Projet de Fin d’Etudes En vue de l’obtention du diplôme … · l'homme fait appelle aux plusieurs méthodes physiques et chimiques qui ont été ... antimicrobiens ... car ils

UNIVERSITE KASDI MERBAH - OUARGLA

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES

Projet de Fin d’Etudes

En vue de l’obtention du diplôme de

Licence

Domaine : Sciences de la nature et de la vie

Filière : Biologie

Spécialité : Microbiologie fondamentale et appliquée

Thème

Présenté par :

DJEDIAI RANIA.

ZIGHEM AICHA.

Encadreur : Mme SIBOUKEUR AMINA. U.K.M Ouargla.

Examinatrice: Melle

SOUID WAFA. U.K.M Ouargla.

Année universitaire : 2013/2014.

Lisetria monocytogenes: Effet combiné de la nisine et de

conditionnement des aliments

Dédicace :

Je dédie ce modeste travail à :

A mon très cher père, je lui dédie avec fierté ce mémoire qui reflète le fruit de l’éducation et de l’attention qu’il m’a tant réservé, je suis très reconnaissante et j’aurai tant aimé partager la joie de ma réussite

avec lui.

À la plus merveilleuse des mamans, qui ma supportée et sacrifier et m’a aidée dans les pires moments, car tu as toujours cru en moi, je

suis que je suis maintenant ; merci maman.

A mes frères: Doussem, Nizar et Mohammed.

A mes sœurs: Djoumana et Farah.

A mes collègues ainsi que ma binôme Aicha.

A mes copines avec lesquelles j'ai partagé mes moments: hanane, hana, heyeme, ikram.

DJEDIAI RANIA

Dédicace

Je dédie ce mémoire :

A mon chère mari qui m’offre tous ses efforts pour m’aide et m’encourager de continuer

mes études.

A ma chère maman qui n’a jamais cessé de ménager ses sacrifices et privations comme

mère soucieuse de l’avenir de ses enfants.

A mon cher papa qui a su se montrer son encourageant.

A mes frère Zakaria,Youcef , Sabri et Adem .

A mes sœurs Bahria et ses enfants Brahim et Shaima , Djamaa et ses enfants Tadj et

Siradj , Fatima, Radia.

A Daouia,Taher ,mes belles sœurs Zineb , Nawel, Hana, Sara ,Hasna et Khadidja

Jamais de simples mots ne me permettront de vous exprimer mes remerciements.

A mes grandes familles ZIGHEM et DARI , grands et petits.

A mes chères cousines lesquelles j’ai partagé mes bons souvenirs :

Fatiha et Fouzia

A ma binôme Rania ainsi que tous mes collègues

Avant tout nous remercions '' DIEU '' tout puissant de nous

avoir guidées tout au long de nos années d'études et de nos

avoir donné le courage pour réaliser ce travail.

Nous tiens à exprimer nos remerciements les plus distingués:

A notre encadreur : SIBOUKEUR AMINA pour ça bien

vaillance, ses conseils, son aides moral et scientifique, sa

patience et sa disponibilité pendant toute la période de

travail

A notre examinatrice: SOUID WAFA d'avoir accepté

d'examiner se modeste travail.

A tous ceux qui ont contribués de près ou de lion à la

réalisation de se mémoire.

Sommaire

Introduction 1

Partie I: Généralité sur Listeria monocytogenes

1.1.1. Historique 2

1.1.2. Taxonomie 2

1.3. Habitat 3

1.4. Caractères de Listeria monocytogenes 3

1.4.1. Caractères morphologiques 3

1.4.2. Caractères biochimiques 4

1.4.3. Caractères culturaux 4

1.5. Facteur de croissance 4

1.5.1. Température de croissance 4

1.5.2. pH de croissance 4

1.5.3. Activité d'eau et croissance 5

1.5.4. Tolérance aux sels 5

1.6. Pouvoir pathogène 6

1.6.1. Listériose 6

1.6.1.1. Listériose animale 6

1.6.1.2. Listériose humaine 6

1.7. Contamination des produits alimentaires par L.m 6

1.7.1. Sources de contamination des aliments 7

1.7.2. Recherche et dénombrement de L.m dans les denrées alimentaires 8

1.8. Méthodes de préservation des produits alimentaires contre L.m 9

1.8.1. Acide lactique 9

1.8.2. Acide acétique 9

1.8.3. Acide phenylacétique 9

1.8.4. Hautes pressions et irradiation 10

1.8.5. Thermo-résistance 11

1.8.6. Substances antimicrobiennes "bactériocines 11

1.8.6.1. Généralités sur les bactériocines 12

Partie II: Utilisation de la nisine dans le conditionnement des aliments

2.1Conditionnement 14

2.2. Emballage 14

2.3. Conservation des aliments 14

2.3.1. Techniques de conservation par la chaleur 14

2.3.2. Techniques de conservation par froid 15

2.4. Méthodes de conditionnement 15

2.4.1. Mise sous vide 15

2.4.2. Conditionnement sous atmosphère modifiée 15

2.4.3. Emballage actif 15

2.4.3.1. Emballages actifs et les agents antimicrobiens 16

2.5. Nisine 16

2.5.1. Bactéries lactiques productrices de la nisine 16

2.5.2. Généralité sur les bactéries productrices de la nisine 16

2.5.2.1. Biosynthèse de la nisine 17

2.5.2.2. Structures de la nisine 18

2.5.2.3. Spectre d'activité 19

2.5.2.4. Extraction et purification de la nisine 19

2.5.2.5. Purification de la nisine 19

2.6. Effet de la nisine dans les produits alimentaires conditionnés 19

2.7. Mécanisme d’action de la nisine 23

Conclusion 25

Références bibliographiques 26

Liste d'abréviations:

aw Activity Water(Activité d'eau)

BL Bactéries Lactiques

CAM Conditionnement sous Atmosphère Modifiée

CMI Concentration Minimal Inhibitrice

Da Dalton

D Dose

µm Micromètre

G Gramme

HPLC Chromatographie Liquide à Haute Performance

kGy Kilo Gray

Ml Millilitre

Mg Milligramme

MPa Méga Pascal

L.m Listeria monocytogenes

L Litre

TC° Température en degré Celsius

UHT Ultra Haut Température

UI Unité Internationale

Liste des tableaux:

Page Tableau

5 Tableau I : Croissance de Listeria monocytogenes sur milieu Trypticase

(LAPRENT, 1997).

9 Tableau II : Identification de L.m (FEDERIGHI, 2005).

12 Tableau III: Classification des bactériocines des bactéries lactiques

(HENG et TAGG, 2006).

20 Tableau IV : Variation de la sensibilité de quelques souches de Listeria à

la nisine (HUGENHOLTZ et VEER, 1991 in RICHARD, 1996).

Liste des figures

Figure Page

Figure 1 : Vois de contamination des matières premières alimentaires

par Listeria monocytogenes (FEDERIGHI, 2005).

7

Figure 2: Schéma de biosynthèse, de sa régulation et d’immunité de la

souche Productrice pour la nisine (MAKHLOUFI et al, 2011)

18

Figure 3 : Structure de la nisine (MAKHLOUFI et al, 2011) 19

Figure 4: Inibition de L.innocua par la nisine dans la viande de porc

hachée concervée à 6C° sur le milieu Palcam (RICHARD,1996).

21

Figure 5:Inhibition de L. monocytogenes en phase de latence, par

addition à t = 0 des bactériocines seules ou en association nisine-

curvaticine ou nisine-pédiocine (SEBTI et al. ,2002)

22

Figure 6: Formation des pores membranaires par le complexe nisine-

lipide II selon CHATTERJEE et al, (2005).

23

Introduction

1

Introduction

Listeria monocytogenes est une bactérie ubiquitaire qui peut être trouvée dans le sol, les

réseaux hydriques, sur les végétaux ainsi que dans l’environnement industriel des ateliers de

production et de transformation des aliments (Dumas, 2007). Elle est l'espèce la plus

pathogène du genre Listeria, est à l'origine de la listériose une infection grave chez l'homme et

les animaux, d’origine alimentaire affectant essentiellement les personnes immunodéprimées,

les personnes âgées et les femmes enceintes (VIDEAU, 1997).

Toujours on a recherché des méthodes pour conserver les aliments, entre le moment

où les denrées sont capturées, ou récoltées et celui de la consommation. Depuis des siècles,

l'homme fait appelle aux plusieurs méthodes physiques et chimiques qui ont été appliqués sur

les aliments au fur y a mesure. ces procédés font des dégâts à la santé humaine.

Une nouvelle alternative a été étudiée pour éviter la contamination microbienne de

produits alimentaires par des agents antimicrobiens. c'est l'utilisation des agents

antimicrobiens (bactériocines) qui peuvent être incorporés dans la masse lors de la

formulation du produit, ou appliqués en surface sur le produit fini (KIM et al., 2002).

Les emballages actifs antimicrobiens, qui consistent à incorporer ces substances dans

l’emballage, constituent une option innovante. En effet, ils offrent une plus grande efficacité

dans la protection de l’aliment car ils permettent une meilleure stabilité de l’agent

antimicrobien, et assurent le contrôle de son relargage vers l’aliment dans le temps. La

question qui se pose. Quelles sont ces molécules antimicrobiennes généralement utilisées dans

ces emballages et quel est l'effet de ces molécules durant la durée de conditionnement de

l'aliment. Le présent travail a l'objectif de l’étude des caractères généraux de Listeria

monocytogenes, et son action sur les produits alimentaires et l'effet de ces substances

antimicrobiens incorporées dans le bio-emballage sur cette souche pathogène.

Partie I

GENERALITES SUR

Listeria monocytogenes

PARTIE I: Généralités sur Listeria monocytogenes

2

1.2.Historique

La découverte de Listeria monocytogenes est liée à des cas de listérioses

humaines et animales étudiés au début de xxe siècle (RYSER et MARTH, 1999).

En 1918. Dumont et Cotoni isolèrent une bactérie du liquide cephalorachidien

d’un soldat atteint de méningite. Cette bactérie fut conservée et identifiée en 1940

comme étant L.monocytogenes. En 1926. Murray, Web et Swann isolèrent un petit

bacille à Gram positif du sang de lapins atteints d’une mononucléose sangaine et

fournirent une description détaillé du germe qu’ils nommèrent Bacterium

monocytogenes. En outre, le germe a été isolé chez le porc en 1924, chez une espèce

de gerbille africaine en 1927 sous le nom de Listerella hepatolytica et chez le mouton

en 1929. En 1929. Nyfeldt isola une bactérie qu’il nomma Bacterium monocytogenes

hominis du sang de trois malades présentant une mononucléose. Bacterium

monocytogenes et Listérella hepatolytica semblant être le même organisme, le nom de

Listorella hepatolytica fut proposé et conservé jusqu’en 1939. Puis le nom de

Listorella serévélant déjà utilisé pour désigner un champignon le nom de Listeria

monocytogenes fut adopté en 1940, en hommage à Lord Lister, chirurgien analais

promoteur de l’asepsie, et en référence à la mononucléose observée chez les malades.

(FEDERIGHI, 2005).

Le rôle des aliments dans la transmisson de L.m à l’homme a été suspecté des

la fin des années quarante, mais sans pouvoir etre clairement démontré. En 1981 au

Canada, une épidémie de listériose à provoqué 17 décès parmi 41 personnes malades.

Ces personnes avaient consommé une salade de chou cru contaminée par L.m .par sa

fréquence et par les méthodes de typage des souches mis en oeuvere cet épisode à

permis la première démonstration de la transmission du germe par les aliments.

Depuis cette date, de nombreuses épidémies de listériose d’origine alimentaire ont été

décrites dans différents pays de monde. En France, en 2004, la proportion de cas de

listériose humaine due à une origine alimentaire estimée à 99% (FEDERIGHI,

2005).

1.3.Taxonomie

Selon la classification officielle .les Listeria appartiennent à la branche des

clostrdium voisin des genres Brochothrix, Lactobacillus, Staphylococcus,

Streptococcus et Bacillus .appartienne a la famille de listeriaceae, classe des bacilli et

l'ordre des bacillale. Aussi elles appartiennent au groupe 19 concernant les bacilles

réguliers, non sporulées, Gram positive (GUIRAUD et ROSE, 2004).

Actuellement le genre Lisertia comporte six espèces réparties en deux groupes

de parenté génétique, non pathogènes pour l'homme : L.monocytogenes L. innocua,

L. ivanovii (subspecies ,ivanovii et subspecies, londoniensis) L. seeligeri, L.

welshimeri, L. grayi (SEELIGER et JONES, 1986). L.monocytogenes qui fait de

notre étude bibliographique.


3

La Listeria monocytogenes est une anthropo-zoonose (CZUPRYNSKI et al,

2003). Les infections qu'elle provoque peuvent se manifester sous diverses formes

telles que la listériose, la septicémie, l'abcès, l'encéphalite, la méningite, ou les fausses

couches. Par ailleurs, moins de 300 cas sont recensés chaque année (essentiellement

des immuno-déprimés, enfants et femmes enceintes). La listériose se propage par la

consommation d'aliments contaminés. (MENG et al., 1997)

1.3. Habitat

L.m possède les caractères d’une bactérie tellurique. Cette bactérie non

sporulée est capable de résister dans ou à la surface de nombreux supports: sol, plants,

eaux, denrées alimentaires appareillages locaux. Elle peut profiter des matières

organiques en décomposition, se comportant alors en germe saprophyte ou peut

constituer des biofilms sur des surfaces. Cette capacité de survie et d’implantation

multiplie les modalités de contamination des denrées alimentaires d’exposition des

animaux et de l’homme: Chez des espèces animales dont 10 à 30% d’ovins,

caprins,…qui sont parfois des porteurs sains de L.m. Chez l’homme, avec 3 à 5% des

individus qui peuvent hébeiger L.m sans avoir des manifestations chimique. L.m est

aussi capable de survivre et de multiplier dans des conditions propres aux animaux et

à l'homme. En particulier cette bactérie peut survivre dans le tube digestif des

animaux et de l’homme créant ainsi des porteurs a symptomatiques. Elle peut aussi

envahir un hôte, se comportant alors en parasite intracellulaire (GUIRAUD et ROSE,

2004).

1.4. Caractères de Listeria monocytogenes

1.4.1. Caractères morphologiques

Les espèces de L.m se présentent sous la forme de petits bacilles droits

(quelques cellules peuvent être incurvées), de 0,4 à 0,5 µm de diamètre sur 0,5 à 2,5

µm de longueur, aux extrémités arrondies, se présentant de manière isolée ou groupés

en V ou en L ou en palissades ou, parfois, en courtes chaînes. Dans les vieilles

cultures, il est possible d'observer des formes mesurant de 6 à 20 µm de longueur , il

est possible d'observer des formes coccoïdes (0,4 à 0,5 µ m de diamètre sur 0,4 à 0,6

µ m de longueur).Ce sont des bactéries à Gram positif (les cellules prélevées dans de

vieilles cultures retiennent mal la coloration de Gram), non acido-résistantes, non

capsulées, non sporulées, aéro-anaérobies facultatives mais cultivant mieux en

aérobiose et mobiles lorsqu'elles sont cultivées à 20 - 28 °C. Le G+C% des L.m est de

37à39%.La ciliature est de type péritriche avec un nombre de flagelles compris entre

1 et 5 et la mobilité est caractéristique car la bactérie semble tourner sur elle-même

(FEDERIGHI, 2005).

http://www.imgt.org/IMGTeducation/Tutorials/MHC/_FR/Presentation/MHC_listeria.html#9




4

1.4.2. Caractères biochimiques

La caractérisation biochimique de L.m fait appel aux méthodes classiques

d’identification bactérienne: catalase+, oxydase-, ß-hémolyse sur gélose au sang, D-

xylose-, D-mannitol-, L-rhamnose+, Citrate-, _-méthyl-D-mannoside+. Cette bactérie

est privée de nitrate réductase, elle fermente le glucose sans production de gaz, le

catabolisme du glucose emprunte la voie d’Embden-Meyrhof. En anaérobiose, le

produit terminal est l’acide lactique, elle hydrolyse l’esculine, elle ne produit pas

d’indole, ni de H2S. Elle est uréase négatif et non protéolytique (gélatine) phosphatase

alcaline+. L’arabinose, le lactose, le mélézitose, le saccharose et la dextrine sont

tardivement fermentés ou négatifs. La xylose, raffinose, inositol, dulcitol, mannitol,

adonitol ne sont pas fermentés. Listeria monocytogenes donne des résultats positifs en

présence de rouge de méthyle et au test Vges proskauer (JONES, 1986).

1.4.3. Caractères culturaux

L.m est aérobie microaérophile et anaérobie facultative. Elle est mésophile

mais avec un comportement souvent psychrotrophe (DJENANE et al., 2006).

Elle n'est pas exigeante et sa culture obtenue sur les milieux classiques telle que; la

gélose nutritive au sang ou un bouillon nutritif. (KERDOUS et LAMROUS, 2006)

Les colonies de Listeria monocytogenes sur gélose nutritive et après 24 heures

d'incubation se développent sous formes légèrement lisse et convexe, à bords

réguliers translucides et leur diamètres varie de 0.5à1.5 µm, éclairées par une

lumière oblique, les colonies ont une légère coloration bleu vert.

Sur une gélose au sang, on observe une zone d'hémolyse complète autour des

colonies.

Sur un bouillon nutritif, on obtient un trouble modéré homogène. L'addition

aux milieux précités de substances telles que le sang, le sérum, le glucose

(0.5%) permet d'obtenir une culture plus riche.

1.5. Facteur de croissance

1.5.1. Température de croissance

La température optimale de croissance est comprise entre 30 et 37°C. La

bactérie peut même se développer à des températures comprises entre -2°C et +45°C

(AUGUSTIN, 1999).

Par ailleurs, une forte hétérogénéité des taux de croissance a été décrite Plus

généralement, le comportement à de températures inférieures à 0°C, celui-ci est

extrêmement faible (AUGUSTIN, 1999).

1.5.2. pH de croissance

Selon (BERGY, 1986) Listeria monocytogenes peut se développer dans une

gamme de pH variant de (5.6à9.6).son pH optimal est aux alentours de 7 avec une


5

tendance plutôt alcaline. Des études ou néanmoins prouvé L.m commence à se

développé à des pH inferieurs à 5, mais la tolérance à ces pH est plus faible qu'aux pH

basique. La croissance à des pH bas est directement liée à la température. Tableau (I).

(LOU et YOUSSEF, 1997).

Listeria monocytogenes se conserve mieux à température de réfrigération qu'à 31°C

(11 jours avec un pH de 3,6-3,7 à 8°C)

(2 jours avec un pH de 3,6-3,7 à 37°C)

L'inactivation de Listeria monocytogenes varie également avec l'agent

acidifiant : la forme non dissociée des acides faibles est plus bactéricide.

(ANONYME-1, 2005).

Tableau (I) : Croissance de Listeria monocytogenes sur milieu Trypcase

(LAPRENT, 1997)

PH minimal de croissance T° C d'incubation

4.63-4.39 30

4.62-4.39 20

5.05-4.62 10

5.05-4.62 7

5.45-5.23 4

1.5.3. Activité en eau (aw) et croissance

L'aw optimum de Listeria monocytogenes est de 0,97 mais cette bactérie peut

se développer jusqu'à 0,943. Listeria monocytogenes survit 132 jours à 4°C à un aw=

0,83 sur trypticase, soja.Une aw faible (environ 0,90) augmente la résistance de

Listeria monocytogenes à la chaleur. Cette espèce peut survivre sur des emballages

pendant 14 jours de - 0,8°C à 6,6°C (ANONYME-1, 2005).

1.5.4. Tolérance aux sels

Listeria monocytogenes est capable de se développer en présence de 10%

NaCl. Elles peuvent se développer jusqu'à 12% de NaCl. Elle survit 150 jours dans

du NaCl pur. Le temps de survie de cette espèce dans 25% de NaCl augmente quand

la température baisse (24 jours à 22°C, 132 jours à 4°C) (JOHNSON, 1988).


6

1.6. Pouvoir pathogène

1.6.1. Listériose

L.m Souvent décrites comme des bactéries opportunistes infectant de

nombreuses espèces animales et l’homme. Elle peut se comporter en commensal .Elle

doit son nom à la propriété qu’il possède de provoquer chez certains animaux et dans

certaines conditions une monoucléose (VIDEAU, 1987).

1.6.1.1. Listériose animale

La listériose à été signalée chez une cinquantaine d’espèces animales. Elle

revêt trois aspects principaux: Septicémie, Encéphalite, Avortements.

1.6.1.2. Listériose humaine

Chez l’homme les cas de listériose semblent être de plus en plus nombreux. La

contamination n’est généralement pas d’origine directement animale la listériose revêt

des formes diverses: méningites s’associant parfois à un syndrome encéphalitique,

septicopyohemies (surtout chez le nouveau-né) formes localisées plus rarement

rencontrées (otites, conjonctivites). Chez la femme, la listériose peut être à l’origine

d’avortements à répétitions. La contamination du fœtus par voie transplacentaire ou

celle du nouveau né lors de l’accouchement est possible. Les listeria se comporter

comme des germes virulents infectant les personnes âgées et les sujets en bonne santé.

(VIDEAU, 1987).

Listeria monocytogenes a été clairement identifiée comme étant une des

bactéries responsables d’infection d’origine alimentaire. Cependant l’incidence des

infections alimentaires dues à Listeria est faible comparée à celle des infections dues

aux Escherichia coli, Salmonella, Campylobacter. (VIDEAU, 1987)

1.7. Contamination des produits alimentaires par L.m

L’altération microbienne des denrées alimentaires est synonyme d’un

développement microbien croissant responsable de mise hors consommation du

produit à cause des changements sensoriels (couleur, odeur et texture). Listeria

monocytogenes cause des altérations des produits alimentaires dans le domaine de

l’agroalimentaire, il faut savoir que la contamination des produits est souvent très

aléatoire. (VIDEAU, 1987).

Listeria est un germe opportuniste, ce qui explique que la contamination d’un

produit puisse intervenir à tous les stades de sa fabrication, de son conditionnement,

au “stockage”, à la commercialisation et même dans l’assiette du consommateur. Par

leur origine et leur composition, certains aliments sont plus susceptibles que d'autres

de contenir des Listeria monocytogenes, cette bactérie comme l'immense majorité des


7

bactéries dans la nature, ne sont pas en suspension dans des liquides, mais adhérente à

des supports où elle forme des biofilms (PERNI et al., 2005 ; CHAE et al., 2006).

Cette structure où cohabite généralement plusieurs genres bactériens,

modifient la physiologie bactérienne, favorisent les échanges de matériel génétique,

améliore la survie des bactéries face aux stress (applications technologiques diverses),

et augmente les possibilités de contamination des aliments (RYSER et MARTH,

1999).

1.7.1. Source de contamination des aliments

Le portage intestinal asymptomatique de L.m est relativement fréquent aussi

bien chez l'homme que chez les animaux d'élevages. L.monocytogenes est capable de

survivre très longuetemps dans les fèces d'animaux (entre 6 mois et plus de 5 ans)

(RYSER,.et MARTH,1999). Les matières fécales animales ou humaines constituent

donc une source de contamination de l'environnement naturel (sol et eau)

(FEDEGHI.M, 2005) fig.1

Figure 1 : Vois de contamination des matières premières alimentaires par Listeria

monocytogenes (FEDERIGHI, 2005).

viandes

Sol

Fourrage

Ensilages

Produits

végétaux

Air,

poussiers Fèces

Animaux

Homme

Produits de

mer Lait

Eau


8

L.m a été fréquemment isolée de sols, de végétaux cultivés (fourrages,

légumes) ou on décomposition, d'ensilage d'effluent urbain ou d'élevages et des eaux.

Sa capacité de survie peut aller jusqu'à plusieurs années dans les sols ; elle varie en

fonction physico- chimique et l'humidité de sols (RYSER et MARTH, 1999).

1.7.2. Recherche et dénombrement de L.m dans les denrées alimentaires

Les L.m sont généralement en faible nombre dans les denrées alimentaires

donc il est nécessaire d'utiliser des techniques d'enrichissement sélectifs suivi par un

isolement sur des milieux sélectifs. La recherche et le dénombrement de L.m dans les

aliments sont basé sur des normes;

Lait et produits laitiers: ISO.10560.FIL-143A

Toutes denrées ISO-11290-1, NF-08-028-1; NF -V- 08-028.1; NF-V-08-055;

AFNOR DNA-14/2-02/95 Gene-Trak Systems DNA GTS 609; AFNOR

SDP-07/4-09/98 probelia L.m; AFNOR BIO-12/4-02/95 Accuprobe

détection de L.m; AFNOR SDP-07/4-09/98 RAPID' L.m ; AFNOR BIO-

12/3-03/96 Vidas L.m.

Dénombrement de L.m en toutes denrées: ISO-11290-2;NF-V-08-028.2

Enrichissement et isolement (milieux sélectifs):

Selon la méthode de référence NF en ISO 11290-1 qui comprend plusieurs

étapes:

1. A partir d'une prise d'essai de25g enrichissement primaire de la

suspension mère en milieu sélectif liquide de (bouillon Fraser- demi)

pendant 24h à30C°.

2. Puis en faire le premier isolement sur milieux sélectifs solides : gélose

Oxford PALCAM suivi par une incubation 24 - 48h à 30 - 37C°.

3. Enrichissement secondaire sur milieu sélectif liquide ce milieu

contient 2 fois d'agent sélectif que le bouillon primaire, après on va

l'incubé

4. La 2éme isolement sur milieux solide sélectif.

Identification :

Le tableau II Présente les caractères culturaux en bouillons d'enrichissement

et sur gélose sélective qui permettent de suspecter la présence de Listeria dans

l'échantillon analysée et les critères d'identification de L.m .une confirmation de genre

et de l'espèce ensuite entreprise. Après examen des milieux solides sélectifs

d'isolement, 5 colonies typiques ou suspectes chaque boite de milieu sont repiqués

sur gélose non sélective. Des tests d'identification sont ensuite effectués: recherche de

catalase, coloration de Gram, mis en évidence de la mobilité à 25-30C° soit par

examen microscopique des bactéries à l'état frais, soit en milieu-mobilité, mise en

évidence de l'hémolyse sur gélose au sang (FEDERIGHI, 2005).


9

Tableau II : Identification de L.m (FEDERIGHI, 2005).

Etapes

Caractères utilisés pour identification de

L.m

Enrichissement -Noircissement des bouillons (hydrolyse

de l'esculine)

Isolement sur:

Oxford

PALCAM

- colonies grises, luisantes entourées d'un

halo noir (hydrolyse de l'esculine),

incrustées dans la gélose (dépression

central):

- colonies verdâtres luisante entourées

d'un halo noir (hydrolyse de l'esculine) ,

incrustées dans la gélose (dépression

central):

Identification Caractéristiques l L.m:

- hémolyse β sur gélose au sang (zone

claire, étroite d'hémolyse autour des

colonies ou d'une piqure)

- test de Camp +

On peut complétés l'identification de L.m à l'aide d'une galerie d'identification

API Listeria (FEDERIGHI, 2005).

1.8. Méthodes de préservation des produits alimentaires contre Listeria

monocytogenes

1.8.1. L’acide lactique

Produit caractéristique de la fermentation du lactose par les bactéries lactiques

exerce son activité antimicrobienne par une chute du pH de l’environnement mais

aussi par sa forme indissociée qui peut diffuser au travers des membranes et réduire le

pH intracellulaire (HOLZAPFEL et al., 1995).

1.8.2. L’acide acétique

Est le produit caractéristique de la fermentation de l’acide lactique par

certaines bactéries hétérofermentaires .Il peut aussi avoir une origine protéolytique. Il

se caractérise par une constante de dissociation plus importante, ce qui le rend plus

inhibiteur que l’acide lactique (HOLZAPFEL et al., 1995).

1.8.3. L’acide phenylacétique

Est un composé excrété par certaines bactéries lactiques. Sous l’action de

l’acide phenylacétique (1 mg/ml), les cellules de L. monocytogenes s’agrègent et

sécrètent des exopolysaccharides, puis elles s’affaissent et sont lysées. En milieu

liquide, cet acide possède une activité bactéricide sur L. monocytogenes (7 mg/ml)

mais seulement bactériostatique pour la même concentration dans du lait UHT et de la


10

pâte de fromage. Les différentes matrices alimentaires peuvent être à l’origine de la

diminution de l’effet inhibiteur, (MILLEt et al., 2005) ont fabriqué des fromages de

type saint nectaire avec du lait cru préalablement inoculé avec L. monocytogenes. Une

inhibition de Listeria monocytogenes a été mise en évidence dans les pâtes des

fromages pour des pH inférieurs à 5,2 associés à des valeurs de lactates de 14 mg/g

(MARIANI et al., 2007).

1.8.4. Hautes pressions et irradiation

À l'effet des hautes pressions, il apparaît que L. monocytogenes n'est pas un

germe très résistant comparativement à d'autres germes pathogènes. Il faut néanmoins

appliquer 375 Méga Pascal (MPa) pendant 15 minutes pour réduire la population de 5

unités Log à 10-20°C. Des observations similaires ont été faites par différents auteurs,

dont SIMPSON et GILMOUR, (1997) qui ont observé que L. monocytogenes peut

survivre dans des dérivés de viande traités à Ultra Haute Température et à de 375

MPa/30 minutes à une température ambiante par rapport à ce qui a été observé dans

une solution phosphatée (CHEFTEL et CULIOLI, 1997).

Généralement, la résistance à l'irradiation de L. monocytogenes est faible et

une dose de kGy (Kilo Gray) est suffisante pour détruire les cellules de L.

monocytogenes aux2 inoculum habituellement rencontrés dans les aliments

(OSTERHOLM et POTTER, 1997).

La dose de réduction décimale (D10) se situe, suivant la température et la

nature de l'aliment irradié entre 0,25 et 0,77 kGy, avec une moyenne aux environs de

0,56 kGy (MONK et KIM al., 2006).

1.8.5. Thermo-résistance

L.monocytogenes n'est pas considérée comme un germe thermorésistant et est

rapidement détruit à des températures de pasteurisation (BRÉAND et al., 1998).

Toutefois l'effet de divers prétraitements thermiques peut beaucoup influencer sa

thermo tolérance. Pour des bactéries cultivées initialement à 4°C, un préchauffage à

47,5°C pendant 3 heures (PAGAN et al., 1997).

Pourrait lui acquérir une résistance ultérieure à une température de65C°. Ces

résultats qui confirment ceux de LINTON et al., (1990) montrent que la faculté de

préadaptation des L. monocytogenes aux traitements thermiques est réelle. Il serait

donc probable que cette faculté contribue à la survie de L.m dans certains aliments

subissant, au cours du processus de fabrication, un préchauffage avant pasteurisation

(PAGAN et al., 1997).

1.8.6. Substances antimicrobiennes "bactériocines"

Des études récentes ont révélé que les consommateurs considèrent plus sûres

et sains les produits élaborés à partir des ingrédients naturels, en rejetant ceux qui

enregistrent dans leurs étiquettes des additifs synthétiques. Cette situation justifie


11

l’intérêt pour l’identification des nouvelles substances antimicrobiennes capables

d’être utilisées comme des ingrédients alimentaires.

Les bactéries lactiques ont été utilisées depuis plusieurs siècles pour la

conservation des denrées alimentaires. Les risques de Listérioses seront minimes, si la

multiplication n’aurait pas lieu durant la préparation, l’entreposage et éventuellement

au cours de la distribution des aliments. Les bactéries lactiques constituent la

meilleure alternative de préservation naturelle grâce à leur capacité de synthétiser des

métabolites antimicrobiens (LOZANO et al., 2006).

La description et la caractérisation d’un grand nombre de métabolites

antimicrobiens (bactériocines) durant ces dernières années et leur spectre d’activité

étendu contre la flore d’altération et pathogène fait de ses substances d’excellents

candidats pour répondre à l’attente légitime des consommateurs qui exigent des

produits plus naturels, plus sûrs et moins altérables. L’intérêt croissant concernant les

bactériocines est dû à une série de faits l’approbation que certaines bactériocines sont

considérées des substances saines et la reconnaissance que la majorité des maladies

fréquentes sont associées aux toxi-infections microbiennes provoquées lors de

l’ingestion des aliments infectés. (LOZANO et al., 2006).

1.8.6.1. Généralités sur les bactériocines

Déférentes définitions de bactériocines ont été données au cours du temps, et

la définition la plus largement acceptée est celle de KLAENHAMMER, (1988) cet

auteur à été définit les bactériocines comme des protéines ou complexe des protéines

synthétisée par voie ribosomique et douées d'une activité bactéricide ou

bactériostatique contre les espèces proches de la souche productrice (TAGG et al.,

1976).

Elles représentent une large classe de substances antagonistes qui varient selon

le poids moléculaire de leur mode d'action. Elles agissent à très faible concentrations

de l'ordre de nanomol/L (PARADA et al., 2007).

La découverte des bactériocines remonte à 1925 quand GRATIA appela "colicines"

des substances antibactériennes sécrétées par E.coli active contre E.coli V (TAGG et

al., 1976).

La première classification fut élaborée par KLAENHAMMER, (1988). Elle

séparait les bactériocines en 2 groupes selon l'entendue de leur spectre d'activité

d'inhibition des non-lantibiotiques de faible poids moléculaire et de haut poids

moléculaire Les lantibiotiques. Suite au développement des méthodes biochimiques et

génétiques se basant sur la structure et le mode d'action des bactériocines ,des

nouvelles données ; les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont

actuellement réparties en 03 classe tableau III. (HANG et TAGG, 2006).


12

Tableau III: Classification des bactériocines des bactéries lactiques (HENG et

TAGG, 2006).

Sous classes Classes

Contiennent de lanthionine et de β-

méthyl- Lanthionines

Ӏa- molécules linéaires

Ӏb- bactériocines globulaires

Classe Ӏ- lantibiotique

ӀӀa bactériocines apparentées à la

Pédiocines

ӀӀb peptides de types diver

ӀӀc bactériocines composées de

plusieurs

Peptides

Class ӀӀ- peptides non modifié

ӀӀӀa bactériocines bactériolytiques

ӀӀӀb peptides non lytiques

ӀӀӀ

Classe ӀӀӀ- protéines de poids

moléculaire élevé

Partie II

UTILISATION DE LA NISINE

DANS LE CONDITIONEMENT

DES ALIMENTS

PARTIE II: Utilisation de la nisine dans le conditionnement des aliments

14

Entre conditionnement et emballage ; ces deux termes sont parfois utilisés

indifféremment. Ils ne désignent cependant pas exactement la même opération. Il peut donc

être utile de rappeler les définitions données notamment par" le règlement européen n°

854/2004":

2.1. Conditionnement

L’action de placer une denrée alimentaire dans une enveloppe ou dans un contenant

en contact direct avec la denrée concernée; cette enveloppe ou ce contenant (ANONYME-2,

2002).

2.2. Emballage

L’action de placer une ou plusieurs denrées alimentaires conditionnées dans un

deuxième contenant; le contenant lui-même. (ANONYME-2, 2002).

L’emballage ou le conditionnement constitue une étape importante de la

transformation qui facilite la manutention lors du transport, du stockage et au niveau de la

distribution. Il assure une protection adéquate du produit contre les contaminations extérieures

et contre l’humidité de l’air. Il doit être approprié aux produits à emballer (ANONYME-3,

2000).

Les opérations de conditionnement correspondent au nettoyage des emballages, au

dosage au remplissage, à la fermeture, à l'étiquetage et au stockage du produit. Elles se

raisonnent en fonction d'un couple produit emballage et constituent les dernières étapes des

procédés de transformation (ANONYME-3, 2000).

Leur déroulement doit se passer dans des conditions d'hygiène minimales. Les produits

alimentaires sont sensibles aux attaques microbiennes. Ils ont besoin de subir un traitement

pour assurer leur conservation. Ce traitement détruit les micro-organismes contenus dans le

produit, afin d'en prolonger la conservation durant plusieurs jours voire plusieurs mois. Il a

lieu généralement avant le conditionnement. Les opérations de conditionnement qui suivent,

doivent se dérouler dans des conditions d'hygiène strictes (ANONYME-3, 2000).

2.3. Conservation des aliments

Depuis des siècles l'homme a recherché des méthodes pour conserver sa nourriture,

Parmi ces procédés utilisés pour la conservation des aliments on trouve :

2.3.1. Techniques de conservation par la chaleur

Le traitement des aliments par la chaleur (ou traitement thermique) est aujourd’hui la

plus importante technique de conservation de longue durée. Il a pour objectif de détruire ou

d’inhiber totalement ou partiellement les enzymes et les microorganismes, dont la présence ou

la prolifération pourrait altérer la denrée considérée ou la rendre impropre à l’alimentation

humaine (BOUMENDJEL ,2005).


15

2.3.2. Techniques de conservation par froid

Le traitement par le froid permet de ralentir, voire arrêter, la prolifération et l'action de

micro-organismes, et de conserver l'aliment pendant une période plus ou moins longue

(ANONYME-4, 1993).

2.4. Méthodes de conditionnement

2.4.1. Mise sous vide

Appliquée depuis le début du XXème siècle pour la conservation des aliments en l'état,

cette technique est devenue un procédé de cuisson et de conservation qui diffère de

l'appertisation par la nature du conditionnement et la mise sous vide des aliments avant

cuisson : Appertisation : boîte métallique sertie hermétiquement ; Cuisson sous-vide

d'airpoche en plastique alimentaire thermorésistant, scellée hermétiquement après mise sous

vide des aliments. (BOUMENDJEL ,2005).

Après cuisson dans l'emballage et pasteurisation, les germes principaux sont détruits et

la conservation au froid (entre 0°C. et + 4°C.) peut varier d'une semaine à un mois. La plus

grande vigilance doit être observée car ce procédé, mal appliqué, ne détruit pas tous les

germes et certains, parmi les plus dangereux, résistent bien à la chaleur et prolifèrent

rapidement en absence d'air, La manière la plus astucieuse de conserver mieux et plus

longtemps se base sur une simple constatation: une fois mis sous vide, autrement dit dans un

espace sans air, les aliments se détériorent nettement plus lentement

(BOUMENDJEL ,2005).

2.4.2. Conditionnement sous atmosphère modifiée

Le conditionnement sous atmosphère modifiée CAM est une technologie d'emballage

employée couramment en vue de conserver les produits alimentaires frais. Cette technologie

est utilisée pour les viandes et les pates fraiches, les légumes, le pain, les fruits, et les fruits de

mer (BOUMENDJEL ,2005).

Dans un système de conditionnement sous atmosphère modifié, les gaz qui composent

l'intérieur de l'emballage sont remplacés par un gaz unique ou un mélange gazeux. Dans le but

d'accroitre la durée de conservation du produits. Le ratio d'oxygène, nitrogène, de dioxyde ou

de monoxyde de carbone est modifié en fonction du produit alimentaire visé. La conservation

on prolongée des produits et la réduction au niveau des pertes dues à la dégradation des

aliments procurent des avantages économiques considérables à l'industrie de l'alimentation.

La CAM a pour le but de remplacer l'air par des gaz, principalement l'azote et le

dioxyde de carbone agit sur le produit et sur les germes (BOUMENDJEL ,2005).


16

2.4.3. Emballage actif

Est destinés à prolonger la durée de conservation et/ou à maintenir ou améliorer les

conditions des aliments emballés. Ils sont conçus de façon à incorporer délibérément des

constituants qui libèrent ou absorbent des substances dans les denrées alimentaires emballées

ou dans l’environnement des denrées alimentaires (ANONYME -3 ,2000).

2.4.3.1. Emballages actifs et les agents antimicrobiens

Afin de prévenir la contamination microbienne de produits alimentaires, des agents

antimicrobiens peuvent être incorporés dans la masse lors de la formulation du produit ou

appliqués en surface sur le produit fini (KIM et al., 2002). Ces deux types d’opérations ont

une efficacité limitée car elles résultent en une perte rapide de l’activité antimicrobienne. Les

emballages actifs antimicrobiens, qui consistent à incorporer l’agent antimicrobien dans

l’emballage, constituent une option innovante. En effet, ils offrent une plus grande efficacité

dans la protection de l’aliment car ils permettent une meilleure stabilité de l’agent

antimicrobien, et assurent le contrôle de son relargage vers l’aliment dans le temps Les

molécules antimicrobiennes généralement utilisées peuvent être des acides organiques, des

enzymes, des agents chélateurs (PADGETT et al., 1998). Des huiles essentielles ou encore

des bactériocines (JACQUET et al., 1998).

La nisine est la seule bactériocine de bactéries lactiques, utilisée comme bio-ingrédient

dans les aliments depuis 1988.Elle est reconnue par son efficacité vis-à-vis les listeria

monocytogenes. L'efficacité de la nisine est dépendante de la qualité des aliments et est meilleure

dans le cas où la charge des contaminants n'est pas élevée. La nisine a été utilisée pour la première

fois dans un fromage de type Emmental pour empêcher le gonflement par Clostridium butyricum,

et contre la contamination par Clostridium. botulinum des fromages pasteurisés à pâte fondue.

Dans la viande l'utilisation de la nisine est limité en raison de la quantité importante de nisine

requise pour avoir un effet notable sur la durée de vie du produit La faible solubilité, la

distribution non homogène et le manque de stabilité des bactériocines à la surface des viandes

ainsi que l'action des protéases des ferments utilisés ou de la viande peuvent affecter l'efficacité

des bactériocines.

2.5. Nisine

C'est un métabolite primaire. Elle a été découverte dans les années 1920. Elle est

produite par lactococcus lactis spp lactis. En 1988, elle a été reconnue par la Food and Drug

Administration et est utilisée en tant qu'agent de conservation(E234) dans l'industrie

alimentaire (SEBTI et al., 2002). La nisine appartient à la classe Ӏ des bactériocines ou les

lanthionines (KLAENHAMMER, 1993).

2.5.1. Bactéries lactiques productrices des bactériocines:

La production des bactériocines est une propriété très courante chez les bactéries

lactiques (BL), ces bactéries décrites pour la première fois par ORLA JENSEN au début du

XXe siècle (FEDERIGHI, 2005).


17

En spécifique ; les films d’emballages antimicrobiens, concept innovant en emballage

alimentaire, ont été introduits pour répondre à la demande des consommateurs pour une plus

grande sécurité microbiologique (GUIGA, CHOLLET, GALLAND, PEYROL & SEBTI).

2.5.2. Généralité sur la bactérie productrice de la nisine:

On peut définit ces microorganismes comme étant des bactéries à gram positive,

asporulées généralement immobiles se présentant sous forme bacilles ou coques et capables

de fermenter les sucres en acide lactique. Sont généralement mésophiles quelques genre sont

thermotolérantes, ou psychrotolérantes elles se développent à pH 4-4.5, et certain sont actives

à pH 9.6ou3.2 (DELLAGIO et al., 1994).

La classification actuelle des bactéries lactiques fait apparaître 12 genres sont:

Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,

Pediococcus, Oenococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella.

(MCLAUCHLIN et al., 2004).

Les Lactococcus; font partie du groupe des bacteries lactiques, Cinq espèces

composent ce genre ; garwiae, lactis, piscium, plantarum et rafinolactis. Celle qui nous

intéresse particulièrement, de par son production de la nisine est l'espèce lactis.cet espèce est

constituée de 2 sous espèces Lactococcus lactis subsp cemoris et Lactococcus lactis subsp

lactis.

Lactococcus lactis subsp lactis

C'est une bactérie Gram positive, se trouve sous forme de coque à 0.5 μm diamètre

aéro-anaérobie facultative elle disposée en chaine longue sa métabolisme est

homofermentaire, sa température de croissance minimale est inferieur 10° C, optimal est

environ 30°C à PH 9.6, et elle ne tolère pas plus de 6.6% de Nacl (DELLAGLIO, 1994).

2.5.2.1. Biosynthèse de la nisine

Les gènes impliqué dans la biosynthèse sont organisées en clusters dans le locus est

symbolisé par "lan" (ASADUZZMAN et SONOMOT, 2009).Le système génétique

impliqués dans la production de la nisine est retrouvé sur les éléments tanspostable présent sur

le chromosome trois classes de transponsons qui sont responsables la production de la nisine

bien définit chez L.lactis.ssp .Le systéme génétique codant pour la nisine est la plus étudie,

symbolisé par "nis" .Le peptide précurseur est inactif donc entre dans la protection des

souches productrices par les gènes nisI et nisFEG (nisB, nisC) ces gènes codant la cyclase et

la déshydratase; qui impliques les modification post traductionnel des peptides précurseur.

Les gènes responsable de fixation du zinc, qui impliquée dans la formation des ponts thiol est

(nisC). Il ya aussi des enzymes impliquées dans ces modifications. Les peptides précurseurs

sont transportés dans le milieu extracellulaire via un transporteur (nisT) puis hydrolysée par

une protéase (nisP) qui utilise l'énergie pour cette activité, La biosynthèse de la nisine

influencée par déférentes facteurs tels que la température de milieu, pH, salinité (Fig.2)

(MAKHLOUFI et al., 2011).


18

Figure 2: Schéma de biosynthèse, de sa régulation et d’immunité de la souche

Productrice pour la nisine (MAKHLOUFI et al., 2011).

2.5.2.2. Structures de la nisine

C'est un polypeptide de 3488Da de poids moléculaire. Thermostable, composé de 34

acide am inés. (Fig.3).


19

Figure 3 : structure de la nisine (MAKHLOUFI et al., 2011).

Les molécules de la nisine peuvent s'assembler en dimères ou en oligomères de 7000

à14000 Da (KLAENHAMMER, 1993).Elle possède une structure linéaire chargée

positivement (TWOMEY et al., 2002).

La nisine A et Z ont la même spécificité de l'activité antimicrobienne, mais sont

diffères par un acide aminé en position 27 (MC AULIFFE et al., 2001).

2.5.2.3. Spectre d'activité

Parmi toutes les bactériocines, la nisine possède un spectre d’activité très large. Elle

possède une action inhibitrice sur les bactéries à GRAM positif. (MEGHROUS et al., 1999).

2.5.2.4. Extraction et purification de la nisine

L'extraction de la nisine se fait après une centrifugation d'une culture de la souche

productrice dans un bouillon M17, le surnageant est récupère et purifiée par la suite

(SIBOUKEUR et al., 2011).

2.5.2.5. Purification de la nisine

L'activité de la bactériocine n'était pas adsorbée sur une résine de type échangeur

cationique. Sur résine hydrophobe, cette activité était perdue. Il a toutefois été possible

d'adsorber cette activité par chromatographie sur échangeur anionique. Cela a d'abord été

réalisé à pression normale et ensuite à haute pression (par HPLC) cette méthode a été réalisée

par LACHANCE et al., (2000).

2.6. Effet de la nisine dans les produits alimentaires conditionnés

Quand la nisine est incorporée dans un emballage alimentaire, l’efficacité de la nisine

comme agent antimicrobien dépend de plusieurs paramètres : pH, température, teneur en sel et

en matière grasse de l’aliment (JUNG et al., 1992 ; DEAN et al., 1996).

Ces paramètres conditionnent à la fois la solubilité de la nisine, sa bioactivité, sa

stabilité, sa désorption et sa diffusion dans la matrice alimentaire.


20

Selon les références consultées, seulement quelques études ont abordé la diffusion de

la nisine dans des matrices alimentaires (SEBTI et al., 2004 ; RIPOCHE et al., 2006), mais

aucune ne s’est intéressée au phénomène de désorption de celle-ci sur des films d’emballage.

Parmi ces travaux consultés utilisant la nisine pour la conservation des aliments on

cite les travaux de :

RICHARD, (1996) a constaté une différence considérable dans les estimations de la

concentration minimal inhibitrice (CMI) selon la souche et surtout, selon le milieu de

culture utilisé pour la déterminer. Selon cet auteur, si l'on prend en compte une

production maximale de nisine de 2 000 UI/ml dans un milieu approprié et des

conditions optimales de culture d'une souche de lactocoques productrice de nisine, la

CMI pour la souche de Listeria la plus résistante ne peut être atteinte dans un aliment

que par addition de la nisine purifiée ou d'une culture très concentrée de la souche

productrice (TableauIV). Dans Une publication plus récente montre que la CMI de

nisine vis-à-vis de L monocytogenes est considérablement plus faibles que dans le

tableau précédent, soit de 8 à80 UI/ml. Ces divergences peuvent être attribuées aux

conditions de détermination de la CMI, en particulier, au milieu de culture utilisé

(HUGENHOLTZ et VEER, 1991 in RICHARD, 1996).

Tableau IV : Variation de la sensibilité de quelques souches de Listeria à la nisine

(HUGENHOLTZ et VEER, 1991 in RICHARD, 1996).

GUIGA, CHOLLET, GALLAND, PEYROL, PANTIEZ et SEBTI s’intéressent à

l’étude de l’étape de désorption de la nisine à partir d’un film de

polyéthylène/polyamide/polyéthylène activé par une solution filmogène

d’hydroxypropylméthylcellulose contenant de la nisine, tout en s’attachant à vérifier

que cette activation ne modifie pas les propriétés initiales du film.

Premièrement Ils ont préparés le film puis donner les caractéristiques de ce dernier,et

finalement étudier la désorption de la nisine.

Comme conclusion ce travail a permis de démontrer que les films activés par

enduction d’une solution de HPMC/nisine présentent une activité antimicrobienne

significative contre Micrococcus luteus. L’activation de ces films n’affecte ni leur résistance

mécanique, ni leur sensibilité à l’eau, ni leur transparence. L’étude et la modélisation de la


21

désorption de la nisine a également permis de démontrer que le relargage de cette

bactériocine à partir des films activés dépendait à la fois de la force ionique de la solution de

désorption et de la température d’entreposage mais pas du pH. Cependant, pour mieux

approcher les conditions d’applications alimentaires, le pouvoir inhibiteur des films devra être

vérifié sur des souches pathogènes comme Listeria monocytogenes et validé sur des aliments

liquides réels, ainsi que dans les vraies conditions de stockage de l’industrie agro-alimentaire.

RICHARD, (1996) montre, comme exemple de cette démarche, l'activité de la nisine

vis-à-vis d'une souche de Listeria ajoutée à de la viande fraîche hachée et conservée à

basse température. Les concentrations indiquées sont celles de la phase interstitielle,

c'est-à-dire de la solution de bactériocine en contact avec la surface de la viande avant

hachage. On observe, par rapport au témoin sans nisine, une perte de viabilité des

bactéries cibles qui se poursuit pendant 2 jours, suivie d'une croissance des cellules

survivantes à la même vitesse que les bactéries dans la viande témoin. On notera que 1

000 nisine, soit deux fois la CMI de cette UI/ml de souche déterminée au laboratoire

n'entraîne qu'une diminution modeste de la souche cible. Il faudrait plus de 5 000

UI/ml pour obtenir 3 unités de log de réduction de cette bactérie, soit une destruction

de 99,9 % de la population initiale(Fig.4) (RICHARD, 1996).

Figure 4:Inibition de L.innocua par la nisine dans la viande de porc hachée conservée à 6C°

sur le milieu Palcam (RICHARD,1996).

Dans les références consultées on remarque que l'utilisation de la nisine pour la

conservation des aliments est généralement combinée avec d'autres substances.

SEBTI et al. (2002) ont recherché l'effet combiné éventuel de la nisine et de deux

bactériocines (la pédiocine et la curvaticine).L’effet des deux bactériocines sur les

phases de latence de L. monocytogenes est présenté dans la figure 5.


22

Figure 5:Inhibition de L. monocytogenes en phase de latence, par addition à t = 0 des

bactériocines seules ou en association nisine-curvaticine ou nisine-pédiocine (SEBTI et al.

,2002)

Aux concentrations testées, les temps de latence après addition de bactériocines sont

augmentés d’un facteur 4, 5 et 10 respectivement pour la pédiocine, la nisine, et pour la

curvaticine. L’association des bactériocines permet quant à elle d’améliorer les temps

d’inhibition d’un facteur 6 et 13 pour respectivement la nisine-pédiocine et la nisine

curvaticine. La curvaticine apparaît être la plus efficace en terme d’amélioration des temps

d’inhibition, avec un retard de l’ordre de 2 jours de la croissance bactérienne, lorsque la

curvaticine est associée à la nisine. Selon cet auteur, en accord avec plusieurs études

bibliographiques, l’association de bactériocines a toujours montré un effet de synergie qui

améliore l’activité anti-bactérienne des bactériocines sur L. monocytogenes (HANLIN et al.,

1993, KATLA et al., 2001).

Pour la conservation des aliments notamment les viandes, d’autres travaux ont cité

l’action de d’autre bactériocines. On cite le travail de :

DJENANE et al., (2005) .ce chercheur et ces collaborateurs ont inoculé des steaks

avec deux souches de bactéries lactiques (Lactobacillus sakei CTC 372

(bacteriocinogenique: Sakacine T) et Lactobacillus CTC 711 (non caracterisee).

Les steaks ont été ensuite conditionnés sous atmosphère modifié. Les deux souches

lactiques ont provoqué une inhibition de 67,3% sur L. monocytogenes cultivée dans un milieu


23

de culture à 25ºC. Probablement, les souches lactiques ont atteint une phase logarithmique

maximum à cette température et, par conséquent, une production suffisante de bactériocine

qui pourrait être la cause principale de l’inhibition de Listeria monocytogenes. Néanmoins,

même à 3 et 8ºC l’inhibition de L. monocytogenes a été signifiante. Ce qui explique l'avantage

que peuvent avoir ces deux souches dans la préservation des viandes réfrigérées, notamment

en conditions d’entreposage à des températures abusives (BREDHOLT et al., 2001).

2.7. Mécanisme d’action de la nisine

La perméabilisation de la membrane cytoplasmique par formation de pores conduit à

la mort de la bactérie cible après dissipation d’ions intracellulaires. L’exemple de mécanisme

d’action le mieux connu est celui de la nisine et de différents lantibiotiques de type A I

(subtiline et épidermine) et de type A II (lacticine 481, nukacine -1) .Un premier contact est

initié entre la nisine et la membrane cytoplasmique de la bactérie cible via des interactions

électrostatiques (RUHR et SAHL, 1985). Chargée positivement, la région C terminale de la

nisine interagit avec la membrane cytoplasmique de la bactérie cible fortement anionique.

Les boucles formant la lanthionine et la 3’-méthyllanthionine situées au niveau de la région

N-terminale interagissent avec le disaccharide-pyrophosphate du lipide II précurseur de la

biosynthèse de la paroi bactérienne (fig.6) (ASADUZZAMAN et al., 2006).

Figure 6: Formation des pores membranaires par le complexe nisine-lipide II selon

CHATTERJEE et al., (2005).

D'autre part l’inactivation d’une enzyme nécessaire à la biosynthèse de la paroi

bactérienne. L.m est composée d’une paroi, en contact direct avec le milieu extérieur, formée


24

de peptidoglycanes, d’un espace périplasmique et d’une membrane cytoplasmique. Le

peptidoglycane est composé d’une partie glucidique formé d'un polymère d’unités

disaccharidique d'acide N-acétylmuramique (MurNAc) lié en β à un résidu de N-

acétylglucosamine (GlcNAc). Les polysaccharides sont liés entre eux au niveau du MurNac

par des liaisons pentapeptidiques dont la séquence varie en fonction des bactéries

(PRESCOTT et al., 2003).

Chez L. m la séquence peptidique de ces chaînons est : L-Ala, D-Glu, L-Lys, D-Ala,

D-Ala. Contrairement aux bactéries à Gram positif, le peptidoglycane chez les bactéries à

Gram négatif est plus fin et enchâssé entre deux membranes plasmiques : la membrane

externe composée de phospholipides, de nombreuses protéines intrinsèques, notamment les

protéines de transport appelées porines, ainsi qu’un composé non protéique appelé

lipopolysaccharide . Les bactéries à Gram négatif telles que Escherichia coli (E. coli),

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Salmonella typhimurium et Serratia marcescens

sont résistantes aux lantibiotiques et en particulier à la nisine Cette résistance a été attribuée à

la membrane externe riche en lipopolysaccharide qui empêche les bactériocines d’accéder

pentapeptide du lipide II présent dans la membrane cytoplasmique (CHATTERJEE et al.,

2005) .

Conclusion

24

Conclusion

Un bioemballage est un emballage prolongeant la durée de vie des produits, ou

donnant l'alarme en cas d'altération des denrées. C'est l'un des meilleures procédées

de conservation des aliments. Il est utilisé pour assurer la sécurité et la qualité de ces

denrées contre les germes pathogènes tels que L.m.

Les substances antimicrobiennes naturelles incorporées dans cet emballage sont

nombreux, parmi ces derniers, le lysozyme ou l’acide lactique ou des bactériocines

notamment la nisine. Cette substance est utilisée depuis des années comme

conservateur alimentaire dans plusieurs pays. Plus récemment autre bactériocines (la

pédiocine) a également été commercialisée comme conservateur alimentaire, qui

contrôle la contamination microbienne d’un aliment, améliore son stockage, élimine

les pathogènes indésirables et retarde la prolifération de Listeria monocytogenes.

L'étude portant sur la nisine est toujours en cours afin de mieux comprendre son

structure et son mode d’action pour élargir leurs applications.

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RESUME Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène responsable de la listériose; C’est un micro organisme très

fréquent rencontré dans notre environnement et aussi dans nos aliments.

C’est pour cela que l’industrie agroalimentaire utilise plusieurs méthodes de conditionnement afin de conserver les

produits alimentaires de l'altération par des microorganismes pathogènes notamment L.m.

Parmi ces méthodes de conservation on trouve le conditionnement par bio-emballage ou bien l’emballage actif.

Dans ce procédé, on utilise un emballage associé à des molécules antimicrobiennes excrétées par des bactéries

lactiques. Parmi ces substances antimicrobiennes on trouve, les acides organiques et les bactériocines notamment la

nisine produite par une bactérie lactique appartenant à l'espèce Lactococcus lactis .Cette bactériocine est utilisée

pour constituer la biopréservation (bioprotection) des aliments contre L.m.

MOTS CLES: Listeria monocytogenes , conditionnement , bio-emballage, bactériocines, Lactococcus lactis,

nisine.

Abstract

Listeria monocytogenes is a pathogenic bacterium responsible for listeriosis; this is a very

common microorganism found in our environment and also in our foods.

This is why the food industry uses several methods of packaging to keep food from spoilage by

micro-organisms including L.m.

Among these conservation methods found conditioning bio-packaging or active packaging. In

this method, a package associated with antimicrobial molecules excreted by lactic acid bacteria

is used. Among these there are antimicrobial substances, organic acids and (bacteriocins) such as

(nisin) produced by a lactic acid bacteria belonging to the species Lactococcus lactis. This

bacteriocine is used to form the biopreservation (bioprotection) of foods against L.m.

KEYWORDS: Listeria monocytogenes, packaging, bio-packaging, bacteriocins, Lactococcus

lactis, nisin.

ممخص من أهم األنواع البكترية المجهرية المسببة لألمراض والمسؤولة Listeria monocytogenesتعتبر المستوحدات اللستيرية

. و التي تتواجد بشكل واسع في المحيط و خاصة في األغذية Listérioseعن داء المستريات ولهذا يستخدم في الصناعات الغذائية العديد من أساليب التعبئة و التغميف لمحفاظ عمى المواد الغذائية من التمف الناتج عن

.هذه الكائنات الدقيقةو .bioemballege اوالتغميف الحيوي bioemballage actif التغميف الحيوي النشط ;ومن بين هذه الطرق المستعممة

المرتبط بإضافة جزيئات مضادة لمميكروبات و المفرزة عن طريق البكتريا الالكتيكية والتي من بينها االحماض العضوية و Lactococcus و المنتجة من طرف البكتريا الالكتيكيةNisine))نوع نيزين ( (bactériocinesالمضادات الميكروبية

lactis ssp والذي يستعمل في الحماية البيولوجية لالغذية و خاصة ضد Listeria monocytogenes. Lactococcus ، التعبئة، التغميف الحيوي النشط، المضاد الميكروبي،:Listeria monocytogenesالكممات المفتاحية

lactis النيزين،.

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Projet de Fin d’Etudes En vue de l’obtention du diplôme … · l'homme fait appelle aux plusieurs méthodes physiques et chimiques qui ont été ... antimicrobiens ... car ils