Projet de recherches:Projet de recherches:

Détermination du mécanisme Détermination du mécanisme catalytique d’une enzymecatalytique d’une enzyme

bi-fonctionnelle, l’aminopeptidase Bbi-fonctionnelle, l’aminopeptidase B

Biogenèse des Signaux PeptidiquesUniversité Pierre et Marie Curie - ER3 BIOSIPE

Responsables de stage : Sandrine Cadel, Thierry Foulon

Parcours « Molécules et Cibles Thérapeutiques »Année 2009-2010

Présenté par Patricia Masson

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Plan Plan

I. L’aminopeptidase B

II. Connaissances actuelles

III. Projet et objectifs

IV. Perspectives

2

- R – K -

• Maturation des messagers peptidiquesMaturation des messagers peptidiques

Mécanisme classiqueMécanisme avec

l’aminopeptidase B

- R – K - COOHNH2

+- R - + - K - +

NH2 COOH

Prohormones Prohormones convertasesconvertases

Carboxypeptidase BCarboxypeptidase B

NH2 COOH

COOHNH2

+- R - + - K - +

Aminopeptidase BAminopeptidase B

NRD convertaseNRD convertase

3

- R – K R – K -

I. L’aminopeptidase BI. L’aminopeptidase B

Distribution tissulaire

Localisation subcellulaire

Enzyme ubiquitaire4

Intes

tin g

rêle

Epidi

dym

e

Testic

ule

Cerve

auM

uscle

CœurPo

umon

Foie

72kDa

72kDa

Panc

réas

Rein Gros i

ntes

tinEsto

mac

Rate

• Propriétés Physico-chimiquesPropriétés Physico-chimiques

Enzyme bifonctionnelle: présente in vitro une activité LTA4

hydrolase résiduelle

• Enzyme monomérique, Famille M1

• Zn2+-métallopeptidase

• Hydrolyse séquentielle RK

• Pas d’hydrolyse si proline au voisinage

• Activation par les ions Cl-

• Sensible aux agents réducteurs des ponts disulfures (DTT)

• Active sur une large gamme de pH

Acide arachidonique

LTA4

LTB4

LTA4 Hydrolase

5

• Aspects moléculairesAspects moléculaires

Localisé sur chromosome 1 humain, bande q32.1/q32.2

• Contexte phylogénétiqueContexte phylogénétique

6

HEXXHX18E

C C CCCCCCC CCrLTA4hydrolase

611 aa

CC C C CC CC C CCCCCC

rAp-B 650 aa

Comparaison de séquences: (33% d’identité; 48% de similarité)

7Modélisation et dynamique moléculaireModélisation et dynamique moléculaire

• Modèle 3D de l’Ap-BModèle 3D de l’Ap-B

(LTA4H, Thunnissen et al., 2001)

II. ConnaissancesII. Connaissances actuellesactuelles

(Haeggström et al., 1993)

8

III. Projet et ObjectifsIII. Projet et ObjectifsBut : Identifier des résidus ayant un rôle dans la spécificité de reconnaissance du substrat et le mécanisme enzymatique

Mutagenèse dirigée

Alignements de séquences

Système d’expression

Modèle moléculaire de l’Ap-B9

10

• Cibles de mutagenèse dirigéeCibles de mutagenèse dirigée

Nous effectuerons un certain nombre de mutants concernant :

- Les aspartates de l’Ap-B impliqués dans la fixation du substrat

- Les tyrosines impliquées dans le site catalytique

- Les lysines impliquées dans la fixation du substrat à l’extrémité Cterminal

• Mutation des Asp 403, 405 et 406 de l’Ap-B en Asn et Val

11

Ap-B : DPDDTYLTA4H : DIDPDVAY

Mutants ActivitéD403V -

D403N

D405V -

D405N -

D406V

D406N +++

WT +++

• Les mutantsLes mutants

LTA4H Ap-B

Mutants tyrosines : Tyr 228, 408, 413 et 440 en Phe

• Les mutantsLes mutants

12

• Les mutantsLes mutants

Mutant K600R, K602R, K600X

13

Double mutant F297Y et K600R

• Caractérisation des MutantsCaractérisation des Mutants

• Activités

• Paramètres cinétiques (KM, kcat et kcat/KM)

• Effet du chlore

• Spécificité de substrat

• Profils d’inhibition vis à vis d’inhibiteurs

d’aminopeptidase (bestatine, arphaménine)

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IV. PerspectivesIV. Perspectives

Décrypter les mécanismes catalytiques

Informations sur les spécificités et mécanismes

enzymatiques des aminopeptidases de la famille M1

Concevoir des inhibiteurs spécifiques

Expression de l’Ap-B dans différentes

pathologies

15

16

• Nouveau mécanisme catalytique Nouveau mécanisme catalytique proposé pour la LTAproposé pour la LTA44 hydrolase hydrolase

17(Tholander et al., Chem. Biol., sept. 2008)

E325

E347

E300

Q170

G298

Y413