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Prix Nobel de Chimie Prix Nobel de Chimie 20082008
Découverte et utilisation de la Découverte et utilisation de la Green Fluorescent ProteinGreen Fluorescent Protein Osamu Shimomura, Martin Chalfie, Roger TsienOsamu Shimomura, Martin Chalfie, Roger Tsien
Une petite méduse Une petite méduse verdâtre!verdâtre!
• Aequorea sp.Aequorea sp.• Aequorea sp.Aequorea sp.
• Plus d’eau que dans Plus d’eau que dans une bière! une bière!
• Cellules urticantesCellules urticantes
Osamu ShimomuraOsamu ShimomuraMarine Biological Laboratory, BostonMarine Biological Laboratory, Boston
Etude de la bioluminescence Etude de la bioluminescence d’d’AequoreaAequorea
La bioluminescenceLa bioluminescence
Emission de lumière par des organismes vivantsEmission de lumière par des organismes vivants
Chémoluminescence biologiqueChémoluminescence biologique
Une réaction Une réaction bioluminescentebioluminescente
Luciférase (protéine)
O2
L u c i f é r i n e
N NO
H
NH
OH
HO
N N
OH
NHHOHO
COCO22
Le système luminescent Le système luminescent d’Aequoread’AequoreaShimomura & Johnson, 1960sShimomura & Johnson, 1960s
Head, Inouye, Shimomura. Nature 2000Head, Inouye, Shimomura. Nature 2000
Aequorine:Aequorine:
• Photoprotéine Photoprotéine • CaCa2+2+--dépendantedépendante
Photo : Protein data bankPhoto : Protein data bank
Utilisation de Utilisation de l’aequorinel’aequorine
Brini et al 1999Brini et al 1999
Cinétique du calcium Cinétique du calcium dans des embryonsdans des embryons
La découverte de la La découverte de la GFPGFPOsamu Shimomura,1962Osamu Shimomura,1962
““A protein giving solutions ..... exhibiting a A protein giving solutions ..... exhibiting a very bright, greenish fluorescence in the very bright, greenish fluorescence in the ultraviolet ... has also been isolated from ultraviolet ... has also been isolated from squeezates.” squeezates.” (Shimomura et al. 1962).(Shimomura et al. 1962).
J.Wiedenmann, S. Ivanchenko, F. Oswald, F. Schmitt, C. R!cker,J.Wiedenmann, S. Ivanchenko, F. Oswald, F. Schmitt, C. R!cker,A. Salih, K. D. Spindler, G. U. Nienhaus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 15905.A. Salih, K. D. Spindler, G. U. Nienhaus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 15905.
397- 475 nm397- 475 nm 504 nm504 nm
Le chromophoreLe chromophore
Campbell, 2008. ScholarpediaCampbell, 2008. Scholarpedia
GFP: le vert intenseGFP: le vert intense
Ions calciumIons calcium
A la fois mine....A la fois mine....
et alarme antivol!et alarme antivol!
Le clonage de la Le clonage de la GFPGFP
Douglas Prasher, 1992Douglas Prasher, 1992Woods Hole Oceanographic Woods Hole Oceanographic InstitutionInstitution
La séquence de la GFPLa séquence de la GFP
L’expression de la L’expression de la GFP GFP chez chez CaenorhabditisCaenorhabditisMartin Chalfie, 1994Martin Chalfie, 1994Columbia UniversityColumbia University
Caenorhabditis elegansCaenorhabditis elegans
nématode transparentnématode transparent
1 mm de long, 1031 1 mm de long, 1031 cellulescellules
Prix Nobel de Médecine Prix Nobel de Médecine 20022002Sydney Brenner, John Sydney Brenner, John Sulston, Bob HorvitzSulston, Bob Horvitz
Un travail fondateurUn travail fondateur
Science 1994Science 1994
Formation Formation autocatalytique du autocatalytique du chromophorechromophore
Campbell, 2008. ScholarpediaCampbell, 2008. Scholarpedia
Réaliser des protéines de Réaliser des protéines de fusionfusion
Les avantages de la GFP Les avantages de la GFP comme marqueur comme marqueur cellulairecellulaire
• Non-toxiqueNon-toxique• Absence de cofacteur Absence de cofacteur • StabilitéStabilité• Peu d’interactions avec Peu d’interactions avec constituants cellulaires constituants cellulaires
Des outils pour suivre la Des outils pour suivre la progression d’un cancerprogression d’un cancer
3 semaines3 semaines 5 semaines5 semaines 9 semaines9 semaines
Une nouvelle vision Une nouvelle vision des cellulesdes cellules
Hamamatsu.comHamamatsu.com
Fluorescence Recovery After Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)Photobleaching (FRAP)
Fusion GFP-E-cadherinFusion GFP-E-cadherin
Pre bleachPre bleach 15 sec15 sec 75 sec75 sec 300 sec300 sec
Fluorescence Recovery After Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)Photobleaching (FRAP)
Cliffe et al. 2004Cliffe et al. 2004
Les mutants Les mutants ccoolloorrééss
Roger Tsien, 1996Roger Tsien, 1996University of CaliforniaUniversity of California
Variants colorés de la Variants colorés de la GFPGFP
chromophorchromophoree
chromophorchromophoree
EnvironnemeEnvironnementnt
Chromophores mutants Chromophores mutants
Campbell, 2008. ScholarpediaCampbell, 2008. Scholarpedia
Des variations de Des variations de λλ d’excitation et d’excitation et
d’émissiond’émission
Trugnan et al 2004Trugnan et al 2004
De nombreuses De nombreuses applicationsapplications
Fluorescence Fluorescence Resonance Energy Resonance Energy Transfer (FRET)Transfer (FRET)
FRET: la protéine FRET: la protéine CaméléonCaméléon
Protéine CaméléonProtéine Caméléon
QuickTime™ et undécompresseur codec YUV420
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Hamamatsu.comHamamatsu.com
Marquages multiples Marquages multiples des cellulesdes cellules
Une palette Une palette d’applications d’applications
Les FP chez des organismes Les FP chez des organismes non-bioluminescentsnon-bioluminescents
Une structure similaire Une structure similaire au nidogen-1au nidogen-1
NidogenNidogen
GFPGFP
Hopf et al 2001Hopf et al 2001
Le nidogen-1Le nidogen-1
Hopf et al 2001Hopf et al 2001
Böse et al 2006Böse et al 2006
Une méduse devenue Une méduse devenue princesseprincesse
Révolution en biologie cellulaireRévolution en biologie cellulaire
Une richesse inouïe d’applicationsUne richesse inouïe d’applications
Des perspectives éblouissantes!Des perspectives éblouissantes!
The future is bright!The future is bright!
Chromophores naturelsChromophores naturels
UVUVUVUV UVUVUVUV
GFPGFPGFPGFP
Campbell, 2008. ScholarpediaCampbell, 2008. Scholarpedia