Quantifier les Microorganismes

Méthodes

• Mesure de turbidité• Comptes viables• Nombre le plus probable• Comptes directs

Nombre le Plus probable: NPP

– Fondé sur les statistiques de probabilités– Test présomptif fondé sur des caractéristiques

données– Technique en bouillon

Nombre le Plus Probable (NPP)

• Commencer avec un bouillon qui permet de déceler les caractéristiques désirées

• Inoculer differentes dilutions de l’échantillon à être testé dans chacun de 3 tubes

-1 -2 -3 -4 -5 -6Dilution

3 Tubes/Dilution

1 ml de chaque dilution dans chaque tube

Après une période d’incubation approprié, enregistrer les TUBES POSITIFS (qui ont de la croissance et les caractéristiques désirées)

NPP- Suite• L’objectif est de DILUÉ l’organisme à zero• Après l’incubation, le nombre de tubes qui démontre les

caractéristiques désirées sont enregistré– Exemple de résultats pour une suspension de 1g/10 ml de terre

• Dilutions: -1 -2 -3 -4 -5 -6• Tubes positifs: 3 3 2 1 0 0

NTP /(mL)ou NPP/(g)

P : Nombre de tubes positifs

N : Quantité totale en (g) ou (ml) d’échantillon dans tous les tubes négatifs

T : Quantité totale en (g) ou (ml) d’échantillon dans tous les tubes

NPP

• Calcul– Dilutions: -1 -2 -3 -4 -5 -6– Tubes positifs: 3 3 2 1 0 0

• P = 9• N = (3 X (0,1 X 10-5) + (3 X (0,1 X 10-6) • T= (3 X (0,1 X 10-1) + (3 X (0,1 X 10-2) + … (3 X (0,1 X 10-6)

NTP /(mL)ou NPP/(g) = 9/0,001 = 9 000 bactéries/g

Comptes Directes

• L’échantillon à être énuméré est appliqué sur une lame d’hémacytomètre qui retient un volume fixe dans une chambre de comptage

• Le nombre de cellules est compté• Le nombre de cellules dans le volume donné

est déterminé

Déterminer le Compte Direct

8

• Compter le nombre de cellules dans trois carrés indépendants– 8, 8 et 5

• Déterminer la moyenne– (8 + 8 + 5)/3 =7– Donc 7 cellules/carré

Déterminer le Compte Direct (suite)

9

• Calculer le volume d’un carré:= 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X 10-4cm3 ou ml

• Diviser le nombre moyen de cellules par le volume d’un carré– Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 104 cellules/ml

1mm

1mmDepth: 0.1mm

Problème

• Un échantillon de 500μl est appliqué à une lame d’hémacytomètre avec les dimensions suivantes: 0.1mm X 0.1mm X 0.02mm. Des comptes de 6, 4 et 2 cellules ont été faits dans trois carrés indépendants. Quelle était le nombre de cellules par millilitre dans l’échantillon original si la cellule de comptage possède 100 carrés?

Microscopie

Colorations Différentielles

Coloration de Gram

• Divise les bactéries en deux groupes

• Gram Négatives & Gram Positives

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• Colorées Mauves– Bacille

• Genres: Bacillus et Clostridium– Coccus

• Genres: Streptococcus, Staphylococcus et Micrococcus

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• Colorées Rouges– Bacille:

• Genres: Escherichia, Salmonella, Proteus, etc.

– Coccus: • Genres: Neisseria, Moraxella et Acinetobacter

14

Paroi Cellulaire

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ParoiPeptidoglycane

MembranePlasmique

Couche deLipopolysaccharide

Absente

Gram + Vs Gram -

Méthode - Coloration Primaire

1. Coloration avec le cristal violet2. Ajout d’iode de Gram (Mordant)

+

Gram positif Gram Négatif - - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique - - - - - - - - - - - - - - -

Paroi :peptidoglycane LPS

Méthode - Étape Différentielle

3. Lavage à alcool

Gram positif Gram Négatif - - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique - - - - - - - - - - - - - - -

Paroi :peptidoglycane LPS

+ + + + + + + + + + + + + +

Paroi est déshydratée – Complex colorant + iode est piégé

Paroi n’est pas déshydratée – Complex n’est pas piégé

Méthode - Contre Coloration

4. Coloration avec la Safranine

Gram positif Gram Négatif - - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique - - - - - - - - - - - - - - -

Paroi :peptidoglycane LPS

+ + + + + + +

+

+ + + + + + + + + + + + + +

18

Sommaire

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Fixation

Coloration primaireViolet de cristal

Contre colorationSafranine

LavageDécoloration

Coloration Acido-Alcoolo-Résistante

• Coloration diagnostique de Mycobactérium– Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre– Paroi cellulaire avec acide mycoïque

20

Méthode

• Principe: – Contenu élevé de composés similaires aux cires

dans la paroi cellulaire, Acide Mycoïque, rend ces bactéries très résistantes aux colorants

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Méthode (Suite)

• La paroi est rendue perméable par la chaleur• Coloration avec de la fuchsine basique

– Refroidissement retourne la paroi à son état imperméable

• Colorant est piégé

• Lavage avec de l’alcool acide– Étape différentielle

• Mycobactéries retiennent le colorant• Autres bactéries perdent le colorant

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Coloration de Spores

• Spores:– Cellule bactérienne différentiée– Résistante à la chaleur, la déshydratation, les

ultraviolets, et différents traitements chimiques– Typique des bacilles Gram positifs

• Genres Bacillus et Clostridium– Conditions défavorables induisent la sporogénèse

• Différenciation de cellule végétative à l’endospore

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Coloration au Vert de Malachite

• Perméabilisation des spores par la chaleur• Coloration primaire au vert de malachite• Lavage• Contre coloration à la safranine 24

Cellules végétatives

Spores

Endospore

Sporangium

Les Pathogènes

19e Siècle- Robert Koch

• Étudie la maladie de l’anthrax qui tue le bétail• Fait croître la bactérie à partir du sang

d’animaux malades en culture pure– Bacillus anthracis

• Observations:– Le sang d’animaux malades transmet la maladie– Le microorganisme se retrouve seulement chez les

animaux malades– Le microorganisme crû en laboratoire transmet la

maladie aux animaux sains26

Robert Koch (suite)

• Conclusion: Les microorganismes sont responsables des maladies– Les pathogènes

• Ces résultats mènent Robert Koch à élaborer des lignes directrices pour l’association d’un microorganisme à une maladie– Les postulats de Koch

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Postulats de Koch

• Le microorganisme doit être présent dans chaque cas de maladie, mais absent des organismes sains

• Le microorganisme suspect doit être isolé et cultivé en culture pure

• La maladie doit se développer quand le microorganisme isolé est inoculé dans un hôte sain

• Le même microorganisme doit être isolé à nouveau de l’hôte malade

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