Pr S.AMIRI

METABOLISME BACTERIEN

I. Définition :

Il est défini comme l'ensemble des transformations chimiques (réactions de Biosynthèse

et de dégradation), qui assurent l'élaboration des constituants bactériens et leur

fonctionnement.

L'étude du métabolisme bactérien permet de définir des caractères d'identification

biochimique qui représentent des critères essentiels dans la classification (ou

Taxonomie) bactérienne.

II. Métabolisme énergétique:

La bactérie produit de l’énergie au cours du catabolisme par le biais de réactions

EXERGONIQUES .Pour éviter toute perte sous forme de chaleur, ces réactions

exergoniques (productrices d’énergie) sont couplées à des réactions dites

ENDERGONIQUES (absorbent l’énergie).

L’énergie est ainsi emmagasinée dans des molécules d’ATP ou immédiatement

consommée dans une réaction qui nécessite de l’ATP..

Le composé organique peut être :

• un hydrate de carbone (surtout le glucose) source la plus importante d’énergie

• un acide aminé

• un acide gras

• un alcane

• une base purique ou pyrimidique

Ces réactions sont intégrées dans 2 types de processus énergétiques :

a. La fermentation

La fermentation a été définie par Pasteur comme la« vie sans air » .

C’est une oxydation biologique au cours de laquelle l’accepteur final d’H2 et d’é est un

composé organique. Les voies fermentaires se déroulent au sein du cytoplasme

bactérien. L’énergie est produite par Phosphorylation au niveau du substrat. .Le bilan

énergétique est réduit

b. La respiration

La respiration est l’ensemble des voies métaboliques au cours desquelles l’oxygène moléculaire

ou des composés oxygénés inorganiques ou ioniques jouent le rôle d’accepteur d’électrons et

d’H2 dans les réactions redox.

Ces voies sont liées à la membrane cytoplasmique de la bactérie. L’énergie est produite par

phosphorylation dite oxydative et libérée par paliers via une chaîne de transfert d’électrons ; Le

bilan énergétique est élevé.

L’acide pyruvique sera transformé en Acétyl coa par décarboxylation oxydative, on a 2 étapes :

- Cycle de Krebs : C’est une succession de réactions d’oxydation et de décarboxylation avec

réduction de NAD. Chaque tour génère 3 NAD (x3) + 1 FAD(x2) +1 ATP→12 ATP

- La chaîne respiratoire :

C’est la chaîne cytochromique de transfert des électrons, à laquelle sont associés des

phosphorylations oxydatives.

Ses composants sont disposés de façon séquentielle en fonction de leur potentiel redox.

Selon l’accepteur final d’électrons et d’H2 , on peut distinguer :

1) Dans la respiration aérobie , l’accepteur final est l’O2

2) Dans la respiration anaérobie , l’accepteur final est un composé inorganique ou

ionique (NO3).

c. Voies du Métabolisme intermédiaire

On distingue 3 principales voies enzymatiques, à localisation cytoplasmique, qui oxydent

le glucose en acide pyruvique, véritable plaque tournante du métabolisme et situé au

carrefour du métabolisme intermédiaire

III. EXPLORATION DU METABOLISME BIOCHIMIQUE:

1. Etude du métabolisme respiratoire

1.1. Rapport des bactéries avec l'oxygène:

A. Étude du type respiratoire

On distingue essentiellement 4 types de bactéries en fonction de leur rapport avec

l'oxygène de l'air :

- aérobie strictes.

- micro aérophiles.

- aéro- anaérobie facultatives.

- anaérobies strictes.

Le milieu d'étude type est de la gélose viande foie (V.F).

- au moment de l'emploi, régénérer le milieu en plaçant les tubes 15 mn au bain-marie

bouillant pour en chasser l'O2.

- refroidir a 45-50 C puis inoculer a laide de pipette pasteur, préalablement trempée

dons une culture en milieu liquide jusque au fond du tube puis remonter en décrivant

des tours de spires très serrés.

-Incuber a 37C pendant 18 à 24h.

.

B. Étude des enzymes respiratoires:

3 enzymes respiratoires sont couramment recherchées

-Oxydase.

-Catalase

-Nitrate réductase

a) recherche de l'oxydase

Les derniers stades de la respiration cellulaire oxydative fait intervenir les cytochromes

dont seul le dernier maillon, le cytochrome oxydase réagit directement avec l'oxygène.

Tous les germes aérobies et aérobies facultatifs possèdent un cytochrome oxydase,

Toutefois sa mise en évidence par la technique utilisée n'est possible que si le germe

possède le cytochrome C et le cytochrome aa3+++.

-l'indicateur employé est la N. dimethyl-para phenylène diamine qui est oxydée et donne

une semi quinine colorée en rouge.

Technique:

Prendre un disque de papier buvard déjà imprégné du réactif ; l'imbiber d'un peu d'eau

physiologique à l'aide d'une pipette pasteur fermée ou de l'anse de platine , prendre un

peu de culture à partir d'une culture en milieu solide, la déposer sur le disque .

Un résultat positif se traduit par une coloration violette.

b) recherche de la catalase

Cette enzyme dégrade l' H2O2. Elle est capable de décomposer l'eau oxygénée selon la

réaction. H2O2 H2O+1/2O2

Technique :

-Déposer une goutte d'eau oxygénée sur une lame

-Prélever dans la zone d'asepsie une colonie à l'anse de platine

-Déposer la colonie dans la goutte d'eau oxygénée.

Si la bactérie possède une catalase, on aura un dégagement d' O2 sous forme de bulle

d'air.

c) recherche de la nitrate réductase

Au cours de ce test, on recherche la production d’une enzyme :la nitrate-réductase par la

bactérie. Cette étude va donc consister à mettre en évidence le métabolite nitrite ou la

disparition des nitrates initiaux.

La réduction des nitrates par la nitrate réductase se traduit par la production de nitrites.

Parfois, certaines bactéries peuvent poursuivre cette réduction , jusqu’à une

dénitrification.

IV. Etude de l'utilisation de diverses sources de carbone:

On utilise un milieu synthétique contenant des sources de carbone et d'azote bien

définie. On ensemence la bactérie à étudier sur ces milieux.

-s'il y a culture bactéries utilise le substrat étudié comme source d'énergie

-s'il y a absence de culture bactéries n'a pas pu synthétiser ses métabolites

essentiels à partir du substrat étudié

Le milieu utilisé est le milieu de citrate de Simmons (source d'azote est le phosphate

d'ammonium et la source de carbone est le citrate de sodium, l'indicateur de coloration

est le bleu de bromothymol, le milieu est vert).

Le milieu doit être ensemencé à partir d'une culture prélève sur gélose.

Lecture:

S'il y a culture, l'acide citrique (triacide) est transformé en diacide par décarboxylation

oxydative ce qui entraîne une élévation du PH et donc virage de l'indicateur dans la zone

de culture.

V. METABOLISME DES GLUCIDES :

a. Étude des différents sucres:

Différents milieux peuvent être utilisés, ils sont additionnés du ou des sucres à étudier

+un indicateur de PH coloré, il existe des milieux :

-liquides: eau peptonée ou bouillon nutritif +sucre +indicateur, ces milieux sont

ensemencés avec quelques gouttes de suspension

-solides, ce sont des milieux dont la composition varie avec les exigences des germes.

L'ensemencement se fait en surface

Lecture: après 18h d'incubation, une réaction positive se traduit par une coloration

jaune et une réaction négative par une coloration rouge( si l'indicateur est du rouge de

phénol).

Milieu mannitol mobilité:

- contient du mannitol, nitrates et du rouge de phénol (le milieu est donc rouge)

- Présenté en culot, Avant d'ensemencer régénérer la gélose, pour en chasser l'oxygéné

qui risque de fausser la lecture de la mobilité, laisser refroidir puis ensemencer par

piqûre central jusqu'au font du tube, Incuber à 37°c pendant 24 h

b. Étude de la voie d'attaque des glucides

Les bactéries attaquent les sucres soit par voies

Oxydative

Fermentaire

Ou les 2 à la fois

Le milieu utilisé: MEVAG qui contient le sucre à étudier + rouge de phénol, le milieu se

présente en culot. Au moment de l'emploi régénérer les deux tubes, laisser refroidir puis

pour chaque souche ensemencer deux tubes solidifiés par piqûre centrale à partir d'un

bouillon

Mettre en évidence le rôle de l'O2 en recouvrant un des deux milieux glucosés avec de la

vaseline stérile fondue. Incuber à 37°c pendant 18-24h.

c. détermination de la voie fermentaire:

La mise en évidence de la voie fermentaire empruntée par un germe est très importante

pour son diagnostic, les deux voies que l'on recherche le plus souvent sont:

-voie des acides mixtes : mise en évidence par le test RM (rouge de méthyle)

-voie butylène-glycol : mise en évidence par la réaction de Voges Proskauer (V.P)

Le milieu utilisé est le milieu de Clark et Lubs qui est ensemencé et incubé à 37° pendant

24h. Après incubation on repartit le milieu dans deux tubes,

Dans le premier tube on ajoute quelque goutte de RM (rouge de Méthyle)

- Dans le 2eme tube on ajoute une goutte d'alpha naphtol (VP1) et 2 gouttes de KOH

(VP2)

d. Etude des enzymes intervenant dans la dégradation des sucres:

L'enzyme la plus couramment recherchée est la Beta-Galactosidase responsable de la

dégradation du lactose

Principe : certaines bactéries"lactose –négatif"- ne possèdent pas toutes les enzymes

nécessaires à la dégradation du lactose et notamment lactose-perméase.

Ces germes sont cependant potentiellement capables d'hydrolyser le lactose ou un

galactoside artificiel Ortho-Nitro-Phényl-Galactopyranoside (ONPG) , l’Ortho-Nitro-

Phénol libéré colore le milieu en jaune.

Technique: une anse pleine de culture bactérienne prélevée sur un milieu lactosé est mise en

suspension dans H2O physiologique.

On ajoute des disque de papier buvard imprégnés de réactif.

On incube à 37°c pendant 24 h

Une réaction +( ONPG + ) : coloration jaune: présence d'une Beta-galactosidase

Une réaction – (ONPG - ) : pas de coloration jaune

e. Milieu de diagnostic rapide

Ce sont des milieux sucrés complexes qui permettent une orientation rapide du

diagnostic, en fournissant plusieurs caractères biochimiques.

La lecture se fait au bout de 24h d'incubation. Ce milieu permet la recherche de 5

caractères:

- fermentation du glucose

- fermentation du lactose saccharose

- production d'H2S due à la réduction du thiosulfate qui donne des sulfures de fer

noir

- production de gaz

*lecture au niveau du culot:

-fermentation du glucose: virage au jaune s'il y a fermentation

- production de gaz: décollement de la gélose

- production d' H2S : noircissement du milieu

* lecture au niveau de la pente

-lactose- saccharose- : pente rouge

- lactose- saccharose+ : pente jaune

KIA: dont la composition est identique à celle du TSI mais il contient que 2 sucres:

glucose, lactose, utilisé pour les germes saccharose +.

VI. METABOLISME DES PROTIDES

1. Etude de la dégradation des acides aminés (a a)

1.1. Recherche de l'uréase, du tryptophane désaminase et tryptophanase:

Le milieu utilisé est le milieu de Ferguson qui contient du tryptophane et rouge de

phénol, le milieu est jaune-orangé. Le milieu est ensemencé richement à l'aide d'une

culture prélevée sur TSI incubé à 37°c pendant 24h

Ce milieu permet la détermination de 3 caractères : Urée, TDA, Indole

- Recherche de l'uréase: Urée amido-hydrolase:

Urée+ H2O CO2+NH3

HN3 provoque l'alcalinisation du milieu

Lecture:

-si le germe produit l'Uréase, le milieu devient alcalin et vire au rouge violacée

- dans le cas contraire, le milieu reste inchangé

- Production d'indole ( Tryptophanase):

Certaines bactéries possédant une tryptophanase, ensemencées en milieu riche en

tryptophane elles dégradent celui-ci en provoquant la formation d'indole,

l'indole formé est mis en évidence par para- dimethyl-aminobenzaldehyde en solution

dans l'alcool amylique, en milieu chlorhydrique (réaction de Kovacs) qui prend en

présence d'indole, une coloration rouge: après addition du réactif apparition d'un

anneau rouge à la surface.

Recherche de la TDA:

Les germes possédant cette enzyme, conduisent par désamination oxydative du

tryptophane, a la formation d'acide pyruvique qui est mis en évidence par coloration

brune qu'il donne avec du perchlorure de fer

- Si couleur rouge brun : réaction +

- Si couleur jaune : réaction -

1.2. Recherche des décarboxylases:

Les bactérie dégradent les ( L. lysine, L. ornithine, Ac glutamique, L.arginine) en

empruntant des voies multiples qui, toutes aboutissent pratiquement à la libération de

NH3 ou d'amine alcalin

Le milieu utilisé est le milieu de Moeller- Falkow qui contient l'acide aminé à étudier,

contient également du glucose et du bromocrézol d'ou la coloration violette du milieu

L’ensemencement ne se fait à partir d'une suspension en eau physiologique à raison de 3

à 4 gouttes

Recouvrir la surface du milieu de quelques gouttes d'huile.

-Dans un 1er temps, les bactéries vont fermenter le glucose, le milieu en s'acidifiant

devient jaune.

-Dans un 2eme temps, si les enzymes bactériennes agissent sur les a.a ,il y aura

formation de substances fortement alcalines qui font virer au violet l'indicateur de PH.

Lecture: coloration violette: réaction +

coloration jaune : réaction -

Il faut toujours faire en parallèle un témoin sans a.a, celui ci doit être jaune après

incubation.

sil ne y'a pas de virage , la bactérie n'a pas cultivé sur ce milieu ou n'a pas utilisé le

glucose, la réaction est sans valeur: ne peut être interprétée

1.3. Recherche des enzymes protéolytiques:

La gélatinase est l'enzyme responsable de l'hydrolyse de la gélatine. Les bactéries qui

sont pourvues liquéfient la gélatine. Plusieurs techniques peuvent être utilisées pour

déceler l'hydrolyse de la gélatine. La plus utilisée est la méthode du film photographique

Principe :

Cette méthode, encore plus simple et plus rapide, consiste à utiliser du film

photographique qui composé d'une couche fine de sels d'argent dans la gélatine

déposée sur un support transparent.

Prendre un film vierge, l'exposer à la lumière et le développer, il est noir. Découper en

languettes qui se conservant indéfiniment.

Technique:

Pour rechercher la gélatine, faire une suspension épaisse laiteuse de bactéries dans 0.5

ml environ d'eau physiologique.

Placer une languette de film dont une partie seulement immergée

Boucher le tube pour éviter l'évaporation et le placer à l'étuve ou au bain-marie à 37°c

Si la culture possède une gélatinase, le support transparent de la part immergée du film

est mis a nu et les sels d'argent tombent au fond du tube.

VII. METABOLISME DES LIPIDES

1. recherche des lipases :

Les lipases sont des enzymes qui hydrolysent les esters d'acide gras à longue chaîne

carbonée. . les esters d'acide gras les plus utilisée pour la mis en évidence de l'existence

des lipases, sont les Tween ( esters de sorbitol et d'acide gras)

Technique: technique de Sierra

L'acide libéré est mis en évidence par précipitation sous forme de sels de calcium

insolubles, ce qui provoque l'opacification du milieu gélosé au tour des colonies

2- recherche des lecitinase:

Les licithinases ou phosphalipases sont des enzymes de dégradation des lécithines .la

lécithine la plus utilisée est celle du jaune d'œuf.

Le milieu utilisé est la gélose nutritive au jaune d'œuf, on ensemence par point, incuber

à 37°c pendant 24h

Une réaction + se traduit par l'opacification du milieu

VIII- NOUVELLES TECHNIQUES D'IDENTIFICATION

1. Les galeries AP

ž Une galerie API (analytical profile index) est un ensemble de petits tubes prêts à l’emploi

permettant l'identification de micro-organismes par la réalisation rapide et facile de

testsbiochimiques miniaturisés.

2. AUTOMATISATION L’automatisation de l’identification bactérienne a concerné

d’abord l’inclusion de tests phénotypiques, biochimiques pour la plupart, dans des

supports miniaturisés, avec lecture et interprétation intégrées. On peut citer le

Vitek ®(bioMérieux), le Phoenix® (BD) et le MicroScan® (Siemens puis Beckman). Bien que

ces automates aient des performances tout à fait acceptables, ils sont limités par des

souches parfois peu réactives et par une base de données reflétant difficilement

l’hétérogénéité de certaines espèces