extraction et purification des enzymes

Année universitaire 2014-2015

Méthodes d’extraction et de purification des enzymes

Microprojet

Thème :

Présenté par :

CHEBIRA Hadjar

MOUSSAOUI Rahima

5e Année ingénieur

Devant le jury :

Président : Dr KECHID M. MCB I.N.A.T.A.A.-U.C.1

Promoteur : M. GOMRI M. A. MAB I.N.A.T.A.A.-U.C.1

Examinateur : M. BOUGUERRA A. MAA I.N.A.T.A.A.-U.C.1

REPUBLIQUE ALGERIENNE

DEMOCRATIQUE ET

POPULAIRE

MINISTERE DE

L’ENSEIGNEMENT

SUPERIEUR ET DE LA

RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Université

Constantine 1

Institut de la Nutrition, de l’Alimentation et des

Technologies Agro-Alimentaires (INATAA)

SOMMAIRE

Page

Liste des figures

Liste des tableaux

Introduction 1

Chapitre 1. Généralités sur les enzymes

1- Définition

2- Propriétés des enzymes

3- Sources d’enzymes

4- Domaines d’application des enzymes dans l’industrie agro-alimentaire

5- Schéma général d’obtention d’une enzyme

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3

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Chapitre 2. Extraction des enzymes

1- Définition et principe 6

2- Critères de choix et préparation du matériel biologique de départ 6

3- Méthodes d’extraction

3-1- Méthode physiques

- Choc osmotique

3-2 - Méthodes mécaniques

- Congélation-décongélation

- Broyage ou agitation avec des abrasifs

- Bombe à disruption

- Homogénéisateur d’Elvjm de potier

- Les billes de verre

- Sonication

3-3- Extraction chimique

3-4- Enzymes lytiques

3-5- Extraction liquide- liquide

3-6- Extraction liquide-solide

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Chapitre 3. Purification des enzymes

1- Définition

2- Objectifs de la purification des enzymes

3- Méthodes de purification des enzymes

3-1- Méthode basée sur les différences de solubilité

- Précipitation différentielle au sulfate d’ammonium

3-2- Méthodes basées sur la taille des molécules

3-2-1 Dialyse

3-2-2 Centrifugation

3-2-3 Filtration membranaire

3-3- Méthodes basées sur les propriétés ioniques

3-3-1 Chromatographie

- Définition

- Principe

-Types de chromatographie

Chromatographie par adsorption

Chromatographie par échange d’ions

Chromatographie de partage

Chromatographie d’exclusion

Chromatographie d’affinité

3-3-2 Electrophorèse

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16

Conclusion 17

Références bibliographiques 18

LISTE DES FIGURES

Page

Figure 1. Représentation schématique d’un processus d’isolement et de purification d’une

enzyme………………………………………………………………………………………..5

Figure 2. Schéma représentant l’appareil utilisé dans l’extraction par billes de verre……….8

Figure 3. Précipitation au sulfate d’ammonium……………………………………………...11

Figure 4. Schéma générale d’une dialyse…………………………………………………….12

Figure 5. Chromatographie par échange d’ions……………………………………………...14

Figure 6. Chromatographie d’affinité………………………………………………………..15

LISTE DES TABLEAUX

Page

Tableau 1. Classification des enzymes par l’ « Enzyme Commission » E.C………………2

Tableau 2. Exemples de quelques enzymes utilisées en industrie agro-alimentaire

…………………………………………..…………………………………………………..4-5

Introduction

1

Le mot enzyme a été inventé en 1878 par le professeur Willy Kuhne de l’université de

Heidelberg. Le mot vient du grec « en zume », et signifie, de façon assez appropriée, « dans la

levure ». Les enzymes sont des biocatalyseurs, ce sont des macromolécules de haute masse

moléculaire présentes dans les cellules de tous les organismes vivants (KENT, 2012).

Aujourd’hui, la plupart des applications pour les enzymes industrielles se trouvent

dans l’industrie agro-alimentaire. L’application de la technologie enzymatique débuta dans les

années 1960, avec l’utilisation de la gluco-amylase pour augmenter le rendement et la pureté

du glucose produit à partir de l’amidon ainsi que pour faciliter la cristallisation lors de ce

procédé (KENT, 2012).

Dans l’industrie alimentaire, les enzymes peuvent intervenir lors du procédé de

fabrication pour améliorer les qualités de l’aliment comme dans la panification, la fabrication

des fromages, ou pour une meilleure conservation (DUPRET et al., 2004 ; SPINNLER,

2008).

Les enzymes utilisées en industrie agro-alimentaire sont extraites à partir de

différentes sources biologiques (végétale, animal, microbienne) et doivent donc être purifiées

dans le but d’obtention de maximum de rendement et de maximum de pureté possible.

L’objectif de notre travail est de passer en revue les différentes méthodes d’extraction

et de purification des enzymes industrielles décrites par la bibliographie.


2

1-Définition

Les enzymes sont des catalyseurs des réactions chimiques qui se déroulent chez les

êtres vivants, elles possèdent trois caractéristiques essentielles : ce sont des protéines, elles ont

une spécificité d’action élevée, et elles augmentent considérablement la vitesse des réactions

qu’elles catalysent (SABLONNIERE et CARAYON, 2006).

Dans certains cas, pour être active, l’enzyme doit au préalable s’associer avec un

coenzyme, qui est une molécule de nature et de structure très variable (NAD, ATP...)

(SANTELLI, 2012).

En plus des noms dits « traditionnels » donnés pour les enzymes d’après leurs

origines, action ou autres considérations. L’Enzyme Commission (EC), a établie une

nomenclature des enzymes basée sur quatre nombres précédés de EC. Toutes les enzymes

sont regroupées en six classes principales de 1 à 6 qui constituent le premier chiffre de la

nomenclature. Le second chiffre indique une sous -classe, le troisième une sous-sous-classe et

le quatrième est un nombre arbitraire (SANTELLI, 2012) (Tableau 1).

Tableau 1. Classification des enzymes par l’ « Enzyme Commission» (BURSTEIN, 2000).

CLASSE Exemples

Code EC

1- OXYDO-REDUCTASES (Oxydases, déshydrogénases)

Glucose oxydase GOD L-Lactate deshydrogénase LDH

E.C.1.1.3.4 E.C.1.1.1.27

2- TRANSFERASES

(Méthyl, carbonyl, acyl, amino, glycosyl, phosphoryl) Phosphorylase

E.C.2.4.1.1

3- HYDROLASES Acétylcholine estérase

Phosphodiestérases -α-amylase -cellulase

E.C.3.1.1.7 E.C.3.1.4.1 E.C.3.2.1.1 E.C.3.2.1.4

4- LYASES Carboxylases :

-oxalate décarboxylase ammonia-lyases -aspartate ammonia-lyase

E.C.4.1.1.3 E.C.4.3.1.1

5- ISOMERASES Racemases, Epimérases :

-Alanine racémase -Lactate racémase

-Glucose isomérase

E.C.5.1.1.1 E.C.5.1.2.1

E.C.5.3.1.18

6- LIGASES Tyrosine- RNAt ligase

Glutamate- ammoniac ligase

E.C.6.1.1.1 E.C.6.3.1.2


3

2- Propriétés des enzymes

D’après DESCAMPS (2008), on peut résumer les propriétés générales des enzymes dans

les points suivants :

Ce sont des biocatalyseurs de nature protéique qui accélèrent une réaction

biochimique et se retrouvent intact en fin de réaction ;

toute enzyme possède une zone particulière appelée site actif. Cette zone se

décompose en un site de fixation du substrat (molécule qui sera modifiée par l’action de

l’enzyme) et d’un site catalytique ;

la vitesse de réalisation d’une réaction enzymatique se mesure par la quantité de

substrat disparaissant par unité de temps ou la quantité de produit formé par unité de temps.

La vitesse initiale de catalyse est proportionnelle à la quantité de substrat, et lorsque tous les

sites de fixation sont occupés par le substrat, l’enzyme est saturée ;

les enzymes sont sensibles à de nombreuses modifications environnementales telles

que les changements de température et de pH. Toute enzyme possède une température

optimale d’activité enzymatique pour laquelle la vitesse initiale de catalyse est maximale.

L’enzyme possède également un pH optimal d’activité (le pH modifie en effet la charge

ionique des acides aminés, ce qui entraine une modification de la structure) ;

un seul substrat a une configuration tridimensionnelle complémentaire de celle du site

de fixation enzymatique et peut former une liaison temporaire avec celui-ci : il y a spécificité

de substrat. La formation du complexe enzyme substrat provoque alors l’activation du site

catalytique qui ne permet la réalisation que d’un type de réaction biochimique, qui peut être

une condensation, une hydrolyse, un transfert d’électrons ou de groupement ou encore une

isomérisation : cela induit une spécificité d’action.

3- Sources d’enzymes

Les tissus végétaux et les organes animaux étaient les sources les plus importantes des

enzymes au début de la biotechnologie des enzymes. En 1960, environ 70% des enzymes

étaient extraites à partir des tissus végétaux ou d'exsudats et organes animaux. Vingt ans

après, la situation s'était inversée et la plupart des enzymes industrielles ont été produites à

partir de sources microbiennes. De nos jours, les enzymes issues des plantes et des animaux,

la plupart du temps des protéases, sont toujours sur le marché et certaines d'entre elles sont

d'importance commerciale mais la plus grande part du marché mondial des enzymes

industrielles est occupée par des enzymes d’origine microbienne (ILLANES, 2008).


4

4-Domaines d’application des enzymes dans l’industrie agro-alimentaire

Au cours des fermentations alimentaires, ce sont les multiples enzymes des cellules

microbiennes qui provoquent les modifications complexes observées. Il est également

possible de faire intervenir des enzymes seules, en l’absence de toute cellule vivante. Ces

enzymes jouent plusieurs rôles dans les productions alimentaires industrielles, le tableau

suivant représente des exemples de différents enzymes utilisées dans l’industrie agro-

alimentaire, leurs sources, leurs actions et leurs usages (SPINNLER, 2008).

Tableau 2. Exemples de quelques enzymes utilisées en industrie agro-alimentaire

(SPINNLER, 2008)

Enzymes Sources Actions Usages

Amylases

Aspergillus oryzae (moisissure)

Bacillus subtilis (bactérie)

hydrolyse de l'amidon en sucres solubles

Améliorer la fermentation (pain,

bière) Clarifier les jus de fruits

et de légumes, etc.

Invertase

Saccharomyces cerevisiœ (levure)

Candida utilis

hydrolyse le saccharose en glucose et fructose

Réduire la cristallisation dans les sirops et

Produire du sucre inverti

Lactase

(B-Galactosidase) (A-Galactosidase)

Aspergillus niger (moisissure)

Kluyveromyces fragilis (levure)

Candida

hydrolyse le lactose en glucose et galactose

Faire disparaître le lactose dans les produits

laitiers

Glucose isomérase

Streptomyces, Bacillus

coagulans, Arthrobacter

conversion du glucose en fructose

Produire du sirop de maïs à teneur élevée en

fructose

Glucose oxydase

Aspergillus niger, Pénicillium

transformation du glucose en acide

gluconique

Éliminer le glucose dans les œufs déshydratés

Pectinases


Rhizopus oryzœ Pénicillium

hydrolyse de la pectine Clarifier le vin ou le jus

de fruits et de légumes et Empêcher la gélification

Cellulase

Trichoderma viride (moisissure)


hydrolyse de la cellulose en sucres

Clarifier les jus de fruits Produire davantage de sucres fermentescibles

Lipases

Saccharomycopsis lipolytica (levure) Aspergillus niger

(moisissure) Pénicillium roqueforti,

Rhizopus, Candida lipolytica

hydrolyse les lipides en acides gras et glycérides

Produire davantage de composés d'arômes dans

les fromages et autres produits laitiers


5

Enzymes

protéolytiques

(Protéases)

Aspergillus oryzœ (moisissure)

Bacillus subtilis (bactérie)

hydrolyse des protéines en acides aminés

Améliorer la texture de la pâte à pain

Stabiliser la bière

Rennine

(ou rennet)

Mucor pusillus (moisissure)

coagulation de la caséine du lait

Coaguler le lait pour la fabrication de fromages

5-Schéma général d’obtention d’une enzyme

Pour l’isolement d’une enzyme, deux grandes étapes constituent le processus d’obtention de

la biomolécule : l’extraction et la purification (Figure 1) (LAURENT, 1982).

Figure 1. Représentation schématique d’un processus d’isolement et de purification d’une

enzyme (LAURENT, 1982).

MATIERE PREMIERE

Végétale Microbienne Animale

ENZYME PURE

EXTRAIT BRUT

Etape1

EXTRACTION

Etape 2

PURIFICATION

Chapitre2. Extraction des enzymes

6

1-Définition et principe

Le mot extraction est formé de deux mots d’origine latine : « ex » et « traction » qui

signifie tiré à l’extérieur. On peut dire que le mot extraction désigne l’action de séparer une

substance quelconque du composé dont elle fait partie (BRISSET, 2005).

Les méthodes d’extraction correspondent au transfert sélectif d’un soluté contenu dans

le milieu initial vers un second milieu dans le quel il est soluble en vue de son isolement

(BRISSET, 2005).

L’extraction consiste en la libération des enzymes des cellules ou constituants

cellulaires, nécessitant donc un éclatement de la paroi ou de la membrane cellulaire, par des

procédés mécaniques, physiques ou chimiques (LAURENT, 1982).

2-Critères de choix et préparation du matériel biologique de départ

Bien qu’il n'y ait aucune règle précise et rapide pour choisir le tissu et/ou l'organisme

pour l'isolement d'une enzyme, il est toujours préférable de choisir une source enrichie en

cette enzyme particulière, d’autres éléments sont à prendre en considération (KUMAR et

GARG, 2006):

vérifier si l'enzyme est produite universellement (chez les animaux, les plantes aussi

bien que des micro-organismes) ou confiné à un royaume particulier ;

dans le cas ou l’enzyme visée est universellement produite, choisir une enzyme

microbienne ou animale de préférence, car il est plus facile de travailler sur ce type de

matériel biologique comparativement aux végétaux, puisque les plantes sont généralement

riches en composés phénoliques, qui sont convertis en quinones au contact de l'air, ces

quinones se lient avec la protéine enzymatique pour la rendre inactive ;

pour le tissu animal, on devra sacrifier l'animal dans le laboratoire ou apporter le tissu

d'un abattoir ;

dans le cas des micro-organismes, on devra les accroîtront dans un milieu approprié

de croissance dans des conditions aseptiques ;

3-Méthodes d’extraction

3-1 Méthode physique

Choc osmotique

Le choc osmotique permet de briser certaines cellules fragiles avec un minimum de

dommages. Les cellules sont incubées dans une solution hypo-osmotique. Cherchant à rétablir

l’équilibre osmotique, l’eau pénètre dans la cellule et finit par causer une rupture de la

membrane plasmique (LEBLANC, 2013).


7

3-2 Méthodes mécaniques

Congélation-décongélation

Suite à un refroidissement brusque et à la concentration du soluté intra et

extracellulaire, la formation de cristaux intra et extracellulaires entraîne des cassures dans la

cellule (LAURENT, 1982).

Broyage ou agitation avec des abrasifs

L’agitation violente en présence de microbilles de verre désintègre les

microorganismes avec rupture de la paroi (LAURENT, 1982).

Bombe à disruption

Elle consiste en une chambre pressurisée dans laquelle les cellules sont traitées avec

de l'azote à haute pression. La pression force l'azote à se solubiliser dans les liquides. On

libère alors la pression tout d'un coup; l'azote en solution reprend son état gazeux, forme des

bulles à l'intérieur des cellules et les fait éclater (LEBLANC, 2013).

Homogénéisateur d'Elvejm de potier

Elle est considérée comme une technique douce et est généralement employée pour

l'homogénéisation des tissus mous tels que les tissus animaux.

L’homogénéisateur d'Elvejm de potier est un équipement simple ayant un pilon sous

forme de tige de verre avec des dents sur son bout. La manipulation du pilon se fait

manuellement ou par dispositif mécanique (KUMAR et GARG, 2006).

Les billes de verre

L’appareil utilisé pour cette technique ressemble à un blinder, à ceci près qu’il est

beaucoup plus petit et ne contient pas de lames. Son contenant amovible est rempli de petites

billes en verre sur lesquelles on verse la suspension de cellules. La suspension se répartit entre

les billes. Il est important de remplir complètement le contenant et de ne pas y laisser d’air

pour éviter de faire de la mousse et d’oxyder les protéines. Le tout est alors scellé et on lance

la machine, qui fait furieusement tourbillonner les billes de verre dont l’action abrasive fait de

dégrader les cellules (LEBLANC, 2013).

Séparer les billes du lysat est très facile parce que les billes coulent au fond dès que

l'agitation cesse. On doit prendre soin de garder le tout au frais; le contenant est souvent nanti

d’une chambre où on installe de la glace. Le mouvement des billes génère en effet beaucoup

de chaleur (Figure 2) (LEBLANC, 2013).


8

Figure 2. Schéma représentant l’appareil utilisé dans l’extraction par billes de verre

(LEBLANC, 2013).

Sonication

L’application des ultrasons dans un liquide crée le phénomène connu sous le nom de

cavitation. Des aires de compression et raréfaction apparaissent, et les cavités s’effondrent

rapidement. Les bulles produites dans les cavités sont compressées à plusieurs centaines

d’atmosphère. Ces chocs constituent les éléments de destruction des tissus cellulaires : tout

d’abord, une attaque de la structure cellulaire, puis une lyse (LAURENT, 1982).

L’efficacité de cette technique est liée à des paramètres tels que le pH, la température

et la force ionique du milieu de suspension, ainsi que du temps d’exposition aux ultrasons.

(LAURENT, 1982).

3-3 Extraction chimique

Cette technique, l’une des plus utilisées en industrie, consiste à mélanger le produit en

solution aqueuse avec un petit volume de solvant organique dans lequel il est très soluble. On

agite ensuite vigoureusement le mélange pour permettre au produit de se déplacer de la phase

aqueuse vers la phase organique, puis on récupère celle-ci. Le choix du solvant est

déterminant dans l’efficacité de l’extraction. Il repose sur plusieurs critères (TESSIER,

2007) :

la solubilité du produit dans la phase organique par rapport à la phase aqueuse

(coefficient de partage) ;

la stabilité du produit dans la phase organique ;

la sélectivité du solvant (faible solubilité des impuretés).


9

Après l’extraction, les phases sont séparées, dans le cas des protéines qui ne sont pas

solubles ou sont déstabilisées dans des solvants organiques, on peut les extraire en créant

deux ou plusieurs phases aqueuses séparables, à l’aide de polymères hydrophiles comme le

ployéthylèneglycol (PEG) et le dextrane (TESSIER, 2007).

3-4 Enzymes lytiques

Avec les levures, les plantes, les bactéries, il faut tenir compte de la paroi cellulaire qui

protège la membrane plasmique. Pour ceci les enzymes lytiques comme les cellulases,

pectinases, xylanases, protéases, etc., peuvent être employées pour rompre les parois de ces

cellules (KUMAR et GARG, 2006).

3-5 Extraction liquide-liquide

C’est une opération qui consiste à extraire un ou plusieurs constituants d’une solution A

(solvant initial) au contact d’un solvant liquide B (solvant d’extraction) pour lequel le ou les

constituants à isoler ont une grande affinité par rapport au liquide initial. Les deux solvants A

et B sont non miscibles. L’extraction liquide-liquide est aussi nommée extraction par solvant.

(BRISSET, 2005).

3-6 Extraction liquide-solide

Ce procédé d’extraction est de plus en plus utilisé. Une extraction liquide-solide se

déroule en deux étapes. Une première étape consiste en un passage d’un soluté (ou de solutés)

d’un milieu liquide à un milieu solide, ce dernier ayant pour finalité de retenir ce (ou ces)

soluté (s). La seconde étape consiste en une élution du soluté d’intérêt, par un solvant

approprié, permettant de rompre les interactions soluté-matrice de la phase solide. La

« fixation » du soluté doit donc être réversible. Les relations entre la phase solide et les

solutés sont des interactions de type Van der Waals, électrostatiques, ou de type liaisons

hydrogène (BRISSET, 2005).


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1. Définition

La purification est un ensemble d’opérations visant à enlever toutes les impuretés

d’un extrait brut contenant l’enzyme d’intérêt. En principe, n'importe quelle méthode destinée

au fractionnement de protéines peut être employée pour la purification d'enzymes

(ILLANES, 2008).

La purification d’une protéine donnée passe par l’étude de différents critères la

caractérisant, et permettant de la séparer des autres molécules (taille, forme, charge…)

(CEZARD, 2009).

2. Objectifs de la purification des enzymes

Alors, la purification des enzymes a comme objectifs essentiels d’avoir (HAINQUE et

al., 2008 ; CEZARD, 2009):

Un maximum du rendement de l’enzyme ;

Un maximum de pureté possible ;

Un maximum de son activité catalytique.

3. Méthodes de purification des enzymes

Les méthodes sont celle utilisées dans la purification des protéines. On peut désigner les

différentes méthodes en fonction de leur propriété générale de purification (CEZARD, 2009):

Méthodes basées sur les différences de solubilité.

Méthodes basées sur la taille des molécules.

Méthodes basées sur les propriétés ioniques.

3.1. Méthode basée sur les différences de solubilité

3.1.1 Précipitation

Les techniques de précipitation consistent à rendre une protéine insoluble dans un solvant

donné. Cette solubilité dépend de l’hydratation de ces protéines, de leur structures et leur PH.

(CEZARD, 2009).

Précipitation différentielle au sulfate d’ammonium [(NH4)2SO4]

La précipitation différentielle est une technique plus douce qui préserve en générale la

structure, et donc la fonction des protéines (peu dénaturante, elle n’altère pas non plus

l’activité des éventuelles enzymes (CEZARD, 2009).


11

Le sulfate d’ammonium (SA) est utilisé comme un sel favorisant la précipitation : c’est un

sel très soluble dans l’eau, permettant d’atteindre des forces ioniques très élevées (CEZARD,

2009).

L’addition du sulfate d’ammonium à une solution protéique provoque une déshydratation

et précipitation des protéines, induisant ainsi le phénomène de relargage (l’avantage du

relargage est que les protéines conservent leur conformation native et peuvent être dissoutes

sans dénaturation) (ABDELLAOUI, 2007).

Les ions sulfates et ammonium sont petits et neutralisent efficacement les charges des

protéines. Cette méthode devra être suivie d’un lavage pour éliminer le sel résiduel (en

général par dialyse, gel de filtration) (CEZARD, 2009) (Figure 3).

Figure 3. Précipitation au sulfate d’ammonium (WENK et FERNANDIS, 2007).

3.2. Méthodes basées sur la taille des molécules

3.2.1 Dialyse

La dialyse permet de séparer des substances en utilisant leur capacité respective à

franchir les pores d’une membrane semi-perméable appelée membrane de dialyse. Les

membranes de dialyse utilisées se présentent sous forme de cylindres allongés qu’il faut

fermer aux deux extrémités et qui contiennent le liquide à dialyser. Ce cylindre prend alors le

nom de « boudin » de dialyse. Il est placé dans un récipient contenant le liquide contre lequel

s’effectue la dialyse ou liquide de contre-dialyse (Figure 4) (HAINQUE et al., 2008).

Bécher

Lysat

Glace

Récipient

Barreau magnétique

Agitateur


12

Figure 4. schéma générale d’une dialyse (HAINQUE et al., 2008).

3.2.2. Centrifugation

La centrifugation est une méthode permettant de séparer les constituants d’un mélange

sur la base de leur différence de densité dans un solvant (HAINQUE et al., 2008).

Dans cette méthode, les molécules de protéine sont soumises aux forces (centrifuges)

de la gravité (les molécules de protéine sont des macromolécules) (NITIN et al., 2007).

En effet, si la particule a une densité plus élevée que le fluide en lequel elle est

immergée, elle tend à émigrer en bas, suivant la direction de force de pesanteur

(MIKKELSEN et CORTON, 2004).

Ce déplacement des particules dans le sens de la force centrifuge est dénommé

sédimentations ; lorsque les particules en suspension dans leurs solvant sont ainsi placées

dans le rotor d’une centrifugeuse, la mise en œuvre de la centrifugation génère une

accélération qui pousse les particules vers l’extérieur du rotor, donc vers le fond du tube de

centrifugation. La vitesse à laquelle se déplacent les particules est proportionnelle à

(HAINQUE et al., 2008):

la force gravitationnelle à laquelle les particules sont soumises (dans le cas d’une

simple sédimentation, cette force est due à la seule pesanteur) ;

la masse des particules ;

la différence entre la densité des particules et celle du solvant.

3.2.3 Filtration membranaire

La filtration est l’opération qui consiste à séparer les particules solides qui se trouvent en

suspension dans un liquide par une membrane, tout en limitant son colmatage pour obtenir un

Dialysant

(Les molécules de grandes

tailles, protéines par exemple,

restent dans le boudin de dialyse)

Contre – dialyse

(Les petites molécules contenues

dans le boudin sortent du sac de

dialyse vers le liquide de contre

–dialyse)


13

fonctionnement stable (HAINQUE et al., 2008). On distingue deux types de procédés, la

filtration tangentielle et la filtration frontale (JAFFRIN, 2014).

Filtration tangentielle

Le fluide circule parallèlement à la membrane à partir d’un réservoir sous l’action d’une

pompe. Seule une partie, le perméat, traverse les pores de la membrane par l’effet d’une

différence de pression (pression transmembranaire, Ptm) tandis que le reste (retentât) est

évacué ou recyclé sur le réservoir. Les pores de la membrane vont arrêter les macromolécules

et les particules de taille supérieure, tandis que les microsolutés (molécules et particules plus

petites que les pores) passeront dans le perméat (JAFFRIN, 2014).

Filtration frontale

Dans ce cas, le fluide est forcé de traverser la membrane placée perpendiculairement à

l’écoulement et la concentration du retentât augmente rapidement. Ce système est surtout

employé avec des fluides dilués et le colmatage de la membrane est plus rapide qu’en

filtration tangentielle (JAFFRIN, 2014).

3.3. Méthodes basées sur les propriétés ioniques

3.3.1 Chromatographie

Définition

La chromatographie est la plus importante de toutes les méthodes de purification. Bien

que ce soit la technique qui trouve l'applicabilité la plus large, la chromatographie est une

méthode relativement simple de séparation du composé désiré de ses impuretés, ou d'isoler

différents composants d'un mélange (BUDHIRAJA, 2004). Elle sert en analyse pour

identifier et qualifier des composés au sein d’échantillons divers. (FRANCIS et ANNIK

ROUESSAC, 2004). Les méthodes chromatographique sont des méthodes mettant en jeu

différents processus physicochimiques (GWENOLA et JEAN-LOUIS BURGOT, 2011).

Principe

La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différentes

affinités d’un (des) composé (s) à l’égard de deux phases (BOURGUET et AUGE, 2008).

L’une, dite stationnaire, est emprisonné dans une colonne ou fixé sur un support et l’autre,

dite mobile, se déplace au contact de la première. (FRANCIS et ANNIK ROUESSAC,

2004).

L’échantillon est entrainé par la phase mobile à travers la phase stationnaire qui a

tendance à retenir plus ou moins les composés de l’échantillon à l’aide d’interactions comme

les forces de van der waals ou les liaisons hydrogène. Une fois la phase stationnaire traversée,

les composés sont élués. Les différents composants de l’échantillon ont généralement une


14

affinité différente pour l’une et l’autre des deux phases. Il en résulte une différence de vitesse

de progressions des produits et donc l’élution. Ceci permet de les séparer les uns des autres

voire de les identifier. Cette vitesse de séparation est fortement dépendante de la nature des

phases mobile et stationnaire (BOURGUET et AUGE, 2008).

Types de chromatographie

Chromatographie par adsorption

La phase solide est constituée d’une résine adsorbante qui fixe, faiblement et de façon non

spécifique, certains composés en solution par l’entremise de liaisons de van der waals

lorsqu’on charge la colonne, la phase mobile (l’éluant est généralement un solvant) modifie

ensuite les propriétés de la résine, ce qui force la désorption des composés qui y étaient

adsorbés et permet leur séparation au cours de l’élution (TESSIER, 2007).

Chromatographie par échange d’ions

Dans une chromatographie d’échange d’ions, les protéines sont séparées sur la base de

leur charge électrique globale. Dans une chromatographie échangeuse d’anions, une colonne

contenant des billes chargées positivement est utilisée pour fixer des protéines ayant une

charge électrique globale négative alors que dans une chromatographie d’échange de cations,

des billes chargées négativement sont utilisées pour lier des protéines à charge électrique

globale positive. Les protéines liées sont ensuite éluées en ajoutant une solution de chlorure

de sodium ou en modifiant le pH du tampon (HAMES al., et 2000) (Figure 5).

Figure 5. Chromatographie par échange d’ion (WENK et FERNANDIS, 2007).

Molécule chargé positivement

Molécule positivement chargée

Molécule négativement chargée

Molécule moins chargée

Solvant


15

Chromatographie de partage

Fonctionne par partage de solutés entre deux phases non miscibles ; l’une mobile et l’autre

stationnaire. Plus la répartition des composés d’un mélange dans la phase stationnaire est

grande plus leur rétention est grande et inversement. L’affinité de chaque constituant pour la

phase stationnaire dépend de sa solubilité dans cette phase et de sa polarité (KABOUCHE,

2007).

Chromatographie d’exclusion

La phase stationnaire est un gel ou un réseau macromoléculaire exerçant un véritable effet

de tamis vis-à-vis de grosses molécules, celles-ci migrant plus vite que les molécules de plus

faible poids moléculaire qui elles peuvent diffuser librement dans la phase stationnaire alors

que les premières ne le peuvent pas (GWENOLA et JEAN-LOUIS BURGOT, 2011).

Chromatographie d’affinité

On utilise ici une interaction plus spécifique pour obtenir une séparation, en mettant à

profit un système biologique du type antigène-anticorps, enzyme-inhibiteur ou autre. Un

ligand ayant la propriété de fixer spécifiquement une molécule ou un groupe de molécules est

lié de façon covalente à la phase solide. Ainsi, au moment du chargement de la colonne, les

composés qui ont une affinité pour le ligand sont fixés alors que les impuretés sont éliminées.

Par la suite, les composés sont élués avec un solvant dont les caractéristiques chimiques

favorisent leur dissociation d’avec le ligand (TESSIER, 2007) (Figure 6).

Figure 6. Chromatographie d’affinité (WENK et FERNANDIS, 2007).

Protéine liée

Molécule avec la protéine

d’affinité attachée

Protéine non liée

Solvant


16

3.3.2 L’électrophorèse

L’électrophorèse est une technique extrêmement puissante pour séparer les protéines.

Elle a de nombreuses applications. Elle permet, entre autre, de vérifier la pureté des solutions

obtenues par les techniques précédentes (CEZARD, 2009).

Elle est basée sur le principe de la mise en mouvement différentiel. Des particules

chargées sont donc placées dans un champ électrique crée par une tension continue et se

déplacent vers le pôle de signe opposé à leur charge à une vitesse proportionnelle à cette

charge. Si on dépose une espèce anionique (chargée négativement) elle migrera vers l’anode

(+) et une espèce cationique (chargée positivement) migrera du côté de la cathode (─)

(BOURGUET et AUGE, 2008).

Conclusion

17

Notre travail avait pour but de mettre en évidence les différentes méthodes

d’extraction et de purification des enzymes, notamment celles utilisées en industrie agro-

alimentaire.

Ce sont ses caractéristiques intrinsèques de l’enzyme cible, qui permettront de la séparer de

ses congénères cellulaires. Une protéine a une masse, une forme, des structures primaire,

secondaire, tertiaire et peut-être quaternaire; elle a une certaine charge à un pH donné, elle

présente une certaine densité; elle possède un certain degré d’hydrophilicité ou

d'hydrophobicité. Elle peut avoir des isoformes. Elle se retrouve peut-être dans une certaine

région de la cellule ou dans une organelle donnée. Tous ces critères peuvent être utilisés dans

le choix de la stratégie de purification.

Une bonne stratégie d’obtention d’une enzyme dans les meilleures conditions possibles

comportera donc le bon choix du matériel biologique de départ, le choix des techniques

d’extraction les plus adaptées à ce dernier et les techniques de séparation et de purification

adéquates aux propriétés physico-chimiques de l’enzyme.

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Science

extraction et purification des enzymes