Pou l’o te vtio v du G ade de

THÈSE

Pour l'obtention du grade deDOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS

UFR des sciences fondamentales et appliquéesLaboratoire Signalisation et transports ioniques membranaires - STIM (Poitiers)

(Diplôme National - Arrêté du 25 mai 2016)

École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé (Limoges)Secteur de recherche : Aspects moléculaire et cellulaire de la biologie

Présentée par :Oualid Ayad

Caractérisation fonctionnelle des cellules souchescardiaques humaines dans un but thérapeutique

Directeur(s) de Thèse :Patrick Bois, Aurélien Chatelier

Soutenue le 12 décembre 2017 devant le jury

Jury :

Président Valérie Coronas Professeur des Universités, Université de Poitiers

Rapporteur Emmanuel Deval Chargé de recherche CNRS, Université de Nice-Sophia Antipolis

Rapporteur Christophe Vandier Professeur des Universités, Université de Tours

Membre Patrick Bois Professeur des Universités, Université de Poitiers

Membre Aurélien Chatelier Maître de conférences, Université de Poitiers

Membre Anne Aries Chercheur, Institut de recherche en hématologie et transplantion,Mulhouse

Pour citer cette thèse :Oualid Ayad. Caractérisation fonctionnelle des cellules souches cardiaques humaines dans un but thérapeutique[En ligne]. Thèse Aspects moléculaire et cellulaire de la biologie. Poitiers : Université de Poitiers, 2017. Disponiblesur Internet <http://theses.univ-poitiers.fr>

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THESE

Pou l’o te tio du G ade de

DOCTEUR DE L’UNIVER“ITE DE POITIER“

(Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées) (Diplôme National - Arrêté du 25 mai 2016)

Ecole Doctorale : Biologie-santé

Secteur de Recherche : Aspects moléculaire et cellulaire de la biologie

Présentée par :

Oualid AYAD

************************

Caractérisation fonctionnelle des cellules souches cardiaques humaines dans un but thérapeutique

************************

Directeurs de Thèse : Pr. Patrick Bois & Dr. Aurélien Chatelier

************************

Soutenue le 12 décembre 2017

De a t la Co issio d’E a e

************************

JURY C. VANDIER Professeur, Université de Tours Rapporteur E. DEVAL CR CNRS, IPMC, Nice Rapporteur A. ARIES Chercheur, IRHT, Mulhouse Examinateur V. CORONAS Professeur, Université de Poitiers Examinateur A. CHATELIER MCU, Université de Poitiers Examinateur P. BOIS Professeur, Université de Poitiers Examinateur

Sommaire

1

SOMMAIRE

TABLE DES ILLUSTRATIONS ...................................................................................................................... 8

ABREVIATIONS ....................................................................................................................................... 12

INTRODUCTION ..................................................................................................................................... 16

Chapitre I : Cellules souches et régénération tissulaire ........................................................................ 16

1 Historique ...................................................................................................................................... 16

2 Propriétés des cellules souches ..................................................................................................... 17

2.1 L’auto-renouvellement .......................................................................................................... 17

2.2 Pouvoir de différenciation en plusieurs lignages cellulaires ................................................. 18

3 Types et potentiels de différenciation des cellules souches humaines : ...................................... 19

3.1 Les cellules souches embryonnaires (CSEs) : ......................................................................... 20

3.1.1 Les cellules souches totipotentes : ................................................................................ 20

3.1.2 Les cellules souches pluripotentes : .............................................................................. 21

3.2 Les cellules souches adultes: ................................................................................................. 21

3.2.1 Les cellules souches hématopoïétiques (CSHs) ............................................................. 22

3.2.2 Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) .......................................................... 24

3.2.3 Les cellules souches du tissu adipeux ............................................................................ 27

3.2.4 Les cellules progénitrices endothéliales ........................................................................ 27

3.2.5 Les ellules sou hes de l’ pith liu i testi al : ............................................................ 29

3.2.6 Les ellules sou hes de l’ pide e ............................................................................... 31

3.2.7 Les ellules sou hes de l’ pith liu pul o ai e .......................................................... 32

3.2.8 Les cellules souches de la cornée et de la rétine .......................................................... 33

3.2.9 Les cellules souches/progénitrices hépatiques ............................................................. 35

3.2.10 Les cellules souches neurales (CSNs) du système nerveux central ............................... 36

3.2.11 Les cellules souches musculaires squelettiques ............................................................ 39

3.2.12 Les cellules souches cardiaques .................................................................................... 41

Chapitre II : Cellules souches et progéniteurs cardiaques .................................................................... 43

1 Nature des cellules souches cardiaques ........................................................................................ 43

2 Types des cellules souches cardiaques.......................................................................................... 45

2.1 Les CSCs c-kit positives (CSC c-kit+) ........................................................................................ 45

2.2 Les CSCs Sca1 positives (CSC Sca1+) ....................................................................................... 48

2.3 Les CSCs Isl-1 positives (CSCs Isl-1+)....................................................................................... 50

2.4 Les CSCs BCRP+ positives side-population (BCRP+ SP) ........................................................... 51

Sommaire

2

2.5 Les cellules dérivées des cardiosphères (CDCs) .................................................................... 53

2.6 Les CSCs W8B2 positives (CSC W8B2+) .................................................................................. 54

3 Modulateurs de la différenciation in vitro des CSCs adultes en cardiomyocytes ......................... 56

3.1 La 5-azacytidine ..................................................................................................................... 57

3.2 Le TGF-b: ................................................................................................................................ 58

3.3 L’a ide as o i ue : ............................................................................................................... 59

3.4 L’a ide ti oï ue : ................................................................................................................ 60

3.5 La dexaméthasone :............................................................................................................... 61

3.6 L’o to i e: ........................................................................................................................... 61

Chapitre III : Physiologie des cellules souches /progéniteurs cardiaques ............................................. 62

1 Le calcium : .................................................................................................................................... 62

1.1 Le calcium dans les cellules souches: .................................................................................... 62

1.1.1 L’a ti it al i ue spo ta e da s les ellules sou hes: .............................................. 63

1.1.2 Canaux VGCC et signalisation calciques ........................................................................ 64

1.1.3 Les stocks calciques intracellulaires dans les cellules souches: .................................... 67

1.2 Le calcium dans les cellules souches/progéniteurs cardiaques: ........................................... 67

2 Les canaux ioniques : ..................................................................................................................... 70

2.1 Les canaux ioniques dans les CSEs: ....................................................................................... 70

2.2 Les canaux ioniques dans les CSMs: ...................................................................................... 71

2.3 Les canaux ioniques dans les cellules souches/progéniteurs neurales: ................................ 72

2.4 Les canaux ioniques dans les CSCs: ....................................................................................... 73

3 Rôles des canaux ioniques dans la régulation de la prolifération et/ou la différenciation des

cellules souches: .................................................................................................................................... 73

3.1 Prolifération ........................................................................................................................... 73

3.2 Différenciation : ..................................................................................................................... 75

POSITION DU PROBLEME ...................................................................................................................... 76

MATERIELS ET METHODES .................................................................................................................... 78

I- Isolement et purification des CSCs W8B2+ à pa ti d’ ha tillo s hu ai s d’o eillettes d oites 78

1 Isolement des CSCs W8B2+ avec la méthode des explants ........................................................... 78

2 Purification des CSCs W8B2+ ......................................................................................................... 79

2.1 Enrichissement en CSCs W8B2+ par le système du tri cellulaire magnétique positif: ........... 79

2.1.1 Principe : ........................................................................................................................ 79

2.1.2 Protocole expérimental : ............................................................................................... 81

2.2 Purification des CSCs W8B2+ par le système de tri cellulaire par cytométrie en flux: .......... 82

2.2.1 Principe: ......................................................................................................................... 82

2.2.2 Protocole expérimental: ................................................................................................ 87

Sommaire

3

II- Immunophénotypage des CSCs W8B2+ ..................................................................................... 87

III- Conditions de culture et entretien des CSCs W8B2+ ................................................................. 88

IV- Congélation/décongélation des CSCs W8B2+ ............................................................................ 89

V- Test de formation de colonies (CFU-Fs). ....................................................................................... 89

1 Principe : ........................................................................................................................................ 89

2 Protocole expérimental: ................................................................................................................ 89

VI- Test de prolifération par comptage cellulaire ........................................................................... 90

1 Principe : ........................................................................................................................................ 90


VII- Test de blessure (wound healing assay) .................................................................................... 90

1 Principe : ........................................................................................................................................ 90

2 Protocole expérimental : ............................................................................................................... 91

VIII- Test de viabilité cellulaire .......................................................................................................... 91

1 Principe : ........................................................................................................................................ 91


IX- A al se du le ellulai e a e l’iodu e de p opidiu ............................................................ 92

1 Principe : ........................................................................................................................................ 92


X- Immunocytochimie indirecte .................................................................................................... 93

1 Principe : ........................................................................................................................................ 93


XI- Différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+................................................................... 94

1 Principe : ........................................................................................................................................ 94


XII- Imagerie calcique ...................................................................................................................... 95

1 Principe : ........................................................................................................................................ 95

2 Protocol expérimental : ................................................................................................................. 96

XIII- RT-PCR « Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction » ................................................ 98

1 Principe : ........................................................................................................................................ 98


2.1 Extraction des ARNs totaux ................................................................................................... 99

2.1.1 Extraction des ARNs totaux à partir des CSCs W8B2+ adhérentes en culture : ............. 99

2.1.2 Extraction des ARNs totaux à partir des EODHs : .......................................................... 99

2.2 Rétro-transcription ou RT (Reverse Transcription): ............................................................ 100

2.3 Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) .......................................................... 100

XIV- RT-qPCR « Reverse Transcription- quantitative Polymerase Chain Reaction » en SybrGreen 101

Sommaire

4

1 Principe : ...................................................................................................................................... 101

2 Protocole expérimental : ............................................................................................................. 101

2.1 qPCR avec la technologie SybrGreen .................................................................................. 102

2.2 RT-qPCR à haut rendement ou TLDA (TaqMan Low Density Custom Array) ...................... 102

2.2.1 Principe: ....................................................................................................................... 102

2.2.2 Extraction des ARNs totaux ......................................................................................... 102

2.2.3 Transcription inverse ou RT (Reverse Transcription): ................................................. 103

2.2.4 qPCR avec la technologie TaqMan .............................................................................. 103

XV- Western blot ............................................................................................................................ 106

1 Principe: ....................................................................................................................................... 106

2 Protocole expérimental: .............................................................................................................. 107

XVI- Patch clamp ............................................................................................................................. 108

1 Principe : ...................................................................................................................................... 108

2 Protocole expérimental : ............................................................................................................. 108

XVII- Tests statistiques ..................................................................................................................... 109

RESULTATS ........................................................................................................................................... 110

Chapitre I : Isolement et caractérisation des CSCs W8B2+ .................................................................. 110

I- Isolement et caractérisation phénotypique des CSCs W8B2+ ..................................................... 111

1 Isolement des CSCs W8B2+ .......................................................................................................... 111

2 Capa it s d’auto-renouvellement et de prolifération des CSCs W8B2+ ..................................... 111

3 Immunophénotype des CSCs W8B2+ ........................................................................................... 114

II-Caractérisation génique des CSCs W8B2+ ........................................................................................ 115

1 P ofil d’e p essio des a ueu s a dia ues ........................................................................... 115

1.1 P ofil d’e p essio g i ue des facteurs de transcription cardiaques ............................... 115

1.2 P ofil d’e p essio g i ue des st u tu es o t a tiles a dia ues ................................... 117

1.3 P ofil d’e p essio g i ue des o e i es a dia ues. .................................................... 118

1.4 P ofil d’e p essio g i ue des peptides at iu ti ues.................................................... 119

2 P ofil d’e p essio g i ue des a au io i ues da s les C“Cs W B + ..................................... 119

2.1 P ofil d’e p essio g i ue des a au sodi ues da s les CSCs W8B2+ ............................ 120

2.2 P ofil d’e p essio g i ue des a au potassi ues da s les C“Cs W B + ........................ 121

2.3 P ofil d’e p essio g i ue des a au HCN da s les C“Cs W B + .................................... 127

2.4 P ofil d’e p essio g i ue des a au al i ues da s les C“Cs W B + ............................ 128

2.5 P ofil d’e p essio g i ue des t a spo teu s io i ues da s les C“Cs W B + .................. 129

3 P ofil d’e p essio g i ue des a teu s de l’ho ostasie al i ue da s les C“Cs W B + ......... 130

III-Caractérisation fonctionnelle des CSCs W8B2+ ............................................................................... 131

1 Différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+..................................................................... 131

Sommaire

5

1.1 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des marqueurs cardiaques ..................................................................................................................... 132

1.1.1 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des facteurs de transcription cardiaques .................................................................................... 132

1.1.2 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des structures contractiles cardiaques ........................................................................................ 134

1.1.3 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des connexines cardiaques .......................................................................................................... 136

1.2 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des canaux ioniques ............................................................................................................................... 137

1.2.1 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des canaux sodiques .................................................................................................................... 137

1.2.2 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des canaux potassiques ............................................................................................................... 138

1.2.3 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des canaux HCN ........................................................................................................................... 142

1.2.4 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des canaux calciques ................................................................................................................... 143

1.2.5 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des t a spo teu s io i ues et/ou des a teu s de l’ho ostasie al i ue ................................. 145

2 Etude de l’a ti it al i ue au ou s de la diff e iatio a dia ue in vitro des CSCs W8B2+ . 151

2.1 “ig atu e de l’a ti it spo ta e al i ue au ou s de la diff e iatio a dia ue in vitro

des CSCs W8B2+ ............................................................................................................................... 151

2.2 Evolution des paramètres calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des

CSCs W8B2+ ..................................................................................................................................... 153

2.2.1 Evolution de la fréquence des oscillations calciques au cours de la différenciation

cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ .............................................................................................. 153

2.2.2 E olutio de l’a plitude des os illatio s al i ues au ou s de la diff e iatio cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ .............................................................................................. 155

2.2.3 Evolution de la durée des oscillations calciques au cours de la différenciation


2.2.4 E olutio de l’ai e des os illatio s al i ues au ou s de la diff e iatio a dia ue in

vitro des CSCs W8B2+ .................................................................................................................. 155

2.2.5 Evolution du TTP (time to peak) des oscillations calciques au cours de la différenciation


2.2.6 Evolution du TTR (time to recovery) des oscillations calciques au cours de la

différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ..................................................................... 157

2.2.7 Evolution des pentes 1 et 2 des oscillations calciques au cours de la différenciation


2.2.8 E olutio du pou e tage du te ps d’a ti it al i ue au ou s de la diff e iatio cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ .............................................................................................. 160

Sommaire

6

2.3 Identification des acteurs impliqués dans la génération des oscillations calciques dans les

CSCs W8B2+ différenciées ............................................................................................................... 161

2.3.1 Effet de l’i hi itio de l’ ha geu NCX su les os illatio s al i ues da s les C“Cs W8B2+ différenciées pendant 28 jours........................................................................................ 161

2.3.2 Effet de l’i hi itio de la “ERCA su les os illatio s al i ues da s les C“Cs W B +

différenciées pendant 28 jours ................................................................................................... 162

2.3.3 Effet de l’i hi itio des a au CaV de type L sur les oscillations calciques dans les CSCs

W8B2+ différenciées pendant 28 jours........................................................................................ 163

2.3.4 Effet de l’i hi itio des epteu s à l’IP su les os illatio s al i ues da s les C“Cs W8B2+ différenciées pendant 28 jours........................................................................................ 164

2.3.5 Effet de l’i hi itio des epteu s à la a odi e su les os illatio s al i ues da s les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours ............................................................................... 170

Chapitre II : Rôle du canal BKCa da s la gulatio de la p olif atio et de l’auto-renouvellement des

CSCs W8B2+ ......................................................................................................................................... 172

1 Cad e de l’ tude .......................................................................................................................... 172

2 Résumé des résultats .................................................................................................................. 173

3 Article scientifique: « FUNCTIONAL BKCa CHANNEL IN HUMAN RESIDENT CARDIAC STEM CELLS

EXPRESSING W8B2». ........................................................................................................................... 174

4 BKCa et oscillations calciques dans les CSCs W8B2+ différenciées ............................................... 192

Chapitre III : Effets de la sphingosine 1-phosphate sur les propriétés des CSCs W8B2+ ..................... 196

1 Contexte bibliographique ............................................................................................................ 196

1.1 S1P et signalisation .............................................................................................................. 196

1.2 S1P et tissu cardiaque ......................................................................................................... 197

1.3 S1P et cellules souches ........................................................................................................ 198

2 Co te te de l’ tude ..................................................................................................................... 198

3 Résultats ...................................................................................................................................... 199

3.1 P ofil d’e p essio des i epteu s à la “ P da s les C“Cs W B + ............................... 199

3.2 Effet de la S1P sur les capacités prolifératives des CSCs W8B2+ ......................................... 201

3.3 I pli atio des “ PR da s l’effet a tip olif atif de la “ P o se da s les C“Cs W B + 204

3.4 Effet de la “ P su les p op i t s d’auto-renouvellement des CSCs W8B2+ ....................... 205

3.5 Effet de la S1P sur les capacités migratoires des CSCs W8B2+ ............................................ 206

DISCUSSION ......................................................................................................................................... 207

I-Isolement et caractérisation des CSCs W8B2+ .................................................................................. 207

II-P ofil d’e p essio g i ue des anaux ioniques dans les CSCs W8B2+ .......................................... 208

III-Rôle des canaux ioniques dans les CSCs W8B2+ .............................................................................. 209

IV-P ofil d’e p essio g i ue des a teu s al i ues da s les C“Cs W B + ....................................... 211

V-Différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ......................................................................... 213

1 Profil des marqueurs cardiaques ................................................................................................. 213

Sommaire

7

2 Profil des transcrits codant pour les canaux ioniques ................................................................. 215

3 Oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ .......... 219

4 La sphingosine 1-phosphate (S1P) joue un rôle important dans les CSCs W8B2+ ...................... 223

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ........................................................................................ 227

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ....................................................................................................... 230

RESUME ............................................................................................................................................... 266

ANNEXES .............................................................................................................................................. 268

Table des illustrations

8

TABLE DES ILLUSTRATIONS

Liste des figures

Figure H-1 : Hiérarchie de la différenciation des cellules souches. ................................................... 19

Figure H-2 : La hiérarchie des cellules souches. .................................................................................... 20

Figure H-3 : Les cellules souches hématopoïétiques ...................................................................... 23 Figure H-4 : Les cellules souches mésenchymateuses .................................................................... 25

Figure H-5 : Les cellules progénitrices endothéliales ...................................................................... 28 Figure H-6 : Les cellules souches intestinales ................................................................................ 30 Figure H-7 : Les cellules souches de l'épiderme interfolliculaire ..................................................... 32 Figure H-8 : Les ellules sou hes de l’ pith liu pul o ai e .......................................................... 33 Figure H-9 : Les cellules souches du limbe scléro-cornéen .............................................................. 34 Figure H-10 : Les cellules progénitrices hépatiques ....................................................................... 36 Figure H-11 : Les cellules souches neuronales ............................................................................... 38 Figure H-12 : Les cellules satellites du muscle strié squelettique .................................................... 40 Figure H-13 : Concept des cellules souches cardiaques ................................................................... 42 Figure H-14 : Hiérarchie de la croissance et de la différenciation des cellules souches cardiaques..... 44 Figure H-15 : Illustration schématique des cellules souches cardiaques exprimant c-kit et de leur

pouvoir de différenciation ............................................................................................................ 46 Figure H-16 : Illustration schématique des cellules souches cardiaques exprimant Sca-1 et de leur

pouvoir de différenciation ............................................................................................................ 50 Figure H-17 : Illustration schématique des cellules souches cardiaques exprimant BCRP et de leur

pouvoir de différenciation ............................................................................................................ 53 Figure H-18 : Illust atio s h ati ue de l’e p essio fo tio elle des a au et epteu s calciques au cours de la différenciation des CSEs et des CSMs (du tissu adipeux et de la moelle

osseuse) ..................................................................................................................................... 66 Figure H-19 : Voies de signalisations majeures impliquées dans le maintien de la pluripotence ou de

la favorisation de la différenciation des cellules souches cardiaques .............................................. 69

Figure H-20 : Structure chimique de la sphingosine 1-phosphate ………………………………………………….196

Figure MM-1 : “ h a du p oto ole d’isole e t et de pu ifi ation des CSCs W8B2+ à partir des

échantillons auriculaires humains ................................................................................................. 78 Figure MM-2 : Schéma du principe de la technique du tri cellulaire magnétique positif ................... 80 Figure MM-3 : Schéma simplifié du principe de la technique du tri cellulaire par FACS ..................... 83 Figure MM-4 : “ h a si plifi du p i ipe du fo tio e e t d’u to t e de flu .................. 84 Figure MM-5 : Schéma simplifié des paramètres clés mesurés par le cytomètre de flux ................... 85 Figure MM-6 : Schéma simplifié du protocole de différenciation cardiaque in vitro utilisé pour

différencier les CSCs W8B2+ .......................................................................................................... 95 Figure MM-7 : “ h a du M a is e d’a tio de la GCaMP ......................................................... 95 Figure MM-8 : E e ple d’i age de fluo es e e o te ue lo s des os illatio s al i ues ap s traitement avec le logiciel Image J................................................................................................. 97 Figure MM-9 : T a d’u e os illation calcique obtenue au 28ème jour de différenciation montrant les

différents paramètres calculés avec le logiciel IDL .......................................................................... 98 Figure R-1 : Proportions des CSCs W8B2+ durant les différentes étapes de purification .................. 112 Figure R-2 : Morphologie des CSCs W8B2+ isolées et des colonies formées ................................... 113 Figure R-3 : Capa it d’auto-renouvellement et de prolifération des CSCs W8B2+ ......................... 113


9

Figure R-4 : Pourcentage des CSCs W8B2+ positives pour les marqueurs de surface indiqués

déterminé par cytométrie en flux................................................................................................ 114 Figure R-5 : P ofil d’e p essio des fa teu s de t a s iptio a dia ues da s les C“Cs W B + ....... 116 Figure R-6 : P ofil d’e p essio g i ue des st u tu es o t a tiles a dia ues da s les C“Cs W B +

................................................................................................................................................. 117 Figure R-7 : P ofil d’e p essio g i ue des o e i es a diaques dans les CSCs W8B2+ .............. 118 Figure R-8 : P ofil d’e p essio g i ue des peptides at iu ti ues de t pe A et de t pe B da s les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ........................................................................................... 119 Figure R-9 : P ofil d’e p essio g i ue des a au sodi ues oltage-dépendant dans les CSCs W8B2+

déterminé par RT-qPCR .............................................................................................................. 120 Figure R-10 : P ofil d’e p essio g i ue des sous-unités alpha des canaux potassiques voltage-

dépendant dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ............................................................. 122 Figure R-11 : Ca a t isatio de l’e pression des ARNm codant pour KV4.2 et KV4.3 dans les CSCs

W8B2+ par RT-PCR ..................................................................................................................... 122 Figure R-12 : P ofil d’e p essio g i ue des sous-unités bêta des canaux potassiques voltage-

dépendant dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ............................................................. 123 Figure R-13 : Ca a t isatio de l’e p essio des ARN oda t pou KCa . , KCa . et KCa . da s les CSCs W8B2+ par RT-PCR ......................................................................................................... 124 Figure R-14 : P ofil d’e p essio g i ue des a au potassi ues TWIK et TA“K da s les C“Cs W B +

déterminé par RT-qPCR .............................................................................................................. 125 Figure R-15 : Profil d’e p essio g i ue des a au potassi ues e tifia ts e t a ts a e leu s sous-

unités régulatrices) et le courant sensible au baryum enregistré dans les CSCs W8B2+ .................. 126

Figure R-16 : P ofil d’e p essio g i ue des a au HCN da s les C“Cs W B + déterminé par RT-

qPCR ........................................................................................................................................ 127 Figure R-17 : P ofil d’e p essio g i ue des a au al i ues da s les C“Cs W B + déterminé par

RT-qPCR ................................................................................................................................... 129 Figure R-18 : P ofil d’e p essio g i ue des ha geu s Na+/K+, SERCA, PMCA et NCX1 dans les CSCs

W8B2+ déterminé par RT-qPCR .................................................................................................. 130 Figure R-19 : P ofil d’e p essio g i ue des a teu s i pli u s da s l’ho ostasie al i ue da s les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ........................................................................................... 131 Figure R-20 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g ique des

facteurs de transcription cardiaques .......................................................................................... 133

Figure R-21 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des structures contractiles cardiaques .............................................................................................. 135

Figure R-22 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des peptides natriurétiques de type A et de type B déterminé par RT-qPCR ........................................ 136 Figure R-23 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des connexines déterminé par RT-qPCR ............................................................................................ 137

Figure R-24 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des canaux sodiques voltage-dépendant déterminé par RT-qPCR ....................................................... 138 Figure R-25 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des canaux potassiques voltage-dépendant déterminé par RT-qPCR .................................................. 139 Figure R-26 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des sous-

unités bêta des canaux potassiques voltage-dépendant déterminé par RT-qPCR ........................... 140 Figure R-27 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des canaux potassiques TWIK et TASK déterminé par RT-qPCR .......................................................... 141 Figure R-28 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des sous-

unités régulatrices et des canaux potassiques rectifiants entrants déterminé par RT-qPCR ............ 142


10

Figure R-29 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des canaux HCN déterminé par RT-qPCR .......................................................................................... 143 Figure R-30 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des canaux calciques déterminé par RT-qPCR ................................................................................... 144 Figure R-31 : Courant dynamique enregistré sur les CSCs W8B2+ différenciées en configuration

cellule-entière ........................................................................................................................... 145 Figure R-32 : Effet de la différenciatio a dia ue des C“Cs W B + su l’e p essio g i ue des échangeurs Na+/K+, SERCA, PMCA et NCX1 déterminé par RT-qPCR ............................................ 146

Figure R-33 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des a teu s i pli u s da s l’ho ostasie calcique déterminé par RT-qPCR ....................................... 147 Figure R-34 : Regroupement hiérarchique des gènes dans les CSCs W8B2+, les CSCs W8B2+ après

différenciation cardiaque (Diff) et les CSCs W8B2+ après différenciation cardiaque et stimulation

optogénétique du CHR2 ............................................................................................................. 150 Figure R-35 : T pes d’a ti it s al i ues spo ta es e egist es au ème jour et au 28ème jour de

différenciation des CSCs W8B2+ .................................................................................................. 152 Figure R-36 : E olutio de la f ue e et de l’a plitude de l’a ti it al i ue spo ta e au ou s des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ ...................................................... 154 Figure R-37 : E olutio de la du e et de l’ai e de l’a ti it al i ue spo ta e au ou s des semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ ............................................................... 156 Figure R-38 : E olutio de TTP et de TTR de l’a ti it al ique spontanée au cours des 4 semaines de

différenciation cardiaque des CSCs W8B2+................................................................................... 158 Figure R-39 : E olutio de la pe te et de la pe te de l’a ti it al i ue spo ta e au ou s des semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ ............................................................... 159 Figure R-40 : E olutio du te ps d’a ti it e p i e pou e tage de l’a ti it al i ue spo ta e au cours des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ ......................................... 160 Figure R-41 : Effet de SEA- su l’a ti it al i ue spo ta e e egist e su les C“Cs W8B2+

après 28 jours de différenciation ................................................................................................ 162 Figure R-42 : Effet de la thapsiga gi e su l’a ti it al i ue spo ta e e egist e su les C“Cs W8B2+ après 28 jours de différenciation ..................................................................................... 163 Figure R-43 : Effet de la if dipi e su l’a ti it al i ue spo ta e e egist e su les C“Cs W B +

après 28 jours de différenciation ................................................................................................ 164 Figure R-44 : Effet de la stospo gi e C su les l’a plitude, la f ue e, l’ai e et la du e des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation

................................................................................................................................................. 165 Figure R-45 : Effet de la xéstospongine C sur le TTP , le TTR , la pente1 , la pente 2 et le pourcentage

du te ps d’a ti it des os illatio s al i ues spo ta es e egist es sur les CSCs W8B2+ après 28

jours de différenciation .............................................................................................................. 166 Figure R-46 : Effet du 2-APB su l’a plitude, la f ue e, l’ai e et la du e des os illatio s al i ues spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ............................ 168 Figure R-47 : Effet du 2-APB sur le TTP , le TTR , la pente1 , la pente 2 et le pourcentage du temps

d’a ti it des os illatio s al i ues spo ta es e egist es su les C“Cs W B + après 28 jours de

différenciation ........................................................................................................................... 169 Figure R-48 : Effet de la a odi e su l’a plitude, la f ue e, l’ai e et la du e des os illatio s calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation .............. 170 Figure R-49 : Effet de la ryanodine sur le TTP , le TTR , la pente 1 , la pente 2 et le pourcentage du

te ps d’a ti it des os illatio s al i ues spo ta es e egist es su les C“Cs W B + après 28 jours

de différenciation ...................................................................................................................... 171


11

Figure R-50 : Effet de la pa illi e su l’a ti it al i ue spo ta e e egist e su les C“Cs W B +

après 28 jours de différenciation ................................................................................................ 192 Figure R-51 : Effet de la pa illi e su l’a plitude, la f ue e, l’ai e et la du e des os illatio s calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ............... 194 Figure R-52 : Effet de la paxilline sur le TTP , le TTR , la pente 1 , la pente 2 et le pourcentage du

te ps d’a ti it des os illatio s al i ues spo ta es e egist es su les C“Cs W B + après 28 jours

de différenciation ...................................................................................................................... 195 Figure R-53 : Ca a t isatio de l’e p ession des ARNm codant pour les récepteurs à la sphingosine 1

phosphate de type 1 (S1PR1) et de type 2 (S1PR2) dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR ..................... 199 Figure R-54 : Ca a t isatio de l’e p essio des ARN oda t pou les epteu s à la sphi gosi e phosphate de type S1PR3, de type S1PR4 et de type S1PR5 dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR ........ 200 Figure R-55 : P ofil d’e p essio g i ue des i epteu s à la “ P “ PR , “ PR , “ PR “ PR et S1PR5) dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ................................................................... 201 Figure R-56 : Test de prolifération cellulaire des CSCs W8B2+ par comptage cellulaire en présence de

la S1P ou en situation contrôle .................................................................................................. 202 Figure R-57 : Test de viabilité cellulaire des CSCs W8B2+ par cytométrie en flux en présence de S1P

ou en situation contrôle ............................................................................................................ 202 Figure R-58 : Analyse du cycle cellulaire par cytométrie de flux en présence de la S1P ou en situation

contrôle .................................................................................................................................... 203 Figure R-59 : Test de prolifération cellulaire des CSCs W8B2+ en présence de la S1P, S1P + JTE013 ,

S1P + W146, S1P + BML241 ou en situation contrôle .................................................................. 204 Figure R-60 : Test de formation de colonies CFU-Fs formées par les CSCs W8B2+ en présence de la

S1P , S1P+JTE013, S1P+W146 ou en situation contrôle ............................................................... 205 Figure R-61 : Test de migration cellulaire après 7 heures en présence de la S1P, S1P+JTE013,

S1P+W146 ou en situation contrôle ........................................................................................... 206 Figure D-1 : Mod le h poth ti ue d’u pote tiel d’a tio g pa u e ellule W B +diff e i e ................................................................................................................................................. 218 Figure C-1 : “h a apitulatif des p i ipau g es do t l’e p essio a ie ap s diff e iatio cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ............................................................................................ 229

Liste des tableaux

Tableau H-1 : Principaux marqueurs des cellules souches cardiaques (CSCs) ................................... 45 Tableau H-2 : Protocoles de différenciation cardiaques utilisés pour différents types de CSCs ......... 57 Tableau MM-1 : Liste des a ti o ps utilis s pou l’i u oph ot page pa to t ie e flu ...... 88 Tableau MM-2 : Liste des a ti o ps utilis s pou l’i u o to hi ie i di e te ............................. 94 Tableau MM-3 : Liste des amorces sens et anti-sens utilisées pour la PCR .................................... 101 Tableau MM-4 : Liste des sondes et des 96 gènes analysés par TLDA ........................................... 104 Tableau MM-5 : Liste des anticorps utilisés pour le Western Blot ................................................ 107 Tableau R-1 : Etat d’e p essio des p i ipau g es do t l’e p essio a ie a a t et ap s différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ .................................................................................. 148

Abréviations

12

ABREVIATIONS

A

AA : acide ascorbique ADN: acide désoxyribonucléique ADNc: acide désoxyribonucléique complémentaire ADSCs: adipose-derived stem cells ALP: alkaline phosphatase ANG: Angiopoietin ANKB: ankyrine B ANP: atrial natriuretic factor ARN: acide ribonucléique ATP: adénosine triphosphate ATF2: activating transcription factor 2 AT2: alveolar type 2 B

BCRP: breast cancer resistance protein BKCa : Large conductance calcium-activated potassium channel BMSCs: bone marrow stromal cells BNP: brain natriuretic peptide BrdUrd: bromodésoxyuridine C

Ca2+: calcium ion CaM: calmoduline CaMK-II: Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II CD: Cluster of differentiation CDCs : cellules dérivées des cardiosphères CFU-Fs: colony-forming unit-fibroblasts ChR2: channelrhodopsins 2 Cl- : chloride ion CLASP2: cytoplasmic Linker Associated Protein 2 CPEs: cellules progénitrices endothéliales CPHs: cellules progénitrices hépatiques CPS : prosurfactant protein C CREB: C-AMP response element-binding protein CSBAs : cellules souches broncho-alvéolaires CSCs: cellules souches cardiaques CSECs: ellules sou hes de l’ pith liu o e CSEs: Cellules souches embryonnaires CSHs: cellules souches hématopoïétiques CSIs: cellules souches intestinales CSKs: cellules souches des kératinocytes CSMs: cellules souches mésenchymateuses CSNs: cellules souches neurales CSEps: ellules sou hes de l’ pide e CSRs: cellules souches rétiniennes CT: cycle threshold

CX: connexine [Ca2+]i: concentration de calcium intracellulaire D

DG: dental gyrus DMSO: diméthylsulfoxyde

Abréviations

13

DNMT: DNA Methyltransferases dNTP: deoxynucleotide E

eCSCNs : cellules souches épidermiques issues de la crête neurale EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid EGF: epidermal growth factor EGFP: enhanced green fluorescent protein EGF-R: epidermal growth factor receptor EGM-2: Endothelial Cell Growth Medium 2 EODHs: ha tillo s hu ai s d’o eillettes d oites ER : endoplasmic reticulum

F

FACS: fluorescence activated cell sorting FGF: Fibroblast growth factors FSC: forward scatter channel G

GFP: green fluorescent protein G-CSF: granulocyte colony-stimulating factor GPCs: glial progenitor cells GPI: glycerophosphatidylinositol H

hEag1 human Ether à Go-Go 1 HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HCN Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide–gated HLA: human leukocyte antigen HGF : Hepatocyte growth factor I

IA : A-type potassium current ICa.L : L-type calcium current ICa.T : T-type calcium current ICl : chloride current ICl.vol : Volume-sensitive chloride channels IDL: interactive data language IGF : insulin-like growth factor Ih : hyperpolarization-activated cation current IKir : cardiac inward rectifier potassium current IKCa : intermediate-conductance Ca2+-dependent potassium channels IKDR : delayed rectifier potassium current IMDM: Iscove's Modified Dulbecco's Medium INa : sodium current InsP3 : inositol trisphosphate IP: iodure de propidium iPSCs : induced pluripotent stem cells

IP3 : inositol trisphosphate IP3R: inositol trisphosphate receptor ISL1: ISL LIM Homeobox 1 Ito : cardiac transient outward potassium current

J

JNK: c-Jun N-terminal kinases

Abréviations

14

K

K+: potassium ion KCa: calcium-activated potassium channels Kv: voltage-gated potassium channels K2P: two-pore domain potassium channels

L

LIN- : lignage négatif L-VOCC: L type Voltage-operated calcium channels M

MACS: magnetic-activated cell sorting MAPK: mitogen-activated protein kinases MEF2C: myocyte enhancer factor 2C M-MLV: moloney murine leukemia virus MPC: myocyte progenitor cells MSCA-1: mesenchymal stem cell antigen 1 MYH: myosin heavy chain MYL: myosin light chain M199: medium 199 N

Na+: sodium ion Nav: voltage-gated sodium channels NCX: sodium-calcium exchanger Na+/K+ ATPase: sodium-potassium pump NFAT: nuclear factor of activated T-cells NF-KB: nuclear factor-kappa B NPCs: neural progenitor cells N-VOCC: N type Voltage-operated calcium channels O

OB: olfactory bulb OV-6: ovalbumine-6 P

PBS: phosphate-buffered saline PGF: placental growth factor PKC: protein kinase C PMCA : plasma membrane Ca2+ ATPase PMT : photomultiplicateur P/Q-VOCC : P/Q type Voltage-operated calcium channels pRb : retinoblastoma protein P2X P2Y: purinergic receptors Q

QSP : quantité suffisante pour R

RA: retinoic acid RAR: retinoic acid receptor RMS: rostro-migratory stream RPL13A: Ribosomal Protein L13a RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction RYR: ryanodine receptor R-VOCC : R type Voltage-operated calcium channels S

SCA-1: stem cell antigen 1 SCF: stem cell factor

Abréviations

15

SCs: satellite cells SDF-1: stromal cell-derived factor-1 SERCA: sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase SHH: Sonic hedgehog siRNA: Small interfering RNA SK: small conductance calcium-activated potassium channels SOC: store-operated channel SP: side population SSC: side scatter channel SUR : sous-unité régulatrice SVF: s u de eau fœtal SVZ : subventricular zone S1P: sphingosine 1-phosphate S1PR: sphingosine 1-phosphate receptor T

TA: transit amplifying TAK: tat-associated kinase THY-1: thymus cell antigen 1 TTP: time to peak TTR: time to recovery TRP: transient receptor potential TTX: tetrodotoxin TRPC1: transient receptor potential cation channel subfamily C member 1 TLDA: taqMan low density arrays TNNI: troponin I TNNT: troponin T TNAP: tissue nonspecific alkaline phosphatase TGFβ: transforming growth factor beta T-VOCC: T type Voltage-operated calcium channels U

UA: unité arbitraire V

VEGF: Vascular endothelial growth facto VPC: vascular progenitor cells VGCC HVA: voltage-dependent calcium channels high-voltage-activated VGCC LVA: voltage-dependent calcium channels low-voltage-activated 2-APB: 2-aminoethoxydiphenyl borate W

Wnt 11: wingless-type MMTV integration site family member 11

Introduction

16

INTRODUCTION

Chapitre I : Cellules souches et régénération tissulaire

1 Historique

La biologie des cellules souches a vu sa renaissance à la fin du siècle passé grâce à John

Gurdon (prix Nobel en 2012 avec Shinya Yamanaka), qui est parvenu (dans les années 1960)

à e pla e a e su s le o au d’u e ellule i atu e d’u ovocyte de grenouille avec le

o au d'u e ellule atu e d’o igi e i testi ale. Cet o o te s’est e suite d elopp

normalement.

En 1997, Wilmut et son groupe ont appliqué le résultat de John Gurdon pour démontrer

que le noyau des cellules somatiques avait un potentiel génétique complet en donnant

naissance à la brebis Dolly. Un an après, Thomson et al. (1998) ont développé une méthode

d’isole e t et de ultu e pou ai te i les ellules sou hes embryonnaires (CSEs) humaines

in vitro. Ces travaux ont ouvert les portes pour de nouvelles perspectives de recherche sur les

CSEs (Thomson et al., 1998).

Pou e ui est des ellules sou hes adultes, l’histoi e o e e avec Ernest McCulloch

et James Till (dans les années 1960) ui s’i t essaie t au effets des adiatio s d'une

explosion atomique) sur la capacité de la moelle osseuse à produire des cellules sanguines.

McCulloch a o se des g u eau su la ate d’u e sou is a a t eçu des i je tio s de

moelle. Ces deux chercheurs ont pensé que ces nodules étranges provenaient d'une seule

cellule, probablement de la moelle osseuse.

En 1966, Friedenstein et ses collègues ont caractérisé les p op i t s d’u e petite

population mixte de cellules de la moelle osseuse capable d’adh er au plastique in vitro.

Cette populatio i te tait o stitu e de ellules sou hes h atopoï ti ues et d’u e aut e

populatio ellulai e, i o ue à l’ po ue, apa le de do e aissa e à des ellules «

réticulaires » et à des ostéoblastes. Cette population inconnue correspond à e ue l’o

appelle maintenant les cellules souches mésenchymateuses (CSMs). Cette équipe a également

o t l’i po ta e de l’i te a tio des C“Ms avec le microenvironnement de la moelle

osseuse (ou niche hématopoïétique) mais aussi leur capacité à se différencier en tissu

Introduction

17

d’o igi e sode i ue. Da s e tai es o ditio s, les CSMs étaient capables de se

différencier en ostéoblastes, chondrocytes et adipocytes (Caplan, 1986; Piersma et al., 1985).

Dans les années 1990-2000, le pouvoir de différenciation myogénique des CSMs a été

démontré (Wakitani et al., 1995), notamment leur différenciation en cardiomyocytes in vivo

(Toma et al., 2002; Vacanti et al., 2005). Durant la même période une autre étude a pu mettre

en évidence un pouvoir immuno-modulateur des CSMs par surpression de la prolifération des

lymphocytes T (Di Nicola et al., 2002). Cette tude a atti pa ti uli e e t l’atte tio du

ilieu s ie tifi ue su l’appli atio th apeuti ue des CSMs lors de transplantations

allogéniques.

Ces études ont révélé la plasticité et le pouvoir multipotent des cellules souches adultes

et ont ouvert les possibilités de thérapies cellulaires.

Avant de faire une description plus exhaustive des différents types de cellules souches, il

est important de rappeler les propriétés intrinsèques qui les définissent.

2 Propriétés des cellules souches

2.1 L’auto-renouvellement

Les cellules souches sont définies comme étant des cellules indifférenciées dotées de

apa it d’auto-renouvellement et de diff e iatio e d’aut es t pes ellulai es. L’auto-

renouvellement est un processus par lequel une cellule souche se divise asymétriquement ou

symétriquement pour générer respectivement une ou deux cellules filles qui présentent un

potentiel de développement similaire à celui de la cellule mère. Les divisions symétriques

suppose t ue les ellules filles o se e t les a a t isti ues p op es d’u e ellule sou he

(Ulloa-Montoya et al., 2005). La apa it d’auto-renouvellement est essentielle pour les

cellules souches pour accroitre leur nombre durant le développement, être maintenues au

sein des tissus adultes et rétablir le stock des cellules souches après blessure. L’auto-

renouvellement se différencie de la prolifération même si les deux processus sont liés à la

division cellulaire. La prolifération est un terme plus générique qui regroupe tous les types de

di isio s des ellules sou hes et p og it i es. L’auto- e ou elle e t i pli ue u’au oi s

une des cellules filles possède le même potentiel de développement que la cellule mère.

Pour la plupart des cellules souches de mammifères, telles que les cellules souches

hématopoïétiques (CSHs) et les cellules souches neurales (CSNs), l'auto-renouvellement est

Introduction

18

une division avec maintien de la multipotence. Pour les cellules souches qui forment un seul

type de cellule fille, par exemple les cellules souches spermatogoniales, l'auto-renouvellement

est la division avec la maintenance de l'état indifférencié. La plupart des mécanismes

impliqués dans l'auto-renouvellement des cellules souches régulent ceux impliqués dans la

prolifération de nombreux types cellulaires (Molofsky et al., 2003; Nishino et al., 2008).

Les ellules sou hes o se e t pe da t de t s lo gues p iodes leu apa it d’auto-

e ou elle e t. Il est ie ta li u’à ha ue dupli atio du g o e, des e eu s de le tu e

ou des do ages de l’ADN peu e t su e i . Les ellules souches possèdent des mécanismes

de surveillance qui détectent les erreurs de réplication et éliminent les cellules dans lesquelles

apparaissent ces erreurs. Il y aurait intervention de la protéine p53 bien connue pour son rôle

de facteur anti-tumoral et pro-apoptotique, et de la protéine du rétinoblastome (pRb), elle

aussi facteur anti-tumoral. Ce mécanisme préviendrait ainsi la formation de tumeur par

utatio d’u e ellule sou he et p olif atio de ette ellule ut e MORRI“ON et

SPRADLING, 2008).

2.2 Pouvoir de différenciation en plusieurs lignages cellulaires

La différenciation est définie comme un changement dans le phénotype cellulaire en raison

de l’e p essio de g es sp ifi ues de la fo tio ellulai e sui a t le lig age au uel elle

appartient (Gargett, C.E. . Co e ous l’a o s d jà e tio , les cellules souches

e t e t da s la oie de diff e iatio pa des di isio s dites as t i ues i pli ua t u’u e

seule des deux cellules filles conserve les caractéristiques propres des cellules souches, alors

ue l’aut e ellule fille o ti ue da s la oie de la diff e iatio (Ulloa-Montoya et al., 2005).

Il semblerait que l’as t ie soit li e à u e as t ie ol ulai e au sei de la ellule

souche en division. Il y aurait une ségrégation asymétrique des protéines, des ARNs, des

o ga elles et de l’ADN. Il se le ait gale e t ue le fuseau essai e à la di isio ellulaire

soit lui aussi asymétrique (Morrison and Spradling, 2008). E fi l’e i o ement

i te ie d ait aussi da s l’as t ie des di isio s. La ellule fille o te ue e t a t da s la oie

de diff e iatio est appel e ellule d’a plifi atio t a sitoi e t a sit a plif i g p oge ito

ou cellule TA) (Gargett, 2007). Ces cellules TA, aussi appelées, suivant leur stade, cellules

progénitrices puis cellules précurseurs, possèdent des propriétés intermédiaires entre les

cellules souches adultes et les cellules différenciées : elles ont un potentiel de division limité,

Introduction

19

u e a se e de apa it à l’auto-renouvellement et donnent naissance progressivement aux

cellules différenciées (Figure H-1).

La division asymétrique jouerait aussi un rôle dans la apa it u’o t les ellules sou hes

à se ai te i lo gte ps : les utatio s de l’ADN se aie t sp ifi ue e t e o es da s la

ellule fille pou sui a t la diff e iatio alo s ue l’ADN o igi al, i tact, serait conservé dans

la cellule souche fille respo sa le de l’auto- e ou elle e t. Ce ph o e ’a epe da t

pas été décrit dans tous les systèmes (Morrison and Spradling, 2008).

3 Types et potentiels de différenciation des cellules souches humaines :

Le pouvoir de différenciation des cellules souches est différent selon le type de cellules

souches qui peuvent être totipotentes, pluripotentes ou multipotentes (Laurie, 2004;

Takahashi et al., 2007; Thomson et al., 1998) (Figure H-2).

Figure H-1 : Hiérarchie de la différenciation des cellules souches. Les cellules souches subissent des divisions cellulaires as t i ues, e ui leu pe et de s’auto-renouveler ou de se différencier pour donner naissance à des progéniteurs engagés. Ces derniers prolifèrent et donnent lieu à des « cellules amplificatrices de transit » ou (transit amplifying (TA) cells) plus différenciées, qui prolifèrent rapidement et se différencient finalement pour produire de nombreuses cellules fo tio elles diff e i es sa s apa it de p olif atio . D’ap s Ga gett, C.E et al., .

Introduction

20

3.1 Les cellules souches embryonnaires (CSEs) :

3.1.1 Les cellules souches totipotentes :

Les cellules souches ont la capacité de se différencier en tous types cellulaires

spécialisés. Le nombre de type de cellules spécialisées différents que peut engendrer une

cellule souche définit sa potentialité.

Figure H-2 : La hi a hie des ellules sou hes. Le z gote totipote t fo pa la fusio de l’o ule et le spermatozoïde se divise pour former la masse cellulaire interne (ICM ou inner cell mass) et le tissu extra-embryonnaire (EE ou extra-embryonic) du blastocyste. Lorsqu'elles sont isolées du blastocyste, les cellules de l'ICM peuvent être maintenues in vitro en culture sous la forme de lignées de cellules souches embryonnaires (CSEs) pluripotentes. Au cours du développement de l'embryon, les cellules souches pluripotentes de l'ICM sont de plus en plus restreintes dans leur potentiel de lignage et génèrent des cellules souches multipotentes tissu-spécifiques. Celles-ci incluent des cellules souches épidermiques (cellules souches du follicule pileux) qui forment la peau et les cheveux, des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse qui donnent naissance à toutes les cellules hématopoïétiques, des cellules souches neurales dans la zone subventriculaire du cerveau, des cellules souches gastro-intestinales situées dans la crypte de l'intestin grêle, des cellules ovales qui donnent naissance au foie (non montrées) et des cellules souches mésenchymateuses qui résident dans la moelle osseuse et peuvent former des cellules osseuses, stromales et des adipocytes (non représentées). D’ap s E kfeldt, C.E et al. .

Introduction

21

Les ellules sou hes totipote tes o t la apa it de do e aissa e à ’i po te uel

t pe ellulai e o stitua t l’o ga is e hu ai ompris les tissus extra-embryonnaires

comme le placenta (Thomson et al., 1998). L’e iste e de es ellules sou hes totipote tes

est courte, et dure entre la fertilisation et la formation du blastocyste, lorsque le zygote ou

œuf f o d o e e à se di ise jus u’à a oi huit ellules ide ti ues (Figure H-2).

3.1.2 Les cellules souches pluripotentes :

Au uat i e jou du d eloppe e t e o ai e, l’a as ellulai e fo e le

lasto ste . Le lasto ste est o stitu de deu ou hes ; une couche externe qui se

transforme en tissus extra-embryonnaires et la couche interne qui est un ensemble de 30

ellules e i o ui fo e o t pa la suite l’o ga is e (Eckfeldt et al., 2005) (Figure H-2).

Ces cellules sont pluripotentes et ont le potentiel de se différencier en 200 types

ellulai es à l’esse e du o ps hu ai (Laurie, 2004). Ainsi, les cellules souches pluripotentes

de la couche interne du blastocyste représente une source pour créer des lignées de CSEs

humaines (Laurie, 2004; Thomson et al., 1998). A la différence des cellules souches

totipotentes, les ellules sou hes plu ipote tes e peu e t pas t e à l’o igi e d’u t e

hu ai puis u’elles sont incapables de constituer les tissus extra-embryonnaires essentiels

au développement embryonnaire. Les cellules souches pluripotentes peuvent donc former les

trois feuillets germinaux (endoderme, mésoderme et ectoderme) et se spécialiser ensuite en

d’aut es t pes de ellules sou hes ue so t les ellules sou hes ultipote tes (Enmon et al.,

2002).

3.2 Les cellules souches adultes:

On retrouve les cellules souches adultes multipotentes dans plusieurs tissus et organes

comme la moelle osseuse, le tissu adipeux, le sang périphérique, le muscle squelettique,

l’ pide e, le œu , le foie et le e eau. Ces ellules so t « o ga es-spécifiques », se forment

pe da t le d eloppe e t fœtal et pe du e t da s l’o ga is e adulte (figure H-2).

Elles sont indiffére i es a e u e apa it d’auto-renouvellement et une forte

prolifération et se différencient en cellules spécialisées avec des fonctions spécifiques

(Pittenger et al., 1999). Les cellules souches multipotentes comme par exemple les cellules

souches hématopoïétiques, mésenchymateuses et épidermiques, peuvent êtres différenciées

in vitro et utilisées en médecine régénérative (Ma, 2010; Macrin et al., 2017). Malgré leur

Introduction

22

pouvoir limité de différenciation, les cellules souches adultes multipotentes peuvent être

orientées vers plusieurs types cellulaires et facilement manipulées in vitro contrairement aux

CSEs do t l’utilisatio est sou e t t s li it e pou des uestio s thi ues. Les ellules

souches multipotentes adultes se présentent donc comme de bons candidats pour le

traitement de multiples pathologies dans le domaine de la médecine régénérative et de la

thérapie cellulaire. Cependant, il est nécessaire et indispensable de bien caractériser et

comprendre in vitro leu s a is es d’auto-renouvellement, de prolifération et de

différenciation.

Avant de développer plus spécifiquement les cellules progénitrices cardiaques il est

important de faire une description plus généraliste (synthétique) des différents types de

cellules souches adultes

3.2.1 Les cellules souches hématopoïétiques (CSHs)

Elles font partie des cellules souches adultes de la moelle osseuse les plus connues et

les plus étudiées. Les cellules souches hématopoïétiques sont des cellules multipotentes et

donnent naissance aux deux lignées myéloïde et lymphoïde des cellules sanguines. Ces cellules

ont été utilisées avec succès dans la thérapie cellulaire (Kuznetsov et al., 2001) et peuvent être

aussi trouvées dans le sang périphérique ou dans le sang du cordon ombilical des nouveaux-

nés. Les CSHs o t t à l’o igi e du d ut des e he hes ode es su les ellules sou hes

adultes grâce aux découvertes faites sur leur très forte capacité d’auto-renouvellement et de

différenciation en tous les types cellulaires du lignage hématopoïétique (figure H-3).

Introduction

23

Les CSHs peuvent être isolées par prélèvement direct de la moelle osseuse hématopoïétique

mais aussi prélevées dans le sang périphérique après stimulation par des cytokines (Sackstein,

2004). Les CSHs de la moelle osseuse expriment à leur surface des marqueurs qui permettent

de les identifier comme le CD34, KDR, CD45, AC133. Elles expriment peu les marqueurs THY-

1, KIT et SCA-1. Les CSHs ont la capacité de se différencier en toutes les lignées cellulaires qui

composent le sang. Leur pouvoir de différenciation in vivo en cardiomyocytes a été analysé

mais les résultats obtenus in vitro sont controversés ; des études ont montré que les CSHs

isolées de la moelle osseuse pouvaient exprimer plusieurs facteurs de transcription cardiaques

intégrant les protéines sarcomériques (Eisenberg et al., 2003).

Plusieurs études ont suggéré que des cellules isolées de moelle osseuse et donc

enrichies en CSHs pou aie t g e le o a de da s des od les a i au d’i fa tus

(Agbulut et al., 2003; Jackson et al., 2001; Kajstura et al., 2005; Orlic et al., 2001a). Cependant,

Figure H-3 : Les cellules souches hématopoïétiques (CSHs). Les CSHs sont dotées d'une capacité

d'auto-renouvellement (flèche incurvée) qui maintient leur stock et de potentiel de différenciation

multipotent qui permet de produire toutes les cellules du système hématopoïétique mature. À

esu e ue les C“Hs se diff e ie t, elles pe de t leu apa it d’auto-renouvellement et leur

pouvoir multiple de différenciation devient de plus en plus restreint. Les CSHs donnent naissance

à des progéniteurs (CLP, CMP, MEP et GMP) qui s’e gage t da s u p o essus de diff e iatio pour donner à la fin des cellules spécialisées (lymphocyte B, lymphpcyte T, cellules NK etc ...

CLP (common lymphoid progenitor); CMP (common myeloid progenitor); GMP, (granulocyte

monocyte progenitor); MEP (megakaryocyte erythrocyte progenitor); NK (natural killer). D’ap s Eckfeldt, C.E et al.2005.

Introduction

24

des publications ont montré que la même population de cellules adoptait uniquement un

phénotype hématopoïétique après transplantation (Balsam et al., 2004; Murry et al., 2004).

D’aut es st at gies o e la o ilisatio de ellules p u seu s h atopoï ti ues pa

du Stem Cell Factor et du Granulocyte-Colony Stimulating Factor ou G-CSF pendant le

d oule e t d’u i fa tus o t gale e t do des sultats o t adi toi es (Deten et al.,

2005; Orlic et al., 2001b).

3.2.2 Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs)

Les cellules souches mésenchymateuses appelées également cellules souches stromales

ont été également retrouvées dans la moelle osseuse. Co e ous l’a o s d jà e tio

les CSMs de la moelle osseuse ont été décrites pour la première fois par Ernest McCulloch et

James Till dans les années 1960. D’aut es he heu s du a t les a es -80 (Friedenstein

(1970), Owen (1988), Tavassoli et Crosby (1970), qualifiaient ces cellules de « mechanocytes

dérivées de la moelle osseuse » ou encore « des fibroblastes stromaux ». Ce ’est u’à pa ti

de 1991 que Caplan nomma ces cellules ; «cellules souches mésenchymateuses ». Les CSMs

so t fusifo es et o t la p op i t d’adh e au plastique in vitro. A l’i e se, la plupa t des

autres types de cellules souches de la moelle osseuse comme les CSHs ’o t pas ette

p op i t d’adh e e au plasti ue (Friedenstein, 1995). Les CSMs peu e t s’auto-renouveler

et se différencier en lignage mésodermique (adipocyte, chondrocytes, ostéoblastes et cellules

stromales) (figure H-4).

Des études ont montré la capacité des CSMs à se transdifférencier in vitro e d’aut es

lignages (ectoderme et endoderme) mais cette transdifférenciation est controversée in vivo

(figure H-4). Elles interviennent in vivo lors des processus de réparations des tissus

e do ag s o e l’os, le a tilage, le us le, le liga e t, le te do et le st o a (Pittenger

et al., 1999; Psaltis et al., 2008). Les CSMs ont pu être isolées à partir de plusieurs tissus comme

le sang périphérique (Kuznetsov et al., 1997), le sang du cordon ombilical (Lee et al., 2004), le

sang foetal (Noort et al., 2002), la pulpe dentaire (Gronthos et al., 2000), le liquide amniotique

I ’t A ke et al., , le poumon (Fan et al., 2005), le foie (Campagnoli et al., 2001), le tissu

adipeux (Zuk et al., 2002), l’i testi (Bjerknes and Cheng, 2002) et le follicule pileux (Amoh et

al., 2005).

Introduction

25

U des p o l es d’ide tifi ation des CSMs est l’a se e de a ueu s

immunophénotypiques universels qui leur sont spécifiques (Rastegar et al., 2010; Williams

and Hare, 2011). Cependant, le comité de la société internationale pour la thérapie cellulaire

s’i t essa t au cellules souches mésenchymateuses (the International Society for Cellular

Therapy), a bien défini certains critères pour décrire une CSM, qui se résume en leur adhésion

au plastique en conditions de culture. De plus une CSM doit exprimer le CD105, CD73 et CD90

et doit être négative pour le CD45, CD34, CD14, CD79, CD19 et HLA-DR et doit se différencier

en ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes in vitro (Dominici et al., 2006). En général, elle

Figure H-4 : Les cellules souches mésenchymateuses (MSCs). Les MSCs de la moelle osseuse ont la

apa it de s’auto-renouveler (flèche incurvée) et à se différencier vers la lignée mésodermique

en donnant naissance aux cellules stromales, chondrocytes, adipocytes et ostéoblastes, (flèches

o ti ues . D’aut es apa it s de diff e iatio in vitro vers les lignages ectodermique et

e dode i ue, o t t do u e t es da s la litt atu e fl hes poi till es . D’ap s U elli, A et al.2008.

Introduction

26

’e p i e pas le CD , le CD , le CD et le CD (Majumdar et al., 2003). D’aut e pa t, les

CSMs sont connues pour être positives pour les peptides de surface SH2, SH3, SH4, le CD35

(trans-membrane protein), le CD73, le CD90 (Thy1), le CD123, le CD117, CD271 et le Stro-3-

positive mesenchymal precursor cell (Kuçi et al., 2010). Ces ellules sou hes doi e t d’aut e

pa t e p i e des a ueu s e o ai es o e l’O t , le Na og et le ““EA-4 (Gang et

al., 2007).

N a oi s, d’aut es t pes ellulai es, o e les CSHs, expriment également certains

des marqueurs déjà cités rendant la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses

plus complexe (Kim and Ahn, 2012). Il en résulte que pour bien distinguer les CSMs des CSHs,

une sélection basée sur l'absence des marqueurs hématopoïétiques CD34, CD45 et CD14

serait suffisante (Majumdar et al., 2003).

Les CSM peuvent se différencier en plusieurs types cellulaires. La première

différenciation a été réalisée par Friedenstein et ses collaborateurs (1970) qui ont pu isoler et

différencier les CSMs en tissus osseux in vitro. Différents groupes ont montré par la suite que

les CSMs peuvent se différencier en cellules pancréatiques (Lee et al., 2004) , neuronales

(Woodbury et al., 2000), en os (Haynesworth et al., 1992), en cartilage (Yoo et al., 1998), en

muscle (Wakitani et al., 1995), stroma de la moelle (Majumdar et al., 1998), tendon et

ligament (Young et al., 1998), tissu adipeux (Dennis et al., 1999) et en différents tissus

connectifs (Studeny et al., 2004). Les CSMs de la moelle osseuse sont également capables de

freiner et « réparer » les altérations pulmonaires (Curley et al., 2012), le diabète (Si et al.,

2012), les désordres neurologiques (Edalatmanesh et al., 2011), les maladies rénales (Alfarano

et al., 2012) et les blessures hépatiques (Zhao et al., 2012). En plus de leur pouvoir de

différenciation en différents lignages mésenchymateux, les CSMs peuvent aussi donner

aissa e sous e tai es o ditio s de ultu e à d’aut es ellules sp ialisées comme les

cardiomyocytes.

Ces t a au o t pe is de ett e e ide e des ha ge e ts d’e p essio de

certains gènes cardiaques comme la chaîne lourde de myosine, la troponine T cardiaque, des

facteurs de transcription précoces cardiaques comme NKx2.5 et GATA4 (Reik, 2007). GATA4

est u gulateu ajeu de l’e p essio des g es a dia ues du a t la diff e iatio

(Heineke et al., 2007). P se t da s le œu adulte il joue u ôle de gulateu

transcriptionnel de nombreux gènes cardiaques comme le facteur natriuretic atrial, le peptide

Introduction

27

natriuretic de type B, la chaîne lourde de myosine et la troponine T cardiaque qui sont deux

protéines contractiles cruciales dans la fonction musculaire squelettique et cardiaque.

3.2.3 Les cellules souches du tissu adipeux

Des études ont montré que le tissu adipeux contient des cellules souches nommées

cellules mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ADSCs ou Adipose tissue-derived stem

cells) (Nakagami et al., 2005). Ce tissu est a o da t, fa ile d’a s et ep se te u e

potentielle source de cellules pour des transplantations autologues. Les ADSCs sont

multipotentes et sont localisées au niveau du stroma vasculaire du tissu adipeux sous cutané.

Ces cellules ont beaucoup de similitude avec les CSMs de la moelle osseuse. Elles seraient

positives pour les marqueurs SCA-1 et CD44 et négatives pour les marqueurs KIT, CD11b,

CD31, CD34 ou CD45 (Nakagami et al., 2005). Elles présentent un phénotype proche de celui

des fibroblastes et peuvent se différencier in vitro en adipocytes, ostéoblastes et

chondroblastes. Les ADSCs secrètent de o euses toki es HGF, VEGF, PGF, TGFβ, FGF,

ANG-1 et ANG) mais aussi des facteurs angiogéniques comme le VEGF et le HGF. Les ADSC

partagent beaucoup de gènes avec les CSMs de la moelle osseuse et expriment des marqueurs

hématopoéitiques (CD34, CD133 et ABCG2) (Planat-Benard et al., 2004) suggérant une double

populatio d’AD“Cs : elles de t pe h atopoï ti ue et elles de t pe se h ateu .

3.2.4 Les cellules progénitrices endothéliales

Les cellules progénitrices endothéliales (CPEs) sont des cellules circulantes de la moelle

osseuse ui side t au sei de l’e doth liu et o t i ue t à la as uloge se et

l’ho ostasie as ulai e (Khakoo and Finkel, 2005) (figure H-5). Elles ont été identifiées pour

la première fois en 1997 (Asahara et al., 1997) et ont été isolées à partir du sang périphérique

comme étant des cellules exprimant le marqueur CD34. Ces cellules seraient natives de la

moelle osseuse.

.

Introduction

28

Les h a gio lastes p se ts pe da t l’e oge se se aie t à l’o igi e des ellules

précurseurs des endothéliums (Kubo and Alitalo, 2003; Risau and Flamme, 1995) mais

pourraient également provenir directement des CSHs (Kubo and Alitalo, 2003). En effet, les

CPEs partagent des marqueurs communs avec les CSHs comme le CD133 et CD34 mais elles

expriment en plus le marqueur endothélial FLK-1 (Liao et al., 2007). Les CPEs se présenteraient

comme une sous population de CSHs a a t la apa it d’a u i u ph ot pe e doth lial

(Liao et al., 2007). Les CPEs sont très peu nombreuses dans le sang périphérique et dans la

moelle, limitant leur utilisation (Nakagami et al., 2005). Ces cellules ont été utilisées en

thérapie cellulaire pour différentes pathologies comme certaines maladies cardiovasculaires

(Kawamoto and Losordo, 2008) et le diabète (Fadini et al., 2010).

Figure H-5 : Les cellules progénitrices endothéliales (CPEs). Les CPEs peuvent dériver de cellules

embryonnaires (hémangioblastes) et de plusieurs tissus adultes (cellules CD14+/ CD34+/CD133+ du

sang périphérique, moelle osseuse, paroi vasculaire et myocarde). Les CPEs sont impliquées

esse tielle e t da s la ee dothelisatio des aisseau l s s et da s l’a gioge se da s des zo es ischémiques. D’ap s Le i, A., a d Kajstu a, J. .

Introduction

29

3.2.5 Les ellules sou hes de l’ pith liu i testi al :

Les ellules sou hes de l’ pith liu i testi al fo t pa tie des ellules sou hes

pith liales des tissus à e ou elle e t apide et e pos s au ilieu e t ieu . L’i testi a u

ôle p ote teu ajeu pa la fo atio d'u e a i e a e le ilieu e t ieu d’où la

nécessité de se renouveler en permanence. Ce renouvellement (tous les deux à sept jours) est

assuré par la présence de cellules souches qui en se différenciant, donnent différents types

cellulaires avec différentes fonctions. Les cellules souches intestinales (CSIs) résident dans les

cryptes et expriment à leur surface les marqueurs (MSI-1), CD-24 et KIT (Reya and Clevers,

2005). Elles sont multipotentes et se différencient en quatre types cellulaires : les entérocytes

ôle d’a so ptio des ali e ts , les ellules u ipa es ali ifo es p ote tio de la su fa e

de l'épithélium par la sécrétion du mucus), les cellules entéroendocrines (sécrétion des

hormones peptidiques) et les cellules de Paneth (sécrétion de lysozymes et rôle immunitaire)

(Goodell et al., 2015) (figure H-6).

Les entérocytes, les cellules mucipares caliciformes et les cellules entéroendocrines se

diff e ie t e ig a t e s l’e t it des ptes et e haut des illosit s, es ellules

su isse t l’apoptose et des ua e t da s la lu i e i testinale. Les cellules de Paneth se

différencient en migrant vers la base de la crypte. Ces cellules ont une durée de vie plus longue

ue les aut es t pes ellulai es a a t d’ t e phago t es pa les ellules e i o a tes.

Introduction

30

Figure H-6 : Les cellules souches intestinales (CSIs). Les CSIs sont localisées au niveau de la base

des cryptes de Lieberkühn et sont de deux types : les cellules souches CBC (Crypt base columnar)

et les cellules souches intestinales quiescentes (qISC). Les cellules souches CBC prolifèrent

quotidienne e t et assu e t la p odu tio des diff e ts t pes ellulai es de l’ pith liu intestinal. Les cellules souches CBC se divisent et produisent des cellules filles progénitrices de

deux types ; les cellules TA (transient amplifying) et les cellules progénitrices sécrétrices. Ces

cellules progénitrices se différencient par la suite et donnent naissance aux divers types cellulaires

de l’ pith liu i testi al e t o tes, ellules ali ifo es, ellules e t oe do i es, ellules de Paneth). Les qISC se divisent rarement sous conditions homéostatiques mais peuvent être induites

à produire de nouvelles cellules souches CBC en réponse à des lésions ou à d'autres stimuli. D’ap s Goodell, M.A et al (2015).

Introduction

31

3.2.6 Les ellules sou hes de l’ pide e

L’ pide e est u tissu qui se renouvelle constamment par le phénomène de

des ua atio . Cette de i e o espo d à l’ li i atio des ellules de la ou he o e ui

sont replacées rapidement par les kératinocytes. Il existe ainsi une population de cellules

souches multipotentes apa les d’auto e ou elle e t et ui e p i e t des a ueu s

sp ifi ues o e la K , des ol ules d’adh sio o e des β -intégrines, des E-

adh i es et des β-caténines. Ces cellules souches portent le nom de cellules souches des

kératinocytes (CSKs) (Watt, 2002). Ces CSKs donnent rapidement des cellules intermédiaires

qui se détachent de la membrane basale et se différencient (Solanas and Benitah, 2013)

(figure H-7). On a ainsi des CSKs au niveau de la couche basale associée à des cellules

intermédiaires, des cellules intermédiaires dans la couche épineuse, des cellules différenciées

dans la couche granuleuse et des cellules mortes dans la couche cornée.

Les CSKs so t issues d’aut es ellules sou hes ultipote tes appel es ellules sou hes

de l’ pide e C“Eps). Les CSEps e p i e t les a ueu s CD , le K et la α -intégrine

(Mimeault and Batra, 2006). Les CSEps so t à l’o igi e des cellules progénitrices de la matrice

du follicule pileux, des cellules progénitrices des glandes sébacées et des cellules de la papille

de i ue. A la diff e e des C“Ks ui e do e t aissa e u’au cellules épidermiques,

les CSEps se différencient à la fois e ellules de l’ pide e et e ellules p og it i es de la

matrice du follicule pileux. En plus des CSKs et des CSEps, la peau contient également des

cellules souches pluripotentes épidermiques issues de la crête neurale (eCSCNs). Les eCSCNs

ont été découvertes par LI et al. en 2003 chez la souris comme des cellules exprimant la

nestine (marqueur des cellules de la crête neurale) et retrouvées en partie au niveau du bulbe

du follicule pileux. Les eCSCNs expriment aussi le CD34 et THY-1 et peuvent se différencier en

plusieurs lignages cellulaires incluant des neurones, des mélanocytes, des cellules de Schwann

et des cellules de Merkel (Mimeault and Batra, 2006) et (Sakaue and Sieber-Blum, 2015). Les

eNCSCs semblent être localisées au niveau du bulbe du follicule pileux mais leur localisation

change suivant le cycle folliculaire (Li et al., 2003).

Introduction

32

3.2.7 Les ellules sou hes de l’ pith liu pul o ai e

Chez la sou is, l’ pith lium pulmonaire renferme des cellules souches multipotentes

capables de se différencier en cellules ciliées et en cellules mucipares des glandes sous-

muqueuses (Kim et al., 2005; Lee et al., 2014; Mimeault and Batra, 2006). Ces cellules sont

appelées cellules souches broncho-alvéolaires multipotentes ou CSBAs et sont capables

d’auto-renouvellement. Les CSBAs sont au niveau de la jonction broncho-alvéolaire

(Engelhardt, 2001) et contribuent au maintien des cellules broncho-alvéolaires du poumon.

Ces cellules expriment différents marqueurs comme le marqueur « Scgb1a » des cellules

bronchiques exocrines de Clara, le marquer « AT2 ou alveolar type 2» et le marqueur CPS

(prosurfactant protein C) (Kim et al., 2005). Les CSBAs so t dot es de apa it s d’auto-

renouvellement et se différencient en réponse à une lésion pulmonaire en cellules épithéliales

Figure H-7 : Les cellules souches de l'épiderme interfolliculaire. Les cellules souches de l'épiderme

interfolliculaire humain expriment des marqueurs spécifiques (intégrines α6 et β1, LRIG1, MCSP et

Kératine 15). On a ainsi des cellules souches au niveau de la couche basale associée à des cellules

intermédiaires, des cellules intermédiaires dans la couche épineuse, des cellules différenciées dans

la couche granuleuse et des cellules mortes dans la couche cornée. LRIG1 (Leu-rich repeats and

immunoglobulin-like domains 1), MCSP (melanoma-associated chondroitin sulphate proteoglycan). D’ap s “ola as, G et Benitah, S.A. (2013).

Introduction

33

bronchiques en en cellules épithéliales alvéolaire (Lee et al., 2014; Tropea et al., 2012;

Zacharek et al., 2011) (figure H-8).

L’EGF epide al g o th fa to et le “HH “o i hedgehog au i eau de l’ pith liu

pul o ai e joue t u ôle i po ta t da s l’ho ostasie tissulai e du pou o e sti ula t la

prolifération et la différenciation des CSBAs. Ces facteurs contribueraient ainsi à la réparation

de l’ pith liu pul o ai e ap s u e l sio (Mimeault and Batra, 2006). La majorité des

recherches sur les cellules souches pulmonaires ont été effectuées chez la souris, mais les

mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent l'homéostasie pulmonaire et la

g atio so t e o e al o p is hez l’Ho e.

3.2.8 Les cellules souches de la cornée et de la rétine

L’ pith liu de la su fa e des eu o p e d la o e, le li e, et l’ pith liu st atifi

conjonctival. De par son exposition aux agressions extérieures ce tissu est constamment

régénéré. Dans la cornée il existe des cellules souches de l’ pith liu o e C“ECs qui

Figure H-8 : Les ellules sou hes de l’ pith liu pul o ai e. Les ellules souches broncho-

alvéolaires (CSBAs) se trouvent au niveau de la jonction broncho-alvéolaire et peuvent se

différencier en cellules épithéliales bronchiques et en cellules épithéliales alvéolai es. D’ap s Lee et al., (2014).

Introduction

34

sont localisées plus particulièrement au niveau du limbe dans des cryptes épithéliales (Li et

al., 2007; Pajoohesh-Ganji and Stepp, 2005) (figure H-9).

Les CSECs forment des cellules progénitrices transitoires qui à leur tour donnent des

cellules différenciées de la cornée (Li et al., 2007; Pajoohesh-Ganji and Stepp, 2005). Ces

cellules souches expriment des marqueurs co e le p , l’ABCG , les α - et β -intégrines,

l’EGF-R, le K , l’α-énolase, et le CD71.

U aut e t pe de ellules sou hes e iste aussi au i eau de l’ pith liu iliai e po ta t

le nom de cellules souches rétiniennes (CSRs). Les CSRs peu e t s’auto-renouveler et

expriment des marqueurs comme la télomérase, la nestine et PAX-6 (Das et al., 2005). La

Figure H-9 : Les cellules souches du limbe scléro-cornéen (CSECs). Les cellules souches du limbe

scléro-cornéen (SC) sont situées dans la couche basal du limbe oculaire. Au niveau de cette

couche épithéliale, il existe aussi des cellules progénitrices (eTAC et lTAC) en plus des

mélanocytes (M) et des ellules de La ge ha ’s LC . Les ellules p og it i es p o es eTAC donneraient naissance à des cellules progénitrices tardives (lTAC), qui à leur tour donneraient les

cellules post-mitotiques suprabasales (PMC), et enfin les cellules superficielles différenciées

(TDC). La membrane basale (BM) sépare l'épithélium du stroma sous-jacent. Ce dernier contient

des cellules mésenchymateuses (MC), des nerfs (N) et des aisseau sa gui s BV . D’ap s Li, W et al. (2007).

Introduction

35

prolifération et la différenciation des CSRs sont régulées par de nombreux facteurs et voies de

signalisation (Das et al., 2005).

3.2.9 Les cellules souches/progénitrices hépatiques

Dans des conditions physiopathologiques, par exemple une infection ou un

traumatisme, le foie peut initier un processus de régénération. Le renouvellement hépatique

est assuré par les hépatocytes et les cholangiocytes ou cellules des canaux biliaires qui sont

des cellules inter-mitotiques pouvant entrer en division après stimulation. Ces deux types

cellulaires assurent seulement une régénération à petite échelle lors de lésions mineures.

Des recherches ont révélé la présence de niches pour des cellules souches au sein des

canaux de Hering (canaux biliaires dans la région péri-portale). Ces cellules progénitrices

hépatiques (CPHs) présentent un phénotype intermédiaire entre les hépatocytes péri-portaux

et les cellules des canaux biliaires (Tarnowski and Sieron, 2006). Les CPHs assurent une

régénération à grande échelle et se différencient en hépatocytes et en cellules des canaux

biliaires (Van Haele and Roskams, 2017) (figure H-10). L’o igi e des CPHs serait soit les

hépatoblastes (eux-mêmes issus de cellules précurseurs endodermiques) ; soit des cellules

précurseurs endodermiques (Walkup and Gerber, 2006). Les CPHs expriment de manière

spécifique le OV-6 (ovalbumine-6) (Tarnowski and Sieron, 2006) mais expriment aussi des

marqueurs communs avec les hépatocytes immatures et les cellules des canaux biliaires

o e le CK , l’α-f top ot i e αFP , la -glutamyl-t a sf ase, l’al u i e ALB , le CK ,

et l’OC . Les CPHs sont aussi positives pour des marqueurs hématopoïétiques comme CD34,

THY-1, FLT-3 et KIT. Plusieurs facteurs (HGF, EGF, TGF-α, VEGF, SCF, TGF-β, et “DF-1) et voies

de sig alisatio s WNT/β-caténine, Notch) sont impliqués dans la régulation de la prolifération

et de la différenciation de ces cellules pendant la régénération hépatique. Des études ont

suggérés une source extra-hépatique des CPHs que serait la moelle osseuse (Tarnowski and

Sieron, 2006).

Introduction

36

3.2.10 Les cellules souches neurales (CSNs) du système nerveux central

Depuis très longtemps, le cerveau était considéré comme un organe dépourvu de

régénération avec un stock de neurones qui diminue tout au long de la vie. Mais des études

sur les rongeurs dans les années 196 o t l u’il e istait u ph o e de eu oge se

dans certaines zones du cerveau adulte de mammifères (Altman, 1963, 1969; Altman and Das,

1965). Plus tard entre 1970 et 1980, cette neurogenèse a été confirmée chez des rongeurs

Figure H-10 : Les cellules progénitrices hépatiques (CPHs). Les CPHs quiescentes (K19, K7, NCAM,

CD133+) prolifèrent après activation et donnent des CPHs (K19, K7, NCAM, CD133+, EpCAM). Ces

dernières peuvent se différencier à la fois en hépatocytes et en cholangiocytes, lors de

l'embryogenèse et suite à une lésion hépatique. Après une blessure, la différenciation des CPHs

dépend du site de la lésion. Après une perte d'hépatocytes, les CPHs a ti es s’e gage t da s u lignage hépatocytaire et donnent naissance à des CPHs (K19-, K7+, NCAM-, CD133-, EpCAM+) suite à

l’i hi itio de la oie de sig alisatio Not h. Ces dernières se différencient en hépatocytes matures

(K19-, K7-, NCAM-, CD133-, EpCAM-). Après la perte des voies biliaires, les CPHs a ti es s’e gage t dans un lignage cholangiocytaire et donnent des CPHs (K19+, K7+, NCAM+, CD133-, EpCAM+) via

l'activation de la voie Notch. Ces CPHs engagées se différencient après en cholangiocytes matures

(K19+, K7+, NCAM-, CD133-, EpCAM+). X: inhibition, ++: activation, numb: inhibiteur de la voie Notch.

D’ap s Va Haele, M., et Roska s, T. .

Introduction

37

da s l’hippo a pe et da s la zo e sous-ventriculaire près du ventricule latéral (Bayer, 1982;

Kaplan and Hinds, 1977).

Il a fallu attendre les années 1990 pour démontrer que la neurogenèse se produisait

gale e t da s le e eau des p i ates et de l’Ho e (Kuhn et al., 1996; Luskin, 1993; Seki

and Arai, 1993). La neurogenèse commence précisément dans deux zones du cerveau qui sont

le g us de t de tal g us ou DG de l’hippo a pe et la zo e sous-ventriculaire

(subventricular zone ou SVZ) (Taupin, 2006). Dans le DG, les nouvelles cellules neuronales sont

obtenues au niveau de la zone sous-granulaire (subgranular zone ou SGZ) puis elles migrent

da s la ou he des ellules g a ulai es d’où elles se p ojette t da s l’ai e CA de la o e

d’A o (Bond et al., 2015) (figure H-11 A).

Da s la “V), les ou elles ellules eu o ales o te ues ig e t jus u’au ul e olfa tif

(olfactory bulb ou OB), à travers la voie de migration rostrale (rostro-migratory stream ou

RMS), où elles se différencient en interneurones. Dans le cerveau adulte, la majorité de la

neurogenèse se fait dans la SVZ et la SGZ (LI et XIE, 2005; TARNOWSKI et SIERON, 2006). Une

eu oge se plus « dis te » a t appo t e da s d’aut es zo es du e eau o e le o ps

st i et le e e t i ule et l’ai e CA , hez les o geu s, ai si ue dans le néocortex chez

les primates non humains (Taupin, 2006).

Les CSNs so t dot es de apa it d’auto-renouvellement et elles sont considérées

comme des cellules souches multipotentes donnant naissance aux neurones, aux astrocytes

et aux oligodendrocytes (Taupin, 2006) (figure H-11 B). Les CSNs sont aussi les précurseurs

des cellules progénitrices neurales (neural progenitor cells ou NPCs) et gliales (glial progenitor

cells ou GPCs). Ces deux types de cellules progénitrices sont des cellules indifférenciées et

comparées aux CSNs, elles possèdent une capacité de prolifération limitée et ne peuvent pas

s’auto-renouveler (Taupin, 2006).

L’isole e t et la a a t isatio in vitro des CSNs ont commencé en 1992 avec les

travaux de REYNOLD et WEISS sur la souris. Ces travaux ont montré que les CSNs isolées à

partir de la SVZ pouvaient se différencier en neurones, en astrocytes et en oligodendrocytes.

Ces cellules avaient la particularité de se développer en neurosphères in vitro en présence de

l’EGF.

Introduction

38

A

B

Figure H-11 : Les cellules souches neuronales. (A) Vue sagittale du cerveau adulte de rongeur

montrant les deux niches ; la SVZ (subventricular zone) et la SGZ (subgranular zone) des cellules

souches neurales (NSCs). La SVZ est située le long du ventricule latéral (LV) dans le cerveau

antérieur, tandis que la SGZ est située dans l'hippocampe (Hipp) le long de la couche granulaire du

gyrus denté (DG). CC : corps calleux ; OB : bulbe olfactif; RMS : courant de migration rostrale ; St :

striatum ; CA1 : ai e CA de l’hippo a pe ; CA : ai e CA de l’hippo a pe. (B) Potentiel de

différenciation des NSCs. Les NSCs adultes se trouvent dans un état quiescent ou actif en quittant

ou en entrant dans le cycle cellulaire, respectivement. Une fois activées, les NSCs peuvent se diviser

de manière asymétrique (donnant une NSC et une cellule progénitrice intermediaire IPC) ou de

manière symétrique (donnant deux NSCs ou deux IPCs). Les IPCs peuvent être unipotentes (se

différentiant en un seul type cellulaire), ou multipotentes (se différenciant en plusieurs types

cellulaires . Il est aussi possi le u’u e N“Cs puisse se diff e ie di e te e t e ellules gliales matures (astrocytes). NG2 : eu al/glial a tige . D’ap s Bo d, A.M et al. (2015).

Introduction

39

La nestine marque les cellules souches neuro-épithéliales et les cellules du système nerveux

central durant le développement embryonnaire. En plus de la nestine, les cellules souches

fo a t es eu osph es e p i e t aussi d’aut es a ueu s o e LEX/““EA-1, AC133 et

NG2 (Tarnowski and Sieron, 2006). D’aut es uipes o t pu isole des NSCs à partir du cerveau

adulte et de la oelle pi i e hez de o euses esp es o p is l’Ho e (Li and Xie,

2005; Taupin, 2006). La neurogenèse du cerveau adulte est modulée par de nombreux stimuli

environnementaux et selon certaines conditions physiopathologiques (Taupin, 2006). Chez le

o geu , l’e e i e aug e te ait la eu oge se da s l’hippo a pe alo s ue l’a a e e t

da s l’âge la di i ue ait. L’isole e t so ial, l’al oolis e, le st ess et le a ue de so eil

diminuent la neurogenèse. La neurogenèse adulte survient dans les processus physiologiques

o e la oi e et d’app e tissage ais aussi da s des conditions pathologiques, comme

les pathologies neurologiques et les traumatismes du cerveau (Taupin, 2006).

3.2.11 Les cellules souches musculaires squelettiques

Le muscle strié squelettique renferme des cellules souches bien caractérisées qui

assurent son renouvellement et sa réparation lors des lésions. Les cellules souches

myogéniques, nommées cellules satellites (satellite cells ou SCs), se localisent entre deux

couches de lame basale et expriment des marqueurs comme N-CAM, CD56, la M-cadhérine,

PAX-7, MYO-D et MYF- . L’e p essio e es a ueu s a ie selo le stade de différenciation

(McCullagh and Perlingeiro, 2015; Zammit et al., 2006) (figure H-12). Les SCs se trouvent dans

u tat uies e t ais suite à leu a ti atio pa u sti ulus lessu e, t au atis e, …) ces

cellules prolifèrent, fusionnent et se différencient en myofibres (Christov et al., 2007; Hawke

and Garry, 2001). La différenciation des SCs en myofibres s’a o pag e de ha ge e ts

toplas i ues i po ta ts o e la du tio de l’h t o h o ati e, aug e tatio du

atio toplas e/ o au et aug e tatio du o e d’o ga elles i t a ellulai es (Hawke and

Garry, 2001; Tarnowski and Sieron, 2006).

Introduction

40

L’h poth se d’u e pa atio a dia ue, ap s i farctus, par des cellules satellites de

us le s ueletti ue a t test e hez l’a i al et l’ho e. Les sultats o te us o t e t

que le potentiel de différenciation in vivo des SCs en muscle cardiaque, après injection de SCs

da s des od les a i au d’i farctus, a pu améliorer la fonction cardiaque (Al Attar et al.,

2003; Blatt et al., 2003; Horackova et al., 2004).

Chez l’Ho e, l’i je tio de “Cs da s le o a de se le gale e t favoriser la

fonction cardiaque (Menasché et al., 2001, 2003; Siminiak et al., 2004). Cependant, les SCs

’adopte t pas de ph ot pe ardiaque mais sauvegardent leur phénotype squelettique

(Dorfman et al., 1998; Reinecke et al., 2002).

D’aut e pa t, les otu es fo s ap s i je tio ’ ta lisse t pas de o e io a e

les cardiomyocytes environnants (Leobon et al., 2003) ou alors très rarement (Rubart et al.,

2004) laissa t pe se ue l’a lio atio de la fo tio a dia ue passe ait pa d’aut es

a is es. D’aut es ellules o t pu t e isol es in vitro à partir du muscle squelettique et

différenciées en cardiomyocytes contractiles (Winitsky et al., 2005). Ces cellules sont

différentes des SCs et ’e p i e t pas de a ueu s de ellules sou hes o e “ a-1 et c-

Figure H-12 : Les cellules satellites du muscle strié squelettique. Les cellules souches adultes du

muscle strié squelettique ou cellules satellites (SCs) peuvent sortir de leur état quiescent sous

certaines conditions. La SC quiescente (Pax7+ s’a ti e et se di ise de manière asymétrique donnant

naissance à une cellule SC (flèche incurvée) et une cellule SCs (Pax7+, Myf5+, MyoD-). Cette dernière,

à son tour, se divise asymétriquement et se diffrérencie en myoblaste (Pax7+, Myf5+, MyoD+). Le

myoblaste se divise asymétriquement et se différencie en myocyte (MyoD+, Myogénine). Enfin, les

myocytes fusionnent entre eux pour former des myotubes (Desmine+, MyH+, α-actinine+ . D’ap s McCullagh, K.J et Perlingeiro, R.C (2015).

Introduction

41

kit. Cette nouvelle population de cellules souche contractile pourrait, selon les auteurs,

représenter une alternative intéressante.

3.2.12 Les cellules souches cardiaques

Depuis lo gte ps, le œur des mammifères a été considéré comme un organe post-

mitotique dépourvu de tout pouvoir de régénération. Ce dogme a ainsi limité la recherche

fondamentale et clinique en cardiologie depuis plusieurs décennies. On pensait alors que suite

aux lésions cardiaques, les cardiomyocytes subissaient des hypertrophies cellulaires et ne

pouvaient pas être remplacés. Une autre hypothèse propose que pendant la vie

embryonnaire, les CSEs a dia ues s’e gage t da s u ph ot pe a dia ue et pe de t

définitivement leurs p op i t s de ellules sou hes da s le œu adulte (Anversa et al., 2006).

Il est vrai que, suite à un infarctus du myocarde, les cardiomyocytes nécrosés sont remplacés

par un tissu cicatriciel fibrotique. Cependant, quelques recherches ont pu montrer que les

a dio o tes peu e t se di ise de a i e peu f ue te da s le œur adulte (Beltrami

et al., 2001; Kajstura et al., 1998; Quaini et al., 2002; Reiss et al., 1994). Cette découverte de

divisions mitotiques cardiomyocytaires a cassé le dogme selon lequel le nombre de

cardiomyocytes était défini à la naissance et a éveillé la curiosité des chercheurs sur le fait que

ces nouveaux cardiomyocytes dériveraient de cellules souches cardiaques (figure H-13). En

effet, plusieu s uipes o t is e ide e l’e iste e de ellules sou hes a dia ues

(Cardiac Stem Cells ou CSCs) capables de se différencier en myocytes, cellules musculaires

lisses et en cellules endothéliales (Beltrami et al., 2003; Linke et al., 2005; Oh et al., 2003;

Urbanek et al., 2005). Cette découverte importante a donné de nouvelles perspectives

o e a t la iologie du œu et les mécanismes de son homéostasie tissulaire et de sa

régénération. Grâce à ces travaux, le concept de CSCs est né et le tissu cardiaque est désormais

d fi i o e u tissu apa le d’auto-renouvellement et les myocytes sont régénérés durant

toute la vie de l’o ga is e (Bergmann et al., 2015; Lázár et al., 2017). De même, il a été

montré que les C“Cs e s’e gage t pas i e si le e t e se diff e ia t du a t la ie

embryonnaire mais elles restent après la naissance apa les d’auto-renouvellement.

Introduction

42

B

b

d

a

c

Figure H-13 : Concept des cellules souches cardiaques. (A) La niche cardiaque contient des cellules

souches quiescentes qui une fois activées, donnent des cellules progénitrices qui se différencient

en cardiomyocytes. Dans des conditions pathologiques, les cellules souches cardiaques activées

sont plus nombreuses et forment de nouveaux cardiomyocytes. (B). Cardiomyocytes en division

e ouge e p i a t l’α-a ti e da s des œu s de ats fœtau (a), néonatals (b), adultes (c), et

hypertrophiés (d). Les encadrés blancs montrent des cardiomyocytes en mitose (indiqués par des

flèches). La couleur verte montre les noyaux des cellules (marquage iodide de propidium ou PI) et

la couleur bleue montre le marquage des cellules en prolifération Ki67. D’ap s A e sa, P et al.(2006).

A

Introduction

43

Suite à cette nouvelle découverte, plusieurs groupes de chercheurs ont pu isoler des

C“Cs à pa ti de œu s adultes e se asa t su l’e p essio de e tai s arqueurs de surface

déjà utilisés pou isole des ellules sou hes à pa ti d’aut es o ga es.

Chapitre II : Cellules souches et progéniteurs cardiaques

1 Nature des cellules souches cardiaques

Le ph ot pe des C“Cs ’est pas e o e ie d fi i. La o e latu e est i p ise et

plusieurs types de cellules cardiaques adultes ont été caractérisés et proposés comme des

cellules souches cardiaques (Iancu et al., 2015). Le nombre des CSCs chez différentes espèces,

o p is l’Ho e, est estimé à environ 1 CSC pour 8000 à 20000 myocytes (Anversa et al.,

2006). Un modèle de classement par hiérarchie de différenciation des CSCs a été proposé

(figure H-14). Selon ce modèle, une CSC originelle se divise de manière asymétrique pour

donner naissance à une cellule souche fille et une autre cellule fille nommée cellule

progénitrice (CPg). Cette CPg à son tour donne une variété de cellules progénitrices plus

sp ialis es ; les p u seu s de o tes MPg , u e ellule p og it i e d’e doth liu EPg

et enfin, une cellule progénitrice de muscle lisse (SMPg). Ces cellules donnent ensuite un

précurseur ; la MPg ui est à l’o igi e d’u e ellule p u seu de o tes MP , la EPg u e

ellule p u seu d’e doth liu EP et la “MPg u e ellule p u seu de us le lisse “MP .

Enfin, les précurseurs deviennent des « cellules amplificatrices transitoires » (transient

amplifying cells) et se différencient en myocytes matures des cellules endothéliales ou des

cellules du muscle lisse des vaisseaux sanguins. Les CSC dans ce modèle sont des cellules

lignage-négatives qui expriment uniquement c-kit, MDR1 ou Sca-1. Les progéniteurs

expriment des antigènes de cellules souches et des facteurs de transcription de cellules

cardiaques mais ne présentent pas de protéines cytoplasmiques spécifiques.

Introduction

44

Les précurseurs possèdent des antigènes de cellules souches, des facteurs de transcription et

des protéines membranaires et cytoplasmiques typiques des myocytes, des EC et des SMC.

Les cellules amplificatrices ont des protéines nucléaires, cytoplasmiques et membranaires des

lig ages a dia ues ais so t gati es pou les a tig es de ellules sou hes. A l’heu e

actuelle, plusieurs types ou catégories de cellules souches/progénitrices cardiaques sont

tudi s. Cette at go isatio est as e selo l’e p essio sp ifi ue de e tai s pitopes de

surface. Cependant, la distinction entre les cellules souches et les cellules plus engagées

p og iteu s ou ellule a plifi at i e t a sitoi e est sou e t d li ate a l’e p essio de

Figure H-14 : Hiérarchie de la croissance et de la différenciation des cellules souches cardiaques (CSCs). Une CSC se divise de manière asymétrique pour donner naissance à une CSC (auto-renouvellment) et une cellule progénitrice fille (CPg) qui peut être c-kit+, Sca-1+ ou MDR1+. La CPg (GATA4+) est multipotente et peut donner des cellules progénitrices plus spécialisées ; les cellules progénitrices du muscle lisse SMPg (GATA4+ ,GATA6+), les cellules progénitrices de myocytes MPg (GATA4+,Nkx2.5+,MEF2C+ et les ellules p og it i es d’e doth liu EPg GATA +, Ets1+). Ces trois types de cellules progénitrices se spécialisent encore en précurseurs SMPr, MPr et EPr et deviennent des cellules amplificatrices transitoires. Enfin, les trois types de précurseurs se diff e ie t e ellules us ulai es lisses, o tes et ellules e doth liales. D’ap s A e sa, P et al. (2006).

Introduction

45

certains épitopes de surface peut être commune entre ces cellules. Ceci complique leur

ide tifi atio et leu lassifi atio . Des e p ie es d’isole e t à partir de tissus humains ont

montré que différents types de cellules souches/progénitrices étaient présents da s le œu

(Guan and Hasenfuss, 2013). Elles expriment différentes protéines qui peuvent permettre de

les caractériser comme le facteur de transcription islet-1 (Isl- , l’a tig e-1 des cellules

souches (Sca-1) ou encore le récepteur membranaire au facteur de croissance des cellules

souches c-Kit, cellules SP (Side Population) etc (Tableau H-1).

Tableau H-1 : P i ipau a ueu s des ellules sou hes a dia ues CSCs . Modifi d’ap s Ia u et al., 2015).

Type de CSCs

Positives pour Négatives pour Plus ou moins

c-kit+

c-kit, MDR1, Gata4, TBX5 et NKX2-5

CD45, CD34, CD31, KDR Sca-1

Sca-1+

MDR1, CD31, Pdfra, Tcf21, Gata4, Gata6, Tbx5, Tbx20, Hand2

CD45, CD34, Kdr, Isl1, Nkx2-5, Hand1

c-kit

Isl1+

Isl1, Nkx2.5, Flk1, TBX1 CD45, CD31, Sca-1 c-kit

BCRP+ ou SP

Nk . , α“A, MDR , A g , Vegf, Vcam1, Icam1, Vwf, CD29, CD44, capsulin, Meox2, Mef2A, Mef2C

c-kit, CD31, Sca-1, CD45, Oct3/4, SSEA-3, SSEA-4, Esg1, Rex3, SOX2, Utf1, Nkx2.5, Hand 1/2, myocardin

Gata4

2 Types des cellules souches cardiaques

2.1 Les CSCs c-kit positives (CSC c-kit+)

C-kit a été identifié dans les années 1980 comme un proto-oncogène dans les cellules

de mammifères (Yarden et al., 1987). C-kit ou CD117 est un récepteur (glycoprotéine

transmembranaire de 145 kDa) au facteur de croissance SCF (Stem Cell Factor) qui possède

une activité tyrosine kinase. Le gène codant pour ce récepteur de 5,1 kpb est situé sur le

chromosome 4 humain. La protéine c-Kit est couplée à des voies de signalisations

intracellulaires impliquées dans la survie, la prolifération et la différenciation cellulaire (Nigro

et al., 2015).

Les CSCs exprimant c-Kit ont été découvertes en 2003 (Beltrami et al., 2003) comme une

a e populatio side te da s le œu . Pa e e ple, da s le o a de du at adulte, les C“Cs

Introduction

46

c-Kit+ sont relativement rares (1 pour 104 myocytes) et de petite taille (un dixième de la taille

d’u o te . De e, la f a tio des C“Cs -Kit+ isol es à pa ti de œu s hu ai s sai s

est e t e e t fai le et ette f a tio est aug e t e lo s d’u e h pe t ophie a dia ue

(Urbanek et al., 2003) ou après un infarctus (Kubo et al., 2008; Urbanek et al., 2005). D’aut es

études ont montré que le nombre des CSCs c-kit+ augmente considérablement chez le rat lors

de l’h pe t ophie ph siologi ue due à l’effo t ph si ue (Kolwicz et al., 2009; Waring et al.,

2014). Les CSCs c-Kit+ expriment plusieurs facteurs de transcription cardiaques (NKX2.5+/-,

GATA4+ et MEF2C+) mais elles sont négatives pour les marqueurs du lignage hématopoïétique

(LIN-) comme CD31, CD34, CD45, CD20, CD45-RO et CD8 (Barile et al., 2007). Ces cellules

sou hes poss de t des apa it s d’auto-renouvellement et peuvent se différencier in vitro en

cardiomyocytes, cellules musculaires lisses et cellules endothéliales (Beltrami et al., 2003)

(figure H-15).

Figure H-15 : Illustration schématique des cellules souches cardiaques exprimant c-kit (CSCs c-kit+) et de leur pouvoir de différenciation. Les CSCs c-kit+ se trouvent au niveau des quatre chambres cardiaques (majoritairement dans les oreillettes et faiblement dans les ventricules). Les CSCs c-kit+ (Isl-1-, CD45-, CD31-, GATA4+), se différencient in vivo e a dio o tes e p i a t l’ α-a ti e α-actin+), en cellules musculaire lisses et en cellules endothéliales. In vitro et après traitement à la 5-Azacitydine (5-Aza), les CSCs c-kit+ peuvent être différenciées en cardiomyocytes non battants positives pour la troponine-T cardiaque (cTnT+). RA : oreillette droite, LA : oreillette gauche ; RV : ventricule doit ; LV : e t i ule gau he. D’ap s Gua et Hase fuss. .

Introduction

47

Les cellules CSCs c-kit+/Lin- ep se te t l’u e des p i ipales populatio s de ellules sou hes

t ou es da s le œu (Bollini et al., 2011). Ces cellules se localisent préférentiellement dans

l’o eillette d oite du œu hez l’adulte et hez l’e fa t (Itzhaki-Alfia et al., 2009; Mishra et al.,

2011). Cependant, l’e p essio de -kit ’est pas se seule e t au C“Cs a ette

protéine est aussi exprimée par les mastocytes (Kubo et al., 2008), les cellules endothéliales

(Castaldo et al., 2008), des cellules souches de la moelle osseuse (Chong et al., 2011), les

cellules dendritiques et mélanocytes (Fang et al., 2012), les cardiomyocytes postnatals (Li et

al., 2008) etc. A cause de cette expression non spécifique, les CSCs c-Kit+ représentent une

population hétérogène. E effet, l’a al se t a s ipto i ue au ou s de la diff e iatio

cardiaque des cellules c-Kit+ a l l’e iste e de plusieu s lasses de C“C -kit+; les cellules

c-Kit+KDR+ ou VPC (vascular progenitor cells) , les cellules c-Kit+KDR- ou MPC (myocyte

progenitor cells) et les c-kit+KDR+CD31+ (se différenciant en cellules endothéliales) (Bearzi et

al., 2009; Fang et al., 2012; Tallini et al., 2009). Une autre étude a montré que les CSC c-kit+

expriment des marqueurs mésenchymateux comme le CD105 et le CD29 (Gambini et al., 2011)

et peuvent se différencier en adipocytes et en ostéocytes (Itzhaki-Alfia et al., 2009). Il est

probable donc que les CSCs c-kit+ isolées in vitro soient contaminées par d'autres types

cellulaires (fibroblastes cardiaques, les mastocytes ou les cellules de lignée hématopoïétique).

Les données sur l'expression des marqueurs de lignage sont encore plus conflictuelles. Par

exemple, des études ont montré que les CSC c-kit+ n'expriment pas tous les marqueurs de

lignage cardiaques tels que GATA4, NKX2.5, MEF2C (Bearzi et al., 2007; Boni et al., 2008;

D’A a io et al., . De plus, da s les œu s des ou eau-nés et des jeunes enfants, le

pourcentage de cellules c-kit+ variait de 5% à 9% et seulement 1% à 3% des cellules c-kit+

étaient positives pour Nkx2.5+ (Mishra et al., 2011). De toute évidence, de nombreux aspects

de ces cellules restent à comprendre.

In vitro, les CSC c-kit+ ont des propriétés typiques de cellules souches et certaines études

in vivo ont montré que la transplantation de ces cellules améliore la fonction cardiaque chez

des od les a i au d’i fa tus du o a de (Ellison et al., 2013). Chez l’Ho e, l’i je tio

intra-coronarienne de CSCs c-Kit+ p e ie essai li i ue su l’Ho e de phase I a a lio

la fo tio s stoli ue du e t i ule gau he et a duit la taille de l’i farctus chez les patients

souffra t d’i suffisa e a dia ue (Bolli et al., 2011; Chugh et al., 2012). Une étude a

également montré que la perfusion intra-coronarienne de 20 millions de CSCs c-kit+ dans des

Introduction

48

œu s des po s e p o o ue au u do age al, h pati ue ou o a dia ue (Keith et

al., 2015). Néanmoins, la rétention de ces cellules dans le myocarde reste faible malgré le

nombre élevé injecté.

2.2 Les CSCs Sca1 positives (CSC Sca1+)

L'antigène de cellules souches-1 (Sca-1 ou Ly6A) est une protéine à ancre GPI

(glycerophosphatidylinositol) de 18 KDa qui appartient à la famille des gènes Ly6 (lymphocyte

activation protein-6). La famille des gènes Ly6 contient au moins 18 gènes liés étroitement sur

le h o oso e et ui pa tage t plus de % d’ho ologie de s ue e a e “ a-1 (LeClair

et al., 1986; Patterson et al., 2000; van de Rijn et al., 1989). Co e d’aut es p ot i es à a e

GPI, les protéines Ly6 ont une position membranaire idéale pour réguler ou co-activer des

voies de signalisation via des liaisons ligand- epteu ou d’aut es i te actions protéine-

protéine. Cependant le mécanisme moléculaire exact par lequel ces protéines agissent reste

non élucidé. Sca-1 a été initialement identifié comme marqueur de cellules souches

hématopoïétiques murines (Chong et al., 2014; Han et al., 1995) mais son expression est

également retrouvée da s d’aut es t pes ellulai es. En effet, plusieurs groupes de chercheurs

ont identifié la protéine Sca-1 chez la souris dans plusieurs tissus comme le système

squelettique (Short et al., 2001), la glande mammaire (Welm et al., 2002), la prostate (Burger

et al., 2005; Xin et al., 2005), le derme (Fernandes et al., 2004; Toma et al., 2001), le muscle

squelettique (Gussoni et al., 1999; Lee et al., 2000), le foie (Petersen et al., 2003; Wulf et al.,

2003), la moelle osseuse (Gojo et al., 2003) et le œu (Oh et al., 2003; Rosenblatt-Velin et al.,

2005). Toutefois, il ’a pas e o e t o t si es populatio s “ a-1 positives sont vraiment

des cellules souches tissu-spécifiques. Plusieurs sous-populations de cellules Sca-1+ ont été

a a t is es da s des od les u i s e se asa t su l’e p essio de a ueu s de su fa e

lignage-spécifique (Valente et al., 2014). Ces sous-populatio s ’e p i e t pas les a ueu s

endothéliaux (CD31) et hématopoïétiques (CD45) nommées Lignage négatif (ou Lin-) et

montrent un profil mésenchymateux (CD34-, CD29+, CD90+, CD105+ et CD44+). Ces cellules

Sca-1+ murines, ont été décrites comme pouvant se différencier en cardiomyocytes, cellules

musculaires lisses et cellules endothéliales. De plus, les CSCs Sca-1+ murines expriment

faiblement les gènes codant pour les facteurs de transcription cardiaques précoces GATA-4 et

NKX2.5 et les protéines sarcomériques (Matsuura et al., 2004).

Introduction

49

Il a été montré que l'injection intra-myocardique du facteur de croissance hépatique (HGF) et

du facteur de croissance lié à l'insuline (IGF) chez des modèles animaux facilite la migration et

la prolifération des cellules Sca-1+ c-kit+, qui semblent se différencier en petits myocytes

fonctionnels (Linke et al., 2005; Urbanek et al., 2005).

De plus, après injection intraveineuse des CSCs Sca-1+ da s des od les d’i fa tus

murins, il a été mis en évidence dans le myocarde atteint, la présence de cellules différenciées

en cardiomyocytes e p i a t l’α-actine sarcomérique et la connexine 43 (Oh et al., 2003).

Bien que l'expression de Sca-1 soit limitée aux souris, une protéine de type Sca-1 a été

d te t e pa i os opie o fo ale et pa Weste lot da s le œu du hie et de l’Ho e

(Leri et al., 2005). Comme Sca-1, cette protéine appartient probablement à la famille des

gènes Ly6. Des cellules semblables à Sca-1+ (Sca-1+-like o t t isol es à pa ti du œu

humain adulte en utilisant des anticorps Sca-1 anti-souris. Ces cellules Sca-1+-like humaines

sont négatives pour le CD45, CD34, CD133 et CD14, et positives pour le CD105, GATA4 et

Nkx2.5 (figure H-16). Les CSCs Sca-1+-like hu ai e fœtales et adultes, so t ultipote tes et

peuvent se différencier en cardiomyocytes fonctionnels, en cellules endothéliales et en

cellules musculaires lisses (van Vliet et al., 2008, 2010). Cepe da t, au u essai li i ue ’a

été rapporté avec cette population cellulaire.

Introduction

50

2.3 Les CSCs Isl-1 positives (CSCs Isl-1+)

ISL1 (ISL LIM Homeobox 1) appartient à la famille de facteurs de transcription à

homéodomaine LIM qui lie et régule les promoteurs des gènes de l'insuline, du glucagon et de

la somatostatine. Une petite population de cellules souches cardiaques exprimant Isl-1 (CSCs

Isl-1+ a t ide tifi e da s le œu post atal hez la sou is et hez l’Ho e a e u e

localisation majoritaire au niveau des oreillettes (Laugwitz et al., 2005). Les cellules souches

cardiaques exprimant Isl-1 semblent générer, en plus des cardiomyocytes matures, une partie

du œud si o-auriculaire, des éléments de l'aorte proximale, du tronc pulmonaire, les tiges

des deux artères coronaires, les valvules aortiques et pulmonaires, l'endocarde, l’e doth liu

vasculaire et le muscle lisse (Moretti et al., 2006). Des analyses de coupes cardiaques

provenant du œu fœtal hu ai de 11 à 18 semaines, ont identifié une population mixte de

cellules ISL1+, une exprime uniquement Isl-1 et une autre qui expriment Isl- a e d’aut es

marqueurs spécifiques de lignage comme Nkx2.5 et TBX1. Les CSCs Isl-1+ se situent

principalement dans la région connue sous le nom du second champ cardiaque (oreillette

Figure H-16 : Illustration schématique des cellules souches cardiaques exprimant Sca-1 (CSCs Sca-1+) et de leur pouvoir de différenciation. Les CSCs Sca-1+ se trouvent majoritairement au niveau des oreillettes, faiblement dans le ventricule droit et elles sont absentes dans le ventricule gauche). Les CSCs Sca-1+ (CD45-, CD34-, CD133-, CD14-, CD105- , GATA4+, NKX2.5+), se différencient in vivo en cellules musculaire lisses et en cellules endothéliales. In vitro et après traitement à la 5-Azacitydine (5-Aza), les CSCs Sca-1+ peuvent être différenciées en a dio o tes atta ts positi es pou l’ α-a ti e α-actin+) et la troponine-I cardiaque

(cTnI+). RA : oreillette droite, LA : oreillette gauche ; RV : ventricule doit ; LV : ventricule gau he. D’ap s Gua et Hasenfuss. (2013).

Introduction

51

droite et le tractus d'éjection) (Bu et al., 2009). Juste après la naissance, des CSCs Isl-1+ ont

été identifiées chez la souris, le rat et l'Homme. In vitro, ces cellules sont capables de se

différencier en cardiomyocytes (Laugwitz et al., 2005). Durant le développement cardiaque,

les CSCs Isl1+ jouent un rôle primordial dans la création du ventricule droit, des oreillettes et

du t a tus d’ je tio (Cai et al., 2003). Ces cellules sont multipotentes et capables de se

différencier en tous les lignages cardiaques (Bu et al., 2009). Cependant, l'expression d'Isl1

dans les progéniteurs cardiovasculaires endogènes est étroitement corrélée avec l'âge. Les

tissus o atau et fœtau a dia ues o t des i eau d’e p ession élevés en progéniteurs

Isl1+, ais a e l’âge, l’e p essio de Isl est duit à des i eau fai les oi e i e ista ts

(Simpson et al., 2012). En outre, les marqueurs de surface des cellules Isl1 adultes n'ont pas

été bien définies (Serradifalco et al., 2011) car la plupart des travaux identifiant les

progéniteurs Isl1 reposent sur des études de traçage des lignages pendant le développement.

Malgré le pouvoir de différenciation multiple des CSCs Isl-1+, leu ua tit li it e da s le œu

adulte est insuffisante pour pouvoir envisager des thérapies cellulaires après infarctus de

myocarde.

2.4 Les CSCs BCRP+ positives side-population (BCRP+ SP)

Les cellules souches cardiaques BCRP+ “P o t t ide tifi es da s le œu de sou is

(Hierlihy et al., 2002) et da s le œu hu ai (Emmert et al., 2013). Les CSCs BCRP+ SP ou

“ide Populatio o t t o es ai si a elles o t la p op i t d’e lu e a ti e e t le

marqueu d’ADN Hoe hst de leu toplas e, e ui pe et de les s parer des autres

cellules par cytométrie de flux. Ces CSCs SP+ sont nommées BCRP+ SP car la protéine BCRP

(Breast Cancer Resistance Protein) est responsable du phénotype SP. La protéine BCRP a été

identifiée en tant que membre des transporteurs membranaires à ATP binding cassette (ABC).

C'est un peptide de 655 acides aminés avec une capacité à extruder une grande variété de

composés chimiques à partir des cellules (Hierlihy et al., 2002). Les CSCs BCRP+ SP+ de souris

peuvent se différencier in vitro e olo ies de ellules o t a tiles lo s u’elles so t ulti es

avec des cardiomyocytes primaires de rat (Hierlihy et al., 2002). Des études ont montré que

des cellules cardiaques SP+ de souris expriment un ensemble de marqueurs qui les distinguent

des autres types de cellules souches déjà connus. Ces cellules sont positives pour Sca-1, CD31

et CD38, expriment une télomerase active et des facteurs de transcription cardiaques comme

MEF2C, GATA-4 et TEF-1 (Oh et al., 2003, 2004). In vitro, les CSCs SP+ de souris se différencient

Introduction

52

en cardiomyocytes qui expriment Nkx2.5 et des protéines sarcomériques. De plus, après

i je tio da s u od le d’i fa tus hez la sou is, es ellules so t et ou es da s le

myocarde et se différencient à la périphérie de la zone infarcie (Oh et al., 2004). Dans la

population de CSCs SP+ murines, il existe une sous-population positive pour Sca-1 et négative

pour CD31 (Pfister et al., 2005). Cette population Sca-1+CD31- qui exprime déjà des marqueurs

de cellules musculaires et des cellules endothéliales présentent le plus grand potentiel de

différenciation vers le lignage cardiomyocytaire. Différencier les cellules SP cardiaques des

CSCs Sca-1+ reste une approche expérimentale difficile et non clairement définie. L'analyse

par FACS a suggéré que les cellules SP sont en fait une sous-population des CSCs Sca-1+ (Oh et

al., 2003). Par conséquent, il est probable que seules les cellules SP Sca-1+/CD31- soient

responsables du potentiel cardiomyogénique observé (Pfister et al., 2005). Une autre étude a

montré que les cellules Sca-1+/CD31- de souris isolées par tri cellulaire magnétique se

différencient en lignées endothéliales et cardiomyogéniques (Wang et al., 2006). In vitro, la

stimulation des cellules Sca-1+/CD31- avec le VEGF entraine une forte expression des

marqueurs endothéliaux. La stimulation par la 5-azacytidine et plusieurs facteurs de

croissance induit une différenciation cardiomyocytaire. Comme pour les cellules SP Sca-

1+/CD31- décrites (Pfister et al., 2005), la différenciation des cellules progénitrices Sca-1+/

CD31- est favorisée en co-culture avec des cardiomyocytes de rat. Environ 93% des CSCs SP+

sont Sca-1+/CD45-/c-kit- (Oh et al., 2003) mais les CSCs Sca-1+ ne sont pas toutes des cellules

SP+ (Noseda et al., 2015). Les CSCs SP+ sont des cellules quiescentes retrouvées dans les tissus

adultes, qui sont a a t is es pa l’e lusio spo ta e du olo a t Hoe hst ,

l’e p essio de la esti e et leu capacité à former des sphères in vitro (Tomita et al., 2005).

Fonctionnellement, les cellules CSCs SP+ cardiaques peuvent se différencier en multiples

lignages cellulaires (figure H-17). L'analyse transcriptomique réalisée sur les cellules SP de

souris a montré la présence de certains marqueurs endothéliaux (par exemple, VEGF, Vcam1,

Icam1, Vwf) mais une absence de CD31 (Martin et al., 2004). Tomita et ses collègues, ont

montré l'expression de CD29, CD44 à la surface des cellules SP et l'absence de marqueurs de

la lignée hématopoïétique (Tomita et al., 2005).

Introduction

53

De plus, u e pa tie de es ellules e p i e t des a ueu s d’aut es ellules sou hes

cardiaques comme c-kit et Flk1 et Sca-1. Le même groupe a aussi montré que ces cellules sont

positives pour GATA4 mais négatives pour Nkx2-5 et Mef2C et peuvent se différencier en

cardiomyocytes et en lignages neuronaux.

2.5 Les cellules dérivées des cardiosphères (CDCs)

Les a diosph es so t des ag gats ellulai es de à μ , ui so t g es à

pa ti d’e pla ts p o e a t de biopsies cardiaques et cultivés en suspension (Messina et al.,

2004; Smith et al., 2007). Ces cardiosphères seraient constituées de CSCs qui résideraient à

l’i t ieu de la sphère et de cellules différenciées situées à la couche externe (Messina et al.,

2004). Une étude a montré que le micro-environnement tridimensionnel apporté par les

cardiosphères protège les CSCs du stress oxydatif et maintient leur état de cellule souche

(Wang et al., 2010). Lorsque ces cardiosphères sont cultivées in vitro, elles adhèrent au

plastique, deviennent hautement prolifératives, clonogéniques et multipotentes (Smith et al.,

2007). Les cellules dérivées de cardiosphères (CDCs) représentent une population cellulaire

Figure H-17 : Illustration schématique des cellules souches cardiaques exprimant BCRP (BCRP+ ou SP) et de leur pouvoir de différenciation. Les CSCs BCRP+ (c-kit-, Sca-1-, Nkx2.5+) se trouvent dans les oreillettes et les ventricules. Les CSCs BCRP+ (c-kit-, Sca-1-, Nkx2.5+, CD31+) se différencient in

vivo en cellules endothéliales alors que les CSCs BCRP+ (c-kit-, Sca-1-, Nkx2.5+, CD31-) se différencient en myocytes exprimant la titine (Titin+). In vitro et ap s t aite e t à l’o to i e o to i , les CSCs BCRP+ (c-kit-, Sca-1-, Nkx2.5+) se différencient en cardiomyocytes non battants positives pour la troponine-T cardiaque (cTnT+). RA : oreillette droite, LA : oreillette gauche ; RV : ventricule doit ; LV : e t i ule gau he. D’ap s Gua et Hase fuss. .

Introduction

54

hétérogène composée de cellules indifférenciées et engagées, exprimant c-kit, Sca-1, CD105,

CD90 et CD29 (Messina et al., 2004). Les CDCs peuvent se différencier en cardiomyocytes

battants, en cellules musculaires lisses vasculaires et en cellules endothéliales (Tang et al.,

2009).

Des études in vivo sur des modèles animaux infarctus, ont montré ue l’ad inistration

des CDCs duit la taille de l'i fa tus, a lio e la f a tio d’ je tio du e t i ule gau he et

l'hémodynamique cardiaque (Carr et al., 2011; Chimenti et al., 2010; Johnston et al., 2009;

Smith et al., 2007). Chez l’Ho e, u essai li i ue de phase , onnu sous le nom de

« CADUCEUS », a o t ue l’i je tio i t a-coronarienne de CDCs réduit significativement

la masse de la cicatrice après infarctus (8,4 g au cours des six premiers mois et 12,9 g après un

a , ais au u e diff e e ’a t o se e o e a t la f a tio d’ je tio du e t i ule

gauche (Makkar et al., 2012).

2.6 Les CSCs W8B2 positives (CSC W8B2+)

W8B2 ou MSCA-1 (Mesenchymal Stem Cell Antigen-1) est une phosphatase alcaline non

spécifique (TNAP pour tissue nonspecific alkaline phosphatase) (Sobiesiak et al., 2010). Cette

enzyme (ALP pour alkaline phosphatase) est présente dans de nombreux tissus humains et

possède trois isoformes spécifiques du placenta, des cellules germinales et des intestins et

une isoforme tissulaire non spécifique (Devito et al., 2014).

L’e p essio du marqueur W8B2 chez la souris a été retrouvée dans plusieurs

populations de cellules progénitrices dans les zones neuronales embryonnaires, postnatales

et adultes (Langer et al., 2007). Chez l’Ho e, W B est utilis o e a ueu sp ifi ue

des CSEs Ade u i et al., ; O’Co o et al., , des cellules progénitrices du muscle

squelettique (Dellavalle et al., 2007) et aussi comme marqueur spécifique des cellules souches

mésenchymateuses de la moelle osseuse à haut potentiel prolifératif (Bühring et al., 2007).

L’e p essio de W8B2 a également été retrouvée dans les cellules souches

se h ateuses d’aut es tissus adultes hu ai s o e le p ioste de la â hoi e

(Alexander et al., 2013) et la gelée de Wharton (Devito et al., 2014).

Deux équipes ont rapporté pour la première fois la présence de cellules souches

cardiaques exprimant le marqueur W8B2 avec une provenance mésenchymateuse (Aguiar et

Introduction

55

al., 2011). Depuis, d’aut es he heu s o t pu isole et a a t ise e t pe de ellules sou hes

cardiaques exprimant le marqueur W8B2 et confirmer leur origine mésenchymateuse (Reus

et al., 2016; Zhang et al., 2015a). En effet, les cellules souches cardiaques exprimant W8B2

(CSCs W8B2+) sont positives pour les marqueurs mésenchymateux (CD29+ ,CD73+ ,CD90+

,CD105+ et CD106+), négatives pour les marqueurs hématopoïétiques endothéliaux (CD31-

,CD34- ,CD45- ,CD11b- ,CD19- et CD133-), pour le marqueur des fibroblastes cardiaques DDR2

et les marqueurs de CSCs (Aguiar et al., 2011; Reus et al., 2016; Rossini et al., 2011; Zhang et

al., 2015a).

Bien que les CSCs W8B2+ aient une origine mésenchymateuse, l'analyse génomique a

montré que ces cellules mésenchymateuses cardiaques diffèrent par leur expression génique

des cellules mésenchymateuses de la moelle osseuse ou encore les CSCs c-kit+ (Rossini et al.,

2011; Zhang et al., 2015a).

De plus, les CSCs W8B2+ expriment des facteurs de transcription spécifiques cardiaques

comme GATA4 et peuvent être différenciées en cellules endothéliales, cellules musculaires

lisses et en cellules ayant un phénotype cardiaque immature (Zhang et al., 2015a). Ces cellules

cardiaques immatures (cardiac-like cells), obtenues après différenciation in vitro des CSCs

W8B2+, ne possèdent pas de structures contractiles matures comme celles retrouvées dans

un cardiomyocyte mais répondent aux stimulations électriques (Zhang et al., 2015a).

Rossini et ses collègues ont aussi montré que les cellules souches cardiaques

mésenchymateuses, comparativement aux cellules souches mésenchymateuses de la moelle

osseuse, se différenciaient plus facilement vers le phénotype cardiovasculaire que vers les

phénotypes adipogénique et ostéogénique.

Les CSCs W8B2+ possèdent des capacités réparatrices cardiaques importantes

lo s u’elles so t i je t es da s des od les u i s d’i fa tus du o a de. E effet,

l’i je tio i t a- o a di ue de es ellules à des ats souff a t d’i fa tus h o i ue du

o a de a o t u’elles taie t apa les de ig e e s la i at i e fi euse et de se

différencier en cardiomyocytes (Rossini et al., 2011). Ces résultats ont été confirmés par les

t a au de )ha g et ses oll gues ui o t o t ue l’i je tio i t a-myocardique des CSCs

W8B2+ da s des od les d’i fa tus de o a de h o i ue de rats, améliorait la fraction

Introduction

56

d’ je tio du e t i ule gau he et aug e tait la as ula isatio de la i at i e fi euse ap s

trois semaines de transplantation (Zhang et al., 2015a).

Parallèlement à leurs capacités réparatrices, les CSCs W8B2+ possèdent un large

sécrétome composé de cytokines et de facteurs de croissance intervenant notamment dans

l'a gioge se, la su ie ellulai e, le hi iota tis e, la po se i u itai e, l’i fla atio

et le remodelage extracellulaire (Reus et al., 2016; Zhang et al., 2015a).

Il a été également montré que le milieu conditionné issu de cellules souches cardiaques

se h ateuse fa o isait l’a ti it a giog i ue des ellules e doth liales hu ai es

(microvasculaires et celles de la veine ombilicale), la survie et la prolifération des

cardiomyocytes de rats et des cellules souches mésenchymateuse humaines du tissu adipeux

et favorisait la différenciation cardiomyocytaire de la lignée myoblastique H9c2 (Reus et al.,

2016; Zhang et al., 2015a).

3 Modulateurs de la différenciation in vitro des CSCs adultes en cardiomyocytes

Plusieurs approches expérimentales ont été appliquées pour induire la différenciation

des CSCs en cardiomyocytes in vitro. Plusieurs protocoles de différenciation cardiaque existent

comme l'utilisation de milieux de culture spéciaux, la co-culture avec des cardiomyocytes

néonataux, la stimulation électrique, la stimulation mécanique, des approches

pharmacologiques utilisant par exemple l'ocytocine ou la 5-azacytidin, la stimulation par le

FGF- 2 ou encore le TGF-β (Pasha et al., 2008; Rosenblatt-Velin et al., 2005; Tran et al., 2014).

Divers groupes ont isolé et différencié des CSCs adultes en utilisant des protocoles de

différenciation différents (Chamuleau et al., 2009) (Tableau H-2).

Introduction

57

Tableau H-2 : Protocoles de différenciation cardiaques utilisés pour différents types de CSCs. Modifié

d’ap s Cha uleau et al., .

Type de CSCs

Protocole de différenciation Gènes cardiaques exprimés après

différenciation

c-kit+

-Milieu MEM + 10% SVF+dexamethasone -Co-culture avec cardiomyocytes de rats néonatals

Actine a-sarcomérique, myosine cardiaque, desmine, connexine 43

Sca-1+

-5-azacytidine -Oxytocine -5-aza + TGF-b

Troponine I, a-sarcomerique actine, myosine cardiaque, MHC (a et b), desmine, connexine 43

BCRP+ ou SP

Co-culture avec cellules cardiaque dans un milieu cardiaque spécifique

Troponine, a-actinine cardiaque

Isl1+

Co-culture avec cardiomyocytes néonatals

Troponine T, a-actinine cardiaque

Cardiosphères

-Co-culture avec cardiomyocytes de rats néonatals -Champs magnétique à très faible fréquence

Troponine, a-MHC

3.1 La 5-azacytidine

La 5-azacytidine est l'un des agents de déméthylation d'ADN le plus important et le

mieux caractérisé (Jüttermann et al., 1994). Elle s’i o po e da s l'ADN et fo e u o ple e

covalent et irréversible avec l'ADN méthyltransférase (DNMT) empêchant l'enzyme de

méthyler la position 5 des cytosines qui sont regroupées dans les îlots CpG régulateurs (Cheng

et al., 2003). Cette modification épigénétique par la 5-azacytidine conduit au démasquage des

g es ui e so t pas e p i s e aiso de l’h pe th latio de leu s p o oteu s (Keating,

2009). Bie u’il ait t précédemment montré que la 5-Azacytidine induit une différenciation

en cardiomyocytes de cellules souches mésenchymateuses in vitro, son effet sur les CSCs reste

peu clair. Concernant les CSMs issues du cordon ombilical, cette différenciation passerait par

l’a ti atio des ki ases e t a ellulai es (Qian et al., 2012).

D’aut es t a au o trent que suite au traitement avec la 5-azacytidine, les CSMs de la

oelle osseuse so t apa les d’e p i e des a ueu s sp ifi ues a dia ues et p se tent

des battements spontanés et un potentiel d'action mesurable, compatible avec un lignage

Introduction

58

myocytaire (Antonitsis et al., 2007; Naeem et al., 2013; Toma et al., 2002; Xu et al., 2004; Ye

et al., 2006).

3.2 Le TGF-b:

Le TGF-β est u fa teu de oissa e ultifo tio el t s i po ta t i pli u da s la

différenciation cardiaque des CSEs (Behfar et al., 2002; Slager et al., 1993). Les membres des

facteurs de croissance de la famille TGF-β o t t appo t s pou gule la ardiogenèse en

induisant la formation du premier champ cardiaque et en régulant les processus

morphologiques au cours du développement cardiovasculaire (Azhar et al., 2003; Brand and

Schneider, 1995).

Chez les mammifères, il existe trois isoformes de TGF-β1-3 (TGF-β , -β et -β (Schiller

et al., 2004). Durant le développement, ces trois isoformes sont présentes mais ont un profil

d’e p essio spatio-temporel différent (Pelton et al., 1991). En effet, les trois isoformes de

TGF ont montré des profils d'expression spécifiques à différents stades de développement

avec une localisation spécifique de TGF-β da s les fi es de l'œil e tode e , de TGF-β

dans le cortex de la glande surrénale (mésoderme) et de TGF-β da s l' pith liu o hl ai e

de l'oreille interne (endoderme).

De plus, l’e p essio des t ois isofo es au sei d’u e o ga e a ie en fonction du

stade e o ai e. Pa e e ple, da s le œu de sou is, le i eau d’e p essio de TGF-β

est élevé dans les coussinets atrioventriculaires et faible dans les ventricules au jour 11.5 de

développement. Au jour de développement 12,5, le niveau d’e p essio de TGF-β da s le

œu est le da s les e t i ules et les o eillettes et fai le da s les oussi ets at io-

ventriculaires.

Les protéines de la famille TGF-β se e t de sig au i du tifs pou la fo atio et la

différenciation des muscles cardiaques. Le traitement avec du TGF-β e og e a lio e la

formation du muscle cardiaque dans des CSEs de souris et des lignées cellulaires de carcinome

embryonnaire (Singla et al., 2005; Slager et al., 1993; Zeineddine et al., 2006). Dans le

myocarde infarci la famille TGF-β se ait su a ti e (Bujak and Frangogiannis, 2007; Deten et

al., 2001). L'implantation de CSMs de la moelle osseuse préprogrammée par le TGF-β da s le

o a de l s s’est l e effi a e, elle p o o ue u e g ation cardiaque accompagnée

d’u e i du tio de l’e p essio de gènes de différenciation myocardiques (Li et al., 2005).

Introduction

59

Réciproquement, la perturbation de la voie de signalisation TGF-β via un mutant dominant

négatif du récepteur au TGF-β e p he la diff e iatio des a dio o tes (Behfar et al.,

2002). L’i hi itio de l'activité du TGF-β duit l'a t du le ellulai e ai si ue l'e p essio

de l'inhibiteur des CDK : p21WAF1 et freine l'induction du facteur de transcription cardiaque

Nkx2.5. La voie de signalisation TGF-β joue u ôle i po ta t da s le maintien des capacités

dites « souches » des cellules souches adultes mais aussi celles des cellules ES (Kitisin et al.,

2007; Pucéat, 2007). Les effets observés par le TGF-β so t t s d pe da ts du te ps et de la

dose de traitement et seraient différents selon la source et le type de cellules souches (Pucéat,

2007). Il agit positivement sur la différenciation des myoblastes embryonnaires (Slager et al.,

1993) alo s u’il a u effet gatif su le p o essus de diff e iation myogénique des

myoblastes de lignée C2C12 (Gardner et al., 2011; Massagué et al., 1986).

E su , l’e se le des tudes e es su la diff e iatio des C“Cs adultes

humaines montrent clairement que la stimulation par TGF-β i duit et/ou a lio e la

différenciation en cardiomyocytes.

3.3 L’a ide as o i ue :

L'acide L-ascorbique (AA), souvent appelé vitamine C, est essentiel à la vie chez l'homme,

chez lequel ses propriétés antioxydantes protègent les cellules contre le stress oxydatif

(Padayatty et al., 2004). L’AA pou ait t e o sid o e u a teur important dans la

p olif atio et la diff e iatio ellulai e. E effet, Il a t o t ue l’AA a ait u effet

a tip olif atif asso i à l’i hi itio des g es essai es da s la p og essio du le

cellulaire (Belin et al., 2009). De plus, l’AA i hi e la diff e iatio des p adipo tes adultes

en adipocytes matures (Rahman et al., 2014). Plusieu s tudes e tes o t o t ue l’AA

est capable de reprogrammer des cellules somatiques murines et humaines en cellules

souches adultes (Esteban et al., 2010; Stadtfeld et al., 2012; Wang et al., 2011). Cette

reprogrammation est médiée par la déméthylation de l'ADN sur des loci spécifiques (Chen et

al., 2013).

L'AA favorise la différenciation cardiaque des CSEs (Chan et al., 2009; Sato et al., 2006)

et améliore la différenciation cardiaque des cellules souches pluripotentes murines par

stimulation de la voie de signalisation Wnt/β-catenine (Ivanyuk et al., 2015). La

différenciation des CSEs vers le lignage myogénique serait engagée via son récepteur

Introduction

60

intracellulaire SVCT2 (Rahman et al., 2017). La diff e iatio pa l’AA i pli ue la oie p

MAPK / CREB, probablement stimulée par l'AMPc via l'adénylate cyclase. De e fait, l’AA est

utilisé dans plusieurs protocoles de différenciation cardiaque des ESC et des cellules souches

pluripotentes induites ou iPSCs (Burridge et al., 2011; Kattman et al., 2011; Yang et al., 2008).

3.4 L’a ide ti oï ue :

L'acide rétinoïque (retinoic acid ou RA) est le dérivé actif de la vitamine A. Le RA régule,

par stimulation de ses récepteurs nucléaires (RAR ou retinoic acid receptor), des voies de

signalisation qui sont essentielles à la croissance des organes pendant le développement

embryonnaire (Duester, 2008; Niederreither and Dollé, 2008). La génération locale de RA

implique la rétinaldéhyde déshydrogénase 2 (Raldh2) catalyseur de la deuxième étape

d'oxydation dans la biosynthèse du RA. En effet, les embryons de souris déficients pour la

Raldh2 (Raldh2 -/-) présentent une carence sévère en AR et des défauts de développement

cardiaques (Niederreither et al., 1999, 2003). L’i hi itio de la sig alisatio pa le RA i duit

également des défauts de développement précoce cardiaques (Gruber et al., 1996; Hochgreb

et al., 2003). En excès, l’a ide ti oï ue p o o ue u la gisse e t du o pa ti e t si o-

auriculaire au détriment des tissus ventriculaires chez les embryons de poulets (Osmond et

al., 1991; Yutzey et al., 1994) et chez le poisson zèbre (Stainier and Fishman, 1992). Toutes ces

études indiquent que le RA est nécessaire en tant que morphogène pour un développement

cardiovasculaire normal, mais entraîne des défauts myocardiques si il est présent à des

concentrations anormales.

Dans les CSEs, le traitement avec le RA accélère la différenciation cardiaque et améliore

le développement des cardiomyocytes ventriculaires (Wobus et al., 1997). Par analogie à la

vitamine C, l’effet du RA su la diff e iatio des E“C (soit en cellules pacemaker soit en

cellules atriales) est dépendant de la dose et du te ps d’ad i ist atio (Gassanov et al.,

2008). Des effets de l’AR e o i aiso a e d’aut es ol ules su la diff e iatio des

cellules souches progénitrices in vitro, ont été observés mais les mécanismes moléculaires

restent complexes. Récemment, il a été montré que le RA en combinaison avec la 5-

azacytidine et le DMSO, favorise la différenciation cardiaque des CSMs humaines dérivées du

foie fœtal (Deng et al., 2016). D’aut e pa t, da s les CSMs hu ai es d i es du œu , le RA

(en combinaison avec la 5-azacytidine et le phényl butyrate) induit une différenciation de ces

cellules vers un phénotype cardiaque immature (Zhang et al., 2015a).

Introduction

61

3.5 La dexaméthasone :

La dexaméthasone est un glucocorticoïde synthétique, couramment administré à des

nourrissons prématurés, afin de réduire l'incidence et la gravité du syndrome de détresse

respiratoire (Liggins and Howie, 1972). Cependant, l'exposition aux glucocorticoïdes

synthétiques peut être nocive pour d'autres tissus et organes (Davis et al., 2011; Kelly et al.,

2012). Une étude récente indique que le traitement des rats nouveau-nés avec la

dexaméthasone pendant une période critique du développement cardiaque, diminue la

prolifération et le o e total des a dio o tes da s le œu via des modifications

épigénétiques (Gay et al., 2015). Cette étude montre également que la dexaméthasone

stimule une différenciation terminale cardiomyocytaire prématurée par la répression

épigénétique du gène cycline D2.

Ces résultats ont fourni de nouvelles pistes concernant la régulation de la maturation

des cardiomyocytes par les glucocorticoïdes. Cependant, les mécanismes moléculaires

impliqués durant la différenciation des cellules souches cardiaques en cardiomyocytes en

utilisant la dexaméthasone restent non étudiés. Ainsi, les différentes propriétés de la

dexaméthasone évoquées ci-dessus conduisent à son utilisation in vitro dans plusieurs

protocoles de différenciation de CSCs en cardiomyocytes (Matsuura et al., 2004; Zhang et al.,

2015a).

3.6 L’o to i e:

L'ocytocine ou oxytocine, est un neuropeptide composé de neuf acides aminés sécrétés

principalement par les noyaux hypothalamiques. L'ocytocine est également produite dans des

tissus p iph i ues o e l’ut us, le pla e ta, l’a ios, le o ps jau e o pus luteu , le

testi ule et le œu (Gimpl and Fahrenholz, 2001). Elle a longtemps été reconnue comme étant

principalement impliquée dans la régulation des fonctions reproductives, telles que

l'induction des contractions utérines, le réflexe d'éjection du lait et l'ovulation (Gimpl and

Fahrenholz, 2001). D’aut es ôles de l’o to i e o t t tudi s ota e t da s la gulatio

de différentes fonctions et comportements (comportement sexuel et maternel, la mémoire,

la cognition, la tolérance, les fonctions cardiovasculaires etc.) (Bussolati and Cassoni, 2001).

L'ocytocine est également considérée comme régulateur positif et négatif de la prolifération

cellulaire dans différents tissus (Cassoni et al., 2001). Cette hormone administrée en excès

hez le fœtus pe tu e le d eloppe e t a dia ue hez le at (Schriefer et al., 1982). Elle

Introduction

62

régulerait également la différenciation. En effet, le nombre de récepteu s à l’o to i e

augmente à partir du 7ème jour de gestation, le jour où la différenciation cardiaque

o e e hez l’e o de sou is (Mukaddam-Daher et al., 2002). Chez l’adulte, da s

l'i fa tus du o a de i duit e p i e tale e t hez les ats, l’appo t o ti u d’o to i e

améliore la guérison cardiaque, le travail cardiaque, réduit l'inflammation et stimule

l'angiogenèse (Gutkowska et al., 2014).

En résumé, l'ocytocine est décrite comme étant un puissant inducteur de différenciation

cardiomyocytaire dans les CSEs et les CSCs adultes de souris (Matsuura et al., 2004; Paquin et

al., 2002).

Chapitre III : Physiologie des cellules souches /progéniteurs cardiaques

1 Le calcium :

1.1 Le calcium dans les cellules souches:

Dans toutes les cellules et particulièrement dans les cellules somatiques de mammifères

cet ion divalent joue un rôle fondamental dans les processus de prolifération et la

différenciation. Cependant le rôle du calcium da s les ellules sou hes ’a t tudi ue

depuis quelques années (Heubach et al., 2004; Kawano et al., 2002). Cette recherche a suscité

un intérêt important dans le domaine car les données suggèrent que la signalisation calcique

est liée à la prolifération et à la différenciation cellulaire, deux fonctions fondamentales des

cellules souches.

Le calcium (Ca2+) est un cation ubiquitaire qui contrôle de nombreux processus

cellulaires tels que la prolifération, la différenciation cellulaire, et l'apoptose. Le mécanisme

général de la signalisation calcique est relativement simple et repose sur les variations

spatiotemporelles de cet ion (calcium libre). Dans les cellules eucaryotes, la concentration de

calcium intracellulaire [Ca2+]i au repos est comprise entre 50 et 100 nM et peut atteindre entre

1 et 10µM suite à une stimulation. Les composants moléculaires du réseau de signalisation

Ca2+ peuvent être divisés en plusieurs groupes selon leur fonction : il existe des canaux

calciques de la membrane plasmique qui permettent l'entrée de Ca2+ dans la cellule (comme

les canaux calciques indépendants et dépendants du voltage), des canaux de libération

calcique localisés aux niveaux des stocks intracellulaires (comme les canaux sensibles à

l’i ositol t iphosphate IP et à la ryanodine), des pompes et des échangeurs Ca2+ (comme la

Introduction

63

pompe PMCA (pour plasma membrane Ca2+ ATPase) et SERCA (sarco/endoplasmic reticulum

Ca2+-ATPase), l’ ha geu Na+/Ca2+) qui réduisent la concentration du calcium cytosolique

et/ou favorisent sa recapture dans les stocks intracellulaires; et enfin de nombreux senseurs

cytoplasmiques (comme la calséquestrine, la calmoduline, le phospholamban ou encore la

calcineurine A) qui traduisent les signaux calciques en activité cellulaire.

Plusieurs paramètres caractérisent les signaux calciques: leur origine, leur localisation,

leur fréquence, leur amplitude et leur cinétique. Ainsi, en fonction de la nature de ces signaux,

la ellule pa l’i te diai e de p ot i es lia t le al iu a la o e u e po se

appropriée (Berridge et al., 2000).

1.1.1 L’a tivit al i ue spo ta e da s les ellules sou hes:

Les oscillations calciques spontanées ont été observées à la fois dans les cellules

excitables et non-excitables et elles sont importantes pour le développement embryonnaire.

Les oscillations calciques contribuent à la régulation de plusieurs processus tels que la

fertilisation, la prolifération cellulaire, la sécrétion, la différenciation neuronale, la croissance

axonale, la prolifération et la migration neuronale etc. (Clapham, 2007; Montoro and Yuste,

2004).

Bie u’elles soie t des ellules dites « non-excitables », les cellules souches adultes

expriment certains canaux ioniques activés par le voltage (Heubach et al., 2004; Zahanich et

al., 2005). Une étude réalisée sur les CSEs et les CSMs a montré que ces deux types cellulaires

e po daie t pas au sti ulatio s pa le gluta ate, le GABA, l’o to i e ou la

dépolarisation confirmant leur non-excitabilité (Forostyak et al., 2013).

Cependant, la majorité des cellules souches ont généré des [Ca2+]i transitoires après

sti ulatio pa l’ATP ; % des CSEs, 90% des CSMs du tissu adipeux et 62% des CSMs de la

moelle osseuse (Kawano et al., 2006). La majorité des CSMs ont des récepteurs purinergiques

fonctionnels (Faroni et al., 2013; Kotova et al., 2014) de type P2X pour les CSMs du tissu

adipeux et de type P2X et P2Y pour les CSMs de la moelle osseuse (Coppi et al., 2007).

Les transitoires [Ca2+] spontanés se produisent principalement au cours des premiers

stades de la différenciation des précurseurs neuronaux et régulent la croissance des neurites

et l'apparition du phénotype GABAergique (Ciccolini et al., 2003). L'activité [Ca2+] spontanée

a été observée dans 31% des précurseurs neuronaux dérivés des CSEs humaines et elle est

Introduction

64

médiée par l'influx Ca2+ via les VGCC HVA (pour High-voltage-activated Voltage-gated calcium

channel) (Forostyak et al., 2013). L’i hi itio des t a sitoi es [Ca2+] spontanés (médiés par les

VGCC de type L et des canaux de type TRPC1) entraine une réduction significative de la

prolifération dans les neurones post-mitotiques dérivés des CSEs humaines (Weick et al.,

2009). L'activité [Ca2+] spontanée et synchronisée enregistrée dans les progéniteurs

neuronaux dérivés des CSNs fœtales hu ai es se ait d pe da te des jo tio s gap de t pe

connexine 43 et des VGCC (Jäderstad et al., 2010). En effet dans ces cellules neuronales,

l'inhibition des jonctions gap annule l'activité Ca2+ spontanée et la prolifération cellulaire

(Malmersjö et al., 2013).

Les CSMs de la moelle osseuse possèdent également des oscillations [Ca2+] spontanées

et des transitoires calciques (Kawano et al., 2003). Dans les CSMs de la moelle osseuse

humaines, les transitoires [Ca2+] spontanés résultent de la libération calcique des stocks du

réticulum endoplasmique (ER) médiée par IP3 (Kawano et al., 2003, 2006).

En résumé, les oscillations calciques spontanées se produisent dans plusieurs types

cellulaires; dans les CSEs, elles dépendent de l'influx Ca2+ via la membrane plasmique, alors

que dans les cellules souches adultes, elles sont déclenchées principalement par la libération

du Ca2+ depuis le RE. Les recherches dans ce domaine et plus particulièrement sur les cellules

sou hes adultes so t peu o euses. Les d ou e tes da s l’a e i pou aient aider à la

compréhension des mécanismes et du rôle de ces oscillations dans la prolifération et la

différenciation.

1.1.2 Canaux VGCC et signalisation calciques

Les canaux Ca2+ voltage-dépendant (Voltage-Gated Ca2+ Channels ou VGCC)

représentent la principale voie d'entrée de Ca2+ dans les cellules excitables. Les VGCC ont été

lass s e deu g oupes p i ipau : les a au à haut seuil d’a ti atio High Voltage-

Activated channels ou HVA) qui comprennent les canaux de type L, N-, P / Q et R et les canaux

à bas seuil d’a ti atio Lo Voltage-Activated channels ou LVA) ou canaux de type T (Catterall

and Swanson, 2015; Wang et al., 1999b). L'expression du VGCC de type L et T a été identifiée

dans de nombreux types de cellule souches.

En particulier, ils ont été détectés au niveau protéique dans les CSMs du tissu adipeux

(Bai et al., 2007; Jang et al., 2010) et dans les CSMs de la moelle osseuse (Heubach et al., 2004;

Introduction

65

Kawano et al., 2002; Zahanich et al., 2005). Certains travaux montrent que la modulation des

canaux de type T qui se produit pendant la progression dans le cycle cellulaire pourrait

contribuer à la maintenance de la capacité d'auto-renouvellement des CSEs de souris

(Rodríguez-Gómez et al., 2012). L'activation des VGCC LVA serait à l’o igi e des os illatio s

calciques dans les progéniteurs neuronales dérivés des CSEs suggérant leur intervention dans

le processus de prolifération cellulaire (Malmersjö et al., 2013). Les stocks calciques impliqués

dans ces oscillations induites dans les CSEs et les CSMs avant différenciation font intervenir

principalement les stocks calciques sensibles aux IP3 couplés aux vecteurs calciques

membranaires P2x,y et VGCC. Les VGCC favorisent la différenciation des CSEs ainsi que les

CSMs adultes de différentes origines (Forostyak et al., 2016) (figure H-18). En effet, au cours

de la différenciation neuronales des CSEs, ces dernières commencent à exprimer les canaux

calciques (L-VOCC, N-VOCC, P/Q-VOCC et R-VOCC). Les CSMs (du tissu adipeux et de la moelle

osseuse) quand elles sont différenciées en plusieurs lignages (neuronal, adipogénique et

ostéogénique) expriment les canaux calciques L-VOCC et T-VOCC (pour les CSMs du tissu

adipeux) et les canaux calciques P/Q-VOCC (pour les CSMs de la moelle osseuse). En

particulier, il a été démontré que la différenciation neuronale des CSEs dépend de la

coopération entre les canaux calciques VGCC de type L et les canaux de libération calcique

intracellulaire de type RyR2 (Yu et al., 2008) (figure H-18).

Le signal calcique spontané ou induit observé pendant la différenciation jouerait un rôle

fo da e tal da s l’e p essio de e tai s g es ota e t ceux impliqués dans le cycle

e du al iu . L’appa itio des epteu s à la a odi e et de diff e ts a au al i ues

t pes N, P/Q, R, T, L e t e aut es se ait o te po ai e à l’ olutio des p op i t s du sig al

calcique.

Introduction

66

Figure H-18 : Illust atio s h ati ue de l’e p essio fo tio elle des a au et epteu s calciques au cours de la différenciation des ESCs (A), des AMSCs (B) et des BMSCs (C). Les uESCs expriment les canaux (T-VOCC), les récepteurs (P2X2,4,5,7 et P2Y1,2,6) et les récepteurs (InsP3 R1-3). Au cours de la différenciation, les pESCs commencent à exprimer les canaux calciques (L-VOCC, N-VOCC, P/Q-VOCC et R-VOCC), les récepteurs (P2X2,3,4,5,7 et P2Y1), les récepteurs (RyR1,2,3), la SERCA et une augmentation du [Ca2+]i a o pag e de l’appa itio d’os illatio s al i ues. Les uAM“Cs expriment les récepteurs P2X, les récepteurs AVP-V1, les récepteurs OT,les récepteurs InsP3R et présentent des oscillations calciques. Au cours de la différenciation, les pAMSCs commencent à exprimer les récepteurs P2Y, les canaux calciques (L-VOCC,T-VOCC), la SERCA et les récepteurs (RyR) avec une augmentation [Ca2+]i. Les uBMSCs expriment les récepteurs (P2X, P2Y1,2), les canaux calciques (L-VOCC) ,les récepteurs AVP-V1a,les récepteurs InsP3R , la SERCA et présentent des oscillations calciques. Au cours de la différenciation, les pBMSCs commencent à exprimer les récepteurs OT, les récepteurs (P2X7, P2Y1), les canaux calciques (P/Q-VOCC), les récepteurs RyR avec une augmentation [Ca2+]i. D’ap s Fo ost ak et al., (2016). u: undifferentiated ; p :pre-differentiated ;ESCs : embryonic stem cells ; AMSCs : adipose-derived mesenchymal stem cells ; BMSCs : bone-marrow derived mesnchymal stem cells ; P2 :récepteur purinergique ;OT :récepteur à l’o to i e,AVP :récepteur à la vasopressine ;VOCC :canal calcique voltage dépendant ;RyR :récepteur à la ryanodine ;InsP3R : epteu à l’IP ; [Ca2+]i :concentration calcique intracellulaire ; SERCA : Ca2+-ATPase du réticulum sarco-endoplasmique.

A

C

B

Introduction

67

1.1.3 Les stocks calciques intracellulaires dans les cellules souches:

Le réticulum endoplasmique (ER) est le principal organe de stockage de Ca2+.

Parallèlement, deux mécanismes majeurs de libération de Ca2+ réticulaire existent via les

récepteurs à la ryanodine (RyR) et les récepteurs au 1,4,5-triphosphate d'inositol (InsP3). Le

remplissage des stocks calciques « vidés » est assu pa l’e iste e d’u e po pe Ca2+-ATPase

(SERCA).

La cascade de signalisation métabotropique PLC/InsP3 a été démontrée comme la voie

principale induisant la libération de Ca2+ de l'ER dans différents types de cellules souches. Des

tudes o t o t ue seuls les epteu s à l’I sP , et o les R R, so t fo tio els da s

les ESC de souris (Yanagida et al., 2004); dans les CSMs humaines du tissu adipeux (Kotova et

al., 2014; Tran et al., 2014) et dans les CSMs humaines de la moelle osseuse (Kawano et al.,

2002). La oie de li atio al i ue PLC/I sP este fo tio elle uelle ue soit l’o igi e ou

le stade de différenciation, ce qui laisse à penser que cette voie est conservée dans toutes les

cellules souches. Par exemple, les CSES et les MSC différenciés en cardiomyocytes, en

adipo tes ou e eu o es, poss de t toutes des epteu s fo tio els à l’I sP (Kawano

et al., 2006; Resende et al., 2010; Sedan et al., 2008; Tran et al., 2015). Cependant, les

récepteurs à la ryanodine sont peu caractérisés dans les cellules souches, même si ils

apparaissent lors de la différenciation. Par exemple, les cellules neuronales et cardiaques

dérivées des CSEs ou des CSMs, expriment des RyR fonctionnels (Forostyak et al., 2013;

Resende et al., 2010). Des tudes o t o t u’il y a un lien fonctionnel entre les RyR type2

et les VGCC de type L et que cela est important dans la différenciation neuronale (Yu et al.,

2008).

1.2 Le calcium dans les cellules souches/progéniteurs cardiaques:

Le al iu joue u ôle i po ta t da s le œu e a ti a t les p o essus de oissa e

(Berridge et al., 2000; Frey et al., 2000) et en modulant le comportement mécanique des

cardiomyocytes (Bers, 2002; Houser and Molkentin, 2008).

A l’heu e a tuelle, les tudes su l’a ti it et la sig alisatio al i ue da s les C“Cs so t

rares. Ferreira-Martins et ses collègues ont montré pour la première fois que les CSC c-kit+

humaines possèdent des oscillations calciques spontanées et que ces dernières jouent un rôle

essentiel dans la régulation de la prolifération cellulaire (Ferreira-Martins et al., 2009). Ces

Introduction

68

oscillations intrinsèques se produisent indépendamment du couplage avec des

cardiomyocytes ou de la présence de Ca2+ extracellulaire. Ces résultats ont été confirmés dans

les œu s de sou is t a sg i ues da s les uelles l’EGFP (pour enhanced green fluorescent

protein) était sous le contrôle du promoteur c-kit. Ces oscillations calciques ont été régulées

par la libération calcique depuis l'ER par l'activation des IP3R et la réabsorption du Ca2+ par la

SERCA. Les IP3R et les SERCA ont été fortement exprimés dans ces cellules alors que les RyR

n'ont pas été détectés.

D’aut e pa t, les C“Cs -kit+ exprimaient des canaux SOC (Store-Operated Channel ou

canaux calciques activés consécutivement à la déplétion des stocks de Ca2+ du réticulum

endoplasmique) et la pompe Ca2+ de la membrane plasmique. Bien que ces canaux et pompes

soient fonctionnels, ils n'ont aucun effet direct sur les oscillations de Ca2+. Néanmoins, la

fréquence des oscillations calciques peut être significativement augmentée par l'ATP et

l'histamine via les epteu s pu i gi ues et les epteu s à l’hista i e de t pe .

D’aut e pa t, il appa ait ue es oscillations calciques sont couplées avec l'entrée des

cellules dans le cycle cellulaire et l'incorporation de BrdUrd. L'induction des oscillations

calciques dans les CSCs c-kit+ a a t leu i je tio i t a o a di ue da s des œu s i fa is de

souris, amélio e ait la g effe et l’e pa sio de es ellules (Ferreira-Martins et al., 2009). Lors

de la différenciation des CSCs en cardiomyocytes, la famille des facteurs de croissance FGF et

TGFβ joue u ôle ajeu dans lequel intervient le signal calcique (Tonelli et al., 2012) (figure

H-19).

L'activation des récepteurs TGF-ß sti ule l’a ti atio de la tat-associated kinase (TAK),

une protéine qui appartient à la voie MAPK. Le TAK agit sur les facteurs de transcription ATF2

et CREB via la voie MAPK sensible au Ca2+ (Park et al., 2009). L'ATF2 peut également se lier aux

Smads pour favoriser l'expression des facteurs de transcription responsables du

développement du phénotype cardiaque.

Wnt11 participe également au processus de différenciation cardiaque, en agissant sur

des voies de signalisation dépendantes du Ca2+ médiées par la Protéine kinase

Ca2+/calmoduline-dépendante (CaMK-II), la proteine kinase C (PKC) et les c-Jun N-terminal

kinases (JNK) (Biteau et al., 2008).

Introduction

69

Les propriétés des cellules souches cardiaques (différenciation, auto-renouvellement,

p olif atio , ig atio so t ide e t o ditio es pa d’aut es p o essus ol ulai es

que ceux décrits plus haut. En effet, au stade de progéniteur et au cours de la différenciation

de cellules souches cardiaques, il apparait un nombre significatif de protéines membranaires

qui incluent les canaux ioniques.

Figure H-19 : Voies de signalisations majeures impliquées dans le maintien de la pluripotence ou de la favorisation de la différenciation des cellules souches cardiaques (CSCs). Le calcium (entouré e ouge i te ie t e a al de la oie W t/β-catenin canonique (médiée par Wnt 1,3,8) mais également en amant de Wnt 11 (voie Wnt non canonique dépandante du calcium). La CamK II, intervient par la suite pour maintenir la multipentence ou la pluripotence des cellules souche. Dans la différenciation des CSCs en cardiomyocytes, la fa ille des fa teu s FGF, BMP et TGFβ so t les principaux régulateurs. L'activité de TAK (une protéine appartenant à la voie MAPK), est stimulée pa l'a ti atio des epteu s au TGFβ. La TAK agit su les fa teu s de t a s iptio o e ATF via la voie MAPK sensible au Ca2+. L'ATF2 peut également se lier aux Smads pour promouvoir l'expression des facteurs de transcription responsables du développement du phénotype cardiaque. La voie ERK est activée par les FGF via la protéine Ras pour favoriser essentiellement la prolifération cellulaire. D’ap s To elli et al., .

Introduction

70

2 Les canaux ioniques :

Comme nous l’a o s a o d su i te e t da s le hapit e p da t, les signaux

bioélectriques générés par les canaux ioniques jouent un rôle crucial dans la genèse de

l’e itatio le t i ue et da s la o du tio des sti ulatio s da s les ellules e ita les. Da s

les cellules non-excitables, les canaux ioniques interviennent dans différents processus

ellulai es o e la p olif atio , la ig atio et l’apoptose (Berridge et al., 1998, 2000;

Orrenius et al., 2003). E effet, il a t o t u’u e sti ulatio électrique conditionnante

(de 1 Hz pendant 7 à 14 jours) sur des progéniteurs cardiaques humains, fa o ise l’e p essio

de protéines membranaires et structurales (ex : Troponine I, SERCA2 Cx43, alpha-actine) ;

favorisant leur potentiel phénotypique cardiovasculaire (Llucià-Valldeperas et al., 2014).

Plusieurs études ont montré que les cellules souches expriment différents canaux

ioniques. Ces derniers sont exprimés de manière hétérogène et dépendent du type de cellule

souche. Le rôle de ces canaux dans les cellules souches reste peu étudié mais les données

dispo i les o t e t u’ils so t fo da e tau da s la gulatio de la p olif atio , la

différenciation et la migration.

De nombreux courants ioniques ont été caractérisés dans les cellules souches; ils

comprennent des courant potassiques rectifiants retardés voltage-dépendant ou IKDR (codé

par différents gènes KV), des courants K+ activés par le Ca2+ intracellulaire ou KCa (BKCa, KCa de

grande conductance, IKCa; KCa de conductance intermédiaire et SK4, KCa à petite conductance

comme le SK1,2,3), le courant transitoire sortant K+ (Ito) , le courant K+ rectifiant entrant (IKir),

le ou a t a ti pa l’h pe pola isatio Ih a au HCN et modulé par les nucléotides

cycliques intracellulaires et non sélectif aux cations, différents courants chlorures (ICl), le

courant sodium dépendant du voltage (INa), les courant calciques de types T et L (ICaT ,ICa.L)

et les courants TRP (transient receptor potential ) perméables aux cations (Li and Deng, 2011).

Tous ces courants étaient présents de manière hétérogène dans les cellules ES, les CSMs

de différentes origines (moelle osseuse, tissu adipeux et sang du cordon ombilical humain),

les cellules progénitrices neurales ou les cellules progénitrices cardiaques.

2.1 Les canaux ioniques dans les CSEs:

Il a été rapporté que les CSEs qui co-expriment les courants IKDR et BKCa sont retrouvés

dans 52% des cellules CSEs de souris et 100% des cellules CSEs humaines (Wang et al., 2005).

Introduction

71

Les IKDR des cellules CSEs de souris sont codés par les gènes KV1.1, KV1.2, KV1.3 et KV1.6 dans

des cellules CSEs alors que les IKDR des cellules ES humaines sont codés par les gènes KV7.2 et

Kv9.3. De plus, un courant Ih (codé par le gène HCN3) est présent dans 23% des cellules CSEs

de souris mais absent dans les cellules CSEs humaines. De même, les courants K rectifiant

entrant (IK1) responsables de la stabilisation du potentiel de membrane de repos n'étaient pas

présents dans les CSEs de souris (Wang et al., 2005).

2.2 Les canaux ioniques dans les CSMs:

La plupart des CSMs humaines de la moelle osseuse possèdent des courant KCa et IKDR

(Heubach et al., 2004; Li et al., 2005). Le courant KCa dans les CSMs de la moelle osseuse est

codé par le gène MaxiK (KCa1.1 ou Slo), comme le montrent plusieurs études (Heubach et al.,

2004; Kawano et al., 2003). De plus, des courants sodiques tetrodotoxine (TTX) sensibles

(codés par NaV1.7), des courants Ito (codés par KV1.4 et KV4.2) et des courants ICa.L (codés par

CaV1.2) sont présents dans une petite population (29%, 8% et 15% respectivement) de CSMs

humaines (Li et al., 2005).

Des courants IKCa (codé par KCa3.1), des courants Cl- sensibles au volume (codé par Clcn3)

et des courants IKir (codé par Kir2.1), sont présents dans les CSMs de la moelle osseuse de

souris (Tao et al., 2007). Le p ofil d’e p essio des a au io i ues da s les CSMs de souris

est différent de celui des cellules ES de souris, ce qui suggère que l'expression du canal ionique

peut dépendre de l'origine de la cellule souche. Il a été constaté que dans les CSMs de rat,

plusieurs courants ont été caractérisés; des courants INa TTX sensibles (16% des cellules) ; Ito

(10% des cellules) ; ICa.L (8% des cellules), IKDR (91% des cellules) et des BKCa coexprimés avec

des courants IKCa (33% des cellules) (Li et al., 2006). Dans les CSMs de la moelle osseuse de

lapin, il existe des courants IKDR (codés par KV1.2 et KV2.1) présents dans 78% des cellules, des

courants BKCa et IKCa coexprimés avec IKDR dans 29% des cellules, tandis que IKir (codé par

Kir1.1) est présent dans 28% des cellules (Deng et al., 2006). Les résultats obtenus sur les CSMs

de la oelle osseuse de at, de lapi ou de l’Ho e ette t e ide e des p ofils et des

ph ot pes d’e p essio de a au io iques différents, suggérant une expression

dépendante de l'espèce.

D’aut es tudes o t o t la présence de plusieurs courants dans les CSMs de la veine

du cordon ombilical humain. Ces cellules possèdent des courant ; BKCa (codé par KCa1.1) dans

Introduction

72

92% des cellules, Ito (codé par KV1.4 et KV4.2) dans 50%, INa TTX sensibles (codé par hNE-Na)

dans 30% des cellules et des courants IKir (codé par TWIK et Kir2.1) dans 5% des cellules.

Cependant, aucun courant IKDR typique n'a été enregistré, bien que les gènes KV1.1 et KV10.1

soient détectés dans ces cellules (Park et al., 2007). Dans les CSMs humaines du tissu adipeux,

des courants INa et Ito ont pu être enregistrés dans une petite population de cellules (8% et

19%). Les courants IKDR (73% des cellules), BKCa (codé par KCa1.1), IKCa (codé par KCa3.1) et

SKCa (codé par KCa2.3) sont présents dans ces cellules (Bai et al., 2007). Ces études suggèrent

que le profil d'expression des canaux ioniques dans les CSMs peut être tissu-spécifique.

2.3 Les canaux ioniques dans les cellules souches/progéniteurs neurales:

Une étude publiée en 1997, a montré que les cellules progénitrices oligodendrocytaires

et les oligodendrocytes différenciés provenant de rats néonatals, possèdent des courants IKDR

(codés par KV1.2, KV1.5 et KV1.6) et des courants potassiques IA (codés par KV1.4) (Attali et al.,

1997). Des études récentes ont montré également que les courants IKir (codé par Kir4.1 et

Kir5.1) et le IKDR (codé par KV3.1) sont présents dans les progéniteurs neuronaux de souris

issus de sphères (Yasuda and Adams, 2010; Yasuda et al., 2008).

De multiples canaux ioniques sont exprimés de manière hétérogène dans des cellules

souches neurales embryonnaires de rat. Ces cellules ont des courants potassqiues IA et IKDR

dans plus de 80% des cellules, des courants INa (TTX sensibles et TTX non sensibles) dans 22

% des cellules et et des courants ICa,L dans 19% des cellules souches neurales (Cai et al., 2004).

Des courants IKDR (codé par KV2.1) et IA (codé par KV4.3) ont été aussi retrouvés chez les

progéniteurs neuronaux embryonnaires de rat (Smith et al., 2008). Il a été signalé que les

cellules progénitrices du cerveau antérieur de rat néonatal co-expriment des courants INa

TTX sensibles, des courants IKDR et des courants IA (Stewart et al., 1999) alors que, seuls les

courants IKDR sont présents dans les cellules progénitrices de rat adulte (Liebau et al., 2006).

Concernant les cellules souches neurales embryonnaires humaines, des études ont

montré la présence de courants IA (codé par KV4.2) et de courants IKDR dans les CSEs neurales

hu ai es d i es du tissu e eu de fœtus a o t (Schaarschmidt et al., 2009). Quatre

types de courants ioniques (IA, IKDR, IKir et INa TTX sensibles) ont été également décrits dans

les ellules sou hes eu ales hu ai es du o te de fœtus a o t (Lim et al., 2008).

Introduction

73

2.4 Les canaux ioniques dans les CSCs:

Peu d’i fo atio s su l'e p essio des a au io i ues da s les ellules

souches/progénitrices cardiaques humaines sont disponibles. Une étude sur les cellules

progénitrices c-kit cardiaques de souris adultes a montré que ces cellules expriment des

courants IKDR (codé par KV1.1, KV1.2 et KV1.6), des courants ICl (codé par Clcn3) et des

courants IKir (codé par Kir1.1, Kir2.1 et Kir2 .2) (Han et al., 2010).

En 2014, Zhang et ses collègues ont caractérisé des courants ioniques dans les cellules

progénitrices cardiaques humaines c-kit+. Plusieurs courants ioniques étaient présents dans

ces cellules ; des courants BKCa codés par KCa.1.1 (dans 86% des cellules), des courants IKir

codés par Kir2.1 ( dans 84% des cellules), des courants Ito codés par KV4.2 et KV4.3 (dans 47%

des cellules) et des courants Na+ TTX sensibles codés par SCN3A et SCN8A (dans 61% des

cellules) (Zhang et al., 2014a). Ces résultats ont révélé pour la première fois que quatre types

de courants ioniques (BKCa, Ito, IKir et INa TTX sensibles) sont présents de manière hétérogène

dans les cellules cardiaques humaines c-kit+.

Une autre étude publiée en 2016 par Che et ses collègues, a identifié la présence de

canaux TRPV (transient receptor potential vanilloid) de type 2 et de type 4 sur les CSC c-kit+

(Che et al., 2016).

3 Rôles des canaux ioniques dans la régulation de la prolifération et/ou la différenciation

des cellules souches:

3.1 Prolifération

Les canaux ioniques jouent un rôle important dans le contrôle de la prolifération

cellulaire (MacFarlane and Sontheimer, 2000; Pardo, 2004). Dans les CSMs de la moelle

osseuse de rat, il a été montré que durant la transition G1/S du cycle cellulaire, le courant

IKDR diminue tandis que le courant IKCa augmente dans les MSC dérivés de la moelle osseuse

de rat (Deng et al., 2007).

De plus, l’e ti tio des a au IKDR ou les a au IKCa avec des siRNA ciblant KV1.2 et

KV2.1 (pour IKDR) ou KCa3.1 (pour IKCa) inhibe la prolifération cellulaire et provoque

l’a u ulatio des ellules e phase G / G du le, e ui sugg e ue es deux canaux

sont nécessaires à la régulation de la prolifération cellulaire de ces cellules (Deng et al., 2007;

Introduction

74

Wang et al., 2008). Le blocage du canal responsable du courant IKDR réduit considérablement

la prolifération des cellules CSEs murines et humaines (Wang et al., 2005), et celle des CSMs

humaines du tissu adipeux (Bai et al., 2007) mais pas la prolifération des CSC c-kit+ murines

(Han et al., 2010). Cependant, l'inhibition de IKDR favorise la prolifération de cellules

progénitrices neurales adultes de rat (Liebau et al., 2006; Yasuda and Adams, 2010; Yasuda et

al., 2008) et celle des progéniteurs neuronaux humains (Schaarschmidt et al., 2009).

De même, le blocage de IKCa réduit également la prolifération cellulaire dans les CSMs

murines de la moelle osseuse avec une accumulation des cellules dans la phase G0 / G1 du

cycle (Tao et al., 2008). Cependant, dans les CSMs humaines du tissu adipeu l'i hi itio d’IKCa

n'a pas d'effet inhibiteur sur la prolifération cellulaire (Bai et al., 2007).

L'effet régulateur de BKCa sur la prolifération a été reporté dans plusieurs types

cellulaires. L'inhibition de BKCa réduit la prolifération cellulaire des pré-adipocytes humains

(Hu et al., 2009) et celle des cellules ES murins (Wang et al., 2005) mais pas celle des CSMs

humaines du tissu adipeux (Bai et al., 2007). Cependant, l'inhibition de BKCa réduit la

p olif atio ellulai e et p o o ue l’a t du le e phase G /G da s les CSMs humaines

de la moelle osseuse (Zhang et al., 2014b). De la e a i e, l’i hi itio de BKCa réduit la

prolifération en accumulant les cellules en phase G0/G1 dans les CSCs c-kit+ humaines (Zhang

et al., 2015b). Le canal Cl- sensible au volume a été impliqué dans la prolifération cellulaire et

l'apoptose de plusieurs types cellulaires (Blackiston et al., 2009; Lang et al., 2006; Liu et al.,

2010). L’i hi itio de ICl. ol duit ota le e t la p olif atio ellulai e des CSMs murines

(par accumulation des cellules en phase G0/G1) en inhibant la cycline D et la cycline E (Tao et

al., 2008). De même, le blocage du canal ICl.vol diminue également la prolifération cellulaire

des CSC c-kit+ murines (Han et al., 2010). L’h pe pola isatio de la e a e est i pli u e

da s l’i hi itio de la p olif atio ellulai e (Hu et al., 2009; Kuhlmann et al., 2005).

Dans les cellules progénitrices neuronales adultes, la dépolarisation membranaire par

l’i hi itio de IKi ou par l'augmentation de la concentration de K+ extracellulaire favorise la

prolifération cellulaire (Yasuda et al., 2008). Cepe da t l’i hi ition du canal Kir2.1 dans les

CSCs c-kit+ hu ai es ’affe te pas la p olif atio ellulai e (Zhang et al., 2015b). Concernant

le rôle du courant Ito dans la prolifération, des études ont montré que l'activation du courant

IA (KV4.2) est une condition requise pour la prolifération dans les cellules progénitrices

neuronales embryonnaires humaines (Schaarschmidt et al., 2009) et ue l’i hi itio du a al

Introduction

75

KV4.2 réduit la prolifération cellulaire dans les préadipocytes humains (Hu et al., 2009). Une

tude e te a o t ue l’i hi itio des a au TRPV et TRPV da s les C“Cs -kit+

humaines réduit la prolifération cellulai e pa l’a u ulatio des ellules e phase G /G du

cycle cellulaire.

Le rôle précis des canaux Na+ TTX sensibles et les canaux Na+ TTX résistants (NaV1.5),

connus pour jouer un rôle fondamental dans la génération du potentiel d'action dans les

ellules e ita les, ’est pas totale e t lu id da s les ellules o -excitables y compris les

cellules souches (Cai et al., 2004; Li et al., 2005). Dans les CSMs humaines du tissu adipeux, le

blocage de l'INa n'affecte pas la prolifération cellulaire (Bai et al., 2007). De e, l’i hi itio

des canaux Na+ TTX sensibles dans les CSCs c-kit+ ’a pas d’i pa t su leu p olif atio (Zhang

et al., 2015b).

3.2 Différenciation :

Co e o u p de e t, l’a ti it al i ue tosoli ue est u iale pou la

croissance et la progression dans le cycle cellulaire des cellules souches et des progéniteurs

(Ferreira-Martins et al., 2009; Resende et al., 2010).

L’i hi itio des a au Ca2+ de type L réduit la différenciation des cellules progénitrices

neurales dérivées du cortex cérébral de souris D’As e zo et al., . De plus, l'entrée Ca2+

médiée par TRPC1 favorise la différenciation des CSEs neurales de rat (Fiorio Pla et al., 2005).

L’i hi itio de TRPC ais pas TRPC a e des siRNA di i ue la diff e iatio des ellules

progénitrices neurales de rat (Shin et al., 2010). Ces résultats suggèrent que la régulation du

Ca2+ cytosolique par les canaux Ca2+ de type L, TRPC1 ou TRPC5 joue un rôle important dans la

transition entre la prolifération et la différenciation neuronale. Dans les CSMs humaines de la

oelle osseuse l’i hi itio des a au BKCa ou hEag1 réduit la différenciation adipogénique et

ostéogénique de ces cellules (Zhang et al., 2014b).

En résumé, su les ellules sou hes a dia ues o e su d’aut e t pe de ellules

souches les propriétés du signal calcique (fréquence amplitude, répartition spatio-temporelle,

microdomaines) conditionneraient les propriétés cellulaires des cellules souches

(différenciation, auto-renouvellement, prolifération migration). Ce signal conditionnerait

l’e p essio de o euses p ot i es e pa ti ulie les a au io i ues.

Position du problème

76

POSITION DU PROBLEME

Le œu hu ai a t o sid pe da t lo gte ps o e u o ga e post-mitotique

sans aucune régénération et dans lequel les cardiomyocytes présents à la naissance

persisteraient tout au long de la vie sans divisions cellulaires. La seule réponse majeure aux

do ages a dia ues se ait l’h pe t ophie des a dio o tes e o e viables (Chien and

Olson, 2002; MacLellan and Schneider, 2000; Soonpaa and Field, 1998). Ce dogme selon lequel

le myocarde est vu comme un tissu statique commençait à être contesté avec les découvertes

chez l’a i al etta t e ide e des di isio s itoti ues da s les a dio o tes

(McDonnell and Oberpriller, 1984; Rumyantsev and Borisov, 1987). D’aut es do es o t

o t l’e iste e de o tes e t i ulai es e di isio hez l’Ho e da s des o ditio s

normales et pathologiques (Beltrami et al., 2001; Kajstura et al., 1998; Quaini et al., 2002).

Cette ou elle isio du œu o e ta t u o ga e d a i ue i pli ue ait la p se e

d’u e populatio de ellules p og it i es ou de ellules sou hes a dia ues à pa ti

desquelles les nouveaux myocytes peuvent être formés.

En effet, plusieurs équipes ont is e ide e l’e iste e de ellules sou hes

a dia ues C“Cs ultipote tes da s le œu hu ai sai et pathologi ue, apa les de se

différencier en myocytes, cellules musculaires lisses et en cellules endothéliales (Messina et

al., 2004; Urbanek et al., 2005). Cette découverte de CSCs a ouvert un nouveau domaine de

recherche sur les mé a is es de l’ho ostasie et de la g atio a dia ue et a pe is

d’e isage des th apies ellulai es à ase de C“Cs. Depuis, différents types de cellules ayant

des propriétés souches ont été isolées à partir des tissus cardiaques humains et proposées

comme modèles de CSCs (Barile et al., 2007; Guan and Hasenfuss, 2013). Ces CSCs portent

plusieu s o e latu es, ui o espo de t à des a ueu s u’elles e p i e t, o e pa

exemple les CSCs Isl-1+, les CSCs Sca-1+ ou les CSCs c-kit+.

Récemment, u e ou elle populatio de C“Cs d’o igi e se h ateuse a t

d ou e te da s le œu hu ai (Reus et al., 2016; Zhang et al., 2015a). Ces cellules

expriment des facteurs de transcription spécifiques cardiaques et peuvent être différenciées

en plusieurs types cellulaires notamment en « cardiomyocytes ». Cependant, cette

différenciation est incomplète et aboutit à des cardiomyocytes très immatures.

Position du problème

77

Les CSCs W8B2+ possèdent des capacités réparatrices cardiaques importantes

lo s u’elles so t i je t es da s des od les u i s d’i fa tus du o a de (Reus et al.,

2016; Rossini et al., 2011). Cette capacité réparatrice cardiaque serait liée au large sécrétome

que possède ces cellules qui est composé de cytokines et de facteurs de croissance

intervenant notamment dans l'angiogenèse, la survie cellulaire, le chimiotactisme, la réponse

i u itai e, l’i fla atio et le e odelage e t a ellulai e (Reus et al., 2016; Zhang et al.,

2015a).

N a oi s, au u e a a t isatio fo tio elle à l’ helle ellulai e

(électrophysiologie, signalisation calcique au cours la différenciation… ’a t appo t e.

Ainsi, les objectifs de ces travaux consistent à :

Mettre au point un modèle de CSCs humaines exprimant le marqueur W8B2+ à partir

d’ ha tillo s au i ulai es hu ai s o te us e olla o atio a e le CHU de Poitie s.

Caractériser la signature électrophysiologique (canaux ioniques et signalisation

al i ue à l’ tat sou he et ap s diff enciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+.

Améliorer la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ in vitro par optogénétique.

Suivre les changements calciques au cours de cette différenciation via l’utilisatio de

la sonde calcique GCaMP.

En parallèle de ces objectifs, nous avons étudié sur ce modèle cellulaire deux types de

cibles, un canal calcium dépendant et un médiateur lipidique, soient:

l’i po ta e des a au io i ues plus p is e t le a al BKCa) dans la régulation

des propriétés fondamentales (prolifération et auto-renouvellement) des CSCs W8B2+.

les effets et le ode d’a tio de la sphi gosi e -phosphate (un important régulateur

physiologique et physiopathologique cardiaque) sur les propriétés des CSCs W8B2+

(prolifération, auto-renouvellement et migration).

Matériels et méthodes

78

MATERIELS ET METHODES

I- Isolement et purification des CSCs W8B2+ à pa ti d’ ha tillo s hu ai s d’o eillettes droites

L’isole e t et la pu ifi atio des C“Cs W B + est un processus relativement long (5 à 6

semaines pour avoir des CSCs W8B2+ pu es ui o siste e l’utilisatio de diff e tes

méthodes et techniques (Figure MM-1).

1 Isolement des CSCs W8B2+ avec la méthode des explants

Les CSCs W8B2+ o t t isol es à pa ti d’ ha tillo s hu ai s d’o eillettes d oites (EODHs)

en collaboration avec le CHU de Poitiers. Ces échantillons sont des déchets opératoires issus

de la mise en place de circulation extracorporelle lors de chirurgies cardiaques telles que le

pontage coronarien ou le remplacement valvulaire aortique. Toutes les procédures ont été

menées conformément à la Déclaration d'Helsinki. Une fois prélevés, les EODHs sont stockés

Passage 0

Passage 1 Passage 2

Figure MM-1 : “ h a du p oto ole d’isole e t et de pu ifi atio des C“Cs W B + à partir des échantillons auriculaires humains. Les échantillons fraîchement récoltés sont coupés en petits fragments de 1-2 mm3 et cultivés selon la méthode des explants. Au bout de 3-4 semaines, les cellules adhérentes ayant proliféré sont triées avec le système du tri magnétique positif pour avoir une population enrichie en CSCs W8B2+. Après la confluence, les cellules sont marquées avec l’a ti o ps a ti-W8B2-PE et triées par FACS.


79

dans une solution de Tyrode (NaCl 140 mM, KCl 5,4 mM, MgCl2 1,8 mM, CaCl2 1,8 mM, HEPES

10 mM, D-Glc 10 mM, pH 7.4) à 4°C et acheminés rapidement au laboratoire. Les échantillons

hu ai s d’o eillettes d oites f ai he e t olt s so t i s fois a e du PB“ oi

o positio e a e e pou e le e le a i u de sa g. Le tissu adipeu a dia ue s’il est

présent) est complétement retiré par dissection. Ces échantillons sont ensuite coupés

manuellement avec des ciseaux stériles en petits fragments de 1–2 mm3 et rincés avec du PBS

X jus u’à e ue le su agea t de ie e totale e t t a spa e t. Ces f ag e ts so t e suite

digérés enzymatiquement avec la collagénase A (1 mg/mL, Sigma-Aldrich) pendant 20 minutes

dans un bain marie à 37°C sous agitation. Après digestion enzymatique, les fragments sont

ensemencés (comme passage 0) dans des boites de Pétri de 10 cm de diamètre préalablement

recouvertes de fibronectine (10 μg/mL, Sigma-Ald i h a a t d’ t e ulti s da s le « milieu

des explants » o pos de ilieu IMDM Lo za suppl e t de % de “VF, , M de β-

mercaptoéthanol (Sigma-Aldrich), 2mM de L-glutamine (Sigma-Aldrich), 100 U/mL de

pénicilline (Sigma-Aldrich), 100 µg/mL de streptomycine (Sigma-Aldrich) et 0,25 µg/mL

d’a phot i i e B “ig a-Aldrich)) dans un incubateur à 37°C et 5% CO2 pendant 3 à 4

semaines en changeant le milieu 1 à 2 fois par semaine. Au bout de quelques jours, les cellules

commencent à sortir des explants, adhèrent au plastic et prolifèrent.

2 Purification des CSCs W8B2+

2.1 Enrichissement en CSCs W8B2+ par le système du tri cellulaire magnétique positif:

2.1.1 Principe :

Il ne faut que 3 étapes simples pour obtenir une population enrichie en CSCs W8B2+ (Figure

MM-2). Dans la 1ère étape, les cellules en suspension sont magnétiquement marquées

(marquage magnétique direct) avec des microbilles (MACS MicroBeads) de 50 nm de diamètre

oupl es au a ti o ps di ig s o t e les a tig es de su fa e W B hu ai s. Il s’agit d’u e

s le tio dite positi e a seul u t pe ellulai e sp ifi ue e l’o u e e les C“Cs W B +)

est magnétiquement marqué.

Dans la 2ème étape, la suspension cellulaire est appliquée à une colonne placée dans un

séparateur. Durant cette étape de séparation, les CSCs W8B2+ marquées magnétiquement

(fraction positive) sont retenues dans la colonne grâce au champ magnétique apporté par un

aimant alors que les cellules non-marquées traversent la colonne (fraction négative).

Dans la 3ème étape, une courte étape de lavage est réalisée et la colonne est retirée du champ


80

magnétique du séparateur. Enfin, les CSCs W8B2+ magnétiquement marquées sont

récupérées par simple élution.

Figure MM-2 : Schéma du principe de la technique du tri cellulaire magnétique positif (MACS pour magnetic-activated cell sorting). Les chiffres 1,2 et 3 illustrent les 3 étapes du tri magnétique. S et N signifient les pôles sud et nord du séparateur. Source : Miltenyi Biotec.


81

2.1.2 Protocole expérimental :

-Préparation des cellules :

Lo s ue les ellules issues des e pla ts o t p olif jus u’à o flue e soit e i o à

semaines après ensemencement des explants), le milieu de culture est retiré et le tapis

cellulaire est rincé avec du PBS 1X (Lonza). Les cellules et les explants sont récoltés par

digestio e z ati ue à l’A u a ® “ig a-Aldrich), pendant 2 à 4 min à 37°C. La totalité des

cellules est récupérée via un tamis cellulaire de nylon de porosité 40µm (Corning) puis

centrifugées à 300 g pendant 7 min.

-Marquage magnétique a e l’a ti o ps a ti-W8B2 (appelé aussi anti-MSCA-1):

Le culot cellulaire est ensuite suspendu dans le tampon du tri magnétique (PBS+ BSA 0,5%+

EDTA M, Milte i iote o te a t l’a ti o ps a ti-W8B2 humain couplé à des micro-

billes magnétiques (dilué au 1/5ème, Miltenyi biotec) et du FCR Blocking Reagent® (dilué au

1/5ème, Miltenyi biotec). Les cellules sont ensuite incubées 15 min à froid (entre 4 et 8°C).

-Séparation magnétique :

Après un lavage dans du tampon dit « tri magnétique », les cellules sont centrifugées (10 min

à 300g), resuspendues puis passées à travers une colonne de séparation cellulaire MACS®

(Miltenyi biotec) positionnée sur un aimant. Un filtre cellulaire de nylon de porosité 40µm est

préalablement placé sur la colonne de séparation cellulaire MACS® pour bien séparer les

cellules.

-Elution des cellules W8B2 positives:

Les cellules W8B2 positives ou W8B2+, retenues dans la colonne, sont lavées par du tampon

« tri magnétique » et récoltées par simple élution en séparant la colonne de l’ai a t. Ap s

centrifugation (10 min à 300 g), les cellules W8B2+ sont ensemencées (comme passage 1) avec

le « milieu de croissance » (contenant 25% du milieu EGM-2 (Lonza) et 75% du milieu M199

Lo za , suppl e t a e % de “VF, , M d’a ides aminés non essentiels, 100 U/mL de

pénicilline, 100µg/mL de streptomycine (Sigma-Aldrich)) et cultivées soit dans des plaques 6

puits ou dans des flasques 25 cm2 (à raison de 103 cellules/cm2) à 37°C et 5% de CO2. Le milieu

de croissance est changé deux fois par semaine et à confluence les cellules W8B2+ sont

préparées pour le tri cellulaire par cytométrie en flux.


82

2.2 Purification des CSCs W8B2+ par le système de tri cellulaire par cytométrie en flux:

2.2.1 Principe:

La cytométrie en flux est une technologie basée su l’utilisatio de lase s pe etta t u e

analyse multi-paramétrique des cellules à un très haut débit (plusieurs milliers de

cellules/seconde).

De nos jours, les termes «cytométrie de flux» et «FACS» sont souvent utilisés pour décrire la

e te h i ue. Le FAC“ est u e te h i ue de to t ie e flu dot e d’u odule

supplémentaire permettant de séparer physiquement les cellules.

Dans ce travail, cette technique a permis de réaliser les expériences suivantes:

-Le tri cellulaire par FACS (Fluorescence-a ti ated ell so ti g à fi d’o te i u e populatio

pure de CSCs W8B2+.

- L’i u o-ph ot page pou tudie le p ofil d’e p essio des a ueu s de surface sur ces

cellules.

-L’a al se du le ellulai e pa i o po atio d’iodu e de p opidiu pou tudie la

répartition des différentes phases du cycle cellulaire.

-L’ tude de la via ilit ellulai e pou tudie l’ e tuelle toto i it de e taines molécules

(ex : paxilline et S1P) sur les CSCs W8B2+.

La figure MM-3 illust e l’i stallatio e p i e tale et les p o du es g ales pou u e

expérience type de tri cellulaire par FACS. Une population mixte de cellules est triée en deux

fractions ; une négative et une positive qui contient les cellules exprimant le marqueur

d’i t t.

E utilisa t des a ti o ps sp ifi ues o jugu s à des so des fluo es e tes, l’a al se pa FAC“

pe et de olle te des do es et aussi de t ie les ellules d’i t t.

L’utilisateu d fi it les pa a t es selo les uels les ellules doi e t t e t i es. E fo tio

des paramètres choisis, le cytomètre impose une charge électrique sur chaque cellule de

manière à ce que les cellules soient triées par charge (par électro-aimants). Elles sont ensuite

réparties dans des récipients séparés à la sortie de la chambre d'écoulement.


83

La cytométrie en flux est réalisée à l’aide d’u to t e ui est o stitu de g a ds

modules : fluidique, optique et électronique (figure MM-4).

-Le système fluidique comprend une cellule d'écoulement, où la suspension cellulaire est

injectée. La cellule d'écoulement nécessite un fluide de gaine pour transporter et aligner les

cellules afin qu'elles passent en une seule file à travers un canal étroit et dans le faisceau

lumineux. Cette focalisation hydrodynamique permet l'analyse d'une cellule à la fois par

interrogation laser.

Figure MM-3 : Schéma simplifié du principe de la technique du tri cellulaire par FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting). Source : Bosterbio.


84

-Le système optique comprend une source de lumière (habituellement un laser), des

détecteurs de lumière et différents filtres.

Les détecteurs de lumière:

Un détecteur situé en face du faisceau lumineux mesure les signaux lumineux de diffusion

di e te, ’est-à-di e d’u e lu i e f a t e pa u e ellule et ui o ti ue so d pla e e t

dans la même direction ue elle de so he i d’o igi e g ale e t jus u'à ° de

décalage par rapport à l'axe du faisceau laser). Ce signal est collecté par un PMT appelé le

canal de diffusion direct (FSC : pour Forward Scatter Channel) figure MM-5 A.

Ce système est couramment utilisé pour déterminer la taille des cellules figure MM-5 A.

Les cellules les plus grandes produiront plus de lumière à diffusion directe que les plus petites.

Le signal de diffusion direct sera plus fort.

Figure MM-4 : “ h a si plifi du p i ipe du fo tio e e t d’u to t e de flu . “ource : Bosterbio.


85

Des détecteurs situés sur le côté mesurent les signaux lumineux de diffusion latérale et sont

appelés SSC (pour Side Scatter Channel) figure MM-5 B. Les détecteurs de fluorescence

mesurent l'intensité du signal de fluorescence émis par les cellules marquées positivement

figure MM-5 C.

Le signal lumineux de diffusion latérale (SSC) est une lumière qui est réfractée par une cellule

et qui se déplace dans une direction différente de celle de son chemin d'origine (mesurée à

un angle de 90 ° par rapport à la ligne d'excitation) figure MM-5 B.

Il fournit généralement des informations sur la granularité et la complexité des cellules. Les

cellules à faible granularité et complexité produiront moins de lumière à diffusion latérale,

tandis que les cellules hautement granulaires avec un degré élevé de complexité interne

(comme les neutrophiles) entraîneront un signal de diffusion latéral plus élevé. Ainsi, en

utilisant la détection de lumière à diffusion directe et à diffusion latérale, les populations

cellulaires peuvent souvent être distinguées en fonction de leur taille et de leur granularité.

Figure MM-5 : Schéma simplifié des paramètres clés mesurés par le cytomètre de flux comprenant la diffusion de lumière directe (FSC), la diffusion de lumière latérale (SSC) et les signaux d'émission de fluorescence. Source : Bosterbio.


86

En plus du FSC et du SSC, les cellules peuvent également être séparées en fonction de

l’e p essio d’u e p ot i e sp ifi ue. Da s e as, u fluo opho e est ha ituelle e t utilisé

pour marquer la protéine d'intérêt. Les fluorophores utilisés pour la détection des protéines

cibles émettent de la lumière après excitation par un laser de longueur d'onde compatible

figure MM-5 C.

À mesure que la cellule fluorescente traverse le point d'interrogation et interagit avec le

faisceau laser, elle crée une impulsion d'émission de photons dans le temps (un pic). Ceux-ci

sont détectés par les PMT et convertis par le système électronique en une impulsion de

tension, généralement appelée «événement». La hauteur et la surface totale des impulsions

sont mesurées par le cytomètre de flux, et la zone d'impulsion de tension sera corrélée

directement à l'intensité de fluorescence pour cet événement individuel.

Il est important de noter que les signaux de fluorescence peuvent également se produire à

partir de substances naturellement fluorescentes dans la cellule telles que les nucléotides de

pyridine (NAD (P) H) et les flavines oxydées (FAD). Cette auto-fluorescence est généralement

plus intense dans les cellules plus grandes et granulaires. Le niveau d'auto-fluorescence peut

être déterminé et exclu à l'aide de cellules non marquées. Il est aussi i po ta t d’utilise u

anticorps contrôle isotypique (un témoin négatif qui révèle la quantité de bruit de fond qui

peut être le résultat de fixations non spécifiques de l'anticorps) approprié qui permet

d’ide tifie a e e titude l'e se le des do es positi es.

Les filtres :

Dans le cytomètre de flux, tous ces différents signaux lumineux sont divisés en longueurs

d'onde définies et canalisées par un ensemble de filtres et de miroirs de sorte que chaque

capteur détecte la fluorescence uniquement à une longueur d'onde spécifique. Ces capteurs

sont appelés tubes photomultiplicateurs (PMTs pour photomultiplying tubes). Chaque PMT

détectera également tout autre fluorophore émettant à une longueur d'onde similaire au

fluorophore qu'il détecte.


87

2.2.2 Protocole expérimental:

Après enrichissement par tri magnétique positif et multiplication cellulaire in vitro, les cellules

W8B2+ so t p pa es pou t e t i es pa le s st e de to t ie e flu afi d’o te i u e

population pure de CSCs W8B2+. Pou ela, les ellules so t tout d’a o d i es au PB“ X,

puis olt es pa digestio e z ati ue à l’A u a ® “ig a-Aldrich). Les cellules sont

ensuite centrifugées (8 min à 300 g). Après élimination du surnageant, le culot est repris dans

du tampon (PBS+ BSA 0,5% + EDTA 2mM) et réparti dans 3 tubes de Polystyrène® (greiner bio-

one) selon les quantités suivantes : 100000 cellules non marquées, 100000 cellules marquées

a e l’a ti o ps isot pi ue o ele a t, et le este des ellules a e l’a ti o ps a ti-W8B2.

Chaque tube est centrifugé (10 min à 300g) à 8°C et les culots sont resuspendus dans du

ta po a e l’a ti o ps isotypique non relevant au 1/11ème couplé à la phycoérythrine

Milte i Biote pou le o t ôle isot pe ou l’a ti o ps a ti-W8B2 (MSCA-1) au 1/11ème

couplé à la phycoérythrine (Miltenyi Biotec) pour marquer les CSCs W8B2+, pendant 10 min, à

l’o s u it , entre 2 et 8°C. Après le marquage, les cellules sont lavées avec du tampon puis

centrifugées (10 min à 300g) à 8°C. Les cellules sont ensuite resuspendues dans du tampon et

triées avec le cytomètre de flux (BD FACS Aria III) en utilisant les cellules non marquées ainsi

ue les ellules i u es a e l’a ti o ps isot pi ue pou p o de au glages de l’appa eil

et régler le bruit de fond de la fluorescence émise par la phycoérythrine. Les CSCs W8B2+ sont

ainsi récupérées séparément dans un tube de Polypropylène (Sarstedt) préalablement

recouvert de milieu de croissance. Enfin, les cellules W8B2+ pures récupérées sont

centrifugées (10 min à 300g) puis resuspendues dans du milieu de croissance à une densité de

50% (passage 2). Suite au tri, les données sont analysées par utilisation du cytomètre de flux

BD Fa sVe se afi d’esti e la pu et de la populatio de C“Cs W B + récupérées.

II- Immunophénotypage des CSCs W8B2+

Les marqueurs de surface cellulaire des CSCs W8B2+ triées ont été analysés par cytométrie en

flux. Les cellules ont été rincées deux fois avec du PBS et remises en suspension dans du

tampon (PBS+ BSA 0,5% + EDTA 2mM) contenant les anticorps humains listés dans le tableau

MM-1.

Tableau MM-1: Liste des a ti o ps utilis s pou l’i u oph ot page pa to t ie e flu .


88

Anticorps Espèce Dilution Fournisseur

IgG1 CD117-APC souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG2a CD45-VioBlue souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG1 CD133/1-VioBright FITC souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG1 CD105-PE souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG2a CD34-PerCP-Vio700 souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG1 CD90-PE-Vio770 souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG1 (S) CD106-FITC Rec Human 1/11e Miltenyi Biotec IgG κ CD -PE-Vio770 souris 1/11e Miltenyi Biotec Mouse IgG1 CD73-APC souris 1/11e Miltenyi Biotec

Anticorps isotypique Espèce Dilution Fournisseur

IgG1-APC souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG2a-VioBlue souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG1-VioBright FITC souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG1-PE souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG2a-PerCP-Vio700 souris 1/11e Miltenyi Biotec REA Control (S)-FITC / 1/11e Miltenyi Biotec IgG1-PE-Vio770 souris 1/11e Miltenyi Biotec

Les cellules ont été incubées à 4 °C dans l'obscurité pendant 10 min, puis lavées avec du PBS,

et remises en suspension pour analyse par cytométrie en flux. Le pourcentage de cellules

positives a été analysé avec le cytomètre Aria Flow FACS en se basant sur plus de 2x104

événements. Pour chaque anticorps testé, un anticorps isotypique est utilisé (tableau MM-1).

Co e il s’agit d’u a uage ultiple ellules a u es a e plusieu s a ti o ps o jugu s

à des fluorochromes différents), une analyse de compensation de fluorescence par cytométrie

en flux a été réalisée grâce aux deux kits suivants: anti-mouse Igk MACS Comp Bead Kit

(Miltenyi Biotec) et anti-REA MACS Comp Bead Kit (Miltenyi Biotec).

III- Conditions de culture et entretien des CSCs W8B2+

Une fois triées, les CSCs W8B2+ sont centrifugées et ensuite ensemencées au ½ dans des

flasques de culture à bouchon ventilé de 25 ou 75 cm2 (en fonction du nombre de cellules

récupérées après tri par FACS) dans du milieu de croissance dans un incubateur à 37°C et 5%

CO2.

Les repiquages cellulaires se font quand les CSCs W8B2+ sont à 80 % de confluence et

l’e se e e e t ellulai e se fait au ¼ a i u da s des flas ues de ultu e à ou ho

e til . Ap s aspi atio de l’a ie ilieu de ultu e, les ellules sont lavées au PBS puis

i u es i a e l’A u a ® “ig a-Aldrich) à 37°C pour les détacher de leur support.


89

Après ajout du milieu DMEM (voir composition en annexe) supplémenté avec 10% de SVF, la

suspension cellulaire est centrifugée (300 g pendant 5 min). Une fois le surnageant aspiré, le

culot cellulaire est repris dans du milieu de croissance et homogénéisé par

pipetage/refoulement et enfin ensemencé dans des flasques.

Les changements de milieu se font 2 à 3 fois par semaine en fonction de la couleur du milieu

de culture. Le nombre de passages maximal pour les expériences est de 9, mais les CSCs W8B2+

continuent à proliférer de manière normale même après 9 passages en culture.

IV- Congélation/décongélation des CSCs W8B2+

Les CSCs W8B2+ peuvent être congelées à faibles passages à une concentration de 1 million de

cellules/ml. Pour cela, les cellules sont passées et le culot est repris dans du milieu de

croissance contenant 10% de DMSO. La suspension cellulaire (1 ml) est rapidement transférée

dans des cryotubes qui sont ensuite placés à -80°C dans une boite de congélation progressive.

heu es ap s, les otu es so t t a sf s pou t e o se s da s l’azote li uide. Pou

la d o g latio , les otu es so t so tis de l’azote li uide et pla s dans le bain marie à 37°C

30 sec. Le contenu du cryotube est repris avec du milieu de croissance et centrifugé (300 g

pendant 5 min). Après aspiration du surnageant, le culot cellulaire est repris dans un volume

adéquat de milieu de croissance dans des flasques de culture qui seront placées dans un

i u ateu . Le le de ai , le ilieu est ha g afi d’ li i e toute t a e de DM“O.

V- Test de formation de colonies (CFU-Fs).

1 Principe :

Le test de formation de colonies (CFU-Fs d o t e la apa it d’auto-renouvellement des

cellules souches en les ensemençant à très faible densité pendant plusieurs jours.

2 Protocole expérimental:

Pour réaliser le test de formation de colonie CFU-Fs (colony-forming unit-fibroblasts), les CSCs

W8B2+ ont été ensemencées à une densité de 5 cellules/cm² dans une plaque 6 puits (soit 50

cellules/puit), dans du milieu de croissance. Le milieu de croissance est renouvelé tous les 3-4

jours. Après 10 jours de culture, les cellules ont été rincées au PBS, fixées pendant 10 min avec

du paraformaldehyde 4% et enfin colorées avec du Crystal violet à 0,5% pendant 30 min

(Sigma-Ald i h . Le tapis ellulai e est e suite i à l’eau ou a te, et s h à l’ai li e, à

température ambiante.


90

L’effi a it de fo atio de olo ie a t esti e e al ula t le appo t du o e de

colonies sur le nombre de cellules ensemencées et est exprimée en pourcentage.

VI- Test de prolifération par comptage cellulaire

1 Principe :

En comptant le nombre de cellules à différents jours après culture, ce test nous permet de

ua tifie et de o pa e l’ olutio du o e ellules à ha ue di isio ellulai e pa

rapport à la condition contrôle.


Les cellules sont ensemencées à une densité de 133 cellules / cm2 dans des boites de Pétri de

35 mm de diamètre et synchronisées avec le milieu de croissance sans SVF pendant 12 h. Le

lendemain le milieu est remplacé par du milieu de croissance (contenant 10 % de SVF) et les

drogues pa illi e ou “ P so t ajout es. Ap s h jou d’i u atio a e les d ogues, les

ellules so t i es au PB“, up es pa digestio e z ati ue à l’A u a et ep ises

dans le milieu DMEM supplémenté avec 10% de SVF et comptées pour chaque jour de culture

(de j 1 à j 9) et pour chaque condition (condition contrôle et condition avec le traitement) en

utilisant la chambre cellulaire de Malassez et le bleu de Trypan pour éliminer les cellules

mortes. Ce comptage est répété durant toute la période de t aite e t alla t jus u’à jou s.

Pour chaque condition, trois comptages différents sont réalisés. Les drogues et le milieu de

croissance sont renouvelés tous les 2 jours.

VII- Test de blessure (wound healing assay)

1 Principe :

Ce test est as su la alisatio d’u e g iffu e au o e d'u o jet pointu (avec une pointe

de pipette) sur une monocouche de cellules confluentes. Les cellules entourant la zone de

lésion (cicatrice ou « wound ») vont se déplacer de façon à recoloniser et couvrir (« healing »)

cet espace. La capacité et la vitesse des cellules à recoloniser la zone de blessure peuvent être

étudiées en présence de différents traitements pour évaluer leurs effets sur le processus

migratoire des cellules.


91

2 Protocole expérimental :

La ig atio ellulai e a t tudi e e utilisa t le test de lessu e pou ega de l’effet des

drogues (paxilline et S1P) sur les capacités migratoires des CSC W8B2+. Pour cela, les CSC

W8B2+ sont ensemencées à une densité de 2x104 cellules/cm2 dans des plaques 6 puits avec

le milieu de croissance contenant 10 % de SVF. Après 6h, le milieu est remplacé par du milieu

de croissance contenant 0 % de SVF et les cellules sont incubées pendant 16h. Ensuite, une

blessure est réalisée au centre du puits de la pla ue à l’aide d’une pointe de cône plastique

st ile de μL. Les f ag e ts de ellules d ta h es so t li i s pa i çages dou au

PBS. Les cellules sont incubées à 37 °C avec le milieu contenant 0% de SVF avec la drogue

correspondante (paxilline ou S1P) pendant 7 h. Les cellules sont ensuite fixées et les noyaux

sont marqués avec le colorant DAPI. Des images cellulaires en transmission ont été prises juste

après la plaie (temps 0h) et après 7h de traitement avec la drogue. Les images ont été

g es à l’aide d’u i os ope o fo ale à disque rotatif (Revolution, Andor) équipé d'un

système motorisé XY (Marzhauser) et d'un logiciel IQ3 (Revolution, Andor) de haute précision

permettant de mémoriser les positions de chaque échantillon. Le nombre de cellules qui ont

ig da s la zo e de lessu e est ua tifi à l’aide du logi iel I ageJ NIH, U“A e

comparant les images prises au temps 0h à celles prises au temps 7h.

VIII- Test de viabilité cellulaire

1 Principe :

Le test de via ilit epose su l’utilisatio de olo a ts fluo es e ts ui pe ette t de d te te

et de discriminer les cellules mortes. Ces colorants réagissent avec les groupements des

amines primaires des protéines de surface et intracellulaires. Contrairement aux cellules

viables, les cellules mortes présentent une membrane cellulaire désintégrée permettant à ces

colorants fluorescents de marquer les protéines intra-cellulaires. Il en résulte une

fluorescence 50 fois plus lumineuse. La discrimination entre les cellules mortes et les cellules

vivantes sera estimée en cytomètrie de flux.


92


A a t de up e les ellules adh e tes pa t aite e t à l’A u a , l’a ie ilieu de

culture est récupéré car ce dernier peut renfermer des cellules mortes. Après centrifugation

i à g , le ulot ellulai e est ep is da s µl de PB“ et µl du olo a t Vio ilit ™

Fi a le D e Milte i Biote et i u pe da t i utes à l’o s u it et à te p atu e

ambiante. Après un rinçage avec le tampon (PBS+ BSA 0,5% + EDTA 2mM), les cellules sont

centrifugées (10 min à 300g) et ensuite analysées par cytométrie de flux à l'aide du cytomètre

de flux FACS VERSE. Pour déterminer le pourcentage de cellules mortes, un contrôle positif

est utilisé (cellules chauffées pendant 10 minutes à 95°C).

IX- A al se du le ellulai e ave l’iodu e de p opidiu

1 Principe :

L’iodu e de p opidiu IP est u age t i te ala t ui peut t e utilis e iologie ol ulai e

comme marqueur des acides nucléiques (ADN et ARN). L’IP est u e ol ule fluo es e te ui

e s’i t g a t à l’ADN ap s t aite e t à l’ARNase pou d g ade les ARNs pe et de

a ue les o au des ellules. E utilisa t la to t ie e flu , le a uage à l’IP pe et

d’ tudie le le ellulai e.


En pratique, les cellules sont ensemencées à une densité de 5 x 102 cellules / cm2 dans des

boîtes de Pétri de 35 mm de diamètre et synchronisées avec le milieu de croissance sans SVF

pendant 12 h. Le lendemain le milieu est remplacé par du milieu de croissance (contenant 10

% de SVF) et les drogues (paxilline ou S1P) sont ajoutées. Pour chaque jour de culture (j 6 à j 8

pour les cellules traitées avec la S1P et j 5 à j 6 pour les cellules traitées avec la paxilline) et

pour chaque condition, le pourcentage des différentes phases du cycle cellulaire (G1, S et G2)

est déterminé. Pour cela, les cellules sont lavées avec du PBS, récupérées par digestion

e z ati ue à l’A u a et e t ifug es i à g . U e fois le su agea t aspi , le

culot cellulaire est lavé avec du PBS et centrifugée (5 min à 300 g). Après centrifugation, les

ellules so t fi es a e de l’ tha ol % pe da t i à °C e ep e a t le ulot a e

µl de PB“ et e ajouta t µl d’ tha ol % f oid goutte à goutte tout en agitant). Après

fixation, les cellules sont centrifugées (5 min à 500g) et ensuite reprises dans la solution de

marquage (constituée de : iodure de propidium à 5 µg/ml (Sigma-Aldrich) + 0,1% de triton


93

(Sigma-Aldrich) + RNase A (Sigma-Aldrich) à 50 µg/ml + QSP PBS) et incubées 1h30 à

te p atu e a ia te à l’a i de la lu i e. Ap s i u atio , les ellules so t filt es a e

des tubes de cytométrie à filtre (BD Falcon) et passées dans le cytomètre de flux (FACS VERSE,

BD pou l’a al se. Les données acquises par le cytomètre sont ensuite traitées à l'aide du

logiciel FLOWJO (Flowjo LLC) afin de déterminer le pourcentage des phases du cycle cellulaire.

X- Immunocytochimie indirecte

1 Principe :

La technique d'immunocytochimie permet de localiser des antigènes dans des cellules ou

organites grâce à l'utilisation d'anticorps spécifiques dirigés contre l'antigène d'intérêt à

détecter. Cette réaction est visualisée par des marqueurs qui sont des molécules

fluo es e tes. O pa le d’i u od tection indirecte quand on utilise un anticorps secondaire

(fabriqué chez l'espèce B) couplé au marqueur dirigé contre l'anticorps primaire (fabriqué chez

l'espèce A).


Les CSCs W8B2+ sont ensemencées à raison de 2x104 cellules/cm² dans des plaques de 24

puits, sur lamelles de verre recouvertes de gélatine à 0,1% et de fibronectine 10µg/mL. Le jour

sui a t l’e se e e e t, les C“Cs W B + (non différenciées), ou après 28 jours de

différenciation sont rincées dans du PBS puis fixées dans du PFA 4% pendant 10 min. Les

cellules sont à nouveau rincées 3 fois pendant 5 min dans du PBS. Les sites de fixation non

spécifiques sont saturés et les membranes cellulaires perméabilisées par du PBS 1X - BSA 0,5%

- Triton 0,1% pendant 1h. Après 3 rinçages au PBS, les cellules sont incubées pendant une nuit

à 4°C sous agitation lente avec les anticorps primaires (tableau MM-2) dilués dans du PBS –

BSA 0,5%. Après 3 rinçages au PBS de 15 min sous agitation, les cellules sont incubées pendant

2h avec les anticorps secondaires (tableau MM-2) dilués dans du PBS – BSA 0,5% et les noyaux

sont marqués dans la même solution avec le TOPRO® 1/1000e (LifeTechnologies). Enfin, les

lamelles sont montées sur lame dans du Mowiol® (Sigma-Aldrich) et observées par

i os opie o fo ale à l’aide d’u i os ope i e s FV Ol pus IX , Tok o, Japo .

L’a uisitio et l’a al se des i ages so t alis es à l’aide du logi iel Fluo ie Ol pus .


94

Tableau MM-2 : Liste des a ti o ps utilis s pou l’i u o to hi ie i di e te.

Anticorps primaire Espèce Dilution Fournisseur

Monoclonal anti-GATA4 souris 1/250e Santa Cruz Biotech Monoclonal anti-MEF2C souris 1/100e abcam Polyclonal anti-NKX2.5 chèvre 1/250e R&D Systems Monoclonal anti-Cnx43 souris 1/500e BD Transduction Labolatories Polyclonal anti-TNNT2 lapin 1/400e Abcam Monoclonal anti-α-actinine souris 1/200e Abcam Monoclonal anti-β-MHC souris 1/500e Abcam

Anticorps secondaire Espèce Dilution Fournisseur

Alexa Fluor 488 anti-lapin poulet 1/250e Invitrogen Alexa Fluor 555 anti-souris chèvre 1/250e Invitrogen Alexa Fluor 555 anti-chèvre singe 1/250e Invitrogen

XI- Différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+

1 Principe :

Ce test de diff e iatio epose su l’utilisatio d’age ts hi i ues o e i du teu s de la

différenciation cardiaque sur des cellules cultivées en monocouche pendant 4 semaines.


Pour induire une différenciation cardiaque in vitro, les CSCs W8B2+ ont été différenciées selon

le protocole schématisé dans la figure MM-6.

Ce p oto ole de diff e iatio du e jou s et epose esse tielle e t su l’utilisatio

d’age ts chimiques (5-aza tidi e, de a thaso e, ph l ut ate et l’a ide ti oï ue

pour induire une différenciation cardiaque.

Les cellules ont été ensemencées à une densité de 2x104 cellules/cm² dans des puits

recouverts de fibronectine 10µg/mL (Sigma-Aldrich) et gélatine 0,1% (Sigma-Aldrich), dans le

ilieu de oissa e. Ap s u e uit d’i u atio , les ellules so t t ait es a e µM de -

azacytidine (Sigma-Aldrich) dans le milieu de croissance pendant 24h.

Les cellules sont ensuite cultivées dans le milieu de différenciation (constitué du milieu IMDM

Lo za suppl e t a e M de de a thaso e, µM de ph l ut ate et µM d’a ide

rétinoïque). Le milieu de différenciation est renouvelé tous les 2 jours.


95

XII- Imagerie calcique

1 Principe :

Pou o se e l’ olutio de l’a ti it al i ue spo ta e au ou s de la diff e iatio des

CSCs W8B2+ in vitro, la GCaMP a été utilisée comme sonde calcique. La GCaMP est constituée

d’u e GFP, d’u e al oduli e CaM ui est u e p ot i e lia t le al iu et u peptide

synthétique appelé M13. E l’a se e de al iu , la GFP fluo es e à u tau fai le. E

présence du calcium, le domai e CaM s’e oule autou du peptide M p o o ua t u

ha ge e t o fo atio el a o pag d’u e fo te fluo es e e de la GFP figure MM-7).

Figure MM-6 : Schéma simplifié du protocole de différenciation cardiaque in vitro utilisé pour différencier les CSCs W8B2+.

Figure MM-7 : “ h a du M a is e d’a tio de la GCaMP. E l’a se e de al iu , la GFP permutée est faiblement fluorescente (GCaMP inactive, à gauche). En liant le calcium, le domaine CaM s’e oule autou du peptide M et p o o ue u ha ge e t o fo atio el de la p ot i e qui restaure la fluorescence de la GFP (GCaMP active, à droite). cpEGFP : enhanced green fluorescent protein (EGFP) modifiée par permutation circulaire (cp) , CaM : calmoduline et M13 : un peptide synthétique (identique au domaine de liaison à la CaM de la kinase de la chaîne légère de la myosine).


96

A l’aide de la i os opie o focale, la GCaMP est excitée à 488 nm à une fréquence donnée

et l’ issio de fluo es e e est olle t e. Cette fluo es e e efl te do l’a ti it al i ue

enregistrée.


En pratique, les CSCs W8B2+ sont ensemencées à une densité de 2x104 cellules/cm² dans des

boites de Pétri de 35 mm fond verre sur un manteau de fibronectine (10µg/mL) et de gélatine

(0,1%) dans le milieu de croissance. Le lendemain, les cellules sont infectées avec la sonde

calcique GCaMP (AAV2/1 CAG-Gcamp6s, Canadian Neurophotonics Platform) pendant 12h, à

4.109 particules virales/mL, dans le milieu de croissance. Après avoir été infectées avec la

GCaMP, les cellules sont cultivées selon le protocole de différenciation déjà décrit. Au cours

de la différenciation (de j à j , l’a ti it al i ue spo ta e ui se t aduit pa des

variations de la fluo es e e ise pa la GCaMP e it e à est e egist e à l’aide

d’u i os ope o fo al à dis ue otatif Olympus IX81-ZDC, Andor) uip d’u s st e

d’i u atio o t ôl e te p atu e °C et e CO2 (5%). Les enregistrements calciques

so t alis s au g ossisse e t pe da t i à u e f ue e d’u e i age/se o de.

Co e a t l’ tude pha a ologi ue, u s st e de pe fusion (fabriqué au laboratoire)

pe et l’i t odu tio des age ts pha a ologi ues et e i pe da t l’e egist e e t. La

durée des enregistrements est comprise entre 20 et 30 min à une f ue e d’u e

image/seconde. Les enregistrements calciques bruts sont ensuite a al s s à l’aide d’u e

« macro » appliquée sous Image J qui permet de quantifier les variations de fluorescence

globales dans chaque cellule étudiée (figure MM-8).

Concernant les graphes ep se ta t l’a ti it al i ue sous fo e d’os illatio s , les

sultats de a iatio de fluo es e e so t o alis s e appli ua t la fo ule ΔF/F . A e

ΔF ui ep se te la a iatio de l’i te sit de fluo es e e IF à l’i sta t t pa appo t à u e

valeur basale de fluorescence (F0) obenue en moyennant les 10 valeurs de fluorescence les

plus basses.

ΔF/F = �� à � − �� é �� é


97

L’a al se des pa a t es des os illatio s al i ues f ue e, amplitude, durée, aire, TTP,

TTR, pou e tage du te ps d’a ti it , pe te et pe te , a t o te ue à l’aide d’u

p og a e d elopp au la o atoi e à pa ti du logi iel IDL. L’a plitude U.A o espo d au

rapport F/F0, la fréquence (pic/min) correspo d au o e d’os illatio s al i ues o te ues

en 10 min, la durée (s) mesurée à mi-hauteu de la ou e, l’ai e sous la ou e U.A.s , le TTP

(s) ou « time to peak » correspond au temps nécessaire pour passer de la fluorescence de

base F0 au maximum de la fluorescence F, le TTR (s) ou « time to recovery » correspond au

temps nécessaire pour passer de la fluorescence maximale F à la fluorescence de base F0, la

pente 1 (s) et la pente 2 (s). Figure MM-9

Figure MM-8 : E e ple d’i age de fluo es e e o te ue lo s des os illatio s al i ues ap s traitement avec le logiciel Image J. La zone rouge délimitée en jaune correspond à la fluorescence glo ale au sei d’u e seule ellule. Cette i age est issue de C“Cs W B + ap s jou s de différenciation cardiaque in vitro. Ba e d’ helle = µ .


98

XIII- RT-PCR « Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction »

1 Principe :

La RT-PCR est une technique qui permet l’a plifi atio de a i e e po e tielle d’u

f ag e t d’ADN o pl e tai e ADNC d’i t t o te u pa t o-transcription ou RT. Elle

s’effe tue pa u e su essio de les the i ues o p e a t ha u u e phase de

d atu atio sui ie d’u e phase d’h idatio des a o es puis u e tape d’ lo gatio . La

s th se du i o pl e tai e se fait pa ajout de dNTP sous l’a tio de la Ta pol ase.


La RT-PCR se fait en 3 grandes étapes ; extraction des ARNs totaux, rétro-transcription (RT)

et amplification en chaîne par polymérase (PCR).

Figure MM-9 : T a d’u e os illatio al i ue o te ue au ème jour de différenciation montrant les différents paramètres calculés avec le logiciel IDL.


99

2.1 Extraction des ARNs totaux

2.1.1 Extraction des ARNs totaux à partir des CSCs W8B2+ adhérentes en culture :

A a t de p o de à la t a s iptio i e se RT , u e tape d’e t a tio des ARNs totaux avec

la te h i ue d’e t a tio « Phénol/chloroforme/isothiocyanate de guanidine selon la

méthode de Chomczynski et Sacchi ». Pour cela, les CSCs W8B2+ adhérentes en culture sont

i es a e du PB“ et le a tif RNABle Eu o io o te a t l’isothio a ate de guanidine et

le phénol est ajouté. Après 30 secondes, les cellules sont lysées mécaniquement avec un

grattoir à cellules (Costar®). Le lysat cellulaire est ensuite transféré dans un microtube exempt

de ribonucléases de 1,5 ml et le chloroforme est ajouté. Après homogénéisation par vortex,

une étape de centrifugation à 14000 rpm pendant 15 min à 4° est nécessaire pour séparer

l’e se le du l sat e t ois phases u e phase a ueuse, u e i te phase et u e phase

organique). Un volume de la phase aqueuse est récupéré et incubé toute la nuit à 4°C avec un

olu e ide ti ue d’isop opa ol pou p ipite les ARNs. Le le de ai , la solutio est

centrifugée pendant 15 min à 14 p à °C et l’isop opa ol est eti . Le ulot o te a t

les ARNs est la a e de l’ tha ol 70% pour éliminer les sels et de nouveau centrifugé

pendant 15 min à 14 p à °C. Ap s a oi eti l’ tha ol, le ulot d’ARNs est s h à

°C à l’aide d’u ai à se . E fi , les ARNs totau so t suspe dus da s de l’eau d sio is e

exempte de ribonucléases et chauffés 5 min à 65°C. La concentration en ARN de chaque

échantillon est mesurée en ng/ml par spectrophotométrie en utilisant le NanoDrop

Spectrophotometer ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc, USA).

2.1.2 Extraction des ARNs totaux à partir des EODHs :

Les EODHs fraichement récoltés sont rincés 3 fois avec du PBS, dégraissés et ensuite coupés

manuellement avec des ciseaux stériles en petits fragments de 1–2 mm3. Ces fragments sont

transférés dans des tubes de 4,5 ml à fond rond (Greiner Bio-One) contenant du réactif RNABle

Eu o io . Les f ag e ts so t e suite o s Pol t o PT E, Fishe “ ie tifi jus u’à

o te tio d’u o at ho og e.

Le reste du protocole expérimental est le même que pour les cellules adhérentes en culture à

l’e eptio de l’ tape de p ipitatio des ARNs totau ui se fait à te p atu e a ia te

pendant 15 min.


100

2.2 Rétro-transcription ou RT (Reverse Transcription):

Les ARNs totaux précédemment extraits sont rétrotranscrits en ADN complémentaire (ADNc)

en utilisant les he a es u l otidi ues al atoi es ui se fi e t al atoi e e t su l’ARN afi

d’a o e la s th se du i d’ADN et l’e z e la t a s iptase i e se M-MLV) qui

atal se la a tio de s th se de l’ADN e utilisa t l’ARN o e at i e.

Après dissolution des ARNs totau , μL de p i so t ajout s au μL d’ARNs totau

µg). Le prémix (ou mélange réactionnel) est constitué de : 5 µl de tampon 5X (composé de 100

mM Tris–HCl pH 8.3, 150 mM KCl, 6.25 mM MgCl2, Invitrogen), 2,5 µl de DTT (20 mM,

Invitrogen), 1 µl de dNTPs (2 mM, I it oge et , µl de Ra do P i e Pd N . μg ,

I it oge et µl d’eau.

Ap s i u atio des ARNs à °C pe da t i , µl de d’i hi iteu de RNAse U,

RNaseOUT-Invitrogen) et 2 µl de transcriptase inverse M-MLV (400 U, Invitrogen) sont ajoutés

pou a oi u olu e fi al de μL.

L'ADNc est synthétisé à 37°C pendant 1 heure puis 25 µL d'eau stérile sont ajoutés. Les

enzymes restantes ont été désactivées par la chaleur (100°C, 2 min). Les ADNc peuvent être

conservés à -20°C.

2.3 Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction)

Ap s la p o du e de RT, , µl d’ADN ≈ g so t ajout s aux 22,5 µl de mélange

réactionnel de PCR. Ce mélange est composé de 2,5 µl de tampon 10X (composé de : 250 mM

de Tris-HCl pH8.4, 62,5 mM KCl, Invitrogen), 1 µl de MgCl2 (2,5 mM, Invitrogen), 0,25 µl de

dNTPs (277, µM, I it oge , µl d’a o es se s et a ti-sens (12 pM, Invitrogen), 0,25 µl de

Taq polymérase (1, U, I it oge et , µl d’eau. De l’huile io is e µl est ajoutée dans

ha ue tu e pou ite l’ apo atio à haute te p atu e.

La réaction de PCR est effectuée avec un thermocycleur (dénaturation à 95 ° C pendant 5

minutes, suivie de 38 cycles à 57°C pendant 30 s, 72°C pendant 30 s et 95°C Pendant 30 s.

Après le dernier cycle, les échantillons sont incubés à 57°C pendant 2 min et à 72°C pendant

10 minutes pour assurer une extension complète du produit. Toutes les amorces sont décrites

dans le tableau MM-3. La GAPDH est utilisée comme gène de ménage. Les produits amplifiés

sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 2% (contenant 0,01% de bromure

d'éthidium) dans du tampon Tris-Acétate-EDTA et visualisés en utilisant un Transilluminateur

UV.


101

Tableau MM-3 : Liste des amorces sens et anti-sens utilisées pour la PCR.

Gène Amorce sens Amorce anti-sens

GAPDH AAGGTCATCCCTGAGCTGAA TGACAAAGTGGTCGTTGAGG

MEF2C AAGAAGGAGATTTGTTTGGAGG CTTTGTAAATGTCACCTGTCTG

GATA4 CCCAATCTCGATATGTTTGAC CGTTCATCTTGTGGTAGAGG

TNNT2 CTGCTGTTCTGAGGGAGAGC CACCAAGTTGGGATGAACG

ACTC1 CCTTCATTGGTATGGAATCTG AATCTTCATGGTGCTTAGGAG

β-MHC GAGCTACGGGTTCCCCTCT GGAAGCTCTGCTACCCCTTTT

NKX2.5 AAAGAAAGGGTGTGAACTGC CGCACAGTAATGGTAAGGGA

KCa1.1 CCTGCAGCGAAGTATCATCA ACTCGAAGTGAAGCTGCCAT

Connexin43 GGGCGTTAAGGATCGGGTTAAGG GTTGGTGAGGAGCAGCCATTGAA

KCa3.1 GCCTCAGAGCAAAAGTCCCA AGGTAGAGCGCCCACGAG

KCa2.1 GAAGTTCCTCCAAGCTATCCA TCTTTCCGTTCCCTGGTCT

KV4.2 ACATGCAGAGCAAACGGAA GGACTGTGACTTGAAGGACGA

KV4.3 GCCTCCGAACTAGGCTTTCT CCCTGCGTTTATCAGCTCTC

Kir2.1 ACTTCCACTCCATGTCCC CTTTACTCTTCCCGTTCC

S1PR1 var 1 GACTCGAGCTGCGGTTTCC TCCTTGTCCGCGCTGATATT

S1PR1 var 2 GAGCGAGGCTGCGGTT CCGCGCTGATATTCAGCTTT

S1PR2 CGGCCTAGCCAGTTCTGAAA AATGGCGCAACAGAGGATGA

S1PR3 GGCCGCTGGAAAAGTTTAGTC GTTGAAAAAGGGCTCCTCCGT

S1PR4 TTGCAGTCTTGCGTGTGGAT GACCATGGGAAGCCCATTTG

S1PR5 var 1 GGAGCAGCGGGAACCTATCT CCCCAAGGCTGTGAACTGA

S1PR5 var 2 AGGGCGCAGACCTTGG GCCCCGACAGTAGGATGTTG

TRPM4 TTGGCATACTGGGAGACGCA GGCCCAAGATCGTCATCGT

TRPM7 TCACAGAACTTCCATTCCTGTTCA CTGTGACAGGCTCCCCTCTT

XIV- RT-qPCR « Reverse Transcription- quantitative Polymerase Chain Reaction » en

SybrGreen

1 Principe :

Cette te h ologie est as e su la d te tio et la ua tifi atio d’u epo te fluo es e t

le « Sybr Green » do t l’ issio est di e te e t p opo tio elle à la ua tit

d’a pli o s g s pendant la réaction de PCR. Le « Sybr Green » est un intercalant de

l’ADN.


La RT-qPCR comme la RT-PCR, s’effe tue e g a des tapes : extraction des ARNs totaux,

reverse transcription (RT) et amplification par PCR quantitative (qPCR ou real-time PCR).

-Les p oto oles d’e t a tio d’ARNs totau et de RT sont les mêmes que pour la RT-PCR.


102

2.1 qPCR avec la technologie SybrGreen

Après la procédure de RT, la qPCR (avec la technologie SybrGreen) est réalisée sur plaque de

96 puits, avec les amorces sens et anti-sens de chaque gène étudié (tableau MM-3). Le volume

final du mélange réactionnel est de 15 µl par puits, o te a t µl de Mi et µl d’ADN

g fi al/puits . Le Mi o tie t , µl de ouple d’a o es se s et a ti-sens) à 900 nM, 7,5

µl de réactif Power SYBR® Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) et 1, µl d’eau.

Le Power SYBR® Green PCR Master Mix contient la Taq Gold® DNA Polymerase (enzyme de la

réaction), les dNTPs et les sels nécessaires pour la réaction. Chaque échantillon a été

pol is e t iple afi d’esti e au ieu le le seuil le th eshold d’appa itio de la

fluo es e e. L’eau est hoisie o e o t ôle gatif. La a tio d’a plifi atio o e e

pa u e d atu atio i itiale de l’ADN pe da t i à °C, pe etta t l’a ti atio de

l’ADN pol ase, et est sui ie de les su essifs o pos s d’u e tape de d atu atio

pe da t se à °C, puis d’u e tape d’h idatio des a o es et d’ lo gatio pe da t

1 min à 60°C. La quantification de produits amplifiés à chaque cycle se fait par détection de

fluo es e e g â e à l’appa eil Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems USA).

2.2 RT-qPCR à haut rendement ou TLDA (TaqMan Low Density Custom Array)

2.2.1 Principe:

La technologie TLDA (ou TaqMan Low Density Array) est une qPCR à haut rendement car elle

permet de déterminer rapidement le profil d'expression d'un grand nombre de gènes et sur

plusieu s ha tillo s tout e utilisa t u e fai le ua tit d’ADN . Co t ai e e t à la PCR

en plaque 96 puits, la TLDA est réalisée sur cartes micro-fluidiques composées de 384 puits.

Le p i ipe de la TLDA epose su l’utilisatio de so des fluo es e tes « sondes TaqMan ».

Comme pour la qPCR en « SybrGreen », le signal fluorescent résultant permet une mesure

quantitative de l'accumulation exponentielle du produit au cours des différents cycles de PCR.

2.2.2 Extraction des ARNs totaux

L’e t a tio des ARNs totau à pa ti des C“Cs W B + et des CSCs W8B2+ différenciées est

alis e a e u Kit d’e t a tio d’ARN Nu leo“pi ® Ma he e -Nagel). Les cellules sont

collectées après trypsinisation et centrifugation (8 min à 300 g) et lysées avec le tampon RA1

et le β-mercaptoethanol. Le lysat est ensuite filtré avec des colonnes (NucleoSpin® Filter) et


103

e t ifug s i à g . Ap s filt atio , l’ tha ol % est ajout au l sat et e de ie

est déposé sur des colonnes (NucleoSpin® RNA Column). Le lysat est ensuite centrifugé (30 s

à 11000 g). Après ajout du MDB (Membrane Desalting Buffer), le lysat est centrifugé (1 min à

g pou li i e les sels. L’ADN est e suite dig a e u e solutio dite de

« digestion » (DNase reaction mixture) pendant 15 min à température ambiante. Les ARNs

sont ensuite rincés avec les tampons RAW2 et RA3 (1er rinçage avec le tampon RAW2 et le 2ème

et 3ème i çage a e le ta po RA . E fi , les ARNs so t lu s da s µl d’eau RNase-free

water) et centrifugés (1 min à 11000 g). La concentration en ARN de chaque échantillon est

mesurée en ng/ml par spectrophotométrie en utilisant le NanoDrop Spectrophotometer ND-

1000 (NanoDrop Technologies Inc, USA). Les ARNs sont gardés à -8 °C jus u’à la p o hai e

étape.

2.2.3 Transcription inverse ou RT (Reverse Transcription):

Les ARNs totaux précédemment extraits sont rétrotranscrits en ADN complémentaires (ADNc)

en utilisant un Kit de transcription inverse (Super Script IV VILO, Invitrogen). Pour cela, 16 µl

d’ARNs totau o te a t µg d’ARNs totau o pl t s a e de l’eau so t ajout s aux 4 µl

de superscript IV VILO Master mix du kit (contenant tout ce qui est nécessaire pour la réaction

de RT). Après centrifugation rapide, le mélange est incubé 10 min à 25°C puis 20 min à 50°C

et enfin 5 min à 85°C. Après une rapide centrifugation, les ADNc obtenus sont conservés à -20

°C.

2.2.4 qPCR avec la technologie TaqMan

Cette expérimentation a été réalisée en collaboration avec le Docteur Nathalie Gaborit de

l'institut du thorax, équipe INSERM UMR 1087 / CNRS UMR 6291 à Nantes.

Le mélange réactionnel TaqMan® master mix (incluant tous les agents nécessaires pour la

réaction de PCR) est ajouté aux 384 puits de la carte (TaqMan® Array Micro Fluidic Card, AB)

préchargés ave des so des d’h d ol se fluo escentes TaqMan® et des amorces spécifiques

du gène à amplifier. La réaction de PCR est effectuée sur TLDA avec le système de détection

de s ue es ABI P is HT Applied Bios ste s . L’a plifi atio se fait e ua a te

cycles comprenant trois étapes : une étape de dénaturation de 30 secondes à 97°C et une

tape d’h idatio et d’ lo gatio d’u e i ute à . °C. Les do es so t e ueillies à

l’aide du logi iel Applied Bios ste s “D“ . et a al s es a e la thode de ua tifi atio

relative du cycle seuil (Ct) (Livak & Schmittgen, 2001).


104

Les 96 gènes humains sélectionnés pour leur expression génique (tableau MM-4) codent pour

des canaux potassiques, calciques, sodiques et HCN. Mais également pour des protéines

i pli u es da s la sig alisatio et l’ho ostasie al i ue, des o e i es, des fa teu s de

transcription et des protéines structurales cardiaques, des NP (peptide natriurétique) et enfin

4 gènes références pour la normalisation. Nous avons sélectionné le gène RPL13A (Ribosomal

Protein L13a) pour la normalisation des données, en tant que gène le plus uniformément

distribué. L'expression relative de chaque gène par rapport à RPL13A a été calculée pour

ha ue ha tillo ΔCt i di ue des do es o alis es . Le p ofil d’e p essio de ha ue

gène dans les CSCs W8B2+ est représenté avec la formule : 2-ΔCt vs RPL13A (x104). La variation

d'expression de chaque gène dans les CSCs W8B2+ différenciées versus les CSCs W8B2+ non

différenciées est représentée par le facteur –ΔΔCt.

Tableau MM-4: Liste des sondes et des 96 gènes analysés par TLDA

Référence de la sonde Nom du gène Nom de la protéine

Hs01093761_m1

Hs00245832_m1

Hs00958036_m1

Hs00426868_g1

Hs00544877_m1

Hs00193090_m1

Hs00608066_m1

Hs00167681_m1

Hs00167753_m1

Hs00367969_m1

Hs01103527_m1

Hs00984856_m1

Hs01021049_m1

Hs01100744_m1

Hs00300085_s1

Hs00968732_g1

Hs00154286_m1

Hs00748445_s1

Hs00270952_m1

Hs00271416_s1

Hs00987388_s1

Hs01085412_m1

Hs00606903_m1

Hs00380018_m1

ABCC8

ABCC9

ATP1A3

ATP1B1

ATP2A2

ATP2A3

ATP2B4

CACNA1C

CACNA1D

CACNA1G

CACNA1H

CACNA2D1

CACNA2D2

CACNB2

CALM1

CALM3

CASQ2

GJA1

GJA5

GJA7

GJD3

HCN1

HCN2

HCN3

SUR1

SUR2

Na/K-ATPase a3

Na/K-ATPase b1

SERCA2

SERCA3

Ca ATPase4

Cav1.2

Cav1.3

Cav3.1

Cav3.2

Cava2d1

Cava2d2

Cavb2

CALM1

CALM3

CASQ2

Cx43

Cx40

Cx45

Cx30.2

HCN1

HCN2

HCN3


105

Hs00975492_m1

Hs00181881_m1

Hs00609908_m1

Hs00270656_s1

Hs00937357_s1

Hs00969279_s1

Hs00361015_m1

Hs00186308_m1

Hs01085073_m1

Hs00270657_m1

Hs00428198_m1

Hs01054873_m1

Hs00542597_m1

Hs00264799_s1

Hs01085745_s1

Hs00270822_s1

Hs01921543_s1

Hs01851577_s1

Hs04234270_g1

Hs01552688_g1

Hs00265026_s1

Hs01876357_s1

Hs04334861_s1

Hs00705379_s1

Hs00168476_m1

Hs00958961_m1

Hs00158428_m1

Hs00605529_m1

Hs00186652_m1

Hs00923522_m1

Hs00383230_g1

Hs01057466_g1

Hs01848144_s1

Hs00174223_m1

Hs00181461_m1

Hs01045137_m1

Hs03987893_m1

Hs00394952_m1

Hs00366913_m1

Hs01024483_m1

Hs01109480_m1

Hs03681025_m1

Hs00165693_m1

Hs00161546_m1

HCN4

ITPR1

ITPR3

KCNA2

KCNA4

KCNA5

KCNA7

KCNAB2

KCNAB3

KCNB1

KCNC4

KCND2

KCND3

KCNE1

KCNE1L

KCNE2

KCNE3

KCNE4

KCNH2

KCNIP2

KCNJ11

KCNJ2

KCNJ3

KCNJ4

KCNJ5

KCNJ8

KCNK1

KCNK3

KCNK5

KCNQ1

NPPA

NPPB

PLN

PPP3CA

RYR2

SCN10A

SCN1B

SCN2B

SCN3A

SCN3B

SCN4A

SCN4B

SCN5A

SCN7A

HCN4

ITPR1

ITPR3

Kv1.2

Kv1.4

Kv1.5

Kv1.7

Kvb2

Kvb3

Kv2.1

Kv3.4

Kv4.2

Kv4.3

MinK

KCNE5

MIRP1

MIRP2

MIRP3

hERG

KChIP2

Kir6.2

Kir2.1

Kir3.1

Kir2.3

Kir3.4

Kir6.1

TWIK1

TASK1

TASK2

KvLQT1

ANP

BNP

PLN

CAM-PRP

RYR2

Nav1.8

Navb1

Navb2

Nav1.3

Navb3

Nav1.4

Navb4

Nav1.5

Nav2.1


106

Hs00161567_m1

Hs01062258_m1

Hs00153998_m1

Hs99999903_m1

Hs04194366_g1

Hs00231122_m1

Hs00171403_m1

Hs00388359_m1

Hs00232018_m1

Hs00232622_m1

Hs01124217_g1

Hs00212560_m1

Hs04334749_m1

Hs00361155_m1

Hs00195612_m1

Hs00911929_m1

Hs00231763_m1

Hs00165957_m1

Hs00943911_m1

Hs01101425_m1

Hs01110632_m1

Hs00188163_m1

Hs00380556_m1

Hs00380518_m1

Hs00187842_m1

Hs01085598_g1

Hs00166405_m1

Hs99999901_s1

SCN9A

SLC8A1

ANK2

ACTB

RPL13A

GATA3

GATA4

GATA5

GATA6

HEY2

IRX3

IRX4

IRX5

TBX5

TBX3

TBX2

NKX2.5

TroponineI, cardiac

TroponineT,cardiac

MYH6

MYH7

RRAD

CLASP2

GPD1L

B2M

MYL7

MYL2

18S

Nav1.7

NCX1

ANKB

ACTB

RPL13A

GATA3

GATA4

GATA5

GATA6

HEY2

IRX3

IRX4

IRX5

TBX5

TBX3

TBX2

NKX2-5

TNNI3

TNNT2

MYH6

MYH7

RAD

CLASP2

GPD1L

B2M

MLV2A

MLC2V

18S

XV- Western blot

1 Principe:

Le Weste lot est u e te h i ue d’a al se pou ett e e ide e l’e p essio des

p ot i es d’i t t se t ou a t da s u la ge p ot i ue. Les p ot i es totales e t aites

sont séparées par électrophorèse en conditions dénaturantes selon leur poids moléculaire,

puis transférées sur une membrane (électrotransfert ou blot). La protéine d'intérêt est ensuite

d te t e pa i u od te tio i di e te pa u a ti o ps p i ai e sp ifi ue. L’a ti o ps

secondaire est couplé à un groupement enzymatique permettant une révélation par chimie-

luminescence.


107


Pour déterminer l'expression protéique de KCa1.1, NCX1 ,NCX3 et S1PR3, les cellules W8B2+

ou le tissu atrial humain ont été lysées dans le tampon de radioimmunoprécipitation

(radioimmunoprecipitation assay buffer) contenant en mM: Tris-HCl 50 pH: 8, NaCl 150, EDTA

5, 0,05% d'Igepal, 1% d'acide désoxycholique, 1% de Triton X-100, 0,1% de SDS) et

supplémenté avec des inhibiteurs des protéases et des phosphatases (Protease Inhibitor

Cocktail, Sigma-Aldrich - PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail, Roche).

Les lysats cellulaires solubles ont été dénaturés 5 min à 37 ° C dans du tampon de Laemmli 2

x contenant (en mM): Tris-HCl 125 pH 6,8, SDS 4%, glycerol 20%, bleu de bromophénol 0,004%,

β-mercaptoéthanol à 10%). Les échantillons protéiques (entre 20 et 80 μg), obtenus à partir

de cellules W8B2+ ou du tissu atrial humain, ont été séparés par SDS-PAGE en utilisant des gels

de polyacrylamide à 8% et transférés dans des membranes de nitrocellulose. Les membranes

ont été bloquées 90 min dans une solution de blocage « TBS-Tween » contenant (en mM): Tris

20 pH: 7,6, NaCl 150 et Tween-20 0,2% supplémenté avec 5% de lait écrémé à température

ambiante. Les membranes sont ensuite incubées pendant la nuit à 4 °C avec les anticorps

primaires (tableau MM-5) dilués dans du TBST contenant 5% de lait écrémé. Les membranes

sont ensuite lavées avec du TBS-Tween trois fois pendant 10 min, puis incubées pendant 90

minutes à température ambiante avec les anticorps secondaires correspondants couplés à la

peroxydase HRP (Horse-Radish Peroxydase) dilués dans le TBST contenant 5% de lait écrémé.

Les membranes sont révélées par chémoluminescence avec le substrat (ECL) (GE Healthcare,

Velizy-Villa ou la , F a e . Les sultats o te us so t a al s s e utilisa t l’i ageu

GeneGnome (SynGene Ozyme, Montigny-le-Bretonneux, France).

Tableau MM-5 : Liste des anticorps utilisés pour le Western Blot.

Anticorps primaire Espèce Dilution Fournisseur

Polyclonal anti-KCa1.1 Lapin 1/500e Alomone Labs Polyclonal anti-NCX1 Lapin 1/200e Alomone Labs Polyclonal anti-NCX3 Lapin 1/200e Alomone Labs Polyclonal anti-S1PR3 Lapin 1/100e Abcam Polyclonal anti-Vimentine Lapin 1/500e Santa Cruz

Anticorps secondaire Espèce Dilution Fournisseur

Anti-lapin Chèvre 1/5000e Interchim


108

XVI- Patch clamp

1 Principe :

Le patch-clamp (« patch » pour fragment de membrane et « clamp » pour maintien) est une

te h i ue d’ tude des a au io i ues. Elle est as e su l’utilisatio d’u e fi e pipette de

e e e plie d’u e solutio o du t i e et o e t e à u a plifi ateur) qui une fois en

contact avec la membrane cellulaire (qui contient des canaux ioniques pe et d’e egist e

des courants ioniques. L’a plifi ateu pe et d’i pose des potentiels et de recueillir des

courants (voltage‐ la p ou d’i pose des ou a ts et de e ueilli des a iatio s de pote tiel

(current-clamp).

Selon la configuration choisie, ette te h i ue pe et d’e egist e des ou a ts

a os opi ues sulta t de l’a ti it de plusieu s e tai es ou illie s de a au , ou des

ou a ts u itai es p o o u s pa l’ou e tu e d’u ou de uel ues a au i di iduels < à

canaux). Pour enregistrer les courants portés sur les CSCs W8B2+, nous avons utilisé le voltage-

clamp en configuration cellule entière (whole cell).


Les courants ioniques ont été enregistrés sur les CSCs W8B2+ (ensemencées à une densité de

2.103 cellules/cm2 dans des boites de culture de 35mm de diamètre) par la technique du patch

la p e o figu atio ellule e ti e. Le pat h la p est alis à l’aide d’u a plifi ateu

Axopatch 200A avec une tête CV 202AU (Molecular Devices, CA, USA). Les courants sont

esu s e po se à l’appli atio d’u e te sio ode oltage la p g e pa

l’a plifi ateu o t ol pa u o di ateu pe so el uip d'u o e tisseu a alogi ue-

numérique (Digidata 1322A, Molecular Devices) et à l'aide du logiciel pClamp version 10

(Molecular Devices).

Au ou s de l’e p i e tatio , les ellules so t pe fus es a e u e solutio e t a ellulai e

contenant (en mM) : 136 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1,8 CaCl2, 0,3 NaH2PO4, 10 Glucose, 10 HEPES,

pH 7,3). Les courants ioniques membranaires sont enregistrés via des électrodes de verre de

sista e o p ise e t e et MΩ e o osili ate GC -T fabriquées sur une étireuse

verticale à double chauffage. La solution intrapipette contient (en mM) : 20 KCl, 110 K-asp, 1

MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES, 2,5 EGTA, 0,1 GTP, 5 Na2-phosphocréatinine, 5 Mg-ATP, pH 7,2 (PCa

= 6,3). Le calcium est absent pour la solution PCa<9. Les ou a ts so t e egist s e l’a se e


109

de traitement pharmacologique ou en présence de drogues. Après avoir obtenu une

résista e d’a ole e t e a ai e de l’o d e du giga-Ohm par pression négative, la

e a e ellulai e a t o pue pa su io afi d’o te i la o figu atio ellule-entière.

Divers protocoles de stimulation ont été imposés et sont précisés sur les figures

représentatives des traces de courant enregistrées.

XVII- Tests statistiques

Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide de GraphPad Prism (La Jolla, CA,

USA). Les tests utilisés pour les différentes expériences sont spécifiés dans les légendes des

figures.

Résultats

110

RESULTATS

La partie « Résultats » s’a ti ule autou de t ois hapit es visant à mieux caractériser la

population des cellules souches cardiaques exprimant le marqueur W8B2 (CSCs W8B2+) à

l’ tat sou he ais aussi au ou s de sa diff e iatio a dia ue in vitro.

Dans un premier temps, nous nous sommes focalisés sur la caractérisation phénotypique,

génique et fonctionnelle des CSCs W8B2+ soit :

- La caractérisation immuno-phénotypique après isolement et purification

- La caractérisation génique des canaux ioniques et des acteurs clés de la signalisation

calcique

- L’ olutio de ette e p essio g i ue au ou s de leu diff e iatio a dia ue in

vitro

- L’ tude de l’a ti it al ique au cours de la différenciation cardiaque in vitro

Da s u se o d te ps, ous a o s tudi l’i po ta e des a au io i ues plus

précisément le canal BKCa) dans la régulation des propriétés fondamentales (prolifération et

auto-renouvellement) des CSCs W8B2+.

Et e fi ous a o s a al s les effets et le ode d’a tio de la sphi gosi e -phosphate

ou S1P (un important régulateur physiologique et physiopathologique cardiaque) sur les

propriétés des CSCs W8B2+ (prolifération, auto-renouvellement et migration).

Chapitre I : Isolement et caractérisation des CSCs W8B2+

Différents types de cellules souches ont pu être isolés à partir du tissu cardiaque humain

(Guan and Hasenfuss, 2013). Cette di e sit est due à l’e p essio sp ifi ue de e tai s

marqueurs qui peuvent être des récepteurs membranaires, des facteurs de transcription ou

encore des antigènes de surface. En fonction des travaux et données récemment publiés dans

le domaine des progéniteurs cardiaques humains (Zhang et al., 2015a) ot e tude s’est

o ie t e su la a a t isatio d’u t pe de ellules sou hes a dia ues e p i a t le

marqueur W8B2 (CSCs W8B2+). Plusieurs propriétés ont été vérifiées :

- Leu s p op i t s d’auto-renouvellement et de prolifération

- Leur immuno-phénotype

Résultats

111

- Leu p ofil d’e p essio pou e tai s a ueu s a dia ues

- Leu p ofil d’e p essio g i ue pou e tai s a au io i ues

I- Isolement et caractérisation phénotypique des CSCs W8B2+

1 Isolement des CSCs W8B2+

Les CSCs W8B2+ so t isol es à pa ti d’ ha tillo s d’o eillettes d oites hu ai es o te us

lo s d’op atio s hi u gi ales e : pontages coronariens). Dans cette étude les patients

choisis présentent tous un rythme sinusal o al. L’âge o e est de , ± 9 ans (5 femmes

et 17 hommes).

U e populatio ellulai e totale est d’a o d isol e pa la te h i ue de « culture des

explants » à partir des tissus atriaux humains. Cette population a été ensuite purifiée par les

techniques du tri magnétique et du tri par FACS. La 1ère étape de purification par tri cellulaire

magnétique positif montre que les CSCs W8B2+ représentent environ 3% des cellules totales

(figure R-1 A).

Après expansion cellulaire en culture, la proportion des CSCs W8B2+ isolées par tri

magnétique est enrichie mais reste faible et représente 9,7% des cellules totales (figure R-1

B). La e tape de pu ifi atio pa t i ellulai e pa FAC“ ua t à elle, pe et d’o te i u e

population pure (> 98% de pureté) de CSCs W8B2+ (figure R-1 C).

Ces résultats réalisés sur 22 patients démontrent la présence de CSCs W8B2+ dans

l’o eillette hu ai e et la essit , de pa leu a et , d’utilise des te h i ues de t i ellulai e

pour obtenir une population pure.

2 Capa it s d’auto-renouvellement et de prolifération des CSCs W8B2+

Les CSCs W8B2+ pures isolées adhèrent facilement au plastique et possèdent un

phénotype allongé et fusiforme identique à celui des cellules mésenchymateuses humaines

(figure R-2 A). Pour démontrer le caractère souche de ces cellules, il a été nécessaire de

montrer leur capacité de multiplication clonogénique par un test de formation de colonies

CFU-Fs (colony-forming unit-fi o lasts . A t s fai le de sit d’e se e e e t

cellules/cm²), les CSCs W8B2+ prolifèrent et forment de multiples colonies rendues visibles par

la coloration au Crystal violet (figure R-2 B a,b).

Résultats

112

A

B C

Figure R-1 : Proportions en pourcentage des CSCs W8B2+ durant les différentes étapes de purification. (A) Pourcentage des CSCs W8B2+ et des cellules W8B2- (calculé après tri magnétique) après mise en culture des biopsies auriculaires cardiaques humaines selon la méthode des explants. n = 22 (âge moyen = 67,9 ± 9 ans, 5 femmes et 17 hommes). (B) Pourcentage des CSCs W8B2+ (déterminé par cytométrie en flux) après tri magnétique et expansion cellulaire en culture. n = 21 (âge moyen = 69,5 ± 9,9 ans, 4 femmes et 17 hommes). (C) Pourcentage des CSCs W8B2+ (préalablement triées par tri magnétique) obtenues et purifiées par tri cellulaire par cytométrie en flux. n = 15 (âge moyen = 70,8 ± 10,4 ans, 3 femmes et 12 hommes). CSCs W8B2+ : cellules souches cardiaques exprimant le marqueur W8B2 ; W8B2- : ellules ’e p i a t pas le a ueu W B ; W8B2-PE = fluo es e e ise pa l’a ticorps anti-W8B2 couplé à la phycoérythrine ; FSC-A = forward scatter, représentant la taille de la cellule. Les pourcentages représentent la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

97± 1,4%

3± 1,4%

Cellules totales

Cellules W8B2+

Résultats

113

Concernant leur capacité proliférative, le test de prolifération montre que le nombre des

CSCs W8B2+ passe en moyenne de 1889 cellules (au jour 1) à plus de 139000 (au jour 9) (figure

R-3 A, n = 3). De plus, le atio d’aug e tatio ellulai e e h est d’e i o , (figure R-3

B).

Ces résultats démontrent que les CSCs W8B2+ sont clonogéniques et hautement prolifératives.

A B

B

Figure R-2 : Morphologie des CSCs W8B2+ isolées et des colonies formées. (A) observation en microscopie photonique des CSCs W8B2+ (passage 1) isolées par tri cellulaire par cytométrie en flu . Ba e d’ helle = µ . (B) Test de formation des colonies CFU-F (Colony-Forming Unit-Fibroblastsissues). (B.a) Observation macroscopique des colonies des CSCs W8B2+ après 10 jours de ultu e. Ba e d’ helle = . B. Ag a disse e t d’u e olo ie de C“Cs W B +. Barre d’ helle = .

a b

A

J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J90

5.0104

1.0105

1.5105

2.0105

Temps en culture (jour)

Nom

bre

cellu

laire

J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J90.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5


Rat

io d

e l'a

ugm

enta

tion

cellu

laire

en

24h

Figure R-3 : Capa it d’auto-renouvellement et de prolifération des CSCs W8B2+. (A) Test de

prolifération des CSCs W8B2+ ulti es pe da t jou s o t a t l’ olutio du o e ellulai e. (n = 3). (B) atio d’aug e tatio ellulai e e h. = . J: jou . Cha ue rond noir sur la courbe

représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne) au jour de culture

correspondant. n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

Résultats

114

3 Immunophénotype des CSCs W8B2+

Pour tudie la atu e et l’i u oph ot pe des C“Cs W B + isol es, l’e p essio e

surface de marqueurs de différents lignages (mésenchymateux, hématopoïétique et cellules

souches cardiaques) a été étudiée par cytométrie en flux. Les résultats obtenus révèlent que

ces cellules expriment des marqueurs de surface typiquement mésenchymateux (W8B2 :

98,6%, CD29 : 99,8%, CD73 :99,8% et CD105 :96,2%) (figure R-4 ; 3 patients). Concernant

l’e p essio des a ueu s des ellules h atopoï ti ues, les C“Cs W B + présentent une

très faible expression de CD34 (4,8%) et une expression quasi nulle pour les marqueurs CD45

et CD133 (0,1% et 0% respectivement) (figure R-4). Les CSCs W8B2+ présentent aussi une très

fai le e p essio . % de l’un des marqueurs de cellules souches cardiaques CD177 (appelé

aussi c-kit).

Ces sultats d o t e t t s lai e e t l’o igi e se h ateuse des C“Cs W B +.

W8B

2

CD

29

CD

73

CD

90

CD

105

CD

106

CD

34

CD

45

CD

133

CD

1170

20

40

60

80

100

MarqueursMésenchymateux

MarqueursHématopoïétiques

Marqueur de progéniteursCardiaques

% d

es c

ellu

les

posi

tives

Figure R-4 : Pourcentage des CSCs W8B2+ positives pour les marqueurs de surface indiqués

déterminé par cytométrie en flux. (n = 3). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M

(erreur standard de la moyenne). CD : Cluster of differentiation. n : représente le nombre de

patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

Résultats

115

II-Caractérisation génique des CSCs W8B2+

1 P ofil d’e p essio des a ueu s a dia ues

1.1 P ofil d’e p essio g i ue des fa teu s de t a s iptio a dia ues

Les facteurs de transcription cardiaques contrôlent le programme génétique cardiaque et

jouent un rôle important dans la cardiogenèse et la différenciation cardiaque. Pour

d te i e le p ofil d’e p essio g i ue de e tai s fa teu s de t a s iptio a dia ues,

ous a o s ua tifi leu i eau d’e p essio pa RT-qPCR à haut rendement ou TLDA.

Les facteurs de transcription étudiés sont :

- La famille des facteurs de transcription GATA (protéines à doigts de zinc se fixant sur

la s ue e d’ADN « GATA ») : GATA3, GATA4, GATA5 et GATA6

- La famille des facteurs de transcription HESR (proteins à motif bHLH (basic helix-loop-

helix)) : HEY2

- La famille des facteurs de transcription à homéodomaine « Iroquois homeobox » :

IRX3, IRX4 et IRX5.

- La famille des facteurs de transcription T-box : TBX2, TBX3 et TBX5.

- La famille des facteurs de transcription à homéodomaine NKX : NKX2.5

Les résultats montrent (figure R-5A) que les CSCs W8B2+ expriment fortement les facteurs

de transcription GATA4 et TBX3 mais aussi les facteurs de transcription GATA3, GATA6, IRX3,

TBX2 et TBX5. Une faible expression des facteurs de transcription HEY2 et IRX5 est détecté

dans les CSCs W8B2+. Les résultats montrent aussi que les facteurs de transcription GATA5,

IRX4 et NKX2.5 sont absents dans les CSCs W8B2+.

L’e se le de es o se atio s i di ue ue certains facteurs de transcription cardiaques

précoces sont exprimés (ex : GATA4). Il ressort également une très forte expression de TBX3

connu comme étant impliqué dans les processus de développement cardiaque.

Afi d’ alue le p ofil d’e p essio p otéique de certains facteurs de transcription

cardiaques, nous avons vérifié leur présence par immunocytochimie.

Les résultats illustrés figure R-5B, o fi e t la p se e de la p ot i e GATA et l’a se e

de la protéine NKX2.5 dans les CSCs W8B2+. Il est à noter u’u aut e fa teu de t a s iptio

Résultats

116

a dia ue o MEF C M o te E ha e Fa to C e p se te pas d’e p essio

protéique dans les CSCs W8B2+.

GATA3

GATA4

GATA5

GATA6HEY2

IRX3

IRX4

IRX5

TBX2TBX3

TBX5

NKX2-5

0

200

400

600

1000

1500

2000

2500

2- Ct v

s R

PL1

3A (x

104 )

Figure R-5 : P ofil d’e p essio des fa teu s de t a s iptio a dia ues da s les C“Cs W B +. (A)

P ofil d’e p essio g i ue des fa teu s de t a s iptio a dia ues da s les C“Cs W B +

déterminé par RT- PCR. = . Le P ofil d’e p essio des g es est ep se t en 2-ΔCt par rapport

au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente

la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients

à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+. (B) P ofil d’e p essio p ot i ue de GATA , MEF C et NKX 2.5 (en rouge) dans les CSCs W8B2+ déterminé par immunocytochimie. (n = 3). Les noyaux sont

ep se t s e leu a e le a uage TOPRO. Ba e d’ helle = µ .

A

B

Résultats

117

1.2 P ofil d’e p essio g i ue des structures contractiles cardiaques

Une des particularités phénotypiques cardiaques matures est la présence de structures

contractiles comme la troponine et/ou la myosine. Afin de contrôler si les CSCs W8B2+ se

trouvent bien dans un état souche non diff e i ous a o s ifi l’e p essio g i ue de

certaines protéines structurales et contractiles dont ; l’a k i e B ANKB , la t opo i e

cardiaque inhibitrice de type 3 (TNNI3), la troponine-T cardiaque de type 2 (TNNT2), la chaîne

lourde de la myosine de type 6 (MYH6), les chaînes lourde et légère de la myosine de type 7

(MYH7 & MYL7) et la chaîne légère de la myosine de type 2 (MYL2).

Les résultats obtenus (figure R-6) par RT-qPCR à haut rendement ou TLDA, montrent que

les CSCs W8B2+ ’e p i e t pas les g es oda t pou ANKB, TNNI , TNNT , MYH , MYH ,

MYL7 et MYL2. Néanmoins, comme certaines cellules souches (Drabek et al., 2012) les CSC

W8B2+ expriment des gènes structuraux non spécifiquement cardiaques comme par exemple

CLASP2 (Cytoplasmic Linker Associated Protein 2) qui code pour une protéine structurale

impliquée dans la stabilisation des microtubules.

ANKBTNNI3

TNNT2

MYH6

MYH7

RRAD

CLASP2

GPD1LMYL7

MYL20

100

200

300

400

2- Ct v

s R

PL1

3A (x

104 )

Figure R-6 : P ofil d’e p essio g i ue des st u tu es o t a tiles a dia ues da s les C“Cs W B +

déterminé par RT- PCR. = . Le P ofil d’e p ession des gènes est représenté en 2-ΔCt par rapport



à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+

Résultats

118

1.3 P ofil d’e p essio g i ue des o e i es a dia ues.

Les connexines cardiaques sont des protéines de communication fondamentales

i pli u es da s le d o ot opis e a dia ue ais aussi de la s h o isatio de l’a ti it

myocytaire.

Les résultats obtenus par RT-qPCR à haut rendement ou TLDA indiquent clairement la

p se e d’e p essio da s les C“Cs W B + de toutes des connexines cardiaques (connexine

43, 40, 45 et 30.2) avec une prédominance de la connexine 43 (figure R-7 A). En outre, la

protéine type connexine 43 a été détectée par immunocytochimie dans les CSCs W8B2+ (figure

R-7 B).

Figure R-7 : (A) P ofil d’e p essio g i ue des o e i es cdans les CSCs W8B2+ déterminé par

RT- PCR. = . Le P ofil d’e p essio des g es est ep se t e -ΔCt par rapport au gène de

référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur

moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir

desquels sont issues les CSCs W8B2+. (B) P ofil d’e p essio p ot i ue de la o e i e e ouge)

dans les CSCs W8B2+ déterminé par immunocytochimie. (n = 3). Les noyaux sont représentés en

leu a e le a uage TOPRO. Ba e d’ helle = µ .

Cx43

Cx40

Cx45

Cx30.2

0

2000

4000

6000

2- Ct v

s R

PL1

3A (x

104 )

B

A

Résultats

119

1.4 P ofil d’e p essio g i ue des peptides at iu ti ues

Les peptides natriurétiques (NP) sont des hormones qui jouent un rôle dans

l’ho ostasie a dio as ulai e e gula t la at iu se, la diu se et aussi la asodilatio . Ils

sont considérés comme des marqueurs de différenciation cardiaques.

Les sultats o te us TLDA fo t esso ti u e a se e d’e p essio du t a s it

codant pour les NP de type A (ANP) et une faible expression du neuropeptide de type B (BNP)

(figure R-8). Ce sultat o fi e le peu d’e gage e t des ellules dans le processus de

différenciation myocytaire.

2 P ofil d’e p essio g i ue des a au io i ues da s les CSCs W B +

Les canaux ioniques sont exprimés dans différents types cellulaires et sont importants

da s le ai tie de l’ho ostasie ph siologi ue. Cepe da t, l’e p essio et le ôle des

canaux ioniques dans les cellules souches cardiaques restent très peu étudiés. Nous nous

sommes donc focalisés sur la caractérisation de ces canaux dans les CSCs W8B2+ en étudiant

leu s p ofils d’e p essio g i ues par RT-qPCR à haut rendement ou TLDA.

Les résultats obtenus sont présentés par classes : canaux sodiques, canaux potassiques,

canaux calciques et canaux HCN

Figure R-8 : P ofil d’e p essio g i ue des peptides at iu ti ues de t pe A et de t pe B da s les CSCs W8B2+ déterminé par RT- PCR. = . Le P ofil d’e p essio des g es est représenté en 2-

ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque

barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le

nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

ANPBNP

0

10

20

30

40

50

2- Ct v

s R

PL1

3A (x

104 )

Résultats

120

2.1 P ofil d’e p ession génique des canaux sodiques dans les CSCs W8B2+

Les canaux sodiques jouent un rôle fondamental dans la génération et la propagation

du pote tiel d’a tio des ellules dites « excitables » comme par exemple les neurones et les

muscles. Un canal sodique de type NaV d pe da t du pote tiel est o stitu d’u o ple e

multimérique incluant au moins une sous-unité alpha et une ou plusieurs petites sous-unités

ta β , β , β et β . Les sous-unités alpha seules sont nécessaires et suffisantes pour

former un canal fonctionnel. Le rôle des sous-unités bêta est de moduler, entre autres,

l’a ti it du a al et so a age à la e a e.

La famille des NaV est composée de 10 isoformes qui présentent une distribution

tissulaire différente. Par exemple, on retrouve dans le système nerveux périphérique les

isoformes NaV1.3, NaV1.7, NaV1.8 et NaV . . Da s le œu l’isofo e NaV1.5 est prédominante

(Moreau et al., 2017).

Dans les CSCs W8B2+ les résultats obtenus (figure R-9) montrent que les sous-unités

alpha des isoformes NaV1.8 NaV1.3, NaV1.4, NaV1.5, NaV1.7 et NaV2.1 sont absentes. Seule une

faible expression du NaV1.3 est détectée. Concernant les sous-unités bêta régulatrices, les

CSCs W8B2+ ’expriment uniquement que la sous-u it β NaVb1).

Figure R-9 : P ofil d’e p essio g i ue des a au sodi ues oltage-dépendant dans les CSCs

W8B2+ déterminé par RT- PCR. = . Le P ofil d’e p essio des g es est ep se t e -ΔCt par

rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre

représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre

de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

Navb1

Navb2

Navb3

Navb4

Nav1.3

Nav1.4

Nav1.5

Nav1.7

Nav1.8

Nav2.1

0

100

200

300

400

2- Ct v

s R

PL1

3A (x

104 )

Résultats

121

2.2 P ofil d’e p essio g i ue des a au potassi ues da s les CSCs W B +

Les canaux potassiques participent à de nombreuses fonctions biologiques et sont

notamment responsables du maintien du potentiel membranaire, de la transmission de

l'influx nerveux et de la rythmogenèse.

Les canaux potassiques sont très variés et peuvent être regroupés en 4 grandes familles :

-Les canaux potassiques dépendant du potentiel (Kv), 6 segments transmembranaires (STM)

et d’u e ou le P fo a t le filtre de sélectivité du canal :

Cette famille regroupe la sous-famille : des KV1.x appelée « shaker », des KV2.x appelée

«shab », des KV3.x appelée «shaw », des KV4.x appelée «shal », des KV7.x appelée «KQT » et

la sous-famille des KV10.x KV11.x et KV12.x appelée « eag » (Luneau et al., 1991; Perney and

Kaczmarek, 1991; Stühmer et al., 1989).

Les résultats obtenus par RT-qPCR à haut rendement ou TLDA montrent que les CSCs

W8B2+ expriment fortement le KV3.4 et faiblement le KV4.2, des canaux potassiques

cardiaques impliqués dans le courant transitoire sortant repolarisant Ito (Han et al., 2002;

Nerbonne, 2016) (figure R-10). Concernant les canaux KV1.2, KV1.4, KV1.5, KV1.7, KV2.1, KV4.3,

KV7.1 (KVLQT1) et KV . hERG , au u e e p essio sig ifi ati e ’est d te t e.

De plus, les résultats des RT-PCR (figure R-11) confirment et montrent que les CSCs

W8B2+ ’e p i e t pas le t a s it KV4.3 et modérément le KV4.2.

E effet, l’isofo e KV4.2 (220 pb) est exprimée à la fois dans les CSCs W8B2+ et dans

le tissu atrial humain utilisé comme contrôle positif.

Qua t à l’isofo e KV4.3, nous obtenons une bande de 310 pb seulement dans le tissu

atrial humain (contrôle positif).

Résultats

122

Figure R-10 : P ofil d’e p essio g i ue des sous-unités alpha des canaux potassiques voltage-

dépendant dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT- PCR. = . Le P ofil d’e p essio des g es est représenté en 2-ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou

cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne).

n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

Kv1.2

Kv1.4

Kv1.5

Kv1.7

Kv2.1

Kv3.4

Kv4.2

Kv4.3

hERG

KvLQT1

0

10

20

30

40

2- Ct v

s R

PL1

3A (x

104 )

Figure R-11 : Ca a t isatio de l’e p essio des ARN oda t pou K . (à gauche) et Kv4.3 (à

droite) dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR. Les ADNc issus du tissu atrial cardiaque humain sont

utilis s o e o t ôle positif et l’eau o e o t ôle gatif.

Résultats

123

Sous-unités régulatrices des canaux potassiques :

Il existe aussi des sous-u it s ta au iliai es ou gulat i es ui peu e t s’asso ie et

gule l’a ti it des a au potassi ues. C’est le as des sous-unités auxiliaires (KVb2, KVb3,

Mi K ui s’asso ie t a e les sous-unités alpha des KV fonctionnels et les sous-unités

régulatrices (MiRP1, MiRP2, MiRP3, KCNE et KChIP ui s’asso ie t a e les KV et modulent

leurs activités (Gulbis et al., 1999; Kukreja, 2017).

Les résultats obtenus (figure R-12) sur les CSCs W8B2+ mo t e t u’il a u e e p essio

importante de KVb2, KVb3, KCNE5, MiRP2 et MiRP3 et une expression très faible de MinK,

MiRP1 et KChIP2.

- La famille des canaux potassiques activés par le calcium (KCa) à 6 STM et 1 segment P :

Cette famille regroupe la sous-famille des KCa à large conductance (BKCa ou KCa1.1), la

sous-famille des KCa à conductance intermédiaire (IKCa ou KCa3.1) et la sous-famille des KCa à

petite conductance (SKCa avec les sous-types KCa2.1, KCa2.2 et KCa2.3). Ces canaux sont

sensibles aux variations de calcium intracellulaires (Miller, 2000; Yuan et al., 2010). Ils

repolarisent ou h pe pola ise t la e a e lo s d’aug e tatio s asales ou os illatoi es de

l’a ti it al i ue i t a ellulai e.

Figure R-12 : P ofil d’e p essio g i ue des sous-unités bêta des canaux potassiques voltage-

dépendant dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT- PCR. = . Le P ofil d’e p essio des g es est représenté en 2-ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou

cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne).

n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

Kvb2

Kvb3

MinK

KCNE5

MIRP1

MIRP2

MIRP3

KChIP2

0

10

20

30

40

50

2- Ct v

s R

PL1

3A (x

104 )

Résultats

124

Les résultats obtenus par RT-PCR montrent que les CSCs W8B2+ expriment le transcrit

de type BKCa (bande de 333 pb) (figure R-13 A) et le transcrit IKCa (bande de 304 pb) (figure R-

13 B) comparées au contrôle positif (tissu atrial humain). Aucune expression significative du

transcrit KCa2.1 codant pour SKCa ’est o se e comparé au tissu atrial humain (bande de 498

pb).

- La famille des canaux potassiques de fonds à 4 STM et 2 segments P :

Cette famille regroupe les sous-familles TWIK, TREK, TASK, TALK, THIK et TRESK. Ces

canaux influencent le potentiel de la membrane de repos et, par conséquent, peuvent

contrôler l'excitabilité des cellules. Ils sont également régulés par les dérivés de l'oxygène

moléculaire, le GABA, la noradrénaline et la sérotonine (Enyedi and Czirják, 2010; Lotshaw,

2007).

Les résultats obtenus ici montrent que seul le canal TWIK1 est exprimé. Les transcrits

codant pour TASK1 et TASK2 dans les CSCs W8B2+ (figure R-14) sont non détectables.

B A

Figure R-13: Ca a t isatio de l’e p essio des ARN oda t pou KCNMA1 ou KCa1.1 (A) et

KCa3.1 et KCa2.1 (B) dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR. GAPDH est utilisé comme gène de référence.

Les ADNc issus du tissu atrial cardiaque humain sont utilisés comme contrôle positif et l’eau o e contrôle négatif.

Résultats

125

Il est à ote i i ue le a al potassi ue TWIK est t s p se t da s l’at iu et joue u ôle

non négligeable dans la régulation du rythme et la morphologie du tissu atrial (Christensen et

al., 2016).

- Les canaux potassiques à rectification entrante (Kir) à 2 STM et 1 segment P :

Cette famille regroupe la sous-famille des Kir ou IK (Kir2.x), des Kir couplés à une

protéine Go ou KG (Kir3.x) et des Kir ATP-sensibles ou KATP (Kir6.x). Les KATP sont régulés par les

deux sous-unités régulatrices SUR1 et SUR2. Ces canaux sont fondamentaux car ils contrôlent

le pote tiel de e a e et/ou de epos, o ditio e t l’e ita ilit et assu e t d’aut es

rôles physiologiques (Hibino et al., 2010).

La figure R-15A montre que les transcrits codant pour IK1 (Kir2.1) et pour le KATP Kir6.1 sont

exprimés significativement dans les CSCs W8B2+. Une légère expression du récepteur aux

sulfonylurés SUR2 est observable. Les résultats de la RT-PCR figure R-15B confirment la

présence du transcrit codant pour Kir2.1.

En revanche, on note une absence de l’e p essio des t a s its oda t pou le KATP

(Kir6.2), les KG (Kir3.1 et Kir3.4), le IK (Kir2.3) ainsi que de la sous-unité régulatrice SUR1 (figure

R-15A).

Figure R-14 : P ofil d’e p essio g i ue des a au potassi ues TWIK et TA“K da s les C“Cs W B +

déterminé par RT- PCR. = . Le P ofil d’e p essio des g es est ep se t e -ΔCt par rapport



à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

TWIK

1

TASK1

TASK20

20

40

602- C

t vs

RP

L13A

(x10

4 )

Résultats

126

Figure R-15 : (A) P ofil d’e p essio g i ue des sous-unités régulatrices et des canaux potassiques

rectifiants entrants dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT- PCR. = . Le P ofil d’e p essio des gènes est représenté en 2-ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold

ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la

moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+. (B)

Ca a t isatio de l’e p essio des ARN odant pour le Kir2.1 dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR.

Les ADN issus du tissu at ial a dia ue hu ai so t utilis s o e o t ôle positif et l’eau o e contrôle négatif. (C) Traces des courants enregistrées en condition contrôle en patch-clamp, en

configuration cellule entière au ou s d’u e a pe de , s de -110 mV à -70 mV. (D) Traces de

courants enregistrées en patch- la p e o figu atio ellule e ti e au ou s d’u e a pe de s

de -100 mV à +100 mV en présence ou en absence de 500 µM de Baryum extracellulaire.

SUR1

SUR2

Kir6.2

Kir2.1

Kir3.1

Kir2.3

Kir3.4

Kir6.1

0

10

20

30

2- Ct v

s R

PL1

3A (x

104 )

B A

100 pA

250 ms

-100 -50 50 100 150

-1000

-500

500

1000

500 µM BaCl 2

I (p

A)

V (mV)

C D

Résultats

127

Les résultats du patch-clamp en configuration cellules entière, montrent la présence

d’u ou a t sortant portant des oscillations sous forme de « bruit » et une réctification

entrante pour le potentiel négatif (Figure R-15C). La rectification entrante est bloquée par

l’ajout de µM de a u (Figure R-15D). Les signatures des courant obtenues

correspondent aux canaux de type BKCa (en dépolarisation) et Kir (en hyperpolarisation). Il est

i po ta t de ote l’a se e de ou ants dits dynamiques sodiques ou calciques.

2.3 P ofil d’e p essio g i ue des a au HCN da s les CSCs W B +

Les canaux contrôlés par les nucléotides cycliques et activés par l'hyperpolarisation ou

HCN (Hyperpolarisation-activated Cyclic Nucleotides-gated cation channels) sont des canaux

cationiques non sélectifs activés par hyperpolarisation intégrant un site de fixation pour les

nucléotides cycliques. Les canaux HCN sont entre autres présents dans le cerveau (courant Ih)

et le œu ou a t If). Les canaux HCN so t à l’o igi e du ou a t pa e ake et la ge se et

la gulatio de l’auto th i it odale a dia ue (Biel et al., 2002).

Quatre sous-types de canaux HCN sont connus ; HCN1, HCN2, HCN3 et HCN4. Ces

iodofo es so t plutôt e p i s da s les tissus dou s d’a ti it th i ues. Les HCN est

ubiquitaire, le HCN1 est neuronal et la HCN4 est très exprimé dans les tissus nodaux et

conducteurs cardiaques (Stieber et al., 2003).

Les résultats obtenus montrent que les CSCs W8B2+ expriment exclusivement les

transcrits codant pour les canaux HCN2 et HCN3 avec une expression plus forte du transcrit

HCN2 (figure R-16).

Figure R-16 : P ofil d’e p essio g i ue des a au HCN da s les C“Cs W B + déterminé par RT-

PCR. = . Le P ofil d’e p essio des g es est ep se t e -ΔCt par rapport au gène de



desquels sont issues les CSCs W8B2+.

HCN1 HCN2 HCN3 HCN40

50

100

150

200

250

2- Ct v

s R

PL1

3A (x

104 )

Résultats

128

2.4 P ofil d’e p essio g i ue des a au al i ues da s les CSCs W B +

Les canaux calciques sont impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires allant du

couplage excitation- o t a tio us ulai e à la li atio d’ho o es ou de

neurotransmetteurs.

On décrit deux types de canaux calciques ; les canaux calciques récepteurs

dépendants do t l’ou e tu e est o te ue pa l'a tio des diateu s hi i ues et/ou les

canaux calciques potentiel-dépendants qui s'ouvrent grâce aux variations de voltage.

Les canaux calciques potentiel-dépendants (CaV so t o stitu s d’u e sous-unité

canalaire alpha (qui apporte la diversité fonctionnelle) associée aux sous-unités régulatrices

bêta et alpha 2-delta.

Les CaV sont eux-mêmes classés en plusieurs types (Catterall, 2011) ;

-Les CaV de type L (CaV 1.x) : exprimés dans les muscles (lisse, squelettique et cardiaque), les

neurones, les cellules endocrines et la rétine.

-Les CaV de type P/Q (CaV 2.1) : e p i s da s les eu o es et les ellules β pa ati ues.

-Les CaV de type N (CaV 2.2) : exprimés dans les neurones.

-Les CaV de type R (CaV 2.3) : exprimés dans les neurones et les cellules endocrines.

-Les CaV de type T (CaV 3.x) : exprimés dans les muscles (lisse et cardiaque), les neurones et

les cellules endocrines.

Dans notre étude, nous avons ciblé les CaV a dia ues à as et haut seuil d’a ti atio

(CaV 1.2, CaV 1.3, CaV 3.1 et CaV 3.2) et à leurs sous-u it s gulat i es α , α et β .

Les résultats figure R-17 montrent que les CSCs W8B2+ ’e p i e t au u t a s it

codant pour les CaV cardiaques et les sous-u it s gulat i es α et β . La sous-unité

gulat i e α ua t à elle, p se te u e e p essio t s fo te du t a s it. Ces sultats

sugg e t u’au u e pe a ilit fo tio elle al i ue d pe da te du oltage ’est

présente dans les progéniteurs cardiaques.

Résultats

129

2.5 P ofil d’e p essio g i ue des t a spo teu s io i ues da s les CSCs W B +

Le transport ionique actif à travers la membrane plasmique via les échangeurs et les

po pes essite de l’ e gie pa le g adie t le t o hi i ue et/ou l’ATP pou assu e les

changements de configurations profonds de ces acteurs. Il est essentiel pour le maintien de

l'homéostasie ionique, particulièrement calcique.

Dans les cellules excitables comme les cardiomyocytes, les échangeurs et les pompes

joue t u ôle esse tiel da s les p o essus d’e itatio et de o t a tio .

Dans les cellules non excitables, ils assurent notamment les processus sécrétoires.

Nous nous so es do i t ess s au p ofil d’e p essio g i ue des C“Cs W B +

o e a t l’e p essio de la po pe sodiu -potassium (Na+/K+ ATPase), de la pompe à

calcium (Ca2+-ATPase) du réticulum sarcoplasmique et endoplasmique (SERCA), la pompe à

calcium (Ca2+-ATPase de la e a e plas i ue PMCA et l’ ha geu Na+/Ca2+ (NCX1).

Figure R-17 : P ofil d’e p essio g i ue des canaux calciques dans les CSCs W8B2+ déterminé par

RT- PCR. = . Le P ofil d’e p essio des g es est ep se t e -ΔCt par rapport au gène de




Cav1.2

Cav1.3

Cav3.1

Cav3.2

Cava2

d1

Cava2

d2

Cavb2

0

500

1000

1500

2- Ct v

s R

PL1

3A (x

104 )

Résultats

130

Les résultats illustrés en figure R-18, montrent une forte expression des transcrits codant pour

la SERCA2, la SERCA3 et la Ca-ATPase4 (PMCA) et une expression significative, mais moins

intense du NCX1. Concernant la pompe Na+/K+ ATPase, les CSCs W8B2+ ne montrent aucune

expression du transcrit codant pour Na+/K+ ATPase a3 mais elles expriment fortement la sous-

unité bêta 1 Na+/K+ ATPase b1.

3 P ofil d’e p essio g i ue des a teu s de l’ho ostasie al i ue da s les CSCs W B +

Le calcium est un second messager important au sein des cellules, car il intervient dans

différentes voies de signalisation et divers processus biologiques. De ce fait, les concentrations

calciques entre le cytoplasme et le milieu extracellulaire sont hautement régulées. Les

variations de concentration calcique permettent de contrôler différents phénomènes

cellulaires comme la prolifération, la différenciation, la sécrétion ou encore la contraction

(Marty, 1989). Da s le us le a dia ue, l’ho ostasie al i ue i t a ellulai e est di e

notamment via les epteu s al i ues a ti s pa l’i ositol t iphosphate ITPR , les

récepteurs calciques activés par la ryanodine (RYR), les CaV de type T, les CaV de type L et

Figure R-18 : P ofil d’e p essio g i ue des ha geu s Na+/K+, “ERCA, PMCA et NCX da s les CSCs W8B2+ déterminé par RT- PCR. = . Le P ofil d’e p essio des g es est ep se t e -

ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque



Na/K-A

TPase a

3

Na/K-A

TPase b

1

SERCA2

SERCA3

Ca ATPas

e4NCX1

0

50

100

1000

2000

3000

4000

2- Ct v

s R

PL1

3A (x

104 )

Résultats

131

l’ ha geu NCX. I e se e t, le al iu est e t ud du toplas e via la SERCA, la pompe

PMCA et l’ ha geu NCX.

Dans cette régulation calcique sont intégrées également certaines calciproteines

intracellulaires comme la calmoduline (CALM), la calséquestrine (CASQ), le phospholamban

(PLN) ou encore la calcineurine A (CAM-PRP).

Les résultats obtenus (figure R-19) sur les CSCs W8B2+ montrent une expression très forte du

transcrit codant pour la CALM3 et forte des transcrits codant pour CALM1, CAM-PRP, ITPR1 et

ITPR3. Cependant, il y a une faible expression du PLN et aucune expression des transcrits

codant pour CASQ2 et RYR2.

III-Caractérisation fonctionnelle des CSCs W8B2+

1 Différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+

La capacité des cellules souches cardiaques humaines à se différencier in vitro en

plusieurs lignages cellulaires a été démontrée (Guan and Hasenfuss, 2013). Dans notre étude

fonctionnelle, nous nous sommes concentrés sur la différenciation de notre modèle de CSCs

Figure R-19 : P ofil d’e p essio g i ue des a teu s i pli u s da s l’ho ostasie al i ue da s les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le Profil d’e p essio des g es est ep se t e 2-ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque



CALM1

CALM3

CASQ2PLN

CAM-PRP

RYR2

ITPR1

ITPR3

0

200

400

600

800

1000

10000000

20000000

30000000

2- Ct v

s R

PL1

3A (x

104 )

Résultats

132

W8B2+ e lig age a dio o tai e. L’ tude des a is es i pli u s da s ette

diff e iatio e a dio o tes est fo da e tale a elle pe et d’o ie te et d’i agi e

des solutio s th apeuti ues de de i e g at i e. Le ut ulti e est d’obtenir des

ellules p og it i es ui u e fois g eff es, se aie t apa les de pa e le œu pa

e pla e e t ou e fo e e t des a dio o tes da s les as d’i suffisa e a dia ue

grave.

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches cardiaques après différenciation in vitro

décrits à ce jour, présentent des caractéristiques fonctionnelles et structurelles plutôt

immatures par rapport aux cardiomyocytes adultes natifs. Ainsi, un défi futur sera de

développer des stratégies pour atteindre un degré plus élevé de maturation des

cardiomyocytes in vitro.

Dans cette partie, nous avons suivi le processus de différenciation cardiaque in vitro des

CSCs W8B2+ e a al sa t l’e p essio g i ue des a ueu s a dia ues ou a e t utilis s

dans la littérature (structures contractiles, facteurs de transcription cardiaque, connexines

et … ais aussi le p ofil g i ue des a au io i ues et des a teu s de l’ho ostasie calcique

a au sodi ues, potassi ues, al i ues, po pes, ha geu s et … .

1.1 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio génique des marqueurs cardiaques

1.1.1 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio génique des facteurs de transcription cardiaques

Les facteurs de transcriptions cardiaques sont primordiaux pour le développement et

la morphogenèse cardiaque et sont utilisés pour caractériser les différents types de cellules

souches ca dia ues. Il est do i po ta t d’a al se l’ olutio de es fa teu s ap s

différenciation.

Les résultats montrent que les transcrits codant pour GATA5 et GATA6 sont fortement

augmentés (+ 55,3 fois pour GATA5 et + 14 ,4 fois pour GATA6) (figure R-20A). L’e p essio

de GATA3 et TBX5 est légèrement induite (+ 2,6 fois pour GATA3 et + 2,9 fois pour TBX5) et

au u e a iatio de l’e p essio g i ue des fa teu s de t a s iptio GATA , HEY , IRX ,

IRX , TBX et NKX . ’est o se e. Co e a t les deu fa teurs de transcription IRX3 et

TBX3, une légère répression de leurs transcrits est observée (- 3,8 fois pour IRX3 et -2,5 fois

Résultats

133

pou TBX . Au i eau p ot i ue, les sultats de l’i u o to hi ie o t e t ue les C“Cs

W8B2+ diff e i es e p i e t le fa teu de t a s iptio GATA à l’i e se de MEF C et

NKX2.5 (figure R-20B).

GA

TA

3

GA

TA

4

GA

TA

5

GA

TA

6

HE

Y2

IRX

3

IRX

4

IRX

5

TB

X2

TB

X3

TB

X5

NK

X2-

5

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Var

iatio

n d'

expr

essi

on (l

og2)

VS

Non

Diff

Figure R-20 : (A) Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des facteurs de transcription cardiaques déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations

d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées.

Entre 1 et - , l’e p essio des g es e a ie pas e i o espo d à des a iatio s de + fois et - 2

fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M

(erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs

W8B2+ ont été différenciées. (B) P ofil d’e p ession protéique de GATA4, MEF2C et NKX 2.5 (rouge)

après 28 jours de différenciation des CSCs W8B2+ déterminé par immunocytochimie. (n = 3). Les

o au so t ep se t s e leu a e le a uage TOPRO. Ba e d’ helle = µ .

B

A

Résultats

134

1.1.2 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio génique des structures contractiles cardiaques

La mise en place des structures contractiles cardiaques après les protocoles de

différenciation cardiaque in vitro est souvent observée pour confirmer la présence ou non

d’u ph ot pe a dia ue ap s diff e iatio des ellules sou hes a dia ues.

Nous nous sommes donc intéressés aux marqueurs de différenciation cardiaque

o e la t opo i e, la osi e, l’a k i e ou e o e les peptides natriurétiques.

Les résultats obtenus par RT-qPCR à haut rendement ou TLDA (figure R-21A), montrent

ue l’e p essio des t a s its oda t pou l’ANKB et MYL est fo te e t i duite au ou s de

la différenciation cardiaque (induction de + 137 fois pour ANKB et + 13 fois pour MYL7). A

moindre intensité il en est de même pour les transcrits TNNT2 et e GPD1L (induction de + 3,3

fois pour la TNNT2 et + 2,9 fois pour GPD1L).

Au u e odifi atio de l’e p essio de CLA“P et de MYL ’est isi le ; en effet, entre + 2

fois et – 2 fois par rapport aux CSCs W8B2+ o diff e i es. E e a he, l’e p essio des

transcrits codant pour la TNNI3, MYH6, MYH7 et RRAD est réprimé au cours de la

différenciation (répression de – 5,2 fois pour la TNNI3, - 4,7 fois pour MYH6, - 3.1 fois pour

MYH7 et - 3,2 fois pour RRAD).

Les i u o a uages i di ue t aussi u’il ’ a pas de st u tu es o t a tiles

matures (absence de striations typiques des a dio o te o e l’i di ue le marquage de

TNNT2, a-actinine et b-MHC (figure R-21B).

Résultats

135

AN

KB

TN

NI3

TN

NT

2

MY

H6

MY

H7

RR

AD

CLA

SP

2

GP

D1L

MY

L7

MY

L2-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8V

aria

tion

d'ex

pres

sion

(log

2) V

S N

on D

iff

Figure R-21 : (A) Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des structures contractiles cardiaques déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations


Entre 1 et - , l’e p ession des gènes ne varie pas (ceci correspond à des variations de + 2 fois et - 2



W8B2+ ont été différenciées. (B) P ofil d’e p essio p ot i ue de TNNT , a-actinine et b-MHC après

28 jours de différenciation des CSCs W8B2+ déterminé par immunocytochimie. (n = 3). Les noyaux

sont représentés en bleu avec le marquage TOPRO. Ba e d’ helle = µ .

A

B

Résultats

136

En ce qui concerne les peptides natriurétiques, les résultats montrent une très forte

indu tio + fois de BNP alo s ue l’e p essio de ANP este i a ia le (figure R-22).

1.1.3 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio génique des connexines cardiaques

Co e ous l’a o s e tio plus a a t les cardiomyocytes sont connectés les uns

aux autres par des jonctions communicantes au niveau des disques intercalaires. Ces jonctions

sont assurées par les quatre connexines cardiaques Cx43, Cx40, Cx45 et Cx30.2.

Les connexines cardiaques ont un rôle très important dans la médiation électrique et

l’ ha ge de ta olites entre les cardiomyocytes pour coordonner les contractions des

quatre chambres cardiaques (Jansen et al., 2010). L’o je tif est de ifie l’ olutio de

l’e p essio de es o e i es du a t le p o essus de diff e iatio des C“Cs W B +.

Figure R-22 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des peptides natriurétiques de type A et de type B déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre

les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non

différenciées. Entre 1 et - , l’e p essio des g es e a ie pas e i o espo d à des a iatio s de + 2 fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur


desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées.

AN

P

BN

P-2-10123456789

101112131415

Var

iatio

n d'

expr

essi

on (

log2

) V

S N

on D

iff

Résultats

137

Les résultats (figure R-23) montre t au u e a iatio d’e p essio des t a s its oda t pou

les Cx43, Cx40, Cx45 et Cx30.2 au cours de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+.

1.2 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio génique des canaux ioniques

1.2.1 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio génique des canaux sodiques

Da s le œu , o et ou e ajo itai e e t l’isofo e NaV1.5 responsable de la phase

as e da te du pote tiel d’a tio a dia ue, ais gale e t les isoformes Nav1.1, Nav1.2,

NaV1.3, NaV1.4, NaV1.6 et NaV2.1 (Gaborit et al., 2007; Mishra et al., 2015; Zimmer et al., 2014).

Il tait do i po ta t d’ alue l’e p essio des a au sodi ues et de d te i e les

isoformes impliqués lors de la différenciation des CSCs W8B2+. Les résultats montrent (figure

R-24) u e fo te i du tio de l’e pression des transcrits codant pour NaV1.4 (+ 14,3 fois),

NaV1.5 (+ 14,5 fois), NaV1.7 (+ 8,9 fois) et NaV2.1 (+ 474,4 fois) ainsi que pour les sous-unités

NaVb2 (+ 12 fois) et NaVb3 (+ 24,7 fois).

Cx4

3

Cx4

0

Cx4

5

Cx3

0.2-2

-1

0

1

2V

aria

tion

d'ex

pres

sion

(lo

g2)

VS

Non

Diff

Figure R-23 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des connexines déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes

(en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et - , l’e p essio des gènes ne varie pas (ceci correspond à des variations de + 2 fois et - 2 fois par rapport aux cellules

non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la

moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été

différenciées.

Résultats

138

Cepe da t, l’e p essio du t a s it NaV1.3 diminue fortement (- 13 fois) au cours de la

diff e iatio . Au u e a iatio d’e p essio ’est isi le pou le NaV1.8 et les sous-unités

NaVb1 et NaVb4.

1.2.2 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio génique des canaux potassiques

Les canaux de potassium représentent la classe la plus complexe de canaux ioniques

du point de vue fonction el et st u tu el. Da s le œu , les a au potassi ues so t

essai es pou la phase de epola isatio du pote tiel d’a tio et la estau atio du

pote tiel du epos e a ai e. Le p ofil des a iatio s d’e p essio g i ue des a au

potassiques durant la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ est illustré dans les figures

de R-25 à R-28.

Figure R-24 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des canaux sodiques voltage-dépendant déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations


Entre 1 et -1, l’e p essio des g es e a ie pas e i o espo d à des a iatio s de + fois et - 2



W8B2+ ont été différenciées.

Nav

b1

Nav

b2

Nav

b3

Nav

b4

Nav

1.3

Nav

1.4

Nav

1.5

Nav

1.7

Nav

1.8

Nav

2.1-5

-4-3-2-10123456789

10

Var

iatio

n d'

expr

essi

on (

log2

) V

S N

on D

iff

Résultats

139

Les résultats indiquent ue da s l’e se le, il a u e i du tio sig ifi ati e de

l’e p essio des t a s its oda t pou les a au potassi ues d pe da ts du pote tiel KV),

les canaux potassiques à rectification entrante (Kir), les canaux potassiques de fonds TASK et

les sous-unités régulatrices.

Plus précisément il y a une augmentation très importante de KV1.2 (+ 36,2 fois), KV1.4

(+ 19,1 fois), KV1.5 (+ 10,1 fois), KV2.1 (+ 28,8 fois), KV4.2 (+ 9,3 fois) et KV4.3 (+ 23,4 fois) (figure

R25). N a oi s, au u e a iatio d’e p essio au ou s de la diff e iatio des t a s its

codant pour KV4.3, KV11.1 (hERG) et KV7.1 (KVLQT ’est o se a le.

Figure R-25 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des canaux potassiques voltage-dépendant déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les

variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non

différenciées. Entre 1 et - , l’e p ession des gènes ne varie pas (ceci correspond à des variations de

+ 2 fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur



Kv1

.2

Kv1

.4

Kv1

.5

Kv1

.7

Kv2

.1

Kv3

.4

Kv4

.2

Kv4

.3

hER

G

KvL

QT

1

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Var

iatio

n d'

expr

essi

on (l

og2)

VS

Non

Diff

Résultats

140

L’e p essio des sous-unités régulatrices des Kv change au cours de la différenciation

avec une induction forte du transcrit codant pour MIRP3 (+ 19,1 fois) et une induction

relativement faible des transcrits codant pour KVb2 (+ 2,7 fois), MinK (+ 3 fois), MIRP1 (+ 3,7

fois) (figure R-26). Les transcrits codant pour KVb3, KCNE5, MIRP2 et KChIP2 ne varient pas au

cours de la différenciation cardiaque.

Figure R-26 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des sous-unités bêta des canaux potassiques voltage-dépendant déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le

graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les

cellules non différenciées. Entre 1 et - , l’e p essio des g es e a ie pas e i o espo d à des variations de + 2 fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente


à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées.

Kvb

2

Kvb

3

Min

K

KC

NE

5

MIR

P1

MIR

P2

MIR

P3

KC

hIP

2-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

Var

iatio

n d'

expr

essi

on (l

og2)

VS

Non

Diff

Résultats

141

Une forte induction du transcrit codant pour TASK1 (+ 4067 fois) est observée au cours

de la diff e iatio alo s ue l’e p essio des t a s its oda t pou TA“K et TWIK ’est

pas modifiée (figure R-27).

Concernant les canaux potassiques à rectification entrante (Kir), nous observons une

induction des transcrits codant pour Kir6.2 (+ 18,7 fois), Kir3.1 (+ 14,4 fois) et Kir2.3 (+ 10,1

fois) et une répression du Kir2.1 (- 4,4 fois) au cours de la différenciation cardiaque des CSCs

W8B2+ (figure R-28). Pour les transcrits codant pour Kir3.4, Kir6.1 et les sous-unités

gulat i es “UR et “UR , ous ’o se o s au u e odifi atio .

TW

IK1

TA

SK

1

TA

SK

2

-5-4-3-2-10123456789

10111213

Var

iatio

n d'

expr

essi

on (

log2

) V

S N

on D

iff

Figure R-27 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des canaux potassiques TWIK et TASK déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations


Entre 1 et - , l’e p essio des g es e a ie pas e i o espo d à des a iatio s de + fois et - 2



W8B2+ ont été différenciées.

Résultats

142

1.2.3 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio génique des canaux HCN

Comme nous l’a o s p is da s le hapit e p de t les a au HCN à l’o igi e du

ou a t de pa e ake so t espo sa les da s les ellules odales de la ge se de l’a ti it

rythmique cardiaque.

Afin de vérifier si notre protocole de différenciation pouvait orienter les cellules vers un

ph ot pe odal les i eau d’e p essio des a au HCN o t t esti s (figure R-29).

SU

R1

SU

R2

Kir6

.2

Kir2

.1

Kir3

.1

Kir2

.3

Kir3

.4

Kir6

.1

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7V

aria

tion

d'ex

pres

sion

(log

2) V

S N

on D

iff

Figure R-28 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des sous-unités régulatrices et des canaux potassiques rectifiants entrants déterminé par RT-qPCR. (n

= 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées

versus les cellules non différenciées. Entre 1 et - , l’e p essio des g es e a ie pas e i correspond à des variations de + 2 fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque


nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées.

Résultats

143

Les résultats montrent une forte induction des canaux HCN1 (+ 22,9 fois) et HCN4 (+ 25,8

fois) qui apparait moins intense pour des canaux HCN2 (+ 3,5 fois) et HCN3 (+ 4,1 fois) au

cours de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+.

1.2.4 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio génique des canaux calciques

Da s le œu , les CaV de t pe L so t u des a teu s espo sa les du pote tiel d’a tio

cardiaque et ils sont responsables du phénomène de la libération du calcium induite par le

calcium (Calcium-Induced Calcium Release) qui permet la contraction du muscle cardiaque.

Les CaV de type T quant à eux, sont importants dans les événements de dépolarisation et

pa ti ipe t à l'a ti it th i ue du œud si o-auriculaire (SA).

Les sultats de l’a al se de l’e p essio des transcrits codant pour les CaV après

différenciation des CSCs W8B2+, montrent une forte induction des transcrits codant pour les

canaux CaV de type L : CaV1.2 (+ 897,6 fois) et CaV1.3 (+ 74,5 fois) et les CaV de type T : CaV3.2

(+ 149 fois) (figure R-30).

HC

N1

HC

N2

HC

N3

HC

N4

-2-1012345678

Var

iatio

n d'

expr

essi

on (

log2

) V

S N

on D

iff

Figure R-29 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des canaux HCN déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes

(en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et - , l’e p essio des gènes ne varie pas (ceci correspond à des variations de + 2 fois et - 2 fois par rapport aux cellules

non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la

moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été

différenciées.

Résultats

144

Concernant les sous-unités régulatrices, nous remarquons une variation de

l’e p essio de CaVb2 (+ 7,5 fois), une très légère induction de CaV3.1 (+ 2.5 fois) et aucun

ha ge e t d’e p essio pou CaVa d .

Un courant entrant a pu être mis en évidence lors des expérimentations de patch-clamp en

configuration cellule entière, sur la population W8B2+ après 28 jours de différenciation

cardiaque in vitro (Figure R-31).

Ce courant est d a i ue a e u e phase d’a ti atio relativement rapide (10 à 20 ms) suivie

d’u e phase d’i a ti atio lente (figure R-31a). Ce ou a t e t a t s’a ti e pou u pote tiel

proche de -50mV est atteint son pic à - V. Le pote tiel d’i e sio du ou a t est proche

de +80 (figure R-31b). Ce courant rapide est bloqué par 5 mM nickel NiCl2 (figure R-31c).

Il faut e tio e i i ue e ou a t e t a t p o ale e t al i ue ’a t e egist

ue deu fois su ellules diff e i es tudi es i di ua t p o a le e t l’e iste e da s

ot e od le ellulai e, d’u e sous populatio et/ou u stade du le ellulai e différent. Il

est difficile de conclure sur un type précis de courant calcique compte tenu des seuils

d’a ti atio , de la se si ilit au i kel et de la i ti ue. Il est epe da t p o a le u’il

s’agisse d’u ou a t de t pe L de t pe eu o al i a e un de type L cardiaque ou lisse.

Cav

1.2

Cav

1.3

Cav

3.1

Cav

3.2

Cav

a2d1

Cav

a2d2

Cav

b2-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Var

iatio

n d'

expr

essi

on (

log2

) V

S N

on D

iff

Figure R-30 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des canaux calciques déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et -1, l’e p essio des g es e a ie pas e i o espo d à des a iatio s de + fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées.

Résultats

145

1.2.5 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’e p essio génique des t a spo teu s io i ues et/ou des a teu s de l’ho ostasie calcique

Les résultats de la figure R-32, o t e u e fo te aug e tatio de l’e p essio des t a s its

codant pour la pompe sodium-potassium Na+/K+ ATPase a3 (+ 14,4 fois), la sous-unité Na+/K+

ATPase b1 (+ 4,9 fois), de la pompe à calcium (Ca2+-ATPase) du réticulum sarcoplasmique et

e doplas i ue “ERCA + , fois et “ERCA + , . L’ ha geu Na+/Ca2+ ou NCX1 a été

a plifi de , fois . Au u e a iatio d’e p essio pou la po pe à al iu (Ca2+-ATPase4)

de la e a e plas i ue ’est o se a le.

Figure R-31 : Courant dynamique enregistré sur les CSCs W8B2+ différenciées en configuration cellule-entière. (a) Traces du courant enregistré. (b) Courbe courant-potentiel du courant enregistré. (c) courant dynamique enregistré pour différents temps de rampes de potentiel en condition contrôle (à gauche) et en présence du chlorure de nickel (à droite).

Résultats

146

La figure R-33 o t e les a iatio s d’e p essio des epteu s IP (ITPR), à la

ryanodine (RYR) et celle des calciprotéines comme la calmoduline (CALM) et la calséquestrine

CA“Q , d’u gulateu des “ERCA le phophola a PLN et des p ot i es phosphatases

comme la CAM-PRP. Les résultats obtenus montrent que les transcrits codant pour la

calmoduline CALM3 sont hautement réprimés (- 40,5 fois) au cours de la différenciation. Nous

observons une légère induction des transcrits codant pour le PLN (+ 2,9 fois) et le ITPR1 (+ 3,4

fois et au u e a iatio de l’e p essio des transcrits codant pour CALM1, CASQ2, CAM-PRP,

RYR2 et TTPR3.

Figure R-32 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des échangeurs Na+/K+, SERCA, PMCA et NCX1 déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les

variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non




Na/

K-A

TP

ase

a3

Na/

K-A

TP

ase

b1

SE

RC

A2

SE

RC

A3

Ca

AT

Pas

e4

NC

X1

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

Var

iatio

n d'

expr

essi

on (l

og2)

VS

Non

Diff

Résultats

147

L’e se le des g es do t le i eau d’e p ession varie entre l’ tat sou he et l’ tat diff e i

des CSCs W8B2+ est résumé dans le tableau R-1.

Figure R-33 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’e p essio g i ue des a teu s i pli u s da s l’ho ostasie al i ue d te i pa RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre

les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non




CA

LM1

CA

LM3

CA

SQ

2

PLN

CA

M-P

RP

RY

R2

ITP

R1

ITP

R3

-9

-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3V

aria

tion

d'ex

pres

sion

(lo

g2)

VS

Non

Diff

Résultats

148

Tableau R-1 : Etat d’e p essio des p i ipau g es do t l’e p essio va ie ava t et ap s différenciation cardiaque des CSCs W8B2+.

Gène Expression dans les CSCs

W8B2+

Expression après différenciation des CSCs

W8B2+

GATA4 Forte Invariable

TBX3 Forte Invariable

GATA5 Absente Induite

GATA6 Présente Induite

ANKB Absente Induite

MYL7 Absente Induite

Connexine 43 Forte Invariable

NaVb1 Forte Invariable

NaVb2 Absente Induite

NaVb3 Absente Induite

NaV1.3 Présente Réprimée

NaV1.4 Absente Induite




KV3.4 Forte Invariable

KV4.2 Forte Induite

KV1.2 Absente Induite






MIRP1 Présence Induite

MIRP3 Forte Induite

Kir2.1 Forte Légèrement réprimée

Kir6.1 Forte Invariable

Kir6.2 Très faible Induite

Kir3.1 Absente Induite

Kir2.3 Absente Induite

TWIK1 Forte Invariable

TASK1 Absente Induite

HCN2 Forte Induite

HCN1 Absente Induite

HCN3 Très faible Induite

HCN4 Absente Induite

CaV2d1 Forte Invariable

CaVa2d2 Absente Induite

CaVb2 Absente Induite

Résultats

149

CaV1.2 Absente Induite



Pompe Na+/K+ b1 Forte Induite

Pompe Na+/K+ a3 Absente Induite

SERCA2 Forte Invariable

SERCA3 Forte Induite

Pompe calcique Forte Invariable

NXC1 Forte Induite

CALM1 Forte Invariable

CALM3 Forte Réprimée

Calcineurine

(CAM-PRP)

Forte Invariable

ITPR1 Forte Induite

ITPR3 Forte Invariable

BNP Forte Induite

KCa1.1 Présente Non étudiée

KCa3.1 présente Non étudiée

Da s le ut d’a lio e la diff e iatio e a dio o tes des C“Cs W B +, nous

avons opté pour une approche optogénétique par expression du canal rhodopsine 2 (CHR2)

dépolarisant capable de transporter du sodium et des protons activé par flash lumineux dans

le bleu.

Cette dépolarisation pourrait être un puissant déclencheur de la différenciation

cardiaque tel u’il a d jà t o t da s d’aut e t pe de ellules sou hes (Stroh et al., 2011).

Nos résultats préliminaires ont montré que cette stimulation par optogénétique au

cours de la différenciation des CSCs W8B2+, ’a lio e pa la diff e iatio a dia ue ie

au contraire comme le montre la figure R-34. En effet, le profil génique des CSCs W8B2+

différenciées avec stimulation optogénétique est très similaire à celui des CSCs W8B2+ non

différencié.

Résultats

150

Figure R-34 : Regroupement (clustering) hiérarchique des gènes (données normalisées en -ΔCt da s les C“Cs W B + (Non Diff), les CSCs W8B2+ après différenciation cardiaque (Diff), les CSCs W8B2+ après différenciation cardiaque et stimulation optogénétique du CHR2 (Diff CHR2).

Diff GFP représente les CSCs W8B2+ après différenciation cardiaque et stimulation optogénétique de la GFP, utilisée comme contrôle.

Résultats

151

2 Etude de l’a tivit al i ue au ou s de la diff e iatio a dia ue in vitro des CSCs

W8B2+

La bibliographie actuelle montre que très peu de travaux sont publiés sur le décryptage

de la sig atu e de l’a ti it et la sig alisatio al i ue da s les ellules sou hes a dia ues.

Seule une étude réalisée sur les CSCs c-kit+ a montré que ces progéniteurs cardiaques

pouvaient présenter des oscillations calciques spontanées qui semblaient jouer un rôle

essentiel dans la régulation de la croissance cellulaire (Ferreira-Martins et al., 2009).

Cepe da t, au u e a a t isatio de l’a ti it al i ue au ou s de la diff e iatio des

C“Cs ’a t appo t e. Not e o je tif est do de sui e l’a ti it al i ue des C“Cs W B +

au cours de leur différenciation cardiaque in vitro et d’appo te des léments de réponse qui

pou aie t ous aide à ieu o p e d e l’i pli atio du al iu da s le p o essus de

différenciation.

2.1 Sig atu e de l’a tivit spo ta e al i ue au ou s de la diff e iatio a dia ue in vitro des CSCs W8B2+

Pour étudier et suivre l’ olutio de l’a ti it al i ue spo ta e au ou s de la

différenciation in vitro des CSCs W8B2+, nous avons utilisé la sonde calcique GCaMP6s comme

senseur des changements de concentrations calciques intracellulaires. Via cette sonde, nous

pouvons sui e l’ olutio de l’a ti it al i ue tout au lo g du p oto ole de diff e iatio

cardiaque in vitro (4 semaines) des CSCs W8B2+.

L’e egist e e t de l’a ti it al i ue a t alis pa i os opie o fo ale à °C. Les

variations de fluorescence de cette dernière reflètent les variations de calcium intracellulaires.

Les enregistrements calciques bruts obtenus par microscopie confocale sont ensuite analysés

à l’aide d’u e a o appli u e sous I age J ui pe et de ua tifie les a iatio s de

fluorescence globales dans chaque cellule étudiée. Ces variations de fluorescence peuvent

être présentées sous forme de courbes en fonction du temps.

Les sultats o te us o t e t ue l’a ti it al i ue e egist e su les C“Cs W B + en

début de différenciation (2ème jour de différenciation) et à la fin du protocole de

différenciation (28ème jou se p se te sous fo e d’os illatio s al i ues (figure R-35).

Résultats

152

200 400 6000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Temps (s)

F/F0

(U.A

)

200 400 6000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Temps (s)

F/F0

(U.A

)

Figure R-35 : T pes d’a ti it s al i ues spo ta es e egist es au ème jour (A) et au 28ème jour

(B) de différenciation des CSCs W8B2+. Les graphes illustrent les variations de la [Ca2+]i représentées

pa le appo t ΔF/F . ΔF =F-F0 (F : fluorescence émise par la GCaMP à un temps donné, F0 :

fluorescence de base émise par la GCaMP). U.A : unité arbitraire. [Ca2+]i : concentration en calcium

intracellulaire.

A

B

Résultats

153

Les oscillations obtenues au 2ème jour de différenciation cardiaque sont irrégulières, plus

fréquentes, et présentent une amplitude nettement plus faible que les oscillations obtenues au 28ème

jour de différenciation.

2.2 Evolution des paramètres calciques au cours de la différenciation cardiaque in

vitro des CSCs W8B2+

Afi d’ tudie e tai s pa a t es de l’a ti it al i ue e egist e au ou s de la

différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+, dans chaque cellule, les variations de

globales fluorescence obtenues sous Image J ont été analysées grâce à une application

développée au laboratoire sous le langage IDL (Interactive Data Language). Cette application

permet de mesurer différents paramètres cinétiques des oscillations calciques obtenues

comme ; l’a plitude, la f ue e, la du e, l’ai e sous la ou e, le TTP ti e to peak , le TTR

ti e to e o e ou e o e le pou e tage du te ps d’a ti it oi at iels et thodes .

L’ olutio de es pa a t es est ep se t e pa se ai e pe da t uat e se ai es de

différenciation :

1ère semaine de différenciation : regroupant toutes les oscillations calciques obtenues entre

le 2ème et le 7ème jour post-différenciation.

2ème semaine de différenciation : regroupant toutes les oscillations calciques obtenues entre

le 8ème et le 14ème jour pos-différenciation.


le 15ème et le 21ème jour post-différenciation.


le 22ème et le 28ème jour de différenciation.

2.2.1 Evolution de la fréquence des oscillations calciques au cours de la

différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+

Les résultats représentés dans la figure R-36A, montrent que la fréquence des

oscillations calcique diminue progressivement au cours des 4 semaines de différenciation.

Résultats

154

Figure R-36 : Evolution de la fréquence (A) et de l’a plitude (B) de l’a ti ité calcique spontanée

au cours des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+. (N = 3). Sem : semaine, U.A :

unité arbitraire, ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont

été différenciées et n : nombre total des cellules analysées. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs.

se . L’a al se statisti ue est effe tu e pa u test A o a No pa a et i epeated Measu es One-Way ANOVA) suivi par un test de Newman-Keuls.

B

A

sem 1 sem 2 sem 3 sem 40.0

0.5

1.0

1.5

*

nsns

n = 65 n = 42 n = 36 n = 65

Temps de différenciation (semaine)

Am

plitu

de (U

.A)


0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

**

******

n = 65 n = 42 n = 36 n = 65


Fréq

uenc

e (p

ic/m

in)

Résultats

155

En effet, cette fréquence baisse significativement et diminue de 0,75 pic/min en

semaine 1 à 0,31 pic/min en semaine 4 de différenciation (soit une diminution de 58,7 %).

Cette diminution de la fréquence est également significative en comparant la semaine 1 avec

la semaine 2 (une baisse de 20%) et la semaine 1 avec la semaine 3 (une baisse de 50,6%).

2.2.2 Evolutio de l’a plitude des os illatio s al i ues au ou s de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+

L’a plitude a i ale de fluo es e e appo te des i di atio s su la ua tit de

calcium libéré. Les résultats représentés dans la figure R-36B, o t e t ue l’a plitude des

oscillations calciques augmente progressivement à chaque semaine de différenciation jus u’à

atteindre une significativité statistique à la semaine 4. Cette amplitude passe de 0,7 U.A en

semaine 1 à 1,2 U.A en semaine 4. Ceci représente une augmentation significative de

l’a plitude de 1,4%.

2.2.3 Evolution de la durée des oscillations calciques au cours de la différenciation

cardiaque in vitro des CSCs W8B2+

La figure R-37A montre que la durée des oscillations calciques augmente

progressivement au cours des quatre semaines de différenciation. Cette durée est de 36,8 s

en semaine 1 contre 88,7 s en semaine 4 soit une augmentation significative de 141%.

Cette augmentation est aussi significative entre la semaine 1 (36,8 s) et la semaine 3 (74,2 s)

soit 101,6% d’aug e tatio .

2.2.4 Evolutio de l’ai e des os illatio s al i ues au ou s de la diff e iation

cardiaque in vitro des CSCs W8B2+

L’ai e sous la ou e appo te des i di atio s su l’i po ta e des os illatio s al i ues

puis u’elle p e d e o pte à la fois l’a plitude du ph o e et sa du e. La figure R-37B

o t e ue l’ai e sous la ou e augmente progressivement au cours des quatre semaines de

diff e iatio . L’ai e aug e te sig ifi ati e e t de , U.A.s e se ai e à , U.A.s e

semaine 4 (soit une augmentation de 210,9%).

Résultats

156

Figure R-37 : Evolution de la durée (A) et de l’ai e (B) de l’a ti it al i ue spo ta e au ou s des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+. (N = 3). Sem : semaine, U.A : unité

arbitraire, ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été

différenciées et n : nombre total des cellules analysées. **p< . , ***p< . s. se . L’a al se statistique est effectuée par un test Anova (Nonparametric repeated Measures One-Way ANOVA)

suivi par un test de Newman-Keuls.

A

B

sem 1 sem 2 sem 3 sem 40

20

40

60

80

100***

**

ns

n = 65 n = 42 n = 36 n = 65


Dur

ée (s

)


20

40

60

80

**

ns

ns

n = 65 n = 42 n = 36 n = 65


Aire

(U.A

)

Résultats

157

2.2.5 Evolution du TTP (time to peak) des oscillations calciques au cours de la


Le TTP est le temps mis pour atteindre le pic ou le maximum de fluorescence « F ». Le

TTP apporte des indications sur le temps des libérations calciques intracellulaire.

La figure R-38A montre que le TTP augmente progressivement au cours des quatre

semaines de différenciation cardiaque et il passe de 9,8 s en semaine 1 à 26 s en semaine 4

(soit une augmentation significative de 165,3%). Cette augmentation est également

significative entre la semaine 1 et la semaine 3 post-différenciation (augmentation

significative de 120,1%).

2.2.6 Evolution du TTR (time to recovery) des oscillations calciques au cours de la


Le TTR est le temps mis pour atteindre la fluorescence de base « F0 ». Le TTR apporte

des indications sur le temps des recaptures et extrusions calciques intracellulaires.

La figure R.38B montre que le TTR augmente progressivement entre la semaine 1, la

semaine 2 et la semaine 4 post-différenciation. Entre la semaine 2 et la semaine 3 post-

différenciation, le TTR reste stable.

Le TTR passe de 27 s en semaine 1 à 62,7 s en semaine 4 (soit une augmentation

significative de 132,2%). Cette augmentation est également significative entre la semaine 1 et

la semaine 3 (augmentation significative de 52,9%) et la semaine 1 et la semaine 2 post-

différenciation (augmentation significative de 50,3%).

Résultats

158

2.2.7 Evolution des pentes 1 et 2 des oscillations calciques au cours de la


Les pentes 1 et 2 apportent respectivement des indications sur les vitesses de libération

et de recapture calciques. La figure R-39 montre que la pente 1 (figure R-39A) et la pente 2

(figure R-39B) des oscillations calciques varient faiblement au cours des quatre semaines de


10

20

30

40

***

ns

**

n = 65 n = 42 n = 36 n = 65


TT

P (s

)

Figure R-38 : Evolution de TTP (A) et de TTR (B) de l’a ti it al i ue spo ta e au ou s des semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+. (N = 3). Sem : semaine, U.A : unité

arbitraire, ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été

différenciées et n : nombre total des cellules analysées. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. sem 1.

L’a al se statisti ue est effe tu e pa u test A o a No pa a et i epeated Measu es O e-Way

ANOVA) suivi par un test de Newman-Keuls.

A

B


20

40

60

80

***

**

n = 65 n = 42 n = 36 n = 65


TT

R (s

)

Résultats

159

différenciation cardiaque in vitro. La pente 1 varie de manière non significative et diminue de

0.07 U.A/s en semaine 1 à 0,04 U.A/s en semaine 4 (figure R-39A).

La pente 2 augmente de -0.02 U.A/s en semaine 1 à -0.01 U.A/s en semaine 4 avec une

variation statistiquement non significative (figure R-39B).


0.05

0.10

0.15

ns

nsns

n = 65 n = 42 n = 36 n = 65


Pen

te 1

A

B

Figure R-39 : Evolution de la pente 1 (A) et de la pente 2 (B) de l’a ti it al i ue spo ta e au cours des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+. (N = 3). Sem : semaine, U.A :

unité arbitraire, ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont

été différenciées et n : nombre total des cellules analysées. s s. se . L’a al se statisti ue est effectuée par un test Anova (Nonparametric repeated Measures One-Way ANOVA) suivi par un

test de Newman-Keuls.


-0.03

-0.02

-0.01

0.00

ns

ns

ns

n = 65 n = 42 n = 36 n = 65


Pen

te 2

Résultats

160

2.2.8 Evolutio du pou e tage du te ps d’a tivit alcique au cours de la


Le pou e tage du te ps d’a ti it al i ue est u pa a t e t s i po ta t a il p e d

en considération la fréquence et la durée des oscillations calciques.

La figure R-40 o t e lai e e t ue le pou e tage du te ps d’a ti it au ou s des

quatre semaines de différenciation cardiaque in vitro. Ce pourcentage varie faiblement et

sans aucune significativité statistique (37,9% en semaine 1, 47,7% en semaine 2, 39,7% en

semaine 3 et 42,4% en semaine 4).


20

40

60ns

nsns

n = 65 n = 42 n = 36 n = 65


% te

mps

d'a

ctiv

ité

Figure R-40 : E olutio du te ps d’a ti it e p i e pou e tage de l’a ti it al i ue spontanée au cours des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+. (N = 3). Sem :

semaine, U.A : unité arbitraire, ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les

CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : nombre total des cellules analysées. s s. se . L’a al se statistique est effectuée par un test Anova (Nonparametric repeated Measures One-Way ANOVA)

suivi par un test de Newman-Keuls.

Résultats

161

2.3 Identification des acteurs impliqués dans la génération des oscillations calciques

dans les CSCs W8B2+ différenciées

Pou alue le ôle des diff e ts a teu s ajeu s de l’ho ostasie al i ue da s la

génération des oscillations calciques observées dans les CSCs W8B2+ après 28 jours de

différenciation cardiaque in vitro, ous a o s tudi l’effet de l’i hi itio sp ifi ue de ha u

de es a teu s à l’aide d’age ts pha a ologi ues.

Soit :

L’ ha geu Na+/Ca2+ ou NCX: i hi pa l’age t pha a ologi ue “EA

La pompe à calcium du réticulum sarco-endoplasmique (SERCA) : inhibée par la

thapsigargine

Les epteu s à l’IP : inhibés par la xéstospongine C et le 2-APB (2-

Aminoethoxydiphenyl borate)

Les canaux calciques dépendants du voltage de type L : inhibés par la nifédipine

Les récepteurs à la ryanodine : inhibés par la ryanodine à forte concentration

Nous nous également testé :

L’effet de la sphi gosi e -phosphate, un second messager lipidique connu pour

moduler les stocks calciques intracellulaires

L’effet de l’i hi itio du a al BKCa ; u a al potassi ue do t l’a ti atio est

d pe da te de l’ho ostasie al i ues i t a ellulai e.

Les effets observés lors de cette étude pharmacologique sur les oscillations calciques sont

analysés grâce à Image J et les paramètres calciques décrits précédemment sont analysés

grâce à une application développée au laboratoire sous le langage IDL (Interactive Data

Language).

2.3.1 Effet de l’i hi itio de l’ ha geu NCX su les os illations calciques dans les

CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours

Le “EA i hi iteu s le tif de l’ ha geu Na+/Ca2+ ou NCX, utilisé à 10 µM abolit

totalement les oscillations calciques observées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de

différenciation (figure R-41).

Résultats

162

L’ajout du “EA à te ps = s, oï ide a e l’o u e e d’u e ème oscillation calcique

suivie d’u etou à l’ tat asal sa s au u e os illatio s ou elles.

2.3.2 Effet de l’i hi itio de la SERCA su les os illatio s al i ues da s les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours

Pou esti e le deg d’i pli atio de la po pe à calcium (Ca2+-ATPase) du réticulum

sarcoplasmique et endoplasmique (SERCA) dans la génération des oscillations calciques

obtenues sur les W8B2+ CSCs après 28 jours de différenciation cardiaque in vitro, nous avons

testé son inhibiteur, la thapsigargine (figure R-42).

L’appli atio de µM de thapsigargine (ajout au temps t = 750 s), est suivie de

l’appa itio d’u e ème oscillation calcique interrompue par une nouvelle augmentation

calcique qui diminue progressivement.

Figure R-41 : Effet de SEA- i hi iteu de l’ ha geu NCX su l’a ti it al i ue spo ta e enregistrée sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. Les graphes illustrent les

variations de la [Ca2+]i ep se t es pa le appo t ΔF/F . ΔF =F-F0 (F : fluorescence émise par la

GCaMP à un temps donné, F0 : fluorescence de base émise par la GCaMP). U.A : unité arbitraire.

300 600 900 1200

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8SEA-0400

Temps (s)

F/F0

(U.A

)

Résultats

163

2.3.3 Effet de l’i hi itio des a au CaV de type L sur les oscillations calciques dans

les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours

L’ajout da s le ilieu de µM de if dipi e o ue o e lo ueu des a au al i ues

de type L) à t = 600s augmente transitoirement la concentration du calcium cytoplasmique

(figure R-43).

Cette augmentation est suivie d'u e aisse p og essi e jus u’à l'appa itio d'u plateau.

300 600 900 1200 15000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5 Thapsigargine

Temps (s)

F/F0

(U.A

)

Figure R-42 : Effet de la thapsiga gi e i hi iteu de la “ERCA su l’a ti it al i ue spo ta e enregistrée sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. Les graphes illustrent les



Résultats

164

2.3.4 Effet de l’i hi itio des epteu s à l’IP sur les oscillations calciques dans

les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours

L’ajout de µM de stospo gi e C i hi iteu sp ifi ue des IP à t = s (figure

R-44A), i duit u e di i utio sig ifi ati e , % de l’a plitude pa appo t au o trôle

(figure R-44Ba), une augmentation significative (63,3%) de la durée des oscillations calciques

(figure R-44Bd) et aucun changement concernant la fréquence (figure R-44Bb) et l’ai e (figure

R-44Bc).

300 600 900 12000.0

0.5

1.0

1.5

Nifédipine

Temps (s)

F/F0

(U.A

)

Figure R-43 : Effet de la nifédipine (inhibiteur des CaV de t pe L su l’a ti it al i ue spo ta e enregistrée sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. Les graphes illustrent les



Résultats

165

300 600 900 1200 1500 18000.0

0.5

1.0

Xéstospongine C

Temps (s)

F/F0

(U.A

)

Figure R-44 : (A) Effet de la stospo gi e C i hi iteu des epteu s à l’IP su l’a ti it al i ue spontanée enregistrée sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. Les graphes illustrent les variations de la [Ca2+]i ep se t es pa le appo t ΔF/F . ΔF =F-F0 (F : fluorescence émise par la GCaMP à un temps donné, F0 : fluorescence de base émise par la GCaMP). U.A : unité arbitraire. (B) Effet de la stospo gi e C su l’a plitude (a), la fréquence (b), l’ai e (c) et la durée (d) des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. (N = 2). ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : o e d’ e e ts (oscillations) enregistrés. *p<0.05, **p<0.01 vs. Co t ôle. L’a al se statisti ue est effe tu e pa u test t No pa a et i t test .

Contrôle Xéstospongine C0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

**

n = 10 n = 20Am

plitu

de (U

.A)

Contrôle Xéstospongine C

0.0

0.2

0.4

0.6

ns

n = 4 n = 8

Fréq

uenc

e (p

ic/m

in)

Contrôle Xéstospongine C0

10

20

30

40

ns

n = 11 n = 20

Aire

(U.A

.s)


50

100

150

*

n = 11 n = 24

Dur

ée (s

)a b

c d

B

A

Résultats

166

De plus, la figure R-45 montre que le traitement à la xéstospongine C provoque une

augmentation significative (105,7%) du TTR (figure R-45B) et aucun changement pour le TTP

(figure R-45A), de la pente 1 (figure R-45C), la pente 2 (figure R-45 D) et le pourcentage du

te ps d’a ti it (figure R-45E).

Figure R-45 : Effet de la stospo gi e C i hi iteu des epteu s à l’IP su le TTP (A), le TTR (B),

la pente1 (C), la pente 2 (D) et le pou e tage du te ps d’a ti it (E) des oscillations calciques

spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. U.A : unité

arbitraire. (N = 2). U.A : unité arbitraire, ns : non significatif, N : nombre de patients à partir

desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : o e d’ e e ts os illatio s e egist s. *p< . s. Co t ôle. L’a alyse statistique est effectuée par un test t (Nonparametric

t test).


5

10

15

20

25

ns

n = 11 n = 27

TT

P (

s)


50

100

150

*

n = 11 n = 26T

TR

(s)

Contrôle Xéstospongine C0.00

0.05

0.10

0.15

ns

n = 11 n = 27

Pen

te 1

U.A

/s

Contrôle Xéstospongine C-0.025

-0.020

-0.015

-0.010

-0.005

0.000

ns

n = 11 n = 27

Pen

te 2

U.A

/s

A B

C D


20

40

60

80

ns

n = 3 n = 8

% te

mps

d'a

ctiv

ité

E

Résultats

167

Nous avons ensuite testé le 2-APB connu comme étant est un autre inhibiteur des

epteu s à l’IP ais a e oi s de sp ifi it ue la stospo gi e C.

En effet, selon la concentration utilisée, le 2-APB agit sur des cibles différentes. Le 2-

APB est u a tago iste des epteu s à l’IP IC50 = μM et u odulateu des a au “OCs

(store-operated calcium channels) (Diver et al., 2001; Ma et al., 2002; Prakriya and Lewis,

2001). Le 2-APB stimule les libérations calciques à partir des SOCs pour de faibles

concentrations (< µM et les i hi e à fo tes o e t atio s jus u’à µM .

Les sultats o t e t ue l’ajout de et µM de 2-APB ’i pa te isi le e t pas

les oscillations calciques observées dans les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation

cardiaque in vitro (figure R-46 A).

Cepe da t, l’a al se des pa a t es i ti ues des os illatio s calciques après traitement au

2-APB, o t e des effets su e tai s pa a t es o e l’a plitude, l’ai e, la du e, le TTP

et le TTR.

Le 2-APB à µM, aug e te l’a plitude de , % pa appo t au o t ôle et à l’i e se, la

diminue de 26% quand il est utilisé à 50 µM (figure R-46 Ba). Le 2-APB utilis à µM ’a pas

d’effet sig ifi atif su la f ue e (figure R-46 Bb), l’ai e (figure R-46 Bc), la durée (figure R-

46 Bd), le TTP (figure R-47 A), le TTR (figure R-47 B), la pente 1 (figure R-47 C), la pente 2

(figure R-47 D) et le pource tage du te ps d’a ti it (figure R-47 E).

Le 2-APB à µM, ’a pas d’effet su la f ue e (figure R-46 Bb) mais diminue de 61,5%

l’ai e (figure R-46 Bc) et diminue de 45,1% la durée (figure R-46 Bd). De plus, le 2-APB à 50

µM ’a pas d’effet su le TTP (figure R-47 A), la pente 1 (figure R-47 C) et la pente 2 (figure R-

47 D) mais diminue de 56,3% le TTR (figure R-45 B) et de 48,4% le pourcentage du temps

d’a ti it (figure R-47 E).

L’e se le de es sultats sugg e t u e pa ti ipatio sig ifi ati e de la voie IP3

se si le ui se ait i pli u e plus sp ifi ue e t da s l’i te sit du sig al al i ue sa s

altérer sa fréquence.

Résultats

168

300 600 900 1200 1500 18000.0

0.5

1.0

1.52APB 5 µM 2APB 50 µM

Temps (s)

F/F0

(U.A

)

A

Figure R-46 : (A) Effet du 2-APB et µM su l’a ti it al i ue spo ta e e egist e su les C“Cs W8B2+ après 28 jours de différenciation. Les graphes illustrent les variations de la [Ca2+]i représentées

pa le appo t ΔF/F . ΔF =F-F0 (F : fluorescence émise par la GCaMP à un temps donné, F0 :

fluorescence de base émise par la GCaMP).U.A : unité arbitraire. (B) Effet du 2-APB (5 et 50 µM) sur

l’a plitude (a), la fréquence (b), l’ai e (c) et la durée (d) des oscillations calciques spontanées

enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. (N = 2). ns : non significatif, N :

nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : nombre

d’ e e ts os illatio s e egist s. *p< . , **p< . s. Co t ôle. L’a al se statisti ue est effectuée par un test one way ANOVA suivi par un post test de Bonferroni.

B

Contrô

le

2APB 5

µM

2APB 50

µM0.0

0.5

1.0

1.5*

n = 15 n = 11n = 4

**

Am

plitu

de (U

.A)

Contrô

le

2APB 5

µM

2APB 50

µM0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

ns

ns

n = 6 n = 2 n = 4Fréq

uenc

e (p

ic/m

in)

Contrô

le

2APB 5

µM

2APB 50

µM0

50

100

150 ns

*

n = 16 n = 12n = 4

Aire

(U.A

.s)

Contrô

le

2APB 5

µM

2APB 50

µM0

50

100

150

200 ns

*

n = 16 n = 12n = 4

Dur

ée (s

)

a b

c d

Résultats

169

Contrô

le

2APB 5

µM

2APB 50

µM0

20

40

60

80

ns

*

n = 5 n = 4n = 2% te

mps

d'a

ctiv

ité

E

Contrô

le

2APB 5

µM

2APB 50

µM0

20

40

60

80

ns

ns

n = 4n = 16 n = 12

TTP

(s)

Contrô

le

2APB 5

µM

2APB 50

µM0

50

100

150

ns

*

n = 16 n = 4 n = 10

TTR

(s)

Contrô

le

2APB 5

µM

2APB 50

µM0.00

0.05

0.10

0.15

ns

ns

n = 16 n = 4 n = 12

Pen

te 1

U.A

/s

Contrô

le

2APB 5

µM

2APB 50

µM

-0.0

-0.0

-0.0

0.0

ns

ns

n = 16 n = 4 n = 12

Pen

te 2

U.A

/s

A B

C D

Figure R-47 : Effet du 2-APB (5 et 50 µM) sur le TTP (A), le TTR (B), la pente1 (C), la pente 2 (D) et le

pou e tage du te ps d’a ti it (E) des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs

W8B2+ après 28 jours de différenciation. U.A : unité arbitraire. (N = 2). ns : non significatif, N : nombre

de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : o e d’ e e ts os illatio s e egist s. *p< . s. Co t ôle. L’a al se statistique est effectuée par un test one way

ANOVA suivi par un post test de Bonferroni.

Résultats

170

2.3.5 Effet de l’i hi itio des epteu s à la a odi e su les os illatio s al i ues dans les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours

L’ajout de µM de a odi e i hi iteu des R R à fo te o e t atio à t = s (figure R-

48A), ’i duit au u ha ge e t su l’a plitude (figure R-48 Ba), la fréquence (figure R-48

Bb), l’ai e (figure R-48 Bc), la durée des oscillations calciques (figure R-48 Bd).

300 600 900 12000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5Ryanodine

Temps (s)

F/F0

(U.A

)

Figure R-48 : (A) Effet de la a odi e µM su l’a ti it al i ue spo ta e e egist e su les C“Cs W8B2+ après 28 jours de différenciation. Les graphes illustrent les variations de la [Ca2+]i représentées

pa le appo t ΔF/F . ΔF =F-F0 (F : fluorescence émise par la GCaMP à un temps donné, F0 : fluorescence

de base émise par la GCaMP). U.A : unité arbitraire. (B) Effet de la a odi e µM su l’a plitude (a),

la fréquence (b), l’ai e (c) et la durée (d) des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs

W8B2+ après 28 jours de différenciation. (N = 2). ns : non significatif, N : nombre de patients à partir

desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : o e d’ e e ts (oscillations) enregistrés. ns

s. Co t ôle. L’a al se statisti ue est effe tu e pa u test t No pa a et i t test .

Contrôle Ryanodine0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

n = 5 n = 5

ns

Am

plitu

de (U

.A)

Contrôle Ryanodine

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

n = 2 n = 2

ns

Fréq

uenc

e (p

ic/m

in)

Contrôle Ryanodine0

50

100

150

n = 5 n = 5

ns

Aire

(U.A

.s)


50

100

150

n = 5 n = 5

ns

Dur

ée (s

)

a b

c d

A

B

Résultats

171

De plus ette i hi itio ’affe te pas le TTP (figure R-49A), le TTR (figure R-49B), la pente 1

(figure R-49C), la pente 2 (figure R-49D) et le pou e tage du te ps d’a ti it (figure R-49E).

Ce sultat o o o e l’a se e d’e p essio du epteu a odi e (figure R-19 et figure R-

32) sur les W8B2 en début et en fin de différenciation.


20

40

60

80

n = 5 n = 5

ns

TT

P (

s)


20

40

60

80

100

n = 5 n = 5

ns

TT

R (s

)

Contrôle Ryanodine0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

n = 5 n = 5

ns

Pen

te 1

U.A

/s

Contrôle Ryanodine-0.020

-0.015

-0.010

-0.005

0.000

n = 5 n = 5

ns

Pen

te 2

U.A

/s

A B

C D


20

40

60

80

n = 2 n = 2

ns

% te

mps

d'a

ctiv

ité

E

Figure R-49 : Effet de la ryanodine (50 µM) sur le TTP (A), le TTR (B), la pente 1 (C), la pente 2 (D)

et le pourcentage du te ps d’a ti it (E) des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les

CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. U.A : unité arbitraire. (N = 2). ns : non significatif, N :

nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : nombre

d’ e e ts os illatio s e egist s. s s. Co t ôle. L’a al se statistique est effectuée par un

test t (Nonparametric t test).

Résultats

172

Chapitre II : Rôle du canal BKCa dans la régulation de la prolifération et de

l’auto-renouvellement des CSCs W8B2+

Les résultats présentés dans ce chapitre sont présentés sous format article scientifique.

Ce dernier est soumis dans le journal « The FEBS Journal » et il est actuellement en révision.

L’a ti le s ie tifi ue s’i titule « FUNCTIONAL BKCa CHANNEL IN HUMAN RESIDENT CARDIAC

STEM CELLS EXPRESSING W8B2».

1 Cad e de l’ tude

Le œu hu ai adulte a ite plusieu s populatio s de ellules sou hes a dia ues ui

expriment des marqueurs spécifiques. Récemment, une nouvelle population positive pour le

marqueur W8B2 a été identifiée. Ces cellules souches cardiaques exprimant W8B2 (CSCs

W8B2+) ont une origine mésenchymateuse et présentent un fort potentiel thérapeutique

(Zhang et al., 2015a). Cependant, le profil électrophysiologique de ces cellules n'a pas encore

été caractérisé.

Nous nous sommes donc focalisés sur la caractérisation des canaux fonctionnels

exprimés par les CSCs W8B2+ et leurs éventuels rôles dans la régulation de leurs propriétés

(auto-renouvellement, prolifération et migration cellulaire) qui sont importantes pour le

maintien de leur nombre et de leur mobilité pour la réparation tissulaire tout au long de la vie.

Grâce à la technique du patch-clamp, nous avons montré pour la première fois la signature

le t oph siologi ue d’u ou a t BKCa dans ces cellules.

Les canaux potassiques à large conductance activés par le calcium, ou BKCa, sont des

a au ui s’ou e t suite aux changements du potentiel électrique membranaire et/ou suite

à l’aug e tatio du calcium intracellulaire. Ces canaux se trouvent dans de nombreux tissus

et participent à divers processus cellulaires (Toro et al., 2014). Les canaux BKCa sont impliqués

dans la modulation de l'excitabilité vasomotrice et nerveuse en régulant le potentiel de

membrane et la signalisation calcique (Nelson and Quayle, 1995). En outre, cette large

conductance potassique contribue au maintien du potentiel de membrane dans les petits

vaisseaux myogéniques (Waldron and Cole, 1999).

Il est intéressant de noter que ce canal joue un rôle clé dans de nombreux processus

biologiques tels que le métabolisme cellulaire, la prolifération, la migration et l'expression des

gènes. En plus de ses rôles physiologiques, le canal BKCa est impliqué dans plusieurs

Résultats

173

pathologies comme l'obésité ou le cancer (Toro et al., 2014). Cepe da t, l’e p essio

fonctionnelle et le rôle des canaux BKCa dans les cellules souches cardiaques humaines,

restent peu étudiés.

Après avoir identifié le canal fonctionnel BKCa dans notre modèle de CSCs W8B2+, nous

avons donc voulu étudier son rôle physiologique dans la régulation des processus

fondamentaux de ces cellules souches comme l'auto-renouvellement, la prolifération et la

migration.

2 Résumé des résultats

Co e ous l’a o s d jà d it p de e t hapit e I résultat (p 114) Les CSCs

W8B2+ isolées par tri magnétique suivi du tri par FACS, ont une morphologie étalée et

fusifo e o e elle des fi o lastes et poss de t des apa it s d’auto-renouvellement

(démontrées par le test de formation de colonies « CFU-Fs »). De plus, ces cellules

p olif aie t apide e t a e u te ps de d dou le e t d’e i o h. L'a al se pa

cytométrie de flux a révélé que les CSCs W8B2+ expriment fortement les marqueurs de surface

associés aux cellules souches mésenchymateuses (W8B2, CD29, CD73 et CD105) et sont

négatives pour les marqueurs hématopoïétiques (CD34, CD45 et CD133). Au niveau génique,

les CSCs W8B2+ ont montré une forte expression des facteurs de transcription cardiaque

spécifiques précoces comme GATA4 et MEF2C mais pas Nkx2.5. De plus, ces cellules expriment

les transcrits codant pour la connexine 43 (isoforme cardiaque) mais pas les transcrits codant

pour les structures contractiles cardiaques (ACTC1, TNNT2, b-MHC).

Les enregistrements de courants obtenus par la technique de patch clamp (en

configu atio ellule e ti e , o t l la p se e d’u ou a t potassi ue de t pe BKCa

bloqué par la paxilline. L'identité moléculaire du canal BKCa a été confirmée au niveau

transcriptionnel par RT-PCR et au niveau protéique par Western Blot dans les CSCs W8B2+.

Pour évaluer le rôle du canal BKCa dans la prolifération cellulaire des CSCs W8B2+, la paxilline

a t utilis e pou lo ueu sp ifi ue e t e a al. La pa illi e utilis e à μM et μM a

progressivement inhibé la prolifération à partir du 4è e jou e ultu e. D’aut e pa t, l'a al se

du le ellulai e pa to t ie de flu , a o t ue la pa illi e μM et pa ti uli e e t

à 10 µM) a significativement augmenté la fraction de la population cellulaire en phase G1 et

considérablement diminu la f a tio de la populatio ellulai e e phase “/G . L’i hi itio

du canal BKCa a affecté l'auto-renouvellement des CSCs W8B2+. En effet, la paxilline (utilisée à

Résultats

174

, et μM a o sid a le e t duit le o e de olo ies CFU-Fs après dix jours de

culture.

Concernant la migration cellulaire évaluée par le test de blessure (wound healing), les

résultats ont montré que le blocage du canal BKCa par la paxilline ne réprime pas les capacités

migratoires des cellules.

L’e se le de es sultats d o t e que le canal BKCa est probablement un

régulateur clé de la prolifération et de l'auto-renouvellement des CSCs W8B2+ et fournit une

base pour une meilleure compréhension de la physiologie de ces cellules. De nouvelles

recherches, basées sur la relation ent e le pote tiel de e a e et l’a ti it al i ue via les

canaux BKCa, semblent primordiales pour ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques.

3 Article scientifique: « FUNCTIONAL BKCa CHANNEL IN HUMAN RESIDENT CARDIAC

STEM CELLS EXPRESSING W8B2».

Résultats

175

FUNCTIONAL BKCa CHANNEL IN HUMAN RESIDENT CARDIAC STEM CELLS EXPRESSING

W8B2

Ayad O , Magaud C, Sebille S, Bescond J, Cognard C, Faivre JF, Bois P* and A Chatelier*

Equipe Transferts Ioniques et Rythmicité Cardiaque, Laboratoire Signalisation et Transports Ioniques

Membranaires, ERL CNRS 7368, EA 7349, Université de Poitiers *These authors have contributed equally to this work

ABSTRACT

Recently, a new population of resident cardiac stem cells positive for W8B2 marker has been

identified. These cardiac stem cells (CSCs) are considered an ideal cellular source to repair

myocardial damage after infarction. However, the electrophysiological profile of these cells

has not been characterized yet. We first establish the conditions of isolation and expansion of

W8B2+ CSCs from human heart biopsies using magnetic sorting system followed by flow

cytometry cell sorting. These cells display a spindle-shaped morphology, are highly

proliferative and possess self-renewal capacity demonstrated by their ability to form colonies.

Besides, W8B2+ CSCs are positive for mesenchymal markers but negative for hematopoietic

and endothelial ones. RT-qPCR and immunostaining experiments show that W8B2+ CSCs

express some early cardiac-specific transcription factors but lack the expression of cardiac-

specific structural genes. Using patch-clamp in whole cell configuration, we show for the first

time the electrophysiological signature of BKCa current in these cells. Accordingly, RT-PCR and

western blotting analysis confirm the presence of BKCa at both mRNA and protein levels in

W8B2+ CSCs. Interestingly, BKCa channel inhibition by paxilline decreases cell proliferation in

a concentration-dependent manner and cell cycling progression by accumulating the cells at

G0/G1 phase. The inhibition of BKCa also decreased self-renewal capacity but did not affect

W8B2+ CSCs migration. Taken together, our results are consistent with an important role of

BKCa channels on cell cycle progression and self-renewal in human cardiac stem cells.

Key words: W8B2+ CSCs, BKCa channel, cell proliferation, cell cycle; migration; patch-clamp;

self-renewal.

INTRODUCTION

The adult human heart harbors several populations of cardiac stem/progenitor cells that

express specific markers. Recently a new population was identified which is positive for W8B2

marker (also called mesenchymal stem cell antigen-1) and shows high expression of

mesenchymal but not hematopoietic nor endothelial markers. W8B2 positive cardiac stem

cells (W8B2+ CSCs) exhibit a strong therapeutic potential when transplanted into a chronic

myocardial infarction rat model [1]. Self-renewal, proliferation and migration are important

properties that allow the perpetuation of progenitor cells and their mobility for repairing

processes during life. However, the mechanisms that control these properties still have to be

characterized in W8B2+ CSC.

Résultats

176

High-conductance calcium-activated potassium channels (BKCa) are found in many tissues and

participate in variety of cellular processes [2]. These channels are gated open by both binding

of intracellular calcium and membrane depolarization. BKCa channels are involved in the

modulation of vasomotor and nerve excitability by regulating membrane potential and

calcium signaling [3]. Moreover, this large potassium conductance contributes to the

maintenance of the membrane potential in small myogenic vessels [3-5]. Interestingly,

increasing evidence indicates that the channel plays a key role in numerous biological

processes such as cell metabolism, proliferation, migration, and gene expression. It strongly

impacts physiological cell functions, for example in human primary skeletal myoblast [6] or in

pathologies like obesity or brain, prostate, and mammary cancers [2]. However, whether

these high-conductance calcium-activated potassium channels are functionally expressed in

human cardiac progenitor cells remains poorly understood. Although human cardiac W8B2+

progenitor cells have been well characterized, the physiological role of BKCa channel in these

cells type has never been reported.

In the present study, we identify BKCa channel current expressed in human cardiac W8B2+

progenitor cells isolated from human atrial appendage. We also investigate the role of BKCa

on proliferation, migration and self-renewal processes in these progenitor cells.

MATERIALS AND METHODS

Isolation of W8B2+ CSCs

Human right atrial specimens were obtained from 10 adult patients (mean age 72.7 ± 3.2

years, 9 males and 1 female). The right human atrium samples are operational waste resulting

from the implementation of extracorporeal cardiac surgery, such as coronary artery bypass

surgery, and are obtained in cooperation with the University hospital of Poitiers. All

procedures were carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. Freshly harvested

specimens were rinsed with PBS and manually minced into 1–2 mm3 fragments and subjected

to enzymatic digestion with collagenase A (1 mg/mL, Sigma-Aldrich) for 20 minutes at 37°C.

The tissue fragments were plated onto fibronectin- oated dishes μg/ L, Ro he Diagnostics) and cultured in explant medium containing IMDM medium (Lonza) supplemented

with 20% fetal bovine serum (Biowest), 0. M β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich), 2 mM L-

gluta i e, μg/ L st epto i “ig a-Ald i h , μg/ L pe i illi “ig a-Aldrich) and

. μg/ L a phote i i B “ig a-Aldrich), at 37 °C and 5% CO2.

Magnetic-activated cell sorting

After 2–3 weeks, monolayers of adherent cells outgrowth from the adherent tissue fragments

were collected using enzymatic digestion with Accumax® (Sigma-Aldrich) and partially

enriched for W8B2 marker by magnetic Cell Sorting System (Miltenyi Biotec, Bergisch

Gladbach, Germany) using W8B2 antibody. The cells were incubated for 15 minutes at 4-8°C

in PBS-BSA 0.5% -2 mM EDTA buffer containing FCR Blocking Reagent® (Miltenyi Biotec,

Bergisch Gladbach, Germany), mouse anti-MSCA-1 monoclonal antibody coupled to magnetic

micro-beads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). After being washed, the cells

e e passed th ough a μ po osit lo ell sie e Co i g pla ed i to a MAC“ ell separation column (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) positioned on a magnet.

Résultats

177

Inside the column, the retained cells were washed with PBS-BSA buffer 0.5% - 2 mM EDTA and

then harvested in this same buffer by separating the column from the magnet. The positive

fraction (W8B2+ cells) were seeded in growth medium containing 25% EGM-2 (Lonza) and 75%

M Lo za , supple e ted ith % fetal o i e se u Bio est , μg/ L st epto i (Sigma-Ald i h a d . μg/ L a phote i i B “ig a-Aldrich), 0.1 mM nonessential amino

acids, 100 U/mL penicillin, cultured at 37°C 5% CO2.

Flow cytometry cell sorting

After magnetic cell sorting, confluent cells were labeled with W8B2 PE-conjugated antibody

and sorted using a FACS Aria Flow cytometer and sorter. Cells were first rinsed with PBS and

then harvested by Accumax® (Sigma-Aldrich) enzymatic digestion. The cells were taken up in

PBS buffer - BSA 0.5% - 2 mM EDTA and labeled with the isotypic antibody coupled to

phycoerythrin (1:11, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) or MSCA-1 (W8B2)

antibody coupled to phycoerythrin (1:11, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) for 10

min, in the dark, at 2-8 ° C. After labelling, the cells were washed with PBS buffer - 0.5% BSA -

2 mM EDTA and sorted by a flow cytometer (FACS Aria III, BD). After cell sorting, the collected

W8B2+ cells were seeded into flasks with growth medium.

Cell surface marker analysis

The cell surface markers of sorted human W8B2+ CSCs were analyzed with flow cytometry.

The cells were rinsed twice with pre-cooled PBS and re-suspended in cold PBS containing

specific human antibodies from Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany: Mouse IgG1

CD117-APC (1:11), Mouse IgG2a CD45-VioBlue (1:11), Mouse IgG1 CD133/1-VioBright FITC

(1:11), Mouse IgG1 CD105-PE(1:11), Mouse IgG2a CD34-PerCP-Vio700 (1:11), Mouse IgG1

CD90-PE-Vio770(1:11), Rec Human IgG1 (S) CD106-FITC : , Mouse IgG κ CD -PE-Vio770

(1:11), Mouse IgG1 CD73-APC (1:11). For each antibody, isotype control antibodies were used:

Mouse IgG2a-VioBlue (1:11), REA Control (S)-FITC (1:11), Mouse IgG1-VioBright FITC (1:11),

Mouse IgG1-PE (1:11), Mouse IgG2a-PerCP-Vio700 (1:11), Mouse IgG1-PE-Vio770 (1:11),

Mouse IgG1-APC (1:11). For flow cytometry florescence compensation, MACS Comp Bead Kit,

anti-mouse Igk (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) and MACS Comp Bead Kit, anti-

REA (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) were used.

The cells were incubated at 4 °C in the dark for 10 min, then washed with PBS, and re-

suspended for flow cytometry analysis. The percentage of positive cells was analyzed with

FACS Aria Flow cytometer based on over 20000 events.

Colony formation assay (colony-forming unit fibroblasts)

W8B2+ CSCs were seeded at a density of 5 cells/cm² in a 6-well plate, in growth medium. The growth medium was renewed every 3-4 days. After 10 days of culture, the cells were rinsed with PBS, fixed for 10 min with 4% PFA and finally stained with 0.5% Crystal violet for 30 min (Sigma-Aldrich). The colonies were photographed under a phase contrast microscope and the colonies were counted. Proliferation assay

Résultats

178

Cells were plated at a density of 133 cells/cm2 in 35mm dishes with growth medium for 9 days.

Cells were then synchronized to G0/G1 phase with a culture medium containing 1% FBS for 12

h. Every day, cell number is counted for each condition (control vs paxilline treated) using

Malassez cell chamber.

Cell cycle analysis with propidium iodide incorporation

Cells were plated and cultured in 35 mm cell culture dishes at a density of 5×102 cells/cm2.

Cells were then synchronized to G0/G1 phase with a culture medium containing 1% FBS for 12

h. Briefly, the cells were cultured in normal culture medium with ion channel blocker paxilline

for 9 days. The cells were lifted using 0.125% trypsin, washed with PBS, and fixed with 70%

ethanol for 30 minutes, cells were incubated with the staining solution (0.1% triton, 50µg/mL

of RNase A (Sigma-Aldrich) and 5 µg/mL of propidium iodide (Sigma-Aldrich) in PBS in the dark

for 90 minutes. Data were acquired using FACS VERSE cytometer (BD) and the percentage of

cell cycle phases was determined using and FLOWJO software (Flowjo LLC).

Immunostaining

W8B2+ cells were seeded on gelatin-fibronectin coated glass slide. Cells were then fixed,

permeabilized and incubated overnight with primary antibodies directed against connexin-43

(1:500, mouse monoclonal antibody, BD Transduction Laboratories, San Jose, CA), GATA4

(1:250, mouse monoclonal antibody, Santa Cruz Biotech,Texas,U.S.A.) and Nkx2.5 (1:250, goat

polyclonal antibody, R & D Systems Minneapolis,U.S.A). Cells were washed three times with

PBS and incubated for 2 h with the secondary antibody against connexin-43 (1:250, goat anti-

mouse alexa 555, Invitrogen,California , U.S.A), GATA-4 (1:250, goat anti-mouse alexa 555,

Invitrogen,California , U.S.A) and NKX2.5 (1:250, donkey anti-goat, alexa 555,

Invitrogen,California , U.S.A). TOPRO (1:1000, Invitrogen,California , U.S.A) was used for nuclei

labelling. Finally, the slides were slide-mounted in Mowiol® (Sigma-Aldrich) and visualized

using confocal microscopy.

Patch clamp

Cells were seeded at a density of 2.103 cells/cm2 in 35mm diameter culture dish 24 h prior to

the patch clamp experiments. The ionic currents were recorded on human W8B2+ CSCs in the

whole-cell configuration using an Axopatch 200A amplifier with a CV 202AU headstage

(Molecular Devices, CA, USA). Voltage clamp were generated by a personal computer

equipped with an analog-digital converter (Digidata 1322a, Molecular Devices) using pClamp

software v10 (Molecular Devices). During recordings, cells were superfused with an

extracellular solution containing (in mM) : 136 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl2, 1.8 CaCl2, 0.3 NaH2PO4,

10 glucose , 10 HEPES, pH 7.3. Membrane ion currents were recorded via glass electrodes of

borosilicate GC150-T manufactured on a vertical twin heating puller. Pipette resistance was

et ee a d MΩ he filled ith the i t apipette solutio hi h o tai ed in mM): 20

KCl, 110 K-asp, 1 MgCl2, 10 HEPES, 2 CaCl2, 2.5 EGTA, 0.1 GTP, 5 Na2-phosphocreatine, 5 Mg-

ATP, pH 7.2 (PCa = 6.3). The currents were recorded in control (with 0.1% DMSO as vehicle) or

i pa illi e μM o ditio s. A al ses e e pe fo ed usi g Cla pfit soft a e. Cell

Résultats

179

capacitance was measured by integrating the area under the capacitive transient elicited by 5

mV depolarizing steps from holding potential of 0 mV.

Reverse transcription and polymerase chain reaction

Total RNA from W8B2+ cells was isolated using Rnable reagent (Eurobio) followed by

chloroform extraction and isopropanol precipitation. RNA integrity was evaluated by

ethydium bromide staining on a 1% agarose gel. Total RNA was quantified by assessing optical

density at 260 and 280 nm (NanoDrop ND-100 Labtech France). cDNA was synthesized using

the Pd N a do he a e p i e I it oge . μL of total RNA µg as added to μL of reaction mixture (100 mM Tris–HCl pH 8.3, 150 mM KCl, 6.25 mM MgCl2, 20 mM DTT, 2

M dNTPs I it oge a d . μg Ra do P i e Pd N I it oge . RNA e e de atu ed at 65 °C during 2 min and then added to 40 U RNAse inhibitor (RNaseOUT-Invitrogen) and 400

U M-MLV Re e se T a s iptase I it oge to μL fi al olu e. DNA as s thesized at °C fo h a d the added ith μL ste ile ate . Re ai i g e z es e e heat-

deactivated (100 °C, 2 min). After the RT p o edu e, μL of DNA ≈ g as added to μL of PCR ea tio i tu e M T is–HCl pH 8.4, 55 mM KCl, 2.2 mM MgCl2, 277.8 µM

dNTPs, 12 pmol forward and reverse primers and 1.25 U of Taq Polymerase (Invitrogen). The

PCR reaction was performed with a thermocycler (denaturation at 95 °C for 5 min, followed

by 38 cycles at 57 °C for 30 s, 72 °C for 30 s, and 95 °C for 30 s. After the last cycle, samples

were incubated at 57 °C for 2 min and at 72 °C for 10 min to ensure complete product

extension. All primers are described in table 1. GAPDH cDNA was used as housekeeping. cDNA

extracted from cardiac atrial tissue was used as a positive control and the negative control

consisted of the PCR reaction without the addition of the template. Amplified products were

separated by electrophoresis on 2% agarose gels (containing 0.01% ethidium bromide) in Tris-

Acetate-EDTA buffer and visualised using a UV Transilluminator.

Quantitative RT-qPCR

After reverse transcription the quantitative PCR reaction was carried out on a 96 well- plate,

with the sense and antisense primers allowing the amplification of GAPDH (used as reference

ge e , GATA , MEF C, ACTC , TNNT , a d β-MHC (all primers are described in table 1). Each

well contained a 25 mM primer pair (sense and anti-sense), cDNA at 100 ng/well final , as well

as Power SYBR® Green PCR reagent Master Mix (Thermo Fisher Scientific) containing AmpliTaq

Gold® DNA Polymerase. Each sample was polymerized in triplicate to best estimate the

threshold cycle of fluorescence appearance and water was used as a negative control. The

amplification reaction begins with initial denaturation of the cDNA for 10 min at 95 °C,

allowing the activation of the DNA polymerase, and is followed by 40 successive cycles

consisting of a denaturation step for 15 sec at 95 °C followed by a step of hybridization of the

primers and elongation for 1 min at 60 ° C. The results were obtained and analyzed by the

7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems USA).

Western blotting analysis

To determine KCa1.1 protein expression, cultured W8B2+ cells were washed with cold

phosphate-buffered saline (PBS) and lysed by scraping the cells into a

Résultats

180

radioimmunoprecipitation assay buffer (in mM: Tris-HCl 50 pH:8, NaCl 150, EDTA 5, 0.05%

Igepal, 1% deoxycholic acid, 1% Triton X-100, 0.1% SDS) containing protease and phosphatase

inhibitors (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma-Aldrich - PhosSTOP Phosphatase Inhibitor

Cocktail, Roche).

Soluble cell lysates were denatured 5 min at 37°C in 2× Laemmli sample buffer (in mM): Tris-

HCl pH . , “D“ %, gl e ol %, o ophe ol lue . %, β-mercaptoethanol 10%).

P otei sa ples a d μg , o tai ed f o ultu ed W B + cells, were separated by SDS-

PAGE using 8% polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose membranes. Membranes

were blocked 90 min in TBS-Tween blocking solution (in mM: Tris 20 pH : 7.6, NaCl 150 and

Tween-20 0.2%) with 5% non-fat milk at room temperature. Blots were then incubated

overnight at 4°C with primary antibodies diluted in TBST-5% nonfat dry milk. We used

polyclonal anti-rabbit KCa1.1 (1:500, Alomone Labs, Jerusalem, Israel). Vimentine was probed

by rabbit polyclonal anti-vimentine (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, U.S.A).

Membranes were washed with TBS-Tween three times for 10 min and then incubated for 90

min at room temperature with specific anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated

secondary antibodies (1:5000, Interchim, Montluçon, France). Membranes were revealed

with enhanced chemiluminescence (ECL) chemiluminescent substrate (GE Healthcare, Velizy-

Villacoublay, France). The results were analyzed by using the GeneGnome Imager (SynGene

Ozyme, Montigny - le - Bretonneux, France).

Cell mobility determination

Cell migration was determined using a wound healing method to investigate the potential

effect of BKCa channels on cell mobility in human W8B2+ CSCs. The wound healing assay was

conducted when the cells grew to total confluence in 6-well plates in 0% FBS culture medium.

A sta da d ou d as eated s at hi g the ell o ola e ith a ste ile μL plasti pipette tip. After removing cell fragments by washing cell monolayer gently with PBS, the cells

were incubated at 37°C with the medium containing 0% FBS and 10 µM paxilline for 7 h. The

cells were then fixed and nuclei were labelled with DAPI. Transmission images were taken just

after the wound (time 0h) and after 7h of paxilline treatment. The images were generated

with a spinning disk confocal station (Revolution, Andor) equipped with a high precision

motorized XY stage (Marzhauser) and IQ3 software (Revolution, Andor) that allowed to

memorize positions of each sample. The number of migrated cells on the images were counted

(based on the nuclei labelling) to assess cell mobility under different conditions of treatments.

Statistical analysis Results were expressed as mean ± SEM. All statistical analysis were performed using GraphPad

Prism (La Jolla, CA, USA). The tests used for the different assays are provided in the figure

legends.

RESULTS

W8B2+ CSCs are clonogenic and proliferative Purified W8B2+ CSCs displayed spindle-shape and fibroblastic morphology during early

passages of culture (Fig. 1A). To demonstrate their stem character and their self-renewal

Résultats

181

capacity, their ability to elicit clonogenic multiplication was checked using a colony-forming

unit fibroblasts (CFU-Fs) test carried out by seeding pure W8B2+ CSCs at low density. After 10

days of growth, the cells were able to form several colonies confirming self-renewal ability

(Fig. 1B). Cells were rapidly proliferating and about 1.4 105 cells were obtained after 9 days of

culture from 2.103 cells at day 1 (Fig. 1C left). The cell increase fold in 24 hours was about 1.76

± 0.2 (Fig. 1C right).

Immunophenotype of W8B2+ CSCs Flow cytometry analysis revealed that W8B2+ CSCs highly express surface markers associated

with mesenchymal stem cells (W8B2, CD29, CD73 and CD105) (Fig. 1D). Regarding CD90 and

CD106, two others mesenchymal markers, W8B2+ CSCs showed very little expression. W8B2+

cells were negative for hematopoietic lineage markers (CD34and CD133), CD45, excluding the

possible contribution of bone marrow cells and mast cells, and CD117, a marker of another

type of cardiac stem/progenitor cells. (Fig. 1D).

At gene level, W8B2+ cells showed strong expression of early specific cardiac transcription

factors GATA4 and MEF2C but not Nkx2.5. They did express connexin 43 transcript but lacked

expression of cardiac-specific structural genes ACTC1, TNNT2, b-MHC (Fig. 1E). At the protein

level, immunostaining show that W8B2+ cells did express GATA4 and connexin-43 but no

specific labelling of Nkx2.5 was detected (Fig. 1F).

BKCa current can be recorded and identified in W8B2+ CSCs Ionic current recordings were performed on W8B2+ CSCs using patch-clamp in the whole cell

configuration. Representative traces, shown in Fig. 2, exhibit voltage–dependent currents

ith ois os illatio s du i g st o g depola izatio s et ee + a d + V Fig. Aa . Accordingly, the I/V curve obtained by voltage-ramps ranging from -110 to +110 mV, shows a

strong outward going rectification with a significant increase in noise at high depolarization

voltages (Fig. 2B). This current signature, which is characteristic for BKCa current, was present

in 8 out of 9 human W8B2 progenitor cells. When cells were superfused with 10 µM paxilline

(a BKCa selective blocker the out a d u e t as de eased a d ois u e t os illatio s were abolished (Fig. 2Ab, 2B and 2C), as expected for BKca inhibition. Similar inhibitory effect

was obtained with 5 mM TEA (not shown, n = 3).

W8B2+ CSCs express BKCa channel at both transcriptional and protein levels To investigate the molecular identity of the functional ionic channel in W8B2+ CSCs, gene

expression was examined by RT-PCR using the human gene-specific primers targeting genes

for BKCa channel (Table 1). Fig. 3A shows the images of RT-PCR products corresponding to

gene expression of ion channels. A remarkable expression of KCNMA1 gene (coding for BKCa)

was detected. Atrial tissue was used as positive control and GAPDH as reference. At the

protein level, western blot analysis demonstrated an abundant expression of the ionic channel

responsible for BKCa current using the specific antibody anti-KCa1.1 (Fig.3B). Atrial tissue was

used as positive control and vimentin as reference.

Inhibition of BKCa channel by paxilline decreases cell proliferation and cell cycling

progression in a concentration-dependent manner

Résultats

182

To evaluate the role of BKCa channel in cell proliferation, paxilline was used as a specific

blocker of this channel at different concentrations (1, 3 and 10 µM). Whereas paxilline 1 µM

had no effect, the cell proliferation was progressively inhibited by the application of paxilline

at 3 µM and 10 µM until day 9 of culture (Fig. 4A). The inhibitory effect of paxilline 10 µM was

stronger than that of 3 µM, an effect which reached statistical significance from day 4. The

paxilline blocking effect of BKCa on cell cycling progression was evaluated by flow cytometry

analysis in human W8B2+ CSCs. Fig 4B illustrates an example of the mean percentage values

of li g phases i o t ol ‰ DM“O as ehi le o i ells t eated ith pa illi e a d µM) at day 5, showing a shift from cells in S and G2 phases into G1 phase. Taken together,

these experiments show that 10 µM paxilline significantly increased the fraction of G1

population from 56.9 % to 72.4 % (p<0.01) and from 59.8 % to 71.4 % (p<0.01; Fig 4C) at day

5 and 6, respectively. In contrary, fraction of S+G2 population was significantly decreased from

39.8% to 22.8% (p<0.001) at day 5 and from 37.6 % to 24.4 % (p<0.05) at day 6 after treatment

with 10 µM of paxilline (Fig 4C). At 3 µM, the effect of paxilline was lower in amplitude but

reached statistical significance versus control only for the S+G2 population. These results

suggest that BKCa participates in G1/S cell cycling progression in human W8B2+ CSCs.

Inhibition of BKCa channel by paxilline decreases self-renewal in human W8B2+ CSCs

To investigate further the role of BKCa channel, paxilline was used at different concentrations

(1, 3 and 10 µM) to block the activity of BKCa channel on self-renewal of W8B2+ CSCs. Paxilline

at 1, 3 and 10 µM significantly reduced the number of colony-forming unit W8B2+ CSCs after

ten days of culture (Fig. 5). This decrease reached about 15 % (p<0.05), 34 % (p<0.001) and

50% (p<0.001) with 1 ,3 and 10 µM of paxilline, respectively. This result suggests that BKCa

channel is important in the stem cells self-renewal process by which stem cells divide to

perpetuate their pool throughout life and maintain their undifferentiated state.

Inhibition of BKCa channel by paxilline did not affect cell migration To examine whether BKCa channel can regulate cell migration in human W8B2+ CSCs, wound

healing assay was conducted in cells treated with different concentrations of paxilline. Figure

A sho s the ou d heali g i ages i o t ol ‰ DM“O as ehi le a d pa illi e o ditio s (1, 3 and 10 µM). For each condition, images were taken just after the wound (time 0h) and

after 7 h of migration. To estimate the cell migration, nuclei of cells were fixed and colored

with DAPI (green) after 7 hours as illustrated (fig. 6A, right). Fig. 6B illustrates the ratio of

migrated cells into the acellular area after 7 h in the different treatments. Blockade of BKCa

channels with paxilline did not impact cell migration compared to the control (ns) suggesting

that BKCa channel may not be involved in cell migration regulation of W8B2+ CSCs.

DISCUSSION

In the present study, human W8B2+ cardiac progenitor cells isolated from right atrial

specimens highly expressed surface markers associated with mesenchymal stem cells (W8B2,

CD29, CD73, and CD105) but not hematopoietic markers. Moreover, human W8B2+ CSCs

exhibited an important clonogenic efficiency. These human cardiac stem cell properties

assessed in our experimental conditions are consistent with those reported previously [1].

Résultats

183

In stem cells, the presence of BKCa current has been reported in some cell types like human

embryonic stem cells [7], human mesenchymal stem cells from different origins [8-10], cancer

stem cells [11] and human cardiac progenitor cells [12]. In the present study,

electrophysiological properties of W8B2+ CSCs, paxilline sensitivity, RT-PCR and Western

immunoblot analysis, all converge on the idea that BKCa current exists in these cells and that

the ionic channel responsible for this current is encoded by KCa1.1 gene.

In non-excitable cells, high-conductance calcium-activated potassium channel has been

reported to be involved in the regulation on cell proliferation. For example, blocking BKCa by

the selective channel blocker inhibits cell proliferation in human endothelial cells [13-14], in

mouse ES cells [7] and in human preadipocytes [15]. In human cardiac fibroblast, BKCa

inhibition by paxilline results in a cell proliferation reduction [16]. Other studies report that

inhibition of BKCa has little effect on cell proliferation in human bronchial smooth muscle cells

[17], or MCF-7 cells [18]. Recently it was reported that blocking of KCa1.1 in normal myoblasts

induced an increase in proliferation [6], suggesting that regulation of cell proliferation by BKCa

channels may be cell-type dependent. In the present study, we report that inhibition of BKCa

by paxilline significantly reduces human W8B2+ CSCs proliferation as well as the proportion of

cells in the G0/G1 phase of the cell cycle. This result is in agreement with that obtained on

human cardiac c-kit+ progenitor cells [19]. Interestingly, it has been reported that membrane

potential hyperpolarized during the cell cycle and that potassium conductance increased

during progress from G1 to S phase in rat mesenchymal stem cells from bone marrow [19].

Accordingly, the effects that we have obtained by inhibiting BKCa could be due to changes in

the membrane potential during the cellular cycle.

The present study also shows that blocking BKCa channels with paxilline decreased the

number of colony-forming unit fibroblasts (CFU-Fs) suggesting that BKCa channel could be

involved in the process of self-renewal and differentiation of W8B2+ CSCs. Self-renewal

consists in cell division with maintenance of the undifferentiated state. This requires cell cycle

control and often maintenance of multipotency or pluripotency, depending on the stem cell

type [21]. We show that mesenchymal stem cells are clonogenic when plated at low densities.

The number and the morphology of the colonies formed by a fixed number of input cells

provide preliminary information about the ability of progenitors to differentiate and

proliferate.

Ca2+-activated potassium channels, including BKCa, are involved in the regulation of

differentiation of several cell types. Similarly to what was reported on cell proliferation (see

above), BKCa modulation can enhance or inhibit the differentiation process depending on the

cell type. It has been shown for example that inhibition of potassium channels influences the

differentiation of endothelial progenitor cells (EPCs) from human peripheral blood [22]. These

cells strongly express BKCa channel, which inhibition disrupts their differentiation into mature

endothelial cells. On another hand, inhibition of BKCa with paxilline negatively regulates the

differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) suggesting

the essential role of BKCa in maintaining bone marrow physiological function [23]. Further

study is required to find out how BKCa channel may contribute to cellular differentiation in

human W8B2+ CSCs.

Résultats

184

In addition to differentiation and proliferation, previous studies have demonstrated that the

Ca2+-activated potassium channel is closely involved in cell migration but its implication is

again cell-type specific. For example, KCa1.1 channels were shown to be required for

migration in gloma cells, but not in microglia cells [24-25]. Interestingly, blockade of BKCa by

paxilline inhibited cell migration in human cardiac c-kit+ progenitor cells [19]. In the present

study, inhibition of BKCa did not affect W8B2+ CSCs migration suggesting that the regulation

of mobility differs between the two types of human cardiac progenitor cells. This discrepancy

could be due to the various calcium signaling parameters such as amplitude and frequencies

of calcium oscillations, which regulate directly and/or indirectly BKCa channel (preliminary

data not shown). An estimation of calcium subcellular domains within cells is required to

investigate further this hypothesis, for example using green fluorescence protein (GFP)-linked

calcium calmoduline (CaM) probes [25].

In conclusion, we demonstrate that BKCa channel is likely a key regulator of proliferation and

self-renewal of human cardiac stem cells and provides a basis for a better understanding of

the physiology of these cells. Further investigations are required to open new avenues for

cellular therapeutic strategies since W8B2+ cells have been described as having powerful

regenerative and functional effects when injected into the hearts of rats after attack [1].

Figure Legends

Figure 1. Growth and phenotype characteristics of W8B2+ CSCs. (A) Cell morphology at

passage 2 of isolated W8B2+ cells. (B) colony-forming unit fibroblasts (CFU-Fs) assay after 10

days post-plating. (C) Proliferation assay of W8B2+ cells cultured for 9 days. (n=3). D: day. (D)

Percentage of positive cells for the indicated surface markers in W8B2+ CSCs determined by

flow cytometry. (n=3). (E) Gene expression of cardiac markers in W8B2+ CSCs determined by

RT-qPCR (n=3). Ct: cycle threshold. Bar graph represents the 1/Ct ratio for each gene. A value

of /Ct hi h is ≤ . Ct= o espo ds to a egligible gene expression. (F)

Immunostaining of cardiac markers in W8B2+ CSCs. Left: GATA4; Center: Nkx2.5; Right:

connexin 43. Nuclei are marked in blue with TOPRO staining. (n=3). Scale bare = 50 µm.

Figure 2. Inhibition of membrane current by BKCa ion channel blocker in W8B2+ CSCs. (A)

Voltage dependent current recorded in whole cell configuration during 2 s pulses at potentials

from -110 to +90 mV (10 mV increment) with a holding potential of -80 mV in the absence (Aa)

and in the presence (Ab) of 10 µM paxilline (arrow indicates 0 current level). (B) I/V curves

obtained during a ramp protocol stimulation from -110 to 110 mV (duration 2 sec) in the

absence and in the presence of 10 µM paxilline. In A and B, note the presence of large noisy

oscillations (typical signature of BKCa channels) on the current traces obtained for high

positive potentials in control condition. (C) Current density estimated at +110 mV in control

and in the presence of paxilline (10 µM) (P<0.001, n= 5).

Figure 3. Molecular scanning of functional channel in W8B2+ CSCs. (A) Characterization of the

expression of KCNMA1 mRNA in cultured W8B2+ cells by RT-PCR. Expression of KCNMA1

mRNA was analyzed in cultured W8B2+ Cells using RT-PCR primers specific. Amplification

products were resolved on 2% agarose gels alongside a X174 RF DNA/HaeIII fragments

http://context.reverso.net/traduction/anglais-francais/demonstrated+that

Résultats

185

ladder marker. GAPDH cDNA was used as housekeeping. cDNA extracted from cardiac atrial

tissue was used as a positive control and the negative control consisted of the PCR reaction

without the addition of the template. Fragment of the expected molecular size indicated the

expression of KCNMA1 in cultured W8B2+ Cells. The top and the down arrows indicate

amplicons with 310 and 271-281 bp, respectively. (B) Characterization of the expression of

KCa1.1 protein in cultured W8B2+ cells. Western blotting analysis were performed from cell

l sates o tai i g o μg of total p otei s. As sho , W B + cells displayed a band with

a molecular mass of 100 kDa approximately, as expected for KCa1.1 protein channel.

Figure 4. Effect of BKCa inhibition by paxilline on cell proliferation and cell cycling in W8B2+

CSCs. (A) Cell proliferation assay expressed as percentage of cell number obtained with vehicle

(control) or paxilline at different concentrations. (n=3,*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs.

control, Two-Way ANOVA with Bonferroni post-test).

(B) Examples of flow cytometry graphs with percentage of cycling phases in cells treated with

vehicle (control, left) or paxilline (3 (middle) and 10 µM (right)) at day 5 post treatment. (C)

Distribution of cell cycle phases in cells treated with vehicle (control) or paxilline at 3 and 10

µM after 5 and 6 days post-plating. (n=3,*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. control, Two-Way

ANOVA with Bonferroni post-test).

Figure 5. Effect of BKCa inhibition by paxilline on self-renewal of W8B2+ CSCs. (A) Images of

colony-forming unit W8B2+ CSCs in control or paxilline conditions after 10 days post-plating.

(B) Number of CFU-Fs in cells treated with vehicle (control) or paxilline at different

concentrations for 10 days post-plating. (n=3,*p<0.05, ***p<0.001 vs. control, Nonparametric

One-Way ANOVA).

Figure 6. Effect of BKCa inhibition by paxilline on cell migration in W8B2+ CSCs. Cell images

with a cellular wound at time 0 (left) and after 7 hours (right) in cells treated with vehicle

(control) or paxilline at different concentrations. Green dots represent nuclei of cells fixed and

colored with DAPI after 7 hours. (B) % of migrated cells in W8B2+ CSCs treated with vehicle

(control) or paxilline at different concentrations. (n=3, Nonparametric One-Way ANOVA).

Scale bare = 100 µm.

ACKNOWLEDGMENT

This work has benefited from the facilities and expertise of ImageUP (University of Poitiers)

and was supported by AFM.

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Résultats

187

22.Ye, G., Guan, H., Karush, J., Wang, F., Xu, X., Mao, H., Huang, X., Yang, X., Peng, P., Ba, Y., et al. (2014). Effects of Ca2+-activated potassium and inward rectifier potassium channel on the differentiation of endothelial progenitor cells from human peripheral blood. Mol Biol Rep 41, 3413–3423. 23.Zhang, Y.-Y., Yue, J., Che, H., Sun, H.-Y., Tse, H.-F., and Li, G.-R. (2014). BKCa and hEag1 channels regulate cell proliferation and differentiation in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J. Cell. Physiol. 229, 202–212. 24.Schilling, T., Stock, C., Schwab, A., and Eder, C. (2004). Functional importance of Ca2+-activated K+ channels for lysophosphatidic acid-induced microglial migration. Eur. J. Neurosci. 19, 1469–1474. 25.Weaver, A.K., Bomben, V.C., and Sontheimer, H. (2006). Expression and function of calcium-

activated potassium channels in human glioma cells. Glia 54, 223–233.

26.Li, C.J., Heim, R., Lu, P., Pu, Y., Tsien, R.Y., and Chang, D.C. (1999). Dynamic redistribution of calmodulin in HeLa cells during cell division as revealed by a GFP-calmodulin fusion protein technique. J. Cell. Sci. 112 ( Pt 10), 1567–1577.

Table 1: Human gene-specific primers for RT-PCR and RT-qPCR

Gene name fo a d ’ ’ e e se ’ ’

GAPDH AAGGTCATCCCTGAGCTGAA TGACAAAGTGGTCGTTGAGG

MEF2C AAGAAGGAGATTTGTTTGGAGG CTTTGTAAATGTCACCTGTCTG

GATA4 CCCAATCTCGATATGTTTGAC CGTTCATCTTGTGGTAGAGG

TNNT2 CTGCTGTTCTGAGGGAGAGC CACCAAGTTGGGATGAACG

ACTC1 CCTTCATTGGTATGGAATCTG AATCTTCATGGTGCTTAGGAG

β-MHC GAGCTACGGGTTCCCCTCT GGAAGCTCTGCTACCCCTTTT

NKX2.5 AAAGAAAGGGTGTGAACTGC CGCACAGTAATGGTAAGGGA

KCNMA1 CCTGCAGCGAAGTATCATCA ACTCGAAGTGAAGCTGCCAT

Connexin43 GGGCGTTAAGGATCGGGTTAAGG GTTGGTGAGGAGCAGCCATTGAA

Résultats

188

Figure 1

Résultats

189

Figure 2

Figure 3

Résultats

190

Figure 4

Résultats

191

Figure 5

Figure 6

Résultats

192

4 BKCa et oscillations calciques dans les CSCs W8B2+ différenciées

En plus de so ôle da s la p olif atio et l’auto-renouvellement des CSCs W8B2+, le

canal BKCa semble joue u ôle su l’a ti it al i ue au ou s de la différenciation (figure R-

50).

300 600 900 12000.0

0.5

1.0Paxilline 1 µM

Temps (s)

F/F0

(U.A

)

300 600 900 12000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Paxilline 10 µM

Temps (s)

F/F0

(U.A

)

Figure R-50 : Effet de la paxilline à 1 µM (A) et à 10 µM (B) su l’a ti it al i ue spo ta e enregistrée sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. Les graphes illustrent les


GCaMP à un temps donné, F0 : fluorescence de base émise par la GCaMP).U.A : unité arbitraire.

B

A

Résultats

193

La perfusion de 1 µM de paxilline (inhibiteur spécifique du canal BKCa) à t = 700 s

(figure R-50A), ’i duit au u ha ge e t su l’a plitude (figure R-51A), la fréquence (figure

R-51B), l’ai e (figure R-51C) , la durée des oscillations calciques (figure R-51D), le TTP (figure

R-52A), le TTR (figure R-52B), la pente 1 (figure R-52C) , la pente 2 (figure R-52D) et le

pou e tage du te ps d’a ti it (figure R-52E).

Cependant, à 10 µM (figure R-50B) la pa illi e di i ue sig ifi ati e e t l’a plitude

(diminution de 83,3%, figure R-51A), la fréquence (diminution de 83,3%, figure R-51B , l’ai e

(diminution de 81,3%, figure R-51C) et la durée (diminution de 67,7%, figure R-51D) des

oscillations calciques par rapport au contrôle.

De plus, la figure R-52 montre que le traitement la paxilline à 10 µM, provoque une

diminution significative (64.1%) du TTR (figure R-52B), de la pente 1 (81,4%) (figure R-52C), et

du pou e tage du te ps d’a ti it % (figure R-52E) mais ne modifie pas le TTP (figure R-

50A) et la pente 2 (figure R-52D).

Résultats

194

Contrô

le

Pax 1

µM

Pax 10

µM0.0

0.5

1.0

1.5

n = 12

ns

*

n = 10 n = 6

Am

plitu

de (U

.A)

Contrô

le

Pax 1

µM

Pax 10

µM0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

ns

ns

**

n = 4 n = 3 n = 4

Fréq

uenc

e (p

ic/m

in)

Contrô

le

Pax 1

µM

Pax 10

µM0

20

40

60

80

**

ns

n = 12 n = 6 n = 10

Aire

(U.A

.s)

Contrô

le

Pax 1

µM

Pax 10

µM0

20

40

60

80

100 ns

**

n = 12 n = 9 n = 6

Dur

ée (s

)

A B

C D

Figure R-51 : Effet de la pa illi e et µM su l’a plitude (A), la fréquence (B), l’ai e (C) et la

durée (D) des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de

différenciation. U.A : unité arbitraire. (N = 2). ns : non significatif, N : nombre de patients à partir

desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : o e d’ e e ts os illatio s e egist s. *p< . , **p< . s. Co t ôle. L’a al se statisti ue est effe tu e pa u test o e a ANOVA suivi par un post test de Bonferroni.

Résultats

195

Contrô

le

Pax 1

µM

Pax 10

µM0

20

40

60

80

ns

*

ns

n = 4 n = 3 n = 4

% te

mps

d'a

ctiv

ité

E

Contrô

le

Pax 1

µM

Pax 10

µM0

10

20

30

40

50

ns

ns

n = 12 n = 5 n = 10

TT

P (

s)

Contrô

le

Pax 1

µM

Pax 10

µM0

20

40

60

80ns

**

n = 12 n = 9 n = 6

TT

R (

s)

Contrô

le

Pax 1

µM

Pax 10

µM0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

ns

*

n = 11 n = 6 n = 7

Pen

te 1

U.A

/s

Contrô

le

Pax 1

µM

Pax 10

µM

-0.020

-0.015

-0.010

-0.005

0.000

nsns

n = 12 n = 10 n = 6

Pen

te 2

U.A

/s

A B

C D

Figure R-52 : Effet de la paxilline (à 1 et 10 µM) sur le TTP (A), le TTR (B), la pente 1 (C), la pente 2

(D) et le pou e tage du te ps d’a ti it (E) des oscillations calciques spontanées enregistrées sur

les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. U.A : unité arbitraire. (N = 2). ns : non significatif,

N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : nombre

d’ e e ts os illatio s e egist s. *p< . , **p< . s. Co t ôle. L’a al se statisti ue est effectuée par un test one way ANOVA suivi par un post test de Bonferroni.

Résultats

196

Chapitre III : Effets de la sphingosine 1-phosphate sur les propriétés des CSCs

W8B2+

1 Contexte bibliographique

1.1 S1P et signalisation

La sphingosine 1-phosphate (S1P) est un lysophospholipide (figure H-20) circulant qui

induit plusieurs réponses cellulaires comme la prolifération, la migration, la contraction et la

mobilisation du calcium intracellulaire (Payne et al., 2002; Spiegel and Milstien, 2003). Dans

le plas a, la o e t atio e “ P peut attei d e jus u’à µM. Cette s tio p o ie t

majoritairement des plaquettes, des mastocytes et des érythrocytes. Dans la lymphe, la

p odu tio de la “ P est p i ipale e t assu e pa l’e doth liu e i o M .

La S1P exerce la majorité de ses effets biologiques via l’a ti atio de ses epteu s

nommés S1PR1-5. Ces epteu s ou epteu s EDG pou e dothelial diffe e tiatio ge e ,

appartiennent à la famille des récepteurs couplés aux protéines G ou GPCRs. Ils ont une forte

affinité pour la S1P (Kd = 2- M et so t e p i s de faço diff e tielle d’u t pe cellulaire

à l’aut e. La sig alisatio di e pa es i epteu s est o ple e a es de ie s

œu e t e s e gie ou e a tago is e e s’asso ia t a e des p ot i es G disti tes .

L’effet iologi ue o se est la sulta te de l’e se le des chaînes de transduction

activées. Bien que la signalisation médiée par la S1P via ses cinq récepteurs est bien

caractérisée, le rôle de la S1P en tant que second messager intracellulaire a été évoqué

(Olivera et al., 2003; Payne et al., 2002).

Les S1PR1, S1PR2 et S1PR3 sont exprimés de manière ubiquitaire et assurent de

o euses fo tio s o e l’a gioge se, la eu oge se, la ig atio , la gulatio du

rythme cardiaque, la survie des cardiomyocytes etc. Quant aux S1PR4 et S1PR5, leurs

expressions sont restreintes à certains types cellulaires. Le S1PR4 est exprimé dans les cellules

immunitaires, les cellules musculaires lisses bronchiques alors que le S1PR5 se trouve exprimé

dans les cellules immunitaires et les cellules neuronales.

Figure H-20 : Structure chimique de la sphingosine 1-phosphate. D’ap s Rose , H et al. .

Résultats

197

1.2 S1P et tissu cardiaque

Pa i les i epteu s à la “ P, le œu e e p i e t ois ; le S1PR1, le S1PR2 et le

S1PR3. De par leur expression et localisation ces récepteurs sont impliqués dans différentes

fonctions cardiaques. En effet, dans les cardiomyocytes, on retrouve les récepteurs S1PR1,

S1PR2 et S1PR3 avec une prédominance du S1PR1 (Means et al., 2008; Zhang et al., 2007).

L’a ti atio de es epteu s da s les a dio o tes est asso i e au th e et contractilité

cardiaque (Budde et al., 2002; Sanna et al., 2004), à l’i du tio d’h pe t ophie (Robert et al.,

2001), à la p ote tio de l’is h ie (Jin et al., 2004; Zhang et al., 2007) et à la mobilisation du

calcium intracellulaire (Egom et al., 2016).

Les cellules musculaires lisses, quant à elles, expriment les S1PR1, S1PR2 et S1PR3 avec

une prédominance des récepteurs S1PR2 et S1PR3 (Alewijnse et al., 2004; Kluk and Hla, 2001).

L’a ti ation de ces récepteurs dans le muscle lisse est associée à la vasoconstriction (Ryu et

al., 2002) et la migration (Alewijnse et al., 2004).

Dans les cellules endothéliales vasculaires, on retrouve majoritairement le S1PR1 et

des niveaux faibles d’e p essio de S1PR2 et de “ PR . L’a ti atio de es p teu s est

asso i e à l’a gioge se (Allende et al., 2003), à la migration (Wang et al., 1999a), l’adh e e

(Windh et al., 1999) et l’i t g it de l’e doth liu (Brindley et al., 2002; Garcia et al., 2001).

Les fibroblastes cardiaques expriment majoritairement le S1PR3 et à des niveaux

faibles des récepteurs S1PR1 et S1PR2 (Landeen et al., 2008). La signalisation par ces

récepteurs régule la prolifération des fibroblastes cardiaques (Benamer et al., 2011; Gellings

Lowe et al., 2009).

En plus des rôles physiologiques cardiaques, il a été montré que les quantités de S1P

circulante augmentent chez les patie ts attei ts d’i suffisa e a dia ue (Polzin et al., 2017),

d’i fa tus du o a de aigu (Klyachkin et al., 2015) et de fibrose cardiaque (Takuwa et al.,

2013). La “ P est aussi i pli u e da s d’aut es pathologies de t pe i fla atoi es,

immunitaires, métaboliques ou encore cancéreuses (Maceyka et al., 2012).

Résultats

198

1.3 S1P et cellules souches

Chez la souris, il a été montré que les cellules souches mésenchymateuse (CSMs) de la

moelle osseuse secrétaient la S1P et que cette dernière stimulait la prolifération des cellules

satellites du muscle squelettique (Sassoli et al., 2014).

D’aut es tudes i di ue t ue la “ P pou ait sti ule la p olif atio et la ig atio

des cellules satellites(Calise et al., 2012; Donati et al., 2007) et des cellules souches

mésenchymateuse de la moelle osseuse (Lu et al., 2015; Price et al., 2015). La S1P participe

également à la régulation de la différenciation des CSMs murines de la moelle osseuse. En

effet, la S1P améliorait la différenciation des CSMs murines en adipocytes, en ostéoblastes et

en cellules endothéliales vasculaires (Lu et al., 2015; Price et al., 2015).

Chez l’Ho e, la “ P joue u ôle i po ta t da s la gulatio de la p olifération, de

la différenciation et la migration. Certaines études montrent que la S1P intervient dans la

survie cellulaire des CSEs humaines (Inniss and Moore, 2006) et module la migration des CSMs

humaines de la moelle osseuse (Kong et al., 2014). De plus, la S1P oriente la différenciation

des CSMs du tissu adipeux vers un phénotype musculaire lisse (Nincheri et al., 2009) et

favorise la différenciation des CSMs humains du cordon ombilical vers un phénotype

cardiaque (Zhao et al., 2011).

2 Co te te de l’ tude

La “ P gule l’a ti it a dio-vasculaire (via ses récepteurs) par la médiation de voies

de signalisation intervenant dans la régulation du tonus vasculaire et dans l’i t g it de la

a i e e doth liale. Il a lio e la sista e des a dio o tes à l’is h ie-reperfusion.

Cependant, le rôle de ce lysophospholipide dans la régulation des propriétés des cellules

sou hes a dia ue ’a pas t tudi .

Nous nous sommes donc focalisés dans notre étude sur les points suivants :

Ca a t isatio de l’e p essio des i epteu s à la “ P da s les C“Cs W B +

Effet de la S1P utilisé à 1µM (concentration plasmatique normale) sur les propriétés

d’auto-renouvellement, de prolifération et de migration des CSCs W8B2+.

Implication des récepteurs à la S1P (exprimés dans CSCs W8B2+) dans la régulation

des propriétés fondamentales de ces cellules (auto-renouvellement, prolifération et

migration).

Résultats

199

3 Résultats

3.1 P ofil d’e p essio des i epteu s à la S P da s les CSCs W B +

La S1P assure la majorité de ses fonctions en agissant sur ces cinq récepteurs qui sont

exprimés de manière différente selon le tissu et le type cellulaire. Pour identifier les récepteurs

à la S1P (S1PR) exprimés dans les CSCs W8B2+, nous avons vérifié la présence ou non des

transcrits codant pour les 5 récepteurs par la technique de RT-PCR.

Les résultats obtenus montrent que les CSCs W8B2+ expriment les transcrits codant

pour les récepteurs S1PR1 (variant 1) et S1PR2 (figure R-53). Le tissu atrial humain utilisé

comme contrôle positif, présente aussi une expression des transcrits codant pour S1PR1

(variant 1 et 2) et S1PR2.

La figure R-54 A, montre que les CSCs W8B2+ expriment faiblement les transcrits

codant pour le S1PR3 comparées aux cellules issues de glioblastome humain (1) utilisées

comme contrôle positif. Concernant le S1PR4, les transcrits codant pour ce récepteur sont

totalement absents dans les CSC W8B2+ et le tissu atrial humain comparés aux cellules issues

de glioblastome humain (2).

Figure R-53 : Ca a t isatio de l’e p essio des ARN oda t pou les epteu s à la sphi gosi e 1 phosphate de type 1 (S1PR1) et de type 2 (S1PR2) dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR. GAPDH est

utilisé comme gène de référence. Les ADNc issus du tissu atrial cardiaque humain sont utilisés

o e o t ôle positif et l’eau o e o t ôle gatif.

Résultats

200

Le S1PR5 quant à lui, présente une faible expression des transcrits codant pour le

variant 1 du S1PR5 et aucune expression des transcrits codant pour le variant 2 du S1PR5 dans

les CSCs W8B2+ (figure R-54 B). Le tissu atrial humain ne présente aucune expression des

Figure R-54 : Ca a t isatio de l’e p essio des ARN oda t pou les epteu s à la sphi gosi e 1 phosphate de type S1PR3 et de type S1PR4 (A) et de type S1PR5 (B) dans les CSCs W8B2+ par RT-

PCR. GAPDH est utilisé comme gène de référence. Les ADNc issus des cellules de glioblastome

hu ai et so t utilis s o e o t ôle positif et l’eau o e o t ôle gatif.

A

B

Résultats

201

transcrits codant pour les variants 1 et 2 du S1PR5 comparé aux cellules issues de glioblastome

humain (1) utilisées comme contrôle positif.

Parallèlement, les résultats de RT-qPCR (figure R-55) montrent une expression des

transcrits codant pour les récepteurs S1PR1 et S1PR2 (avec une plus forte expression du

S1PR2), une très faible expression des transcrits codant pour les S1PR3 et S1PR5 et aucune

expression du récepteur S1PR4.

3.2 Effet de la S1P sur les capacités prolifératives des CSCs W8B2+

Afi d’ alue le ôle de la “ P da s le p o essus de p olif atio ellulai e, les C“Cs

W8B2+ ont été cultivées pendant plusieurs jours en présence de la S1P utilisée à une

o e t atio de μM. La figure R-56 montre que la S1P diminue significativement la

prolifération cellulaire par rapport au contrôle. Cette diminution débute à partir du 3ème jour

a e u e aisse de % et pe du e jus u’au ème jour (avec une baisse de 31,4%). Le

a i u d’i hi itio se p oduit au ème jour de culture avec une baisse de 48,6% par rapport

au contrôle.

Figure R-55 : Profil d’e p essio g i ue des i epteu s à la “ P “ PR , “ PR , “ PR “ PR et S1PR5) dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR. (n = 2). Le Profil d’e p essio des g es est représenté en 2-ΔCt par rapport au gène de référence GAPDH (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle

seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n :

représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

S1PR1 S1PR2 S1PR3 S1PR4 S1PR50

50

100

150

2- Ct v

s G

AP

DH

(x10

4 )

Résultats

202

Cette diminution de la prolifération suite au traite e t a e la “ P ’est pas due à une

mortalité cellulaire comme le montre la figure R-57.

Figure R-56 : Test de prolifération cellulaire des CSCs W8B2+ par comptage cellulaire en présence

de la S1P (1µM) ou en situation contrôle (méthanol utilisé comme véhicule) pendant 9 jours. (n =

5). Le taux de prolifération cellulaire est exprimé en pourcentage par rapport au nombre cellulaire

obtenu dans le contrôle. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de

la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

*p< . , **p< . , ***p< . s. o t ôle. L’a al se statisti ue est effe tu e pa u test Anova

double entrée suivi par un test de Bonferroni.

J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J90

20

40

60

80

100 ContrôleS1P (1 µM)

*

** ****** *** ***

**


% d

u no

mbr

e ce

llula

irepa

r rap

port

au c

ontrô

le

J5 J6 J7 J8 J9

0

50

100Contrôle positifContrôleS1P (1 µM)


% d

e m

orta

lité

cellu

laire

Figure R-57 : Test de viabilité cellulaire des CSCs W8B2+ par cytométrie en flux en présence de S1P

(1 µM) ou en situation contrôle (méthanol utilisé comme véhicule) cultivées pendant 9 jours. (n =

1). Le taux de mortalité cellulaire est exprimé en pourcentage par rapport au contrôle positif (CSCs

W8B2+ chauffées à 95°C pendant 10 minutes).

Résultats

203

En effet, le pourcentage des cellules mortes suite au traitement à la S1P est compris

entre 0,2 et 1,5 % par rapport au contrôle positif. Dans les cellules non traitées (contrôle), le

pourcentage des cellules mortes est également faible et reste compris entre 0.2 et 1,6%.

Afi de ifie si l’effet a tip olif atif de la “ P est li à u lo age da s la p og essio

du cycle cellulaire, nous avons évalué la répartition des différentes phases du cycle cellulaire.

La figure R-58 A, illustre un exemple des valeurs (exprimées en pourcentage) des différentes

phases du le ellulai e e o t ôle et ap s jou s de t aite e t à la “ P μM .

G1 S G2 G1 S G2 G1 S G20

20

40

60 ContrôleS1P (1 µM)

J6 J7 J8

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns


% d

es p

hase

s du

cycl

e ce

llula

ire

Figure R-58 : Analyse du cycle cellulaire par cytométrie de flux en présence de la S1P (1 µM) ou en

situation contrôle (méthanol utilisé comme véhicule). (A) Graphs de cytométrie en flux montrant

la distribution des phases du cycle cellulaire (G1, S et G2) dans les CSCs W8B2+ en présence de la

S1P (1µM) ou en situation contrôle au 6ème jour post-traitement. (n = 3). (B) Pourcentages des

phases du cycle cellulaire (G1, S et G2) dans les CSCs W8B2+ en présence de la S1P (1µM) ou en

situation contrôle à j 6, j 7 et j 8 post-traitement. Chaque barre représente la valeur moyenne ±

S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont

issues les CSCs W8B2+. s s. o t ôle. L’a al se statisti ue est effe tu e pa u test A o a dou le entrée suivi par un test de Bonferroni.

A

B

Résultats

204

Les sultats o te us i di ue t ue la “ P ’alt e pas la pa titio des diff e tes

phases du le ellulai e G , “ et G . E effet, au u e diff e e sig ifi ati e ’est o se e

à j 6, j 7 et j 8 post-traitement à la S1P comparativement au contrôle.

3.3 I pli atio des S PR da s l’effet a tip olif atif de la S P o se v da s les CSCs W8B2+

Da s le ut d’ide tifie les t pes de epteu s à la “ P “ PR i pli u s da s l’effet

antiprolifératif observé suite au traitement avec la S1P, nous avons inhibé grâce à des

antagonistes très spécifiques les S1PR exprimés dans les CSCs W8B2+. Les agents

pharmacologiques W146, JTE013 et BML241 ont été choisis pour inhiber respectivement et

spécifiquement les récepteurs S1PR1, S1PR2 et S1PR3. La figure R-59 confirme une fois de

plus l’effet a tip olif atif de la “ P utilis e à µM et e i à pa ti du ème de culture (avec une

i hi itio de , % . De plus, la p se e d’a tago istes des deux récepteurs de types S1PR1

et “ PR W et JTE , fo te e t e p i s da s les C“Cs W B , e odifie pas l’effet

a tip olif atif de la “ P. L’i hi itio du “ PR fai le e t e p i da s les C“Cs W B +) par

l’a tago iste BML , ai tie t aussi l’effet a tip olifératif de la S1P.

J1 J4 J6 J80

20

40

60

80

100ContrôleS1PS1P+JTE013S1P+W146S1P+BML241

ns

**

***

*

ns

******

***

ns

****

***

ns

** ***

*


% d

u no

mbr

e ce

llula

irepa

r rap

port

au c

ontrô

le

Figure R-59 : Test de prolifération cellulaire des CSCs W8B2+ par comptage cellulaire en présence de

la S1P (1µM), S1P (1µM) + JTE013 (1µM), S1P (1µM) + W146 (1µM), S1P (1µM) + BML241 (10µM) ou

en situation contrôle (méthanol utilisé comme véhicule) pendant 8 jours. (n = 3 sauf pour S1P +

BML241). Le taux de prolifération cellulaire est exprimé en pourcentage par rapport au nombre

cellulaire obtenu dans le contrôle. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur

standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs

W8B2+. *p< . , **p< . , ***p< . s. o t ôle. L’a al se statisti ue est effe tu e pa u test Anova double entrée suivi par un test de Bonferroni.

Résultats

205

3.4 Effet de la S P su les p op i t s d’auto-renouvellement des CSCs W8B2+

Da s l’opti ue d’ tudie l’effet de la “ P µM su les apa it s d’auto-

renouvellement des CSCs W8B2+, nous avons réalisé le test de formation de colonies CFU-Fs

en condition contrôle ou en présence de la S1P utilisée seule ou en présence des antagonistes

des récepteurs S1PR1 et S1PR2 (figure R-60).

La figure R-60 A et B, montre que la S1P réduit très fortement le nombre de colonies

CFU-Fs comparé au contrôle (une diminution de 81,2%). L’effet de di i utio du o e de

colonies de la S1P est aussi observé en présence des antagonistes du S1PR1 (W146) et du

S1PR2 (JTE013). Cette di i utio est de , % e p se e de l’a tago iste W et de , %

e p se e de l’a tago iste JTE .

0

5

10

15

20

25

** ** *

ContrôleS1PS1P+JTE013S1P+W146

No

mb

re d

e c

olo

nie

s

Figure R-60 : Test de formation de colonies CFU-Fs (colony-forming unit fibroblastes) dans les CSCs W8B2+. (A) Images des colonies CFU-Fs formées par les CSCs W8B2+ en présence de la S1P (1µM), S1P + JTE013, S1P + W146 ou en situation contrôle (méthanol utilisé comme véhicule) après 10 jours de culture. (B) Nombre des colonies CFU-Fs formées par les CSCs W8B2+ en présence de la S1P (1µM), S1P + JTE013, S1P + W146 ou en situation contrôle après 10 jours de culture. (n = 3). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+. *p<0.05, **p<0.01

s. o t ôle. L’a al se statisti ue est effe tu e pa u test A o a si ple e t e o -paramétrique suivi par un test de Dunnett.

A

B

Résultats

206

3.5 Effet de la S1P sur les capacités migratoires des CSCs W8B2+

Pou e a i e l’ e tuel ôle de la “ P su la ig atio ellulai e des C“C W8B2+, nous

a o s alu leu apa it ig atoi e à l’aide du test de « wound healing » ou test de blessure.

Ce test a été réalisé en présence de la S1P seul ou en présence des antagonistes des récepteurs

S1PR1 et S1PR2. Les résultats préliminaires représentés dans la figure R-61 A et B, montrent

que la S1P réduit la migration cellulaire de 27,9% après 7h par rapport au contrôle. Cependant,

e p se e des a tago istes du “ PR W et du “ PR JTE , l’effet a ti-migratoire

de la S1P semble être levé.

A

Figure R-61 : Test de migration cellulaire en « wound healing ». (A) Images cellulaires du test de

blessure à temps 0 heure (à gauche) et après 7 heures de migration (à droite) dans les CSCs W8B2+

en présence de la S1P (1µM), S1P + JTE013, S1P + W146 ou en situation contrôle (méthanol utilisé

comme véhicule). (B) Nombre des cellules ayant migré après 7 heures en présence de la S1P (1µM),

S1P + JTE013, S1P + W146 ou en situation contrôle. (n = 2). Chaque barre représente la valeur



0

20

40

60

ContrôleS1P

S1P+JTE013S1P+W146

Nom

bre

de c

ellu

les

mig

rant

es

B

Discussion

207

DISCUSSION

I-Isolement et caractérisation des CSCs W8B2+

Dans la première partie des résultats, nous avons mis en place un modèle de cellules

souches cardiaques exprimant le marqueur W8B2 (CSCs W8B2+ à pa ti d’ ha tillo s

auriculaires humains en collaboration avec le CHU de Poitiers. Ces CSCs W8B2+ isolées dans

un premier temps par tri cellulaire magnétique ne représentaient que 3% de la population

cellulaire totale. Ce faible pourcentage est proche de celui obtenu par BEARZI et al., 2007 pour

la population des CSCs c-kit+ hu ai es. Afi d’a lio e le e de e t ous a o s i s u e

étape de tri cellulaire par cytométrie de flux, plus fiable et efficace, et qui nous a permis

d’o te i u e populatio pu e de C“Cs W B + (plus de 98% de pureté).

Les CSCs W8B2+ isolées sont apa les d’auto-renouvellement et hautement

prolifératives. Elles expriment des marqueurs typiques des cellules souches

se h ateuses W B , CD , CD et CD o e l’o t d jà o t )ha g et ses

collègues (Zhang et al., 2015a). Cependant, les CSCs W8B2+ isolées dans nos conditions

expérimentales, présentent une faible expression des marqueurs mésenchymateux CD90 et

CD106. Néanmoins, une faible expression du CD90 est fréquemment observée sur les CSCs

hu ai es d’o igi e se h ateuse Rossi i et al., 1 ; Reus et al., 2016). De plus, Yang

et ses oll gues, o t o t u’au sei e des C“Ms hu ai es, l’e p essio de CD

variait selon la nature tissulaire (0,73% dans les CSMs du tissu adipeux, 7,44% dans les CSMs

du cordon ombilical, 32,04% dans les CSMs de la moelle osseuse et 65,01% dans les CSMs du

placenta) (Yang et al., 2013b). Cette diff e e d’e p essio du CD et CD , peut aussi t e

due au diff e tes sou es d’a ti o ps utilis s pou la to t ie. Les C“Cs W B + présentent

une très faible expression des marqueurs de cellules hématopoïétiques (CD34, CD45, CD133)

et du marqueur de CSCs CD117 (ou c-kit , o fi a t ai si l’o igi e se h ateuse de

notre population.

Les CSCs W8B2+ non différenciées expriment certains transcrits codant pour des

facteurs de transcription spécifiques du lignage cardiaque comme GATA4 et TBX3. GATA4 et

TBX3 ont un rôle clé dans le développement et la fonction cardiaque (Ang et al., 2016; Yang et

al., 2013a). TBX3 est essentiel dans la régulation génique et phénotypique des cellules nodales

Discussion

208

(Hoogaars et al., 2007). Les travaux de Bakker et al. ont mont ue l’i du tio de TBX3

favorisait la reprogrammation des cardiomyocytes matures de souris en cellules possédant un

phénotype nodale (Bakker et al., 2012). Co e da s d’aut es od les de ellules souches

cardiaques, les CSCs W8B2+ ’e p i e t pas tous les fa teu s de t a s iptio a dia ues tels

que GATA5, IRX4 ou encore NKX2.5. Par exemple, dans les CSCs c-kit+ humaines, seulement

0,4% des cellules sont positives pour GATA4 et NKX2.5 (Bearzi et al., 2007). Dans les CSCs Isl-

1+ fœtales hu ai es, deu populatio s a e u pou oi de diff e iatio diff e t o t t

identifiées; une population exprimant uniquement Isl-1 et une autre qui expriment Isl-1 avec

Nkx2.5 et TBX1 (Bu et al., 2009). Il est do p o a le ue l’e p ession des facteurs de

transcription cardiaques soit dépendante du type des CSCs étudié.

La nature non différencié des CSCs W8B2+ isolées dans nos conditions expérimentales

est e fo e pa l’a se e d’e p essio g i ue des st u tu es o t a tiles a dia ues

(comme par exemple ANKB, TNNI3, TNNT2).

Le œu e p i e uat e isofo es de la o e i e C , C , C et C . a e

u e dist i utio pa ti uli e selo la gio du œu Despla tez, . L’e p essio des

quatre isoformes de la connexine cardiaque (avec une prédominance de la connexine 43) est

détectée dans les CSCs W8B2+. Leu p se e sugg e u’elles pou aie t joue u ôle da s

le contact intracellulaire observé dans les niches intra tissulaires des cellules souches

cardiaques.

Le profil d’e p essio g i ue des peptides at iu ti ues NP o t e ue les C“Cs W B +

e p i e t le NP de t pe B. Ce de ie ui est u i di ateu d’i suffisa e a dia ue, a t

récemment montré comme modulateur important de la prolifération des CSCs Sca-1+ murines

(Rignault-Clerc et al., 2017).

II-P ofil d’e p essio g i ue des a au io i ues da s les CSCs W B +

L’a al se des t a s its oda t pou les a au io i ues o t e ue les C“Cs W B +

p se te t u ph ot pe de ellules o e ita les ui se t aduit pa l’a se e des t a s its

oda t pou les a au sodi ues ota e t l’isofo e a dia ue NaV1.5) et les canaux

calciques (notamment les isoformes cardiaques CaV 1.2, CaV 1.3, CaV 3.1 et CaV 3.2). Dans la

littérature, seule une petite population de CSMs humaines de la moelle osseuse présentait

des canaux sodiques tetrodotoxine (TTX) sensibles (codés par NaV1.7 dans 29% des cellules)

Discussion

209

et des canaux de type ICa.L (codés par CaV1.2 dans 15% des cellules) (Li et al., 2005).

N a oi s, u e aut e tude alis e su le e t pe ellulai e i di ue l’a se e des

transcrits codant pour le canal sodique NaV . o l e a e l’a se e des ou a t sodi ues

(Heubach et al., 2004). Dans les CSMs humaines du tissu adipeux, seulement des courants INa

ont pu être enregistrés dans une petite population de cellules (8%) (Bai et al., 2007) alors que

dans les CSMs de la veine du cordon ombilical humain, 30% des cellules présentaient des

courants INa TTX sensibles (codé par hNE-Na) (Park et al., 2007). Dans les CSC c-kit+ humaines,

des courants Na+ TTX sensibles codés par SCN3A et SCN8A ont été observés dans 61% des

cellules (Zhang et al., 2014a). Ces études suggèrent que le profil d'expression des canaux

ioniques dans les CSMs peut être tissu-spécifique.

Contrairement aux canaux sodiques, les CSCs W8B2+ montre une expression génique

de certains canaux potassiques codant pour les canaux K dépendant du voltage KV3.4 et KV4.2

(Ito), les canaux K activés par le calcium intracellulaire BKCa et SK4, les canaux K à rectification

entrante Kir2.1 et Kir6.1 et les canaux K TWIK1. Ces résultats sont en accord avec ceux décrits

dans la littérature notamment dans les CSMs humaines de la moelle osseuse où des courants

KCa (codé par KCa1.1) ont été observés (Heubach et al., 2004).

D’aut es tudes alis es da s les CSMs de la veine du cordon ombilical humain (Park

et al., o t o t l’e p essio de plusieu s ou a ts potassi ues BKCa (codé par KCa1.1)

dans 92% des cellules, Ito (codé par KV1.4 et KV4.2) dans 50% des cellules, et des courants IKir

(codé par TWIK et Kir2.1) dans 5% des cellules. En outre, aucun courant IKdr typique n'a été

enregistré, bien que les transcrits KV1.1 et KV10.1 soient détectés dans ces cellules. Dans les

CSMs humaines du tissu adipeux, des courants IKdr et BKCa ont pu être enregistrés (73% des

cellules) ainsi que des courants Ito (19% des cellules) (Bai et al., 2007). Dans les cellules

progénitrices cardiaques humaines c-kit+, plusieurs courants potassiques ont été également

caractérisés (des courants BKCa codés par KCa.1.1 (dans 86% des cellules), des courants IKir

codés par Kir2.1 (dans 84% des cellules), des courants Ito codés par Kv4.2 et Kv4.3 (dans 47%

des cellules) (Zhang et al., 2014).

III-Rôle des canaux ioniques dans les CSCs W8B2+

L’e se le de es tudes o t e t u e e p essio diff e tielle des a au io i ues

dans les cellules souches qui serait liée à leur origine tissulaire et/ou à des fonctions

Discussion

210

spécifiques. Le rôle de ces canaux dans les cellules souches adultes reste peu étudié mais les

do es dispo i les o t e t u’ils so t t oite e t i pli u s da s la gulatio de la

prolifération et la migration cellulaire.

Le blocage du courant IKdr réduit considérablement la prolifération des CSMs

hu ai es du tissu adipeu alo s ue l'i hi itio d’IKCa 'a pas d'effet Bai et al., . De

plus, l’i hi itio des ou a ts BKCa et KV4.2 (Ito) réduit la prolifération cellulaire des pré-

adipocytes humains (Hu et al., 2009). Une autre étude a montré que l’i hi itio de BKCa réduit

la prolifération cellulaire des CSMs hu ai es de la oelle osseuse e p o o ua t l’a t du

cycle en phase G0/G1 (Zhang et al., 2014b). Dans les CSCs c-kit+ hu ai es, l’i hi itio de BKCa

réduit la prolifération (en accumulant les cellules en phase G0/G1) et réduit également la

ig atio ellulai e. Cepe da t, l’i hi itio du a al Ki . ’affe te pas la p olif atio

cellulaire mais stimule la migration cellulaire (Zhang et al., 2015b).

Dans notre modèle de CSCs W8B2+, nous avons observé deux courants majoritaires, le courant

BKCa (codé par KCa1.1) et le courant IK1 od p o a le e t pa Ki . . L’appli atio de

l’apa i e lo ueu du a al SK1, 2, 3) ne provoque aucun effet suggérant que les canaux

SK1, 2 et 3 ne sont pas des canaux fonctionnels dans les CSCs W8B2+ (résultats non présentés).

Quant au canal BKCa il joue un rôle important dans notre modèle cellulaire car son inhibition

affecte les propriétés fondamentales (prolifération et auto-renouvellement) des CSCs W8B2+

(Résultats, chapitre II « article scientifique »).

Le rôle précis des canaux Na+ TTX sensibles et des canaux Na+ TTX résistants (NaV1.5),

’est pas totale e t lu id da s les ellules sou hes adultes. Da s les CSMs humaines du

tissu adipeux, le blocage de l'INa n'affecte pas la prolifération cellulaire (Bai et al., 2007). De

e, l’i hi itio des canaux Na+ TTX sensibles dans les CSCs c-kit+ ’a pas d’i pa t su leu

prolifération (Zhang et al., 2015b).

Nos résultats ont également montré que les CSCs W8B2+ expriment les transcrits

codant pour les canaux potassiques TWIK1 de la famille des canaux K à deux pores (K2P) qui

sont entre autres des canaux sensibles au pH (Chatelain et al., 2012). Les données de la

littérature ne cessent de démontrer que les acteurs de cette famille possèdent divers rôles

physiologiques et pathologiques (Feliciangeli et al., 2015). Un étude récente montre que le

Discussion

211

a al TWIK est fo te e t e p i da s les o eillettes et u’il est di e te e t i pli u da s

la régulation de la fréquence cardiaque et de la taille des oreillettes (Christensen et al., 2016).

Malg la p se e des t a s its oda t pou HCN , ous ’a o s pas o se de

courant If dans les CSCs W8B2+. Heubach et ses collègues ont obtenus les mêmes résultats

dans les CSMs humaines de la moelle osseuse, qui exp i e t u i ue e t l’ARN de

l’isofo e HCN sa s g e de ou a t a ti e h pe pola isatio Heu a h et al., .

Au u e tude à l’heu e a tuelle ’a o t l’e iste e de ou a ts If dans les CSCs humaines

adultes.

Concernant les canaux calciques, nous ’a o s e egist au u ou a t al i ue da s

notre modèle de CSCs W8B2+. Ce constat est peu surprenant car les résultats obtenus en RT-

qPCR ne montrent aucune expression des transcrits codant pour les CaV de type L (Cav1.2,

Cav1.3) et les CaV de type T (CaV3.1 et CaV3.2). Cependant, plusieurs équipes ont reporté

l’e p essio des t a s its oda ts pou les CaV de t pe L et T et la p se e de ou a t CaV

de type L dans les CSMs humaines de la moelle osseuse (Kawano et al., 2002 ; Heubach et al.,

2004 ; Zahanich et al., 2005). Il est important de mentionner dans ces travaux une

h t og it e tai e da s l’e p essio fo tio elle des a au al i ues. E effet, % des

CSMs de la moelle osseuse expriment les transcrits codant pour les canaux Ca2+ de type L et

seulement une petite population (13%) de ces cellules présentent des courant fonctionnels

(Zahanich et al., 2005). Dans les CSMs humaines du tissu adipeux, les ARNm des CaV de type L

et T ont été détectés sans aucune fonctionnalité (Bai et al., 2007). De même, dans les CSCs c-

kit+ hu ai es, au u ou a t al i ue ’a t o se (Zhang et al., 2014a).

IV-P ofil d’e p essio g i ue des a teurs calciques dans les CSCs W8B2+

Bien que les CSCs W8B2+ ’e p i e t pas de t a s its oda t pou les a au

calciques, nos résultats montrent une présence de plusieurs transporteurs ioniques (la pompe

Na+/K+, la pompe calcique SERCA, la pompe à calcium PMCA et l’ ha geu Na+/Ca2+) et des

a teu s de l’ho ostasie al i ue la CALM / et les epteu s à l’IP ITPR / .

Ce p ofil d’e p essio est se la le à e ui a t d jà d it su les CSMs humaines

et ui se ait à l’o igi e de ph o es d’os illations calciques spontanées (Ye, 2010). En effet,

les CSMs humaines possèdent des oscillations calciques spontanées qui sont régulées

ajo itai e e t pa les IP R, la “ERCA, l’ ha geu Na+/Ca2+ et la pompe PMCA (Kawano et

Discussion

212

al., 2002, 2003, 2006; Orciani et al., 2010). Ces oscillations induiraient des fluctuations du

potentiel membranaire via le canal potassique IKCa (Kawano et al., 2003) et seraient associées

à la translocation nucléaire de NFAT; un facteur de transcription connu comme régulateur

d’e p essio g i ue Ka a o et al., .

Ces oscillations calciques sont aussi présentes dans les CSCs c-kit+ humaines (Ferreira-

Martins et al., 2009; Maxwell et al., 2016) et sont régulées par les IP3R et la SERCA sans

impliquer la pompe Ca2+ membranaire (Ferreira-Martins et al., 2009). D’aut e pa t, il appa ait

que ces oscillations calciques jouent un rôle essentiel dans la régulation de la prolifération

cellulaire. L'induction des oscillations calciques dans les CSCs c-kit+ avant leur injection dans

des œu s i fa is de sou is, a lio e ait la g effe et l’e pa sio de es ellules sou hes.

(Ferreira-Martins et al., 2009).

Il est à noter que notre modèle de CSCs W8B2+, nous retrouvons aussi ces oscillations

al i ues sultats o o t s ais ous ’a o s pas e o e a a t is les a teu s

calciques impliqués dans leur genèse.

Pa all le e t à l’e p essio des odulateu s i pli u s da s l’ho ostasie al i ue

nous avons pu mettre en évidence, sur notre modèle de CSCs W8B2+, l’e p essio des

transcrits codants pour la calmoduline et la calcineurine qui sont deux principaux médiateurs

des effets moléculaires du calcium. La calmoduline, qui est un acteur fondamental de

t adu tio ellulai e li à l’a ti it al i ue, gule plusieu s p o essus ellulai es do t la

régulation du cycle cellulaire et la cytokinèse (Tsang et al., 2006). E a ti a t d’aut es p ot i e

(comme la CaMKII ou Ca2+/calmodulin-dependant protein kinase II), la calmoduline promeut

la survie des CSCs de souris et leur engagement dans le lignage cardiaque (Quijada et al.,

2015). La calcineurine intervient également dans diverses fonctions notamment le

développement du muscle cardiaque et squelettique via le facteur de transcription NFAT

(Schulz and Yutzey, 2004; Seok et al., 2014; Wu et al., 2009) et le cycle cellulaire (Afroze et al.,

2003).

Il est donc très probable que la calmoduline et la calcineurine jouent un rôle

fondamental dans la régulation de prolifération des CSCs W8B2+ en relation directe ou

indirecte avec la signature calcique.

Discussion

213

En conclusion, de cette partie nous avons pu isoler et purifier à partir de biopsie de

œu hu ai des ellules d’o igi e se h ateuse qui possèdent toutes les

caractéristiques des cellules sou hes. L’a al se glo ale de l’e p essio g i ue i di ue

lai e e t u’elles e so t pas « strictement excitables » par analogie aux cardiomyocytes

(absence de canaux dépolarisants de type sodique et calcique) mais auraient une activité

intracellulaire liée probablement aux IP3 et à certaines conductances potassiques calcium-

dépendante de type BKCa. Ces cellules possèdent un potentiel de différenciation certain

orienté prioritairement vers un génotype et un phénotype myocytaire.

V-Différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+

1 Profil d’e p essio des marqueurs cardiaques

Les cellules souches adultes ont la propriété de se différencier in vivo et générer des

cellules différenciées du tissu dans lequel elles se trouvent (Ghosh et al., 2011; Guilak et al.,

2010). L’o je tif i i est d’ tudie le pouvoir de différenciation cardiaque de notre modèle de

CSCs W8B2+. Ce choix de différenciation est particulièrement intéressant car il permet de

proposer des thérapies cellulaires de type autologue qui permettraient de remplacer des

tissus nécrosés par de nouveaux cardiomyocytes lors de pathologies cardiaques comme

l’i fa tus pa e e ple.

Pou i dui e ette diff e iatio a dia ue et da s le ut d’u e tude o pa ati e

nous avons utilisé des inducteurs chimiques de différenciation en se basant sur les travaux de

Zhang (Zhang et al., 2015a).

Nos résultats de RT-qPCR montrent u’ap s jou s de diff e iatio in vitro, les

CSCs W8B2+ présentent un profil génique très différent de celui avant différenciation.

Néanmoins, les cellules différenciées ne présentent pas le phénotype strict des

a dio o tes. Ce i se t aduit à l’ helle p ot i ue pa l’a se e de st iatio s t pi ues des

structures contractiles (la troponine T cardiaque, l’α-actinine, la chaîne lourde la myosine

a dia ue et à l’ helle t a s ipto i ue pa l’a se e d’i du tio des t a s its odant

notamment pour les chaînes lourdes de la myosine cardiaques. En revanche, certains

t a s its oda t pou des a ueu s de diff e iatio a dia ue o e l’a k i e B, la

chaîne légère de la myosine, le facteur natriurétique de type B sont surexprimés au cours de

du processus de différenciation.

Discussion

214

L’a k i e B ANKB a t o t e o e u e p ot i e gulat i e de l’auto atis e

du œud si o-auriculaire humain (Hund and Mohler, 2008; Le Scouarnec et al., 2008)

probablement via la régulation du canal calcique CaV1.3 (Cunha et al., 2011). Parmi les chaînes

légères de la osi e, l’isofo e au i ulai e MYL7 est surexprimé au cours de la

diff e iatio a dia ue o e l’o t o t )ha g et ses oll gues (Zhang et al., 2015a).

Ces résultats ne sont aucunement surprenant car les cardiomyocytes différenciés à partir des

cellules souches in vitro ont été largement montrés comme ayant un phénotype cardiaque

immature sur les plans morphologiques et électrophysiologiques (Shi et al., 2016; Yang et al.,

2014; Zhang et al., 2015a).

Il est probable que les protéines contractiles aient une localisation nucléaire immature

dans les « cardiomyocytes » issus des CSCs W8B2+. En effet, plusieurs études ont montré

l’e p essio de structures contractiles (comme la tropomyosine et la troponine) dans le noyau

des CSMs de rat à un stade précoce de différenciation (Asumda and Chase, 2012). D’aut es

marqueurs cardiaques comme les facteurs de transcription GATA5 et GATA6 se trouvent

également surexprimés au cours de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+. Ces deux

facteurs jouent un rôle fondamental dans la morphogenèse cardiaque (Charron and Nemer,

1999; Peterkin et al., 2005) particulièrement vers le développe e t d’u ph ot pe odal ,

comme par exemple, sur les CSEs de souris (Hashem and Claycomb, 2013; Wiese et al., 2011).

GATA6 est également surexprimé au cours de la différenciation vers un phénotype

cardiomyocytaire des cellules humaines du cordon ombilical exprimant c-kit (Iachininoto et

al., 2015) mais aussi lors la reprogrammation des CSMs humaines en précurseurs

cardiovasculaires (Vecellio et al., 2012). GATA6 serait également essentiel dans le processus

de différenciation en cellules musculaires lisses vasculaires (Lepore et al., 2005; Losa et al.,

2017).

Dans ce contexte, il est a noter u’au u e i du tio de GATA ’a t o se e à

l’ helle t a s ipto i ue da s ot e od le, o e peu e t le o fi e deu aut es

études (Reus et al., 2016; Zhang et al., 2015a).

Nos sultats soulig e t gale e t u e a plifi atio de l’e p essio du fa teu

natriurétique de type B (BNP) au cours de la différenciation des CSCs W8B2+. Cette induction

a été également retrouvée lors de la différenciation en cardiomyocytes des CSMs de rat et des

CSEs de singe (Abdelalim et al., 2006; Fukuda, 2002; He et al., 2011). Ce facteur natriurétique

Discussion

215

est apa le d’i dui e la diff e iatio a dio o tai e des C“Cs de sou is (Bielmann et al.,

2015) mais également d’améliorer la fonction cardiaque lors de transplantation de CSMs dans

u od le u i d’i suffisa e a dia ue (Zhang et al., 2013). Récemment, Al-Maqtari et ses

collègues ont montré que les transcrits codant pour le BNP sont surexprimés lors de

l’i du tio des C“Cs -kit+ humaines par certains facteurs de transcription cardiaques (Al-

Maqtari et al., 2017).

Cependant, nous ’a o s pas o se de ha ge e ts d’e p essio de t a s its

oda t pou le fa teu at iu ti ue de t pe A ANP d’auta t plus ue e de ie e p se te

pas d’e p essio da s les C“Cs W B + a a t diff e iatio . Il est à ote u’il a pu t e is

en évidence, notamment par notre équipe, que l’ANP joue u ôle i po ta t lo s de la

différenciation des fibroblastes de rat en myofibroblastes (Cameron et al., 2000; Moubarak et

al., 2015). L’e p essio et le ôle de es deu t pes de fa teu s at iu ti ues pou aie t

dépendre du type cellulaire.

L’e se le de es sultats o fi e t le ph ot pe i atu e des a dio o tes o te us

après différenciation in vitro des CSCs W8B2+.

L’utilisatio de l’optog ti ue à l’aide du ChR o e o e pe etta t

l’a lio atio de ette diff e iatio s’est l i effi a e a le « clustering hiérarchique »

des gènes se rapproche plus des CSCs W8B2+ non différenciées que celui des CSCs W8B2+

après différenciation cardiaque. Nous pensons que ce constat viendrait de la dégradation par

la lumière bleue (utilisée en pulse de 50 ms à une fréquence de 1Hz pour stimuler le ChR2

tout au long du protocole de différenciation) des agents de différenciation utilisés dans notre

protocole comme par exemple la vitamine A (acide rétinoïque).

2 Profil d’e p essio des transcrits codant pour les canaux ioniques

Les résultats des RT- PCR ous o t pe is d’ide tifie plusieu s t a s its oda ts pou

des a au io i ues sodi ues, potassi ues, al i ues, HCN do t d’e p essio appa ait au

cours de la différenciation cardiaque in vitro de notre modèle de CSCs W8B2+.

En effet, plusieurs transcrits codants pour les canaux sodiques apparaissent au cours

de la diff e iatio ota e t, l’ e ge e de l’e p essio de l’isofo e a dia ue

NaV1.5 ; un canal sodique responsable de la phase de dépolarisation (phase 0) du potentiel

d’a tio a dia ue. E plus de l’isofo e a dia ue, les t a s its oda ts pou les isofo es

Discussion

216

neuronaux (NaV1.7) et du muscle squelettique (NaV1.4) émergent au cours de la

diff e iatio . Cette o se atio est oupl e à l’appa itio des t a s its codants pour les

sous-unités β régulatrices (NaV β et NaV β . Ces sultats so t t s se la les à eu d its

au cours de la différenciation cardiomyocytaire des iPSC humaines (Moreau et al., 2017). Une

autre isoforme (NaV . e p i da s le œu hu ai Ga o it et al., appa ait

également durant la différenciation. Une étude réalisée sur les CSCs c-kit+ de souris a montré

l’e p essio p ot i ue de a au sodi ues de e atu e ais o fo tio els a se e

de courant sodique) (Lagostena et al., 2005).

Après différenciation « cardiaque » des CSCs W8B2+, nous avons également observé

l’appa itio des t a s its KV1.4 et KV4.3 et la surexpression du transcrits KV4.2 codant pour

les canaux potassiques cardiaques impliqués dans le courant transitoire sortant repolarisant

Ito du a t la phase du pote tiel d’a tio a dia ue. Il est i po ta t de p ise ue des

transcrits codant pour des canaux potassiques neuronaux apparaissent au cours de la

différenciation cardiaque. Ceux-ci incluent le KV1.2 et le KV2.1 ; des canaux responsables du

courant IKDR essai e à la epola isatio du pote tiel d’a tio eu o al.

Les transcrits codant pour les canaux KV1.5 et KV1.7 responsables des courants sortants

repolarisants ultra-rapides IKur apparaissent au cours de la différenciation. Cependant les

transcrits codant pour les canaux hERG (responsables du courant IKr) et KVLQT1 (responsables

du courant IKs) essentiels pou la epola isatio phase du pote tiel d’a tio a diaque sont

absents. Parallèlement, nous avons observé la surexpression des sous-unités β régulatrices

des canaux potassiques après différenciation cardiaque.

Nous retrouvons également une induction très forte des transcrits codant pour TWIK1

(canal potassique à deux domaines P ou K2P). Ce canal serait impliqué dans les processus

fréquentiels et sécrétoires de certaines cellules neurales (Buckler, 2015; Ryoo and Park, 2016)

et semble jouer un rôle important dans la régulation du tonus musculaire vasculaire lisse

(Olschewski et al., 2006; Tang et al., 2009).

Nos sultats o t e t gale e t l’appa itio des t a s its oda t pou le a al

calcique CaV1.2 responsable du courant ICaL essentiel pour la phase du plateau (phase 3) du

pote tiel d’a tio a dia ue. De e ue les t a s its oda ts pou le a al CaV1.3 ; un

canal responsable du courant ICaL neuronal et qui serait également impliqué dans la

Discussion

217

g atio de l’a ti it pa e aker cardiaque chez la souris (Mangoni et al., 2003; Zhang et

al., 2005). D’aut es t a s its, oda t pou le a al al i ue CaV3.2 dont le courant (ICaT) est

responsable d’u e pa tie de la phase le te de d pola isatio du pote tiel d’a tio si usale

apparaissent au cours de la différenciation cardiaque. L’appa itio de l’e p essio de es

canaux calciques (de type L et T) est corrélée avec celle des sous-unités régulatrices

importantes pour la modulation de leur activité.

Grajales et ses collègues ont montré que durant la différenciation myogénique des

MSC murines, les transcrits codant pour les canaux calciques CaV1.2 étaient induits alors que

les transcrits codant pour les canaux CaV3.2 ne présentaient aucune variation (Grajales et al.,

2015). Il faut mentionner que ces conductances calciques joueraient un rôle important dans

les p op i t s ellulai es des ellules sou hes. E effet, l’i hi itio des a au al i ues de

type L par la nifédipine, diminuait la prolifération et la différenciation cardiaque des CSCs de

souris (Hotchkiss et al., 2014).

La différenciation cardiaque in vitro de notre modèle de CSCs W8B2+ est aussi

accompagnée de l’appa itio des t a s its oda ts pou HCN isofo e eu o ale et HCN

(isoforme cardiaque) et d’une surexpression de HCN2 et HCN3. Ces canaux HCN, notamment

le HCN4 so t à l’o igi e des ou a ts If espo sa les de l’a ti it th i ue a dia ue des

cellules nodales. Plusieurs études réalisées sur les CSMs hu ai es et hez d’aut es esp es,

ont montré clairement que la différenciation en cellules pacemaker fonctionnelles était

corrélée avec la surexpression génique des isoformes HCN1 ou HCN4 (Bruzauskaite et al.,

2016; Lu et al., 2013; Zhou et al., 2013).

Concernant les canaux potassiques rectifiant entrants non dépendants du temps, nous

a o s o se l’appa itio des t a s its Ki . oda t pou le a al esponsable du courant

potassique IK1, e tifia t e t a t. Ce ou a t est fo da e tal puis u’il o ditio e le

potentiel dit de « repos » à u e aleu p o he du pote tiel d’ uili e au potassiu . D’aut es

t a s its oda t pou des a au potassi ues e tifia t e t a ts se si les à l’a t l holi e

Ki . et se si les à l’ATP Ki . appa aisse t gale e t au ou s de la différenciation des

CSCs W8B2. Les canaux Kir3.x ont une localisation nodale et atriale et sont impliqués dans la

régulation du rythme cardiaque via les récepteurs muscariniques de type M2 (Corey et al.,

1998; Krapivinsky et al., 1995). Quant aux canaux Kir6.x couplés aux récepteurs aux

sulfonylurés (SUR2A ; qui est maintenu), ils sont fortement impliqués dans la régulation de la

Discussion

218

s tio d'i suli e et da s e tai es o ditio s is h i ues d pl tio d’ATP i t a ellulai e

du contrôle du tonus musculaire vasculaire lisse et cardiaque (Miki et al., 2002; Ng et al., 2010;

Seino, 1999). Da s ot e od le, es a au e peu e t t e a tifs u’e a se e d’ATP

i t a ellulai e, soit da s des o ditio s d’is h ie d asti ues ui pou aie t t e

potentiellement un déclencheur de la différenciation.

Il a t o t ue l’h pe pola isatio des C“Cs fœtales hu ai es tait suffisa te pou

induire la différenciation cardiaque mature (générant des cardiomyocytes qui battent

spontanément) soulignant un nouveau mécanisme de différenciation cardiomyogénique des

CSCs (van Vliet et al., 2010) ayant pour socle une plateforme de vecteurs ioniques.

Da s l’e se le l’a al se des t anscrits codant pour les canaux ioniques après

différenciation des CSCs W8B2+, peut t oig e d’u e o ie tatio ve s u ph ot pe de

cellules excitables de type pacemaker. Le maintien des gènes TBX3 (voir chapitre I résultats),

de l’i du tio de HCN, ICaT, Ki va da s le se s d’u e diff e iatio de t pe pa e ake ,

a oi s l’i du tio du Nav .5, de Ki . IK1 est e faveu d’u e diff e iatio de t pe

atrial.

Même si un courant calcique a été enregistré sur quelques CSCs W8B2+ différenciées

(non o t , les aut es ou a ts i pli u s da s le pote tiel d’a tio a dia ue ’o t pas t

enregistrés (mise à part BKCa et IK1), confirmant ainsi le phénotype cardiomyocytaire immature

obtenu après différenciation in vitro. Nous pouvons néanmoins construire u e sig atu e d’u

pote tiel d’a tio h poth ti ue d’u e ellule diff e i e. Figure D-1

Figure D-1 : od le h poth ti ue d’u pote tiel d’a tio g pa u e ellule W B +différenciée

Discussion

219

3 Oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+

E plus de l’appa itio de l’e p essio des transcrits codant pour les canaux calciques

de t pe L et T , os sultats o t o t u ha ge e t da s l’e p essio des a teu s de

l’ho ostasie al i ue i pli u s da s le ouplage excitation-contraction au cours de la

différenciation des CSCs W8B2+. E effet, ous a o s o se u e appa itio de l’e p essio

des transcrits codant pour la pompe Na+/K+, une surexpression des transcrits codant pour la

“ERCA, l’ ha geu NCX et les epteu s à l’IP et u e fo te sous-expression de la CALM3. En

pa all le, l’i age ie al i ue via l’utilisatio de la so de al i ue GCaMP a l des

ha ge e ts sig ifi atifs da s la f ue e, l’a plitude, l’ai e, le TTP, le TTR et les pe tes des

oscillatio s al i ues o se es au ou s de ette diff e iatio a dia ue. De plus, l’ tude

pharmacologique réalisée sur les CSCs après différenciation a permis de déterminer le rôle

ajeu de l’ ha geu NCX da s la g atio de es os illatio s. Les sultats de l’i hi itio

de e tai s a teu s al i ues sugg e t ue es os illatio s so t g es d’u e pa t pa les

canaux calciques CaV de t pe L et les epteu s à l’IP espo sa les de l’aug e tatio

al i ue i t a ellulai e et d’aut e pa t pa la “ERCA pour la recapture calcique responsable de

la baisse de la concentration calcique intracellulaire. Ces oscillations apparaissent insensibles

à la ryanodine, un constat logique car les transcrits qui la codent sont absents dans les CSCs

non différenciées et après différenciation cardiaque.

Dans les cellules souches les oscillations calciques ont été enregistrées et analysées

principalement dans les CSMs humaines (Orciani et al., 2010 ; Kawano et al., 2006 ; Kawano

et al., 2003) . Elles ont été néanmoins obse es et a a t is es da s d’aut es t pes

cellulaires comme les fibroblastes cardiaques humains (Chen et al., 2010), les cellules

endothéliales aortiques et cérébrovasculaires humaines (Hu et al., 2002; Scharbrodt et al.,

2009) et les lymphocytes (Lewis, 2003). Toutefois, leurs rôles dans ces différents types

cellulaires restent à élucider.

Il est i po ta t aussi de sig ale le a ue uel de do es su l’ olutio et le ôle

de ces oscillations lors de processus de différenciation notamment cardiaque.

Au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+, nous avons observé

u e di i utio de la f ue e et u e aug e tatio de l’a plitude des os illatio s al i ues

ce qui pourrait suggérer un rôle de ces oscillations dans le processus de différenciation. Une

étude sur la différenciation ostéogénique des CSMs humaines a rapporté également une

Discussion

220

diminution de la fréquence des oscillations calciques au cours de la différenciation mais aucun

ha ge e t o e a t l’a plitude (Sun et al., 2007). Dans ce travail, la différenciation

ostéogénique des CSMs conjuguée à la réduction de la fréquence des oscillations (induites par

sti ulatio le t i ue aug e tait l’effi a it de la diff e iatio , e ui sugg e u ôle

important de la fréquence dans ce p o essus. D’aut e pa t, il a t o t ue des os illatio s

calciques apparaissent dans les cellules souches hépatiques de rat et les MSC humaines quand

celles-ci sont mises en culture avec des cardiomyocytes de rats néonataux (Muller-Borer et

al., 2012, 2007). Ces oscillations dans ces cellules souches sont synchrones avec celles des

a dio o tes et p o o ue t l’a uisitio d’u ph ot pe a dia ue pa l’i du tio

transcriptomique de gènes cardiaques. Dolmetsch et ses collègues indiquent que la fréquence

des os illatio s al i ues gulait diff e e t l’e p essio g i ue et seul NF-kB répondait

aux oscillations de faibles fréquences (Dolmetsch et al., 1998).

Nos résultats montrent une sous-expression significative des transcrits codants pour la

calmoduline 3 supposant son a se e d’implication durant le processus de différenciation

cardiaque.

Cepe da t, au u ha ge e t d’e p essio des t a s its oda ts pou la al i eu i e ’a

été observé. La calmoduline (CaM) et la calcineurine font partie des principaux médiateurs

des effets moléculaires du calcium en activant plusieurs cibles moléculaires comme NF-AT,

NF-KB, CaMKII. La odulatio de l’e p essio sp ifi ue de fa teu s de t a s iptio (Smedler

and Uhlén, 2014) serait en relation avec les paramètres cinétiques, d’a plitude et de

f ue e de l’ho loge al i ue i t i s ue.

Le facteur de transcription NFAT activé par la calcineurine jouerait le rôle de décodeur des

oscillations calciques (Dolmetsch et al., 1998). Par exemple, dans les cellules endothéliales

humai es de la ei e du o do , la f ue e, l’a plitude et la du e des os illatio s al i ues

gulaie t l’a ti it du fa teu de t a s iptio NF-KB (Song et al., 2012). Ce facteur de

transcription est activé seule e t si l’a plitude des os illatio s attei t u e aleu seuil. “o

activité est plus intense au fur et à mesure que la fréquence et/ou la durée des oscillations

augmentent. Plusieurs études ont également souligné que la fréquence et la durée des

oscillatio s gulaie t l’a ti it de NFAT da s plusieu s od les ellulai es (Onohara et al.,

2006; Tomida et al., 2003; Uhlén et al., 2006). Des travaux récents indiquent (via un contrôle

des oscillations calciques par optogénétique) que le facteur de transcription NFAT est aussi

Discussion

221

se si le au a iatio s de l’ai e des os illatio s al i ues (Hannanta-Anan and Chow, 2016).

L’e se le des données disponibles montre que NFAT est activé par les oscillations calciques

a a t u e f ue e de à Hz et d’u e du e de , à s (Smedler and Uhlén, 2014).

Le facteur de transcription NF-KB (activé par la calcineurine) connu comme étant

se si le à la f ue e, la du e et l’ai e des os illatio s al i ues da s plusieu s t pes

cellulaires (Hu et al., 1999; Jin et al., 2006; Scharbrodt et al., 2009; Zhu et al., 2008, 2011).

NF-KB se ait a ti pa les os illatio s al i ues a a t u e f ue e de à Hz et d’u e

durée de 36 à 52 s (Smedler and Uhlén, 2014).

L’a ti atio de la al iu al oduli e ki ase de t pe II CaMKII est aussi sensible aux

oscillations calciques (De Koninck and Schulman, 1998; Dupont et al., 2003). Elle est activée

par les oscillations calciques ayant une fréquence de 100 à 4000 mHz et une durée de 200 ms

(Smedler and Uhlén, 2014).

La protéase calpaïne a été également considérée comme un décodeur calcique (Tompa

et al., 2001) et activée par les oscillations calciques ayant une fréquence de 1 à 50 Hz et une

durée de 20 ms (Smedler and Uhlén, 2014).

Durant la différenciation des cellules souches en cardiomyocytes, la voie MAPK

(Mitogen-activated protein kinases) joue un rôle central (Grajales et al., 2010; Park et al., 2009;

Tonelli et al., 2012). Elle serait également sensible aux oscillations calciques (Lockyer et al.,

2001; Tognon et al., 1998; Walker et al., 2004). L’a ti atio de ette oie via la

phosphorylation de ERK) est régulée par des oscillations calciques ayant une fréquence de 1,7

à 17 mHz et une durée approximative de 50 s (Kupzig et al., 2005). Ces résultats ont été

confirmés dans une étude de modélisation théorique montrant une corrélation négative entre

la di i utio de la f ue e os illatoi e et l’a ti atio de la oie MAPK (Yi et al., 2011).

Il est très probable que les changements dans les paramètres des oscillations calciques

f ue e, a plitude, du e, ai e … o se v es ap s diff e iatio de ot e od le de CSCs

W8B2+ soie t li s à l’a uisitio du ph ot pe a dia ue i atu e o se v .

De plus, les changements des paramètres des oscillations calciques pourraient bien agir sur

des a teu s ol ulai es pou odule l’e p essio de g es a dia ues. Co pte te u des

données bibliographiques, la voie MAPK serait un décodeur potentiel des changements de

Discussion

222

fréquence et de durée des oscillations observées dans notre modèle de CSCs W8B2+

différenciées. Dans ces dernières, la fréquence est de 5 mHz et la durée est de 92 s, des valeurs

proches de celles auxquelles la MAPK est sensible (Smedler and Uhlén, 2014). De plus, nous

observons une diminution de la fréquence au cours de la différenciation cardiaque, des

sultats se la les à l’ tude de od lisatio th o i ue (Yi et al., 2011) selon laquelle la

di i utio de la f ue e os illatoi e et li e à l’a tivatio de la voie MAPK.

Selon Smedler et Uhlén, la MAPK est également sensible aux oscillations dans les

cardiomyocytes d’auta t plus ue ette oie est i pli u e da s la diff e iatio a dia ue.

Il est très probable que les facteurs de transcription NFAT et NF-KB (régulés par la calcineurine)

ne seraient pas des décodeurs des oscillations observées dans les W8B2+ différenciées car

l’e p essio des t a s its oda t pou la al i eu i e e ha ge t pas au ou s de la

différenciation. De même, la CaMKII ne serait pas directement impliquée car les transcrits

codant pour la calmoduline se trouvent sous-exprimés au cours de la différenciation. De plus,

la alpaï e, la CaMKII ’est pas se si le au valeu s de f ue e et de du e o se v es su les

CSCs W8B2+ différenciées.

Il est i po ta t de ote u’e plus de so ôle esse tiel da s la p olif atio et l’auto-

renouvellement des CSCs W8B2+, le canal potassique activé par le calcium BKCa semble jouer

u ôle da s la diff e iatio . L’i hi itio du a al BKCa diminuait drastiquement les

pa a t es des os illatio s al i ues f ue e, a plitude, du e… o se es su les C“Cs

W8B2+ diff e i es. D’aut e pa t, les os illatio s al i ues spo ta es i duise t des

fluctuations du potentiel membranaire via le canal potassique IKCa (Kawano et al., 2003) et

est associées à la translocation nucléaire de NFAT (Kawano et al., 2006). Une autre étude a

o t ue le pote tiel e a ai e gulait les os illatio s al i ues o t ôl es pa l’IP

(Kukuljan et al., 1994) suggérant une implication du canal BKCa dans la régulation ce ces

oscillations.

Discussion

223

4 La sphingosine 1-phosphate (S1P) joue un rôle important dans les CSCs W8B2+

La signalisation par les récepteurs à la S1P (S1PR) joue un rôle important dans la

gulatio des p op i t s fo da e tales p olif atio , diff e iatio … des ellules

cardiaques (Means and Brown, 2009). Cepe da t au u e tude à l’heu e a tuelle su les C“Cs

et notamment sur les CSCs W8B2+ n’a appo t des effets de la “ P. Nos sultats o t o t

sur ce modèle de cellules souches cardiaques, l’e p essio t a s ipto i ue des epteu s

S1PR1, S1PR2 et S1PR3 (avec une prédominance du S1PR2). Ce p ofil d’e p essio est

semblable à celui des MSC humaines de la moelle osseuse (Kong et al., 2014; Quint et al.,

2013). Da s le œu hu ai , Ah ed et ses oll gues o t ide tifi l’e p essio des “ PR ,

S1PR2 et S1PR3 au niveau transcriptomique et S1PR1 et S1PR3 au niveau protéique, un profil

quasi identique, da s les œu s de ats (Ahmed et al., 2017).

Dans notre étude, l’ajout de la “ P à µM, u e o e t atio plas ati ue

physiologique) diminue significativement la prolifération des CSCs W8B2+. Cependant

l’a al se du le ellulai e ap s et jou s de t aite e t à la “ P e o t e pas de

différence dans les phases du cycle comparé au contrôle contrairement à la paxilline et

l’i ioto i e. De plus, l’i hi itio pha a ologi ue sp ifi ue des epteu s “ PR , “ PR

et S1PR3 (candidats moléculaires pote tiels e ous a pas pe is d’ide tifie le ou les

epteu s i pli u s da s l’effet a tip olif atif di pa la “ P.

Il est important de signaler que la majorité des données de la littérature rapporte un

effet pro-prolifératif de la S1P et ceci dans plusieurs modèles cellulaire tels que les fibroblastes

cardiaques (via le S1PR3) (Benamer et al., 2011), les cellules satellites (via le S1PR2 et le S1PR3)

(Calise et al., 2012; Donati et al., 2013), les cellules endothéliales (via le S1PR1 et le S1PR3)

(Kimura et al., 2000) et les CSMs humaines du chorion (Innamorati et al., 2017).

Cependant, la S1P peut avoir un effet antiprolifératif notamment dans les lymphocytes

T humaines (Jin et al., 2003), les myofibroblastes hépatiques humains (Davaille et al., 2000),

les hépatocytes (Ikeda et al., 2003) et dans les cellules thyroïdiennes de rats (Björklund et al.,

2005). Da s les l pho tes T, le a is e ’a pas t tudi ais l’effet a tip olif atif

dans les hépatocytes de rats serait médié par le S1PR2 (via la voie Rho) (Ikeda et al., 2003).

Les auteurs ont supposé que la S1P est un régulateur négatif de la régénération hépatique.

Da s les ofi o lastes h pati ues hu ai s, l’effet a tip olif atif de la “ P sti ulait la oie

de l’AMP suite à u e aug e tatio du taux des protaglandine E2 (Davaille et al., 2000). Dans

Discussion

224

les cellules thyroïdiennes de rats, la S1P augmente la concentration de calcium intracellulaire

(via la phoshoplipase C et l’IP et de l’AMP . D’aut e pa t, la “ P p o o ue u e aug e tatio

transitoirement des transcrits codant pour son propre récepteur S1PR2 (Björklund et al.,

. De plus, Ji et ses oll gues o t o t ue l’a ti atio des l pho tes T par des

stimuli chimiques i pa tait o sid a le e t l’e p essio des “ PR Ji et al., 2003).

L’e se le de es do es o t e t lai e e t ue l’effet a tip olif atif de la S P est

di pa le S PR faisa t i te ve i le al iu . Le ha ge e t de l’e p essio des S PR pa

la S1P elle-même ajoute u aut e iveau d’auto-régulation par la S1P.

Il a été montré récemment que la S1P pouvait être secrétée par les CSMs de souris

(Sassoli et al., 2014) et humaines dérivées des iPS (Du et al., 2017), ajouta t ai si d’aut es

niveaux de complexité de régulation para et autocrine. En effet, cette S1P secrétée par les

CSMs u i es tait apa le d’i dui e la p olif atio des cellules souches satellites et des

cellules myoblastiques C2C12 (Sassoli et al., 2014). Quant aux MSC humaines dérivées des iPS,

les auteurs observent pour la première fois que la sécrétion de la S1P passait par un processus

exosomique via la membrane plasmique des hépatocytes (Du et al., 2017). Ces exosomes

taie t apa les d’i dui e la p olif atio des h pato tes p o a le e t e i duisa t la

synthèse et la libération de la S1P intracellulaire.

La S1P agit principalement via ses cinq récepteurs mais une voie intracellulaire

déclenchée indépendamment des récepteurs est de plus en plus décrite (Dupont et al., 2003;

Payne et al., 2002). Par exemple, Xiu et ses collègues ont montré que la S1P intracellulaire

i duit l’e p essio du ollag e pa les ofi o lastes lo s de la fi ose h pati ue,

indépendamment de l’a ti atio de ses récepteurs (Xiu et al., 2015).

Ces données viennent encore une fois ajouter un autre niveau de régulation

indépendant de la signalisation médiée par les récepteurs à la S1P.

Nos sultats o t gale e t o t ue la “ P di i ue d asti ue e t l’auto-

e ou elle e t, u a is e de di isio a e p se atio de l’ tat sou he et ui peut t e

odul pa l’e i o e e t (He et al., 2009). L’i hi itio des “ PR1 et S1PR2 dans notre

modèle de CSCs W8B2+, a o t ue ette p essio de l’auto- e ou elle e t ’est pas

médiée par les récepteurs S1PR1 et S1PR2.

Discussion

225

Il a été montré que la S1P joue un rôle très important dans la régulation des cellules

souches neurales (CSNs) de souris (Codega et al., 2014). Ces CSNs se trouvent dans deux états ;

un état quiescent (qCNSs) et un état activé (aCNSs). Quand elles sont activées, les CNSs

deviennent hautement prolifératives. Ces chercheurs ont montré que la S1P agit en diminuant

l’a ti atio des CN“s sa s alt e le o e des aCN“s alo s ue les p ostagla di es D

di i uaie t à la fois l’a ti atio des CN“s et le o e des aCNSs (Codega et al., 2014). Ces

travaux soulignent un rôle important de la S1P dans la physiologie des cellules souches.

Une autre étude décrite sur les MSC humaines du chorion a montré que la S1P

di i uait l’auto-renouvellement seulement si elle est combinée avec des agents qui

aug e te t la o e t atio i t a ellulai e de l’AMP (Innamorati et al., 2017).

Ces do es de la litt atu e sugg e t ue la S P gule gative e t l’auto-

renouvellement des cellules souches en maintenant leur état quiescent ou en induisant leur

engagement vers un processus de différenciation.

Enfin, nos résultats préliminaires ont montré un effet plutôt anti-migratoire de la S1P

dans les CSCs W8B2+.

La migration joue un rôle essentiel dans la régulation des propriétés des cellules

souches. En effet, la majorité des cellules souches est retenue dans une niche mais peuvent la

quitter en réponse à des stimuli spécifiques, un processus appelé « mobilisation ». Les cellules

souches sont également capables de regagner la niche par un processus opposé nommé

domiciliation ou « homing ». Il s’a e ue la “ P est u sti ulus t s i po ta t qui régule la

mobilisation de différents types cellulaire comme les CSMs, les progéniteurs endothéliaux, les

CSHs etc. (Ratajczak et al., 2014).

Le rôle de la S1P dans la mobilisation des CSHSs a été bien étudié et les études ont

soulig l’i po ta e du g adie t “ P e t e le sa g, la l phe et le tissu da s la gulatio

de la mobilisation de ces cellules (Golan et al., 2013; Liu et al., 2011).

L’e se le des do es de la litt atu e su l’effet de la “ P su la ig atio ellulai e in vitro

montre des effets pro et anti- ig atoi es. L’effet p o-migratoire a été signalé par exemple

dans les cellules endothéliales humaines (probablement via S1PR1 et S1PR3) (Kimura et al.,

2000), les cellules satellites de souris (Calise et al., 2012), les CSMs humaines de la moelle

osseuse (via S1PR1 et S1PR3)(Kong et al., 2014) et les fibroblastes cardiaques de souris (via le

Discussion

226

S1PR3) Be a e et al., . Qua t à l’effet a ti-migratoire, la S1P inhibait la migration des

CSMs humaines du chorion (via l’aug e tatio de l’AMP I a o ati et al., , les

cellules musculaires lisses bronchiques humaines (via S1PR2)(Kawata et al., 2005), les

myoblastes C2C12 (via S1PR2) (Becciolini et al., 2006) et les p u seu s d’oligode d o tes

de rat (via S1PR5) (Novgorodov et al., 2007).

E su , l’e se le de os sultats o t e u e e p essio des t a s its oda t

pour S1PR1, S1PR2 et S1PR3 avec une prédominance du S1PR2 dans notre modèle de CSCs

W8B2+. De plus dans ce modèle cellulaire, la S1P régule négativement la prolifération et/ou

l’auto-renouvellent et la migration. Les données de la littérature suggèrent que la S1P

augmenterait la quiescence (cellules en phase G0, sorties du le ellulai e ou l’e gage e t

des CSCs W8B2+ dans une voie de différenciation.

Quant au mécanisme, les données de la littérature nous orientent vers un effet de la

S1P médié par le S1PR2 faisant intervenir le Ca2+ et l’AMP . Ce i peut e ett e e uestion la

sp ifi it de so i hi itio S PR pa l’age t JTE . E effet, l’i hi itio du S PR pa le

JTE s’est v l e i effi a e (Salomone and Waeber, 2011) et su tout su l’aug e tatio du

calcium intracellulaire (Long et al., 2010).

Si o , d’aut es a is es e : autorégulation par la S1P de ses propres récepteurs,

sécrétion de la S1P par les CSCs W8B2+, signalisation intracellulaire etc.) peuvent être à

l’origine des effets observés de la S1P dans notre modèle.

Conclusion générale et perspectives

227

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

Nous a o s pu isole et pu ifie à pa ti de iopsies de œu hu ai des ellules

d’o igi e se h ateuse e p i a t le a ueu W B2, ayant des caractéristiques de

cellules souches. Ces clones apparaissent homogènes de par leur génotype et leur phénotype.

L’a al se glo ale de l’e p essio g i ue e pa ti ulie des a au io i ues, i di ue

que les CSCs W8B2+ possèdent un phénotype non-e ita le o e ’est le as pou les aut es

types de cellules souches. Ces cellules expriment quelques courants potassiques, notamment

le canal BKCa ui s’a e esse tiel pou gule leu s p op i t s fo da e tales o e la

p olif atio et l’auto-renouvellement. De plus, ces cellules présentent une signature calcique

ou a ti it al i ue i t a ellulai e p o a le e t li e à l’ho loge al i ue de t pe IP et au

conductances potassiques calcium-dépendantes de type BKCa. L’a al se t a s ipto i ue

mont e ue es ellules peu e t s’o ie te e s u ph ot pe a dia ue de t pe odal et/ou

auriculaire immature quand elles sont différenciées in vitro (figure C-1).

Cette diff e iatio s’a o pag e d’i po ta ts ha ge e ts de l’a ti it al i ue et

peut s’appa e te à l’appa itio d’u e ho loge al i ue e a ai e gulat i e de l’ho loge

calcique interne. Nos expérimentations montrent que la différenciation in vitro, par analogie

à la différenciation des cellules souches pluripotentes induites, ne peut en aucun cas conduire

à l’o te tio de a dio o tes t pi ues. Nous o t o s gale e t ue la diff e iatio in

vitro ne semble pas la meilleure orientation pour la réalisation de greffe cellulaire cardiaque.

Les approches génomiques et fonctionnelles des progéniteurs cardiaques semblent les plus

pertinentes pour en intégrant la notion de niches cardiaques et les processus

autocrine/paracrine liés à leur environnement multicellulaire. La cible principale apparait

o e ta t l’ho loge al i ue i te e p i itive intégrant tous les facteurs de régulation.

Comme par exemple les processus inflammatoires, hormonaux, ischémiques, mécaniques, de

o ta tes… sus epti les d’ eille es p og iteu s pou u e pa atio tissulai e op a te.

Dans ce cadre et comme exemple, les CSCs W8B2+ sont particulièrement sensibles à la

sphingosine 1-phosphate (S1P), un lipide plasmatique extrêmement important qui agit sur ces

ellules e di i ua t leu s apa it s de p olif atio , d’auto-renouvellement et de migration.


228

Dans son e se le e t a ail appo te d’i po ta tes i fo atio s su la ph siologie

des ellules sou hes a dia ues, ota e t su l’i pli atio des a au io i ues et l’a ti it

dynamique calcique intrinsèque dans la régulation de leurs propriétés.

Néanmoins, cette étude doit être complétée par :

U e tude plus app ofo die de l’a ti it al i ue spo ta e des ellules sou hes

W B pa u e a a t isatio pha a ologi ue, afi d’ide tifie les a teu s i pli u s

da s la g atio de leu l’ho loge ou os illateu al ique.

L’a al se à l’ helle p ot i ue des a au io i ues et a teu s al i ues do t

l’e p essio ha ge au ou s de la diff e iatio o e pa e e ple les a au de

la K2P et TRP, ASIC, les récepteurs purinergiques ou SOCs ...

Une optimisation du protocole de différenciation cardiaque de type chimique en

ajustant notre mode de stimulation par optogénétique ou par des protocoles de

différenciation plus performants (par exemple en 3 dimensions ou en mimant le

microenvironnement cardiaque).

Une étude plus poussée pour décrypter au niveau moléculaire les cibles impliquées

dans les modifications des paramètres des oscillations calciques au cours de la

différenciation.

Un examen plus approfondi du ode d’a tio de la “ P ui peut t e u odulateu

négatif de la régénération cardiaque en impactant les propriétés fondamentales des

C“Cs. Plusieu s poi ts doi e t t e solus pou d te i e le a is e d’a tio de

ce lipide (expression protéique des récepteurs, étude de la quiescence, inhibition plus

ciblée des ré epteu s et …


229

Figure C-1 : Sch a apitulatif des p i ipau g es do t l’e p essio a ie ap s diff e iatio cardiaque in vitro des CSCs W8B2+. Avant différenciation cardiaque, les CSCs W8B2+ (A) expriment

les transcrits codant pour les facteurs de transcription GATA4 et TBX3, les connexines cardiaques

(Cx43, Cx40, Cx45, Cx30.2) et la calmoduline 3. Ces cellules expriment également les transcrits codant

pour les canaux potassiques (KV3.4, KV4.2, BKCa, TWIK1, Kir 2.1 et Kir 6.1) et les canau HCN . A l’ tat non différencié, les CSCs W8B2+ p se te t des os illatio s al i ues apides, des epteu s à l’IP , la “ERCA et l’ ha geu NCX . Ap s diff e iatio a dia ue B , il a u e appa itio de l’e p essio des t a s its oda t pou les canaux calciques (CaV1.2 CaV1.3 et CaV3.2), les canaux

sodiques (NaV1.4 NaV1.5 NaV1.7 et NaV2.1), les canaux HCN (HCN1, HCN3 et HCN4), les canaux

potassiques (KV1.2, KV1.4, KV1.5, KV1.7, KV2.1, KV4.3, TASK1, Kir 2.3, Kir 3.1 et Kir 6.2) et la pompe

Na+/K+). Dans les CSCs W8B2+ différenciées, les oscillations calciques présentent une fréquence plus

faible et u e a plitude plus i po ta te. Pa all le e t à ela, il a u e su e p essio de l’ ha geu NCX , de la “ERCA et des epteu s à l’IP . Il est à ote gale e t u’ap s diff e iatio les facteurs de transcription GATA5 et GATA6 sont surexprimés.

A B

Références bibliographiques

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Résumé

266

RESUME

Résumé

L’o je tif de ette th se tait de d eloppe et de a a t ise u od le de ellules sou hes

cardiaques humaines dans un contexte de thérapie cellulaire.

Ap s a oi s le tio et a a t is u e populatio de ellules sou hes d’o igi e

se h ateuse, isol e à pa ti d’au i ules hu ai es, e p i a t le a ueu W B C“Cs

W8B2+), nous nous sommes focalisés (par les techniques de RT-qPCR à haut rendement,

d’i u o-marquage, de western-blot et de fluorescence calcique) sur ; 1) la caractérisation

g i ue des a au io i ues et des a teu s de la sig alisatio al i ue et l’ tude de leu

diff e iatio i it o e pa all le à l’a ti it al i ue i t a ellulaire.

Les résultats montrent que CSCs W8B2+ tendent à se différencier en cellules pacemaker.

Certains gènes spécifiques nodaux, comme Tbx3, HCN, ICaT,L, KV, NCX, s’e p i e t du a t la

diff e iatio . L’e egist e e t de l’a ti it al i ue ia u e so de optogénétique) montre

la p se e d’os illatio s al i ues ui olue t e f ue e et e i te sit pe da t la

différenciation. Les stocks-IP se si les et l’ ha geu NCX joue aie t u ôle fo da e tal.

Nous a o s e suite tudi l’i po ta e du a al BKCa et des récepteurs sphingosine 1-

phosphate (S1P) dans la régulation des propriétés fondamentales des CSCs W8B2+.

L'inhibition du BKCa diminue la prolifération cellulaire en accumulant les cellules à la phase

G0/G1, réprime l'auto- e ou elle e t ais ’affe te pas la ig atio . Qua t à la “ P elle

f ei e la p olif atio et l’auto-renouvellement via une voie différente de celles des

récepteurs S1P1,2,3.

Ce travail fait ressortir des cibles moléculaires fondamentales dans un contexte de thérapie

cellulaire cardiaque.

Mots-clés : thérapie cellulaire, cellules souches cardiaques humaines, cellules

mésenchymateuses, différenciation, canaux ioniques, signalisation calcique, canal BKCa,

sphingosine 1-phosphate, optogénétique.

Résumé

267

Abstract

The aim of this thesis was to develop and characterize a model of human heart stem cells in a

context of cell therapy.

A population of mesenchymal stem cells, expressing the W8B2 marker (CSCs W8B2+), was first

isolated from human auricles and characterized using high-throughput RT-qPCR techniques,

immuno-labeling, western-blot and calcium fluorescence imaging. These experiments were

focused on 1) the gene expression of ion channels and calcium signaling proteins; and 2) the

study of CSCs W8B2+ in vitro differentiation and associated intracellular calcium activity

changes.

The results show that CSCs W8B2+ tend to differentiate into pacemaker cells. Some nodal

specific genes such as Tbx3, HCN, ICaT, L, KV, NCX, are expressed during differentiation. The

recording of calcium activity (via an optogenetic probe) shows the presence of calcium

oscillations that change in frequency and intensity during differentiation. IP3 sensitive calcium

stocks and the NCX exchanger would play a fundamental role in these variations.

Then we studied the importance of the BKCa channel and the sphingosine 1-phosphate (S1P)

receptors in the regulation of the fundamental properties of the W8B2+ CSCs. Inhibition of

BKCa reduces cell proliferation by accumulating cells in the G0 / G1 phase, suppresses cell self-

renewal but does not affect migration properties. Concerning S1P, it decreases proliferation

and self-renewal without stimulate S1P1,2,3 receptors.

This work highlights fundamental potential molecular targets in a context of cardiac cell

therapy

Keywords : cell therapy, human cardiac stem cells, mesenchymal cells, differentiation, ion

channels, calcium signaling, BKCa channel, sphingosine 1-phosphate, optogenetic.

Annexes

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ANNEXES

Annexes

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Documents

Pou l’o te vtio v du G ade de