Prédiction de la structure 3-D des protéines

Swissprot+/- 200.000 séquences

Protein Data Bank+/- 30.000 structures

Analyse de séquence Recherche de fonction Analyse d’hydrophobicité (PO, TM, H amphip.) Prédiction de sites d’interactions Prédiction de sites antigéniques Prédiction de structures secondaires …

Analyse de structure 3D Etude des interactions (3D / 4D) Etude du site actif Docking Dynamique, modifications Etude des interactions avec une membrane Ingénierie des protéines Etude du folding …

Introduction

Détermination expérimentale coûteuseet pas toujours possible…

Détermination expérimentale de la structure d’une protéine

Prédiction de structures 3D

• Modélisation par homologie :

Identification d’une protéine de structure connue de séquence homologue

• Fold recognition ou threading :

Se base également sur la connaissance de structures 3D de protéines. On essaie de déterminer le fold de la protéine.

• Ab initio :

Construction de modèles 3D sur base de la séquence parsimulation des forces qui gouvernent le repliement pour trouver la structure de plus basse énergie.

Principe de la modélisation par homologie

Structures mieux conservées que séquences !

Si homologie entre séquences=> homologie entre structures=> prédiction modèle 3D par homologie possible

templatetarget templatetarget

Si identité > 30% => OKSi 20% < identité < 30 % => + difficile / risquéSi identité < 20% => +++ difficile / impossible

Estimation :

28% des séquences ont au moins 25% ID avec une protéine de structure connue (PDB)

Protéine homologue dans la PDB ???

Principe de la modélisation par homologie

Etapes de la prédiction du modèle 3D

1. Identification d’une protéine de structure connue de séquence homologue (ou plusieurs !)

2. Alignement Target / Template(s)

3. Construction du modèle 3D

4. Optimisation du modèle 3D

5. Validation du modèle 3D

! Étapes 1 et 2 déterminantes !

1. Recherche de séquence(s) homologue(s) dans la PDB

Cfr. cours sur les méthodes d’alignement.

Utilisation d’un algorithme pour chercher des protéines de structure connue qui ont une séquence homologue à notre séquence target et qui pourront ainsi être utilisées comme template.

Alignements

4. Comparaison de séquences : les alignements

= une des premières étapes dans l’analyse des séquences

= comparaison de séquences dans le but de repérer les endroits où se trouvent des régions identiques ou très similaires entre des séquences et d’en déduire celles qui sont significatives et qui correspondent à un sens biologique de celles qui sont observées par hasard.

Séquence1 LRTMPDSYGWPLVGPLSDRLDYFFFQITRAEKNIPPTFGN

Séquence2 IKTMPERYGSEIISPGDEGWLYLYHNIEHFQKYLPIYLGN

Séquence1 LRTMPDSYGWPLVGPLSDRLDYFFFQITRAEKNIPPTFGN *** ** * * * * * **Séquence2 IKTMPERYGSEIISPGDEGWLYLYHNIEHFQKYLPIYLGN

Séquence1 LRTMPDSYGWPLVGPLSDRLDYFFFQITRAEKNIPPTFGN ..***. ** .. * . * . .* . .* .* **Séquence2 IKTMPERYGSEIISPGDEGWLYLYHNIEHFQKYLPIYLGN

% identité = 30% % similarité = 57%

similarité homologie homologie si ancêtre commun homologie mesurée par similarité

Alignements

Objectif :

Révéler des informations importantes sur • la structure, • la fonction• l’évolution

de ma(mes) séquence(s) d’intérêt

Quelqu'un a t-il déjà rencontré ce type de séquences ?

Si oui, je vais pouvoir avoir rapidement accès à toutes ses connaissances !!

Alignements : principes

Principe des alignements

Durant l’évolution,• substitutions de résidus

Subsitution homologue Substitution non homologue

• insertions / délétions de résidus

Séquence1 LRTMPDSYGWPLVGPSDRDLYLFHQITRAEKNIPPTFGNF ..***. ** .. * * * . Séquence2 IKTMPERYGSEIISPGDEKELYLYHNIEHFQKYLPIYLGN

Séquence1 LRTMPDSYGWPLVGPSD-RDLYLFHQITRAEKNIPPTFGNF ..***. ** .. * * ..***.*.* . .* .* **Séquence2 IKTMPERYGSEIISPGDEKELYLYHNIEHFQKYLPIYLGN-

Représente une insertion-délétion (indel ou gap)

=> Calcul d’un score pour évaluer la qualité de l’alignement

Détermination d’un score

Utilisation de matrice de substitution

Calcul d’un scorescore global = la somme des scores élémentaires

Score = seIntroduction de gap (avec pénalité)

• Pénalité pour l’insertion d’un gap (x)

• Pénalité pour l’extension d’un gap (y) (svt x = 10 y)

P = coût global du gap de longueur L

P = x + yL

Score = se - P

Le score élémentaire (se) = la valeur donnée directement dans la matrice

Alignements : principes

Identité

Homologie

*Similarités physico-chimiques

*Matrice d’évolution (probabilité qu’un A.A. soit

muté en un autre après un temps d’évolution

donné) (PAM, Blosum)

*Matrice basée sur la comparaison des

séquences (Gonnet)

Matrices de substitution

Alignements : principes

A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y VA 2R -2 6N 0 0 2D 0 -1 2 4C -2 -4 -4 -5 4Q 0 1 1 2 -5 4E 0 -1 1 3 -5 2 4G 1 -3 0 1 -3 -1 0 5H -1 2 2 1 -3 3 1 -2 6I -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -3 -2 5L -2 -3 -3 -4 -6 -2 -3 -4 -2 2 6K -1 3 1 0 -5 1 0 -2 0 -2 -3 5M -1 0 -2 -3 -5 -1 -2 -3 -2 2 4 0 6F -4 -4 -4 -6 -4 -5 -5 -5 -2 1 2 -5 0 9P 1 0 -1 -1 -3 0 -1 -1 0 -2 -3 -1 -2 -5 6S 1 0 1 0 0 -1 0 1 -1 -1 -3 0 -2 -3 1 3T 1 -1 0 0 -2 -1 0 0 -1 0 -2 0 -1 -2 0 1 3W -6 2 -4 -7 -8 -5 -7 -7 -3 -5 -2 -3 -4 0 -6 -2 -5 17Y -3 -4 -2 -4 0 -4 -4 -5 0 -1 -1 -4 -2 7 -5 -3 -3 0 10V 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -1 -2 4 2 -2 2 -1 -1 -1 0 -6 2 4

The PAM250 scoring matrix

Alignements : principes

Matrices protéiques utilisées• Pam 120• Pam 250• blossum 50• blossum 62• blossum 80• Gonnet matrix

Le choix d'une matrice protéique

Pas de consensus, mais ce qui est généralement reconnu... • Matrices Blosum > matrices Pam• Matrice Blosum62 = la meilleure pour la détection de la majorité des similarités protéiques faibles.• Matrice Blosum45 = la meilleure pour la détection de la majorité des similarités protéiques faibles et longues.

Alignements : principes

Alignements : principe

Alignement global alignement local

!!! ce critère doit être relié

• à la longueur de la similitude

• au nombre d’insertion introduite

Généralement reconnu :

Des séquences protéiques de 100 aa ou plus possédant au moins 25% d’identité entre elle ont certainement un ancêtre commun.

On peut douter d’un alignement s’il nécessite plus d’une insertion en moyenne pour 20 acides aminés.

Alignements : évaluation

Alignements : évaluation

E-value

E = Y Z K e-S

s = score authentiqueY = longueur de la séquenceZ = taille de la banqueK et = constante

E = Probabilité d'observer au hasard  ce score à travers la banque de séquences considérée. Plus la E-value est faible, plus l'alignement est significatif.

E-value conclusion

> 0.01 séquences homologues

1-10 similarité plus lointaine

E-Value Conclusion

 < e-100 match exact (même gène, même espèce)

gènes quasimment identiques 

(allèles, mutations, espèces voisines)

e-50...0.1 relation plus lointaines

> 0.1 séquenes en général inintéressantes

e-100...e-50

Fasta Blast

Pour les programmes d’alignements suivants, on considère que :

Alignements : type

Type d’alignement

• Alignement entre une séquence et une banque

• Fasta

• Blast

• Alignement entre deux séquences = alignement pairé

• SIM

• Alignement entre plusieurs séquences = alignement multiple

• ClustalW

• Match-box

• Dialign 2

2. Alignement des séquences target / template

Si un ou plusieurs template ont été identifiés, il faut générer un alignement entre les séquences target et template.

Questions :

• Quel(s) algorithme(s) utiliser ?• Quels paramètres utiliser ?• Comment juger de la pertinence des résultats ?• Comment améliorer l’alignement ?

• Quel(s) algorithme(s) utiliser ?

• Quels paramètres utiliser ?

• Comment juger de la pertinence des résultats ?

• Comment améliorer l’alignement ?

2. Alignement des séquences target / template

- Clustal, MatchBox,…- comparaisons et combinaisons possibles- alignement structural si plusieurs templates

- en fonction des cas…

- % ID, % homologie, gaps et positions- alignement de résidus particuliers- Homologie HCA- Structures secondaires,…

- cfr. ci-dessus

Construction d’un modèle 3D- séquence Target- structure Template- alignement Target/Template

3. Construction du modèle 3-D

4. Optimisation du modèle 3-D

Optimisation de la géométrie par minimisation énergétique

5. Validation du modèle 3-D

Calcul de paramètres pour juger de la validité du modèle

Confrontation à des données expérimentales

=> Contraintes spatiales

= fonction de densitéde probabilité (pdf)

Contraintes :- basées sur l’alignement- stéréochimiques- utilisateur éventuelles

Modeller

Comment ?

modèle 3D

- séquence Target- structure Template- alignement

Principe de développement de Modeller

Utilisation d’une base de données de protéines de structure connue correspondant à des protéines homologues réparties en familles.

Cette base de donnée sert à déterminer :- les paramètres (caractéristiques) relevants à utiliser lors de la prédiction- comment utiliser ces paramètres

Les paramètres relevants sont déterminés par des méthodes statistiques (sans à priori).

Une fois les paramètres relevants déterminés, la base de données est utilisée pour déterminer les fonctions de densité de probabilité qui décrivent le lien entre les paramètres.

Contraintes basées sur l’alignement

Notion de « caractéristique »

= paramètre= propriété associée à un élément simple ou relation entre plusieurs éléments

= relative à un résidu, à plusieurs résidus, à une protéine, ou à deux séquences

Exemples :

acide aminé, accessibilité au solvant dans la structure, distance entre deux C, résolution de la structure, identité entre séquences,…

Définition de 21 caractéristiques

1 r Amino acid residue type

2 Main-chain dihedral angle

3 Main-chain dihedral angle

4 t Secondary structure class of a residue

5 M Main-chain conformation class of a residue

6 Fractional content of residues in the main-chain conformation class A

7 i Side-chain dihedral angle i, i = 1, 2, 3, 4

8 ci Side-chain dihedral angle i class, i = 1, 2, 3, 4

9 a Residue solvant accessibility

10 a Average accessibility of two residues in one protein

11 s Residue neighbourhood difference between two proteins

12 s Average residue neighbourhood difference between two proteins

13 i Fractional sequence identity between two proteins

14 d C-C distance

15 d Difference between two C-C distances in two proteins

16 h Main-chain N-O distance

17 h Difference between two main-chain N-O distances in two proteins

18 b Average residue Biso (atomic isotropic temperature factor)

19 R Resolution of X-ray analysis

20 g Distance of a residue from a gap in alignement

21 g Average distance of a residue from a gap

Formulation des contraintes ?

Contrainte = fonction (pdf) qui établit une relation

entre différentes caractéristiques

Qu’est-ce qu’une contrainte ?

1. Quantification de l’association entre les caractéristiques

caractéristiques dépendantes ou indépendantes ?

2. Définition d’une fonction mathématique

expression de la contrainte = pdf

Contraintes basées sur l’alignement

Banque de 17 familles de protéines de structure connue= 80 protéines alignées

Table multidimensionnelle des fréquences relativesobservées pour la caractéristique x en fonction des

caractéristiques a, b, c,…

Tests statistiques pour mesurer la dépendancede x par rapport à a, b, c,…

Formulation des contraintes ?

caractéristiques dépendantes ou indépendantes ?

4 types de contraintes sont définies :

- sur les distances C-C- sur les distances O-N (main-chain)- sur la conformation de la chaîne principale- sur la conformation des chaînes latérales

Exemple :

Contrainte sur distance C- C dans Target exprimée sour forme de fonction de densité de probabilité (pdf)…

=> probabilité que dist(C- C) = x dépend de

- distance entre C équivalents dans Template- accessibilité des C équivalents dans Template- homologie de séquence Target/Template- distance moyenne aux gaps dans l’alignement

Contraintes basées sur l’alignement

Résultat :

pdfs des caractéristiques => pdf moléculaire

« Variable Target Function Approach »

pondération des pdfs des caractéristiques au cours de la recherche de la structure de plus grande probabilité

Contraintes locales (en terme de séquence) => Contraintes globales

Comment combiner les contraintes des caractéristiques pour la molécule ?

Evaluation de Modeller

- Choix de la structure Template !

- Qualité de la structure Template !

- Qualité de l’homologie !

- Qualité de l’alignement !

Résidus enfouis mieux prédits que résidus accessibles

Zones de faible homologie moins bien prédites

Swiss Model & Swiss PDB Viewer

Serveur de modélisation par homologie automatisée accessible à l’adresse : http://swissmodel.expasy.org/

ou via Swiss PDB Viewer (Deep View)

Modeller Swiss Model

Modeller :

L’entièreté de la structure de la protéine est modélisée en utilisant des contraintes dérivées des structures templates.

Swiss Model :

La prédiction de la structure de la protéine se base sur un découpage de la protéine en des régions conservées et des régions variables qui sont modélisées séparément.

=> assemblage de fragments basés sur les structures templates.

Swiss Model : méthode

1. Identification de fragments de structure conservée

2. Construction du cœur du modèle :

- Position moyenne des atomes du backbone du cœur des templates avec pondération en fonction de la similarité séquence target / template

- Les régions non conservées (boucles) sont laissées pour plus tard…

Swiss Model : méthode

2. Construction du cœur du modèle 3. Modélisation des boucles :

- recherche de fragments compatibles dans une banque de donnée de boucles (Loop-database)

- reconstruction ab initio pour les boucles manquantes

4. Positionnement des chaînes latérales

On recherche la conformation la plus probable pour chaque chaîne latérale en utilisant :

- les structures homologues

- des banques de rotamères

- des critères énergétiques

Swiss Model : méthode

3. Modélisation des boucles

Swiss Model : méthode

4. Positionnement des chaînes latérales 5. Minimisation énergétique

- régularisation de la géométrie (longueurs de liaisons et angles)

- suppression des conflits stériques

Prédiction de structures 3D

• Modélisation par homologie :

Identification d’une protéine de structure connue de séquence homologue

• Fold recognition ou threading :

Se base également sur la connaissance de structures 3D de protéines. On essaie de déterminer le fold de la protéine.

• Ab initio :

Construction de modèles 3D sur base de la séquence parsimulation des forces qui gouvernent le repliement pour trouver la structure de plus basse énergie.

FOLD=

Type de repliement

Certaines protéines (même non-homologues) adoptent le même

fold.

La PDB regroupe environ 30.000 structures, ce qui fait

environ 4.000 folds.

Fold recognition

1. Identification du template (fold de la protéine)

2. Alignement Target / Template(s)

3. Construction du modèle 3D

4. Optimisation du modèle 3D

5. Validation du modèle 3D

Idem que pour modélisation par homologie

• On impose différents folds à la séquence

• On calcule un score pour mesurer l’adéquation structure séquence

• On optimise l’alignement pour la structure ayant le meilleur score

• On effectue une analyse statistique des résultats

On essaie de prédire le fold compatible avec la séquence de la protéine sans tenir compte de l’homologie de séquence

Méthode :

Validation des structures 3D

Comparaison des modèles prédits

Comparaison au(x) Template(s)

Stéréochimie acceptable ? (Procheck)

- conflits stériques

- longueurs de liaison, angles de valence,…

- carte de Ramachandran

- …

Mesure de l’adéquation entre la structure et la séquence

Confrontation à des résultats expérimentaux

…

Comparaison de structures

3 modèles prédits par Modeller

Stéréochimie (Procheck)

Stéréochimie (Procheck)