Pour l’obtention du Diplôme de Magister · De nombreux médicaments renferment des principes actifs extraits des plantes. En effet, environ 40% des médicaments en contiennent,

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

UNIVERSITE D’ORAN ES-SENIA Faculté des Sciences

Département de Chimie

Mémoire Présenté par

Mohamed CHENNI

Pour l’obtention du Diplôme de

Magister Spécialité : CChhiimmiiee MMoollééccuullaaiirree :: AAnnaallyyssee,, MMooddéélliissaattiioonn,, SSyynntthhèèssee

________________________________________________

Contribution à l’étude chimique et biologique de la

racine d’une plante médicinale :

Bryonia dioica Jacq. ______________________________

Soutenu le 14/07/2010 devant la commission d’examen :

Mr S. Hacini Pr. Université d’Oran Es-Sénia Président

Melle Z. Fortas Pr. Université d’Oran Es-Sénia Examinateur

Melle H. Habib-Zahmani M.C. (A) Université d’Oran Es-Sénia Examinateur

Mme D. El Abed Pr. Université d’Oran Es-Sénia Rapporteur

Avec l’aide de dieu, j’ai pu réaliser ce modeste travail que Je dédie :

A mes parents, qu’ils trouvent ici toute ma gratitude pour leur soutien tout au long de mes études

A ma sœur unique Fatima-Zohra

A mes très chers frères : Zoheir, Brahim, Bilal et Younes el habib

A ma très chère femme Fatima-Zohra

A toute la famille

A tous mes collègues et ami(e)s

CHENNI MOHAMED

AVANT-PROPOS

Ce travail a été réalisé, au Laboratoire de Réactivité et Chimie Fine du Département de

Chimie, de la Faculté des Sciences de L’Université d’Oran Es-sénia, sous la direction de

Mme D. El Abed. Je tiens à lui exprimer ma profonde gratitude pour m’avoir initié à la

recherche, pour son aide efficace et les conseils judicieux qui ont contribué à ma formation et

qui m’ont permis de mener à bien ce travail.

La partie biologique a été effectuée au Laboratoire de Biologie des micro-organismes et

de Biotechnologie, Faculté des Sciences, Université d’Oran, Es-Sénia, en collaboration avec

Melle Z. Fortas, Professeur au Département de Biotechnologie. Qu’il me soit permis de la

remercier vivement pour avoir accepté de juger ce travail.

J’adresse mes respectueux remerciements à Monsieur S. Hacini, Professeur à l’Université

d’Oran Es-sénia, pour m’avoir fait l’honneur de présider ce jury.

Je tiens à remercier Melle H. Habib-Zahmani, Maître de conférences au Département de

Biologie de l’Université d’Oran Es-sénia, pour avoir accepté d’examiner ce travail.

Je ne saurais oublier de remercier Melle F-Z Chenni, chargée de Cours à l’Université

Djilali Liabes de Sidi-Bel-Abbès, Mme N. Ouis, chargée de Cours à l’Université de Mascara,

Mr M. Hamadouche, Maître de conférences, Mme S. Belahouel-Dib, Chargée de cours,

Mr S. Neggaz, Magister en Microbiologie, à l’Université d’Oran Es-Sénia, pour leurs aides

efficaces et leurs précieux conseils dans la partie biologique et Mme M. Belkheira , Chargée

de cours à l’Université de Bechar pour les spectres de RMN qu’elle m’a réalisé.

J’exprime ma gratitude à Melle S. Ameur du Laboratoire Scientifique du Commissariat

d’Oran pour les analyses chromatographiques et à mes collègues du Laboratoire de Chimie

Organique de l’Université d’Oran, Es-Sénia pour les analyses spectroscopiques IR et UV.

Enfin, j’associe à ces remerciements tous les membres de ma famille, pour leurs

encouragements et toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation

de ce travail.

Tables des matières

INTRODUCTION GENERALE…............................................................................................2

Chapitre I : Les Cucurbitaceae

I.INTRODUCTION……………………………………………………………………………5

II. PRESENTATION DES CUCURBITACEAE……………………………………………...5

II.1. Appareil végétatif………………………………………………………………….......5

II.2. Appareil reproducteur………………………………………………………………….6

III. ETUDE BOTANIQUE ET PHARMACOLOGIQUE DE LA BRYONE………………...7

III.1. Répartition géographique et habitat…………………………………………………..7

III.2. Présentation de la région d’étude………………………………………………..…....8

III.3. Classification………………………………………………………………………...11

III.4. Noms et Synonymes végétaux………………………………………………………11

III.5. Description botanique……………………………………………………………….12

III.6. Usages et Propriétés thérapeutiques…………………………………………………13

IV. CONCLUSION…………………………………………………………………………...15

Chapitre II : Screening phytochimique

I.INTRODUCTION ………………………………………………………………………….17

II. GENERALITES SUR LES PRINCIPES ACTIFS …………………………………….....17

II.1. Les alcaloïdes .…………………………………………………………….................17

II.1.1. Caractérisation des alcaloïdes ……………………………………………………20

II.1.2. Action pharmacologique et emplois……………………..………………………..20

II.2. Les anthocyanes…………….…………………………………………………….......21

II.2.1. Caractérisation des anthocyanes…..……………………………………………....22

II.2.2. Action pharmacologique et emplois..……………………………………………..22

II.3. Les flavonoïdes.………………………………………………………………...........23

II.3.1. Caractérisation des flavonoïdes…………………………………………………...24

II.3.2. Action pharmacologique et emplois……………………………………………....25

II.4. Les hétérosides……………………………………………..........................................26

II.4.1. Caractérisation…………………………………………….....................................28

II.4.2. Action pharmacologique et emplois……………………………………………....28

II.5. Les Huiles essentielles……………………………………………………………......28

II.4.1. Caractérisation..……………………………………………...................................31

II.4.2. Action pharmacologique et emplois.……………………………………………...31

II.6. Les quinones.…………………………………………………………………………32

II.6.1. Caractérisation des quinones.……………………………………………..............33

II.6.2. Action pharmacologique et emplois….…………………………………………..33

II.7. Les saponines ou saponosides….…………………………………………………….34

II.7.1. Caractérisation des saponines..……………………………………………………35

II.7.2. Action pharmacologique et emplois….…………………………………………...35

III.8. Les stérols et stéroïdes.……………………………………………………………...36

II.8.1. Caractérisation des stérols et des stéroïdes….…………………………………....37


II.9. Les tanins ou tannins…….…………………………………………………………...38

II.9.1. Caractérisation des tannins.……………………………………………………….40


III. TESTS PHYTOCHIMIQUES…….……………………………………………………...41

III.1. Produit végétal épuisé avec de l’eau….……………………………..……………...42

III.2. Produit végétal épuisé avec de l’éthanol…………………………………………….43

III.3. Produit végétal épuisé avec du chloroforme………………………………………...45

III.4. Produit végétal épuisé avec de l’acide sulfurique…………………………………...46

IV. RESULTATS ET DISCUSSION………………………………………………………...46

V. CONCLUSION……………………………………………………………………………48

Chapitre III : Extraction et analyse de quelques principes actifs

I. INTRODUCTION ................................................................................................................ 50

II. RAPPEL SUR LES METHODES D’ANALYSE .............................................................. 50

II.1. Analyse chromatographique ....................................................................................... 50

II.1.1. Chromatographie sur couche mince (CCM) .......................................................... 50

II.1.2. Chromatrographie sur colonne (CC) ..................................................................... 51

II.1.3. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse .................. 52

II.1.4. Analyse par chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC) ............ 53

II.2. Analyse spectroscopique ............................................................................................. 53

II.2.1. Spectroscopie Ultraviolet-Visible (UV) ................................................................ 53

II.2.2. Spectroscopie Infra-rouge (IR) .............................................................................. 54

II.2.3. Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ................................ 54

III. PROCEDES D’EXTRACTION UTILISEES .................................................................... 55

III.1. Chauffage à reflux ...................................................................................................... 55

III.2. Hydrodistillation ........................................................................................................ 56

IV. EXTRACTION ET ANALYSE DES PRINCIPES ACTIFS DE LA BRYONE ............. 57

IV.1. Extraction et analyse des alcaloïdes ........................................................................... 57

IV.2. Extraction et analyse des flavonoïdes ........................................................................ 66

IV.3. Extraction et analyse de l’huile essentielle (H.E)....................................................... 74

IV.4. Extraction et analyse des tannins .............................................................................. 78

V. CONCLUSION ................................................................................................................... 85

Chapitre IV : Etude biologique

I. INTRODUCTION ................................................................................................................ 87

II. MATERIEL ET METHODE ............................................................................................... 87

II. 1. Matériel ....................................................................................................................... 87

II.1. 1. Souches bactériennes ............................................................................................. 87

II.1. 2. Souches fongiques ................................................................................................. 88

II. 1. 3. Principales caractéristiques des souches testées ................................................... 89

II. 1. 4. Matériel chimique ................................................................................................. 92

II. 1. 5. Milieux de culture ................................................................................................. 93

II. 2. Méthodes ..................................................................................................................... 95

II. 2. 1. Préparation de L’échantillon d’extrait méthanolique ........................................... 95

II. 2. 2. Préparation des précultures ................................................................................... 95

II. 2. 3. Conservation des cultures ..................................................................................... 95

II. 2. 4. Tests d’activité antimicrobienne de l’extrait méthanolique ................................. 96

III. RESULTATS ET DISCUSSION .................................................................................... 102

III.1. Bactéries .................................................................................................................. 105

III.2. Champignons filamenteux ........................................................................................ 110

III.3. Champignons levuriformes ...................................................................................... 112

V. CONCLUSION .......................................................................................................... 117

CONCLUSION GENERALE……………………………………………………………….119

BIBLIOGRAPHIE…………………………………………………………………………..122

ANNEXE……………………………………………………………………………………128

Abréviations

Ac : Acétyle

ANRH : Agence Nationale Des Ressource Hydriques

BuOH : Butanol

CC : Chromatographie sur Colonne

CCM : Chromatographie sur Couche Mince

CG/MS : Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse

CHCl3 : Chloroforme

Cm : Centimètre

DMSO : Diméthylsulfoxide

Fig ou FIG : Figure

g : Gramme

h : Heure

HPLC : Chromatographie en phase Liquide à Haute Pression

I2 : Diiode

INSA : Institut National des Sciences Appliquées

KBr : Bromure de potassium

Kg : Kilogramme

KOH : Hydroxyde de potassium

L : Litre

MeOH : Méthanol

mg : Milligramme

mL : Millilitre

mm : Millimètre

mn : Minute

MV : Matière végétale

N : Normalité

nm : Nanomètre

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

PDA : Potato Dextrose Agar

ppm : Partie par million

PPUR : Presses Polytechniques et Universitaires Romandes

Rdt : Rendement

Tr. : Temps de rétention

% : Pourcentage

°C : Degré Celsius

Résumé

Les principes actifs ou métabolites secondaires des végétaux constituent une source

inépuisable de molécules dotées de propriétés médicamenteuses très recherchées dans le

domaine pharmaceutique.

Le travail que nous avons entrepris porte sur l’étude phytochimique de la racine d’une

plante médicinale Bryonia dioica Jacq., dite Fashira ou Querioua, de la localité de

Bouamama (Oran) et sur l’évaluation de l’activité biologique de son extrait méthanolique.

La mise en évidence des phytoconstituants par des tests chimiques de coloration et de

précipitation, menée sur les extraits racinaires aqueux, éthanoliques,…et acides de la Bryone,

a montré la présence, d’alcaloïdes, d’anthracénosides, de composés réducteurs, de

flavonoïdes, d’hétérosides, de saponosides,… et de tanins.

Les alcaloides, les flavonoides, l’huile essentielle et les tanins, contenus dans

la racine de la Bryone, ont été extraits par différents protocoles expérimentaux. Les méthodes

spectroscopique et chromatographique disponibles que nous avons utilisées nous ont permis

de caractériser les différents principes actifs isolés. La diversité des éléments les composant,

le nombre de combinaison possibles rendent complexe l’établissement de leur structure.

Par ailleurs, les résultats des tests effectués in vitro avec l’extrait méthanolique de la

racine de la Bryone sur des espèces microbiennes, par la méthode de diffusion en milieu

solide, révèlent que l’extrait méthanolique présente une activité vis-à-vis des bactéries testées

et aucune sensibilité n’est observée pour les souches fongiques.

Mots clés : Principes actifs, Bryonia dioica Jacq., Extraction, Analyse, Chromatographie,

Spectroscopie, Activité antimicrobienne

Introduction

Générale

Introduction Générale

2


Les plantes aromatiques médicinales représentent un intérêt économique considérable par

leur appartenance aux industries de la parfumerie, des cosmétiques, de l’agroalimentaire et de la

pharmacie.1

De par leurs effets thérapeutiques, les principes actifs des végétaux : alcaloïdes,

flavonoïdes, hétérosides, huiles essentielles, quinones, saponosides, tannins, … et vitamines

constituent une source inépuisable de molécules doués de propriétés biologiques et

pharmacologiques très diversifiées.2

De nombreux médicaments renferment des principes actifs extraits des plantes. En effet,

environ 40% des médicaments en contiennent, par exemple en Chine les préparations

traditionnelles à base de plantes représentent entre 30 et 50% de la consommation totale des

médicaments.3

Actuellement, une grande partie de la population mondiale, particulièrement celle des

pays en voie de développement a recours aux remèdes naturels surtout d’origine végétale4.

Par exemple, en Afrique 80% de la population utilise la médication traditionnelle à base

d’extraits de plantes.5

De plus, la médication par les produits de synthèse devient préoccupante car elle présente

de nombreux effets néfastes pour la santé. A cet effet, l’étude de substances actives ou principes

actifs d’origine naturelle moins toxiques et en alternative avec les médicaments de synthèse

suscite un regain d’intérêt des scientifiques, du fait qu’elle permet la mise au point de nouveaux

médicaments. 6

1 Bruneton, J., “Pharmacognosie, Plantes médicinales”, Ed. Lavoisier, Techniques et documentation, Paris, 1999, p.405. 2 a) Beloued, A., “Plantes médicinales d'Algérie”, OPU, Alger. 1998; b) Sallé, J.L., "Le Totum en Phytothérapie’’ Approche de phytothérapie. Ed Frison-Roche. Paris 1991; c) Valnet, J., « Aromathérapie », Traitement des maladies par les essences de plantes. Ed. Vigot, 2001. 3 Organisation mondiale de la Santé. General Guidelines for Methodologies on Research and Evaluation of Traditional Medicine. Genève, Organisation mondiale de la Santé, 2002-2005 (référenceWHO/EDM/TRM/2002.1). 4 Organisation Mondiale de la Santé (OMS), Aide mémoire, N° 134, révisé Mai 2003. 5 Pousset, J.L., Medecine Tropicale, 2006, 66, p.606-609. 6 a) Farnsworth, N. R., Akerele, O., Bingel, A.S., Soejarto, D.D., Guo, Z., Bulletin de l’Organisation mondiale de

la Santé, 1986, 64(2), p.159-175 ; b) Roux, D., Catier, O., “Botanique, pharmacognosie, phytothérapie”, 3ème Ed. Porphyre, 2007, p.13.


3

Dans le cadre de l’axe de recherche sur la valorisation de la biodiversité floristique

algérienne et plus particulièrement des plantes aromatiques et médicinales7, nous avons entrepris

l’étude phytochimique du genre Bryone dite Fashira ou Querioua8 afin de justifier scientifiquement

l’utilisation de cette plante en médecine traditionnelle.

Notre étude a pour objet de mettre en évidence, en premier lieu les principaux

phytoconstituants de la racine de la Bryone, de tenter d’extraire quelques uns d’entre eux, pour

ensuite les analyser par les méthodes chromatographiques et spectroscopiques.

Dans un deuxième lieu, l’activité biologique de l’extrait méthanolique de la racine de la

Bryone sera évaluée

Notre travail, exposé dans ce mémoire, est partagé en quatre (4) chapitres :

Le premier chapitre est consacré à la présentation de la famille des cucurbitaceae

suivie par celle de la Bryone.

Le deuxième chapitre traite de la mise en évidence des phytoconstituants de la

racine de la Bryone précédée par une étude des principaux métabolites secondaires

des végétaux.

Le troisième chapitre porte sur l’extraction et l’analyse de quelques principes

actifs de la racine de la Bryone.

L’analyse microbiologique de l’extrait méthanolique de la racine de la Bryone est

développée dans le dernier chapitre.

Enfin, une conclusion générale résumera l’ensemble des résultats du travail fourni et les

perspectives envisagées. La composition des réactifs utilisés dans les tests phytochimiques

préliminaires est donnée en annexe.

7 Ouis, N., “Mise en évidence, Extraction et Analyse de quelques principes actifs de l’Anis, du Fenouil et du Persil”, Mémoire de Magister, Université d'Oran Es-Sénia, 2004. 8 Quezel, P., Santa, S., “Nouvelles Flore De L’Algérie et des Régions Méridionales”, Ed. CNRS, 1963, p.893.

Chapitre I

Les Cucurbitaceae

Chapitre I Les Cucurbitaceae

5

I. INTRODUCTION

Le règne végétal comprend une infinité de plantes. Ces derniers s’utilisent à divers et

multiples fins : alimentaires, ornementales, …et médicinales.

Les plantes sont classées en espèces, genres, ordres, …et familles botaniques. La

famille des Cucurbitaceae comprend environ 825 espèces réparties en 120 genres, pour la

plupart réparties dans les régions subtropicales et tropicales du globe.9 C’est une famille qui

constitue une source d'alimentation importante pour les êtres humains.10

II. PRESENTATION DES CUCURBITACEAE

Les Cucurbitaceae représentent une famille de plantes Dicotylédones grimpantes à

croissance rapide, portant des feuilles aux lobes palmés, des vrilles hélicoïdales et des fleurs

unisexuées monoïques ou dioïques, à racine charnue parfois très grosse.

La famille des Cucurbitaceae est répandue dans tous les continents du monde et

particulièrement en Afrique et en Amérique latine. Elle a une grande importance économique

car elle comprend des légumes comme les Courgettes et les Concombres, des fruits

comestibles comme le Melon (Cucumis melo) et la Pastèque (Citrullus vulgaris), des plantes

décoratives comme la Coloquinte (Citrullus colocynthis),… et la Bryone (Bryonia dioica) une

des rares Cucurbitaceae que l’on trouve à l’état sauvage.11

II.1. Appareil végétatif

Les Cucurbitaceae sont des plantes annuelles, vivaces à appareil végétatif aérien

généralement herbacé, à tige rampante ou grimpante par des vrilles opposées aux feuilles, qui

s’enroulent dans un sens, puis dans l’autre autour des objets environnants.

Les tiges, assez grêles, souvent cannelées, sillonnées et anguleuses par la présence de

collenchyme, peuvent dépasser 10 m de long.

Au niveau des nœuds se différencie un complexe axillaire comprenant une ou

plusieurs feuilles, une vrille, une ou plusieurs inflorescences, ou encore une ramification. Les

feuilles, alternes et exstipulées, peuvent varier considérablement de forme au sein d'une même

9 Mabberley, D. I., “The Plant Book” Camb. Univ. Press, Cambridge, New York, 1987. 10 Qaiser, M., et A. Perveen, Pak. J. Bot., 2008, 40(1), p.9-16. 11 Encyclopédie Microsoft® Encarta ® en ligne 2008.


6

espèce. Elles sont simples, entières, tri- ou palmatilobées. Plusieurs Cucurbitaceae vivaces

possèdent des racines charnues et volumineuses.12

II.2. Appareil reproducteur

Les fleurs sont unisexuées (plantes monoïques ou dioïques). Les sépales et les pétales

sont au nombre de cinq (05) généralement et les pétales sont soudés au moins à la base. Les

étamines sont également plus ou moins soudées par les filets.

Chez les fleurs mâles, les étamines sont soudées les unes aux autres. Chez les fleurs

femelles, le gynécée est composé de trois carpelles et d'un ovaire infère qui donnera un fruit.

L'inflorescence que l'on rencontre le plus souvent est une cyme. Une cyme est une

inflorescence simple, dans laquelle l'axe principal est terminé par une fleur (Fig. I.1).13

Figure I.1 : Bryonia dioica

A : Fleur mâle; B : Fleur femelle; C : Diagramme floral mâle; D : Diagramme floral femelle

12 http://www.plantes-botanique.org//f-cucurbitaceae 13 Roques, H., “Précis de botanique pharmaceutique : Phanérogamie“ Ed. Librairie Maloine, Paris, 1959.


7

Les fruits sont en général des baies à exocarpe, généralement coriace ou induré, ou

plus rarement une capsule sèche ou charnue à déhiscence variable. Ils contiennent des graines

aplaties à albumen fugace ou absent (Fig. I.2).14

Figure I.2 : Bryonia dioica

A : Fruit (Baie); B : Coupe transversale d’un fruit; C : Graine ; D : Coupe transversale d’une graine

III. ETUDE BOTANIQUE ET PHARMACOLOGIQUE DE LA BRYONE

La Bryone tire son origine des mots « Bryone » et « bryô » qui signifient

respectivement pousser et vigoureux en grec, puisqu’elle croît très rapidement et pousse

avec vigueur.

III.1. Répartition géographique et habitat

La Bryone appartient à la famille des Cucurbitaceae. Son aire de répartition est

eurasienne. Elle se trouve au Maghreb -Algérie, Maroc, Tunisie-, au Proche Orient, dans tous

les pays d’Europe Occidentale et particulièrement en France, dans certains pays d’Europe

Centrale et Méridionale ainsi que dans certains pays d’Asie. C’est une mauvaise herbe

volubile qui pousse dans les haies, buissons, broussailles de jardins. Elle grimpe dans les

endroits incultes,… et les murs des jardins.

14 Spichiger, R. E., Figeat, M., “Botanique systématique des plantes à fleurs : une approche phylogénétique nouvelle des angiospermes des régions tempérées et tropicales“ Ed. PPUR, Lausanne, 2002, p.413.


8

En Algérie, elle est commune partout dans les régions du Tell et plus rare ailleurs. Elle

pousse parmi les broussailles et dans les forêts.15

III.2. Présentation de la région d’étude

La plante étudiée provient de la localité de Bouamama (Fig.I.3) qui est mitoyenne

avec le quartier des Amandiers et se situe dans la région ouest d’Oran. Elle comprend les trois

régions suivantes :

El-Hassi

Coca-cola

Rocher

Elle est limitée au Nord par la forêt du Murdjadjou, à l’ouest par la commune de

Misserghin, au Sud par la commune d’Es-sénia (Fig. I.3) 16, à l’Est par la Deuxième Région

Militaire et le Stade Habib Bouakeul (Fig. I.4).

Cette zone est caractérisée par 400 Ha de terrains agricoles et de zone urbaine, constituée par

des terrains meubles, mi-rocheux et rocheux qui représentent environ 160 Ha.17

15 Ait Youcef, M., Brette, J. P., “Plantes Médicinales De Kabylie“ Ed. Ibis Press, 2006, p.75. 16 Sourissou, B., “Etude Hydrogéologique du Massif de Murdjadjou d’Oran“ Ed. ANRH, 1976. 17 Chenni, F. Z., Mémoire de Magister, Département de biologie, Université de Sidi Bel Abbès, 2005.


9

Figure I.3 : Carte représentant la zone d’étude


10

Figure I.4 : Situation géographique de la zone d’étude


11

III.3. Classification

Le genre Bryone comprend douze espèces réparties en Europe et en Asie.18 Toutes les

espèces sont dioïques à part Bryona alba qui est monoïque. Seules les espèces Bryonia alba

Linn. et Bryonia dioica Jacq. sont utilisées en médecine et se distinguent entre elles par la

couleur de leurs baies, les unes sont noires et les autres sont rouges.19

La Bryone dioïque occupe la position suivante dans la classification12 des plantes :

Embranchement : Spermatophytes (Plantes à graines)

Sous-embranchement : Angiospermes (Plantes à fleurs)

Classe : Dicotylédones

Sous-classe : Dilleniidae

Ordre : Violales

Famille : Cucurbitaceae

Genre : Bryone

Espèce : Dioïque

III.4. Noms et Synonymes végétaux

Le nom scientifique de la Bryone est : Bryonia dioica Jacq. Il faut noter que plusieurs

noms et synonymes lui sont attribués dans la littérature :

Synonymes : Bryonia acuta Desf., Bryonia cretica ssp. dioica (Jaq) Tutin.

Noms Vernaculaires : Fachira, Querioua, âneb d-dib « raisin du chacal », Karma

beida « arbre blanc », Luwwâya « celle qui s’enroule ». 15

Autres noms : Bryone, Bryone dioïque, Couleuvrée, Navet du diable, Vigne blanche,

Herbe de feu, Ipéca indigène.20

18 Bailey, L. H., “The Standard Cyclopedia of Horticulture“, The Mac-MillianCompany, New-York, 1950, Vol.1, p.453-83. 19 Rendle, A. B., “The Classification of Flowering Plants”, The University Press Cambridge, 1959, Vol.2, p.216-27. 20 Debelmas, A., Delaveau, P., “Guide des plantes dangereuses“, 2éme Ed. Maloine, Paris, 1978, p.105-106.


12

III.5. Description botanique

La Bryone est une plante dioïque : elle possède des fleurs mâles à étamines et des

fleurs femelles à carpelles sur des pieds différents. L’ovaire infère est constitué de trois carpelles.

L’inflorescence est en petit corymbe. C’est une plante vivace, très commune dans les

haies, possédant une racine rameuse, longue, fusiforme, charnue, d’un blanc jaunâtre, à stries

transversales parfois grosse comme le bras.

Ses tiges sont grêles, sarmenteuses, cannelées, velues et grimpantes. Elles peuvent

atteindre 6 m de long. Ses feuilles alternes, palmatilobées, calleuses, rudes au toucher,

présentent à la base de leur pétiole une longue vrille enroulée en spirale. 13


13

Le fruit dit « bacciforme » est une baie. Il mesure 6 à 8 mm de diamètre, de la grosseur

d’un grain de groseille et de forme globuleuse ou ovale. Sa surface est lisse et mate.

Il porte au sommet les restes jaunâtres des stigmates. Il est de couleur verte, puis

orange, puis rouge pourpre à maturité (durant l’automne). Il contient 4 à 6 graines appelées

« pépins ». Elles sont de forme aplatie, elliptique, avec une extrémité arrondie et l’autre

pointue (longueur 5 mm; largeur 3 mm ; épaisseur 2 mm); elles sont dépourvues d’albumen et

sont de couleur jaune à brunâtre. 15

III.6. Usages et Propriétés thérapeutiques

La Bryone présente à la fois des effets toxiques et thérapeutiques par sa racine, son

suc… et ses fruits. Elle a figuré dans la pharmacopée française jusqu’en 1884. Cet intérêt à

cette époque est dû à son emploi à très faibles doses (à raison de 1 à 2 g) comme purgatif

drastique qui a été recommandé dans le traitement des œdèmes,…et des congestions

cérébrales. Toutefois, il faut l’utiliser avec précaution car c’est un remède dangereux pouvant

donner lieu à des diarrhées cholériformes et hémorragiques.21

La racine de la plante Bryone a été employée dans différents pays en médecine

vétérinaire, en usage interne, en médecine populaire comme vomitifs d’où son appellation

ipéca indigène 20 et comme anti-laiteux (pour arrêter l’allaitement en s’opposant à la montée

laiteuse). Cet usage a conduit à des accidents avec vertiges, diarrhées et convulsions.21

21 Paris, R., Moyse, H., “Précis de matière médicale. Tome III : Pharmacognosie spéciale, Dicotylédones“ Ed. Masson, 1971.


14

En Afrique du Nord le suc de la plante fraîche était employé en usage interne, comme

purgatif très violent et bon vermifuge. En usage externe, Il s’utilise dans le traitement des

ulcères, de la gale et de la lèpre. 22

En Tunisie23 et au Maroc la Bryone est employée prudemment car le contact avec des

racines fraîches, de la poudre de racine ou du suc de la plante provoque sur la peau des

irritations, des rougeurs,… et des inflammations graves qui peuvent suppurer.24La racine est

employée au Maroc en usage interne. Néanmoins, elle entraîne de nombreuses intoxications,

parfois mortelles par surdosages thérapeutiques.25

Aussi la Bryone est un remède populaire utilisé comme purgatif et dans le traitement

de la goutte.26 Elle favorise aussi l'évacuation des mucosités bronchiques. On la recommande

essentiellement en cas d'affections rhumatismales douloureuses et inflammatoires, tels que

l'ulcère du duodénum, l'asthme, les bronchites et les pleurésies.27

Elle fait également baisser la tension artérielle. La plante entière est un antiviral

puissant. Les recherches indiquent qu'elle serait adaptogénique c’est-a-dire qu’elle aiderait

l'organisme à s'adapter au stress.28

En outre, la Bryone est préconisée souvent dans le traitement de nombreux cancers

(colon, abdomen, sein, peau, glande,… etc.) à tous les stades de la cancérogenèse.29

En Algérie, la racine, seule partie de la plante à être utilisée, était employée en usage

interne, comme :

- Purgatif drastique dans les affections rhumatismales

- Diurétique

- Base de préparations homéopathiques.30

22 Le Floc’h, E., “Contribution à une étude ethnobotanique de la flore tunisienne“, Tunis, 1983, p.402. 23 Boukef, M, K., “Les plantes dans la médecine traditionnelle tunisienne“, Ed. Librairie Larose, Paris, 1986, p.350. 24 Bellakhdar, J., “La pharmacopée marocaine traditionnelle“. Ibis Press, Paris, 1997. 25 Charnot, A., “Toxicologie au Maroc. Mémoire de la Société des Sciences Naturelles au Maroc“, Ed. Siège de l'I.S., Rabat, 1945. 26 Evans, W.C., “A Text Book of Pharmacognosy”, 14th Ed. WB Saunders Company Ltd., 24-28 Oval Road, London, 1997, p.44, 474, 489-94. 27 Youngken, W.H., “Text Book of Pharmacognosy”, 6th Ed. The Blakiston Division, McGraw Hill Book Company Inc., New-York, 1950, p.478-658. 28 Paul Iserin., “Encyclopedie des plantes médicinales“, 2éme Ed. Larousse, 2001, p.180. 29 Duke, A. J., DuCellier, J., Duke, K. P., “Handbook of Medicinal Herbs“, 2e Ed, CRC Press, 2002, p.621. 30 Fourement, P., Roques, H., “Répertoire des Plantes Médicinales et Aromatiques d'Algérie“, Imprimerie P. Guiauchain, Alger, 1942, p.159.


15

Egalement la racine s’utilise encore sous forme de préparation en infusion et cataplasme

comme diurétique, vermifuge, troubles intestinaux, contusions… et rhumatismes.31

Les baies de la plante présentent en usage interne un certain danger. Leur

consommation accidentelle ou à des fins thérapeutiques donne lieu à des intoxications

parfois mortelles, selon la quantité ingérée. Par exemple dix baies peuvent tuer un jeune

enfant. Ces baies rouges se signalent par leur aspect séduisant ; ce qui provoque la convoitise

des enfants très jeunes qui seront tentés de les goûter. 20

Il est à noter que dans l’ouest Algérien particulièrement à Oran et à Mascara, la racine

sèche de la Bryone est populairement appelée ‘’Berestom ‘’par confusion avec celle du genre

Aristolochia (A. baetica L. & A. paucinervis) qui appartient à la famille des Aristolochiaceae.

La population locale préconise une ‘’Akda’’ composé d’un mélange de plusieurs

ingrédients à mesure égale (Aalk attarh, amandes ou cacahuettes , feuilles de pêches, griss,

henne, horf, jaada, karwiya, laktaf, marraret el hench, mensoufa, nabta elbeida, sanoudj, yazir,

halba, sauf pour la racine de la Bryone 1/2 mesure) à prendre tous les matins à jeûn avec du

miel pour le traitement du cancer sous toutes ses formes.

IV. CONCLUSION

Il ressort de cette étude que la famille des Curcubitaceae comprend des légumes, des

fruits, des plantes décoratives,… et une plante médicinale : la Bryone. Cette dernière a été très

utilisée par le passé comme purgatif. Outre sa toxicité, elle offre, par ailleurs, tout un éventail

d’activités biologiques : vermifuge, anti-cancérigène, anti-rhumatismale, anti-inflammatoire,

anti-stress…etc. Ses multiples et diverses propriétés thérapeutiques sont dues aux composants

ou principes actifs qu’elle contient. Le chapitre suivant aura pour objectif de mettre en

évidence les principaux phytoconstituants de la racine de la Bryone.

31 Cecchini, T., “Encyclopédie des plantes Médicinales“ Ed. De Vecchi, 1993, p.66.

Chapitre II

Screening Phytochimique

Chapitre II Screening phytochimique

17

I. INTRODUCTION

Le règne végétal renferme deux types de métabolites qui se différencient entre eux par

leur constitution, leur rôle et leur emploi :

Les métabolites primaires (glucides, protides, lipides,… et acides nucléiques) qui sont

présents en permanence chez les plantes et sont indispensables à la croissance et à la

reproduction des plantes.

Les métabolites secondaires ou principes actifs dont la proportion varie selon la famille,

le genre et l’espèce ne sont pas impliqués dans le développement des plantes.

Avant d’entamer nos tests phytochimiques proprement dit sur la racine de la Bryone, Il

nous a semblé judicieux de donner un bref aperçu sur les différents principes actifs des plantes

et sur leur mise en évidence à savoir : Alcaloïdes, flavonoïdes, huiles essentielles,

saponosides,….et tanins.

II. GENERALITES SUR LES PRINCIPES ACTIFS

Les principes actifs sont des molécules de structure assez complexe à propriétés thérapeutiques très diversifiées.

II.1. Les alcaloïdes

Les alcaloïdes sont des substances organiques naturelles rappelant les alcalis par leurs

propriétés. Alcalis tire son origine de l’arabe al kaly, et du grec eidos signifiant respectivement

soude et aspect.

Ce sont des substances azotées d’origine le plus souvent végétale. Il n’en n’existe que

de rares représentants dans le règne animal. Ils existent le plus souvent sous forme de sels

(citrates, sulfates, nitrates, tartrates,…) ou combinés avec les tanins chez les végétaux. Ce sont

des composés présents principalement chez les Angiospermes Dicotylédones. Ils sont

localisés dans les tissus périphériques tels que les écorces de tige et de racine, les téguments

des graines…par exemple. 1

Ils sont doués, à faible dose, de propriétés pharmacodynamiques marquées et sont

reproductibles par synthèse.32

32 Pengelly, A., “Constituents of medicinal plants“, 2éme Ed. Sunflower Herbals, 1996, p.77-99.


18

Les alcaloïdes ont des masses moléculaires variant de 100 à 900. Ils sont au nombre de

10 000 composés dont le premier à avoir été découvert, en 1803 par Derosne, est la narcotine

de l'opium. Du point de vue chimique, ils sont classés selon la nature du noyau hétérocyclique

présent dans la molécule (Fig. II.1).33

N

HIndole

N

N

Imidazole

N

Pyrrolizine

Figure II.1 : Classification des alcaloïdes selon leur noyau hétérocyclique

A titre indicatif, quelques structures d’alcaloïdes sont rassemblées dans la figure II.2.

33 Woolley, J. G., “Plant Alkaloids in Encyclopedia of life sciences“, Nature Publishing Group, 2001.

N

Tropane

Me

NPyridine


19

Groupe pyrrolidine

N

O

Hygrine

Groupe pipéridine

N

H

(+) Conïne

Groupe pyrolidine-pyridine

Nicotine

Groupe quinoline

N

N

O

HO

Quinine

Groupe isoquinoline

Berbérine

Groupe indole

Emétine

Groupe phénanthrène

Codéine

Groupe Tropane

Cocaïne

Figure II.2 : Exemples de structure d’alcaloïdes


20

Les alcaloïdes non oxygénés sont liquides à température ambiante, volatils, entraînables

à la vapeur d’eau comme par exemple la coniine, la nicotine…, par contre les alcaloïdes

oxygénés sont solides cristallisables et parfois colorés : berbérine, sanguinarine…. Certains

alcaloïdes sont doués de pouvoir rotatoire. Ils ont la propriété de former des sels et d'être

amers. Les alcaloïdes bases sont, en général, insolubles ou peu solubles dans l’eau, solubles

dans les solvants organiques apolaires ou peu polaires. Leurs sels sont généralement solubles

dans l’eau et dans les alcools dilués. 1

II.1.1. Caractérisation des alcaloïdes

Les alcaloïdes sont caractérisés par plusieurs réactions de précipitation qui diffèrent

par leur composition.

À une pincée de poudre végétale sont ajoutées quelques gouttes d’eau distillée

acidulée avec l’acide sulfurique (H2SO4) à 0,5N. L’extrait obtenu après filtration de la

solution est reparti sur des tubes à essai puis soumis aux réactifs suivants :

Réactif de Bouchardat (iodo - ioduré) : Précipité brun.

Réactif de Valser Mayer (tétraiodomercurate de potassium) : Précipité blanc jaunâtre.

Réactif de Dragendorff (tétraiodobismuthate de potassium) : Précipité orangé à rouge.

Réactif de Bertrand (silico-tungstique ou phospho-tungstique) : Précipité blanc jaunâtre.

II.1.2. Action pharmacologique et emplois

Les alcaloïdes sont des substances très intéressantes par leurs activités

pharmacologiques des plus variées :

Sur le système nerveux central comme anti-dépresseurs : codéine, morphine…

Sur le système nerveux autonome excitant du sympathique : hordéine, éphédrine…

Sur les vaisseaux hypertenseurs : hydrastine.

Sur la circulation sanguine : vincamine.

Ce sont pour la plupart des poisons végétaux très actifs, dotés d'une action spécifique.

La médecine les emploie le plus souvent à l'état pur. Il est à noter que les alcaloïdes jouent, à

faibles doses, le rôle d’anesthésiques locaux (cocaïne), d’analgésiques (morphine),


21

d’antibiotiques, d’antiparasitaires, d’antipaludiques (quinine), d’anti-tumoraux (vinblastine),

d’amoebicides (émétine)… 1

II.2. Les anthocyanes

Le mot anthocyane tire son origine du grec anthos, fleur et kuanos, bleu violet. Les

anthocyanes sont le plus important groupe de pigments végétaux qui font partie des

polyphénols. Ces pigments hydrosolubles sont responsables de la coloration des plantes en

bleu, rouge, rose, violet ou orange. 1,34 Ces couleurs varient en fonction du pH et dépendent

aussi du nombre d’hydroxyles portés par le cycle B. Elles sont habituellement caractéristiques

des pétales de fleurs, des fruits et des baies rouges ou bleues. Elles se rencontrent également

dans les bractées, les feuilles, les pétioles, les tiges, les racines et même les graines. Elles sont

généralement localisées dans les vacuoles des cellules épidermiques qui sont de véritables

poches remplies d’eau. Leur aglycone (partie non glucidique) est appelée anthocyanidine et

dérive d’un noyau hétérocyclique de type benzopyroxonium à oxygène tétravalent. 35

Les formules de quelques anthocyanidines sont données dans le tableau II-1.

Tableau II.1 : Nomenclature des anthocyanidines

OHO

OH

OH

1

2

345

6

7

8

2'

3'

5'

6'

4'

3’ 4’ 5’ Anthocyanidines correspondantes

H OH H Pélargonidine

OH OH H Cyanidine

34 a) Harborne, J., B., “Comparative biochemistrie of the flavonoïds”, Academic Press, New York, 1967, p.1-30; b) Brouillard, R., « The flavonoids », Advances inceserch since, 1986, Ed. J.B.Harborne, Chapman and Hall, London, 1993, p.525-538. 35 a) Harborne, J., B., Grayer, R.,J., “The flavonoids”, Advances in research since, 1980, Ed.J.B.Harborne, Chapman and Hall, London, 1988, p.1-20; b) Mc-Clure, J. W., « Biochemastry of plants phenolics », éds. T. Swain, J. B. Harborne et C. F. Van Sumere, Plenum Press, New York, 1979, p.525; c) Merlin, J. C., Statoua, A. et Brouillard, R., « Phytochemistry », 1985, 24, p.1575-1581.


22

OH OH OH Delphinidine

OCH3 OH OCH3 Malvidine

OCH3 OH H Péonidine

OH OH OCH3 Pétunidine

En général, la partie glucosidique des anthocyanes est située le plus souvent en

position 3 et 5 de la molécule par l’intermédiaire de l’hydroxyle. Les sucres les plus fréquents

sont le glucose, le galactose, …et l’arabinose).

II.2.1. Caractérisation des anthocyanes

La recherche des anthocyanes repose sur l’apparition d’une coloration rouge en milieu

acide et bleue violacée en milieu alcalin. Leur mise en évidence s’effectue sur un extrait

aqueux ou alcoolique de la matière végétale, on observe des changements de coloration en

fonction de l’acidité :

pH acide : coloration rouge

pH alcalin : coloration bleue ou bleue violacée (par ionisation des fonctions

phénols)

pH 12 : coloration jaune (par fonction d’une chalcone)


L’action pharmacologique des anthocyanes est en général, limitée au domaine

vasculaire. Elles augmentent, comme tous les flavonoïdes, la solidité des capillaires. Elles

inhibent les enzymes protéolytiques de dégradation. Elles sont proposées en ophtalmologie en

cas de troubles oculaires et pour l’amélioration de la vision crépusculaire.

Elles sont peu utilisées dans l’industrie alimentaire et cosmétique, et ceci du fait de leur

instabilité vis-à-vis des facteurs physico-chimiques incontournables (lumière, température et

pH), ainsi que par leur sensibilité aux sulfites (souvent utilisés comme conservateurs) et aux

métaux (présents dans les boîtes de conserves).1


23

II.3. Les flavonoïdes

Le terme flavonoïde désigne une très large gamme de composés naturels appartenant à

la famille des polyphénols36. Ce sont des pigments jaunes responsables de la coloration des

plantes. Ils sont largement abondants chez les plantes supérieures, d’une manière très

générale, dans toutes les plantes vasculaires où ils peuvent être localisés dans divers organes :

racines, tiges, bois, feuilles, fleurs, fruits, pollen… Ils sont également présents dans les

légumes, le vin rouge et le thé. Les herbes aromatiques (persil, céleri,…et thym), les céréales

et les épices constituent une source importante de flavonoïdes. Il est à souligner qu’ils sont

pratiquement absents chez les algues.

De nos jours, plus de 4000 flavonoïdes ont été identifiés. Ils ont une origine

biosynthétique commune et par conséquent, possèdent tous un même squelette de base à

quinze atomes de carbone (C15), constitué de deux unités aromatiques, deux cycles en C6 (A et

B), reliés par une chaîne en C3 (Fig. II.3). 1

Figure II.3 : Squelette de base des flavonoïdes

Structuralement, les flavonoïdes se répartissent en plusieurs classes de molécules qui ont

tous en commun, la structure de la flavane, 3 cycles dont un hétérocycle dont la configuration

variée permet leur classification en familles: flavones, flavonones, flavonols, flavanediols,…

et les chalcones dont l’hétérocycle n’est pas formé et qui est un intermédiaire caractéristique

de la synthèse de différents flavonoïdes. Ils diffèrent aussi les uns des autres par le type de

sucre lié à l’aglycone, par le degré d’insaturation de l’hétérocycle et par le degré

d’hydroxylation, méthylation,… des noyaux A et B (Fig. II.4).37

36 Diehl, M. A., Schulz, C. M., Shaw, D. A., and Williams, T. M.,’’Bioflavonoïds: a new approach in cosmetics.” Cosmetics & toiletries manufacture worldwide, 2001, p.6. 37 Richter, G., “Métabolisme des végétaux: physiologie et biochimie“ Ed. PPUR, 1993, p.330-340.


24

O

A

B

O

O

FlavanonesO

O

FlavonesO

OH

Chalcones

Flavane

O

Anthocyanidines

OH

O

Flavan-3,4-diols

O

Flavan-3-ols

O

O

Flavonols

OHOH

OH

OH34

3

35

6

78

4

3

2

2'3'

4'

5'

6'

1 1'

Figure II.4 : Structure des différents types de flavonoïdes à partir du squelette flavane

Les flavonoïdes sont des solides cristallisés dont la teinte varie du blanc au jaune vif.

La grande diversité de leurs couleurs dépend principalement du nombre de groupements

phénoliques, ou des groupements méthoxy (OCH3), portés par leur cycle B. Ils sont solubles

dans les solvants organiques apolaires.

Il faut souligner que le noyau flavonoïde est souvent lié à un sucre pour former un

hétéroside qui est soluble dans l’eau, l’alcool et les solvants organiques polaires mais

insolubles dans les solvants organiques apolaires.1

II.3.1. Caractérisation des flavonoïdes

La recherche de flavonoïdes se fait par de nombreuses réactions colorées, mais la plus

connue et retenue est celle de la cyanidine.


25

À un extrait alcoolique sont ajoutés quelques gouttes d’acide chlorhydrique concentré

avec quelques brins de tournures de magnésium; après dégagement d’hydrogène par réduction

des flavonoïdes en anthocyanes, on observe une coloration en fonction de la structure des

flavonoïdes mis en jeu à savoir :

Flavone : coloration rose orangée

Flavonol : coloration rouge

Flavonone : coloration rose violacée

Chalcone et Isoflavone : pas de coloration


Une des propriétés majeure des flavonoïdes est de contribuer à la couleur des plantes

et notamment à celle des fleurs. Or, c’est par la couleur de ses fleurs que la plante exerce un

effet attracteur sur les insectes et les oiseaux pollinisateurs, assurant par ce biais une étape

fondamentale de sa reproduction. On peut également noter que les flavonoïdes, en repoussant

certains insectes par leur goût désagréable, peuvent jouer un rôle dans la protection des

plantes.38

Les flavonoïdes sont, en effet, essentiellement connus pour leur action anti-oxydante.39

Ils diminuent la perméabilité et augmentent la résistance des capillaires (action sur les artères,

veines, capillaires, lymphatiques…).1

Ils sont également reconnus pour leurs nombreuses et diverses activités

thérapeutiques: anti-allergiques, antivirales40et anti-inflammatoires.41 Ces activités sont dues à

leur capacité de piéger les radicaux libres et d’inhiber les enzymes responsables de la

formation de ces radicaux. La consommation régulière de fruits frais et de légumes diminue le

risque de développement des maladies cardiovasculaires et d’apparition de certains cancers.42

38 Bovy, A., Phytochemistry., 2004, Vol.65, p.2631-2648. 39 Woodman, O. L., Meeker, W. F., Boujaoude, M., J. Cardiovasc. Pharmacol., 2005, Vol. 46, n°3, p.302-309. 40 Van Hoof, L., Vanden Berghe, D. A., Hatfield, G. M., Vlietinck, A. J., Planta Medica., 1984, 50, p.513-517. 41 Brasseur, T., J. Pharm. Belg. 1989, 44, p. 235-241. 42 Hertog, M.G., Feskens, E.J., Hollman, P.C., Katan, M.B., Kromhout, D., Lancet., 1993, 342, p.1007-1011.


26

II.4. Les hétérosides

Les hétérosides ou glycosides sont des molécules formées par combinaison d’oses et de

substances non glucidiques appelées aglycones ou génines. Ce sont les substances du

métabolisme secondaire les plus anciennement connues. Ils forment des substances de réserve

localisées dans les vacuoles cellulaires. Les hétérosides se différencient entre eux par leurs

génines qui appartiennent à tous les groupes du métabolisme secondaire (flavonoïdes,

saponosides,…et tanins) et par le mode de liaison entre la génine et l’ose, ainsi que par la

nature de la partie glucidique.43 Ils sont classés selon la nature de la liaison en C-, N, O- ou S-

hétérosides :

C- Hétérosides

O

OH

O

HO

OHO

HO

OH

OH

OH

Vitexine

La liaison entre la génine et l’ose se fait de

carbone à carbone. Parmi les flavonoïdes les

plus fréquents, on peut citer la vitexine.44

N-Hétérosides

Ce sont des dérivés du ribose ou du désoxyribose liés à des bases pour former les

nucléosides, présents dans toutes les cellules (ARN et ADN).45 En outre, la liaison

hérérosidique se produit entre la fonction réductrice de l’ose et une fonction amine.

43 Guignard, J.L., " Biochimie végétale", Ed. Masson, Paris, 2000, p. 231-241. 44 Ribéreau-Gayon, P., « Les composés phénoliques », Dunod, 1968,7, p.120. 45 Charles A. Q., Linden, G., « Abrégé de biochimie alimentaire », 4émeEd. 1997, p.118-119.


27

O-Hétérosides

Quelques exemples d’hétérosides sont représentés ci-après : La digitoxoside et le

mélitoside, hétérosides cardiotoniques, se trouvent dans la digitale et le mélilot.

HC

C

O

N

CH2

OH

OHHO

O

O

HO

OHHO

CH2OH

Amygdaline

(Amandes amères) 45

Digitoxoside (digitale)

Mélitoside (mélilot)

S- Hétérosides

O

CH2OH

HO

OH

OH

H

S C

OSO3K

N CH2 CH

CH2

Le Sinigroside est un hétéroside sulfuré, localisé

dans les grains de la moutarde noire et dans

diverses crucifères. La liaison hétérosidique se

fait entre la fonction réductrice de l’ose et un

thiol. 43


28

II.4.1. Caractérisation

La caractérisation des hétérosides s’effectue par l’apparition d’une couleur plus ou

moins intense selon la structure de l’hétéroside à partir d’un extrait chloroformique additionné

d’une solution d’hydroxyle d’ammonium.


Il convient de noter que les différents groupes d’hétérosides ont des propriétés

pharmaceutiques et sont employés en thérapeutique. Les glycosides cardiotoniques, par

exemple, sont des médicaments utilisés dans le traitement de l’insuffisance cardiaque ou

l’arytmie cardiaque. D’autres hétérosides ont une activité vitaminique concernant les

capillaires sanguins, la peau (flavonoïdes hétérosidiques, anthocyanosides). Certains d’entre

eux, par leur goût amer et leur toxicité, protègent la plante contre les prédateurs. Néanmoins,

chez les mammifères (lapin, mouton), la forte consommation de plantes à glucosinolates peut

conduire à la formation d’un goitre. Les thiocyanates captent en effet l’iode et empêchent sa

fixation par la thyroïde. 43

II.5. Les Huiles essentielles

Les huiles essentielles (H.E) sont des extraits volatils et odorants que l'on extrait par

distillation à la vapeur d'eau, pressage ou incision de certains végétaux qui les contiennent.

Elles se forment dans un grand nombre de plantes comme sous-produits du métabolisme

secondaire.

Les H.E sont très largement répandues chez les végétaux supérieurs. Ils s'accumulent

dans certains tissus au sein de cellules ou de réservoirs à essence, sous l'épiderme des poils,

des glandules ou dans les espaces intercellulaires. Elles peuvent être localisées dans les

cellules sécrétrices isolées, mais on peut les trouver le plus souvent dans les organes

sécréteurs.46

Les H.E sont généralement liquides à température ambiante. Elles ne sont que très

rarement colorées. Leur densité est le plus souvent inférieure à l’eau. Elles ont un indice de

réfraction élevé, et le plus souvent sont douées de pourvoir rotatoire. Elles sont volatiles et

entraînables par la vapeur d’eau, elles sont très peu solubles dans l’eau, mais elles lui

communiquent leur odeur.

46 El Abed, D., et Kambouche, N., « Les huiles essentielles » Ed. Dar El Gharb, 2003.


29

Elles sont solubles dans l’alcool et dans la plupart des solvants organiques. La teneur

des huiles essentielles est généralement faible, elle est de l’ordre de 1% à 5%. Il existe

quelques exceptions comme par exemple la Badiane de Chine, où la teneur en essence est

supérieure à 5%.

Les terpènes et les composés aromatiques du phénylpropane sont les principaux composants

des huiles essentielles. Le squelette carboné des terpènes dérive formellement du squelette

ramifié en C5 de l’isoprène (2méthylbuta-1,3-diène : C5H8). Ils résultent de la condensation de

deux ou plusieurs unités isopréniques. Selon le nombre d’unités associées,

on les classe en 47 :

Hémiterpènes (C5)

Monoterpènes-(C10)

Sesquiterpènes(C15)

Diterpènes(C20)

TriterpènesC30)

Tétraterpènes-(C40) et polyterpènes.

Les huiles essentielles contiennent surtout des monoterpènes (C10), sesquiterpènes

(C15) et plus rarement des diterpènes (C20).48

Les terpènes sont de structures très diverses (acycliques, monocycliques,

bicycliques,…) et contiennent la plupart des fonctions chimiques des matières organiques :

alcool, aldéhyde,…et cétone.1

A titre indicatif, quelques-unes de leurs structures sont représentées sur la figure II.5.

47 Allinger, N.L., Cava, M.P., Dejougle, C.R., Jonhson, C.R., Lebel, N.A. et Stevens, C.L., “Chimie organique“, Ediscience Mc Graw. Hill, Paris, 1975, p.813. 48 Finar, I.L., "Organic chemistry", Ed. Longman Scientific et Technical, 1994, Vol. II, p.354.


30

Myrcène

Limonène

CHO

Géraniol

O

Carvone

-Terpinéol

-Pinène

OH

Bornéol

O

Camphre

Figure II.5 : Exemples de structures terpéniques

Les composés aromatiques dérivant du phénylpropane (C6-C3) sont moins fréquents

que les terpènes dans les HE et eux aussi peuvent contenir différentes fonctions. Nous avons

représenté sur la figure II.6 quelques unes de leurs structures.

Eugénol

(girofle)

E-anéthol

(anis, fenouil)

O

OCH3

OH

Vanilline

Cinnamaldéhyde

(cannelle)

Figure II.6 : Exemples de structures dérivant du phénylpropane

CHO


31

II.5.1. Caractérisation

Les terpènes, principaux constituants des huiles essentielles, sont mis en évidence

comme les stérols insaturés par la réaction de Salkowski (addition d'acide sulfurique à la

solution chloroformique) :

Coloration jaune avec une fluorescence verte : phase inférieure sulfurique

Coloration rouge : phase supérieure chloroformique


Les huiles essentielles, mélanges complexes de constituants en proportions souvent

variables, sont employées depuis les temps les plus reculés pour leurs effets thérapeutiques les

plus diversifiés. Elles sont douées de toute une gamme de propriétés biologiques. Chaque

huile possède des vertus spécifiques liées aux différents composants qu’elle renferme.

Un grand nombre d’H.E présentent des propriétés antiseptiques, d’autres des

propriétés digestives ou des propriétés antispasmodiques, sédatives, irritantes, cicatrisantes,

etc…Ces activités sont dues surtout à leurs constituants terpéniques. La mise en évidence de

leur activité biologique a fait l’objet de nombreuses études.49 Le tableau II.2 regroupe

l’activité biologique de quelques terpènes.

Tableau II.2 : Activité biologique de quelques composés terpéniques50

Composés Structures Activités biologiques

Thymol OH

Antimicrobien; Analgésique; anti-acné; anti-

herpétique; anti-inflammatoire;

antispasmodique; antioxydant; antiseptique;

antitussif; sédatif; pesticide; insectifuge.

49 Bakkali, F., Averbeck, S., Averbeck, D., Idaomar, M., Food and Chemical Toxicology, 2008, 46, p.446-475. 50 Duke, J. Ac., Phytochemical and Ethnobotanical Databases, Site Internet : « http://www.ars-grin.gov/duke/chem- activities.html».


32

β-Caryophyllène

Anti-acné; antiasthmatique; anti-microbien;

anti-tumorale, anti-inflammatoire;

sédatif; pesticide; insectifuge.

Myrcène

Analgésique; antimicrobien;

antispasmodique; antioxydant;

anti-épileptique; hypothermie; pesticide;

insectifuge.

Camphre

OCH3

CH3

CH3

Analgésique; allopathique; anesthésique;

anti-diarrhéique; antiémétique;

antispasmodique; antiseptique; antioxydant;

anti-épileptique; antinévralgique;

antifongique; anti-acné; expectorant;

pesticide; insectifuge.

II.6. Les quinones

Les dérivés quinoniques renferment au sein de leur molécule des quinones. Ces

dernières sont des composés oxygénés, caractérisés par le motif 1,4-dicéto cyclohexa-2,5-

diénique (p-quinone) ou par celui du 1,2-dicéto cyclohexa3,5-diénique (o-quinone).

Elles sont liées au benzène, au naphtalène, à l’anthracène,…et au naphtodianthracène.1

p-Quinone

O1

2

3

45

6O

o-Quinone


33

Les composés quinoniques existent dans le végétal (fleurs, champignons et algues) à

l’état libre ou combiné (sous forme d’hétérosides).45Ils sont classés en benzoquinones,

naphtoquinones, anthraquinones, anthracyclinones, …selon le noyau présent dans leur

molécule. A titre indicatif, sont donnés sur la figure II.7 quelques structures de dérivés benzo

et anthraquinoniques.

R1= OH, R2 = CH3 : Plumbagone

R1 = OH, R2 = H : Juglone

R1 = H, R2 = OH : Lawsone

O

O

Anthraquinone

Figure II.7 : Exemples de structures quinoniques

Les quinones libres sont solubles dans les solvants organiques et insolubles dans l’eau.

Leurs hétérosides sont solubles dans l’eau et les solutions hydro-alcooliques. Elles absorbent

dans le domaine UV. 1

II.6.1. Caractérisation des quinones

Les quinones sont caractérisées par la réaction de Bornträger effectuée soit

directement sur la matière végétale, soit après extraction au chloroforme. Une coloration rose

en milieu ammoniacal se développe révélant la présence de dérivés quinoniques.


Les quinones sont des composés irritants qui ont des propriétés laxatives (émodol),

phytotoxiques (juglone) et allergiques (alkyl benzoquinones). Certaines d’entre elles ont des

propriétés tinctoriales comme par exemple la lawsone localisée dans les feuilles de l’arbuste

tropical Henne. Elle sert à teindre en orange la soie,…et les cheveux.47


34

II.7. Les saponines ou saponosides

Les saponosides ou saponines (du latin sapo signifiant savon) sont des tensio-actifs

très répandus chez les végétaux. Ce sont des glycosides terpéniques. Ils se dissolvent dans

l’eau en formant des solutions moussantes comme les savons. Structuralement,

les saponosides peuvent être classés en deux groupes selon la nature de leur génine :

Saponosides triterpéniques

Ce sont les plus nombreux, environ 120. Ils sont essentiellement présents chez les

Angiospermes Dicotylédones, la structure de leur aglycone en C30 étant le plus souvent

pentacyclique comme la β-amyrine.

3

1

2

45

67

810

9

11

1213

14

1516

17

2019

22

282625

24 23

18

21

27

HO

H

H

H

3029

β-amyrine

Saponosides stéroïdiques

Ils sont surtout représentés chez les Angiospermes Monocotylédones. La structure de

leur aglycone en C27 dérive uniquement de celle du stérane. La diosgénine en est un exemple.

HO

HO

O

H H

H

H

3

12

45

67

810

911

12

1314

15

16

17

20

19

22

26

25

24

23

18

21 27

Diosgénine

Du point de vue chimique, Ils se caractérisent également par un radical glucidique

(glucose, galactose) rattaché au groupe hydroxyle du carbone 3.


35

Ils ont une importance économique comme source de composés stéroïdaux, leur

aglycone étant libéré de son oligoholoside pour synthétiser des stéroïdes humains.

Leur propriété physique principale est de réduire fortement la tension superficielle des

systèmes hétérogènes. Toutes les saponines sont fortement moussantes et constituent

d'excellents émulsifiants. Ils sont difficilement cristallisables. Ils sont solubles dans l’eau,

l’alcool dilué et dans les solvants organiques apolaires.37

II.7.1. Caractérisation des saponines

La mise en évidence des saponines peut se faire par différentes techniques :

Par examen par les rayons UV de la CCM qui révèle une fluorescence bleue pour les

saponines triterpéniques et jaune pour les stéroïdiques.

Par réaction de Libermann qui consiste à dissoudre les saponines dans l'acide

sulfurique concentré, on observe successivement une coloration jaune, rouge, bleu vert

ou bleu violet.

Par détermination de l’indice de mousse, effectuée selon la 10e Pharmacopée

Française. On introduit successivement dans une série de dix tubes à essai 1, 2, 3,

4,...10mL un décocté aqueux, obtenu par ébullition d’1g de substrat dans 100mL d’eau

pendant 30mn. Tous les tubes sont complétés à 10mL avec de l’eau distillée et agités

vigoureusement pendant 15 secondes. Après un repos de 15 minutes, la hauteur de la

mousse est mesurée. Si cette dernière est égale à 1cm, la dilution de la substance dans

ce tube correspond à l’indice de mousse recherché. Un indice supérieur à 100 est

considéré comme une réaction positive témoignant d’une richesse de la plante en

saponines.51


La présence des saponines est largement commune chez les plantes médicinales, plus

de 100 familles en contiennent. Ce sont des substances naturelles à large spectre d’activité

biologique : Ils ont une action protectrice sur le système veineux d’où leur effet veinotrope.

Ils sont utilisées en thérapeutique comme : anti-tumoraux, anti-microbiens, anti-appétants,

51 Dohou, N., Yamni, K., Tahrouch, S., Idrissi, H., Badoc, A., Gmira, N., Bull. Soc. Pharm., Bordeaux, 2003, 142, p.61-78.


36

anti-inflammatoires et cicatrisants notamment au niveau des plaies cutanées. Ils donnent

naissance à des mousses généralement stables, qui présentent une activité hémolytique. En

effet, ils provoquent la lyse des érythrocytes qui entraîne une toxicité à l’égard des animaux à

sang froid, principalement les poissons.1

III.8. Les stérols et stéroïdes

Les stéroïdes font partie des lipides insaponifiables et dérivent d’un triglycéride, le

squalène. Ce ne sont pas des terpènes et la « règle isoprénique » ne peut leur être appliquée,

mais ils présentent un lien avec les triterpènes du point de vue synthétique. Ce sont des

dérivés naturels caractérisés par une structure chimique commune comportant un squelette de

type cyclopentanoperhydrophénanthrénique ou stérane. Le cholestérol en est le principal

représentant.

Stérane

Cholestérol

Ils sont très répandus dans la nature où on les rencontre à tous les échelons du règne

végétal et du règne animal. Les stéroïdes naturels sont ainsi répartis en quatre séries :

Les acides biliaires

Les hormones stéroïdes

Les vitamines D

,…et Les stérols.

Les stérols sont des alcools secondaires, solides, saturés ou non, qui possèdent un

noyau polycyclique dérivé du phénanthrène et un groupement hydroxyle caractéristique en

C3. Ils se différencient les uns des autres par le nombre et la position des doubles liaisons dans

le noyau et par la structure de la chaîne latérale greffée sur le carbone 17. D’après l’origine

biologique on distingue deux types de stérols :


37

Zoostérols : Ce sont des stérols d’origine animale, les plus importants sont le

cholestérol et certaines hormones stéroïdiques.

Phytostérols : Ce sont des stérols d’origine végétale, les plus importants sont

l’ergostérol, le sitostérol,… et le stigmastérol.52

II.8.1. Caractérisation des stérols et des stéroïdes

Les stérols sont caractérisés principalement en solution chloroformique par de

nombreuses réactions colorées, signalons la réaction de Liebermann-burchard et de

Salkowski. La coloration est en fonction de la structure des stérols et varie selon les stéroïdes

mis en jeu à savoir :

Réaction de Liebermann (addition d’anhydride acétique puis d’acide sulfurique à la

solution chloroformique) : coloration verte, rouge ou bleu violacé.

Réaction de Salkowski (addition d'acide sulfurique à la solution chloroformique) :

Coloration jaune avec une fluorescence verte : Phase inférieure sulfurique.

Coloration rouge : Phase supérieure chloroformique.


Les différents stérols et leurs rôles biologiques sont reportés dans le tableau II.3.

Tableau II.3 : Rôle biologique de quelques stérols

Composés Structure Rôle

Cholestérol

HO

Participe à la synthèse biologique

des hormones de reproduction, de

la vitamine D…

Activité antifongique et

hémolytique53

Cholestanol

Synthétisé in-vivo à partir du

cholestérol

Propriétés anticancéreuses54

52 Audigié, C., Zonszain, F., “Biochimie structurale“, Ed. Doin, 1991, p.246-252. 53 Takechi, M., Uno, C., Tanaka, Y., Phytochemistry, 1991, 30, p.2557-2558. 54 Inoue, K., Kubota, S., Seyama Y., Investigative Ophtalmology & Visual Science, 2000, 41, p.991-997.


38

Sitostérol

Propriétés anti-inflammatoires,

anti-cholestérol55

Traitement de l’hyperplasie de la

prostate56

Renforce le système immunitaire

(tuberculose, VIH, …)57

II.9. Les tanins ou tannins

Les tanins sont des substances d’origine végétale non azotées à structure poly-

phénolique, donc soluble dans l’eau. Leur poids moléculaire est compris entre 500 et 3000. En

plus de la réactivité usuelle des composés phénoliques, ils ont la capacité de faire précipiter

les alcaloïdes, la gélatine et les autres protéines.58

Ils sont localisés dans les feuilles, l’écorce et les fruits de nombreuses plantes. Ils font

ainsi partie intégrante de notre alimentation (thé, divers fruits…).

Chimiquement, les tanins résultent de la polymérisation de molécules élémentaires

possédant des fonctions phénols. Ils se divisent en deux catégories : les tanins hydrolysables

(fig.II.8) et les tanins condensés (fig.II.9).

Tanins hydrolysables

Les tanins hydrolysables ou pyrogalliques donnent à l’hydrolyse un ose (le glucose) et un

acide phénolique, l’acide gallique ou l’acide ellagique. Ce dernier acide est une molécule

polycyclique qui se compose de deux cycles benzéniques portant chacun deux fonctions

hydroxylés qui sont reliés entre eux par deux fonctions quinoniques portant des cétones.

Les tanins galliques sont des polymères hétérogènes constitués d’un noyau central

-le glucose- et de chaînes latérales (en position 1, 2, 3, 4 ou 6 du glucose) comprenant 1 à n

monomères d’acide gallique.

Les tanins ellagiques sont des molécules complexes et rigides, constituées par des liaisons

carbone-carbone entre les noyaux benzéniques de l’acide ellagique et une molécule de

glucose.

55 Wong, N. C., Can. J. Cardiol, 2001, 17, p.715-721. 56 Aurad. Atif, B., Gan, Y., Fink, C. S., Nutr. Cancer, 2000, 36, p.74-78. 57 Park, E. H., Kahng, J. H., Lee, S. H., Shin, K. H., Fitoterapia, 2001, 72, p.288-290. 58 Bate. Smith, E. C., Swain, T., ‘’Flavanoïd compounds in Comparative Biochemistry’’ Academic Press, New-York, 1962, 3, p.755-809.


39

Les tanins galliques et ellagiques sont caractéristiques des Dicotylédones où ils se

localisent dans tous les organes de la plante : racines, tiges, feuilles et fruit avant maturité. 44

OH

OH

HO

O OH

OH

O

HO

OH

O

O

OH

O

Acide gallique Acide ellagique

HO

HO

OH

HO

HO

OH

CO

CO

O

OR

RO

OR

O

O

1

2

3

4

56

Figure II.8 : Exemple de structure de tanin hydrolysable (Tannin ellagique)

Tanins condensés

Les tanins condensés ou tanins catéchiques sont des polymères formés par la

condensation d’unités flavonoïdes reliées par des liaisons fortes carbone-carbone le plus

souvent 4→8 ou 4→6 non hydrolysables. Ils sont également appelés proanthocyanidines,

nom provenant de leur capacité à libérer des anthocyanidines de couleur rouge par rupture de

la liaison interflavane en milieu acide et en conditions d’oxydation.


40

O

OH

HO

OH

O

OH

HO

OH

OH

OH

OH

OH

Figure II.9 : Exemple de structure de tanins condensés

Les tanins se dissolvent dans l'eau sous forme de solutions colloïdales. Ils sont

solubles dans les alcools et l'acétone. Ils sont précipités de leur solution aqueuse par de

nombreux réactifs, ils précipitent avec les sels de métaux lourds tels que le fer, le plomb, le

zinc et le cuivre.1

II.9.1. Caractérisation des tanins

La caractérisation des tanins se fait généralement par des réactions de coloration avec

les sels ferriques. On obtient des précipités colorés différemment selon la nature des tanins :

Les tanins hydrolysables donnent des colorations et des précipités bleu-noir et les

tanins condensés donnent des précipités brun-verdâtre.

Il existe d’autres réactions de différentiation des tannins :

Avec l’iodate de potassium : les tanins galliques donnent une coloration rose.

Avec l’acide nitreux en milieu acétique : les tanins ellagiques sont colorés en

rose, la coloration vire au pourpre puis au bleu.

Avec la vanilline chlorhydrique : les tanins condensés sont colorés en rouge.


Les tanins ont des propriétés astringentes. Ils favorisent la régénération des tissus en

cas de blessure superficielle ou de brûlure. Ils sont utilisés pour fixer la teinture d'étoffes, pour

encoller le papier ou la soie et pour coaguler le caoutchouc. Ils sont largement employés dans

les industries du cuir dans le tannage des peaux animales, des vernis et de la peinture.1


41

Les tanins avec les polyphénols possèdent des propriétés biologiques remarquables. Ils

ont une activité anti-oxydante59, anti-cancérigène, anti-inflammatoire dans les cas de brûlures,

anti-virale60, anti-diarrhéique, action anti-septique, vasoconstricteur de petits vaisseaux

(hémorroïdes, blessures superficielles) et possèderaient un rôle préventif contre les maladies

cardiovasculaires61.

III. TESTS PHYTOCHIMIQUES

Comme nous venons de l’exposer, les plantes contiennent plusieurs principes actifs

(flavonoïdes, alcaloïdes, tanins,… et H.E) qui se différencient entre eux par leur structure

chimique et leurs effets. Ces métabolites secondaires, substances extractibles, représentent un

grand intérêt dans de multiples industries (pharmacie, parfumerie, agro-alimentaire,

cosmétique…).

L’extraction de ces principes actifs nécessite préalablement leur mise en évidence au

sein de la plante. Pour notre part, nous nous sommes intéressés à la mise en évidence des

principes actifs présents au niveau de la racine de la Bryone (Bryonia dioica).

Afin de rechercher les constituants présents dans la racine de la Bryone, sujet de notre

étude, nous avons eu recours à différentes méthodes de détection qui consistent à réaliser des

réactions spécifiques conduisant à l’apparition d’un précipité ou un changement de couleur

confirmant la présence de ces phytoconstituants.

Plusieurs techniques ont été mises en œuvre afin de déceler la présence des principes

actifs au niveau de la racine de Bryonia dioica récoltée à Bouamama (région ouest d’Oran) en

Octobre 2008.

Après avoir récupéré la racine, nous l’avons lavé à l’eau courante, découpé en

rondelles (ou rouelles), puis séché au soleil et conservé, à température ambiante, dans un

endroit sec et à l’abri de la lumière. Après cela, les rondelles ont été broyées pour obtenir une

poudre fine, qui a servi à effectuer nos expériences.

59 Nakao, M., Takio, S., Ono, K., Phytochemistry, 1998, 49, 8, p.2379-2382. 60 a) Saint-Cricq de Gaulejac, N., Provost C., Vivas N., J. Agric. Food Chem., 1999, 47, p.425-431; b) Soleas, G. J., Diamandis E. P., Goldberg, D. M., J. Clin. Lab. An., 1997, 11, p.287-313. 61 a) Frankel E.N., German J.B., Kinsella J.E., Parks E., Kanner J., Lancet, 1993, 341, p.454-457; b) Renaud S., de Lorgeril M., Lancet, 1992, 339, p.1523-1526.


42

Les tests chimiques de détection des phytoconstituants ont été effectués à partir du

végétal épuisé dans différents milieu : eau, éthanol, …, milieu acide, milieu basique.

III.1. Produit végétal épuisé avec de l’eau

5g de matière végétale sont introduits dans un ballon surmonté d’un réfrigérant et

contenant 50 mL d’eau distillée. Le mélange ainsi formé est porté au reflux pendant 1h.

L’extrait aqueux obtenu après filtration de la solution a été soumis aux tests suivants :

Amidon :

Traiter 1mL de la solution préparée avec l’empois d’amidon ou avec l’iode I2.

L’apparition de la couleur bleu violacée indique la présence d’amidon.

Composés réducteurs :

Traiter 2 mL de la solution avec quelques gouttes de la liqueur de Fehling (0,5 mL

de réactif A et 0,5 mL de réactif B, mélange extemporané) et chauffer. L’apparition d’un

précipité rouge brique indique la présence d’hydrates de carbone.

Saponosides :

Après refroidissement de la solution, on introduit 6 mL de la solution dans un tube à

essai et on agite fortement pendant 30 secondes. Ensuite, on mesure la hauteur de la mousse

qui indique la teneur en saponosides après un repos de 20 mn :

Pas de mousse : test négatif (-).

Mousse moins de 1 cm : test faiblement positif (±).

Mousse de 1-2 cm : test positif (+).

Mousse plus de 2 cm : test très positif (++).

Tanins :

Traiter 1mL de la solution aqueuse avec 1 mL d’eau et quelques gouttes d’une solution

de chlorure ferrique (FeCl3) à 1%. L’apparition d’une coloration vert foncée ou bleu-verdâtre

indique la présence de tanins.


43

Réactif de Stiasny

10 mL de formol à 30 % et 5 mL d'acide chlorhydrique concentré sont ajoutés à 5 mL

de la solution à tester. Le mélange est chauffé au bain-marie pendant 15 mn.

L’obtention d’un précipité montre la présence de tanins catéchiques. Pour les tanins

galliques, nous avons filtré la solution précédente. Ensuite, on ajoute au filtrat recueilli 5mL

d’acétate de sodium et 3 gouttes de FeCl3. L’apparition d’une coloration bleu-noir intense,

signe la présence de tanins galliques.

Réactif de Bath Smith

À 2 mL d’infusé on ajoute 2 mL d’HCL à 20 %. Le mélange est porté à l’ébullition. En

présence des tannins catéchiques on aura un précipité de couleur rouge brique. (Apparition

d’une couleur vert bouteille).

III.2. Produit végétal épuisé avec de l’éthanol


contenant 100 mL d’éthanol. Le mélange ainsi formé est porté au reflux pendant 1h. L’extrait

obtenu après filtration de la solution a été soumis aux tests suivants :

Alcaloïdes :

Deux essais ont été effectués :

Evaporer 20 mL de la solution éthanolique.

Ajouter 5 mL d’acide chlorhydrique (HCl) à 10% au résidu et chauffer dans un bain-

marie. Filtrer le mélange et l’alcaliniser avec une solution d’hydroxyde d’ammonium

(NH4OH) à 10% jusqu’à pH = 9, extraire la solution avec l’éther diéthylique (Et2O), ensuite,

dissoudre le résidu obtenu dans l’acide chlorhydrique (HCl) à 2%.

Les alcaloïdes sont décelés par les réactifs de Mayer et de Wagner.

Evaporer 20 mL de la solution éthanolique.

Ajouter 5mL d’acide chlorhydrique (HCl) 2N au résidu et chauffer dans un bain-marie.

Filtrer puis diviser le filtrat en deux parties :

La première est traitée avec le réactif de Mayer et la seconde avec le réactif de Wagner.

L’observation d’une turbidité ou d’un précipité indique la présence d’alcaloïdes.

Une légère opacité : test faiblement positif (±)

Une turbidité et non une floculation : test positif (+)

Une floculation ou un précipité lourd : test très positif (++)


44

Anthracénosides et les anthocyanosides :

25 mL de l’extrait éthanolique sont introduits dans un ballon surmonté d’un

réfrigérant et contenant 15 mL d’acide chlorhydrique (HCl) à 10%. Le mélange ainsi formé

est porté au reflux pendant 30 mn. Après refroidissement, on extrait la solution trois fois avec

15mL d’éther diéthylique. Ensuite, les deux phases sont traitées séparément.

Anthracénosides :

Traiter 8mL de la solution extractive éthérique avec le réactif de Bornträger.

L’apparition d’une couleur qui varie de l’orange-rouge au violet pourpre indique la présence

d’anthracénosides.

Anthocyanosides :

Doser la phase aqueuse acide par une solution de soude (NaOH).

Un changement de couleur en fonction du pH prouve la présence des anthocyanosides.

pH < 3 la solution se colore en rouge, coloration qui décroît quand le pH

augmente vers la neutralité.

4 < pH < 6 la solution prend une coloration bleue.

Composés réducteurs :

Ajouter 2 mL d’eau distillée et quelques gouttes de la liqueur de Fehling à 1mL de

l’extrait éthanolique puis chauffer. La formation d’un précipité rouge brique prouve la

présence de sucres.

Flavonoïdes :

Ajouter quelques gouttes d’acide chlorhydrique concentré (HCl) à 5 mL de l’extrait

éthanolique en présence de 0,5g de tournures de magnésium (Mg). La présence des

flavonoïdes est indiqué par l’apparition d’une couleur : rose-orangé (flavones) ; rouge

(flavonols) ; rouge, violet, bleu (flavonones) et pas de coloration (isoflavones).


45

Stérols et stéroïdes :

Deux essais ont été réalisés :

Traiter le résidu obtenu après évaporation de 10mL d’extrait éthanolique avec

10 mL de chloroforme (CHCl3). Après filtration, on ajoute quelques gouttes d’acide

sulfurique (H2SO4) concentré à 5 mL de la solution chloroformique en présence de 5 mL

d’anhydride acétique. Agiter puis laisser reposer.

L’apparition d’une coloration violacée fugace virant au vert indique la présence des stérols et

stéroïdes.

Dissoudre le résidu obtenu par évaporation de 10mL de l’extrait alcoolique dans

0,5 mL de chloroforme (CHCl3). Traiter le filtrat avec 1mL d’acide sulfurique concentré.

L’apparition d’une couleur rouge superposée à une couleur jaune-verdâtre indique

la présence des stérols et stéroïdes.

Tanins :

Traiter 2 mL de la solution éthanolique avec quelques gouttes d’une solution de chlorure

ferrique (FeCl3) à 1%. Puis les Réactifs de Stiasny et Bath Smith sont utilisés.

L’apparition de la couleur verte ou bleu verdâtre indique la présence des tanins.

III.3. Produit végétal épuisé avec du chloroforme


contenant 50mL de chloroforme (CHCl3). Le mélange ainsi formé est porté au reflux pendant

30mn. L’extrait obtenu après filtration de la solution a été soumis aux tests suivants :

Stérols insaturés et terpènes :

Traiter 2 mL de la solution chloroformique avec 1 mL d’acide sulfurique (H2SO4)

avec précaution, l’apparition à l’intersection de deux phases, d’une couleur verte qui se

transforme en rouge confirme l’existence des stérols insaturés et terpènes.

Anthraquinones

Ajouter 1mL d’une solution de potasse [KOH aqueux 10% (v/v)] à l’extrait

chloroformique. Après agitation, la présence des anthraquinones est confirmée par un virage

de la phase aqueuse au rouge.


46

III.4. Produit végétal épuisé avec de l’acide sulfurique


contenant 50mL d’acide sulfurique (2N). Le mélange ainsi formé est porté au reflux pendant

2h. L’extrait obtenu après filtration de la solution a été soumis aux tests suivants :

Quinones combinées :

Extraire la solution obtenue avec du chloroforme (CHCl3), décanter, puis après

évaporation de la phase organique, on ajoute quelques gouttes d’une solution d’hydroxyde

d’ammonium (NH4OH) diluée à 50%. L’apparition d’une couleur rouge indique la présence

de quinones combinées. Si on n’observe aucun changement de couleur cela prouve qu’il n’y a

pas de quinones combinées au niveau de cette plante.

IV. RESULTATS ET DISCUSSION

Les substances extractibles par l’eau, l’éthanol,…le milieu acide ou basique à partir de

la racine de la Bryone ont donné lieu à la formation d’un précipité ou à l’apparition d’un

changement de couleur confirmant la présence de différents phytoconstituants contenus dans

la plante étudiée. Les résultats des tests chimiques de détection des phytoconstituants de la

racine de la Bryone épuisée par l’eau sont consignés sur le tableau II.4.

Tableau II.4 : Résultats des tests chimiques de détection des principes actifs de l’extrait aqueux de la racine

Principes actifs Techniques utilisées Résultats

Amidon Empois d’amidon +/-

I2 +

Composés réducteurs Liqueur de Fehling +

Saponosides La Mousse +

Indice de mousse 100

Tanins

FeCl3 +

Réactifs de Stiasny +

Réactifs de Bath Smith +

+ : réaction positive +/- : réaction douteuse; - : réaction négative


47

On note que tous les tests répertoriés sur le tableau II.2 sont positifs ; ce qui signifie

que la racine de la Bryone contient de l’amidon, des composés réducteurs (sucres), des

saponosides et des tanins.

Les résultats des tests chimiques de détection des phytoconstituants de la racine de la

Bryone épuisée par l’éthanol sont regroupés sur le tableau II.5.

Tableau II.5 : Résultats des tests chimiques de détection des principes actifs de l’extrait

éthanolique de la racine

Principes actifs Techniques utilisées Résultats

Alcaloïdes

Réactif de Mayer +

Réactif de Wagner +

Anthocyanosides Dosage avec NaOH +

Anthracénosides Réactif de Bornträger +

Composés réducteurs Liqueur de Fehling +

Flavonoïdes HClConcentré + Mg +

Stérols et stéroïdes Réactif de Lieberman Burchard +

Tanins

FeCl3 +

Réactif de Stiasny +

Réactif de Bath Smith +


On remarque également, que tous les tests effectués sur l’extrait éthanolique sont

positifs ; ce qui indique que la racine de la Bryone contient des alcaloïdes, des

anthocyanosides, des anthracénosides, des composés réducteurs (sucres), des flavonoïdes, des

stérols, des stéroïdes et des tanins.


48

Les résultats des tests chimiques de détection des phytoconstituants de la racine de la

Bryone épuisée par le chloroforme (CHCl3) et l’acide sulfurique (H2SO4) sont reportés sur le

tableau II.6.

Tableau II.6 : Résultats des tests chimiques de détection des principes actifs de la racine

épuisée au CHCl3 et H2SO4

Principes actifs Solvant d’épuisement Techniques utilisées Résultats

Stérols insaturés et terpènes Chloroforme H2SO4 Concentré +

Quinones combinées Acide sulfurique CHCl3 + NH4OH +/-

Anthraquinones Chloroforme KOH à 10% -


Au vu des résultats des tests réalisés par le chloroforme et l’acide sulfurique,

les anthraquinones sont absentes dans notre extrait. Les quinones combinées existent en

petites quantités. Les stérols insaturés et terpènes se trouvent en grandes quantités.

V. CONCLUSION

Nous avons montré par cette étude la diversité structurale des phytoconstituants

des plantes, leur rôle et leur caractérisation. Par ailleurs, le screening phytochimique effectué

sur la racine de la Bryone, par épuisement à l’aide de divers solvants révèlent :

La présence d’amidon, d’alcaloïdes, d’anthracénosides, d’anthocyanosides, de

composés réducteurs, de flavonoïdes, d’hétérosides, de saponosides et de tanins.

Les composés les plus abondants dans la racine sont surtout les alcaloïdes et les saponosides.

Nous tenterons dans le chapitre suivant d’extraire quelques principes actifs qui ont été

mis en évidence comme les alcaloïdes, les flavonoïdes, l’huile essentielle et les tanins … à

partir de la racine de la Bryone pour les analyser.

Chapitre III

Extraction et Analyse de

quelques principes actifs

Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

50

I. INTRODUCTION

A notre connaissance aucune étude n’a été réalisée sur les constituants chimiques et

l’activité biologique de la Bryone en Algérie, ni dans les pays du Maghreb. Toutefois, la

littérature signale la présence d’alcaloïdes62, de flavonoïdes, 63de glycosides, 64de saponosides, 65

de triterpènes 66…et quelques traces d’huile essentielle.67 Les résultats des tests chimiques

positifs que nous avons obtenus sur la mise en évidence des phytoconstituants (cf. chapitre II)

nous ont incités à tenter d’extraire les alcaloïdes, les flavonoïdes, l’huile essentielle,…et les

tanins contenus dans la racine de Bryonia dioica.

Dans le but d’analyser ces principes actifs isolés à partir de la racine de la Bryone, nous

avons eu recours à la chromatographie ainsi qu’à la spectroscopie.

Ces techniques permettent d’avoir des données conduisant à l’identification des structures

moléculaires organiques. Les plus utilisées au cours de notre travail ont été : CCM, CC, CG/SM,

HPLC; UV, IR, RMN 1H et RMN 13C.

II. RAPPEL SUR LES METHODES D’ANALYSE

II.1. Analyse chromatographique

La chromatographie est une technique fréquemment utilisée pour séparer et identifier les

espèces chimiques constituant un corps. Bien que cette technique ait été développée à l’origine

pour séparer des substances colorées d’où son nom dérive (khrôma qui signifie couleur en grec),

elle est d’une grande efficacité pour l’analyse des substances organiques.

II.1.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)

La chromatographie sur couche mince est un phénomène d’adsorption que l’on effectue

surtout en vue d’une analyse et de séparation des espèces chimiques constituant un corps.

L’appareillage utilisé pour la chromatographie sur couche mince est relativement simple. Il est

composé d’une plaque et d’une cuve rectangulaire pour l’élution. Cette dernière dépend du

62 Raffauf, R. F., “A Handbook of Alkaloids and Alkaloid-Containing Plants“, Smith Kline and French Laboratories, Philadelphia, 1970, p.24-33. 63 a)Proliac, A., Chaboud, A., et Raynaud, J., Pharm Acta Helv, 1989, 64, p.207-208 ; b) Krauze-Baranowska, M. et Cisowski W., Phytochemistry, 1995, Vol.39, N°3, p. 727-29. 64 P.J. Hylands et J. Kosugi, Phytochemistry, 1982, 21(6), p.1379-84. 65 Oobayashi, K., Yoshikawa, K., et Arihara, S., Phytochemistry, 1992, 31 (3), p. 943-46. 66 a) Hylands, P.J., Oskoni, M.T., Phytochemistry, 1979, 18 (11), p.1843-45; b) Hylands, P.J., Mansour, E.S., Oskoui., M.T., J. Chem. Soc., 1, 1980, p.2933-66. 67 Karryev, M.D., Artemeva, M.V., Meshcheryakov A. A., and Rozhkova L.I., Izv Akad Nauk Turkm SSR Ser Biol Nauk, 1981, 4, p.54-66.


51

choix des phases stationnaire et mobile (éluant). Les phases stationnaires les plus utilisées en

chromatographie sur couche mince sont le gel de silice, l’alumine et la cellulose en poudre.

Nous rapportons dans ce qui suit le protocole effectué pour l’huile essentielle de la Bryone.

Protocole expérimental :

Sur une plaque de gel de silice de 2 × 5 cm, on trace au crayon un trait horizontal à une distance

de 0,5 cm du bord inférieur et à 0,2 cm du bord supérieur. On dilue l’H.E dans l’éther et on

dépose une goutte sur le trait du bord inférieur. La plaque est alors introduite dans une cuve

contenant l’éluant : éther/éther de pétrole (1 : 4) à une hauteur de 0,5 cm.

Lorsque l’éluant atteint le front de la plaque, cette dernière est retirée de la cuve et puis

séchée. Les taches apparaissant à l’aide d’un révélateur sont caractérisées par un facteur de

rétension (Rf) qui est défini comme étant le rapport entre la distance parcourue par la substance

(X) sur la distance parcourue par le front de l’éluant (Y) :

II.1.2. Chromatrographie sur colonne (CC)

Le principe général de cette technique est similaire à celui de la CCM. Dans cette forme

de chromatographie, la phase stationnaire est contenue dans une colonne. L’éluant qui peut être

sous la pression d’une pompe ou non, entre par une extrémité et sort par l'autre. Il peut être un

solvant unique ou un mélange de solvant.

Sous l’action de l’éluent et des liaisons qu’elles établissent avec l’adsorbant,

les molécules vont se déplacer différemment dans la colonne et prendre un certain retard les unes

par rapport aux autres pendant la migration. Elles vont donc se présenter avec un certain retard à

la sortie de la colonne.


52

L’élution peut se faire sous forme d’un gradient. En principe, la phase mobile est

composée des mêmes solvants que ceux utilisés pour la CCM. Toutefois, l’élution peut être

accélérée grâce à l’addition progressive de solvant de plus en plus polaire par rapport à la phase

initiale. Les différentes fractions sont collectées dans des tubes à essais. Ces fractions sont

ensuite analysées par CCM décrite précédemment.

II.1.3. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse

II.1.3.1. Principe de la chromatographie en phase gazeuse

La chromatographie en phase gazeuse est rapidement devenue l’une des meilleures

méthodes analytiques dans le domaine scientifique, autant en recherche que dans le domaine

industriel (industrie pharmaceutique, agriculture, environnement,…etc.). L’échantillon

à analyser est introduit dans l’injecteur de façon à ce qu’il entre dans la colonne sous forme

vapeur. La phase mobile est un gaz chimiquement inerte, appelé gaz vecteur (N2 ou He). Celui-ci

entraîne avec lui l’échantillon à travers la colonne à des vitesses différentes. Lorsqu’il arrive à la

sortie de la colonne, il est détecté par un détecteur qui transmet un signal électrique à un

enregistreur. Les résultats apparaissent sur le chromatogramme sous forme de pics, qui sont

caractérisés par un temps de rétention permettant ainsi de déterminer l’identité du constituant

dans l’échantillon.

II.1.3.2. Principe de la spectrométrie de masse

La spectrométrie de masse est une technique de détection extrêmement sensible qui

permet de déterminer le poids moléculaire d’un produit pur ou de recueillir des informations

structurales à partir de la nature des fragments obtenus.

Le principe de la spectrométrie de masse est basé sur l’ionisation des molécules

introduites dans l’appareillage par un champ électrique et/ou magnétique. L’ion ainsi obtenu,

appelé ion moléculaire, permet la détermination de la masse molaire du composé.68

II.1.3.3. Principe de la CG/SM

La chromatrographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse constitue l’un

des outils le plus puissant d’analyse de mélanges complexes de molécules organiques ou

biochimiques.69 La chromatographie en phase gazeuse permet de séparer les constituants d'un

68 Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Darnell, J., Kaiser, C., Masson, L., “Biologie moléculaire de la cellule“, 3émeEd. Deboeck, Bruxelles, 2005, p.94-95. 69 Skoog, A., Holler, F., Nieman, A., “Principes d’analyse instrumentale”, Ed. De Boeck, Paris, 2003, p.528.


53

mélange. La spectrométrie de masse associée permet d'obtenir le spectre de masse de chacun des

constituants et bien souvent de les identifier.

La technique CG/SM consiste à injecter l’échantillon à analyser dans l'appareil de CG.

Les gaz ionisés sont injectés dans un spectrographe de masse. On obtient pour chaque pic de CG

un temps de rétention correspondant et un spectre de masse permettant de caractériser le

composé obtenu.

II.1.4. Analyse par chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC)

La chromatographie en phase liquide à haute pression met en œuvre, aussi bien des

phénomènes de partage qui sont les plus courants, que des phénomènes d’adsorption, ou

d’échanges d’ions. La méthode de séparation fait sensiblement appel aux mêmes éléments de

base que ceux employés en chromatographie sur colonne. Des colonnes de large diamètre sont

utilisées avec un débit faible et sous pression. La distribution du soluté entre la phase stationnaire

greffée dans la colonne et la phase mobile, se fait grâce à une pompe qui maintient constant le

débit du liquide. Les solvants le plus souvent utilisés sont le méthanol ou l’acétonitrile purs ou

mélangé à l’eau distillée. En outre, l’emploi d’un détecteur permet l’enregistrement électronique

du message qui est traduit par des pics ou chromatogramme.

II.2. Analyse spectroscopique

L’identification des structures moléculaires organiques se fait généralement par

utilisation combinée de plusieurs techniques spectroscopiques, la spectroscopie UV,

la spectroscopie IR, la spectroscopie RMN du H1 et RMN du 13C.

II.2.1. Spectroscopie Ultraviolet-Visible (UV)

La spectroscopie UV est une technique simple et rapide qui fournit des informations sur

la nature chimique, les propriétés physico-structurales, et les caractéristiques optiques des

composés. Dans les composés, chaque fonction absorbe à une longueur d’onde bien déterminée.

L’absorption de rayonnement UV par les molécules se traduit généralement par diverses bandes

d’absorption électronique constituées de nombreuses raies. Chaque raie résulte de la transition

d’un électron de l’état fondamental à l’un des nombreux états énergétiques roto vibrationnels

associés à chaque état électronique excité. Ceci permet de caractériser surtout les molécules

possédant des doubles liaisons conjuguées. La mesure de l’absorption UV permet également de


54

connaître ou de déterminer la composition chimique d’un mélange, par comparaison avec des

témoins.70

II.2.2. Spectroscopie Infra-rouge (IR)

La spectroscopie infrarouge (IR) est une technique d’analyse qui sert principalement à

déterminer la présence de groupements fonctionnels dans les molécules organiques et

les structures dans certaines molécules simples. Elle est basée sur l'absorption d'un rayonnement

infrarouge par l’échantillon analysé. Elle permet via la détection des vibrations caractéristiques

des liaisons chimiques, d'effectuer l'analyse des fonctions chimiques présentes dans

l’échantillon.71

II.2.3. Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)

La résonance magnétique nucléaire ou RMN est une technique utilisée pour l’analyse des

structures de nombreuses molécules chimiques. Elle sert principalement à la détermination

structurale des composés organiques. Cette méthode repose essentiellement sur le phénomène de

magnétisme. En effet, les noyaux de certains atomes (1H, 13C, etc.…) possèdent un moment

magnétique nucléaire, c'est-à-dire qu’ils se comportent comme des aimants microscopiques

caractérisés par une grandeur quantique appelée «le spin».

La technique de RMN étudie le comportement des noyaux atomiques en présence d'un

champ magnétique externe. Le champ magnétique appliqué aux produits entraîne un

dédoublement des niveaux d'énergie du spin nucléaire, de sorte qu'on puisse induire des

transitions entre eux, suite à l'absorption d'une radiation électromagnétique adéquate.

Les spectres RMN du 1H et du 13C sont enregistrés sur un appareil Brucker AC-300, qui

fonctionne à une fréquence de 300 MHz. Les échantillons sont dissous dans un solvant deutérié

qui peut être du dichlorométhane, du chloroforme, du DMSO etc… Ces solvants possèdent des

déplacements chimiques spécifiques. Le tube contenant l’échantillon est soumis au champ

magnétique permettant l’obtention des spectres utiles à l’identification structurale.

70 Skoog, D.A., West, D.W., Holler, F.J., Buess-Herman, C., “Chimie analytique“, Ed. De Boeck, Bruxelles, 1997,

p.557-63. 71 Peter, K., Vollhardt, C., Schore, N., “Traité de chimie organique“, 4émeEd. De Boeck, Bruxelles, 2004, p.444-49.


55

Déplacement chimique (en ppm) des solvants deutériés utilisés.

Solvants δ 1H (ppm) δ 13C (ppm)

Dichlorométhane-d2 5,32 (Singlet) 53,8 (Singlet)

Chloroforme-d1 7,26 (Singlet) 77,0 (Triplet)

DMSO-d6 2,5 (Quintuplet) 39,43 (Septuplet)

II.2.3.1. RMN 1H du proton

Le spectre RMN du proton est une méthode puissante utilisée dans la détermination

structurale des composés organiques inconnus. Il fournit de nombreuses informations tels que,

les différents types d’hydrogènes présents dans la molécule analysée, les différents types

d’hydrogènes présents dans l'environnement électronique, le nombre d'hydrogènes voisins d’un

hydrogène donné et le déplacement chimique caractéristique de chaque proton.

II.2.3.2. RMN 13C du carbone 13

Cette technique permet de mettre en évidence tous les carbones de la molécule. L'analyse

se base sur les déplacements chimiques observés en fonction de l'environnement de chacun des

atomes de carbone. Cette expérience permet la mise en évidence des carbones primaires (CH3),

secondaires (CH2), tertiaires (CH) et dans une moindre mesure les carbones quaternaires.72

III. PROCEDES D’EXTRACTION UTILISES

Il existe plusieurs procédés pour extraire les principes actifs du métabolisme secondaire à

partir de la matière végétale. Cela va de l’hydrodistillation, chauffage à reflux à l’extraction par

les solvants organiques.

III.1. Chauffage à reflux

C’est un procédé qui est utilisé pour extraire les principes actifs tels que les alcaloïdes et

les tannins. Il consiste à porter à ébullition un mélange de matière végétale et de solvant. On

utilise ici un réfrigérant à boule, plutôt qu’un réfrigérant droit, afin d’augmenter la surface de

contact avec les vapeurs. La vapeur dégagée est condensée sur les parois froides du bas du

réfrigérant ce qui permet de former des gouttes de liquide qui tombent régulièrement du

72 Silverstein, R.M., Bassler, G.C., Morill, T.C., Larue, E., “Identification spectrométrique de composés organiques“, 5émeEd.

De Boeck, Bruxelles, 2004, p.165-71.


56

réfrigérant dans le mélange. Ainsi, on récupère le filtrat après la fin du chauffage pour entamer

l’extraction par différents solvants afin de récupérer le produit final (Fig.III.1).

Figure III.1: Montage de chauffage à reflux

III.2. Hydrodistillation

C’est une méthode qui est utilisée principalement pour extraire les huiles essentielles

(H.E). Elle consiste à porter à ébullition un mélange de matière végétale et d’eau. La vapeur

d'eau formée entraîne les composés organiques à l'état gazeux vers le réfrigérant qui sont

récupérés dans un ballon. Le distillat, ainsi obtenu est introduit dans une ampoule à décanter afin

de séparer l’eau de l’H.E par extraction avec des solvants tels que l’hexane ou le

dichlorométhane par exemple (Fig.III.2).


57

Figure III.2: Montage d’hydrodistillation

IV. EXTRACTION ET ANALYSE DES PRINCIPES ACTIFS DE LA BRYONE

Dans toutes les analyses par CCM que nous avons effectué, le p-anisaldéhyde a été

utilisé comme révélateur. C’est un révélateur universel obtenu en dissolvant 4,5 mL de para-

anisaldéhyde, 5 mL d’acide acétique à 99 % et 5 mL d’acide sulfurique concentré dans 85 mL

d’éthanol à 95 %.

IV.1. Extraction et analyse des alcaloïdes

Les alcaloïdes sont des substances naturelles qui existent le plus souvent sous forme de sels

et réagissent comme des bases. Leur extraction se fait par des solvants organiques soit en milieu

acide ou basique.


Le principe de l’extraction des alcaloïdes en milieu basique peut se faire par deux

méthodes, l’une utilisant le bicarbonate, l’autre l’ammoniac. Pour notre part, nous avons utilisé

l’ammoniac (Schéma III.1).


58

Une quantité de 100g de matière végétale (racine broyée en poudre) est submergée dans

200mL de solution ammoniacale (NH4OH) à 10% pendant 24h. Ensuite, les bases libérées sont

portées au reflux pendant 20h dans 500mL de méthanol. Après filtration la solution obtenue est

extraite par l’éther puis acidifiée à l’aide d’une solution d’acide chlorhydrique (HCl) 1N.

Après décantation, la phase aqueuse acide obtenue est alcalinisée par une solution de

soude (NaOH : 1N), puis extraite avec trois solvants de polarité croissante : le dichlorométhane,

l’acétate d’éthyle et le butanol. Les solutions organiques sont alors évaporées après séchage sur

Na2SO4.

Le schéma III.1 représente le principe de l’extraction des alcaloïdes.

200 mL de NH4OH à 10% (macération 24h) 500 mL de MeOH Reflux 20h Filtration

Evaporation Extraction à l’aide de l’éther Epuisement par HCl 1N

NaOH (1N) CH2Cl2, AcOEt et BuOH Na2SO4 puis évaporation

Schéma III.1: Différentes étapes d’extraction des alcaloïdes en milieu basique par le méthanol

Les résultats obtenus lors de l’extraction des alcaloïdes par chauffage au reflux dans le

méthanol sont reportés dans le tableau III.1.

100 g de MV

Marc épuisé Solution extractive

Solvant épuisé Solution aqueuse acide

Solution aqueuse épuisée Alcaloïdes Totaux


59

Tableau III.1: Résultats d’extraction des alcaloïdes

Analyse spectroscopique des extraits 1, 2 et 3 des alcaloïdes Spectroscopie IR

Les spectres IR ont été réalisés sur un appareil JASCO FT/IR-4200 à transformée de

fourrier sur des échantillons conditionnés en pastilles de KBr. Les nombres d’ondes sont

exprimés en cm-1. Le spectre IR de la fraction 1 représenté sur la figure III.3 montre différentes

bandes caractéristiques :

Une bande intense et large correspondant aux vibrations d’allongement d’un OH ou NH, vibrations de valence qui apparaissent vers 3301,54cm-1.

Une bande petite et large correspondant aux vibrations d’allongement des CH aliphatiques

vers 2400,94cm-1. Une bande fine et intense attribuable aux carbonyles vers 1679,69cm-1.

Deux bandes intenses relatifs aux doubles liaisons C=C du benzène vers 1153,22 et 1085,73cm-1.

Une multitude de bandes correspondant aux vibrations de déformation hors du plan des CH

du benzène à 982,554 – 820,563 - 619,038 -470,546 - 418,477.

Extraits Couleur Aspect Pf Poids (g) Rdt %

Dichlorométhane

Extrait 1

Blanc Solide > 270°C 1,968 1,97

Acétate d’éthyle

Extrait 2

Blanc Solide > 270°C 2,089 2,09

Butanol

Extrait 3

Brun

jaunâtre

Solide 130°C 0,9 0,9

mt= 4,957g Rdtt= 4,96%


60

Figure III.3 : Spectre IR de l’extrait 1 d’alcaloïde


61

Le spectre IR de l’extrait 3 reproduit sur la figure III.4 montre les bandes caractéristiques

suivantes :

Une bande intense et large correspondant aux vibrations d’allongement d’un OH ou NH, vibrations de valence qui apparaissent vers 3375,78cm-1.

Une bande petite correspondant aux vibrations d’allongement des CH aliphatiques vers

2929,34cm-1. Une bande intense qui peut correspondre à C=C, C=O, C=N, ou N=O vers 1662,34cm-1.

Une bande d’intensité moyenne correspondant aux doubles liaisons C=C vers 1420,32cm-1.

Une bande d’intensité moyenne correspondant aux liaisons C-C, CO, CN vers 1050,05cm-1.

Une multitude de bandes correspondant aux vibrations de déformation hors du plan des CH du cycle aromatique à 669,178 -420,406 cm-1.

* Bande large et intense qui est caractéristique d’une bande OH ou NH. Il est difficile de

distinguer l’une de l’autre.


62

Figure III.4 : Spectre IR de l’extrait 3 d’alcaloïde


63

Spectroscopie RMN 1H

L’analyse par spectroscopie RMN de l’extrait 1 d’alcaloïde montre un signal sous forme

de quintuplet à 2,5ppm correspondant au DMSO et trois signaux sous forme de multiplet de 7,45

à 7,48ppm, de 8,02 à 8,04ppm et à 8,49ppm.

Sur la base des données spectroscopiques obtenues (IR et RMN) et en nous aidant de la

littérature, la structure que nous pouvons proposer pour l’extrait 1 d’alcaloïde est probablement

la bryonicine, un alcaloïde contenu dans les espèces du genre bryone.73

Une multitude de pics est enregistrée sur le spectre RMN du proton de l’extrait 3 reportée

sur la figure III.6. On note le signal du solvant (DMSO), un signal dans la région des systèmes

aromatiques. Toutefois, l’attribution des signaux observés n’a pu être établie.

73 Couplan, F., “Le règne végétale : Plantes sauvages comestibles “, Ed. Ellebore, 2009, p.201-202.


64

Figure III.5 : Spectre de RMN du proton de l’extrait 1 d’alcaloïde


65

Figure III.6 : Spectre de RMN du proton de l’extrait 3 d’alcaloïde


66

IV.2. Extraction et analyse des flavonoïdes

Les flavonoïdes sont des composés naturels appartenant à la famille des polyphénols. Ils

sont souvent liés à des sucres pour former des hétérosides flavonoïdiques. Ces hétérosides

peuvent être extraits, le plus souvent à chaud, par les alcools, l’acétone ou un mélange d’eau-

acétone et les génines libres peuvent être extraits par l’éther. Les solvants apolaires éliminent les

lipides et la chlorophylle et les solvants polaires (AcOEt, butanol,…) entraînent la majorité des

hétérosides.


Une macération de 100g de matière végétale (racine broyée en poudre) dans le méthanol

est réalisée pendant 24h. Après filtration, on recueille un filtrat qui est laissé de côté. La plante

est réextraite une seconde fois avec le méthanol dans les mêmes conditions. Après évaporation

des deux filtrats, on ajoute de l’eau à la solution obtenue. Après cela, on met en œuvre une série

d’extraction liquide-liquide par des solvants de polarité croissante :

par l’éther pour extraire les génines ou les flavonoïdes libres

par l’acétate d’éthyle et le butanol qui donnent la majorité des flavonoïdes glycosidiques

Les solutions organiques sont alors évaporées à sec après séchage sur Na2SO4.

Le schéma III.2 représente le principe de l’extraction des flavonoïdes.


67

Macération avec le MeOH (2x24h) Filtration Evaporation Extraction avec l’H2O et l’éther

Evaporation AcOEt

Evaporation n-butanol

Evaporation

Schéma III.2: Différentes étapes d’extraction des flavonoïdes par le méthanol

Les résultats obtenus lors de l’extraction des flavonoïdes par macération sont regroupés

dans le tableau III.2.

Tableau III.2 : Résultats d’extraction des flavonoïdes

Extraits Couleur Aspect Poids (mg) Rdt %

Ether diéthylique

Extrait 1

Marron foncé Pâteux 378 0,38

Acétate d’éthyle

Extrait 2

Marron Liquide 111 0,11

Butanol

Extrait 3

Marron clair Liquide 293 0,29

mt= 782 mg Rdtt= 0,78%

100 g de MV

Phase organique éthérée Phase aqueuse

Extrait 1 Flavonoïdes libres

(Génines) Phase Organique Phase aqueuse

Extrait 2 Flavonoïdes glycosidiques

Phase aqueuse Phase Organique

Extrait 3 Majorité des flavonoïdes

glycosidiques


68

Analyse spectroscopique des extraits 1, 2 et 3 des flavonoïdes

Spectroscopie RMN 1H RMN 13C

L’analyse par CCM des trois extraits a été effectuée. Sur la plaque CCM de l’extrait 1,

on observe 5 spots très rapprochés; l’extrait 2 montre plusieurs spots.

Après plusieurs essais pour rechercher le meilleur éluant pour la CCM, nous avons opté

pour le système : Toluène/acétate d’éthyle/acide formique (5 : 4 : 1).

Nous avons regroupé les Rf des différents spots observés pour l’extrait 1 sur le tableau III.3.

Tableau III.3 : Facteurs de rétention (Rf) des constituants de l’extrait 1 diéthylique

Nous avons tenté de séparer les différents composés révélés par CCM par CC. Il nous a

été impossible de le faire. Le spectre RMN du 1 H de l’extrait 1 est inexploitable (Fig.III.7).

Après cela, nous avons effectué la CG/Masse des trois extraits isolés.

L’établissement de la structure d’un flavonoïde est complexe et exige de résoudre le

problème concernant l’identification de ses différents composants (génine, monosaccharides… et

acide organiques). Cette détermination de structure se fait à l’aide des analyses des spectres issus

de l’absorption en UV, mais surtout de la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire du

proton et du carbone 13 mono et bi-dimensionnelle et la spectrométrie de masse.

N° de Taches Rf Couleur

1 0,42 Marron

2 0,49 Bleu-noir

3 0,64 Bleu

4 0,74 Mauve

5 0,61 vert


69

Figure III.7 : Spectre de RMN du proton de la fraction 1 des flavonoïdes


70

Analyse par chromatographie en phase gazeuse (CG /SM)

L’analyse par CG /SM de nos échantillon a été réalisée sur un appareil GC de type PERKIN

ELMER GC : CLARUS 500, MASSE : MS CLARUS 500

Les conditions d’analyse sont les suivantes :

Colonne : ELITE 5MS 60m

Rampe 12°/min. 50C°---------160C°

Rampe 5C°/min. 160C°-------220C°

Rampe 20 C°/min. 220C°-------300C° maintenue 5min.

Débit du gaz vecteur (N2) : 30ml/min.

Volume injecté : 1L

Les tracés chromatographiques des extraits 1, 2 et 3 des flavonoïdes, enregistrés dans les

conditions citées ci-dessus sont représentés sur les figures III.8-10. Il comporte plusieurs pics.

Les profils chromatographiques obtenus montrent la présence de nombreux flavonoïdes, majoritaires

et beaucoup d’autres minoritaires.

On note sur le chromatogramme de l’extrait 2 plusieurs pics par rapport à l’extrait 3.

L’identification des composants de l’extrait 1 a été réalisée par la recherche des spectres de masse de

référence emmagasinés dans la banque de données du spectromètre de masse.

La CG/MS de l’extrait 1 révèle la présence d’un produit majoritaire caractérisé par un temps

de rétention de 34,59mn correspondant d’après la banque de données à des systèmes phénoliques.

La détection d’acides à longue chaîne (acide dodécanoique, laurique) à 13,54mn et celles des sucres

(galactose ou xylose) à 17,92mn. On note à 4,33mn, la détection de la cycloserine. Les spectres de

masse de référence sont reproduits dans l’annexe pour l’extrait 1 (Figs.1-4).

Le tracé chromatographique de l’extrait 2 enregistre la présence de plusieurs pics qui diffère

de ceux de l’extrait 1. On note à 37,18mn selon les données du spectromètre de masse à des acides à

longue chaîne (Fig.5). Par absence d’échantillons dans la banque de données, les autres pics n’ont pu

être identifiés.

Le chromatogramme de l’extrait 3 révèle peu de pics par rapport aux deux autres.

La présence du pic à 40,06mn correspond d’après les données à des acides gras (Fig.6). Il est à noter

que l’existence de l’acide palmitique a été signalée dans l’espèce Bryonia alba.74

Il convient de noter que la banque de données emmagasinées dans le spectromètre de masse que nous

avons utilisé n’est pas riche en substances naturelles.

74 Duke, A.J., “Handbook of Phytochemical Constituents of GRAS Herbs and other economic plants“, Ed. CRC Press, 1992, p.114.


71

Figure III.8 : Chromatogramme en phase gazeuse de l’extrait 1 des flavonoïdes


72

Figure III.9 : Chromatogramme en phase gazeuse de l’extrait 2 flavonoïdes


73

Figure III.10 : Chromatogramme en phase gazeuse de l’extrait 3 des flavonoïdes


74

IV.3. Extraction et analyse de l’huile essentielle (H.E)

Les H.E sont des substances odorantes volatiles contenues dans les végétaux. Leur

extraction se fait par des solvants organiques apolaires, les plus utilisés sont le pentane, l’hexane,

mais aussi des solvants chlorés, le dichlorométhane et le chloroforme.


On introduit 100g de matière végétale (racine broyée en poudre) dans un ballon de 1L en

présence de 600mL d’eau distillée et quelques fragments de pierre ponce. Le mélange ainsi

formé est porté au reflux pendant 5h. Après filtration, la solution obtenue est extraite avec du

dichlorométhane (CH2Cl2). La solution organique est alors évaporée à sec après séchage sur

MgSO4. Le schéma III.3 illustre les différentes opérations effectuées pour l’extraction de l’H.E.

600 mL d’eau distillée Reflux pendant 5h Filtration

Extraction avec dichlorométhane

Séchage sur MgSO4

Filtration

Evaporation

Schéma III.3 : Protocole d’extraction de l’huile essentielle

Marc épuisé Phase aqueuse

Phase Organique Phase aqueuse

H.E

100 g de MV


75

Les résultats obtenus lors de nos extractions répétées de l’huile essentielle par

hydrodistillation durant 5h sont consignés dans le tableau III.4.

Tableau III.4 : Rendement d’extraction de l’H.E de la racine de Bryonia dioica

Les rendements d’extraction calculés par le rapport de la quantité d’H.E sur la quantité de

la matière végétale, son exprimés en pourcentage.

Au vu des résultats ci-dessus, on note que le rendement d’extraction de l’huile essentielle

de la Bryone dioïque est très faible, ce qui est conforme avec la littérature. L’opération

d’hydrodistillation n’est pas reproductible car les différentes extractions conduisent à un extrait

de couleur différente.

Nous avons effectué six (06) extractions successives avec 50g de matière végétale pour

chaque extraction. Les quantités obtenues ont été regroupées, ce qui nous a permis d’avoir 50 mg

d’H.E de couleur marron foncé. Les résultats des mesures du Rf [éluant : éther/éther de pétrole

(1 : 4)] des constituants de l’H.E sont reportés sur le tableau III.5.

Tableau III.5 : Facteurs de rétention (Rf) des constituants de l’H.E

L’analyse par spectroscopie de RMN 1H et du 13C de l’huile essentielle a conduit aux

spectres reportés sur les figures III.11-12.

Extractions Couleur Poids (mg) Rdt %

1 Jaune verdâtre 26 0,03

2 Brun 16 0,02

3 Brun jaunâtre 20 0,02

N° de Taches Rf Couleur

1 0,13 Mauve

2 0,32 Marron

3 0,44 Bleu

4 0,52 Mauve

5 0,61 Orange


76

Figure III.11 : Spectre RMN 1H de l’huile essentielle extraite


77

Figure III.12 : Spectre RMN 13C de l’huile essentielle extraite


78

IV.4. Extraction et analyse des tannins

Les tanins sont des composés naturels appartenant à la famille des polyphénols, soluble

dans l’eau, possédant une masse comprise entre 500 et 3000.

Ils peuvent être extraits, le plus souvent à chaud, par un mélange d’eau et d’acétone.

Le méthanol est évité, car il provoque la méthanolyse des depsides galliques.

La procédure d’extraction des tanins que nous avons utilisée est donnée ci-après :

Dégraissage du matériel végétal

100g de racine broyée en poudre sont introduits dans un ballon de 1L surmonté d’un

réfrigérant et contenant 200mL d’éther de pétrole. Le mélange ainsi formé est porté au reflux

pendant 2h. La racine dégraissée est séparée par filtration.


On introduit 100g de matière végétale (racine broyée en poudre) dégraissée dans un

ballon de 1L en présence de 380mL d’eau et 200mL d’acétone avec quelques fragments de pierre

ponce. Le mélange ainsi formé est porté au reflux pendant 4 jours.

Après filtration, la solution obtenue est extraite avec :

Du dichlorométhane (CH2Cl2) pour éliminer les pigments et les lipides puis avec

De l’acétate d’éthyle (AcOEt).

Les solutions organiques sont alors évaporées à sec après séchage sur Na2SO4.

Le schéma III.4 représente le principe de l’extraction des Tannins.


79

200mL d’éther de pétrole Reflux 2h Filtration

380mL d’eau 200mL d’acétone Reflux 4 jours Filtration Dichlorométhane

AcOEt Séchage Filtration Evaporation

Séchage Filtration Evaporation

Schéma III.4 : Protocole d’extraction des tanins

Les résultats obtenus lors de l’extraction des tannins par chauffage au reflux sont reportés

dans le tableau III.5.

Tableau III.5: Résultats d’extraction des tannins

Extraits Couleur Aspect Pf Poids (g) Rdt %

Dichlorométhane Marron foncé Liquide 28,250 28,25

Acétate d’éthyle Gris jaunâtre Solide > 270 9,686 9,69

mt= 37,936mg Rdtt= 37,94%

Matière Grasse 100g de MV dégraissée

Phase aqueuse Phase organique

Pigments et lipides

Phase Organique Phase aqueuse

Tannins

100g de MV


80

Analyse spectroscopique des tanins

Afin d’identifier la structure des tanins extraits, nous avons fait appel aux moyens d’analyse

spectroscopique à savoir : UV, IR, RMN du H1 et RMN du 13C.

Spectroscopie Ultra-Violette (UV)

L’appareil utilisé pour enregistrer le spectre UV est un spectrophotomètre UV-Visible

Thermo Electron Corporation «Nicolet Evolution 100» qui fonctionne sur une plage de longueurs

d’onde allant de 190 à 1100 nm. L’échantillon à analyser est préparé à partir d’une solution

d’extrait dilué dans l’eau distillée.

Le spectre UV des tannins (Fig.III.13) présente une bande large très intense à 294 nm

relative à la transition qui correspond au système aromatique disubstitué et phénolique.

Figure III.13 : Spectre UV des Tannins


81

Spectroscopie IR

L’échantillon à analyser a été réalisé sur des pastilles de bromure de potassium (KBr).

L’examen du spectre Infrarouge (Fig.III.14) des tanins extraits montre l’existence des bandes

suivantes :

Une bande intense et large correspondant aux vibrations d’allongement des groupements OH, vibrations de valence qui apparaissent vers 3417,24cm-1.

Deux bandes d’intensité faible à 2917,77 et 2850,27cm-1 relatives aux vibrations d’élongation

des (C-H) oléfiniques. Une bande de moyenne intensité à 1658,48cm-1 attribuable aux vibrations d’élongation des

liaisons aromatiques C=C ou C=O. Une bande d’intensité faible correspondant aux vibrations de déformation des groupements

OH située à 1405,85cm-1. Une bande multiple entre 1156,12 – 1079,94cm-1correspondant aux liaisons C-C.

Une multitude de bandes relatives aux vibrations de déformation hors du plan des CH des cycles benzéniques à 982,554 – 606,503 -423,298cm-1.


82

Figure III.14 : Spectre IR des tannins


83

Analyse par chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC)

L’analyse par HPLC a été réalisée sur un appareil Agilent 1100 HPLC-UV, avec

détecteur de barrettes de diode et détecteur de diffusion de la lumière par évaporation Sedex,

modèle 75, Séparation, quantification de composés organiques non volatils.

Les conditions d’analyse sont les suivantes :

Colonne Hypersil BDS C18 (5 µm, 250 × 4.0 mm)

λ : 280 nm

A: H2O/ HCOOH 98:2 (v/v)

B: CH3CN/HCOOH 80:20 (v/v)

Injection: 10 µL

L’analyse par chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC) des tanins a

conduit au chromatogramme représenté sur la figure III.15. Nous avons injecté 10L de l’extrait

et utilisé comme solvant : eau-acide formique / Acétonitrile-acide formique.

Le chromatogramme enregistré révèle trois (03) principaux pics et d’autres pics

minoritaires. Les résultats obtenus sont mentionnés sur le tableau III.6.

Tableau III.6 : Analyse par HPLC des tanins

N° de Pic 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tr. 2,78 3,04 3,13 28,83 29,66 30,04 31,26 32,01 35,01

Chaque pic a été caractérisé par son temps de rétention. Néanmoins, aucune identification

structurale n’a pu être effectuée par absence d’échantillons authentiques de référence.


84

Figure III.15 : Chromatogramme en phase liquide des tannins


85

V. CONCLUSION

Nous avons mis en pratique différents protocoles expérimentaux pour extraire

les alcaloïdes, les flavonoïdes, l’huile essentielle et les tanins contenus dans la racine de la

Bryone.

Les méthodes spectroscopique et chromatographique disponibles que nous avons utilisées

nous ont permis de caractériser les différents principes actifs isolés. La diversité des éléments les

composant, le nombre de combinaison possibles rendent complexe l’établissement de leur

structure.

Chapitre IV Etude Biologique

Chapitre IV Etude biologique

87

I. INTRODUCTION

La médication par les plantes date depuis les temps les plus reculés. Actuellement, elle

connaît un regain d’intérêt auprès des populations. Près de 80% de la population Africaine ont

recours aux plantes pour se soigner et n’ont pas accès aux médicaments dits modernes.

Plusieurs principes actifs isolés des plantes sont devenus des médicaments efficaces.

Afin de valider l’utilisation de la Bryone en médecine traditionnelle, nous nous

sommes proposés de tester in vitro le pouvoir antibactérien et antifongique de l’extrait

méthanolique de la racine de Bryonia dioica sur la croissance de différentes souches

microbiennes.

II. MATERIEL ET METHODE

II.1. Matériel

Pour la mise en évidence de l’activité biologique, huit (08) souches bactériennes et quatre (04) fongiques ont été testées vis-à-vis de l’extrait méthanolique de la racine de la Bryone.

II.1.1. Souches bactériennes

Bactéries en forme de sphère : les cocci à Gram positif Provenance

Enterococcus faecalis ATCC 6538 Institut Pasteur d’Oran

Micrococcus luteus MCIM 8166 Institut Pasteur de Paris

Staphylococcus aureus ATCC 6538 Institut Pasteur d’Oran

Bactéries en forme de bâtonnet : les bacilles Provenance

Bacilles à Gram positif

Bacillus subtilis ATCC 6633 Institut Pasteur d’Oran

Corynebacterium sp. LBMB*


88

Bacilles à Gram négatif Provenance

Escherichia coli ATCC 25922 Institut Pasteur d’Oran

Proteus mirabilis LBMB*

Pseudomonas aeruginosa ATCC 14028 Institut Pasteur d’Oran

* Laboratoire de Biologie des Micro-organismes et de Biotechnologie de l’Université Es-sénia d’Oran.

II.1. 2. Souches fongiques

Les deux espèces de champignons filamenteux testées sont :

Provenance

Aspergillus niger ATCC 16404 Institut Pasteur de Paris

Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (f.o.l) LBMB*

Les deux espèces de levure testées sont :

Provenance

Candida albicans ATCC 10231 Institut Pasteur d’Oran

Saccharomyces oviformis LBMB*

* Laboratoire de Biologie des Micro-organismes et de Biotechnologie de l’Université Es-sénia d’Oran.


89

II.1.3. Principales caractéristiques des souches testées

Souches bactériennes

*Bactéries en forme de sphère : les cocci à Gram positif

Enterococcus faecalis

C’est un coccus à Gram positif, dépourvu de catalase, à métabolisme anaérobie.

Il appartient à la famille des Streptococaceae. C’est une bactérie non sporulé, immobile, qui

se présente de manière isolée ou en paire ou en courte chaînette. C’est un germe ubiquitaire

présent dans l’intestin de l’homme et des animaux, dans les eaux usées, dans l'eau douce, dans

l'eau de mer, dans le sol et sur les végétaux.

Les entérocoques sont susceptibles de contaminer les aliments comme les produits laitiers et

les viandes. Chez l'homme, les entérocoques sont des bactéries pathogènes opportunistes

responsables de septicémies, d’endocardites, d’infections urinaires, de surinfections des plaies

(notamment chirurgicales), de méningites, d’infections nosocomiales.75

Micrococcus luteus

C’est une bactérie de forme arrondie (coccus) à Gram positif, aérobie, appartenant à la

famille des Micrococcaceae.76 Elle a pour habitat le sol, l’eau. Elle est fréquente sur la peau

de l'homme. Cet organisme a été reconnu comme étant un pathogène opportuniste et

responsable d’arthrite, d’endocardites, de méningites, suppuration intracrânienne et

pneumonie chez les patients immunodéprimés.77

Staphylococcus aureus ATCC 6538

C’est un coccus à Gram positif immobile, appartenant à la famille des Micrococcaceae.

Il est disposé en amas, à la façon d’une grappe de raisin. C’est un germe ubiquitaire très

répandu dans la nature, le sol, l’air et l’eau. II se retrouve chez 30 à 40% des individus sain au

niveau de leurs fosses nasales et de la gorge. Il est pathogène et responsable d'infections

cutanées, ostéomyélites, septicémies et pneumopathies.78

75 Avril, J. L., Fauchère J. L., “Bactériologie générale et médicale“, Ed. Ellipses, Paris, 2002. 76 Young, M., et al., J.Bacteriol. 2010, Vol. 192, N°3, p.841-860. 77 Yang, S., Sugawara, S., Monodane, T., Nishijima, M., Adachi, Y., Akashi, S., Miyake, K., Hase, S., Takada, H., Infection and Immunity, 2001, Vol. 69, N°4, p.2025-2030. 78 a) Avril, J. L., Dabernat, H., Denis, F., Monteil., H., “Bactériologie Clinique“ 2émeEd. Ellipses, 1992, p.9-21; b) Nauciel, C., Vildé, J-L “Bactériologie médicale“ Ed. Elsevier Masson, 2005, p.77.


90

*Bactéries en forme de bâtonnet : les bacilles


Bacillus subtilis ATCC 6633

C’est un grand bacille à Gram positif, groupé en chaînette, mobile, aérobie strict.

Il appartient à la famille des Bacillaceae. C’est un saprophyte du sol, de l’air, de l’eau,… et

des plantes. Il n’est pas considéré comme pathogène pour l’homme, mais il peut contaminer

des aliments et peut exceptionnellement provoquer des intoxications alimentaires.79

Corynebacterium sp.

Les bactéries du genre Corynebacterium appartiennent à la famille des

Corynebacteriaceae. Ce sont des bacilles à Gram positif, immobiles, asporulés

et éro-anaérobies facultatifs, souvent granuleux et à extrémités élargies. De nombreuses

espèces font partie de la flore normale de la cavité orale, de la muqueuse et de la peau.80

Bacilles à Gram négatif

Escherichia coli ATCC 25922

C’est un bacille à Gram négatif appartenant à la famille des Enterobacteriaceae.

C’est une bactérie à mobilité péritriche, se développant en aéro-anaérobie et sur gélose

ordinaire. C’est un hôte commun de la microflore commensale intestinale de l’homme. C’est

le germe le plus fréquemment responsable d’infections urinaires. Cette bactérie est aussi à

l’origine de septicémies, de méningites chez le nourrisson ainsi que de manifestations

intestinales telles que les diarrhées. Elle est également responsable d’infections

communautaires et nosocomiales.75

Proteus mirablis ATCC 29906

C’est un bacille à Gram négatif appartenant à la famille des Enterobacteriaceae.

C’est une bactérie très mobile, extrêmement répandue dans la nature, dans le sol, l’air et

79 a) Schaechter, M., Piggot, P. J., “Encyclopedia of Microbiology: Bacillus subtilis“, Ed. Elsevier, USA, 2009, p.54; b) Hugo, W. B., Russell, A. D., “Pharmaceutical Microbiology“, 6émeEd. Blackwell science Ltd, 1998, p.27. 80 Schaechter, M., Smith, K. F., Oram, D. M., “Encyclopedia of Microbiology: Corynebacteria. including diphtheria“ Ed. Elsevier, USA, 2009, p.94-106.


91

l’eau. C'est un commensal du tube digestif, responsable d’infection de plaie, de septicémie et

le plus fréquemment d’infections urinaires.75

Pseudomonas aeruginosa ATCC 14028

C’est un bacille mobile à Gram négatif, aérobie strict. Il est connu sous le nom de bacille

pyocyanique, parce que l’une de ses caractéristiques principales est la production d’un

pigment bleu ou pyocyanine. C'est un germe qui vit normalement à l'état de saprophyte dans

l'eau et le sol humide ou sur les végétaux. Par ailleurs, cette bactérie peut vivre en

commensale au niveau du tube digestif de l’homme et de divers animaux.78

Elle est responsable de redoutables infections hospitalières ou nosocomiales surtout chez les

malades affaiblis aux défenses diminuées ou ayant une affection sévère (diabète, brûlures,

arthrite…).81

Souches fongiques

* Champignons filamenteux

Aspergillus niger ATCC 16404

Aspergillus niger est une moisissure cosmopolite. Elle fait partie des champignons

Ascomycètes très petits, extrêmement répandus dans l’environnement. Ce champignon vit au

dépend des matières organiques en décomposition et se développe dans les céréales, les fruits,

les légumes moisis et diverses plantes.82Il est responsable de la pourriture des arachides et

d’autres plantes. Il est pathogène et responsable dans les atteintes pulmonaires. Il est souvent

retrouvé dans les otites du conduit auditif externe.83

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (f.o.l)

Les Fusariums sont des champignons cosmopolites, retrouvés dans le sol, l’air ou l’eau, et

qui parasitent de très nombreuses plantes, notamment les fruits et les légumes auxquels ils

provoquent diverses maladies.82 La contamination a lieu principalement par les racines et

81 Keynes, S. A., Due, S. L., Paul, B., ‘’Age and Ageing’’, 2009, 38, p.245-246 et références citées. 82 Guillaume, V., “Mycologie : auto-évaluation, manipulations“, Ed. De Boeck Université, Bruxelles, 2006. 83 Kayser, F. H., “Medical Microbiology“, Ed. Thieme, Stuttgart, 2005, p.364-365.


92

s’étend dans les plantes par le système vasculaire; ce qui implique que cette espèce est

considérée comme l’agent causal de la fusariose vasculaire de la tomate.84

* Les levures

Candida albicans ATCC 10231

C’est l’espèce la plus fréquente en pathologie humaine du genre Candida. Elle est

retrouvée chez 83% de la population. Cette levure saprophyte est responsable d’infection

superficielle ne survenant que chez des individus immunodéprimés. Elle provoque alors des

infections fongiques candidoses essentiellement au niveau des muqueuses buccale, digestive

et gynécologique.85

Saccharomyces oviformis

Saccharomyces oviformis est une levure de forme ovoïde et résistante à l’alcool. Elle est

utilisée, parmi tous les ferments, levains, levures,…dans le pain, les yaourts, la bière et le

vin.86

II.1.4. Matériel chimique

L’extrait méthanolique testée a été obtenu par extraction au Soxhlet à partir de la racine

de la plante Bryone dioïque récoltée en Octobre 2008 dans la localité de Bouamama située à

l’ouest d’Oran (cf. chap. I, page 9).

Système d’extraction au Soxhlet

L’extracteur de Soxhlet permet le traitement de la matière végétale en plus grande

quantité, avec des solvants en phase liquide ou partiellement vaporisés. Le corps de

l’extracteur, contient une cartouche en cellulose remplie de matière végétale. Cette cartouche

est fixée sur un ballon qui est surmonté d’un réfrigérant. Le solvant est vaporisé puis

condensé tout en restant en contact avec la matière végétale. La solution collectée dans le

ballon s’enrichit de plus en plus en soluté à chaque cycle d'extraction et la matière végétale est

84 Reis, A., Costa, H., Boiteux, L.S., Lopes, C.A., Fitopatologia Brasileira, 2005, Vol.30, p.426-428. 85 Hart, T., Shears, P., “ Atlas de poche de microbiologie“, Ed. Médecine-Sciences, Paris, 1997, p.240. 86 Site Internet : Levure de www.ac-nancy-metz.fr


93

toujours en contact avec du solvant fraîchement distillé. L’extraction est terminée lorsque le

solvant d’extraction devient de plus en plus très coloré. (Fig.IV.1).

Figure IV.1 : Montage d’extraction au Soxhlet

II.1.5. Milieux de culture

Plusieurs milieux ont été choisis pour les cultures bactériennes :

Bouillon nutritif

Gélose nutritive

Gélose de Mueller-Hinton

Pour les cultures fongiques nous avons choisi :

Milieu Pomme de terre Dextrose Agar (PDA) pour les champignons filamenteux

Milieu Sabouraud pour les champignons levuriformes


94

II.1.5.1. Milieux pour les cultures bactériennes

Bouillon nutritif (B.N) :

Peptone……………………………………............................5g

Extrait de viande…………………………………………….3g

NaCl…………………………………………………………5g

Eau distillée…………………………………….……………1L

Ajuster le pH à……………………………………………….7

Gélose nutritive (G.N) :

Bouillon nutritif…………………………………………...1L

Agar-agar………………………………………………….20g

Ajuster le pH à …………………………………………….7

Gélose de Mueller Hinton (M.H) :

Bouillon de Mueller-Hinton ………………………………1L

Agar-agar…………………………………………………20g

Ajuster le pH à ……………………………………………7,4

II.1.5.2. Milieux pour les cultures fongiques

Milieu PDA (Pomme de terre Dextrose Agar) :

Extrait de pomme te terre………………………………….1L

Glucose……………… ……………………………………20g

Agar-agar……………… ………………………………….20g

Ajuster le pH à………………………………………..5,6 0,2

Préparation de l’extrait de pomme de terre

200g de pomme de terre sont lavés, découpés en petits cubes et portés à l’ébullition

pendant une 1h dans 1L d’eau distillée. On complète le filtrat récupéré à 1L avec de l’eau

distillée. On ajuste le pH après ajout du glucose, ensuite la solution à chaud est additionnée de

20g d’Agar-agar.

N. B : Tous les milieux sont stérilisés par Autoclavage à 120°C pendant 30 minutes.


95

II.2. Méthodes

II.2.1. Préparation de L’échantillon d’extrait méthanolique

L’extrait méthanolique de la Bryone est dilué avec une petite quantité de méthanol.

II.2.2. Préparation des précultures

La sensibilité des bactéries et des champignons vis-à-vis de l’extrait méthanolique

peut être étudiée par la technique de culture en milieu liquide ou par la technique de diffusion

en milieu solide. Pour notre part nous avons utilisé la méthode de diffusion en milieu solide

coulé en boîte de pétri.

II.2.2.1. Bactéries

Les huit souches bactériennes conservées sont ensemencées dans des boîtes de Pétri

contenant 20mL de gélose nutritive et incubées à 37°C pendant 24h, afin de stimuler leur

croissance.

II.2.2.2. Champignons

On prélève des implants de 5mm de côté à partir de cultures mères des souches

fongiques filamenteuses conservées, qui sont ensemencés sur milieu PDA en boîte de Pétri.

Les boîtes sont incubées à 25°C pendant 7 jours.

Les levures sont ensemencées par la méthode des stries sur milieu Sabouraud en

boîtes de Pétri. Ces dernières sont incubées à 25°C pendant 48h.

II.2.3. Conservation des cultures

La conservation des souches bactériennes se fait dans des tubes de gélose nutritive

inclinée à une température de 4°C. Elles sont repiquées sur un nouveau milieu tous les

trois mois.

La conservation des champignons filamenteux se fait dans des tubes contenant du

PDA gélosé incliné, à une température de 4°C, tandis que les souches levuriformes se fait

sur des tubes contenant du milieu Sabouraud à 4°C.


96

II.2.4. Tests d’activité antimicrobienne de l’extrait méthanolique

II.2.4.1. Test antibactérien 87

Préparation de l’inoculum

À partir d’une préculture âgée de 24h ensemencée sur une gélose nutritive, on prélève

3 à 4 colonies bien isolées avec une anse et les émulsionner dans un tube contenant 10mL de

bouillon nutritif.

Après 24 heures d’incubation à 37°C, on compare le tube de la suspension bactérienne

avec le tube de l’étalon 0,5 Mac Farland (108UFC/mL) contre une fiche de papier blanc avec

des lignes noires pour ajuster la turbidité de la suspension. La turbidité peut être diminuée en

ajoutant plus de bouillon nutritif stérile, ou bien augmentée par l’augmentation de la durée

d’incubation.

Ensemencement des milieux de cultures en boîtes et dépôts des disques

On coule 20mL de gélose de Mueller-Hinton en surfusion dans des boîtes de Pétri de

90mm de diamètre. Ensuite, on introduit les boîtes dans l’étuve à 37°C pendant 30mn avant

de les ensemencer pour éliminer l’humidité.

1mL d’inoculum bactérien standardisé (108UFC/mL) est aseptiquement déposé et étalé

sur la surface du milieu à l’aide d’un étaloir, le liquide en excès est aspiré avec une pipette

Pasteur stérile.

On dépose 3 disques de 6mm de diamètre, imprégnés de l’extrait méthanolique, à

l’aide d’une pince stérile dans chaque boîte testée (03 boites pour chaque souche bactérienne).

Pour une bonne diffusion du contenu des disques, on laisse les boîtes à la température

ambiante 15mn avant de les incuber à 37°C. Les disques déposés dans les boîtes témoins sont

imprégnés uniquement de méthanol à 96%.

87Joffin, J., Leyral, G.,’’ Microbiologie Technique’’, 1996, p.43.


97

Préparation de la suspension bactérienne

Schéma IV.1 : Etapes du test antibactérien

Etalon 0,5 Mac Farland

Couler 20mL de gélose de M.H dans des boîtes de Pétri, Puis, introduire ces

boîtes dans l’étuve à 37°C pendant 30mn avant de les ensemencer pour

éliminer l’humidité.

Déposer et étaler 1mL d’inoculum bactérien standardisé sur la

surface du milieu M.H coulé précédemment dans les boîtes.

Imprégner les disques de l’extrait MeOH à tester et de MeOH à 96%

Déposer les disques imprégnés d’extrait MeOH dans les boîtes testées

et les disques imprégnés de MeOH dans les boîtes témoins

Incubation à 37°C pendant 24h, après un

repos de 15mn à température ambiante

Mesurer les diamètres des zones d’inhibition autour des disques.

Ensemencer sur GN en

boîte de Pétri

Culture bactérienne

Prélever 3 à 4 colonies bien

isolées

Emulsionner dans un tube contenant

10mL de B.N

Incubation à 37°C pendant

24h

Ajuster la turbidité avec l’étalon 0,5

Mac Farland


98

II.2.4.2. Test antifongique 87

II.2.4.2.1. Tests sur les champignons filamenteux

Préparation des suspensions sporales

On prélève des implants de 5mm de côté de chaque souche fongique filamenteuse

testée à partir des précultures âgées de 7 jours, qui sont émulsionner dans des tubes à essai

contenant chacun 10mL d’eau distillée stérile.

On compte le nombre de spores après agitation au Vortex à l’aide d’un hématimètre

(cellule de Thomas) sous microscope photonique. La concentration est calculée selon la

formule suivante :

N= n.4.106

N : Nombre de spores par mL. n : Moyenne du nombre de spores dans dix petits carrés.

Les concentrations des suspensions sporales doivent être égales à 5,4 x 106 spores par mL.


On dépose 1mL de chaque suspension sporale standardisée avec la cellule de Thoma

dans une boîte de Pétri de 90mm de diamètre, puis on coule le milieu PDA en surfusion et on

homogénéise par mouvement circulaire de huit.

Des disques de papier filtre de 6mm de diamètre sont déposés dans les boîtes de Pétri.

Il faut noter qu’on ne peut pas placer plus de 3 disques dans une boîte de 90mm pour éviter le

chevauchement des zones d’inhibition. Une fois que le disque entre en contact avec la surface

de la gélose, il ne doit plus être déplacé. Les disques sont imprégnés soit de :

L’extrait méthanolique dissout dans le méthanol à 96% pour les boîtes testées.

Le méthanol pour les boîtes témoins.

On effectue trois répétitions pour chaque souche de champignon filamenteux. Il faut sceller

les boîtes avec un ruban adhésif et les laisser un quart d’heure à la température ambiante avant

de les incuber à 25°C pendant 48h à 72h, pour que le contenu des disques diffuse dans le

milieu.


99

Préparation de la suspension sporale

Schéma IV.2 : Etapes du test antifongique sur les champignons filamenteux

Prélever des implants de 5mm

Emulsionner dans un tube

contenant 10mL d’eau

distillée stérile Ajuster la concentration

à 5,4 x106 spores/mL à l’aide

de l’hématimètre de Thoma

Agitation au Vortex

Préculture fongique

filamenteuse âgée de 7 jours

Déposer 1mL de suspension sporale standardisée avec la cellule de Thoma

dans une boîte de pétri

Couler le milieu PDA en surfusion et homogénéiser par un

mouvement circulaire de huit

Imprégner des disques dans l’extrait MeOH à tester et de MeOH à 96%

Déposer les disques imprégnés de l’extrait MeOH dans les boîtes

testées et les disques imprégnés de MeOH dans les boîtes témoins

Incubation de 48h à 72h à 25°C, après un repos

de 15mn à température ambiante

Mesurer les diamètres des zones d’inhibition autour des disques


100

II.2.4.4. Tests sur les levures 87

Préparation de l’inoculum

Chaque culture doit être ensemencée par la méthode des stries sur le milieu

Sabouraud pour obtenir des colonies isolées. Après une incubation de 48 heures à une

température de 25°C, on prélève 4 à 5 colonies bien isolées avec une anse et on les

émulsionne dans un tube contenant 10mL de bouillon nutritif.

Après 24 heures d’incubation à 25°C, on compare le tube de la suspension de levure

avec le tube de l’étalon 0,5 Mac Farland (108UFC/mL) contre une fiche de papier blanc avec

des lignes noires pour ajuster la turbidité de la suspension. La turbidité peut être diminuée en

ajoutant plus de bouillon nutritif stérile, ou bien augmentée par l’augmentation de la durée

d’incubation.


La méthode utilisée est celle décrite précédemment pour les bactéries en remplaçant le

milieu Mueller-Hinton par celui de Sabouraud. L’incubation dure de 24h à 48 h à 25C°.


101

Etalon 0,5 Mac Farland

Ensemencer sur milieu Sabouraud en boîtes de Pétri

Prélever 4 à 5 colonies bien

isolées

Emulsionner dans un tube contenant

10mL de B.N

Incubation de 24h à 25°C

Ajuster la turbidité avec l’étalon 0,5

Mac Farland

Incubation de

48h à 25°C

Préparation de la suspension levuriforme

Schéma IV.3 : Etapes du test antifongique sur les levures

Culture de levure

Couler 20mL de milieu Sabouraud dans des boîtes de Pétri, Puis, introduire

ces boîtes dans l’étuve à 37°C pendant 30mn avant de les ensemencer pour

éliminer l’humidité

Déposer et étaler 1mL d’inoculum de levure standardisé sur la

surface du milieu Sabouraud coulé précédemment dans les boîtes

Imprégner des disques de l’extrait MeOH à tester et de MeOH à 96%

Déposer les disques imprégnés d’extrait MeOH dans les boîtes testées

et les disques imprégnés de MeOH dans les boîtes témoins

Incubation à 25°C pendant 24h à 48h, après un

repos de 15mn à température ambiante

Mesurer les diamètres des zones d’inhibition autour des disques


102

III. RESULTATS ET DISCUSSION

Nous avons eu recours à l’antibiogramme qui est une méthode efficace pour

déterminer l’effet antimicrobien de l’extrait méthanolique de la Bryone dioïque sur les micro-

organismes testés.

Pour cela la sensibilité des souches testées est déterminée en mesurant les diamètres

des zones d’inhibition dans les deux sens perpendiculaires autour des disques.

En fonction de l’existence ou non de zones d’inhibition, trois réponses sont possibles :

Souche sensible : La dimension du diamètre de la zone d’inhibition est égale ou

supérieure à 10mm

Souche limite (intermédiaire) : La dimension du diamètre de la zone

d’inhibition inférieure à 10mm

Souche résistante : Absence de zone d’inhibition

Les résultats des tests de l’activité anti-microbienne de l’extrait méthanolique de la

racine de la Bryone vis-à-vis des souches sont reproduits sur les planches I à II regroupant

diverses figures. Les diamètres d’inhibition sont regroupés sur les tableaux IV.1-3.


103

PLANCHE I

Résultats de l’activité biologique de l’extrait méthanolique de la Bryone dioïque sur

les Bactéries

Bactéries en forme de sphère : les cocci à Gram positif

FIG I.1 : Résultat sur la croissance d’Enterococcus faecalis, après 24h d’incubation à 37°C,

sur milieu Mueller-Hinton.

A : boîte témoin.

B : boîte testée.

FIG I.2 : Résultat sur la croissance de Micrococcus luteus MCIM8166, après 24h

d’incubation à 37°C, sur milieu Mueller-Hinton.

A : boîte témoin.

B : boîte testée.

FIG I.3 : Résultat sur la croissance de Staphylococcus aureus ATCC 6538, après 24h


A : boîte témoin.

B : boîte testée.


104

Bactéries en forme de bâtonnet : les bacilles


FIG I.4 : Résultat sur la croissance de Bacillus subtilis ATCC 6633, après 24h d’incubation à

37°C, sur milieu Mueller-Hinton.

A : boîte témoin.

B : boîte testée.

FIG I.5 : Résultat sur la croissance de Corynebacterium sp., après 24h d’incubation à 37°C,

sur milieu Mueller-Hinton.

A : boîte témoin.

B : boîte testée.

Bacilles à Gram négatif

FIG I.6 : Résultat sur la croissance d’Escherichia coli ATCC 25922, après 24h


A : boîte témoin.

B : boîte testée.

FIG I.7 : Résultat sur la croissance de Proteus mirabilis ATCC 29906, après 24h


A : boîte témoin.

B : boîte testée.

FIG I.8 : Résultat sur la croissance de Pseudomonas aeruginosa ATCC 14028, après 24h


A : boîte témoin.

B : boîte testée.


105

III.1. Bactéries

PLANCHE I

Bactéries en forme de sphère : les cocci à Gram positif

A: Enterococcus faecalis (Témoin)

B: Enterococcus faecalis (Testée)

FIG I.1: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance d’Enterococcus faecalis

A: Micrococcus luteus MCIM 8166 (Témoin)

B: Micrococcus luteus MCIM 8166 (Testée)

FIG I.2: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de Micrococcus luteus MCIM 8166


106

Bactéries en forme de bâtonnet : les bacilles

Bacilles à Gram positif :

A: Bacillus subtilis ATCC 6633 (Témoin)

B: Bacillus subtilis ATCC 6633 (Testée)

FIG I.4: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de Bacillus subtilis ATCC 6633

A: Staphylococcus aureus ATCC 6538

(Témoin)

B: Staphylococcus aureus ATCC 6538

(Testée)

FIG I.3: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de Staphylococcus aureus ATCC 6538


107

Bacilles à Gram négatif :

A : Escherichia coli ATCC25922 (Témoin)

B : Escherichia coli ATCC25922 (Testée)

FIG I.6: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance d’Escherichia coli ATCC25922

A: Corynebacterium sp. (Témoin)

B: Corynebacterium sp. (Testée)

FIG I.5: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de Corynebacterium sp.


108

A: Pseudomonas aeruginosa ATCC 14028

(Témoin)

B: Pseudomonas aeruginosa ATCC 14028

(Testée)

FIG I.8: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de Pseudomonas aeruginosa ATCC 14028

A: Proteus mirabilis ATCC 29906 (Témoin)

B: Proteus mirabilis ATCC 29906 (Testée)

FIG I.7: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de Proteus mirabilis ATCC 29906


109

PLANCHE II


les champignons filamenteux

FIG II.1 : Résultat sur la croissance d’Aspergillus niger ATCC1640, après 48h à 72h

d’incubation à 25°C, sur milieu PDA.

A : boîte témoin.

B : boîte testée.

FIG II.2 : Résultat sur la croissance Fusarium oxysporum f.sp lycopersici (f.o.l), après 48h à

72h d’incubation à 25°C, sur milieu PDA.

A : boîte témoin.

B : boîte testée.


110

III.2. Champignons filamenteux

PLANCHE II

A: Aspergillus niger ATCC16404 (Témoin)

B: Aspergillus niger ATCC16404 (Testée)

A: Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (f.o.l)

(Témoin)

B: Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (f.o.l)

(Testée)

FIG II.1: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance d’Aspergillus niger ATCC16404

FIG II.2: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de

Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (f.o.l)


111

PLANCHE III


les levures

FIG III.1 : Résultat sur la croissance de Candida albicans ATCC 10231, après 24h


A : boîte témoin.

B : boîte testée.

FIG III.2: Résultat sur la croissance de Saccharomyces oviformis, après 24h


A : boîte témoin.

B : boîte testée.


112

III.3. Champignons levuriformes

PLANCHE III

A: Candida albicans ATCC10231 (Témoin)

B: Candida albicans ATCC10231 (Testée)

FIG III.1: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de Candida albicans ATCC10231

A: Saccharomyces oviformis (Témoin)

B: Saccharomyces oviformis (Testée)

FIG III.2: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de Saccharomyces oviformis


113

Au vu des résultats obtenus au cours de nos expériences, on constate que les disques

imbibés de l’extrait méthanolique sont entourés par des zones d’inhibition, ce qui traduit une

absence de croissance microbienne. Les tableaux IV.1-3 regroupent les résultats de la mesure

des diamètres d’inhibition pour les bactéries.

Tableaux IV.1 : Diamètres (Φ) des zones d’inhibition des Bactéries en forme de sphère : Les cocci à Gram positif, après 24h d’incubation à 37°C, sur milieu M-H.

Bactéries en forme de sphère :

les cocci à Gram positif Φ (Témoin) Φ (Testée)

Enterococcus faecalis 6 mm 14 mm

Micrococcus luteus 6 mm 8 mm

Staphylococcus aureus 7 mm 15 mm

Tableaux IV.2 : Diamètres (Φ) des zones d’inhibition des Bactéries en forme de bâtonnet : Les bacilles à Gram positif, après 24h d’incubation à 37°C, sur milieu M-H.

Bactéries en forme de bâtonnet :

Les bacilles Gram positif Φ (Témoin) Φ (Testée)

Bacillus subtilis 6 mm 12 mm

Corynebacterium sp. 6 mm 6 mm

Tableaux IV.3 : Diamètres (Φ) des zones d’inhibition des Bactéries en forme de bâtonnet : Les bacilles à Gram négatif, après 24h d’incubation à 37°C, sur milieu M-H.

Bactéries en forme de bâtonnet :

Les bacilles Gram négatif Φ (Témoin) Φ (Testée)

Escherichia coli 6 mm 12 mm

Proteus mirabilis 6 mm 10 mm

Pseudomonas aeruginosa 6 mm 10 mm


114

Pour les tests antibactériens, l’intervalle des diamètres d’inhibition mesurés est

compris entre 6 et 15 mm. On remarque que l’extrait méthanolique de la Bryone a agi

positivement sur l’ensemble des souches bactériennes sauf pour Corynebacterium sp.

L’inhibition la plus élevée est observée avec les bactéries à Gram positif et particulièrement

pour Staphylococcus aureus.

Les diamètres d’inhibition mesurés pour les souches fongiques sont rassemblés sur

les tableaux IV.4 et IV.5.

Tableaux IV.4 : Diamètres (Φ) des zones d’inhibition des champignons filamenteux, après 48h à 72h d’incubation à 28°C, sur milieu PDA.

Tableaux IV.5 : Diamètres (Φ) des zones d’inhibition des levures, après 24h d’incubation à

25°C, sur milieu PDA.

Pour les tests antifongiques, d’après la mesure des diamètres, aucune variation de la

dimension des zones d’inhibition par rapport au témoin n’est observée; ce qui signifie que

l’extrait méthanolique de la Bryone n’a aucun effet sur toutes les souches fongiques testées.

Afin de visualiser l’action de l’extrait méthanolique de la racine de la Bryone sur

les souches microbiennes testées, il nous a semblé plus commode de représenter les résultats

de nos expériences sous forme d’histogrammes (figures IV. 2-3) respectivement pour

les bactéries et les champignons.

Champignons filamenteux Φ (Témoin) Φ (Testée)

Aspergillus niger 6 mm 6 mm

Fusarium oxysporum 6 mm 6 mm

Levures Φ (Témoin) Φ (Testée)

Candida albicans 6 mm 6 mm

Saccharomyces oviformis 6 mm 6 mm


115

Figure IV.2 : Influence de l’extrait méthanolique de la Bryone sur les souches bactériennes


116

Figure IV.3 : Influence de l’extrait méthanolique de la racine de la Bryone sur les souches fongiques


117

V. CONCLUSION

Les tests biologiques réalisés montrent clairement que les germes sont sensibles

à l’extrait méthanolique de la Bryone. Toutefois, aucune activité n’est observée pour les

différentes espèces fongiques testées. Les résultats des tests indiquent que la Bryone montre

une efficacité contre la population bactérienne jusqu’à atteindre 15mm d’inhibition pour

Staphylococcus aureus.

Conclusion

Générale

Conclusion

119

Conclusion Générale

Le travail que nous avons mené sur l’étude chimique et microbiologique de la racine

de Bryonia dioica provenant de la localité de Bouamama (région ouest d’Oran) nous a permis

de dégager les points essentiels suivants :

Les Curcubitaceae dont fait partie la Bryone sont une famille qui comprend différents sortes

de plantes : des légumes, des fruits, des plantes décoratives,…Cette plante se caractérise par

son action purgatif, diverses propriétés thérapeutiques (anti-inflammatoire, vermifuge,…et

anti-cancérigène) et une certaine toxicité.

Aussi, les constituants chimiques des plantes sont de structure variée et représentent

une source de remèdes populaires des plus efficaces, surtout dans les pays en voie de

développement et sont à la base de nombreux médicaments.

Les résultats des tests phytochimiques préliminaires de coloration et de précipitation

laissent penser à l’existence prépondérante d’alcaloïdes, de flavonoïdes,…et de tanins ; ce qui

en fait une source potentielle. Il apparaît également de ces tests que la racine de la Bryone

renferme très peu de quinones combinées et pas d’anthraquinones. La recherche de ces

différents principes actifs a été conduite sur des extraits racinaires aqueux, éthanoliques,…et

acides.

L’extraction d’alcaloïdes, de flavonoïdes,…et des tanins a été effectuée selon

différents protocoles expérimentaux; celle de l’huile essentielle par hydrodistillation avec un

très faible rendement.

Les constituants chimiques de la racine de la Bryone à savoir : les alcaloïdes,

les flavonoïdes,…et les tanins ont été séparés et caractérisés par spectroscopie (UV, IR, RMN 1H et 13C) et chromatographie (CCM, CG/SM et HPLC). Néanmoins, la détermination

structurale de ces extraits n’a pu être établie faute d’appareillage adéquat et de témoins

appropriés.

Conclusion

120

Il est à noter que des analyses complémentaires s’avèrent nécessaires, en particulier,

pour élucider du point de vue structural, les principes actifs mis en évidence dans la racine de

la Bryone.

Par ailleurs, les tests anti-microbiens ont permis d’estimer le pouvoir de l’extrait

méthanolique de la racine de la Bryone sur huit (08) espèces bactériennes et quatre (04)

espèces fongiques (2 champignons filamenteux et 2 levures).

Les résultats de ces expériences, effectuées in vitro par la méthode de diffusion en

milieu solide, révèlent que l’extrait méthanolique est actif sur toutes les souches bactériennes

testées à l’exception de Corynebacterium sp. L’espèce Staphylococcus aureus, bactérie à

Gram positif, présente la plus grande inhibition.

Néanmoins, on note une absence totale d’activité de l’extrait méthanolique vis-à-vis

des souches fongiques testées. Cette activité anti-bactérienne enregistrée est due

essentiellement aux polyphénols présents dans la plante.

Bibliographie

122

Bibliographie

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126

73 Couplan, F., “Le règne végétal : Plantes sauvages comestibles “, Ed. Ellebore, 2009, p.201-202.

74 Duke, A.J., “Handbook of Phytochemical Constituents of GRAS Herbs and other economic plants“, Ed. CRC Press, 1992, p.114. 75Avril, J. L., Fauchère J. L., “Bactériologie générale et médicale“, Ed. Ellipses, Paris, 2002. 76 Young, M., et al., J.Bacteriol. 2010, Vol. 192, N°3, p.841-860. 77 Yang, S., Sugawara, S., Monodane, T., Nishijima, M., Adachi, Y., Akashi, S., Miyake, K., Hase, S., Takada, H., Infection and Immunity, 2001, Vol. 69, No. 4, p.2025-2030. 78 a) Avril, J. L., Dabernat, H., Denis, F., Monteil., H., “Bactériologie Clinique“ 2émeEd. Ellipses, 1992, p.9-21; b) Nauciel, C., Vildé, J-L “Bactériologie médicale“ Ed. Elsevier Masson, 2005, p.77. 79 a) Schaechter, M., Piggot, P. J., “Encyclopedia of Microbiology: Bacillus subtilis“, Ed. Elsevier, USA, 2009, p.54; b) Hugo, W. B., Russell, A. D., “Pharmaceutical Microbiology“, 6émeEd. Blackwell science Ltd, 1998, p.27. 80 Schaechter, M., Smith, K. F., Oram, D. M., “Encyclopedia of Microbiology: Corynebacteria. Including diphtheria“, Ed. Elsevier, USA, 2009, p.94-106. 81 Keynes, S. A., Due, S. L., Paul, B., “Age and Ageing“, 2009, 38, p.245-246 et références citées. 82 Guillaume, V., “Mycologie: auto-évaluation, manipulations“, Ed. De Boeck Université, Bruxelles,

2006. 83 Kayser, F. H., “Medical Microbiology“, Ed. Thieme, Stuttgart, 2005, p.364-365. 84 Reis, A., Costa, H., Boiteux, L.S., Lopes, C.A., Fitopatologia Brasileira, 2005, Vol.30, p.426-428. 85 Hart, T., Shears, P., “ Atlas de poche de microbiologie“, Ed. Médecine-Sciences, Paris, 1997, p.240. 86 Site Internet : Levure de www.ac-nancy-metz.fr 87 Joffin, J., Leyral, G.,’’ Microbiologie Technique’’, 1996, p.43.

Annexe

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Préparation des réactifs

Empois d’amidon

Disposer 1g d’amidon de blé dans 10 mL d’eau distillée froide. Ajouter ensuite 90 mL d’eau

bouillante à la pâte formée en agitant constamment, amener le mélange à ébullition pendant 5mn et

laisser refroidir.

Liqueurs de Fehling

La solution est un mélange de deux solutions :

Solution A : Dissoudre 8.66g de CuSO4, 5H2O dans une eau contenant quelques gouttes d’acide

sulfurique (H2SO4) 0,1N, diluer ensuite la solution à 125 mL.

Solution B : Dissoudre 15g de NaOH et 43,25 g de tartrate de sodium et de potassium dans 50 mL

d’eau. Filtrer puis diluer la solution à 125 mL.

Les deux solutions à volume égal sont mélangées au moment de l’emploi.

Réactif de Bornträger

C’est une solution de dilution d’ammoniac à 10% agitée avec un volume égal d’extrait

étherique à tester.

Réactif de Bouchardat

C’est une solution contenant 2g d’iode et 2g d’iodure de potassium dissous dans 100mL d’eau

distillée.

Réactif de Dragendorff

Dissoudre 5g de carbonate de bismuth et 25g d'iodure de potassium dans 50mL d'eau

distillée, puis mélanger avec 10mL d’HCL concentré et compléter à 100mL avec de l'eau distillée.

Réactif de Lieberman Burchard

5mL d’anhydride acétique et quelques gouttes d’acide sulfurique concentré sont ajoutés à

5mL de la solution à tester. Agiter et laisser la solution reposée pendant 30mn à température

ambiante.

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Réactif de Mayer

Dissoudre 1,35g du chlorure de mercure (HgCl2) et 5g d’iodure de potassium (KI) dans 60mL

d’eau distillée. Ensuite, agiter jusqu’à dissolution et compléter le volume à 100mL.

Réaction de Salkowski

C’est une solution chloroformique additionnée d’un égal volume d’acide sulfurique

concentré.

Réactif de Wagner

Dissoudre 2g d’iodure de potassium (KI) et 6g d’iode (I2) dans 60mL d’eau distillée. Ajuster

le volume total à 100mL.

Réactif de Stiasny

10mL de formol à 30 % et 5 ml d'acide chlorhydrique concentré sont ajoutés à 5mL de la

solution à tester. Le mélange est chauffé au bain-marie pendant 15 min.

Réactif de Bath Smith

A 2 mL d’infusé on ajoute 2 mL d’HCL à 20 %. Le mélange est porté à l’ébullition.

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Figure.1 : Spectre de masse des échantillons de référence de l’extrait 1 des flavonoïdes à 34,601 mn

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Glossaire

Aérobie : se dit des micro-organismes qui ne peuvent se développer qu’en présence d’air ou d’oxygène.

Albumen : tissus de réserve d’une graine enveloppant l’embryon de la plante.

Amas : Assemblage, accumulation, entassement de plusieurs choses.

Amoebicide : substance traitant l'amibiase, qui est une infection parasitaire.

Anaérobie : se dit des micro-organismes qui peuvent vivre sans oxygène.

Analgésique : supprime la douleur.

Anesthésique : qui provoque une privation complète ou partielle de la faculté de sentir.

Angiosperme : sous embranchement de phanérogame qui englobe les plantes à fleurs.

Antibactérien : inhibe et détruit les bactéries.

Anti-diarrhéique : lutte contre les diarrhées.

Antiémétique : qui à la propriété d’arrêter le vomissement.

Antifongique : actif contre les champignons et les levures parasites.

Anti-herpétique : lutte contre l’herpès.

Antihypertenseur : protège contre l’augmentation de la tension vasculaire.

Anti-inflammatoire : qui combat les inflammations.

Antimicrobien : inhibe et détruit les microbes.

Antioxydant : permet aux aliments de résister à l’oxydation et à une détérioration graduelle.

Antipaludique : qui agit sur le paludisme : maladie parasitaire qui se manifeste par des accès de fièvres.

Antiparasitaire : lutte contre les parasites animaux et végétaux.

Antiseptique : détruit les microbes et empêche leur développement.

Antispasmodique : lutte contre les spasmes.

Anti-tumorale : détruit les tumeurs.

Antivirale : toute substance active contre les virus.

Bractée : petite feuille située à la base du pédoncule floral.et qui recouvre la fleur avant son développement

Calice : enveloppe extérieure des fleurs.

Cannelé : rayure profonde de la tige de certaines plantes.

Carpelle : organe femelle d’une fleur, c’est le compartiment dont est constitué l'ovaire.

Cataplasme : compresse humide que l’on applique sur une partie du corps comme agent thérapeutique.

Collenchyme : tissu de soutien des végétaux, constitué de cellulose.

Contusion : lésion produite par un choc sans déchirure de la peau.

Coriace : tenace, flexible et plus ou moins épais comme le cuir.

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Corymbe : inflorescence dans lequel les pédoncules sont de longueur différente et s’élèvent en

divergeant de telle sorte que les fleurs soient sur un même plan.

Cosmopolite : se dit d’un micro-organisme à distribution géographique très vaste et répandue dans divers pays.

Cotylédon : feuille embryonnaire, issue de la graine, qui se développe au-dessus ou sous la surface du sol.

Déhiscence : ouverture spontanée d'organes végétaux clos comme les fruits secs.

Dicotylédones : classe regroupant les plantes dont les graines ont 2 cotylédons. En général, ses

plantes ont des feuilles à nervures ramifiées et des fleurs du type 4 ou 5. Appelée aussi

Magnoliopsida.

Dioïque : terme désignant une plante dont les fleurs mâles et les fleurs femelles se trouvent sur des pieds différents.

Diurétique : substance permet d’augmenter la sécrétion urinaire.

Duodénum : première portion de l’intestin grêle.

Ensemencement : action d’ensemencer : déposer des microbes ou leurs spores sur un milieu de culture approprié.

Etamine : organe mâle de la reproduction chez les végétaux supérieurs ou angiospermes.

Exocarpe : couche externe de la paroi d’un fruit.

Exstipulé : dépourvu de stipule, absence de petite feuille supplémentaire.

Gale : affection contagieuse de la peau.

Goutte : maladie inflammatoire qui affecte particulièrement les articulations.

Grêle : long et mince.

Gynécée : ensemble des carpelles d'une même fleur.

Hémolytique : qui rapport avec l’hémolyse qui provoque la destruction des globules rouges.

Hyperplasie : développement excessif d’un tissu ou d’un organe.

Incubation : développement silencieux dans l’organisme d’un germe qui a pénétré et ne

manifeste pas encore chimiquement sa présence.

Induré : devenu dur, en parlant d'un tissu organique.

Inflorescence : manière dont les fleurs sont disposées dans la plante.

Lèpre : maladie infectieuse de la peau ou du système nerveux due au bacille de Hansen.

Moisissures : noms de petits champignons qui se développent sur les substances qu’ils altèrent.

Monoïque : terme désignant une plante qui porte des fleurs mâle et des fleurs femelles séparées

les unes des autres, mais sur un même pied.

Œdème : gonflement survenant dans les tissus sous-cutanés par suite d’une infiltration de liquide séreux.

Palmatilobée : terme qualifiant les feuilles palmées qui ont des lobes arrondis.

Pathogène : qui peut provoquer une ou des maladies.

Péritriche : se dit des micro-organismes ayant des flagelles implantés tout autour.

Pétale : chacune des parties dont est composée la corolle d’une fleur.

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Pétiole : partie rétrécie de la feuille, qui lui sert de support.

Pleurésie : inflammation de la plèvre, membrane séreuse qui entoure le thorax et les poumons.

Purgatif : qui a la propriété de purger, d’évacuer le contenu de l’intestin.

Saprophyte : se dit des microbes qui se nourrissent de matières mortes et ne nuisent pas à l’organisme.

Sarmenteuse : tige flexible et grimpante, ayant besoin d’appui.

Sépale : chacune des pièces formant le calice d’une fleur.

Suppurer : laisser écouler du liquide jaunâtre qui se forme lors de l’infection d’une plaie.

Ubiquitaire : se dit des microbes qui peuvent être présents dans de très nombreux tissus de l’organisme.

Velue : couvert de poils longs, mou et rapprochés.

Vermifuge : se dit d’un remède qui a la propriété d’expulser les vers intestinaux.

Documents

Pour l’obtention du Diplôme de Magister · De nombreux médicaments renferment des principes actifs extraits des plantes. En effet, environ 40% des médicaments en contiennent,