclonale. Lorsqu’on les retrouve dans les urines, on parle de
protéinurie de Bence Jones. [9] (page : 200) et [8] (page : 394).
Étiologie Le MM atteint généralement des personnes âgées de 60 à 70 ans et préférentiellement des hommes. [10]
(page : 295). Il semblerait que les personnes ayant été exposées aux radiations ou à certaines substances
toxiques présentent un risque plus élevé de développer un MM. [9] (page : 202).
Signes cliniques
asthénie, anorexie et amaigrissement
douleurs osseuses et fractures spontanées ou dues à un effort ou à un traumatisme insignifiant
insuffisance rénale chronique et protéinurie
complications neurologiques, cardiaques et hémorragiques (rarement)
complications infectieuses
manifestations respiratoires (rarement) [8] (page : 395) et [10] (page : 296).
Ces signes cliniques sont résumés par l’acronyme CRAB (hypercalcemia – renal insufficiency – anaemia
– bone lesions). [9] (page : 201).
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Sang et moelle osseuse Voici les caractéristiques du sang et de la moelle osseuse d’un patient atteint d’un myélome multiple.
San
g
anémie (50% des cas), généralement normocytaire normochrome non régénérative
érythrocytes en rouleaux
leucocytes habituellement normaux (neutropénie et leucocytose possibles – éosinophilie
et lymphocytose relative rare)
rarement plasmocytes circulants (forme leucémique ou stade terminal)
thrombocytes habituellement normaux ou faiblement abaissés
vitesse de sédimentation fortement augmentée
Mo
elle
oss
euse
infiltration plasmocytaire, de degré variable
hypoplasie myéloïde
[8] (page : 395) et [10] (page : 297).
Analyses de laboratoire
électrophorèse des protéines (cf. « 9. Lexique » page : 60) : cette dernière montre un pic étroit
caractéristique de la fraction gamma. Ce pic correspond à l’Ig monoclonale. Les autres
immunoglobulines sont diminuées.
immunofixation (cf. « 9. Lexique » page : 61) : Cette dernière permet de caractériser l’Ig
monoclonale.
dosage quantitatif des immunoglobulines
recherche d’une cryoglubuline (cf. « 9. Lexique » page : 60)
dosage de la protéinurie dans les urines de 24 heures
cytogénétique (il existe des anomalies de nombre et de structure dans 50% des cas, cependant
aucune n’est spécifique).
cytométrie de flux. [8] (pages : 395 à 396) et [10] (page : 297). Plusieurs marqueurs sont étudiés
dans le cadre d’un MM. Au LCH, on étudie les marqueurs suivants : CD45, CD38, CD138, CD56
et CD19. Le CD38 est positif pour une grande majorité de cellules, cependant, les plasmocytes
ont la particularité de l’exprimer très fortement. Ils expriment également le CD138 (ce sont les
seules cellules qui co-expriment les CD38 et CD138). Ces informations sont nécessaires pour la
compréhension des futurs résultats. [11].
Figure n°3 : pic monoclonal à l’électrophorèse des protéines et IgG monoclonale de type kappa à l’immunofixation.
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Traitement et évolution Le MM est toujours d’évolution fatale. Le traitement est essentiellement symptomatique. Une
chimiothérapie est également administrée. Chez les patients de moins de 55 ans, une greffe allogénique
(cf. « 9. Lexique » page : 60) est envisageable. [8] (page : 396).
1.3.3.6. Les lymphomes Les lymphomes représentent un groupe d’hémopathies malignes particulier qui se définit par une atteinte
localisée principalement au niveau des organes lymphoïdes. On observe généralement une hypertrophie
ganglionnaire assez évocatrice.
Bien souvent, on ne retrouve pas de cellules malignes au niveau sanguin. Il existe deux grands groupes de
lymphomes : les lymphomes hodgkiniens et les lymphomes non hodgkiniens. [8] (page : 399).
Figure n°4 : hypertrophie ganglionnaire
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2. BUTS
Ce travail vise à une éventuelle amélioration du protocole de CMF utilisé au LCH. C’est sur l’étape de
préparation des échantillons, comprenant une étape de lyse des érythrocytes et une étape de marquage,
que nous avons particulièrement travaillé.
Pour ce faire, 8 protocoles différents de préparation des échantillons ont été comparés. Ces méthodes sont
précisément décrites au point « 3.4. Méthodes » (page : 32). Les 8 protocoles ont été effectués sur 13
échantillons provenant de la routine du laboratoire des moelles. Le marquage a été effectué avec
différents anticorps et fluorochromes.
Le but a ensuite été d’évaluer ces différentes méthodes en comparant les MFI obtenues pour chaque
anticorps, l’idéal étant d’obtenir des MFI les plus élevées possibles. Un autre objectif consistait à évaluer
la morphologie obtenue sur les cytospins après l’utilisation des différents réactifs de lyses. Un objectif
moins scientifique, mais tout de même important pour un laboratoire, visait à évaluer si l’une ou l’autre
des méthodes présentait un net intérêt financier.
Pour le cas des MM, la question était différente, puisque nous ne nous intéressions pas à la MFI mais au
pourcentage de plasmocytes détectés par l’appareil de CMF. La question était donc de savoir si une
méthode permettrait de récupérer significativement plus de plasmocytes.
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3. DÉVELOPPEMENT : MATÉRIEL, PRINCIPES ET MÉTHODES
3.1. MATÉRIEL
En « Annexe 1 : traçabilité » (page : 62), vous trouverez les numéros de lot ainsi que les dates de
péremption de tout le matériel utilisé.
Automates
appareil de cytométrie de flux
Nom de l’appareil : Navios
Fabricant : Beckman Coulter
Réf. : A80706
Laser : Argon à 488 nm
He/Ne (Hélium/Néon) à 633 nm
Diode à 405 nm
Liquide de gaine : Beckman Coulter
Iso Flow™ Sheath Fluid
Réf. : 8546859
pipeteur automatique
Nom de l’appareil : Biomek NXP
Fabriquant : Beckman Coulter
Réf. : A31839
(Cet appareil permet le pipetage automatique du mélange
d’anticorps nécessaire lors de chaque analyse.)
Anticorps et fluorochromes
Anticorps Fluoro-
chrome
Excitation
(nm)
Émission
(nm) Laser Filtres Fabricant Réf.
Ctrl IgG1 FITC 495 520 Argon 525 Beckman Coulter A07795
Ctrl IgG1 PE 480 575 Argon 575 Beckman Coulter A07796
Ctrl IgG1 ECD 480 767 Argon 770 Beckman Coulter A07797
Ctrl IgG1 PC5.5 480 694 Argon 700 Beckman Coulter A62833
Ctrl IgG1 PC7 480 767 Argon 770 Beckman Coulter 6607099
Ctrl IgG1 APC 650 660 He/Ne 675 Beckman Coulter IM245
Ctrl IgG1 A700 696 719 He/Ne 720 Beckman Coulter A79391
Ctrl IgG1 A750 650 780 He/Ne 780 Beckman Coulter A79393
Ctrl IgG1 PB 405 455 Diode 450 Beckman Coulter A74764
α-CD2 APC 650 660 He/Ne 675 Beckman Coulter A60794
α-CD3 A750 650 780 He/Ne 780 Beckman Coulter A66329
α-CD4 PE 480 575 Argon 575 Becton-Dickinson 345769
α-CD5 PC5.5 480 694 Argon 700 Beckman Coulter A70203
α-CD7 PB 405 455 Diode 450 Beckman Coulter PNB06499
α-CD8 PB 405 455 Diode 450 Beckman Coulter A82791
α-CD10 ECD 480 620 Argon 620 Beckman Coulter IM3608
α-CD11c PC7 480 767 Argon 770 Beckman Coulter A80249
α-CD13 FITC 495 520 Argon 525 Beckman Coulter IM0778U
α-CD19 A700 696 719 He/Ne 720 Beckman Coulter A78837
α-CD19 PC5.5 480 694 Argon 700 Beckman Coulter A66328
α-CD20 PB 405 455 Diode 450 Beckman Coulter A74777
Figure n°5 : cytomètre de flux
Figure n°6 : pipeteur automatique
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
15
α-CD22 PC5.5 480 694 Argon 700 Beckman Coulter A80712
α-CD23 APC 650 660 He/Ne 675 Beckman Coulter A69964
α-CD33 PE 480 575 Argon 575 Becton-Dickinson 345799
α-CD34 A700 696 719 He/Ne 720 Beckman Coulter A86354
α-CD34 A750 650 780 He/Ne 780 Beckman Coulter A89309
α-CD38 FITC 495 520 Argon 525 Beckman Coulter A07778
α-CD43 FITC 495 520 Argon 525 Beckman Coulter IM3264U
α-CD45 KO 398 528 Diode 550 Beckman Coulter A96416
α-CD56 PC5.5 480 694 Argon 700 Beckman Coulter A79388
α-CD57 FITC 495 520 Argon 525 Beckman Coulter IM0466U
α-CD79b PE 480 575 Argon 575 Beckman Coulter IM1612
α-CD117 APC 650 660 He/Ne 675 Beckman Coulter IM3638
α-CD123 PC7 480 767 Argon 770 Biolegend 306010
α-CD138 PE 480 575 Argon 575 Beckman Coulter IM2759
α-HLADR ECD 480 620 Argon 620 Beckman Coulter IM3636
α-HLADR PC7 480 767 Argon 770 Becton-Dickinson 335830
α-KAPPA FITC 495 520 Argon 525 DakoCytomation F0434
α-
LAMBDA PE 480 575 Argon 575 DakoCytomation R0437
α-sIgM PE 480 575 Argon 575 Beckman Coulter R5111
[12] Les noms complets des fluorochromes se trouvent au point « 9. Lexique » pages : 60 à 61).
Réactifs de lyse
NH4Cl Solution de travail
Fabriquant : LCH (cf. « Annexe 2 : solutions de travail » page : 64).
BD FACS™ Lysing Solution (10x)
Fabriquant : Becton, Dickinson and Company, BD Biosciences
Réf. : 349202 (cf. « Annexe 3 : FacsLyse » page : 65).
VersaLyse Lysing Solution (1x)
Fabriquant : Beckman Coulter
Réf. : A09777 (cf. « Annexe 4 : VersaLyse »
page : 71).
IOTest 3 Lysing Solution (10x)
Fabriquant : Beckman Coulter
Réf. : A07799 (cf. « Annexe 5 : IOTest » page :
74).
Solutions de travail
PBS – Albumine - Azide
Fabriquant : LCH (cf. « Annexe 2 : solutions de travail » page : 64).
RPMI – AZIDE - BSA (RAB)
Fabriquant : LCH (cf. « Annexe 2 : solutions de travail » page : 64).
Figure n°7 : Solutions de lyses testées
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
16
RPMI Medium 1640 (1x) 500ml
Fabriquant : gibco® by life technologies™
Réf. : 31870-025
Acqua ad injectabilia « Bichsel »
Fabriquant : Bichsel
Réf. : 100 0 006
Leucostase
Fabriquant : Sobioda
Réf. : 3101-002E
Colorants
MGG Tampon Weise pH6.8
Fabriquant : LCH (cf. « Annexe 6 : coloration Romanowsky »
page : 76).
Giemsa Stain, Modified Solution Fluka Analytical
Fabriquant : Sigma-Aldrich
Réf. : 48900 (cf. « Annexe 7 : Giemsa » page : 79).
Méthanol
Fabriquant : Merck
Réf. : 1.06009.2500
Petit matériel de laboratoire
tubes de différentes tailles
pipettes pasteur, automatiques et graduées
embouts à pipettes
pipet-boy
gants
vortex
centrifugeuse
portoirs
poubelles diverses
chambres de comptage
microscope
chronomètres
lames à bords rodés
colle de montage
lamelles
cytocentrifugeuse
Figure n°8 : solutions de travail
Figure n°9 : colorants
Figure n°10 : petit matériel de laboratoire
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
17
Échantillons biologiques
sang sur héparinate de lithium
moelle osseuse sur héparinate de lithium ou EDTA
Sang : Le sang doit être recueilli sur héparinate de lithium. Un délai de 24 heures est fixé pour effectuer
le prélèvement. Les échantillons se conservent à température ambiante.
Moelle : La moelle peut être prélevée sur EDTA ou sur héparinate de Lithium. Le prélèvement de la
moelle osseuse se fait dans la crête iliaque postéro-supérieure. Une ponction (aspiration) et généralement
une biopsie sont effectuées. Pour la CMF, on travaille avec du matériel provenant de la ponction. Tout
comme le sang, l’analyse doit être effectuée dans les 24 heures qui suivent le prélèvement et les
échantillons se conservent à température ambiante. [13] et [14].
Programme informatique (Kaluza) Kaluza est un programme informatique utilisé pour traiter les données générées par les analyses faites sur
l’appareil de CMF. Il permet de modifier certains paramètres post-analyse ainsi que de connaître, entre
autre, les pourcentages et la fluorescence moyenne de populations cellulaires ciblées. Ce programme est
produit par la firme Beckman Coulter.
3.2. PRINCIPE DE L’APPAREIL DE CYTOMÉTRIE DE FLUX
3.2.1. Préparation de l’échantillon
Comme nous l’avons déjà brièvement dit dans le chapitre « 1.2. Intérêt de ce sujet » (page : 5), une
préparation de l’échantillon est nécessaire avant son passage dans l’appareil de CMF. La préparation d’un
échantillon comprend 2 étapes principales, la lyse des érythrocytes ou la méthode Ficoll et le marquage.
L’étape de marquage peut précéder ou suivre l’étape de lyse. Au LCH, la lyse est effectuée avant le
marquage.
3.2.1.1. La lyse des érythrocytes ou la méthode Ficoll La méthode Ficoll permet, par gradient de densité, de récupérer uniquement les cellules mononuclées
(lymphocytes, monocytes, blastes, etc.).
La méthode de la lyse des érythrocytes permet, elle, de récupérer tous les leucocytes. Par ce fait, elle offre
une meilleure représentation quantitative de la population leucocytaire. Plusieurs agents de lyse sont
Figure n°11 : échantillons
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
18
disponibles. Les 4 que nous avons testés seront décrits précisément au chapitre « 3.3. Principe d’action
des réactifs de lyse testés» (page : 32). [3] (diapositives : 5 à 9).
3.2.1.2. Le marquage Le marquage fait intervenir 3 notions
principales : les antigènes, les anticorps, et les
fluorochromes. La réaction de base du marquage
est une réaction immunologique entre un
antigène et son anticorps spécifique lié à un
fluorochrome. Il existe une méthode de
marquage direct et une méthode indirecte. (Nous
avons utilisé uniquement la méthode directe,
c’est pourquoi nous avons développé seulement
celle-ci).
Les antigènes Antigen (en anglais) = ANTIbody GENerate
Comme son nom l’indique, l’antigène est une molécule qui est reconnue spécifiquement par le système
immunitaire (capacité immunogène) et qui a la capacité d’induire une production d’anticorps (capacité
antigénique). Cet anticorps est alors spécifique à l’antigène et peut interagir avec ce dernier. [15] (pages :
13 à 14).
Les cellules sont recouvertes d’antigènes. Ceux-ci peuvent se trouver à leur surface, être
transmembranaires, intracytoplasmiques ou encore intranucléaires. Ces antigènes confèrent leur identité
aux cellules. [15] (pages : 13 à 14).
Certains antigènes sont présents sur tous les leucocytes, d’autres peuvent être spécifiques d’une lignée
cellulaire, d’autres encore d’un stade de maturation. Plusieurs de ces antigènes ont été répertoriés et
numérotés en utilisant la dénomination « CD » qui signifie Cluster of Differenciation. (Ex : CD4, CD8,
CD19). Il en existe plus de 350. C’est majoritairement ce type d’antigènes que nous marquons en CMF
[15] (pages : 13 à 14).
Le pouvoir antigénique est la capacité d’un antigène à induire une production d’anticorps. Il varie selon la
nature chimique de l’antigène : protéique, glucidique, acides nucléiques ou lipidiques. [15]
(pages : 13 à 14).
L’épitope est le site antigénique de l’antigène, ce dernier en possède
plusieurs. C’est sur ce site que viendra se lier de façon spécifique
l’anticorps. La valence de l’antigène est déterminée selon son
nombre d’épitopes. [15] (pages : 13 à 14).
Figure n°12 : marquage direct
Figure n°13 : épitope
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)
19
Les anticorps Les anticorps sont des protéines synthétisées par les cellules dérivées du lymphocyte suite à une
stimulation antigénique : les plasmocytes. [15] (pages : 14 à 16).
Plus précisément, les anticorps sont des glycoprotéines formées par 4 chaînes : 2 chaînes légères
identiques et 2 chaînes lourdes identiques. Ce sont des ponts disulfures qui relient les chaînes entre-elles.
Il y a 2 sortes de chaînes légères : kappa (κ) et lambda (λ). Deux tiers des lymphocytes produisent des
anticorps dont les chaînes légères sont de type kappa.
Pour les chaînes lourdes, il en existe 5 types, qui déterminent les classes d’anticorps :
les IgG γ (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)
les IgM µ (pentamère)
les IgA α (monomérique dans le sang, dimère sous forme sécrétoire) (IgA1, IgA2)
les IgE ε
les IgD δ
En CMF, on utilise surtout des IgG1, IgG2a, IgG2b, IgM et des Fragments d’Ig – F(ab’)2. Il est
important, lorsqu’on utilise un anticorps en CMF, de connaître son isotype afin d’effectuer le contrôle
isotypique adéquat. [16] (diapositive : 10).
La structure d’un anticorps forme la lettre « Y », il est constitué de deux parties, une partie constante (Fc,
fragment cristallisable) et une partie variable (Fab, fragment antigen binding). C’est cette deuxième partie
qui est spécifique à un antigène et c’est avec cette partie
que l’anticorps se lie à l’épitope (déterminant
antigénique) de l’antigène. [15] (pages : 14 à 16).
Tout comme les antigènes, les anticorps peuvent être
classés selon plusieurs critères. Il existe par exemple des
anticorps monoclonaux (produits par un seul clone
lymphocytaire) et des anticorps polyclonaux (produits par
plusieurs clones lymphocytaires) [15] (pages : 14 à 16).
Aujourd’hui, en CMF, on utilise essentiellement des
anticorps monoclonaux. L’explication de la fabrication de
ces derniers n’est pas essentielle pour la compréhension
de notre TD, néanmoins nous trouvons ce processus
intéressant, c’est pourquoi il est expliqué à l’ « Annexe 8 :
la fabrication des anticorps » (page : 80).
Figure n°14 : schéma d’un anticorps
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
20
Technique de marquage direct Voici un exemple de marquage direct. Selon les laboratoires, quelques détails peuvent différer, mais le
principe reste le même.
Figure n°15 : technique de marquage
Lors de la première étape, les cellules à marquer sont mises en contact avec les anticorps fluoromarqués.
Si l’anticorps trouve l’antigène correspondant, il s’y fixe. Lors de l’étape 2 et 3, les cellules sont lavées
afin d’éliminer les anticorps non liés. [16] (diapositive : 13).
Figure n°16 et 17 : technique de marquage direct
Lors de l’étape 4, les cellules sont à nouveau suspendues dans un milieu approprié, elles sont prêtes à être
analysées sur l’appareil de CMF. [16] (diapositive : 13).
Les fluorochromes L’appareil de CMF détecte la fluorescence des cellules. Ce sont les fluorochromes (liés aux anticorps) qui
confèrent de la fluorescence aux cellules. Nous pouvons définir les molécules fluorescentes comme des
molécules absorbant la lumière à une certaine longueur d’onde et la réémettant à une longueur d’onde
supérieure.
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
21
Ce phénomène a une explication physique : lorsqu’une molécule absorbe plus d’énergie lumineuse
qu’elle n’en retransmet, la molécule passe
d’un état stable à excité puis à nouveau à une
situation stable. Cela s’explique par le
déplacement des électrons sur une couche
électronique supérieure sous l’influence des
photons (cf. « 9. Lexique » page : 61). La
molécule est alors instable. C’est lors du
retour à l’état stable qu’il y a une perte
d’énergie sous forme d’émission de lumière.
Ce principe est résumé sur le Diagramme de
Jablonski.[4] (pages : 48 à 49).
C’est lors de ce passage de l’état excité à l’état stable qu’a lieu la diminution d’énergie lumineuse
retransmise par rapport à l’énergie lumineuse absorbée. Une faible longueur d’onde contenant plus
d’énergie qu’une longueur d’onde plus élevée, cela explique pourquoi la longueur d’onde retransmise est
plus grande que celle absorbée.
Ce décalage est appelé « Décalage de Stokes »,
il montre l’écart entre les spectres d’absorptions
et d’émissions. [4] (pages : 48 à 49). Chaque
fluorochrome a un spectre d’excitation et
d’émission qui lui est propre.
En « Annexe 9 : fluorochromes » (page : 81),
vous trouverez des exemples de quelques
fluorochromes avec leur longueur d’onde
d’excitation et d’émission ainsi que le laser
utilisé pour les exciter.
3.2.2. Focalisation hydrodynamique
Le but de la focalisation hydrodynamique est de faire passer des cellules en suspension, les unes derrières
les autres, à très grande vitesse, devant une source laser afin de les analyser séparément. [4] (page : 5) et
[6] (pages : 4 à 5).
Ceci est réalisable grâce aux propriétés des fluides. Il y a 2 composants liquides principaux, le liquide de
gaine (qui forme le manteau à l’intérieur duquel les cellules circulent) et l’échantillon contenant des
cellules en suspension. Trois paramètres permettent d’expliquer la focalisation hydrodynamique : la
pression, la vitesse et la densité. [4] (pages : 5 à 6) et [6] (pages : 4 à 5).
Figure n°18 : diagramme de Jablonski
Figure n°19 : spectres d’excitation et d’émission, définition du rayon de
Stokes
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
22
Figure n°20 : focalisation hydrodynamique
L’échantillon est injecté avec une certaine pression au milieu d’une buse, à l’intérieur de laquelle le
liquide de gaine est lui aussi amené avec une certaine pression. C’est la pression du liquide de gaine qui
définit la vitesse du flux cellulaire, et donc la vitesse
d’analyse des cellules. La sortie de la buse étant un
petit orifice, le liquide de gaine sera accéléré à la
sortie de la buse. Ce dernier sort de la buse sous
forme de jet dont le diamètre correspond à celui de
l’orifice. La structure de la buse et de l’orifice
permettent d’obtenir un flux laminaire à l’intérieur
duquel les cellules sont attirées et sont forcées de
circuler les unes derrière les autres, permettant ainsi
une analyse individuelle. [4] (page : 6) et [6] (pages :
4 à 5).
Deux conditions sont nécessaires pour permettre la création d’un flux :
une pression doit être appliquée sur le liquide de gaine et sur l’échantillon.
la pression doit être plus grande sur le liquide de gaine que sur la suspension cellulaire
(différentiel positif). [4] (pages : 6 à 7).
Si le différentiel de pression était négatif, le liquide de gaine serait refoulé vers l’injecteur et donc vers
l’échantillon également. En cas de pression identique sur le liquide de gaine et sur l’échantillon, ce
dernier n’aurait pas la possibilité de s’insérer dans le flux.
Comme dit précédemment, la pression du liquide de gaine influence la vitesse de défilement cellulaire,
mais il y a aussi la pression de l’échantillon qui influence le flux. L’utilisateur a la possibilité de changer
la pression différentielle appliquée sur l’échantillon et donc de modifier la vitesse de défilement des
cellules. Cependant, en augmentant le différentiel de pression, la vitesse est accélérée mais le diamètre du
jet cellulaire est lui aussi agrandi. Cette dernière modification entraîne une influence négative sur la
précision de l’analyse. En effet, le diamètre étant élargi, la vitesse de défilement augmente mais le
centrage des cellules dans le flux diminue et péjore la qualité de l’analyse. Lorsque les cellules ne passent
Figure n°21 : focalisation hydrodynamique
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
23
pas toutes au même endroit devant le laser, il se crée alors des variations entre les cellules. La
fluorescence des cellules n’est alors pas le reflet exact de leur charge en fluorescence, et les résultats sont
moins précis. Pour intensifier la vitesse d’analyse, il est donc préférable d’appliquer une pression qui
permet de garder cette précision de centrage des cellules, et
plutôt d’augmenter la concentration cellulaire de
l’échantillon. [4] (pages : 6 à 7) et [6] (pages : 4 à 5).
En ce qui concerne la densité, c’est aussi un élément
important de la focalisation hydrodynamique. Il est
préférable de choisir les liquides de gaine ayant une densité
inférieure ou identique à celle de l’échantillon, afin de
prévenir les effets de réflexion qui peuvent entraîner une
perte du signal. [4] (page : 7) et [6] (pages : 4 à 5).
Évidemment, chaque appareil est différent. Les réglages faits
sur un appareil ne seront pas les mêmes sur un autre appareil
de CMF. Chaque paramètre doit être adapté. Par exemple,
certains appareils de CMF analysent 1’000 à 2’000
cellules/seconde alors que d’autres sont capables de lire
30'000 cellules/seconde. Dans ce cas, la concentration idéale
de l’échantillon à analyser n’est pas la même. [4] (page : 7) et
[6] (pages : 4 à 5).
3.2.3. Le système optique (banc optique)
Le système optique d’un appareil de CMF se compose de plusieurs éléments :
une ou plusieurs sources lumineuses : le(s) laser(s)
une cellule de lecture
une succession de filtres et miroirs
des détecteurs. [17] (diapositive : 5).
Figure n°23 : schéma d’un cytomètre de flux
Figure n°22 : influence de la concentration et de la pression sur la précision de la mesure
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
24
A ce jour, on utilise 3 types de lasers en CMF ; un laser Argon à 488 nm, un laser He/Ne (Hélium/Néon)
à 633 nm et un laser diode à 405 nm [18].
Les appareils de CMF peuvent être équipés uniquement d’un laser argon, ou alors posséder un deuxième
et/ou un troisième laser. Évidemment, le nombre de fluorochromes potentiellement exploitables est
proportionnel au nombre de lasers que possède l’appareil. [17] (diapositive : 8).
3.2.3.1. La cellule de lecture Le point de rencontre entre le laser et les cellules
constitue la cellule de lecture. [17] (diapositive : 9).
Au moment où le laser frappe les cellules qui se
présentent devant lui, plusieurs informations sont
obtenues :
la taille de la cellule (forward scatter à 0
degré)
la complexité de la cellule (side scatter à
90 degrés)
les différentes intensités de fluorescence
émises par la cellule (90 degrés). [19] [20]
Forward scatter (diffusion aux petits angles) Le forward scatter donne une indication sur la
taille de la cellule. Ce signal correspond à la
lumière diffractée. Cette dernière est recueillie
à 0 degré par rapport à l’axe du laser. Plusieurs
paramètres sont susceptibles d’influencer le
forward scatter : la composition du milieu et la
structure des cellules. [4] (pages : 9 à 13).
Side scatter (diffusion aux grands angles) Le side scatter donne une indication sur la
complexité de la cellule (granularité et
noyau). Ce signal correspond à un mélange de
lumière diffusée, réfléchie et réfractée,
recueillie à 90 degrés par rapport à l’axe du
laser. [4] (pages : 9 à 13).
Figure n°24 : cellule de lecture
Figure n°25 : forward scatter
Figure n°26 : side scatter
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
25
Fluorescence émise par les cellules A 90 degrés, on recueille également la fluorescence émise par les cellules. Une cellule émet de la
fluorescence pour autant qu’elle ait été préalablement marquée par un anticorps lié à un fluorochrome. La
fluorescence doit finalement être acheminée vers des détecteurs. [4] (pages : 9 à 13).
3.2.3.2. Les filtres et les miroirs Le rôle des filtres et des miroirs est de conduire la fluorescence vers un détecteur et également de définir
la « partie » de la fluorescence à transmettre afin que chaque détecteur ne reçoive finalement que les
longueurs d’ondes qui lui sont appropriées. [4] (pages : 9 à 13).
Les miroirs dichroïques Il existe 2 types de miroirs dichroïques, les miroirs dichroïques passe-bas et les miroirs dichroïques passe-
haut. Ceux-ci permettent de transmettre la lumière jusqu’à, ou à partir, d’une certaine longueur d’onde. A
titre d’exemple, un miroir dichroïque passe-bas de 630 nm réfléchit les longueurs d’ondes supérieures à
630 nm. Les longueurs d’ondes inférieures sont transmises. A l’inverse, un miroir dichroïque passe-haut
de 630 nm transmet les longueurs d’ondes au-delà de 630 nm et réfléchit les longueurs d’ondes
inférieures à 630 nm. [4] (pages : 9 à 13).
Figure n°27 : fluorescence
Figure n°28 : miroirs dichroïques
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
26
Les filtres Il existe 3 types de filtres :
Figure n°29 : les filtres
Les filtres passe-haut stoppent la lumière inférieure à une certaine longueur d’onde, à l’inverse, les filtres
passe-bas arrêtent la lumière supérieure à une certaine longueur d’onde. Quant aux filtres passe-bande, ils
laissent passer la lumière se trouvant entre deux longueurs d’ondes. Ce type de filtres est le plus
largement utilisé. Placés juste devant un détecteur, les filtres passe-bande permettent d’assurer que le
détecteur reçoive uniquement les longueurs d’ondes qui lui sont appropriées.
Bien qu’ils fassent partie intégrante de la partie optique d’un appareil de CMF, les détecteurs font l’objet
d’un chapitre particulier dans ce travail car la compréhension de la détection du signal en CMF est un
point capital. [4] (pages : 9 à 13).
3.2.3.3. La détection du signal La détection du signal en CMF s’effectue grâce à des photodétecteurs. Le rôle d’un photodétecteur est de
convertir les photons en photon-électrons, ce qui a la particularité de créer un courant électrique. Il existe
2 types de photodétecteurs dans un appareil de CMF : les photodiodes (PD) et les photomultiplicateurs
(PMT). [4] (pages : 13 à 16).
Les photodiodes Les PD, particulièrement efficaces pour transformer les photons en photons-électrons, sont généralement
utilisés pour détecter des signaux d’intensité élevée. On les utilise notamment pour la détection du signal
du forward scatter.
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
27
Les photomultiplicateurs Les PMT sont habituellement utilisés pour détecter des signaux de plus faible intensité (comme le side
scatter). On les utilise également pour la détection de la fluorescence des éléments marqués. Les PMT
possèdent un enchaînement d’électrodes (les dynodes) dont le rôle est d’augmenter le signal électrique
Cette possibilité d’amplification du signal fait que les PMT sont des photodétecteurs particulièrement
sensibles. La sensibilité est encore accrue en augmentant le voltage appliqué aux PMT.
Après la photodétection, on obtient ce que l’on appelle une impulsion. Grâce à cette valeur, l’étape de
conversion d’un voltage en une valeur numérique est réalisable. Cette étape s’appelle la digitalisation du
signal. Pour sa réalisation, des convertisseurs analogiques-numériques (ADC) sont nécessaires.
Aujourd’hui, chaque firme possède un système de traitement du signal un peu différent. [4] (pages : 13 à
16).
3.2.3.4. Les réglages de l’appareil Avant de pouvoir utiliser l’appareil de CMF et afin d’être certain que les résultats obtenus sont fiables, il
est important de faire plusieurs réglages sur l’appareil :
la détermination des volts appliqués à chaque PMT
le calcul de la compensation de fluorescence entre les différents
fluorochromes.
Détermination des volts Les volts sont réglés en analysant une population cellulaire. Ils sont
ajustés de façon à ce que le pic de fluorescence des cellules négatives se
retrouve dans la première décade de l’échelle logarithmique du
fluorochrome concerné.
Compensation Il arrive que les spectres d’émission de deux fluorochromes se chevauchent, par exemple, FITC et PE.
Cela crée alors des interférences lors de la
lecture. Comme nous pouvons le voir sur
le graphique, une partie de la fluorescence
de FITC est lue par le PTM destiné à la
lecture de PE (et inversement). Cela
signifie, que sans compensation, une
cellule uniquement marquée avec du FITC
peut se retrouver positive aussi pour PE (et
inversement). Il y a une contamination du
canal de lecture PE par la fluorescence
émise par le fluorochrome FITC (et
inversement). Cet effet peut ainsi induire
de faux résultats. [21] (diapositives : 22 à
29).
Figure n°30 : ajustement du voltage
Figure n°31 : compensation
525 nm 575 nm
canal delectureFITC
canal delecture
PE
[Longueur d'onde en nm]
[I]
FITC PE
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28
La correction de ce phénomène s’appelle la compensation de fluorescence. Afin de régler ces
compensations, une série de marquages est effectuée avec de l’α-CD45 (cf. « 3.2.3.5. Interprétation des
histogrammes ».page : 28) dans les
différents fluorochromes utilisés
habituellement. Les tubes, contenant
chacun un seul fluorochrome, sont
analysés sur l’appareil de CMF. Cela
permet de déterminer le pourcentage
de contamination de chaque
fluorochrome sur les autres canaux
de lecture. Le logiciel de l’appareil
de CMF calcule automatiquement
les pourcentages de contamination.
[21] (diapositives : 22 à 29).
3.2.3.5. L’interprétation des histogrammes Lors d’une analyse par CMF, plusieurs histogrammes peuvent être construits :
l’histogramme FS/SS
l’histogramme SS/α-CD45
les histogrammes monoparamétriques
les histogrammes biparamétriques.
L’histogramme FS/SS Sur cet histogramme, les cellules sont réparties selon leur complexité en abscisse (SS) et selon leur taille
en ordonnée (FS). La fluorescence émise par les cellules n’est pas prise en compte. Cet histogramme
permet une visualisation de la répartition des différents types de leucocytes. Ces derniers se répartissent
comme sur le schéma ci-dessous.
Figure n°32 : compensation
Figure n°33 : répartition des différents types leucocytaires
LYMPHOCYTES
MONOCYTES GRANULOCYTES
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
29
L’histogramme SS/α-CD45 Cet histogramme s’établit selon 2 paramètres, la complexité de la cellule (SS) et l’intensité de la
fluorescence des cellules à l’α-CD45.
Pour pouvoir analyser correctement cet histogramme, une petite introduction sur le CD45 est nécessaire.
Le CD45 est un antigène composé d’une glycoprotéine de 240 kD. Cette protéine est codée par un gène
localisé sur le chromosome 1. Cet antigène possède la caractéristique d’être exprimé sur tous les
leucocytes. Sur les leucocytes immatures, il peut être plus faiblement exprimé, voire absent sur les
cellules très immatures. [22] (page : 71).
Voici une représentation de la répartition des différentes cellules sur un histogramme SS/α-CD45. L’axe
des abscisses correspond au SS avec une échelle linaire, celui des ordonnées à la fluorescence de l’α-
CD45 marqué au Krome orange (KO).
Par rapport au FS/SS, cet histogramme permet une
meilleure discrimination entre les lymphocytes et les
blastes. Ce type d’histogramme est essentiel lorsque la
technique de la lyse des globules rouges est utilisée. Sur
l’histogramme FS/SS, des érythrocytes mal lysés se
mélangent à la population lymphocytaire. [21]
(diapositive : 8).
Le « gating » Sur la base des histogrammes FS/SS et SS/α-CD45,
l’utilisateur peut décider d’effectuer un « gating ». Ce
dernier cible la population à analyser. Après un « gating »,
il est possible de conditionner les graphiques afin que les
résultats obtenus ne portent que sur la population
sélectionnée. Des « gating » successifs peuvent être
réalisés. [23] (diapositive : 39). Voici un exemple de
gating, tiré de l’une des analyses que nous avons effectuée
pour ce TD.
Figure n°34 : répartition des différents types leucocytaires sur un
histogramme biparamétrique SS / CD45
Figure n°35 : le gating
GATING
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
30
Les histogrammes monoparamétriques Les histogrammes monoparamétriques donnent une information sur un seul paramètre. Sur l’axe des
abscisses se trouve l’intensité de la florescence (échelle logarithmique) et sur l’axe des ordonnées se
trouve le compte cellulaire. Chaque cellule analysée est ensuite répartie dans différents canaux. Les
histogrammes monoparamétriques donnent une
représentation de la population (est-elle fortement
positive, négative ?). [21] (diapositive : 29) et [23]
(diapositives : 42 à 44). L’image ci-contre est un
exemple d’histogramme monoparamétrique. Sur ce
dernier, on s’intéresse au CD43. Pour cela, on a utilisé
un α-CD43 couplé au fluorochrome FITC, 100% de la
population cellulaire testée est positive au CD43. Sur
l’image, le trait horizontal AW définit, la « zone
positive ». Cette dernière commence à l’endroit où
s’arrête la « zone négative », qui, comme expliqué au
point suivant, est fixée au début de l’analyse grâce au
contrôle isotypique.
Contrôle isotypique – contrôle négatif Le contrôle négatif, appelé contrôle isotypique, consiste à faire passer des cellules marquées uniquement
avec de l’α-CD45 dans l’appareil de CMF. Le tube de contrôle isotypique contient des anticorps de même
isotype que le tube analytique (ex : IgG1, IgG2a.), fluoromarqués, mais qui ne sont pas dirigés contre des
antigènes humains. Ils ne se fixent donc pas, mais une fluorescence est tout de même captée dans chaque
canal. On peut alors fixer le seuil de négativité pour chaque fluorochrome, correspondant au bruit de fond.
Lors des passages suivants, les cellules ne présentant pas une fluorescence supérieure au contrôle seront
considérées comme négatives. A l’inverse, si une cellule émet une fluorescence plus élevée, elle sera
considérée comme positive. [21] (diapositives : 11 à 12).
Figures n°37 et 38 : contrôle isotypique
Co
mp
te c
ellu
lair
e
Intensité de fluorescenceéchelle logarithmique
1 10 100 1000
Négatif Positif
Tube contrôle isotypique
Figure n°36 : exemple d’un histogramme monoparamétrique
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
31
Figure n°39 : échantillon positif I Figure n°40 : échantillon positif II
Les histogrammes biparamétriques Les histogrammes biparamétriques renseignent sur 2 paramètres. Sur l’axe des abscisses se trouve
l’intensité de fluorescence de l’un des 2 paramètres étudiés et sur l’axe des ordonnées, l’intensité de
fluorescence du second paramètre étudié. Ces histogrammes biparamétriques sont très utiles car ils
permettent d’analyser la co-expression de deux marqueurs. Un histogramme biparamétrique n’est en fait
que la « combinaison » de deux histogrammes monoparamétriques.
L’interprétation d’un histogramme biparamétrique se fait de la manière suivante : Les éléments se
trouvant dans le carré en bas à gauche sont négatifs pour les 2 paramètres testés. A l’inverse, les éléments
se trouvant dans le carré en haut à droite sont doublement positifs. Dans les carrés en haut à gauche et en
bas à droite, les éléments sont positifs pour l’un des deux paramètres uniquement. Par exemple, si l’on se
réfère à la « Figure n°41 : histogramme biparamétrique I » 94.8% des cellules testées sont positives
uniquement pour le CD19. [21] (diapositive : 15) et [23] (diapositives : 45 à 47).
Figure n°41 : histogramme biparamétrique I Figure n°42 : histogramme biparamétrique II
Mean Fluorescence Intensity (MFI) La MFI correspond à l’intensité moyenne de la fluorescence émise par un fluorochrome pour un anticorps
donné. L’idéal est d’obtenir une MFI élevée. Ces notions sont importantes pour la compréhension des
résultats.
Com
pte
cellu
laire
Intensité de fluorescenceéchelle logarithmique
1 10 100 1000
Négatif Positif
Tube analyse
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3.3. PRINCIPE D’ACTION DES RÉACTIFS DE LYSE TESTÉS
NH4Cl Le NH4Cl (ou chlorure d’ammonium) est fréquemment utilisé pour obtenir une lyse des érythrocytes. Ces
derniers ont une membrane perméable au NH4Cl. Lorsque du NH4Cl entre à l’intérieur d’un globule
rouge, cela provoque un déséquilibre de la pression osmotique. C’est précisément ce déséquilibre qui est à
l’origine de la lyse de l’érythrocyte. [24].
Facslyse Pour la Facslyse, le fabricant donne peu d’indication quant au principe de la méthode utilisée. Il est juste
notifié que la lyse des érythrocytes intervient dans des conditions hypotoniques douces et que les
leucocytes sont préservés. [25] (cf. « Annexe 3 : FacsLyse » page : 65).
VersaLyse Le fabricant ne donne pas beaucoup d’indication. Il nous explique que le réactif VersaLyse contient une
amine cyclique (cf. « 9. Lexique » page : 60) qui, au contact avec une anhydrase carbonique (cf. « 9.
Lexique » page : 60) présente dans les érythrocytes, devient hautement lytique pour ce type de cellules.
[26] (cf. « Annexe 4 : VersaLyse » page : 71).
IOTest Le principe actif du réactif IOTest est le chlorure d’ammonium. IOTest agit donc de la même manière que
NH4Cl. [27] (cf. « Annexe 5 : IOTest » page : 74).
3.4. MÉTHODES
La première étape de notre TD a été de nous sensibiliser à la CMF. Durant la première semaine, M.
Quarroz nous a introduit les notions théoriques nécessaires à la réalisation et à la compréhension d’une
analyse en CMF. Une TAB nous a ensuite enseigné la pratique. Puis, nous avons pu réaliser nos analyses
de façon indépendante.
Vous trouverez les protocoles que nous avons « recréés » et adaptés à notre travail de diplôme à partir de
ceux du laboratoire (cf. « Annexe 6 : coloration Romanowsky » page : 76 et « Annexe 10 : préparation
pour la CMF » page : 82) et avec lesquels nous avons travaillé. En ce qui concerne la préparation
cellulaire, nous en avons établi 2 :
un premier avec la lyse des érythrocytes puis le marquage (LSW), qui correspond plus ou moins à
ce que fait le LCH.
un deuxième avec le marquage puis la lyse des érythrocytes (SLW).
Chaque échantillon a été traité selon les 2 méthodes. Nous avions 4 lyses à disposition, ce qui nous donne
finalement 8 manières différentes de traiter un échantillon. Voici un tableau explicatif :
Lyses NH4Cl Facslyse VersaLyse IOTest
Méthode LSW LSW/NH4Cl LSW/Facslyse LSW/VersaLyse LSW/IOTest
SLW SLW/NH4Cl SLW/Facslyse SLW/VersaLyse SLW/IOTest
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)
33
Pour les 2 premiers essais, nous n’avions pas compté les cellules, puis, afin de standardiser nos méthodes
nous avons introduit ce comptage. En effet, selon les pratiques du LCH et selon les recommandations du
fabricant, il est important d’avoir une certaine concentration de leucocytes à marquer. Cette concentration
se situe entre 1 et 5 millions de cellules par ml. Cela correspond à la concentration idéale pour que le
marquage se fasse de façon optimale.
Les premières semaines de la réalisation de ce travail, tous les réactifs de lyse n’étaient pas encore à
disposition. Nous avons donc effectué une série d’analyses (appelée : TD essai 0, 1, 2, etc.) uniquement
avec les réactifs de lyse disponibles (NH4Cl et Facslyse). Lorsque les 2 derniers réactifs de lyse nous sont
parvenus, nous avons enfin pu traiter chaque échantillon avec les 4 réactifs de lyse. Nous les avons alors
appelés TD éch 1, 2, etc.
En ce qui concerne les cytospins, elles n’ont pas été réalisées systématiquement. Nous avons choisi de les
effectuer lorsque notre emploi du temps s’y prêtait le mieux.
Plusieurs facteurs expliquent le fait que nous n’ayons obtenus que peu de valeurs pour certains anticorps.
Nous étions dépendantes des échantillons que le laboratoire pouvait nous transmettre. Lorsque nous
travaillions sur des prélèvements de moelle osseuse, il était nécessaire qu’il y ait une infiltration
médullaire. Un facteur limitant était également la quantité de matériel. De plus, selon les indications
cliniques, les échantillons ont été marqués par différents panels d’anticorps. Au total, nous avons donc
obtenu un nombre important de données mais pour certains anticorps, nous n’avons que peu de résultats.
3.4.1. Protocole n°1 : préparation du matériel
Prêt à
l’emploi Préparation
NH4Cl
Facslyse Diluer 10X avec de l’eau désionisée. Stable un jour.
VersaLyse
IOTest Diluer 10X avec de l’eau désionisée. Stable un jour.
PBS – Albumine – Azide
RPMI – Azide – BSA (RAB)
RPMI
Leucostase
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3.4.2. Protocole n°2 : Lysis Staining Washing (LSW) L
ys
e / L
av
ag
e
1. Pipeter 300 µl de moelle ou 500 µl de sang, si possible, dans 4 tubes de 10 ml
2. Ajouter l’agent de lyse ad 10 ml (NH4Cl, Facslyse et IOTest). Attention : pour VersaLyse
ajouter 1ml de solution pour 100 µl de matériel. Mélanger
3. Incuber 30’ à 4°C à l’abri de la lumière (mélanger pendant l’incubation)
4. Centrifuger 3’ à 900 g
5. Vider le surnageant. Détacher le culot
6. Resuspendre dans 10 ml de RPMI. Mélanger
7. Centrifuger 3’ à 900 g
8. Vider le surnageant. Détacher le culot
9. Resuspendre dans 1 ml de RPMI-AZIDE-BSA (RAB). Mélanger
Co
mp
tag
e
10. Mettre en chambre 10 – 15 μl
11. Laisser sédimenter 1’
12. Compter (la méthode de comptage est décrite à l’ « Annexe 11 : comptage » (page : 86)).
13. Si nécessaire, diluer avec du RPMI-AZIDE-BSA (RAB) ou concentrer (Objectif : 1 à 5
millions de cellules par ml)
Ma
rqu
ag
e
14. Préparer et identifier les tubes de marquage
15. Programmer le panel d’anticorps fluoromarqués choisi sur le Biomek
16. Ajouter 100 µl de suspension cellulaire dans les tubes de marquage (pipeter au fond du tube,
ne pas toucher les bords). Mélanger
17. Incuber 15’ à 4°C à l’abri de la lumière
Lavag
e
18. Ajouter 3 ml de PBS – Albumine – Azide. Vortexer
19. Centrifuger 3’ à 900 g
20. Vider le surnageant. Détacher le culot
21. Resuspendre dans 1 ml de PBS – Albumine – Azide. Vortexer
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)
35
3.4.3. Protocole n°3 : Staining Lysis Washing (SLW) P
ré-l
ava
ge
1. Pipeter 300 µl de moelle ou 500µl de sang, si possible, dans un tube de 10 ml
2. Ajouter du RPMI ad 10 ml
3. Centrifuger 3’ à 900 g
4. Vider le surnageant. Détacher le culot
5. Resuspendre dans 1 ml de RPMI-AZIDE-BSA (RAB). Mélanger
Co
mp
tag
e
6. Pipeter 45 μl de Leucostase
7. Ajouter 5 μl de suspension cellulaire
8. Incuber 5’ à TA (lyse des érythrocytes)
9. Mettre en chambre 10 – 15 µl
10. Laisser sédimenter 1’
11. Compter (la méthode de comptage est décrite à l’ « Annexe 11 : comptage » (page : 86))
12. Si nécessaire, diluer avec du RPMI-AZIDE-BSA (RAB) ou concentrer (Objectif : 1 à 5 millions
de cellules par ml)
Ma
rqu
ag
e
13. Préparer et identifier les tubes de marquage
14. Programmer le panel d’anticorps fluoromarqués choisi sur le Biomek
15. Ajouter 100 µl de suspension cellulaire dans les tubes de marquage (pipeter au fond du tube, ne
pas toucher les bords)
16. Incuber 15’ à 4°C à l’abri de la lumière
Lyse
17. Ajouter environ 2.5 ml de solution de lyse (NH4Cl, Facslyse et IOTest). Attention : pour la
VersaLyse ajouter 1ml. Vortexer
18. Incuber 30’ à 4°C à l’abri de la lumière (vortexer pendant l’incubation)
Lavag
e
19. Centrifuger 3’ à 900 g
20. Vider le surnageant. Détacher le culot
21. Resuspendre dans 3 ml de PBS – Albumine – Azide. Vortexer
22. Centrifuger 3’ à 900 g
23. Vider le surnageant. Détacher le culot
24. Resuspendre dans 1 ml de PBS – Albumine – Azide. Vortexer
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)
36
3.4.4. Protocole n°4 : cytospin
Une cytospin s’effectue toujours avant l’étape de marquage mais après l’étape de la lyse des érythrocytes,
car on ne s’intéresse qu’aux leucocytes. Elles ont donc été effectuées uniquement à partir de la méthode
LSW, et sur un nombre restreint d’échantillons. S’il fallait introduire ces cytospins dans un protocole de
type SLW, un tube parallèle ne contenant aucun anticorps devrait être ajouté et la cytospin se ferait à
partir de ce dernier.
1. Préparer la cytocentrifugeuse.
2. Préparer une dilution à partir des suspensions cellulaires obtenues au point 9 du protocole LSW
selon le tableau ci-dessous :
Concentration cellulaire
(millions/ml)
Volume (µl) de la suspension
cellulaire
Volume (µl) de
PBS-Albumine-Azide 1 200 1000
2 100 1000
3 70 1000
4 50 1000
5 40 1000
3. Déposer 200 µl de cette dilution dans les réservoirs de la cytospin.
Effectuer 2 lames par échantillon.
4. Centrifuger (5’ à 500 RPM).
3.4.5. Protocole n°5 : coloration “Romanowsky” pour cytospin
Bac 1 Bac 2 Bac 3
Préparation Méthanol absolu 150 ml
Préparation Giemsa Fluka filtré 70 ml
Méthanol absolu 80 ml
Préparation Giemsa Fluka filtré 25 ml
Tampon Weise 130 ml
Conservation 1 semaine à T° ambiante
Conservation 1 semaine à T° ambiante
Conservation 1 jour T° ambiante
Temps de coloration
3 minutes
Passer dans le bac 2 sans rincer
Temps de coloration
5 minutes
Rincer abondamment à l’eau
courante et passer dans le bac 3
Temps de coloration
20 minutes
Rincer abondamment à l’eau
courante – sécher – monter sous
Eukitt
[28]
Vous trouverez à l’« Annexe 12 : liste des échantillons traités » (page : 87), un tableau contenant tous les
échantillons que nous avons traités et de quelles façons ils ont été traités. A l’« Annexe 13 : détails des
panels utilisés » (page : 92), vous trouverez un détail de chaque panel d’anticorps utilisés.
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)
37
4. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS
La première étape du traitement des résultats a été d’affiner nos « gatings », puis de reporter les données
fournies par le logiciel Kaluza dans un tableau (% de cellules ciblées (= « gated ») et MFI des différents
anticorps fluoromarqués). Vous trouverez à l’« Annexe 14 : résultats bruts » (page : 93) ce tableau et à
l’« Annexe 15 : exemples Kaluza » (page : 99) les documents Kaluza.
Nous avons décidé de prendre les données de nos échantillons nommés « TD éch… » car ces échantillons
ont tous été traités selon les 8 protocoles. Néanmoins, nous avons aussi pu utiliser les données des « TD
essai 0, 2, 4, 5, 6, 8, 11 et 12 » car ils provenaient de patient atteint de myélome et pour ce point, nous
n’avions besoin que des échantillons traités avec NH4Cl de la façon SLW et LSW.
Puis, vu le nombre assez élevé de données, il a ensuite fallu choisir lesquelles nous voulions exploiter et
de quelle façon nous allions les exploiter (type de graphique, quelles données dans quels graphiques, etc.).
Les analyser toutes n’aurait pas été possible et M. Quarroz a fait un choix arbitraire des anticorps à
analyser.
4.1. RÉSULTATS DE LA COMPARAISON DES MFI DES DIFFÉRENTES MÉTHODES
Voici une représentation graphique des résultats obtenus. Nous avons effectués ces graphiques sur un
nombre limité d’anticorps. Sur l’axe des abscisses se trouve le numéro des échantillons et sur l’axe de
l’ordonnée, les MFI obtenues pour les différents anticorps fluoromarqués. Voici un exemple de
graphique :
Anticorps fluoromarqué
Pour des questions de lisibilité, les données utilisées pour la réalisation de ces graphiques se trouvent à
l’« Annexe 16 : données des graphiques de comparaison des MFI » (page : 109).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 1 2 3 4 5
MFI
Echantillons
Réactif de lyse utilisé
LSW
SLW
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)
38
α-CD2 APC α-CD3 A750
5
10
15
20
0 1 2 3 4 5
NH4Cl
LSW
SLW
25
30
35
40
45
0 1 2 3 4 5
NH4Cl
LSW
SLW
5
10
15
20
0 1 2 3 4 5
Facslyse
LSW
SLW
25
30
35
40
45
0 1 2 3 4 5
Facslyse
LSW
SLW
5
10
15
20
0 1 2 3 4 5
VersaLyse
LSW
SLW
25
30
35
40
45
0 1 2 3 4 5
VersaLyse
LSW
SLW
5
10
15
20
0 1 2 3 4 5
IOTest
LSW
SLW
25
30
35
40
45
0 1 2 3 4 5
IOTest
LSW
SLW
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)
39
α-CD4 PE α-CD8 PB
55 65 75 85 95
105 115 125
0 1 2 3 4 5
NH4Cl
LSW
SLW
15 20 25 30 35 40 45 50 55
0 1 2 3
NH4Cl
LSW
SLW
55 65 75 85 95
105 115 125
0 1 2 3 4 5
Facslyse
LSW
SLW
15 20 25 30 35 40 45 50 55
0 1 2 3
Facslyse
LSW
SLW
55 65 75 85 95
105 115 125
0 1 2 3 4 5
VersaLyse
LSW
SLW
15 20 25 30 35 40 45 50 55
0 1 2 3
VersaLyse
LSW
SLW
55 65 75 85 95
105 115 125
0 1 2 3 4 5
IOTest
LSW
SLW
15 20 25 30 35 40 45 50 55
0 1 2 3
IOTest
LSW
SLW
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)
40
α-CD13 FITC α-CD19 A700
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0 1 2 3
NH4Cl
LSW
SLW
0 20 40 60 80
100 120
0 1 2 3
NH4Cl
LSW
SLW
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0 1 2 3
Facslyse
LSW
SLW
0 20 40 60 80
100 120
0 1 2 3
Facslyse
LSW
SLW
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0 1 2 3
VersaLyse
LSW
SLW
0 20 40 60 80
100 120
0 1 2 3
VersaLyse
LSW
SLW
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0 1 2 3
IOTest
LSW
SLW
0 20 40 60 80
100 120
0 1 2 3
IOTest
LSW
SLW
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)
41
α-CD19 PC5.5 α-CD45 KO
0
20
40
60
80
100
0 1 2
NH4Cl
LSW
SLW
0
10
20
30
40
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
NH4Cl
lsw
slw
0
20
40
60
80
100
0 1 2
Facslyse
LSW
SLW
0
10
20
30
40
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Facslyse
lsw
slw
0
20
40
60
80
100
0 1 2
Versalyse
LSW
SLW
0
10
20
30
40
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
VersaLyse
lsw
slw
0
20
40
60
80
100
0 1 2
IOTest
LSW
SLW
0
10
20
30
40
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
IOTest
lsw
slw
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)
42
α-CD56 PC5.5 α-HLADR ECD
6 8
10 12 14 16 18 20
0 1 2 3 4
NH4Cl
LSW
SLW
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0 1 2 3 4 5
NH4Cl
LSW
SLW
6 8
10 12 14 16 18 20
0 1 2 3 4
Facslyse
LSW
SLW
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0 1 2 3 4 5
Facslyse
LSW
SLW
6 8
10 12 14 16 18 20
0 1 2 3 4
VersaLyse
LSW
SLW
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0 1 2 3 4 5
VersaLyse
LSW
SLW
6 8
10 12 14 16 18 20
0 1 2 3 4
IOTest
LSW
SLW
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0 1 2 3 4 5
IOTest
LSW
SLW
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
43
α-HLADR PC7
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3
NH4Cl
LSW
SLW
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3
Facslyse
LSW
SLW
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3
VersaLyse
LSW
SLW
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3
IOTest
LSW
SLW
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
44
α-Kappa FITC α-Lambda PE
10 30 50 70 90
110 130 150 170 190 210
0 1 2 3
NH4Cl
LSW
SLW
0 20 40 60 80
100 120 140 160 180
0 1 2 3
NH4Cl
LSW
SLW
10 30 50 70 90
110 130 150 170 190 210
0 1 2 3
Facslyse
LSW
SLW
0 20 40 60 80
100 120 140 160 180
0 1 2 3
Facslyse
LSW
SLW
10 30 50 70 90
110 130 150 170 190 210
0 1 2 3
VersaLyse
LSW
SLW
0 20 40 60 80
100 120 140 160 180
0 1 2 3
VersaLyse
LSW
SLW
10 30 50 70 90
110 130 150 170 190 210
0 1 2 3
IOTest
LSW
SLW
0 20 40 60 80
100 120 140 160 180
0 1 2 3
IOTest
LSW
SLW
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
45
4.2. DISCUSSION DES RÉSULTATS DE LA COMPARAISON DES MFI DES
DIFFÉRENTES MÉTHODES
L’ensemble des résultats présentés montre une certaine cohérence. Les 11 anticorps étudiés permettent de
tirer des conclusions relativement similaires. On peut donc supposer que les résultats ne sont dépendants
ni du type d’anticorps, ni du type de fluorochrome utilisé.
On constate ensuite que la FacsLyse est la moins constante des 4 réactifs de lyses testés. Les résultats de
la Facslyse sont à plusieurs reprises très différents en fonction de la méthode (LSW ou SLW) utilisée. Il
serait intéressant de comprendre pourquoi la méthode utilisée a une telle influence sur les résultats
obtenus. Nous ne l’avons pas fait car cela n’était pas vraiment le but de notre TD mais il pourrait s’agir là
d’une suite à donner à notre travail. Quoiqu’il en soit, d’après ces résultats, il n’est pas possible
d’introduire la FacsLyse au laboratoire, nous avons donc décidé d’éliminer ce réactif de lyse de la suite de
nos résultats. A l’exception de l’étude morphologique, ce réactif de lyse ne figurera plus dans les analyses
suivantes.
En ce qui concerne les 3 autres réactifs de lyse, les résultats obtenus sont de qualité acceptable. A
quelques exceptions près, les valeurs de MFI obtenues diffèrent peu en fonction de la méthode utilisée
(LSW ou SLW). Là encore, il serait intéressant de déterminer pourquoi on observe des différences
largement supérieures à la moyenne dans quelques situations mais nous n’avons pas poussé nos
investigations aussi loin.
Sur la base des résultats obtenus, il est difficile de dégager une tendance et de déterminer quelle est la
meilleure méthode entre LSW et SLW. Pour ce point-là, les résultats sont assez hétérogènes et présentent
des différences entre patients même avec un anticorps et un fluorochrome identique. Comme la méthode
SLW ne semble pas présenter des MFI significativement meilleures, nous avons donc décidé de poursuive
l’étude de nos résultats uniquement avec la méthode LSW (méthode actuellement employée au LCH). Un
passage à la méthode SLW impliquerait non seulement une adaptation de la part du personnel du
laboratoire, mais c’est également une méthode nécessitant plus de temps. De plus, elle ne laisse pas la
possibilité de tester un nouveau marqueur sans avoir à recommencer la préparation cellulaire dès le début,
contrairement à la méthode LSW. Mis à part un léger avantage financier, car la méthode SLW nécessite
un plus petit volume de réactif de lyse, il n’y a pas d’argument pour que le laboratoire change sa méthode.
Les kappa/lambda font l’objet d’une analyse spécifique. Il était important de tester ces deux anticorps car
le cas des chaînes légères kappa et lambda est un peu particulier. En effet, ces dernières peuvent se
trouver à la fois à la surface cellulaire et être secrétées dans le plasma sous forme « libre ». C’est donc une
analyse pour laquelle les lavages jouent un rôle prépondérant. Si les lavages ne permettent pas d’éliminer
toutes les chaînes légères libres, il y a, lors de l’ajout des anticorps, un phénomène de compétition entre
les chaînes légères cellulaires et les chaînes légères libres. On risque alors d’obtenir un résultat
faussement abaissé voire négatif.
Si on s’intéresse maintenant à nos résultats, on constate de grandes différences entre la méthode LSW et
SLW. C’est particulièrement frappant pour les antigènes lambda où force est de constater que la méthode
SLW donne toujours des résultats inférieurs à la méthode LSW. La méthode LSW nécessitant plus de
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
46
lavages que la méthode SLW, nous avons donc supposé que les résultats obtenus avec la méthode SLW
n’étaient pas représentatifs de la réalité. Ce phénomène constitue un argument de choix pour nous
conforter dans l’idée de ne pas remplacer la méthode LSW par la méthode SLW. En effet, un résultat
faussement diminué pourrait avoir de lourdes conséquences pour le patient.
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
47
4.3. RÉSULTATS DE L’ANALYSE MORPHOLOGIQUE
Voici des exemples de morphologie cellulaire obtenue avec les différents agents de lyse suite aux
cytospins effectuées.
NH
4C
l
Fac
sLyse
Ver
saL
yse
IOT
est
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)
48
4.4. DISCUSSION DES RÉSULTATS DE L’ANALYSE MORPHOLOGIQUE
L’analyse morphologique montre que la méthode FacsLyse altère considérablement les leucocytes. Cette
constatation nous conforte dans l’idée que la Facslyse n’est pas adaptée pour la routine du laboratoire des
moelles. Les trois autres réactifs de lyse montrent toutes des images interprétables et de qualité identique
permettant une étude morphologique.
4.5. RÉSULTATS STATISTIQUES
Afin d’affiner quelque peu notre étude, nous avons décidé d’analyser les résultats obtenus avec les
méthodes LSW NH4CL, VersaLyse et IOTest sur un plan plus statistique. Le but de ce TD étant d’évaluer
si un des réactifs de lyse testés pourrait potentiellement remplacer la méthode actuelle, nous avons
comparé la méthode actuelle versus les réactifs de lyse commerciaux et non les réactifs de lyse
commerciaux entre-eux. Ces résultats sont basés sur des petites séries de données, ils sont toutefois
suffisants pour établir une tendance mais ne constituent en aucun cas une étude statistique poussée. Tout
d’abord, voici les graphiques de corrélation obtenus pour l’α-CD45. Nous avons réalisés ces graphiques
uniquement avec l’α-CD45 KO car c’est le seul anticorps pour lequel nous avions une valeur de MFI pour
tous les échantillons. A l’« Annexe 17 : données utilisées pour les corrélations » (page : 121), vous
trouverez les tableaux des données utilisées pour faire ces graphiques.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 5 10 15 20 25 30 35 40
MFI
α-C
D4
5 K
O V
ers
aLys
e
MFI α-CD45 KO NH4Cl
MFI α-CD45 KO NH4CL/VersaLyse
NH4CL/VersaLyse
Linéaire (NH4CL/VersaLyse)
r : 0.972
Droite idéale
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Voici ensuite un tableau récapitulatif des coefficients de corrélation obtenus.
α- CD2
APC
CD3
A750
CD4
PE
CD8
PB
CD13
FITC
CD19
A700
CD56
PC5.5
HLADR
ECD
HLADR
PC 7
NH4Cl / VersaLyse 0.973 0.850 0.983 0.987 0.931 0.997 0.999 0.957 0.949
NH4Cl / IOTest 0.987 0.943 0.939 0.986 0.999 0.999 0.898 0.989 0.933
A noter que nous avons calculé les coefficients de corrélation uniquement pour les anticorps pour lesquels
nous avions au minimum 3 valeurs.
4.6. DISCUSSION DES RÉSULTATS STATISTIQUES
Les 2 graphiques présentés ci-dessus montrent une bonne corrélation entre VersaLyse, IOTest et NH4Cl.
VersaLyse semble montrer des résultats légèrement meilleurs, mais au vu du faible nombre de données à
disposition, il est difficile de l’affirmer. Quant aux coefficients de corrélation, ils ne permettent pas non
plus de dégager une tendance claire. VersaLyse et IOTest montrent, chacune à leur tour, de meilleurs
résultats. Ces résultats ne présentent donc pas d’arguments incitant à remplacer NH4Cl par VersaLyse ou
IOTest.
4.7. RÉSULTATS DE L’ANALYSE DE L’ASPECT FINANCIER
Les coûts ont été calculés pour le protocole LSW. Bien qu’il soit clair que la FacsLyse ne puisse pas
remplacer la lyse actuellement utilisée, elle y figure tout de même à titre informatif.
Lyse utilisée Prix de vente
(Fr.-) Contenu (ml)
Quantité (ml)
nécessaire pour
une analyse
Prix approximatif
de la lyse par
analyse (Fr.-)
NH4Cl 15 1000 10 0.15
VersaLyse 304 100 ~ 3 à 5 ~ 9 à 15
IOTest 183 20 1 9
Facslyse 303 100 1 3
r : 0.969
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 5 10 15 20 25 30 35 40
MFI
α-C
D4
5 K
O I
OTe
st
MFI α-CD45 KO NH4Cl
MFI α-CD45 KO NH4CL/IOTest
NH4Cl/IOTest
Linéaire (NH4Cl/IOTest)
Droite idéale
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50
4.8. DISCUSSION DES RÉSULTATS DE L’ANALYSE DE L’ASPECT FINANCIER
Les 4 réactifs de lyse testés s’étalent sur une gamme de prix relativement large (passant du simple à un
prix 200 fois supérieur). NH4Cl est l’agent de lyse le moins cher, ce qui nous conforte dans l’idée de
garder cette lyse pour l’analyse des échantillons de routine. Quoiqu’il en soit, aucun des autres réactifs de
lyse testés ne présente un intérêt financier pour le laboratoire.
4.9. RÉSULTATS DU MYÉLOME MULTIPLE
Pour l’analyse des myélomes, le but n’est pas de comparer les MFI mais les pourcentages de cellules que
nous considérons comme plasmocytes. Une première sélection est effectuée sur l’histogramme
biparamétrique α-CD38 FITC/ α-CD45 KO, puis un deuxième sur l’histogramme biparamétrique α-CD38
FITC/ α-CD138 PE ciblé sur la première sélection de cellules. (cf. « Annexe 15 : exemples Kaluza »
page : 107).
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
% c
iblé
Echantillons
% ciblé sur α-CD38 FITC/α-CD45 KO
LSW NH4Cl
SLW NH4Cl
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4.10. DISCUSSION DES RÉSULTATS DU MYÉLOME MULTIPLE
Le premier graphique qui permet une première sélection des plasmocytes, montre des résultats proches
entre les 2 méthodes, exception faite de l’échantillon n°6. On constate cependant que les résultats obtenus
avec la méthode SLW ont tendance à être meilleurs.
Sur le deuxième graphique, permettant de confirmer que les cellules préalablement ciblées sont bien des
plasmocytes, on remarque clairement que les résultats obtenus avec la méthode SLW sont
systématiquement meilleurs ou équivalents à
ceux obtenus avec la méthode LSW.
Face à de tels résultats, nous nous sommes demandées si la méthode utilisée par le LCH n’altérait pas le
CD138. Dans ce cas, les pourcentages obtenus avec la méthode LSW seraient faussement diminués. Cette
théorie semble appuyée par le fait que de telles différences ne sont pas visibles sur le graphique « % ciblé
sur α-CD38 FITC/α-CD45 KO ».
5. CONCLUSIONS
5.1. CONCLUSIONS DE NOTRE TRAVAIL
Au terme de ce travail, après avoir testés 8 manières différentes de préparation d’un échantillon pour son
analyse sur l’appareil de CMF, nous pouvons tirer plusieurs conclusions.
Le constat général est que, parmi tous les protocoles étudiés, aucun ne semble se démarquer de celui
actuellement utilisé. En accord avec les résultats de notre travail, le laboratoire des moelles a donc décidé
de conserver le protocole actuel.
La préparation cellulaire idéale permettrait à la fois d’obtenir des MFI élevées, de conserver la
morphologie des leucocytes et de trouver des résultats de kappa/lambda corrects. Sur les 4 réactifs de lyse
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
% c
iblé
Echantillons
% ciblé sur α-CD38 FITC/α-CD138 PE
LSW NH4Cl
SLW NH4Cl
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52
testés, un seul semble ne pas pouvoir répondre à l’ensemble de ces critères. Il s’agit de la Facslyse. Cette
dernière altère considérablement la morphologie leucocytaire. De plus, les résultats obtenus étaient
fréquemment variables en fonction de la méthode (LSW ou SLW) utilisée. Quant aux 3 autres réactifs de
lyse testés, ils ne présentaient pas de problèmes majeurs et des investigations plus poussées ont été
nécessaires. Ces dernières consistaient en une approche plus statistique et une évaluation financière. Elles
n’ont pas permis de mettre en évidence des arguments qui inciteraient à changer le réactif de lyse
actuellement utilisé (NH4Cl).
Quant à la méthode SLW, elle présente l’inconvénient de ne pas permettre une analyse fiable des
kappa/lambda. Cet élément écarte définitivement l’idée de remplacer LSW par SLW, bien que cette
dernière présenterait un avantage financier. Pour ce qui est des MFI, aucune des 2 méthodes ne s’est
démarquée. Comme nous l’avions déjà évoqué, la réalisation du protocole SLW est légèrement plus
longue que celle du protocole LSW et présente le désavantage de ne pas permettre de rajouts en cours
d’analyse. LSW semble donc plus adapté au travail d’un laboratoire de diagnostic.
En ce qui concerne les MM, nous voyons 2 manières d’envisager la suite. La première consisterait à
adopter la méthode SLW pour les patients atteints de myélome. Dans ce cas, une adaptation de la part du
laboratoire serait nécessaire. Cette solution générerait, entre autre, une plus grande masse de travail pour
les TAB du laboratoire des moelles car, comme nous l’avons expliqué au point « 3.4.4. Protocole n°4 :
cytospin » (page : 36), un tube supplémentaire serait nécessaire pour l’obtention d’une image
morphologique interprétable. De plus, le laboratoire a effectué, ces dernières années, tout un travail
d’uniformisation des méthodes. (cf. « 1.2. Intérêt de ce sujet » page : 5). La seconde solution consisterait
à conserver le protocole actuellement utilisé, mais à cibler le graphique α-CD19 A700/α-CD56 PC5.5 à
partir du premier graphique (α-CD38 FITC/α-CD45 KO), en partant du principe que la population ciblée
sur le graphique α-CD38 FITC/α-CD45 KO est bien constituée de plasmocytes. L’intensité de l’ α-CD138
PE serait, semble-t-il, altérée lors de la préparation cellulaire, si bien qu’une partie de la population
plasmocytaire se retrouve dans la zone négative de l’histogramme α-CD38 FITC/α-CD138 PE.
L’histogramme α-CD19 A700/α-CD56 PC5.5 étant normalement ciblé à partir de l’histogramme α-CD38
FITC/α-CD138 PE, cette solution permettrait ainsi de ne pas perdre les éventuels plasmocytes se trouvant
dans la zone négative de l’histogramme CD38 FITC/CD138 PE. L’histogramme CD19 A700/CD56
PC5.5 est important car les plasmocytes malins n’expriment généralement plus le CD19. Pour une
meilleure compréhension, se référer à l’ « Annexe 15 : exemples Kaluza » (page : 107).
5.2. SUITES POSSIBLES À NOTRE TRAVAIL
Au terme de notre travail de diplôme, diverses perspectives sont envisageables. La première serait de
traiter encore quelques échantillons afin d’obtenir de grandes séries de données et de pouvoir tirer des
conclusions statistiques claires et significatives. A l’inverse, certaines données ont peu ou pas été
exploitées. Il pourrait être intéressant d’analyser cette série de données, mais le nombre de pages et le
temps autorisé pour ce travail de diplôme ne nous l’ont pas permis.
Dans ce travail, nous nous sommes contentées de comparer les MFI obtenues et de tirer des conclusions à
partir de ces observations. Comme nous l’avons déjà évoqué, il serait très intéressant de comprendre
pourquoi il existe des différences entre certains résultats. Il faudrait approfondir nos observations en
cherchant à expliquer les mécanismes qui expliquent les différences observées. Nous pensons notamment
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
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53
à éclaircir pourquoi la méthode SLW permet de mettre en évidence plus de plasmocytes que la méthode
LSW. Évidemment, nous avons émis quelques hypothèses : fragilité de l’antigène, plasmocytes détruits
durant l’étape de lyse, etc. Le but pourrait être maintenant de donner une réponse claire à ces diverses
questions.
5.3. CONCLUSIONS PERSONNELLES
Comme conclusion personnelle, nous souhaiterions dire que nous avons eu beaucoup de plaisir à réaliser
ce TD. Le sujet proposé était particulièrement intéressant et ce travail nous a permis de découvrir la CMF.
Nous avons notamment apprécié le fait de pouvoir travailler à deux. Nous nous sommes rendues compte
combien il était agréable de pouvoir gérer ensemble la partie analytique et la rédaction d’un tel travail. Ce
travail nous a également permis de percevoir la difficulté, pour un laboratoire, de mettre au point une
nouvelle méthode.
Nous avons rencontré quelques problèmes au moment de débuter notre TD, notamment à cause de réactifs
de lyse qui ont mis beaucoup de temps à nous parvenir. De plus, il n’a pas été facile de penser à tous les
paramètres dès le départ et nous avons certainement perdu un peu de temps inutilement. Nous avions 8
manières différentes de traiter un seul échantillon, il nous a donc fallu un peu de temps pour pouvoir
conjuguer la réalisation de ces différents protocoles de manière optimale.
Ce travail a nécessité une grande collaboration avec l’équipe du laboratoire des moelles. D’une part parce
que les échantillons utilisés provenaient de leur routine et d’autre part parce que nous utilisions les mêmes
appareils qu’eux. Nous avons donc dû apprendre à gérer notre temps en fonction de leur planning.
Quant à la rédaction de ce travail, nous avons trouvé que le plus difficile était de sélectionner les
informations pertinentes et indispensables à la compréhension. Comme nous étions 2 à rédiger, nous
avons dû faire attention à ne pas nous répéter. Au vu du nombre de données obtenues, du temps et du
nombre de pages à disposition, nous avons également mis beaucoup de temps à décider de la manière de
traiter nos résultats.
Mais aujourd’hui, nous en sommes convaincues, ce TD nous a beaucoup apporté et les éléments appris
nous seront utiles dans le cadre de notre future vie professionnelle au sein des laboratoires.
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
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6. REMERCIEMENTS
Nous tenions à remercier chaleureusement tout le personnel du laboratoire central d’hématologie du
CHUV pour leur aide et leur soutien lors de la réalisation de notre TD.
Un grand merci à l’équipe du laboratoire des moelles. Nous avons apprécié l’intérêt qu’ils ont porté à
notre travail, leur disponibilité et tous leurs précieux conseils. Cela a été un plaisir de travailler quelques
semaines à leurs côtés. Nous tenions à remercier particulièrement M. Valentin Carfagno pour ses
corrections, son aide et les conseils donnés pour la mise en page de ce document.
Nous remercions aussi Mme Gnaegi de la firme Beckman Coulter qui nous a fourni gratuitement une
partie des réactifs de lyse utilisés pour notre travail de diplôme.
Nous aimerions également remercier M. Frédéric Bauer pour avoir consacré du temps à la relecture de
notre travail. Ses suggestions étaient toujours pertinentes.
Un merci tout particulier à M. Stéphane Quarroz qui nous a soutenues et s’est beaucoup impliqué tout au
long de ce travail de diplôme. Il a fait preuve d’une grande gentillesse et d’une patience remarquable.
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
55
7. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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06.11.2013)
[2] CHUV. (23.10.2013). CHUV Départements des laboratoires. [Page Web]. Accès:
http://www.chuv.ch/dml (Page consultée le 06 11 2013)
Chemin : Service d'hématologie (LCH) → Domaines d'activités
[3] Cours de Quarroz, S. (05.2013). La cytométrie : Mode opératoire. Lausanne CHUV
[4] Ronot, X. Grunwald, D. Mayol, J-F et Boutonnat, J. (2006). La cytométrie en flux. Paris: Editions
TEC & DOC
[5] Kalina, T. Flores-Montero, J. van der Velden, V. Martin-Ayuso, M. Böttcher, S. Ritgen, M. Almeida,
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[6] Leach,M. Drummond, M. et Doig, A. (2013). Practical Flow Cytometry in Haemotology Diagnosis.
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[7] Cours de Spertini, O. (19.09.2013) Leucémies aiguës. Lausanne:CHUV
[8] L'Italien, R.et Lord Dubé, H. (1998). Hématologie. (2ème édition) Québec: Les éditions Le Griffon
d'argile
[9] Swerdlow, S.H. Campo, E. Lee Harris, N. Jaffe, E. S. Pileri, S. A. Stein, H. Thiele, J. et Vardiman, J.
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[10] Gérard, S. (1998). Hématologie clinique et biologique. France: Arnette
[11] Laboratoire Central d' Hématologie. (19.02.2013). Marqueurs immunologiques - NAVIOS - Choix
d'un panel d'Ac. (Version 2.0)( Vdoc: LCH HSP 32 PR 085). Lausanne: CHUV
[12] Laboratoire Central d'Hématologie. (14.11.2012). Marqueurs immunologiques - Principes, Matériel
et Réactifs (Version 7.0) (Vdoc: LCH HSP PR 023). Lausanne: CHUV
[13] Laboratoire Central d'Hématologie. (10.06.2013). Marqueurs immunologiques - Préparations
cellulaires (Version 6.0) (Vdoc: LCH HSP 32 PR 018). Lausanne:CHUV
[14] Laboratoire Central d'Hématologie. (13.03.2013) Stabilité et conservation des échantillons avant
analyse (Version: 3.0) ( Vdoc: LCH LCH 31 FO 002) Lausanne: CHUV
[15] Cours de Bystranowski, G. (2011). Immunologie: FPA 2ème année. Lausanne: ESsanté
[16] Cours de Quarroz, S. (2013). Cytométrie de flux : Rappels Immunologiques. Lausanne: CHUV.
[17] Cours de Quarroz, S. (2013). Cours cytémétrie de flux. Lausanne: CHUV
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
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56
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(Page consultée le 15 11 2013).
[19] C. Duperray, Bienvenue sur CYTOBASE - Service de cytométrie en flux de l'Institut de Recherche en
Biothérapie. [Page Web]. Accès: http://cytobase.montp.inserm.fr/. (Page consultée le 19.11.2013).
Chemin: La cytométrie qu'est-ce que c'est → un document word
[20] C. Duperray, Bienvenue sur CYTOBASE - Service de cytométrie en flux de l'Institut de Recherche en
Biothérapie. [Page Web]. Accès: http://cytobase.montp.inserm.fr/. (Page consultée le 19.11.2013).
Chemin: La cytométrie qu'est-ce que c'est → une présentation Power Point
[21] Cours de Quarroz, S. (2013). Cytométrie de flux : Interprétation des histogrammes. Lausanne:
CHUV
[22] Ortolani, C. (2011). Flow Cytometry of Hematological Malignancies. Singapour: WILEY-
BLACKWELL
[23] Cours de Gregoretti, C. Cytométrie de flux. Lausanne: ESsanté.
[24] Phillips, W. Hosking, C. et Shelton, M. (07.1983). Journal of Clnical Pathology [Page Web]. Accès:
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[25] Becton Dickinson and Company. (01.2010). Solution de Lyse BD FACS Cencentré 10x San José:
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[26] Beckman Coulter.(05.09.2012). VersaLyse Lysing Solution France: IMMUNOTECH SAS
[27] Beckman Coulter. (2011). Lysing Solution IOTest 3 10x concentrate, France: IMMUNOTECH SAS
[28] Laboratoire Central d'Hématologie (14.11.2012). Romabowsky pour Cytospin (Version 2.1) (Vdoc
LCH HSP 32 PR 025 ) Lausanne: CHUV .
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
57
8. ICONOGRAPHIE
Figure n°1 : Cours de Gregoretti, C. Leucocytes. (diapositive : 3) Lausanne : ESsanté
Figure n°2 : Swerdlow, S. H. Campo, E. Lee Harris, N. Jaffe, E. S. Pileri, S. A. Stein, H. Thiele J. et
Vardiman J. W. (2008). WHO Classification of tumours of Haematopoetic and Lymphoid Tissues (4th
Edition) (pages : 10 à 13). Lyon: International Agency for Research on Cancer
Figure n°3: Swerdlow, S. H. Campo, E. Lee Harris, N. Jaffe, E. S. Pileri, S. A. Stein, H. Thiele J. et
Vardiman J. W. (2008). WHO Classification of tumours of Haematopoetic and Lymphoid Tissues (4th
Edition) (page : 203). Lyon: International Agency for Research on Cancer
Figure n°4 : Cours de Rosselet, A. (05.09.2013). Lymphomes malins (1. (diapositive : 58). Lausanne :
ESsanté
Figure n°5 à n°11 : Photographies personnelles
Figure n°12 : Réalisée personnellement, inspirée du Cours de Quarroz S. (mai 2013) Cytométrie – Mode
opératoire (diapositive : 26). Lausanne : CHUV
Figure n°13 : Cours de Bystranowski G. (09.2011). Les molécules du système immunitaire. (diapositive :
9). Lausanne : ESsanté
Figure n°14 : ZeSchool-Le savoir c’est vous. (14.06.2012). ZeSchool- Le savoir c’est vous. [Page Web]
Accès : http://zeschool.com (Page consultée le 12.12.2013)
Chemin : SVT Immunologie Le système immunitaire
Figure n°15 : Cours de Quarroz S. (05.2013) Cytométrie – Mode opératoire (diapositive : 13).
Lausanne : CHUV
Figure n°16 : Cours de Quarroz S. (05.2013) Cytométrie – Mode opératoire (diapositive : 14).
Lausanne : CHUV
Figure n°17 : Cours de Quarroz S. (05.2013) Cytométrie – Mode opératoire (diapositive : 15).
Lausanne : CHUV
Figure n°18 : Ronot, X. Grunwald, D. Mayol, J.-F. and Boutonnat, J. (2006). La cytométrie en flux
(page : 48). Paris : Editions TEC & DOC.
Figure n°19 : Métézeau, P. Miglierina, R. & Ratinaud, M-H. (1994). La cytométrie en flux – Guide
pratique de la préparation à l’analyse des cellules. (page : 19). France : Edition PULIM Presses de
l’Université de Limoges.
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
58
Figure n°20 : Leach, M. Drummond, M. & Doig, A. (2013). Practical Flow Cytometry in Haematology
Diasgnosis (page : 4). India: Editions Wiley Blackwell
Figure n°21 : Ronot, X. Grunwald, D. Mayol, J.-F. and Boutonnat, J. (2006). La cytométrie en flux
(page : 6). Paris : Editions TEC & DOC.
Figure n°22 : Ronot, X. Grunwald, D. Mayol, J.-F. and Boutonnat, J. (2006). La cytométrie en flux
(page : 7). Paris : Éditions TEC & DOC.
Figure n°23 : Blin, M. (date introuvable). Imagif-La plateforme du vivant-expertise et technologies pour
l’étude du vivant. [Page Web] Accès : https://www.imagif.cnrs.fr (Page consultée le 12.12.2013)
Chemin : Pôle de Biologie Cellulaire : Plateforme de Cytométrie
Figure n°24 : Cours de S. Quarroz (05.2013). La cytométrie de flux (diapositive : 11). Lausanne : CHUV
Figure n°25 : Grégori, G. (22.10.2013). PRECYM : Plate-forme Régionale de Cytométrie pour la
Microbiologie [Page Web]. Accès : http://www.com.univ-mrs.fr/PRECYM/ (page consultée le
20.11.2013) (diapositive : 18)
Chemin : Formation & cours / training Diaporamas Introduction à la cytométrie en flux Principes
de la cytométrie en flux
Figure n°26 : Grégori, G. (22.10.2013). PRECYM : Plate-forme Régionale de Cytométrie pour la
Microbiologie [Page Web]. Accès : http://www.com.univ-mrs.fr/PRECYM/ (page consultée le
20.11.2013) (diapositive : 19)
Chemin : Formation & cours / training Diaporamas Introduction à la cytométrie en flux Principes
de la cytométrie en flux
Figure n°27 : Grégori, G. (22.10.2013). PRECYM : Plate-forme Régionale de Cytométrie pour la
Microbiologie [Page Web]. Accès : http://www.com.univ-mrs.fr/PRECYM/ (page consultée le
20.11.2013) (diapositive : 21)
Chemin : Formation & cours / training Diaporamas Introduction à la cytométrie en flux Principes
de la cytométrie en flux
Figure n°28 : Grégori, G. (22.10.2013). PRECYM : Plate-forme Régionale de Cytométrie pour la
Microbiologie [Page Web]. Accès : http://www.com.univ-mrs.fr/PRECYM/ (page consultée le
20.11.2013) (diapositive : 27)
Chemin : Formation & cours / training Diaporamas Introduction à la cytométrie en flux Principes
de la cytométrie en flux
Figure n°29 : Métézeau, P. Miglierina, R. & Ratinaud, M-H. (1994). La cytométrie en flux – Guide
pratique de la préparation à l’analyse des cellules. (page : 28). France : Edition PULIM Presses de
l’Université de Limoges.
Figure n°30 : Image tirée des échantillons de la routine
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
59
Figure n°31 : Cours de Quarroz, S. (05.2013). Interprétation des histogrammes. (diapositive : 23).
Lausanne : CHUV
Figure n°32 : Cours de Quarroz, S. (05.2013). Interprétation des histogrammes. (diapositive : 24).
Lausanne : CHUV
Figure n°33 : Institut de recherche en biothérapies du CHU de Montpellier, (date introuvable). Bienvenue
sur CYTOBASE, Service de cytométrie en flux de l’institut de recherche en biothérapie [Page Web].
Accès : http://cytobase.montp.inserm.fr/ (Page consultée le 19.11.2013)
Chemin : la cytométrie, qu’est-ce que c’est ? Un document word
Figure n°34 : histogramme tiré d’une de nos analyses et annoté par nos soins selon le Cours Quarroz, S.
(05.2013) Interprétation des histogrammes (diapositive : 29). Lausanne : CHUV
Figure n°35 : Image tirée des échantillons de la routine et retouchée par nos soins
Figure n°36 : Image tirée des échantillons de la routine
Figure n°37 : Cours de Quarroz, S. (05.2013). Interprétation des histogrammes. (diapositive : 11).
Lausanne CHUV / Image tirée d’un échantillon de la routine
Figure n°38 : Image tirée des échantillons de la routine
Figure n°39 : Cours de Quarroz, S. (05.2013). Interprétation des histogrammes. (diapositive : 12).
Lausanne : CHUV / Image tirée d’un échantillon de la routine
Figure n°40 à n°41 : Images tirées des échantillons de la routine
Figure n°42 : Cours de Quarroz, S. (05.2013). Interprétation des histogrammes. (diapositive : 15).
Lausanne : CHUV
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
60
9. LEXIQUE
α-…
anti-…
A700
Alexa Fluor 700.
A750
Alexa Fluor 750.
Allogénique
Provenant de la même espèce, mais pas du même individu.
Amine cyclique
Molécule organique contenant de l’azote et dérivée de l’ammoniac.
Anhydrase Carbonique
Enzyme qui permet la réaction suivante : H2O + CO2 ↔ H2CO3 ↔ HCO3- + H
+. Cette enzyme se trouve à
la surface des érythrocytes.
APC
AlloPhycoCyanine.
CD34
Antigène présent à la surface des cellules hématopoïétiques immatures (blastes).
Cryoglobuline
Immunoglobuline caractérisée par sa propriété de précipiter à froid (inférieur à 37°C) et non à chaud.
Cytospin
Appareil permettant, par cytocentrifugation, de concentrer les cellules sur une petite pastille d’une lame
porte-objet.
ECD
PhycoErythrin lié au Texas Red.
Électrophorèse des protéines
Technique de laboratoire permettant, grâce à un champ électrique, la séparation des protéines en 6
fractions distinctes : Albumine, alpha1 globuline, alpha2 globuline, bêta1 et bêta2 globulines et gamma
globuline.
FITC
Fluorescein IsoThyocyanate Conjuguée.
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61
Hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN)
Maladie hématologique causée par la mutation du gène PIG-A. Cette maladie cause une anémie
hémolytique corpusculaire.
Immunofixation
Technique de laboratoire utilisant le principe de la précipitation pour révéler une immunoglobuline
monoclonale. L’immunofixation permet la typisation d’une immunoglobuline monoclonale (classe
d’immunoglubulines et type de chaînes légères).
KO
Krome Orange.
Laser
Source lumineuse ayant pour caractéristique d’émettre une lumière unidirectionnelle et
monochromatique.
PB
Pacific Blue.
PC5.5
PhycoErythrin en liaison covalente cyanine 5.5.
PC7
PhycoErythrin en liaison covalente cyanine 7.
PE
PhycoErythrin.
Phénotypique
Le phénotype est l’expression du génotype.
Photons
Particule qui compose la lumière. La lumière peut se définir de 2 façons, soit par un ensemble de
longueurs d’onde, soit par des particules appelées photons.
Pink test
Test utilisé pour le dépistage de la sphérocytose héréditaire. La sphérocytose héréditaire est une anomalie
corpusculaire du globule rouge. Ce dernier prend une forme sphérique caractéristique, le rendant plus
fragile qu’un globule rouge normal.
Test de falciformation
Test utilisé pour le dépistage de la drépanocytose. La drépanocytose est une maladie héréditaire touchant
les globules rouges. Cette pathologie est due à une anomalie structurelle de la chaîne bêta de la globine.
Les érythrocytes prennent une forme caractéristique de faucille (=drépanocyte).
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62
10. ANNEXES
ANNEXE 1 : TRAÇABILITÉ
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)
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)
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ANNEXE 2 : SOLUTIONS DE TRAVAIL
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)
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ANNEXE 3 : FACSLYSE
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)
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)
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)
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)
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)
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)
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ANNEXE 4 : VERSALYSE
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)
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)
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)
74
ANNEXE 5 : IOTEST
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)
75
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)
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ANNEXE 6 : COLORATION ROMANOWSKY
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)
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)
78
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)
79
ANNEXE 7 : GIEMSA
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)
80
ANNEXE 8 : LA FABRICATION DES ANTICORPS
Les anticorps utilisés en CMF sont des anticorps monoclonaux achetés sur le marché et produits par des
firmes.
La première étape consiste à immuniser une souris avec l’antigène contre lequel un anticorps doit être
produit. Parallèlement, une culture de cellules cancéreuses est effectuée. Quelques temps après
l’immunisation, la rate de la souris est prélevée. Ce sont plus précisément les lymphocytes B qu’elle
contient qui sont importants. Les lymphocytes B de la souris et les cellules cancéreuses sont ensuite
incubées ensemble afin qu’il y ait une fusion. Le but étant de fabriquer des hybridomes. Puis, une culture
est effectuée dans une plaque multi puits.
Il est fait en sorte qu’une seule cellule
soit inoculée par puits dans un milieu
spécial (= sélection par dilution limite).
Le milieu de culture est un milieu HAT
(milieu de culture sélectif spécifique
pour la fabrication des anticorps). Les
lymphocytes B meurent dans ce milieu,
car ils n’ont pas la capacité de se
reproduire indéfiniment. Les cellules
cancéreuses meurent également. Elles
n’ont pas la capacité de survivre dans ce
milieu HAT car leur gène HGPRT n’est
pas fonctionnel. Seuls les hybridomes
peuvent survivre et se multiplier. Ils
survivent, car ils ont gardé la
fonctionnalité du gène HGPRT
provenant du lymphocyte B, et se
multiplient, car ils ont gardé cette
capacité provenant de la cellule
cancéreuse. Une dizaine de jours plus
tard, on recherche la présence
d’anticorps dirigés contre l’antigène
avec lequel la souris a été immunisée.
Les hybridomes peuvent être conservés
dans de l’azote liquide.
Source : ESsanté. (2011). METHODOLOGIE : CFC Laborantins orientation biologie (page : 7)
Figure : La fabrication des anticorps monoclonaux.
Source : Cours de Quarroz S. (mai 2013) Cytométrie de flux : Rappels immunologiques.
Lausanne : CHUV. (Diapositive : 16)
Ag inoculé à une souris
Prélèvement de la rate
Suspension de lympho B
plasmocytesmutants provenantde myélome
culture
Suspension deplasmocytes malins
Fusion des 2 typescellulaires= formation d'hybridome
Transfert descellules en milieudéficient (HAT)
Les hybridomes vontse multiplier - mortdes autres cellules
Culture à grande échelledes hybridomes quiproduisent l'ac recherché
PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX
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)
81
ANNEXE 9 : FLUOROCHROMES
Voici un exemple de quelques fluorochromes avec leur longueur d’onde d’excitation et d’émission ainsi
que le laser utilisé pour les exciter.
Figure : exemple de fluorochromes.
Source : Cours de Quarroz S. (mai 2013). Cytométrie de flux : Rappels immunologiques. Lausanne : CHUV. (Diapositive : 20)
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)
82
ANNEXE 10 : PRÉPARATION POUR LA CMF
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)
86
ANNEXE 11 : COMPTAGE
Conformément au protocole du LCH, lors de l’étape de marquage, la concentration cellulaire des
suspensions doit idéalement se situer entre 1 et 5 millions de cellules par ml.
La concentration des suspensions cellulaires est évaluée à l’aide de diverses chambres de comptage. En
exemple, voici une représentation d’une chambre de Türk.
Figure : chambre de comptage
Source : image réalisée personnellement
On compte les leucocytes se trouvant dans les parties grisées du schéma ci-dessus et on multiplie ensuite
le résultat obtenu par 10'000 pour obtenir la concentration cellulaire en cellules/ml de l’échantillon. Voici
l’explication de ce calcul :
Surface de la chambre : 9.0 mm2
Profondeur de la chambre : 0.1 mm
Volume de la chambre 0.9 mm3
On compte les cellules dans un volume de 0.1 mm3 (1 mm x 1 mm x 0.1 mm). En multipliant ce résultat
par 10, on obtient donc le nombre de cellules par mm3 de l’échantillon (1 mm
3 = 1μl). Puis, en multipliant
encore ce résultat par 1000, on obtient le nombre de cellules/ml de l’échantillon (1000 μl = 1 ml). On
multiplie donc finalement le nombre de cellules comptées par 10'000. Le résultat doit encore être
multiplié par l’inverse de la dilution s’il a été nécessaire d’en effectuer une, notamment pour le protocole
SLW où les cellules ont été diluées 10x avec le réactif Leucostase.
Évidemment, il est possible d’adapter le volume dans lequel on compte les cellules en fonction de la
concentration cellulaire. Le calcul se trouve naturellement modifié.
Source : Marqueurs immunologiques - Préparations cellulaires LCH HSP 32 PR 018 version 6.0
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)
87
ANNEXE 12 : LISTE DES ÉCHANTILLONS TRAITÉS
No
m
Da
te
Pré
lèv
emen
t
Qu
an
tité
uti
lisé
e (μ
l)
Pa
nel
Tu
bes
Mét
ho
de
Ly
se
Co
mp
tage
(mil
lio
ns
de
c/m
l)
Dil
uti
on
/
Co
nce
ntr
ati
on
TD essai 0 31.10.2013 Moelle 40 MM1 + MM2 SLW NH4Cl 1)
TD essai 1 04.11.2013 Sang
1 A + B + C + D SLW
NH4Cl
Facslyse
LSW NH4Cl
Facslyse
TD essai 2 05.11.2013 Moelle 300 40 MM1 + MM2 SLW
NH4Cl
Facslyse
LSW NH4Cl
Facslyse
TD essai 3 06.11.2013 Sang 500 3 A + F + M SLW
NH4Cl 5.2 -
Facslyse 4 -
LSW Facslyse 8.8 /2 1)
TD essai 4 08.11.2013 Moelle 300 40 MM2 SLW
NH4Cl 13.3 /3
Facslyse 11.4 /3
LSW Facslyse 8.8 /2
TD essai 5 08.11.2013 Moelle 300 40 MM2 SLW
NH4Cl 1.1 -
Facslyse
LSW Facslyse 1.8 - 1)
TD essai 6 08.11.2013 Moelle 300 40 MM2 SLW
NH4Cl 3.3 -
Facslyse
TD essai 7 12.11.2013 Moelle 300 11 A + G SLW
NH4Cl 2.5 -
Facslyse
LSW Facslyse 2.18 - 1)
TD essai 8 14.11.2013 Moelle 300 40 MM2
SLW
NH4Cl
0.9 x2
Facslyse
IOTest
600
LSW
NH4Cl 1.42 -
Facslyse 2.51 -
IOTest 2.36 -
TD essai 9 19.11.2013 Sang 500 11 A + G SLW
Facslyse 2.5 -
NH4Cl
LSW Facslyse 3.8 - 1)
TD essai 10 19.11.2013 Moelle 300 11 A + G SLW
Facslyse 21.4 /5
NH4Cl
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
88
LSW Facslyse 22 /5 1)
TD essai 11 20.11.2013 Moelle 500 40 MM2 SLW
Facslyse 1.6 -
NH4Cl
LSW Facslyse 2.56 - 1)
TD essai 12 20.11.2013 Moelle 500 40 MM2 SLW
Facslyse 6.3 oublié
NH4Cl
LSW Facslyse 6.08 /2 1)
TD essai 13 21.11.2013 Sang 500 11 A + G SLW
Versalyse 3.5 -
NH4Cl
LSW Versalyse 5.38 - 1)
TD essai 14 22.11.2013 Sang 500 3 A + F SLW
Versalyse 0.9 x2
NH4Cl
LSW Versalyse 2.3 - 1)
TD essai 15 22.11.2013 Moelle 300 3 A + F SLW
Versalyse 27.1 /6
NH4Cl
LSW Versalyse 22.4 /5 1)
TD essai 16 22.11.2013 Sang 500 3 A + F SLW
Versalyse 4.2 -
NH4Cl
LSW Versalyse 6 /2 1)
TD essai 17 22.11.2013 Sang 500 11 A + G SLW
Versalyse 2 -
NH4Cl
LSW Versalyse 2.12 - 1)
TD éch 1 26.11.2013 Moelle 300 40 MM2
SLW
NH4Cl
0.7 x3
2)
Facslyse
Versalyse
IOTest
LSW
NH4Cl 0.68 x2
Facslyse 0.41 x3
Versalyse 0.6 x3
IOTest 0.3 x3
TD éch 2 29.11.2013 Moelle 300 3 A + F
SLW
NH4Cl
11 /2.5
Facslyse
Versalyse
IOTest
LSW
NH4Cl 12.3 /3
Facslyse 8.9 /2
Versalyse 12.3 /3
IOTest 9.6 /2
TD éch 3 02.12.2013 ? 400 1 A + B
SLW
NH4Cl
5.5 -
Facslyse
Versalyse
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
89
IOTest
LSW
NH4Cl 8.8 /2
3) Facslyse 6.08 /2
Versalyse 5.28 -
IOTest 5.28 -
TD éch 4 03.12.2013 Sang 500 1 D
SLW
NH4Cl
0.5 x2
Facslyse
Versalyse
IOTest
LSW
NH4Cl 0.96 x2
3) Facslyse 1.47 x2
Versalyse 1.24 x2
IOTest 1.45 x2
TD éch 5 04.12.2013 Moelle 300 1 B
SLW
NH4Cl
1.5 x2
Facslyse
Versalyse
IOTest
LSW
NH4Cl 0.7 x2
Facslyse 0.91 x2
Versalyse 1.07 x2
IOTest 0.97 x2
TD éch 6 04.12.2013 Sang 100
0
1 B
SLW
NH4Cl
6 /2
Facslyse
Versalyse
IOTest
LSW
NH4Cl 7.36 /2
Facslyse 7.68 /2
Versalyse 8.8 /2
IOTest 7.2 /2
TD éch 7 05.12.2013 Sang 100
0
1 B
SLW
NH4Cl
0.6 x3
Facslyse
Versalyse
IOTest
LSW
NH4Cl 2.2 Resus-
pendu
dans
200 µl
Facslyse 2.64
Versalyse 3.4
Iotest 2.2
TD éch 8 06.12.2013 Sang 100
0
11 G
SLW
NH4Cl
0.9 x2
Facslyse
Versalyse
Iotest
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)
90
LSW
NH4Cl 2.8 Resus-
pendu
dans
200 µl
Facslyse 2.4
Versalyse 3
Iotest 3.08
TD éch 9 09.12.2013 Moelle 300 3 F
SLW
NH4Cl
7.3
/2
(resus-
pendu
dans
400
µl)
Facslyse
Versalyse
Iotest
LSW
NH4Cl 2.2 -
Facslyse 3.6 -
Versalyse 3.72 -
Iotest 2.25 -
TD éch 10 09.12.2013 Sang 400 1 B
SLW
NH4Cl
0.8
(resus-
pendu
dans
400
µl)
Facslyse
Versalyse
Iotest
LSW
NH4Cl 2.48 (resus-
pendu
dans
150
µl)
Facslyse 1.8
Versalyse 1.64
Iotest 1.76
TD éch 11 11.12.2013 Moelle 300 40 MM2
SLW
NH4Cl
16.4 /4
Facslyse
Versalyse
Iotest
LSW
NH4Cl 16 /4
Facslyse 16 /4
Versalyse 11.2 /3
Iotest 11.2 /3
TD éch 12 11.12.2013 Sang 800 1 D
SLW
NH4Cl
10 /2
Facslyse
Versalyse
Iotest
LSW
NH4Cl 15.2 /3
Facslyse 13.6 /3
Versalyse 12.8 /3
Iotest 13.6 /3
TD éch13 12.12.2013 Moelle 300 3 F
SLW
NH4Cl
20.9 /5
Facslyse
Versalyse
Iotest
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)
91
LSW
NH4Cl 4 -
Facslyse 4 -
Versalyse 4.8 -
Iotest 4.8 -
TD éch 14 12.12.2013 Sang 300 1 D
SLW
NH4Cl
8.4 /2
Facslyse
Versalyse
Iotest
LSW
NH4Cl 5 -
Facslyse 5 -
Versalyse 4.8 -
Iotest 4 -
TD éch 15 08.01.2014 Moelle 300 40 MM2 LSW NH4Cl 1.5 - 1)
TD éch 16 10.01.2014 Moelle 300 40 MM2 SLW NH4Cl 1.5 -
LSW NH4Cl 0.2 x4
1) L'échantillon LSW NH4Cl a été traité par les TAB du laboratoire des moelles
2) Appareil de CMF en panne, l'échantillon a été fixé. Il n'est pas pris en compte pour les résultats.
3) Une cytospin a été effectuée
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)
92
ANNEXE 13 : DÉTAIL DES PANELS UTILISÉS
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)
93
ANNEXE 14 : RÉSULTATS BRUTS
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)
94
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)
95
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)
96
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)
97
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)
98
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)
99
ANNEXE 15 : EXEMPLES KALUZA
Exemple Kaluza MFI α-CD2 APC, α-CD3 A750, α-CD4 PE, α-CD8 PB, α-CD45 KO, α-CD56
PC5.5, α-HLA DR ECD. Provient d’un tube B.
MFI
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)
100
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)
101
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)
102
Exemple Kaluza MFI α-CD19 PC5.5, α-HLA DR PC7. Provient d’un tube F.
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)
103
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)
104
Exemple Kaluza MFI α-CD19 A700, α-kappa FITC, α-lambda PE. Provient d’un tube D.
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)
105
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)
106
Exemple Kaluza MFI α-CD13 FITC. Provient d’un tube F.
Attention, pour les α-CD13 FITC, le « gating » a dû être déplacé sur les neutrophiles afin d’obtenir des
valeurs positives.
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)
107
Exemple Kaluza % de plasmocytes ciblés sur les histogrammes 38 FITC/45 KO et sur 38FITC/138
PE. (Myélome multiple).
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)
108
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)
109
ANNEXE 16 : DONNÉES DES GRAPHIQUES DE COMPARAISON DES MFI
MFI α-CD2 APC
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)
110
MFI α-CD3 A750
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)
111
MFI α-CD4 PE
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)
112
MFI α-CD8 PB
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)
113
MFI α-CD13 FITC
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)
114
MFI α-CD19 A700
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)
115
MFI α-CD19 PC5.5
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)
116
MFI α-CD45 KO
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)
117
MFI α-CD56 PC5.5
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)
118
MFI α-HLA DR ECD
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)
119
MFI α-kappa FITC
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)
120
MFI α-lambda PE
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)
121
ANNEXE 17 : DONNÉES UTILISÉES POUR LES CORRÉLATIONS
MFI α-CD2 APC
MFI α-CD3 A750
MFI α-CD4 PE
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)
122
MFI α-CD8 PB
MFI α-CD13 FITC
MFI α-CD19 PC5.5
Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème
)
123
MFI α-CD45 KO
MFI α-CD56 PC5.5
MFI α-HLADR ECD
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)
124
MFI α-HLADR PC7