Comparaison de séquences GRP

Spectrométrie de masse BP14

Pru p 7

l Petites protéines cationiques aux propriétés anti-microbiennes

l 12 cystéines, 6 ponts disulfures

l Résistantes à la trypsine et à la chaleur

l Partie N-terminale variable, partie C-terminale conservée

l Présentes dans les fruits et les plantesl Impliquées dans la maturation de la plante, du fruit et aussi du pollen, la

réponse de la plante au stress biotique (parasite, …) ou abiotique (froid,sécheresse,…), la transmission de signaux hormonaux , l’équilibre redox, …

l La péamacléine partage 82% d’identité avec la snakine-1 de la pomme de terre

l 4 allergènes de fruits sont actuellement décrits

La famille des snakin/ GRPPéamacléine

Snakine-1

Pisoschi et al. Eur J Med Chem, 2018.Nahirnak et al. Plant Signal Behav 2012. Tanaka et al. Mol Genet Genomics, 2004.Kuddus et al. 2016, Protein Expr. Purif

Les allergènes de la famille des GRP (gibberellin regulated protein)

Pêche (Prunus persica)Péamacléine, Pru p 7

Tuppo et al. 2013, Clin Exp Allergy;2014, Biopolymers;

Inomata et al. 2014,Ann Allergy Asthma Immunol.2016, 2017, J Dermat

Orange (Citrus sinensis)Cit s 7

Inomata et al. 2018, Clin Exp Allergy

Grenade (Punica granatum)Pommacléine, Pun g 7

Tuppo et al. 2017, J Agric Food Chem

Abricot japonais (Prunus mume)UmeboshiPru m 7

Inomata et al. 2017, Immun Inflamm Dis

Au niveau bio et immunochimique

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63Identité (%) avec Pru p 7

Pollen R C L K Y C G I C C E K C 100,00

Cups - - - - - - - - - - K - 91,67

Pêche Pru p 7* G S S F C D S K C G V R C S K A G Y Q E R C L K Y C G I C C E K C H C V P S G T Y G N K D E C P C Y R D L K N S K G N P K C P 100,00

Abricot Pru m 7* - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 100,00

Orange Cit s 7* - - D - - - - - - A - - - - - - - R E D - - - - - - - - - - D - - - - - - - - - - - H - - - - - - - - - - - - - - - K - - - - 87,30

Grenade Pun g 7* - - - - - - - - - A - - - - - - - V - D - - - - - - - - - - - - - N - - - - - - - - - - - - - - - - - - M - - - - - K - - - - 90,48Raisin - - - - - - - - - - A - - - - - - M K D - - - - - - - - - - - E - K - - - - - - - - - - H - - - - - K - K - - - - - Q - - - - 84,13

Kiwi - - D - - - - - - N K - - - - - - R R D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - F - - - - - - - - - - - M - - - - - K - - - - 85,71

Tomate - - D - - - - - - N - - - - - - - R - D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - K - - - - - G - - - - 90,48

Cotton - - D - - - - - - A - - - - - - - V - D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - F - H - - - - - - - - - M - - - - - K S - - - 85,71

Soja - - P - - - - - - - Q - - A - - - - V - D - - - R F - - - - - - - - N - - - - - - - - - - - - - - - - - M - - - - - D - - - - 84,13

PdT Snakin-1 - - - - - - - - - K L - - - - - - L A D - - - - - - - - - - - E - K - - - - - - - - - - H - - - - - - - K - - - - - K S - - - 82,54

Poivron Snakin-1 - - - - - - - - - K Q - - - - - - L A D - - - - - - - - - - - Q - K - - - - - - - - - - H - - - - - - - K - - - - - K - - - - 84,13

Pois chiche - - T - - - T R - - E - - - - - S F - D - - - - - - - - - - - - - N - - - - - - - - - - - - - - - - - - M - - - - - Q G - - - 82,54

Trèfle rouge R - A E - - - E - S I - D - - - - - - - - - - - - - N - - - - - - - - - - - - - - - - - - M - - - - - K G - - - 80,36Cacao - - G - - - - - - K - - - - - - - A K D - - - - - - - - - - K - - K - - - - - - - - - - Q - - - - - - - M - - - - - Q L A L A 79,37

Chêne - - - - - - - - - Q - - - - - - - V - D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - K S - - - 92,06

Noyer - - - - - - - - - A A - - A - - - V - D - - - - - - - - - - - - - Q - - - - - - - - - - H - - - - - - - - - - - - - K S - - - 85,71Palétuvier - - G - - - - - - - - - - - - - - F - D - - - - - - - - - - - - - N - - - - - - - - - - N - - - - - K N - - - - - - K S - - - 85,71

Hêtre - - - - - - - - - K L - - - - - A I - D - - - - - - - - - - - - - Q - - - - - - - - - - N - - - - - - - - - - A - - K A - - - 84,13

Peuplier A - G - - - - - - S - - - - - - - I K D - - - - - - - - - - - - - K - - - - - - - - - - H - - - - - - - M - - - - - K - - - - 84,13

- : Acide aminé identique à Pru p 7. PdT : pomme de terre. * : GRP allergénique.

BP14*

FRU

ITS

PLA

NTE

SA

RBRE

SComparaison de séquences de quelques GRP

Les allergènes de la famille des GRP (gibberellin regulated protein)

Pêche (Prunus persica)Péamacléine

Pru p 7

Orange (Citrus sinensis)Cit s 7

Grenade (Punica granatum)Pommacléine

Pun g 7

Abricot japonais (Prunus mume)UmeboshiPru m 7

Au niveau bio et immunochimique Au niveau clinique

Syndromepollen de cyprès/pêche

Syndromepollen de cyprès/agrumes

QUESTIONBP14 du pollen de cyprès et Pru p 7

croisent elles?

Ce qui expliquerait les syndromes cliniquement décrits

- Hugues et al. (2006) Allergy- Delimi et al. (2007) Rev Fr Allergol Clin Immunol- Caimmi et al. (2013) Allergy

- Martinez et al. (2015) Rev Fr Allergol- Martinez et al. (2015) CFA, EAACI

Tomoyasu AizawaLaboratory of Protein Science

SapporoUniversité d’Hokkaïdo

JAPONThématique

Structure et fonction des protéines d’origine végétale

Immuno-empreintescomparatives de 15 patients

allergiques au pollen de cyprès BP14+ et 15 patients

BP14 -

Extrait depollen de cyprès

Snakin-1 recombinante purifiée

La réduction des ponts disulfure diminue la masse moléculaire

apparente …… et abolie la réactivité IgE

La snakin-1 de pomme de terre se comportecomme la BP14 de pollen de cyprès

INHIBITIONSCROISEES

L’extrait de pollen de cyprès ou la BP14 inhibe la réactivité IgE sur la snakine-1

La snakine-1 n’inhibepas la réactivité IgE sur la BP14

Snakine :

GRP de pommede terre

GRP de pêche :

Péamacléine

Pru p 7Tomoyasu

Aizawa

Production d’une péamacléine recombinantePichia pastoris

Ø En conditions innovantes de sur-expression de la protéine

Ø Correctement repliée

Ø Propriétés anti-microbiennes

Gram positifEscherichia coli ML35

Gram négatifStaphylococcus aureus

ChampignonCandida parapsilosis

0

20

40

60

80

100

1,25 2,5 5 10 20 4000

20

40

60

80

100

1,25 2,5 5 10 20 4000

20

40

60

80

100

1,25 2,5 5 10 20 400

% d

e su

rvie

Concentration protéine (µM)

PéamacléineSnakine-2 (Aizawa et al. unpublished data)

INHIBITIONSCROISEES

L’extrait de pollen de cyprès ou la BP14 inhibe la réactivité IgE sur la snakine-1

La snakine-1 n’inhibepas la réactivité IgE sur la BP14

Snakine :

GRP de pommede terre

GRP de pêche :

Péamacléine

Pru p 7Tomoyasu

Aizawa

La péamacléine (Pru p 7) inhibe la réactivité IgE sur la BP14 de pollen de cyprès

BP14 est plus proche immunologiquement de la péamacléine que de la snakine

Les GRP ont-ils une pertinence clinique?Pru p 7

Cit s 7

Pru m 7

Pun g 7

Inomata et al. 2017, Immunity, Inflam Dis

TAB, SPTAngio-œdème de la faceSymptômes dépendant de l’exercice physique, aspirine100 % identité avec Pru p 7

Test de dégranulation de basophiles (TAB)Klingebiel et al. 2018, Rev Fr Allergol

Skin Prick Test (SPT)Tuppo et al. 2012, Clin Exp Allergy. Inomata et al. 2017, J Dermatol

Association avec :- Angio-œdème palpébral

Inomata et al. 2016, J Dermatol- Anaphylaxie dépendant de l’exercice physique

Inomata et al. 2015, J Dermatol

TABPru p 7

Adapté de Klingebiel et al. 2018, Rev Fr Allergol

Tuppo et al. 2017, J Agr Food Chem

?TAB, SPT ?

Inomata et al. 2018, Clin Exp AllergyTAB, SPTAngio-œdème de la faceSymptômes dépendant de l’exercice physique, aspirine

(avec une petite incertitude

sur Pun g 7)

Patient: - homme, 40 ans, né dans l’Aude, vivant à Paris- Rhino-conjonctivite: pollen de cyprès, de bouleau, …- Syndrome oral: pêche, grenade, pomme, …- tests biologiques: ImmunoCap unitaire, ISAC, (Pru p 3, Pru p 4 neg)

Pertinence clinique de BP14, la GRP de pollen de cyprès (1)

ANALYSE en IMMUNOEMPREINTE IgE

0

20

40

60

80

100

1 10 1 000 10 000ng/ml

100% b

asop

hile

s exp

rim

ant C

D63

Contrôlepositif

Anti-IgE

Contrôlenégatif

Pollen de cyprès

Snakin-1

BP14 a une pertinence clinique comme son orthologue Pru p 7 dans la pêche

BP14

Test d’activation des basophilesBasophiles du patient + allergène à évaluation par cytométrie de flux de l’activation par la

mesure de l’expression du marqueur CD63 à la surface des cellules

Pertinence clinique de BP14, la GRP de pollen de cyprès (2)

Péamacléine

Pêche

Grena

de

Patient contrôle: : BP14 : Pêche : Snakin-1 : Grenade

BP14 et agrumes

P12

Pollen de cyprès

Pamplemousse

LES PATIENTS Cyprès-Agrumes ONT DES IgE DIRIGÉESCONTRE LA BP14 DU POLLEN DE CYPRÈSImmunoempreintes , SDS-PAGE 8-18% d’extraits de pollen de cyprès ou de pamplemousse

Ø un allergène respiratoire de pollen appartient à la famille des snakin/GRP et

présente une réactivité croisée avec d’autres membres de cette famille de protéines,

des allergènes alimentaires, se trouvant dans les végétaux et les fruits.

Ø il est cliniquement pertinent et interviendrait dans les syndromes décrits

cyprès/pêche et cyprès/agrumes en croisant avec Pru p 7 et Cit s 7, deux

allergènes de la famille des snakin/GRP décrits respectivement dans la pêche et

l’orange.

Ø la famille de protéine snakin/GRP correspond donc à une nouvelle famille de

protéine impliquée dans les syndromes allergiques pollen/aliment

CONCLUSION

A new allergen family involved in pollen food-associated syndrome: Snakin/gibberellin-regulated proteins.Sénéchal H, Šantrůček J, Melčová M, Svoboda P, Zídková J, Charpin D, Guilloux L, Shahali Y, Selva MA, Couderc R, Aizawa T,Poncet P. J Allergy Clin Immunol. 2017 Aug 4. pii: S0091-6749(17)31264-2. doi: 10.1016/j.jaci.2017.06.041.

Pollen/fruit syndrome : clinical relevance of the cypress pollen allergenic Gibberellin-regulated proteinSénéchal H., Keykhosravi S., Couderc R., Selva M.A., Shahali, Y., Aizawa T., Busnel J.M., Arif R., Mercier I., Pham-Thi N., CharpinD.A., Poncet P., 2018 (sous presse dans Allergy Asthma & Immunology Research)

Remerciements

Equipe de recherche« Allergie & Environnement »

Hélène SENECHAL Sanaz KEYKHOSRAVIMarie-Ange SELVA Mahdokht MOSSALAEI

Rémy COUDERC ------------------

Jean-Pierre SUTRA Olga RIVERA Andrea BRAZDOVA Cyril LONGEMeng-Yu LI Maxime ALTERKimberley DINARD Noémie GIRARDMaxime DUBAIL Margaux ALLAINOumsaad NAAS Alexis GOMESDaniele GOMES Juliette ANDRIEU

-------------------Jocelyne JUST

Nos collègues tchèques, japonais, luxembourgeois

Les massistes de Chatenay Malabry, de

Cochin, de l’ESPCI, de l’Institut Pasteur

Les cliniciens de France (Paris et Province) et

d’ItalieDenis CHARPIN,

Marseille

Les biologistes de France (Paris et Province)