Purification par separation de phase et caracterisation du plasmalemme de l'epicotyle~de pois

JACQUES REMBUR, PIERRE L A N D R ~ ET ARLETTE NOUGAR~DE Luboratoire de cytologic exptrimentale et morphogenkse ve'gktale, Universite' Pierre et Marie Curie, britiment N2, 4 , place

Jussieu, F-75230 Paris CEDEX 05, France R e p le 29 juillet 1985

Rembur, J . , Landrt, P. & Nougarkde, A. (1986) Purification par stparation de phase et caractkrisation du plasmalemme de l'tpicotyle de pois. Biochem. Cell Biol. 64, 448-455

La validitt de la stparation de phase, pour obtenir une proportion substantielle de vtsicules d'origine plasmalemmique, a partir de la fraction microsomale de 1'Cpicotyle de pois, est dtmontrte. Pour la fraction e ~ c h i e en plasmalemme, les tests de liaison avec I'acide N-naphtyl phtalamique et I'activitt de la P-glucane synthktase I1 indiquent un rendement d'environ 60% et un enrichissement de 2,3 et 2,2, respectivement, par rapport a la fraction microsomale brute. Lorsque les vtsicules plasmalemmiques sont permkabilisks par le Triton X-100, une activitt M g 2 + - ~ T ~ a s i ~ u e s'exprime intenstment en prtsence de K+, a pH acide et alcalin. La sensibilitk au vanadate des activitts M g 2 + - ~ T ~ a s i ~ u e s , obtenues en prtsence de K + , est dtmontrte ainsi que ses variations en fonction du pH. Le dicyclohexylcarbodiimide et le diethylstilbestrol inhibent de 40 a 55% de cette activitk de f a ~ o n identique a pH acide ou voisin de la neutralitt. Les donntes indiquent une contamination rtduite de la fraction plasmalemmique par des endomembranes et suggbrent une asymttrie des deux faces du plasmalemme.

Rembur, J., Landrt, P. & Nougarbde, A. (1986) Purification par stparation de phase et caractkrisation du plasmalemme de I'tpicotyle de pois. Biochem. Cell Biol. 64, 448-455

The validity of phase partition to obtain a substantial proportion of vesicles of plasmalemma origin from the microsomal fraction of pea epicotyl has been demonstrated. In the fractions enriched with plasma membranes, N-naphthyl phtalamic acid binding and P-glucan synthetase I1 activity, showed a yield of about 60% and an enrichment of 2.3 and 2.2, respectively, in comparison with the microsomal fraction. When such plasmalemmic vesicles are permabilized by Triton X-100, an intense M g ' + - ~ ~ ~ a s e activity is obtained in presence of K+ at acid as well as alkaline pH. Inhibition of M g Z + - ~ ~ p a s e by vanadate in presence of Kf and its variations in relation to pH were shown. Dicyclohexylcarbodiimide and diethylstilbestrol inhibit 40-55% of this enzymatic activity, both at acid and neutral pH. The data show a slight contamination of the plasmalemmic fraction by endomembranes and suggest an asymmetry of the two sides of the plasmalemma.

Introduction Malgrt les procCdts de sCparation et de purification de

fractions subcellulaires (1, 2), la caractkrisation bio- chimique du plasmalemme est restCe dClicate, aprks utilisation de gradients de saccharose (3). Des vCsicules, issues d'autres organites, identiques aux vCsicules plas- malemrniques, par leur taille et par leur densitk, peuvent contarniner cette fraction.

Pourtant la fraction membrane plasmique purifiCe du colCoptile du mais (4), ou la concentration en stCrols est quatre 2 cinq fois plus klevCe que dans les fractions plus lkgkres contenant du rkticulum endoplasmique, porte prkfkrentiellement les sites fixateurs de l'acide naphtyl phtalamique. La plus forte activitC spCcifique de la P-glucane synthttase y est enregistrke; une activitt

ABR~~VIATIONS: ATP, adtnosine triphosphate; UDP, uri- dine diphosphate; MOPS, acide (N-morpho1ino)-3 propane- sulfonique; Tris, tris(hydroxym6thyl)aminomtthane; EDTA, tttraacktate d1tthyl8ne diamine; D m , dithiothreitol; SAB, albumine de strum bovin; PEG, polytthyl8neglycol; IDP, ino- sine diphosphate; DES, ditthylstilbestrol; DCCD, dicyclo- hexylcarboiirnide; UDPG, uridine-5'-diphospho-D-glucose; ANP, acide N-naphtyl phtalamique; AIA, acide P-indolyl- acttique; APT-Cr03, acide phosphotungstique - acide chromique.

UDPglucose: stCrol P-glucosyltransfCrase indique ce- pendant une contamination par des dictyosomes. D'ail- leurs, les membranes plasmiques et les dictyosomes des tiges de pois ont des densitks identiques ( 5 ) , ce qui caracttriserait le plasmalemme des 1Cgumineuses (6). Dans 1'Cpicotyle du pois (7), aprks purification sur gradient discontinu de Percoll de fractions microso- males brutes, obtenues par centrifugation diffkrentielle, une fraction dsiculaire, dtja enrichie en plasmalemrne, a Ctt obtenue.

Ce travail a pour but d'amCliorer l'enrichissement et le rendement en plasmalemme de la fraction microso- male brute de l'tpicotyle de p i s . Les activitts enzyma- tiques spCcifiques des diverses endomembranes ainsi que celles du plasmalemme sont estimtes dans chaque fraction issue de la purification.

Materiel et rnethodes Mate'riel

Des pois (Pisum sativum L. var. nain hltif d ' h o n a y ) sont cultivts en serre A partir de graines (21 2 2°C; humidit6, 80%; photoptriode, 16 h) dans de la vermiculite humidifite.

Extraction des frMltions membranuires Au 12' jour de culture, la Agion non chlorophyllienne des

tpicotyles, comprenant le noeud cotyltdonaire et les deux premiers entre-noeuds sus-jacents est prklevke et r inck A I'eau

Rinted in Canada 1 Imprime au Canada

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Epicotyles + milieu de broyage (1 g/2 mL) FRACTION

I Homogtnat

I Filtration

Filtrat

I I Parois noyaux

12000 x g, , 15 min CI arnidon

S1 plastes

I mitachondries

MICROSOM ALE BRUTE

NOUVELLE PHASE

SUPERlEURE

Stparation Gradient de phase de Percoll

SCHBMA 1. Isolement partir de I'kpicotyle de pois de frac- tions brutes, C1 et C2, par centrifugation diffkrentielle. La fraction microsomale brute, C2, est soumise a deux techniques de purification : skparation de phase et gradient de Percoll. S et C, sumageants et culots de centrifugation.

distill& froide. Environ 80 g de segments d'tpicotyle (7) sont hachks et placks sous vide (30 min) dans une solution (1 g/2 mL) comprenant 500mM de saccharose, 40mM de MOPS-Tris (pH 7,6), 1 mM d'EDTA, 5 mM de D l T et 0,5% de SAB (fraction V). Le matkriel est broyk a froid au mortier, I'homogknat est filtrk par passage a travers quatre couches de Miracloth et le pH est ajustk a 7,2 avec du Tris. Le fractionnement du filtrat est rkalist (Schema 1) par deux centrifugations (centrifugeuse Sorvall RC2B, rotor SS 34) : 12000 x g (15 min) qui skdimente les debris de paroi, l'amidon, les plastes, les mitochondries et les noyaux, en un culot C1; 48 000 x g (1 h) qui permet d,'obtenir, en un culot C2, la fraction microsomale brute. A partir de C2, la comparaison de deux techniques de purification, a permis de ne retenir que la separation de phase.

Essai d'isolement d'une fraction enrichie en plasmalernme par siparation de phase

La fraction microsomale brute est remise en suspension et soumise A des stparations de phase selon la technique de Lundborg et al. (8), dans 20g d'un melange comprenant 250 rnM de saccharose, 5 mM de tampon phosphate (pH 7,8), 6,3% de PEG 4000 et 5,3% de dextran T 500. Cette suspension est mklangke par 40 inversions du tube et centrifugke durant 5 min 2 1000 x g (rotor HB 4). Deux couches sont obtenues (fig. 1, Ctape 0) : une phase sugrieure, U1, constituke de PEG et une phase infkrieure, L1, contenant du dextran. UI est prklevk et soumis successivement i deux skparations de phase avec L2 et L3, conduisant ii U2 puis U3 (fig. 1, ktapes I et 11). Afin d'augmenter le rendement en plasmalemme, une nouvelle phase sugrieure est ajout& L1; aprts agitation et centrifuga- tion, la phase UI1 (fig. l, ktape I) est prklevke puis soumise A L2 puis L3. Uf3 (fig. 1, ktape 111) est rkuni B U3; de m2me L1,

FRACTION U

FRACTION

FIG. 1. Enrichissment en plasmalemme d'une fraction microsomale brute issue d'un homogknat (48 000 X g, 1 h) de l'kpicotyle de pois par deux skries successives de trois skparations de phase. L1, L2 et L3, phases inftrieures aprts mClange de phases puis skparation. U,, U2 et US, phases sudrieures de la premitre skrie aprts une, deux et trois stparations de phase. U r l , Ur2 et ~ ' ~ ; ~ h a s e s sup6rieures aprks la deuxikme skrie de transferts. U? vlus U'? constituent la - . fraction U. 0, I, I1 et 111, ktapes successives de la purification.

L2 et L3 sont associks, diluts avec la solution de lavage et centrifuges ?i 100 000 X g durant 1 h (centrifugeuse Beckman L 50, rotor Ti 60). Les deux culots de centrifugation, constituks des divers types membranaires, issues des phases, supkrieures et infkrieures, aprks trois stparations de phase, sont appelCs respectivement U et L.

Analyse biochirnique Tests enzyrnatiques L'identification des diffkrents systkmes membranaires est

rkalide par l'analyse de leurs proprittks enzymatiques a 20°C selon des procCdCs adaptks ii notre matkriel. Les membranes d'origine mitochondriale sont identifites par leur activitk cytochrome c oxydase en suivant I'oxydation du cytochrome c rkduit B 550nm (9). Les membranes du rkticulum endo- plasmique sont dktectkes par dosage de I'activitk NADH- cytochrome c rkductase, insensible I'antirnycine A, en sui- vant la dduction du cytochrome c en prksence de NADH et d'antimycine. Les vksicules d'origine golgienne sont mises en kvidence par l e u activitC IDPasique latente en prksence d'IDP (3 rnM) aprks conservation de la fraction durant 3 jours A 2°C. Les activitks ATPasique (~~ '+-ATpase) sont estimkes selon Rembur et al. (7). Le phosphate 1iErk est dktennink selon la technique de Ames (10). L'activitk ATPasique de la fraction la

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TABLEAU 1. Quantitks de protkines totales obtenues dans diver types de fractions, partir d'un homogknat de 10 g d'kpicotyle de pois

Protkines totales

Fraction mg/ 10 g de matikre fraiche %"

Homogknat filtrk 27,65 Fraction 0- 12 K~~ (C 1) 4,20 Fraction microsomale brute,

fraction 12-48 Kp (C2) 3,27 Stparation de phase

Tourcentage exprime par rapport B la quantitk totale de protkines contenues dans l'homogtnat filtre.

bFraction 0-12Kp = culot apres centrifugation de 0 i 12000 X g.

plus riche en plasmalemme est testke en prksence d'inhibiteurs : molybdate d'ammonium, inhibiteur des phosphatases acides (1 1); vanadate de sodium, inhibiteur de l'activitk ATPasique du plasmalemme, mais aussi de la phosphatase acide (12): DES et DCCD, puissants inhibiteurs des activit6s ATPasiques (13). Les tests sont prkckdks d'une prkincubation de 10 min pour diffkrentes concentrations de ces inhibiteurs. Le Triton X-100 est utilisk 2 faible concentration (0,01%) pour permkabiliser les membranes et abolir leur gradient de pH.

L'activitk glucane synthttase I1 est mesurke en prksence d'une forte concentration (millimolaire) d'UDPG afin de la diffkrencier de I'activitt glucane synthktase I (des vksicules golgiennes) s'exprimant en presence de faibles concentrations (micromolaire) d'UDPG (14). La technique retenue est celle de Elliott (15) Ikgkrement modifike. Le milieu d'incubation comprend 1 mM d'UDPG avec 0,I pCi d'UDP-D-[14C(U)]- glucose (1 Ci = 37 GBq), 10 mM de cellobiose, 2 mM d'EDTA et 1 mM de D m , 50mM de Tris-HC1 (pH 8) et 100 pg de protkines. L'incubation en milieu agitk est de 20 min a 25°C. La rkaction est arretke en chauffant les tubes durant 5 min dans un bain marie a kbullition. Pour chaque tube, 1,s mg de cellulose est rajoutk au milieu puis l'ensemble est transfkrk sur filtre GF/C. Aprks quatre lavages par 2 mL d'eau bouil- lante puis deux lavages par I mL d'un mklange mkthanol- chlorofonne (2:1, v/v), les filtres sont skchks a 70°C et transfkr6s dans un liquide de scintillation (PCS, Amersham). Le comptage est rkalisk a I'aide d'un spectromttre scintilla- tion Intertechnique. Les activitks de synthkse sont exprimkes en nanomoles de glucose incorpork par milligramme de pro- tkine par heure.

Liaison avec 1'ANP Selon Lembi et al. (16), une interaction spkcifique s'ktablit

entre le plasmalemme et I'ANP, inhibiteur du transport polarisk de I'AIA. La fraction microsomale brute et les fractions issues de la separation de phase sont simultankment soumises a deux conditions d'incubation permettant d'ktablir, par diffkrence, une fixation spkcifique de I'ANP (4). Le premier milieu d'incubation comprend 20mM de tampon citrate (pH 5,3), 250mM de saccharose, 5 mM de MgC12 et 2,s X lo-' M de [ 3 ~ ] ~ ~ ~ correspondant h 0,05 pCi d'ANP radioactif. Le deuxikme milieu comporte, en plus, de I'ANP froid A la concentration finale de 2,5 x M. Aprks une

incubation de 5 min a 2"C, les tubes des deux stries sont centrifugks a 48 000 X g durant 30 min (centrifugeuse Sorvall, rotor SS 34). Les culots sont skchks puis suspendus dans 300 ILL d'eau distillke auxquels sont aioutks 2 mL de PCS. La radioactivitk est dktermintk par cornitage dans un spectrom- ttre a scintillation liauide Intertechniaue. La radioactivit6. spkcifiquement like aux membranes, est ttablie par difference entre la premikre skrie (radioactivitk totale) et la deuxitme skrie (radioactivitk rksiduelle non spkcifique).

Dosage des prote'ines Les concentrations en protkines membranaires sont dkter-

minkes en prksence de bleu de Coomassie suivant la technique de Bradford (17). Le complexe protkine - bleu de Coomassie est mesun5 1 595 nm avec un spectrophotomktre Beckman a double faisceau.

Examen en rnicroscopie Clectronique Me'thode classique La fraction C2 et la fraction U sont prkfixkes (15 min,

tempkrature ambiante) par le mklange paraformaldkhyde a 3% dans le tampon cacodylate de sodium O,1 M (pH 7,2). Trois lavages (10 min chacun) dans le m&me tampon froid sont suivis par une inclusion dans une agarose (Sigma type VII). Le matkriel est postfix6 (60 min) par une solution de tktroxyde d'osmium ii 1% dans le tampon cacodylate de sodium 0 , l M (pH 7,2). Des fragments d'kpicotyle sont traitks (I h) par le glutaraldkhyde 2%, dans le tampon cacodylate de sodium 0.1 M (pH 7,2), lavks dans le meme tampon puis soumis au t6troxyde d'osmium 1% (1 h). Aprts dkshydratation par I'alcool kthylique et inclusion dans 1'Araldite M (Fluka), des sections ultrafines sont colorkes par l'acktate d'uranyle - citrate de plomb ou soumises au contraste AFT-Ca3. Contraste par I'APT-CrOs

I1 est pratiquk selon Rambourg (18) et Roland (19) sur les fractions C2 et U et sur des sections ultrafines d'kpicotyle. L'affinitk pour l'APT-CKI3 serait due a la composition spkcifique du plasmalemrne en hydrates de carbone (20).

Rbultats Purijication par skparation de phase

Le tableau 1 montre les quantitts de prottines totales, obtenues dans l'homogtnat filtrt, dans la fraction C1 et

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TABLEAU 2. Caractkrisation des activitCs enzymatiques du plasmalemme et des endomembranes de 1'Cpicotyle de pois. Fractions L et U, obtenues ?I partir d'une

fraction microsomale brute, aprks skparation de phase

ActivitC

Microsomale Enzyme brute L U R,

Glucane synthktase 11" 164,4 (1,O) 103,2 (0,6) 362.1 (2,2) R 100 23,4 58,s 81,9

M~~~ - ~ ~ ~ a s e ~ 31,2 (1,O) 50,O (1,6) 19,l (0,6) R 100 59,8 16,3 76,l

K+-ATPaseb 5,5 (I,()) 2,9 ( 0 3 1 9 ( 0 3 R 100 19,7 9 2 28,9

IDPaseb 42,l (1,O) 47,9 (1,l) 13,1 (0,3) R 100 423 8,3 50.8

NADH-cytochrome c rkductase sensible ?I I'antimycine A' 23,O (1,O) 46 (2,O) 4,6 (0,6)

R 100 74,6 5,3 79.9

NADH-cytochrome c rkductase insensible l'antimycine A' 84,O (1,O) 123,O (1,5) 21,s (0,3)

R 100 54.6 6,8 61.4

Cytochrome c oxydasec 26,O (1,O) 45,6 (1,8) 3.8 (0,l) R 100 65,4 3,9 69,3

NOTE: Les chiffres entre parenthbses indiquent I'enrichissement des fractions rapport6 B I'activitt spdcifique de la fraction micros~male brute. R , rendement des fractions L ou U exprime en pourcentage par rapport a I'activit6 totale de la fraction microsomale brute. R,, rendement total des deux fractions Let U.

"Nanomoles de glucose incorpod par milligramme de pmteine par heure. bMicromoles de Pi liWre par milligramme de proteine par heure. 'Nanomoles de cytochrome par milligramme de protkine par minute.

dans la fraction microsomale brute, C2, h partir de que 23,4%, le reste (l8,1%) ktant solubilist ou inactive laquelle la technique de purification du plasrnalemme a au cours des ktapes de purification. L'activitk IDPasique Ctk utiliste. La fraction C2 contient moins de 12% de la de la fraction U ne reprksente que 8,3% de celle de la totalitk des protkines prksentes dans I'homogknat filtrt. fraction microsomale brute. Les membranes provenant Aprks deux skparations de phase, environ 64% des du rkticulum endoplasmique peuvent Etre estimtes 2I protkines microsomales sont rkcuptrtes dans l'ensem- 6,8% et celles issues des mitochondries 21 4-5%, seule- ble des deux fractions finales U et L. ment.

Apds purification, la proportion des vtsicules pro- venant des endomembranes ou du plasmalemme est estimte, pour chaque fraction, par analyse de leurs activitks enzymatiques.

Le tableau 2 indique les activitts sptcifiques et les activitks totales exprimkes en pourcentage (R) pour une fraction microsomale brute et pour les deux fractions issues de la technique de purification.

Capacite' de Jination de 1'ANP La capacitk de fixation sptcifique de 1'ANP (tableau

3) par la fraction plasmalemmique (U) est 2,3 fois plus klevte que celle de la fraction microsomale brute. Cette fraction purifike contient environ 59,7% des sites spkcifiques, ce qui confirme les rksultats obtenus par analyse de l'activite glucane synthktase II.

La fraction U posskde deia plus forte activitk glucane Activite's ATPasiques M$+-dtpendantes, stimulkes par synthktase 11; son activitt spkcifique est multiplike par le K+ 2,2. De plus, 58,5% des vtsicules plasmalemmiques, Aprks stparation de phase (tableau 2), le pourcentage provenant de la fraction microsomale brute, se retrou- de stimulation (pourcentage de stimulation par le potas- vent dans cette fraction. La fraction L n'en possMe plus sium = (K+-ATP~S~/M~*+-ATP~S~) X 100) qui est de

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TABLEAU 3. Comparaison des capacitCs de fixation sptcifique de I'ANP pour la fraction microsomale brute de 1'Cpicotyle de pois et

pour les membranes des deux fractions L et U obtenues aprBs separation de phase

Fixation spkcifique R Fraction (cpm/mg de protCine) Enrichissement (%)

Microsomale brute 208 L 75 U 467

L + U

FIG. 2. Effet du pH sur l'activitd ATPasique associde au plasmalemme de l'tpicotyle de pois (fraction U) dkpendante du magndsium ( M g 2 + - ~ ~ ~ a s i q u e ) (A, M) et stimulCe par le potassium (K+-AT~asique) (A, U), en absence (U, B) ou en presence (A, A) de 0,01% de Triton X-100.

17-18% dans la fraction microsomale brute, atteint seulement 10% dans la fraction plasmalemmique (U). De plus, l'activitk Kf -ATPasique totale des fractions U et L, issues de la skparation de phase, ne reprksente plus que 28,9% de celle de la fraction brute, alors que 76,1% de l'activitk stimulke par le magnksium est rkcuptrke.

L'activitk M g 2 + - A ~ ~ a s i ~ u e de la fraction plasma- lemmique (U) varie en fonction du pH (fig. 2). Elle est optimale B pH 6,5; cependant, la courbe est nettement asymktrique. Cette activitk est faiblement stimulke par le potassium h pH acide (5-53 .

Dans les fractions U et L, la rkduction importante (68,5%) de l'activitk ATPasique totale, stimulke par le potassium, doit Ctre explicitke. La fraction U est

permkabiliske par de faibles concentrations (0,01%) de Triton X-100. En presence de ce detergent, l'activitk ~ ~ ~ + - ~ ~ ~ a s i ~ u e double B pH 6,5 (fig. 2). Dbs lors, la courbe de pH possbde un profil symttrique. L'activitk spkcifique de la K+-ATPase B pH 5,5 passe de 1,9 B 9,3 pmol de Pi libkrk par milligramme de protkine par heure et le pourcentage de stimulation par le potassium s'klhve B 32%.

En presence de Triton X- 100, la K+-ATPase s'ex- prime par deux optima, l'un h pH acide (5,5), l'autre B pH alcalin (8,O).

La figure 3a montre l'effet du molybdate d'ammo- nium (200 F M ) sur l'activitk ATPasique de la fraction plasmalemmique (U) en prksence de magnksium et de potassium. Cet inhibiteur des phosphatases non spkci- fiques inhibe au rnaximum 13% de l'activitk enzyma- tique h pH acide. A la mCme concentration, le vanadate de sodium inhibe 58% de l'activitk ATPasique B pH 5,5 et 70% de cette activitk B pH neutre. Le maximum de sensibilitk au vanadate (fig. 3b) se situe entre pH 6 et 7; la sensibilitk maximale au molybdate d'ammonium s'e~prime entre.pH 5,5 et 6.

A pH 6,5 (fig. 4), 10 pM de vanadate de sodium suffisent pour inhiber 50% de l'activitk ATPasique; 400 pM sont nCcessaires pour provoquer une inhibition comparable h pH 5,5. Le DCCD et le DES agissent au contraire de f a ~ o n semblable B pH 6,5 et 5,5 et provo- quent 40-55% d'inhibition de l'activitk enzymatique B la concentration de 1 mM.

Ident$cation en rnicroscopie e'lectronique des e'le'ments de la fraction U

Aprhs separation de phase, la fraction U, purifite (fig. 5) ne montre que des vksicules lisses et refermtes dont le diamhtre oscille entre 0 , l et 0,6 pm. Des sys- tkmes membranaires emboitks, plus ou moins com- plexes (flbches) sont prksents. Cette fraction est dk- pourvue de ribosomes. Aprbs contraste par 1'APT-Cr03 (fig. 6a), la majoritk des vksicules de diambtres divers et des systbmes membranaires emboitks (flbches) est sou- lignCe alors que, seules, quelques vksicules (fig. 6b, flhches) sont contrastkes dans la fraction microsomale brute. In situ (fig. 6c), seul le plasmalemme et ses

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25- a 20 - f b

- - k - 20- '0,

0

'8

h

0- ' 5 ; 5 ' 6 S ' i

-5> ,5 ' * 45 ' 5;5 ' (53 ' x5 ' 83

pH pH FIG. 3. Effet du pH sur l'activitt ATPasique associte au plasmalemme (fraction U) de l'tpicotyle de pois. (a) Activitt

ATPasique en absence d'inhibiteur ( a ) , en prksence de 200 pM de vanadate de sodium (W) ou de molybdate d'ammonium (A). (b) Activitts ATPasique sensibles au vanadate (0) et au molybdate (A), ttablies i partir des diffkrences d'activitks mesurkes en absence et en prtsence des inhibiteurs.

"I$ 165 ,b4 I$ Concentration (M)

FIG. 4. Effet de difftrents inhibiteurs sur l'activitt ATPa- sique des membranes plasmalemmiques de I'tpicotyle de pois (fraction U). Prkincubation de 15 rnin en pr6sence de difftren- tes concentrations en inhibiteurs i pH 6,5 et 5,5. Rtsultats exprimts en pourcentage par rapport i I'activitk des contrbles (100%) dont le milieu d'incubation contient 2% d'kthanol ou 2mM de soude. DCCD et DES solubilisCs dans l'tthanol (concentration finale 2%); vanadate dissout dans de la soude (concentration finale 2 mM), pH 5,5 : DCCD (a), DES (A), vanadate (0). pH 6,5 : DCCD (W), DES (A), vanadate ( a ) .

dtpendances sont soulignks (flbches), i l'exclusion du tonoplaste, t, ou des membranes des autres organites.

Discussion Les vksicules, d'origine plasmalernrnique (7) , mises

en suspension dans un mklange de deux polymbres hydrophiles (8 , 21) se distribuent essentiellement dans la phase supkrieure constitute de PEG, donntes en accord avec celles obtenues sur d'autres espbces (22, 23). Trois critkres plaident en faveur de la nature plasmalemmique des vksicules de la fraction U ainsi purifike. (i) La forte activitt et un haut rendement (58,5%) en activitk de la P-glucane synthktase 11, reconnue sur d'autres exemples (9 , 15, 24, 25). ( i i ) La forte capacitt de fixation de l'acide N-naphthyl phtalarni- que des constituants de la fraction (4 ,26) qui retiennent 59,7% des sites spkcifiques, par rapport B la fraction microsomale brute. (iii) L'abondance des syst5mes membranaires (>85%) colorks par I'APT-Cr03. Bien que la spkcificitk de cette dernibre mkthode ait kt6 contestke (20, 27), elle fournit un argument parmi d'autres.

Cette fraction plasmalemrnique est pratiquement dt- pourvue de contamination par des membranes mito- chondriales ou par du rkticulum endoplasmique, comme le montrent les analyses biochimiques des activitks enzymatiques marqueurs de ces organites.

L'utilisation d'un gradient discontinu de Percoll pour purifier une fraction plasmalemmique s'est rkvklke

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FIG. 5 et 6. Epicotyle de pois. Examen en microscopie tlectronique. Fig. 5 . Fraction U. Mtthode classique. Fixation paraformaldthyde - tttroxyde d'osrnium - acttate d'uranyle - citrate de plomb. VCsicules entitrement lisses, parfois emboitees (fltches), absence de ribosomes. X 16 000. Fig. 6a-6c. Contraste par 1'APT-Ca3. (a) Fraction U , membrane de la majorit6 des vksicules (flkches), d'origine plasmalemmique, fortement soulignte. (b) Fraction C2, quelques vtsicules seulement sont contrasttes (flbches). X 23 000. (c) Section ultrafine de cellule parenchymateuse du noeud cotyledonaire. Coloration prononcte du plasmalemme et de ses dtpendances (flkches). Eltments non soulignts : t , tonoplaste; m , membrane mitochondriale; p, membrane plastidale; mn, membrane nucleaire; d, dictyosome; re , rtticulum endoplasmique; N , chromatine. X 11 500.

moins perfomante. Par exemple, pour la P-glucane synthktase 11, la fraction la plus riche ne comporte que 15,5% de 1'activitC totale par rapport a la fraction microsomale brute; de plus, les contaminations par les endomembranes sont plus ClevCes (rksultats non mon- trCs).

Aprbs separation de phase, nous avons recherche l'existence d'une ATPase dependante du ME'+, sti- mulCe par le K+ au pH optimum de 5,5 (7) et associke aux vCsicules plasmalemmiques. Si l'activite ATPasique

dependante du Mg2+ a t te mise en Cvidence, une forte activation par le K+ n'a pas CtC retrouvCe. Plusieurs hypothbses pouvaient etre envisagkes, solubilisation et (OU) inactivation de l'enzyme au cours de la sCparation de phase ou inaccessibilitk de l'enzyme au substrat. La pemeabilisation des vCsicules par le Triton X-100 a rCvtlt une importante stimulation par le K+ , a pH acide, mais a aussi mis en Cvidence un deuxibme optimum d'activitt a pH 8. L'existence de deux pics d'activitk ATPasique, en prCsence de Triton X-100, a CtC signalee

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(28) pour les membranes plasmiques extraites des racines d'avoine. Une m&me ATPase pourrait fonction- ner B des pH diffkrents sur chacune des deux faces du plasmalemme. La ntcessiti de permkabiliser les vtsi- cules pour rkdler la stimulation par le K+ indique que, chez le pois, la rkgion de l'enzyme, intkresstee par cette rtaction, n'est pas a la surface externe des vtsicules issues de la skparation de phase.

Le pH optimum de 1'ATPase tonoplastique, insensi- ble au vanadate, est de 8,O (29), tout cornme l'un des deux optima enregistrt pour l'activitk de la M ~ ~ + - ATPase stimulke par le K+; mais, dans ce dernier cas, une sensiblitk importante au vanadate de sodium (71%) est consemte (par rapport 2 la sensibilitk optimale 21 cet inhibiteur). Une sensiblitk typique au vanadate des vksicules plasmalemmiques a souvent Ctt signalte (7, 12,30,3 1); chez le pois nain, aprbs skparation de phase, cette sensibilitk est fonction du pH : en prksence de Mg2+ et de K+, la concentration micromolaire de vanadate nkcessaire pour bloquer 50% de l'activitk enzymatique augmente d'un facteur 40 entre pH 6,5 et 5 3 .

Dans notre matkriel, comme pour les vksicules microsomales du pois (32) ou d'autres espbces (33-35), l'activitt ATPasique, dkpendante du Mg2+ et stimulke par le K+, est fortement inhibte par le DES et par le DCCD de f a ~ o n identique ?I pH 6,5 ou 5 3 .

Les systbmes vksiculaires du pois, purifiks par skpara- tion de phase sont donc constituts en majoritk de fragments plasmalemmiques; la contamination par des endomembranes est faible. La stparation de phase peut dtsormais etre utiliste pour purifier le plasmalemme du pois et estimer les variations de composition protkique lors de changements dans l'ttat physiologique du matkriel ou dans la nature du cycle cellulaire.

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