Production d’enzyme polygalacturonase par dessouches microbiennes isolées du lait cru et desolives noires et vertes

Farida Bekhouche, Estelle Bonnin, Abderrahmane Boulahrouf etJean Yves Leveau

Résumé : Quarante souches microbiennes, isolées à partir d’échantillons de lait cru et d’olives noires et vertes, furentcultivées dans le milieu MP5 (« mineral pectin 5 medium ») à 0,5 % de pectine de citron. L’ensemble des souchessynthétisait une polygalacturonase extracellulaire. Rhodotorula sp. ONRh9 (0,44 U�mL–1) et Leuconostoc sp. LLn1(0,16 U�mL–1), possédant une polygalacturonase plus active dans le milieu MP5, furent étudiées dans le milieu MAPG5contenant de l’acide polygalacturonique. Les productions de croissance et de polygalacturonase maximales, obtenuespar ces deux souches, furent observées pour des concentrations en acide polygalacturonique égales à 10 g�L–1 (Rhodo-torula sp. ONRh9) et 5 g�L–1 (Leuconostoc sp. LLn1) et pour des valeurs de pH initiaux équivalents à 6 (Rhodotorulasp. ONRh9) et 5,5 (Leuconostoc sp. LLn1). Les deux souches cultivées en fermenteur dans le milieu MAPG5 donnè-rent les résultats suivants : avec le pH initial contrôlé, Rhodotorula sp. ONRh9 produisait un maximum de cellule (DO) etde polygalacturonase (PG) après 20 h (DO, 3,86; PG, 0,24 U�mL–1) de cultures, et ce niveau fut maintenu jusqu’à lafin de la culture. Leuconostoc sp. LLn1 synthétisa plus de cellules et de polygalacturonase entre 4 h (DO, 1,80; PG,0,17 U�mL–1) et 24 h (DO, 3,90; PG, 0,27 U�mL–1) de culture. Avec le pH initial non contrôlé, les cultures produi-saient des cellules et une polygalacturonase maximales après 20 h (DO, 3,30; PG, 0,26 U�mL–1) pour Rhodotorula sp.ONRh9 et 10 h (DO, 2,84; PG, 0,17 U�mL–1) pour Leuconostoc sp.

Mots clés : Leuconostoc, Rhodotorula, acide polygalacturonique, polygalacturonase, croissance cellulaire.

Abstract: Forty microbial strains isolated from raw milk samples and black and green olives were grown in MP5(mineral pectin 5) medium containing 0.5% lemon pectin. All strains synthesized an extracellular polygalacturonase.Rhodotorula sp. ONRh9 (0.44 U·mL–1) and Leuconostoc sp. LLn1 (0.16 U·mL–1), which had a more active poly-galacturonase in MP5 medium, were studied in MAPG5 medium containing polygalacturonic acid. Highest biomass andpolygalacturonase production by these two strains were observed for polygalacturonic acid concentrations of 10 g·L–1

(Rhodotorula sp. ONRh9) and 5 g·L–1 (Leuconostoc sp. LLn1) and for initial pH values of 6 (Rhodotorula sp. ONRh9)and 5.5 (Leuconostoc sp. LLn1). The two strains grown in fermenters in MAPG5 medium generated the following results:with controlled initial pH, Rhodotorula sp. produced maximum biomass (DO) and polygalacturonase (PG) after 20 h(DO, 3.86; PG, 0.24 U·mL–1) of growth, and this level was sustained until the end of the culture; Leuconostoc sp.LLn1 synthesized more cells and polygalacturonase between 4 h (DO, 1.80; PG, 0.17 U·mL–1) and 24 h (DO, 3.90;PG, 0.27 U·mL–1) of culture. With uncontrolled initial pH, the cultures produced maximum biomass and poly-galacturonase after 20 h (DO, 3.30; PG, 0.26 U·mL–1) for Rhodotorula sp. ONRh9 and 10 h (DO, 2.84; PG, 0.17 U·mL–1)for Leuconostoc sp. LLn1.

Key words: Leuconostoc, Rhodotorula, polygalacturonic acid, polygalacturonase, cell growth.

[Journal translation] Bekhouche et al. 663

Can. J. Microbiol. 52: 658–663 (2006) doi:10.1139/W06-024 © 2006 CNRC Canada

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Reçu le 20 juillet 2005. Révision reçue le 21 février 2006. Accepté le 13 avril 2006. Publié sur le site Web des Presses scientifiquesdu CNRC, à http://rcm.cnrc.ca le 15 juillet 2006.

E. Bonnin. Unité de recherche sur les polysaccharides, leurs organisations et interactions, Institut national de la recherche agronomique(INRA), B.P. 71627, 44316 Nantes CEDEX 3, France.F. Bekhouche1,2 et A. Boulahrouf. Laboratoire de génie microbiologique et applications, Département des sciences de la nature etde la vie, Faculté des sciences, Université de Mentouri, Constantine, Algérie.J.Y. Leveau. Laboratoire de microbiologie industrielle, École nationale supérieure des industries alimentaires (ENSIA), 1, avenuedes Olympiades, F-91744 Massy CEDEX, France.

1. Auteur correspondant (courriel : faridabekhouche@yahoo.fr).2. Adresse actuelle : Institut de nutrition d’alimentation et des technologies agro-alimentaires (I.N.A.T.A.A.), Université deMentouri, Constantine, Algérie.

Introduction

Les polygalacturonases (PG) les plus commercialiséesproviennent généralement des espèces d’Aspergillus (Pashovaet al. 1999; Dinu 2001; Singh et Rao 2002), mais ces espè-ces produisent d’autres activités enzymatiques parfois indé-sirables liées aux polygalacturonases (Pilnik et Rombouts1981). Les PG d’Aspergillus conviennent surtout pour la cla-rification des jus de fruits et de certaines légumes, car le pHoptimum de leur activité est situé dans la gamme de pH deces milieux (entre 3,0 et 5,5) (Thibault et Mercier 1979;Useda et al. 1982), tandis que des produits tels que lespurées végétales possèdent des pH proches de la neutralité(Chesson et Codner 1978). Ce furent les raisons pour les-quelles la PG était étudiée chez d’autres microorganismescomme : Geotrichum lactis et Geotricum candidum (Gues-sous et al. 2000), Saccharomyces cereviciae, Rhodotorula,Cryptococcus (Blanco et al. 1999), Candida (Nakagawa etal. 2000) et Bacillus (Soares et al. 1999).

Les microorganismes producteurs de PG isolés des olivesou de leurs huiles (Kacem et al. 2003) pourraient contribuerà la maturation du fruit pour une meilleure extraction deleurs huiles (Asehraou et al. 1993). Ceux isolés des laits crus(bactéries lactiques) trouveraient un intérêt dans l’industriedes produits laitiers à base de fruits (boissons lactées) oudans la clarification des jus de certains végétaux. Cette pro-priété technologique devrait être prise en compte aussi dansla sélection des souches lactiques utilisées pour les ensilagesou les industries cidricoles (Karam 1995).

Les PG par leur action dépolymérisante ont un effet consi-dérable sur la modification des propriétés physico-chimiquesdes pectines et des pectates. Elles catalysent l’hydrolyse desliaisons α-1,4 glycosidique dans le polymère pectique (pec-tine ou acide polygalacturonique) générant des oligomèresd’acide galacturonique qui sont dosés par l’augmentation dupouvoir réducteur. Cette hydrolyse dépend de plusieurs fac-teurs physico-chimiques (proportion substrat/enzyme, tem-pérature d’incubation et pH) et a une influence sur le taux deproduction et sur l’activité de l’enzyme.

Ce travail avait pour objectif de mettre en évidence la pro-duction extracellulaire d’enzyme PG chez 40 souches micro-biennes, d’étudier les effets du pH et de la concentration enacide polygalacturonique (APG) et les influences du pHinitial contrôlé et non contrôlé sur la production de cellule etde la PG chez deux souches.

Matériels et méthodes

Les souches étudiéesQuarante souches isolées lors d’un précédent travail et

présentant une activité pectinolytique selon la technique deMc Kay (1988), furent retenues dans cette étude. Dix-huitsouches de bactéries lactiques provenaient d’échantillons delait cru de vache et appartenaient aux genres : Lactobacillus(5 souches), Leuconostoc (2 souches), Lactococcus (2 souches),Pediococcus (5 souches) et Streptococcus (4 souches).

Vingt-deux souches étaient isolées à partir d’échantillonsd’olives noires et vertes et étaient représentées par les genres :Bacillus (10 souches), Lactobacillus (2 souches), Leuconostoc(2 souches), Rhodotorula (1 souche), Cryptococcus (1 souche),

Aspergillus (1 souche), Pediococcus (2 souches), Endomyces(1 souche), Candida (1 souche) et Rhizopus (1 souche).

Milieux de cultures

Le milieu de culture MP5 (« mineral pectin 5 medium »)Proposé par Atlas (1995), ce milieu était composé par litre

de : pectine de citron (Degré de méthylation (DM) 72 %)(Sanofi bio-industries, Paris, France) 5 g; Na2HPO4 6 g;KH2PO4 4 g; (NH4)2SO4 2 g; extrait de levure 1 g et de1 mL de chaque élément qui composait la solution minéralesuivante : FeSO4 0,1 %; MgSO4�7H2O 0,1 %; CaCL2�2H2O0,1 %; H3BO3 0,001 %; MnSO4�H2O 0,001 %; ZnSO4�H2O0,007 %; CUSO4�5H2O 0,005 % et MoO3 0,001 %.

Le milieu de culture MAPG5Ce milieu était le milieu MP5 modifié, dans lequel la pectine

fut remplacée par l’APG (Degré d’estérification (DE) 0 %)(Fluka, Paris, France).

Conservation des souchesLes souches pures furent conservées à 4 °C sur les milieux

gélosés suivants : le milieu Man Rogosa et Sharpe « MRS »pour les souches du genre Lactobacillus, la gélose de terzaghi« M17 » pour les souches des genres Leuconostoc, Lacto-coccus, Pediococcus et Streptococcus, le milieu Sabouraudpour les souches des levures et moisissures et la gélose nutri-tive pour les souches du genre Bacillus (Guiraud 1998).

Mise en évidence de l’enzyme polygalacturonase des 40souches

Les 40 souches furent cultivées dans le milieu MP5 utiliséà pH initial 5 et contenait 5 g�L–1 de pectine de citron commesubstrat carboné. Des ballons de capacité de 250 mL chacun etrenfermant 150 mL de milieu MP5 liquide, furent inoculésavec les souches à étudier. Les cultures étaient incubées à 30 °Csous agitation rotative (105 tours�min–1; 1 tour = 2π rad)durant 24 h pour les bactéries et 72 h pour les levures etmoisissures.

Évaluation de la croissance cellulaireLa croissance cellulaire fut évaluée par la mesure de la

densité optique (DO) à 600 nm à l’aide d’un spectrophoto-mètre (Uvikon 860).

Mesure de l’activité polygalacturonaseLe milieu de culture fut centrifugé à 4 °C et à 12 000g

durant 20 min. Le surnageant obtenu subit une dialyse à4 °C dans l’eau déionisée durant 24 h. L’activité fut mesuréeselon les techniques de Nelson (1944) et de Smogyi (1952).Le milieu réactionnel contenait 50 µL de surnageant et450 µL de la solution d’APG (DE 0 %) utilisé à 0,5 % dansdu tampon acétate de sodium (50 mmol�L–1; pH 5) (Aval-lone et al. 2002). Le milieu fut incubé à 40 °C pendant10 min. La réaction fut arrêtée par addition du réactif deSmogyi, chauffée à 100 °C pendant 15 min, et après refroi-dissement, le réactif de Nelson fut ajouté. Un témoin conte-nant l’enzyme dénaturée, au bain-marie bouillant durant15 min, fut utilisé pour chaque échantillon. La densité optiquede chaque échantillon avec son témoin fut lue à 600 nm. Laquantité d’acide galacturonique (Fluka) fut déterminée, par rapport

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à une courbe étalon, dans une gamme de concentration enacide galacturonique comprise entre 0 et 250 µg�mL–1.L’activité enzymatique fut exprimée en unité internationalepar millilitre de milieu réactionnel. Une unité d’activité poly-galacturonase représente la quantité d’enzyme qui libère unemicromole d’acide galacturonique par minute dans les mêmesconditions de pH et de température.

Influence des paramètres de production d’enzyme dessouches Rhodotorula sp. ONRh9 et Leuconostoc sp. LLn1

Influence de la concentration du substrat en acidepolygalacturonique

Les cultures furent réalisées dans des ballons de 250 mLcontenant chacun 150 mL de milieu MAPG5 à pH 5 aveccomme seul substrat carboné l’APG utilisé à différentes con-centrations : 0; 1; 3; 5; 7,5 et 10 g�L–1 (Guessous et al.2000).

Influence du pHDans le même milieu les deux souches furent cultivées à

des pH compris entre 3 et 9 (Blanco et al. 1999; Soares et al.1999; Guessous et al. 2000) et à des concentrations optimalesen APG égales à 10 g�L–1 pour Rhodotorula sp. ONRh9 et5 g�L–1 pour Leuconostoc sp. LLn1.

Culture en fermenteur des deux souchesQuatre cuves d’une capacité de 2 L contenant chacune

850 mL de milieu de culture MAPG5 furent utilisées pourl’étude de la croissance cellulaire et de la production de PGde deux souches. Les milieux de cultures destinés pour lasouche Rhodotorula sp. ONRh9 furent ajustés à pH 6 et ren-fermaient 10 g�L–1 d’APG chacun. Ceux réservés pour lasouche Leuconostoc sp. LLn1 furent ajustés à pH 5,5 etcontenaient 5 g�L–1 d’APG chacun. Le milieu de culture dechaque cuve fut inoculé avec 150 mL de préculture de lasouche correspondante.

Les deux souches furent étudiées dans les conditions deculture avec le pH initial contrôlé et non contrôlé. À pH con-trôlé, le maintient du pH initial des milieux de culture utiliséspour chaque souche fut réalisé avec une solution de NaOH(2 mol�L–1). Les cultures furent incubées à 30 °C sous agita-tion rotative (105 tours�min–1).

Résultats

Production de polygalacturonase et de cellule des 40souches

La plupart des souches, isolées du lait cru, produisaientune faible quantité d’enzyme PG égale à 0,01 U�mL–1. SeulesLactococcus sp. LLc7, Streptococcus sp. LSc2 et Leuconostocsp. LLn1 avaient une PG plus active avec des valeurs respec-tives égales à 0,11; 0,13 et 0,16 U�mL–1. La croissance cellu-laire était peu variable (DO de 0,10 à 1,62) pour l’ensembledes souches excepté pour Streptococcus sp. LSc16 (DO 0,02)et Streptococcus sp. LSc8 (DO 0,05) (tableau 1).

Parmi les souches isolées à partir d’échantillons d’olivesnoires et vertes, Aspergillus sp. ONAs14 (0,48 U�mL–1) etRhodotorula sp. ONRh9 (0,44 U�mL–1) possédaient lesactivités PG les plus élevées, et Candida sp. OVCa4 etEndomyces sp. OVEn2 possédaient les activités enzymati-

ques les plus faibles (0,01 U�mL–1). Chez les souches desgenres Bacillus (0,10 à 0,17 U�mL–1) et Lactobacillus (0,14à 0,15 U�mL–1), la production d’enzyme varia peu, par contrechez les souches des genres Leuconostoc (0,03 à 0,11 U�mL–1)et Pediococcus (0,05 à 0,11 U�mL–1) des différences furentobservées. Toutes les bactéries lactiques, d’échantillons d’olivesnoires et vertes, produisaient des cellules avec des DO

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Souches

Croissance cellulaire(densité optique600 nm)

Activités PG(U�mL–1)

Souches isolées des échantillons de lait cruLactobacillus sp. LLb1 0,14 0,06Lactobacillus sp. LLb6 0,14 0,08Lactobacillus sp. LLb7 0,13 0,02Lactobacillus sp. LLb11 0,10 0,01Lactobacillus sp. LLb15 0,13 0,01Leuconostoc sp. LLn1 0,11 0,16Leuconostoc sp. LLn2 0,10 0,01Lactococcus sp. LLc7 0,13 0,11Lactococcus sp. LLc13 0,12 0,01Pediococcus sp. LP1 0,49 0,01Pediococcus sp. LP2 0,12 0,01Pediococcus sp. LP3 0,16 0,01Pediococcus sp. LP4 1,16 0,06Pediococcus sp. LP8 0,17 0,01Streptococcus sp. LSc1 1,45 0,02Streptococcus sp. LSc2 1,62 0,13Streptococcus sp. LSc8 0,05 0,01Streptococcus sp. LSc16 0,02 0,01

Souches isolées des échantillons d’olives noiresBacillus sp. ONB3 1,45 0,14Bacillus sp. ONB5 1,45 0,18Bacillus sp. ONB6 1,47 0,13Bacillus sp. ONB7 1,37 0,12Bacillus sp. ONB8 1,49 0,11Bacillus sp. ONB11 1,37 0,17Bacillus sp. ONB12 1,47 0,11Bacillus sp. ONB13 1,59 0,12Leuconostoc sp. ONLn1 1,01 0,03Rhodotorula sp. ONRh9 1,41 0,44Cryptococcus sp. ONCr10 1,27 0,11Aspergillus sp. ONAs14 1,43 0,48Rhizopus sp. ONRi8 1,02 0,12

Souches isolées des échantillons d’olives vertesBacillus sp. OVB11 1,55 0,16Bacillus sp. OVB12 1,57 0,10Lactobacillus sp. OVLb6 1,03 0,15Lactobacillus sp. OVLb7 1,03 0,14Leuconostoc sp. OVLn9 1,05 0,11Pediococcus sp. OVP10 1,07 0,11Pediococcus sp. OVP1 1,02 0,05Candida sp. OVCa4 0,65 0,01Endomyces sp. OVEn2 0,75 0,01

Tableau 1. Mise en évidence de la polygalacturonase (PG) dessouches isolées à partir des échantillons de laits crus de vache etdes olives noires et vertes.

similaires (1,01 à 1,07). Par contre des différences de DOfurent constatées chez les souches du genre Bacillus (DO de1,37 à 1,59), chez les levures (DO de 0,65 à 1,41) et lesmoisissures (DO de 1,02 à 1,43) (tableau 1).

Effet de la concentration en acide polygalacturonique etdu pH sur la production de l’enzyme des souchesRhodotorula sp. ONRh9 et Leuconostoc sp. LLn1

Avec Rhodotorula sp. ONRh9, les productions d’enzymeet de cellule étaient optimales pour des concentrations enAPG situées entre 5 et 10 g�L–1 et les valeurs maximales(PG, 0,23 U�mL–1; DO, 2,08) furent obtenues avec 10 g�L–1

(fig. 1a).Avec Leuconostoc sp. LLn1, l’activité enzymatique et la

production de cellules étaient plus élevées pour des concen-trations en APG comprises entre 1 et 5 g�L–1. Le maximumd’enzyme (0,24 U�mL–1) et de cellules (DO 1,47) fut obtenupour une concentration en APG égale à 5 g�L–1 (fig. 1a).

Rhodotorula sp. ONRh9 se développa très favorablementet produisait un maximum d’enzyme dans une large gammede pH compris entre 5 (DO, 1,96; PG, 0,12 U�mL–1) et 7(DO, 1,54; PG, 0,10 U�mL–1) (fig. 1b).

Chez Leuconostoc sp. LLn1, l’activité enzymatiquefut limitée dans la zone de pH de 5,5 (0,13 U�mL–1) à 6(0,12 U�mL–1), alors que la production de cellule fut obtenuedans une large gamme de pH située entre 4,5 (DO 1,36) et6,5 (DO 1,49) (fig. 1b).

Croissance cellulaire et biosynthèse de l’enzyme enfermenteur

Les cinétiques de production de cellule et de PG obtenuesavec Rhodotorula sp. ONRh9 et Leuconostoc sp. LLn1 pré-sentèrent les résultats suivants.

À pH initial contrôlé : avec Rhodotorula sp. ONRh9, lescellules furent produites à partir de 15 h (DO 1,86) de cul-ture et la PG après 18 h (0,20 U�mL–1). Elles augmentaientparallèlement en fonction du temps pour atteindre leur maxi-mum après 20 h (DO, 3,86; PG, 0,24 U�mL–1) et ce niveauétait maintenu jusqu’à la fin de la culture (fig. 2a).

Avec Leuconostoc sp. LLn1, les cellules furent produitesaprès 2 h (DO 1,24) de culture et l’optimum fut obtenu aubout de 24 h (DO 3,90). La souche synthétisa un maximumd’enzyme entre 4 h (0,17 U�mL–1) et 24 h (0,27 U�mL–1) deculture (fig. 2b).

À pH initial non contrôlé : avec Rhodotorula sp. ONRh9,la multiplication cellulaire augmentait proportionnellementen fonction du temps (DO de 0,15 à 2,30) puis diminuaitlégèrement au delà de 22 h de culture; tandis que l’enzymeétait plus active (0,10 U�mL–1) seulement entre 15 h et 24 h(fig. 2a). Avec La souche Leuconostoc sp. LLn1, la productionde cellule augmentait en fonction du temps, comme ce fut lecas pour la souche précédente, et atteignait une DO maximale(2,84) après 10 h de culture. L’activité PG était particulièrementplus intense entre 8 h (0,12 U�mL–1) et 24 h (0,15 U�mL–1)de culture (fig. 2b).

Discussion

Les 40 souches, à activité pectinolytique, étaient répartiesen 12 genres. Leurs cultures dans le milieu liquide MP5 (à5 % de pectine) montra qu’elles possédaient toutes au moins

une certaine activité PG. Parmi les genres de bactérieslactiques isolées du lait cru, toutes les souches des genresLactobacillus et Pediococcus avaient une faible activitéenzymatique. Ce ne fut pas le cas des souches appartenantaux genres Leuconostoc, Lactococcus et Streptococcus. Eneffet, certaines souches du même genre avaient une PG plusactive sur le milieu MP5, alors que d’autres souches possé-daient une faible activité PG. Les bactéries lactiques, isoléesà partir d’olives noires et vertes, avaient une activité PG plusélevée que celle de l’ensemble des souches de mêmes genres

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Fig. 1. Influence de (a) la concentration en acide polygalactur-onique (APG) et (b) du pH sur la biosynthèse de la polygalactur-onase (PG) des souches Rhodotorula sp. ONRh9 et Leuconostocsp. LLn1. Les cultures furent réalisées dans le milieu MAPG5 àpH 5 et avec : 0; 1; 3; 5; 7,5 et 10 g�L–1 en APG. Dans le mêmemilieu, les deux souches furent cultivées avec des pH compris entre3 et 9 et des concentrations optimales en APG égales à 10 g�L–1

pour Rhodotorula sp. ONRh9 et 5 g�L–1 pour Leuconostoc sp.LLn1. Elles furent incubées durant 48 h à 30 °C sous agitationrotative (105 tours�min–1).

isolées du lait cru. La nature végétale (pectine, hémicellu-lose, …) des olives noires et vertes laissait prévoir ces résul-tats. L’activité PG chez les deux souches de Lactobacillusisolées à partir d’échantillons d’olives vertes corrobore celleobtenue par plusieurs auteurs. Sakellaris et al. (1988, 1989),Karam et Belarbi (1995) et Avallone et al. (2002) étudièrentla synthèse extracellulaire et la caractérisation de l’enzymePG chez respectivement Lactobacillus plantarum, Lactoba-cillus casei, Lactobacillus plantarum et Lactobacillus brevisL166. Seul Juven et al. (1985) démontrèrent la production

de PG chez Leuconstoc mesenteroides. Nos résultats confir-ment ceux obtenus par ces auteurs pour Leuconostoc sp.LLn1 et Leuconostoc sp. OVLn9.

L’ensemble des souches du genre Bacillus possédaitune PG active comme l’avaient souligné Chesson et Codner(1978), mais nos résultats étaient plus faibles (0,11 à0,18 U�mL–1) que ceux déterminés par Soares et al. (1999)(2,7 à 4,0 U�mL–1). L’activité enzymatique de la soucheCandida sp. OVa4 était faible, résultat obtenu précédemmentpar Avallone et al. (2002) pour quatre espèces de Candida.Alors que la PG de l’espèce Candida boidinii était mise enévidence par Nakagawa et al. (2000). La souche Aspergillussp. ONAs14 possédait la PG la plus active par comparaisonaux autres souches. Cette espèce était déjà connue pour sonaptitude à produire des enzymes pectinolytiques (Thibault etMercier 1979) et principalement des endo PG (Rexovà-Benkovà 1973; Singh et Rao 2002). Les espèces d’Aspergillussont utilisées actuellement dans les industries agroalimentaires,mais malheureusement n’ont pas le statut GRAS (« gener-ally regarded as safe ») (Pilnik et Rombouts 1981). Notreétude avait montré que la souche Rhodotorula sp. ONRh9possédait une PG très active. Vaughn et al. (1969) isolèrenttrois espèces (Rhodotorula glutinis var. glutinis, Rhodotorulaminuta var. minuta et Rhodotorula rubra), à partir d’olivesvertes conservées dans l’eau salée. Ces espèces sont toutesproductrices d’enzyme PG extracellulaire et étaient la causedu ramollissement des olives durant leurs conservations.Mais des résultats, contraires à ceux obtenus par Vaughn etal. (1969), furent observés par Buzzini et Martini (2002),pour qui seule l’espèce Rhodotorula bacarum avait une acti-vité pectinolytique.

Avec Rhodotorula sp. ONRh9, les productions de bio-masse et de PG étaient proportionnelles à l’augmentation dela concentration en APG. L’activité PG était maximale à10 g�L–1. Comparativement, l’activité optimale de la PGdéterminée par Neurospora crassa (10 g�L–1) était à la mêmeconcentration en APG (Polizeli et al. 1991). Pour Geotrichumcandidum et Aspergillus niger, respectivement, des concen-trations en APG de 7,5 et 15 g�L–1 furent observées (Gues-sous et al. 2000; Maldonado et Strasser de Saad 1998). AvecLeuconostoc sp. LLn1, la production de cellules était favorabledans une large gamme de concentrations en APG utilisées,alors que l’enzyme était beaucoup plus active avec 5 g�L–1

en APG. Les variations du pH, de production de biomasse etde PG chez Rhodotorula sp. ONRh9 et Leuconostoc sp.LLn1 étaient parallèles. Les deux souches ne toléraient pasdes valeurs de pH extrêmes, et l’activité optimale de leur PGétait située dans des zones de pH proches de la neutralité. LepH optimum, égal à 6, pour l’activité enzymatique de Rhodo-torula sp. ONRh9 est le même que celui obtenu par Vaughnet al. (1969) pour les espèces Rhodotorula glutinis var. glutinis,R. minuta var. minuta et R. rubra. Le pH optimum de l’activitéde la PG chez la souche Leuconostoc sp. LLn1, comprisentre 5,5 et 6, était plus élevé que celui obtenu chez Lacto-bacillus brevis (pH 4,2) (Avallone et al. 2002) et Lactobacil-lus plantarum (pH 4,5) (Sakellaris et al. 1988).

Les cultures, en fermenteur, à pH contrôlé et à pH noncontrôlé, montrèrent que l’augmentation de l’activité enzy-matique était liée à la production de cellule et à l’optim-isation des paramètres de culture étudiés. Avec Rhodotorulasp. ONRh9, le contrôle du pH maintenait les niveaux d’enzyme

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Fig. 2. Cultures en fermenteur des souches (a) Rhodotorula sp.ONRh9 et (b) Leuconostoc sp. LLn1. Les milieux de culturesdestinés pour la souche Rhodotorula sp. ONRh9 furent ajustés àpH 6 et renfermaient 10 g�L–1 d’acide polygalacturonique (APG)chacun. Ceux réservés pour la souche Leuconostoc sp. LLn1furent ajustés à pH 5,5 et contenaient 5 g�L–1 d’APG chacun. Lesdeux souches furent étudiées dans les conditions de pH initialescontrôlé et non contrôlé. Elles furent incubées à 30 °C sous agi-tation rotative (105 tours�min–1).

et de production cellulaire à des valeurs proches de leurvaleur optimale. Avec Leuconostoc sp. LLn1, le contrôle dupH augmentait les productions d’enzyme et de cellule pen-dant 20 h de culture. Avec le pH non contrôlé, les produc-tions maximales d’enzyme et de cellules des deux souchesétaient très limitées dans le temps.

Ce travail nous a permis de sélectionner deux souchesprésentant une activité PG marquée. Rhodotorula sp.ONRh9 a été retenue pour sa meilleure aptitude à dégraderl’APG et est déjà reconnue par différents auteurs, et Leuco-nostoc sp. LLn1 a été sélectionnée en raison de son activitéPG inédite.

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