Principe de de la résonance plasmonique de surface

Lorsqu'un faisceau de lumière polarisée monochromatique illumine une interface entre deux milieux d'indice de réfraction différent, une partie de la lumière incidente est réfléchie sur l'interface et l'autre partie de la lumière est réfractée à travers la surface.

Plaque de verre

Air

Liquide

Lumière polarisée monochromatique

Lumière réfléchie

Lumière réfractée

Air

Liquide

Lumière polarisée monochromatique

Lumière réfléchie

Selon l'angle d'incidence du faisceau toute la lumière peut être réfléchie. Lorsqu'il n'y a pas de réfraction, une des composantes électromagnétiques de la lumière, l'onde évanescente, se propage perpendiculairement à l'interface sur une distance équivalente à sa longueur d'onde.

Principe (suite)

Onde évanescente

Si une couche fine de métal, riche en électrons libres est déposée à l'interface, ceux-ci entrent en résonance avec les photons du faisceau incident, ce phénomène est appelé résonance plasmonique de surface. Une conséquence énergétique de cette résonance est visible dans le faisceau réfléchi qui, analysé avec une barrette de diodes présente une chute d'intensité à un angle défini. Cet angle d'intensité minimum est l'angle de résonance. Il varie en fonction de l'indice de réfraction du milieu présent dans le champ évanescent.

Principe (suite)

Air

Liquide

Lumière polarisée monochromatique

Lumière réfléchie

Onde évanescente

iPlaque de verre

Film d’or

Barette de diodes

I

Le Biacore a pour fonction de visualiser en temps réel des interactions entre biomolécules non marquées dans un débit continu de tampon.

Principe de fonctionnement du Biacore

Un des réactifs, le ligand, est retenu de manière spécifique sur une interface appelée sensor chip (biocapteur).

L'analyte dilué dans un tampon circule à flux constant à la surface du biocapteur. Les changements de masse induits par l'association ou la dissociation des complexes modifient la réfringence du milieu et décalent la position de l'angle de résonance.L'enregistrement de la variation de l'angle de résonance permet de suivre en temps réel la fixation des molécules injectées sur le biocapteur. Le signal de résonance est exprimé en unités de résonance (RU). L'enregistrement de ce signal s'appelle un sensorgramme.

Le sensorgramme.

Le cycle d’analyse en temps réel

Ligand

Le cycle d’analyse Le cycle d’analyse

Analyte

Le cycle d’analyse Le cycle d’analyse

Phase d’association

Le cycle d’analyse Le cycle d’analyse

Analyte + Ligand Complexe

Phase de dissociation

Le cycle d’analyse Le cycle d’analyse

Tampon

Analyse Mathématique

Le cycle d’analyse Le cycle d’analyse

Analyse cinétique deLa liaison analyte - ligand

Le cycle d’analyse Le cycle d’analyse

Phase de régénération

Agent régénérant

Interactions en Temps Réel par BIACORE

Applications majeuresConstantes d’affinités (KD=10-4 -10-12 M) et cinétiques (ka, kd) Concentration active d’un analyteCartographie épitopiqueValidation de molécules recombinantesDétection de molécules (milieux complexes)Etude paramétriqueMicropurification et récupération

Molécules concernéesprotéines, acides nucléiques, sucres,lipides, petites molécules, drogues, peptidescellules, particules virales...

Nature Biotechnology  21, 71 - 76 (2003)

Rational design of a CD4 mimic that inhibits HIV-1 entry and exposes cryptic neutralization epitopes

Loïc Martin1, François Stricher1, Dorothée Missé2, Francesca Sironi3, Martine Pugnière4, Philippe Barthe5, Rafael Prado-Gotor5, Isabelle Freulon1, Xavier

Magne2, Christian Roumestand5, André Ménez1, Paolo Lusso3, Francisco Veas2 & Claudio Vita1

MiniCD4 protéine mimétique (3kD) faite par synthèsepeptidique à partir d’un fragment de toxine de scorpion donnant les caractéristiques structurales du CD4

Objectifs de l ’étude

Etude des interactions entre gp120 et miniCD4

Démontrer que miniCD4 peut démasquer des épitopes neutralisants de la gp120 rec. et sur la gp120 native

BIACORE

Interaction protéine-virus : HIV

Martin L, Stricher F, Misse D, Sironi F, Pugnière M, Barthe P, Prado-Gotor R,Freulon I, Magne x, Roumestand C,Menez A, Lusso P, Veas F and Vita C. (2003). Nat Biotechnol 21(1): 71-6

STRUCTURE DU VIH

intégrase

enveloppe

RT

gp120

gp41

ARN

P17(matrice)

P24(capside)

P7(nucléocapside)

core

protéase

90 à 120 nm

HIV Lifecycle

Rambaut A. et al. Nat. Rev. Genet. 5:52-61, 2004

Entrée du virus dans la cellule : 1re étape du cycle de réplication virale

Cellules infectées ou exprimant des protéines de l’enveloppe virale

Glycoprotéinesde l’enveloppe

CCR5 ou CXCR4 (corécepteur)

Interaction

entre le complexe trimérique

de l’enveloppe

et le récepteur CD4 modification conformationnelle de la gp120 et de la gp41 augmentation de 100 à 1 000 fois de l’affinité pour le corécepteur

VIH

CD4

Cellules cibles exprimant CD4 et corécepteur

CROI 2003 - D’après E. Hunter, Birmingham, abstract 118, actualisé

11

Les différentes étapes déclenchant la fusion

- D’après E. Hunter, Birmingham, abstract 118, actualisé

Attachement cellulaire

non spécifique

Fixation au récepteur CD4

Initiation de la modificationconformationnelle

de l’enveloppe

Fixation au corécepteur

Fin de la modificationconformationnelle

de l’enveloppe

Formation d’une structureen épingle à cheveux,

hélicoïdale avec rapprochement des membranes

Initiation de la fusion des membranes lipidiques

1. Inhibition de la fixation

au CD4

2. Inhibitionde la fixation

au corécepteur

3. Inhibition de la modificationconformationnellede la gp41 (fusion)

gp120

gp41

CD4

Corécepteur

Étapespossiblesdu blocagede l’entrée

Cellule cible

Virus

22

Structure of HIV-1 gp120/CD4 Complex

CD4

gp120

Blue: glycosylation sites

STRATEGIES ANTI-VIH : bloquer les étapes

Inhibiteurs de la fusion

Inhibiteurs de la RT

Inhibiteurs de l’intégrase

Inhibiteurs de l’assemblage

Analogues nucléosidiquesNon nucléosidiques

Inhibiteurs de la transcriptionARNm

ARN viral

gp120CD4

ADN proviral

ADN intégré

Rétro Transcriptase

protéines

Inhibiteurs de protéaseGC/VIH/99

Synthétiser une mini proteine qui mime CD4 et qui inhibe l’entrée de HIV dans la Cellule

interaction : gp120 sur CD4M33 immobiliségp120 ka kd KD chi2

104(1/M) 10-4(1/s) 10-9(1/M)

HXB2(X4) 4.54+/-0.04 3.70+/-0.02 8.15+/-0.08 1,88

W61D(R5) 5.44+/-0.06 6.7+/-0.03 12.3+/-0.1 0,76

JRFL(R5) 7.28+/-0.09 9.63+/-0.04 0.756+/-0.01 2,88

Les gp120 se lient au CD4M33

Interaction protéine-virus :HIV

Interactions Moléculaires en Temps Réel (M. Pugnière, F. Roquet)CNRS-UMR 5160 site CRLCC Val d’Aurelle

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

-200 0 200 400 600 800 1000

Liaison gp120_HXB2 sur M33 (50 RU)RUR

esp

on

se

sTime

Le CD4M33 induit les changements de conformation de la gp120 HXB2 soluble ou de la gp120 portée par les particules virales nécessaires pour exposer les épitopes du 48D et du 17B.

+ CD4s ou M33

- CD4 ou +M0

gp120WT-CD4 / 48D

Part. virales+CD4 / 48D+M33

Interaction protéine-virus :HIV

--Elles amènent une quantification de l’affinité mais surtout des données cinétiques.-Etude des interactions à plus de deux partenaires-Etude paramétrique de ces interactions-Méthode applicable à grand nombre de molécules etaux interactions complexes-Récupération possible

Conclusions