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Compter des Microorganismes
Méthodes
• Comptes viables• Nombre le plus probable• Comptes directs
Nombre le Plus probable: NPP
– Fondé sur les statistiques de probabilités– Test présomptif fondé sur des caractéristiques
données– Technique en bouillon
Nombre le Plus Probable (NPP)
• Commencer avec un bouillon pour déceler les caractéristiques désirées
• Inoculer differentes dilutions de l’échantillon à être testé dans chacun de 3 tubes
-1 -2 -3 -4 -5 -6Dilution
3 Tubes/Dilution
1 ml de chaque Dilution dans chaque Tube
Après une période d’incubation approprié, enregistrer les TUBES POSITIFS (qui ont de la croissance et les caractéristiques désirées)
NPP- Suite• Les résultats
– -1 -2 -3 -4 -5 -6– 3 3 2 1 0 0 - No de tubes (+)
• Objectif est de DILUÉ à zero l’organisme• Choisir la série la moins dilué qui sont tous négatifs
– Dans cet exemple (-5)• Obtenir les résultats des 3 dilutions précédente
– Dans cet exemple (-2, -3, et -4)– Determiner le nombre de tubes positifs pour chacune
de ces dilutions• Dans cet exemple (3, 2, 1 respectivement)
• Determiner le NPP sur le tableau de NPP
NPP = 1.5 UFC/ml pour la dilution 10-3
NPP
• Calculs– Si 3, 2,1 Donc le résultat est: 1.5/ml or g– Puisque ceci est une estimé pour la dilution de 10-3
nous devons multiplier par 1 000– Notre résultat
• 1.5 UFC/g ou ml• 1.5 x 103 UFC/g ou ml
Comptes Directes
• L’échantillon à être énuméré est appliqué sur une lame d’hémacytomètre qui retient un volume fixe dans une chambre de comptage
• Le nombre de cellules est compté• Le nombre de cellules dans le volume donné
est déterminé
Comptes sur Hémacytomètre
• Cette lame possède 2 cellules de comptages indépendantes, chacune d’un volume de 0.1 mm3 quand elles sont recouverte d’une lamelle
Application à la Lame d’Hémacytomètre
• Remplir la cellule avec la suspension a être compté
• Laisser la cellule se remplir par capillarité
• Ne pas forcer le remplissage avec de la pression
Lamelle
Déterminer le Compte Direct
11
• Compter le nombre de cellules dans trois carrés indépendants– 8, 8 et 5
• Déterminer la moyenne– (8 + 8 + 5)/3 =7– Donc 7 cellules/carré
Déterminer le Compte Direct (suite)
12
• Calculer le volume d’un carré:= 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X 10-4cm3 ou ml
• Diviser le nombre moyen de cellules par le volume d’un carré– Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 104 cellules/ml
1mm
1mmDepth: 0.1mm
•Avantages:– Rapide– Culture pas nécessaire– Aucune info préalable nécessaire
• Limitations:– Ne distingue pas vivant de mort– Difficile de distinguer bactéries de détritus
Problème
• Un échantillon de 500μl est appliqué à une lame d’hémacytomètre avec les dimensions suivantes: 0.1mm X 0.1mm X 0.02mm. Des comptes de 6, 4 et 2 cellules ont été faits dans trois carrés indépendants. Quelle était le nombre de cellules par millilitre dans l’échantillon original si la cellule de comptage possède 100 carrés?
Microscopie
Colorations
Coloration Différentielle Coloration de Gram
Divise les bactéries en deux groupesGram Négatives & Gram Positives
Gram Positives
• Colorées Bleu – Bacille
• Genres Bacillus et Clostridium– Coccus
• Genres Streptococcus, Staphylococcus et Micrococcus
Gram Négatives
• Colorées Rouges– Bacille:
• Genres Escherichia, Salmonella, Proteus, etc.
– Coccus: • Genres Neisseria, Pneumococcus et Meningococcus
Paroi Cellulaire
19
ParoiPeptidoglycane
MembranePlasmique
Couche deLipopolysaccharide
Absente
Gram + Vs Gram -
Méthode - Coloration Primaire
1. Coloration avec le cristal violet2. Ajout d’iode de Gram (Mordant)
+
Gram positif Gram Négatif
- - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique - - - - - - - - - - - - - - - Paroi :peptidoglycane LPS
+ + + + + + + + + + + + + +
Méthode - Étape Différentielle
3. Lavage à alcool
Gram positif Gram Négatif
- - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique - - - - - - - - - - - - - - - Paroi :peptidoglycane LPS
+ + + + + + + + + + + + + +
Paroi est déshydratée – Complex colorant + iode est piégé
Paroi n’est pas déshydratée – Complex n’est pas piégé
Méthode - Contre Coloration
4. Coloration avec la Safranine
22Gram positif Gram Négatif
- - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique - - - - - - - - - - - - - - - Paroi :peptidoglycane LPS
+ + + + + + +
+
+ + + + + + + + + + + + + +
Sommaire
23
Fixation
Coloration primaireViolet de cristal
Contre colorationSafranine
LavageDécoloration
Coloration Acido-Alcoolo-Résistante
• Coloration diagnostique de Mycobactérium– Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre– Paroi cellulaire avec acide mycoïque
24
Méthode
• Principe: – Contenu élevé de composés similaires aux cires
dans la paroi cellulaire, Acide Mycoïque, rend ces bactéries très résistantes aux colorants
25
Méthode (Suite)
• La paroi est rendue perméable par la chaleur• Coloration avec de la fuchsine basique
– Refroidissement retourne la paroi à son état imperméable
• Colorant est piégé
• Lavage avec de l’alcool acide– Étape différentielle
• Mycobactéries retiennent le colorant• Autres bactéries perdent le colorant
26
Coloration de Spores
• Spores:– Cellule bactérienne différentiée– Résistante à la chaleur, la déshydratation, les
ultraviolets, et différents traitements chimiques– Typique des bacilles Gram positifs
• Genres Bacillus et Clostridium– Conditions défavorables induisent la sporogénèse
• Différenciation de cellule végétative à l’endospore
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Coloration au Vert de Malachite
• Perméabilisation des spores par la chaleur• Coloration primaire au vert de malachite• Lavage• Contre coloration à la safranine 28
Cellules végétatives
Spores
Endospore
Sporangium