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David TOUBOUL
CNRS
ICSN
Gif-sur-Yvette
Quelques outils et idées en
spectrométrie de masse assistée par
vos neurones et la bioinformatique
2
La problématique des « big data »
- Comment les générer ?
- Comment les stocker ?
- Comment les analyser ?
L’étude des systèmes biologiques conduit à la nécessité de gérer des
données de plus en plus conséquentes de données afin d’évaluer un plus
grand nombre de variables (pertinentes ou non).
Deux approches sont possibles et complémentaires:
- Approches ciblées (connaissance a priori de l’objet à étudier ou
hypothèses initiales plus ou moins crédibles)
- Approches non ciblées (génération de « big data »)
3
Un cas simple: la protéomique
Simple car:
- 20 acides aminés principaux
- Des modifications connus et facile à implémenter
- Des bases de données riches (mais avec des erreurs d’annotation aussi)
4
Un cas compliqué: la métabolomique
Pas plus de complexité qu’en protéomique en terme de nombre de molécules détectées
Mais plus compliqué d’interprétation car:
- un grand nombre de fonctions chimiques et de squelettes carbonés
- base de données incomplètes
5
Première étape: choisir sa stratégie !
Shotgun:
Rapide
MS haute résolution nécessaire
Suppression ionique
Difficile pour la quantification
Chromatographie-MS:
Long
Pas de méthode universelle
pour toutes les classes de
molécules
MS haute résolution nécessaire
Moins de suppression ionique
Plus facile pour la quantification
6
Première étape: choisir sa stratégie !
DOI: 10.1021/acs.analchem.5b04491
Anal. Chem. 2016, 88, 524−545
La physico-chimie au cœur du problème
MTBE: Méthyl tert-butyl éther
8
Shotgun: tout est dans la préparation de l’échantillon
DOI: 10.1021/acs.analchem.5b04491
Anal. Chem. 2016, 88, 524−545
9
Chromatographie: un vaste choix …
DOI: 10.1021/acs.analchem.5b04491
Anal. Chem. 2016, 88, 524−545 ! Ne pas négliger la GC-MS !
10
Chromatographie: un vaste choix …
11
Source d’ionisation et polarité
12
Impact électronique
M + e- M+. + 2 e-
vers
l’analyseur
ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ
V0
anode
(trappe)
repousseur
molécules
électrons
ions
70 V filament
+
+ +
+ +
13
Impact électronique
L’énergie d’ionisation dépend des électrons de la HOMO:
Type d’orbitale: s, p, n
Électronégativité de l’atome porteur
Et de la stabilité de l’ion formé
14
Impact électronique
15
Impact électronique
CO
H
R
O
Acide gras
+ CH3
OHKOH
BF3C
OR
O CH3
Ester méthylique
CO
H
R
O
Acide gras
+ MTBSTFAC
O
R
O Si C
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
1H, 60°C
t-BDMCS
Dérivé t-BDMS
N-Methyl-N-[tert-
butyldimethylsilyl]
trifluoroacetimide
Silylation
Esterification
16
Un spectre impact électronique 70 eV
CH2OH
NO2
M+• : m/z 153
M +•
-OH
-NO2
-HCO
-CH2O
-C2H2
-H2O
-NO
Impact électronique
17
Banque de données en IE
Scheubert et al. Journal of Cheminformatics 2013, 5:12
18
GC-IE-MS
Un outil extrêmement robuste et fiable pour la métabolomique mais un accès
restreint au métabolome …
19
GC-IE-HRMS
20
Ionisation chimique
Première étape: Ionisation d’un gaz réactif (exemple: l’ammoniac):
NH3 + e- → NH3+. + 2 e-
NH3+. + NH3 → NH4
+ + NH2.
Deuxième étape: protonation de la molécule M par l'ion ammonium
M + NH4+ → (M …..H….. NH3)
+ → MH+ + NH3
m/z 18 m/z M+18 m/z M+1
Lorsque l'on utilise un gaz réactif GH+, la réaction qui se produit avec la molécule M peut s'écrire de la façon suivante:
M + GH+ → MH+ + G
GH+ → G + H+ ΔH°(G) = AP(G)
MH+ → M + H+ ΔH°(M) = AP(M)
Les enthalpies de ces deux réactions s'appellent "affinités protoniques" (respectivement du gaz et de la molécule à analyser); elles correspondent au terme enthalpique de la basicité en phase gazeuse.
La réaction de protonation a lieu lorsque AP(G )< AP(M)
Concrètement, on choisira un gaz réactif adapté à la molécule étudiée (de plus faible AP), en général dans le but de limiter les phénomènes de fragmentation.
21
Ionisation chimique
NH3 CH4 H2O isobutane
22
Un spectre IC positive
CH2OH
NO2
MH+ : m/z 154
MH+
-H2O
Ionisation chimique
23
Source à pression atmosphérique
24
Une vue non globale du métabolome
Phase A: n-heptane/ethyl acetate (99.8:0.2, v/v),
Phase B : acetone/ethyl acetate (2:1; v/v) +0.02% acetic acid,
Phase C : propan-2-ol/water (85:15, v/v) + 0.05% acetic acid and ethanolamine.
Imbert L, Gaudin M, Libong D, Touboul D, Abreu S, Loiseau PM, Laprévote O, Chaminade P.
J Chromatogr A. 2012 Jun 15;1242:75-83.
25
Une vue non globale du métabolome
Imbert L, Gaudin M, Libong D, Touboul D, Abreu S, Loiseau PM, Laprévote O, Chaminade P.
J Chromatogr A. 2012 Jun 15;1242:75-83.
26
Une vue non globale du métabolome
0 2 4 6 8 10
0
1
2
3
4
5
6
7
Inte
nsity (
x1
0-4)
Retention time (min)
Fig 1 : Positive ESI UPLC-MS lipid profile of a control brain sample
PC, PE, SM, Cer, GalCer
LPC, LPE
ESI+
TOF-MS
Fig 2 : Negative ESI UPLC-MS lipid profile of a control brain sample
0 2 4 6 8 10
0
1
2
3
4
Inte
nsity (
x1
0-6)
Retention time (min)
FFA
PE, PG, PI,
Cer, GalCer, ST,
ESI-
TOF-MS
Solvent A : H2O/ACN 60/40 + 10 mM AcONH4
Solvent B : ACN/iPrOH 50/50 + 10 mM AcONH4
27
Le spectromètre de masse
- Résolution spectrale
- Résolution chromatographique
- Résolution en masse
28
Le spectromètre de masse
Il est donc impératif de bien étalonner un spectromètre de
masse pour obtenir des mesures en haute précision en
masse (HRMS)!!!
29
Le spectromètre de masse
Élément Isotope Masse isotopique Rapport isotopique
H 1 1,00782503207 0,999885
2 2,0141017778 0,000115
C 12 12,0000000000 0,9893
13 13,0033548378 0,0107
N 14 14,0030740048 0,99636
15 15,0001088982 0,00364
0 16 15,99491461956 0,99757
17 16,99913170 0,00038
18 17,9991610 0,00205
Défaut de masse!
30
Le spectromètre de masse
Élément Isotope Masse isotopique Rapport isotopique
Cl 35 34.96885268 0.7576
37 36.96590259 0.2424
Br 79 78.9183371 0.5069
81 80.9162906 0.4931
Pt 190 189.959932 0.00014
192 191.9610380 0.00782
194 193.9626803 0.32967
195 194.9647911 0.33832
196 195.9649515 0.25242
198 197.967893 0.07163
31
Le spectromètre de masse
- Basse résolution: quadripôle / trappe ionique (2D ou 3D)
- Haute résolution: TOF, Orbitrap, FT-ICR
- Et toutes les combinaisons de ces techniques !
Un seul impératif: il faut que le spectromètre de masse ait
une vitesse de scan compatible avec le système
chromatographique (identification versus quantification)
33
Workflow en métabolomique
doi:10.1038/nrd4510
34
Comparaison de deux populations: analyse
statistique univarié et multivarié
- Univariée: une seule variable comme observable
- Multivariée: prise en compte de tous les paramètres
35
Annotation de pics
36
Annotation de pics
37
Annotation de pics
38
Annotation de pics
Scheubert et al. Journal of
Cheminformatics 2013, 5:12
Banque de données
doi:10.1038/nrd4510
Banque de données
41
Comment identifier ?
- Spectrométrie de masse tandem (MS/MS, principalement CID
ou HCD pour les métabolites)
- Spectroscopie optique non destructive (UV-Vis, fluorescence…)
- Isolement et RMN
Scheubert et al.
Journal of
Cheminformatics
2013, 5:12
Quid des énergies de collision et de la
transposition des spectres MS/MS par collision ?
Mode d’acquisition des données
Mode d’acquisition des données
Méthode SWAT (Sciex)
Data-Dependant Acquisition (DDA)
Mode d’acquisition des données
47
DDA
20 s
50 s
MS 10 spectres/s MS/MS a maximum of 4 precursor ions per cycle
MS MS/MS MS/MS MS/MS MS/MS
100 ms 250 ms 250 ms 250 ms 250 ms
Total operating time: 1.2 s between 2 scans
Our condition in DDA mode:
10 s
until 16 spectra acquisitions in MSMS
until 8 spectra acquisitions in MSMS
48
DDA
- TiglOH
- iBuOH
Perte théo: 100,0524
Perte exp: 100,0554
Perte théo: 88,0524
Perte exp: 88,0516
MS-1 scan (100ms)
MS/MS-1 scan (250 ms)
49
Arbre décisionnel
DOI 10.1007/s11306-015-0882-8
50
Aide à l’identification des spectres MS/MS
51
Stratégies ???
52
Stratégies ???
Fragmentation in silico
Prédictions de structure
Arbre de fragmentation
57
Arbre de fragmentation
58
Un autre point de vue … la déréplication
Nat. Prod. Rep., 2015, 32, 779–810 |
59
Domaine en plein essor
doi:10.1038/nrd4510
Complexité et intérêt du vivant
61
Problématique
- Faire le tri entre le connu et l’inconnu
- Classer l’intérêt de l’inconnu
- Rapide et simple
62
Réseau moléculaire
Ce n’est, ni plus ni moins, qu’une manière
de classer des spectres de masse tandem
par homologie, donc assez similaire des
arbres de fragmentation sans décrire
réellement les voies de fragmentation!
Facteur de similarité
Similarité cosinus ou mesure cosinus
64
Facteur de similarité
65
Initialement …
pour l’analyse de séquences peptidiques
Mol. BioSyst., 2012, 8, 2535–2544
66
Initialement …
pour l’analyse de séquences peptidiques
67
Initialement …
pour l’analyse de séquences peptidiques
68
Initialement …
pour l’analyse de séquences peptidiques
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1203689109
69
Initialement …
pour l’analyse de séquences peptidiques
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1203689109
70
Initialement …
pour l’analyse de séquences peptidiques
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1203689109
71
Biofilms
The ISME Journal
(2015) 9, 2605–2619
72
Tous les pièges …
International Journal of Mass Spectrometry 377 (2015) 719–727
73
Cholestérol
74
Données redondantes …
75
Initialement …
pour l’analyse de séquences peptidiques
CO2
Subcritical
Subcritical Supercritical
Solid Liquid
Gas
Pre
ssu
re (
bar
)
Temperature (°C)
SFC versus LC
SFC 1260 Infinity (Agilent Technologies)
Q-TOF 6540 (Agilent Technologies)
SFC coupled to a Q-TOF mass spectrometer
Mass accuracy down to 2 ppm
High mass resolution :
20 000 - 40 000 at m/z 922
MS/MS capabilities
Degasser
Pumps
Sampler
Oven
Oven
UVPump
Pump
BPR
CO2
Q-TOF 6540 (Agilent technologies)
Pressure range
50 bar90-400 bar90-600 bar
10 bar
Isocratic Pump
SFC module
Caloratherm
Choice of the column
N° Polarité de la phase Colonne Fournisseur
1
apolaire
Octadécyle silane C18 Eclipse 150 * 2,1 mm et 1,8 µm de diamètre de particules
Agilent
2 Carbone graphite poreux HypercarbR 100 * 2,1 mm et 3 µm de diamètre de particules et 100 * 2,1 et 5µm de diamètre de particules
Thermo
3 Zirconium ZR carbon 150 * 2,1 mm et 3µm de diamètre de particules Supelco
4
Hybride
Torus 1-aminoanthracène (1-AA) 150 * 2,1 mm et 1,7 µm de diamètre de particules
Waters
5 Torus 2-picolylamine (2-PIC) 150 * 2,1 mm et 1,7 µm de diamètre de particules
Waters
6 Torus diéthylamine (DEA) 150 * 2,1 mm et 1,7 µm de diamètre de particules
Waters
7
Polaire
Pentafluorophényl (PFP) 150 * 2 mm et 3 µm de diamètre de particules
Agilent
8 Diphényl 250 * 2 mm et 3 µm de diamètre de particules Agilent
9 Ethyl pyridine (EP) 100 * 2,1 mm et 1,5 µm de diamètre de particules Agilent
10 Cyano (CN) 100 * 2,1 mm et 1,8 µm de diamètre de particules Agilent
11 Silanol (Rx sil) 150 * 4,6 mm et 5 µm de diamètre de particules et 100 * 2,1 mm et 1,8 µm de diamètre de particules
Agilent
Ester de jatrophane (σ = 0.0006 %)
EC50 CHIKV = 0.76 ± 0.14 μM/ SI = 208
Extrait AcOEt (Zypertex)
m = 30,4 g / σ = 6 %
EC90 CHIKV < 0.8 μg / mL
Euphorbia amygdaloïdes subsp semiperfoliata
Materiel végétal sec (m = 450 g) (LF-015)
10 Fractions (A-J)
Fraction I = 5,1 g EC90 CHIKV < 0.8 μg/mL
15 molécules isolées
Plusieurs étapes
chromatographiques (!)
Nothias-Scaglia, L.-F.; Dumontet, V.; Neyts, J.; Roussi, F.; Costa, J.; Leyssen, R.; Litaudon, M.; Paolini, J. Fitoterapia 2015, (in press). Nothias-Scaglia, L.-F.; Retailleau, P.; Paolini, J.; Neyts, J.; Dumontet, V.; Roussi, F.; Leyssen, P.; Costa, J.; Litaudon, -M. J. Nat. Prod. 2014, 77 (6), 1505–1512. Nothias-Scaglia, L.-F.; Gallard J.-F.; Dumontet V.; Roussi F.; Costa J. Bogdan I. I.; Paolini J.; Litaudon M. J. Nat. Prod. 2015 (accepted). Bourjot, M.; Delang, L.; Nguyen, V. H.; Neyts, J.; Guéritte, F.; Leyssen, P.; Litaudon, M. J. Nat. Prod. 2012. Nothias-Scaglia, L.-F.; Pannecouque, C.; Renucci, F.; Delang, L.; Neyts, J.; Roussi, F.; Costa, J.; Leyssen, P.; Litaudon, M.; Paolini, J. J. Nat. Prod. 2015.
Jatrohemiketal
Évaluation de phorboids commerciaux connus pour leurs activité anti-HIV
TPA EC50 CHIKV = 2.9 ± 0.3 nM
SI = 1965
P-12,13-DD EC50 CHIKV = 6.0 ± 0.9 nM
SI = 686
Prostratin EC50 CHIKV = 2.7 ± 1.2 μM
SI = 23
OH
OHO
HH
O OAc
1
4
6
20
12 13
H
OH
O
C13H27
OH
OHO
HH
O O
H
OH
O
C9H21
O
C9H21
OH
OHO
HH
OAc
H
OH
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse
Investigation d’Euphorbia amygdaloides subsp semiperfoliata
Investigation d’Euphorbia amygdaloides subsp semiperfoliata : Récolte n°2
E F G H J
65 % Heptane / 35 % Acétone Molybdate sulfurique
2.4 g
2.0 g
1.7 g
1.8 g
I
5.3 g
4.2 g
Extrait AcOEt
Extrait AcOEt (Zypertex)
m = 24,7 g / σ = 6.7 %
EC90 CHIKV < 0.8 μg / mL
10 Fractions (A-J)
EC90 CHIKV en μg/ml < 0,8 > 100 > 100 1,2 3,4 < 0,8 77
KB à 10 μg/ml en % d’inhibition
16 ± 13 %
0 % 0 % 0 % 51 ± 6
% 45 ± 15 %
0 %
Résultats validés comme CHIKV spécifiques par observation au microscope
Euphorbia amygdaloïdes subsp semiperfoliata
Materiel végétal sec (m = 370 g) (LF-023)
Analyse par SFC-MS/MS et génération de réseaux moléculaires.
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse
Prenols: diterpinoids
Analyses by LC with strong percentage of organics solvent 30 mL acétonitrile by one LC run
Dideoxyphorbol
Deoxyphorbol
Jatrophane
82
Collaboration with ICSN and University of Corte
Choice of the column
C18: 1 min
Torus 1-AA: 3 min
ZR carbon: 18 min
Si: 7 min
Hypercarb: 17 min
Hypercarb
Time (min) EtOH (%) 0 3 3 3
13 10 17 20 20 20 21 3 23 3
Flow rate: 1.5 mL/min
DDA analysis
20 s
50 s
to attribute a peak to a compound 5 at 10 MS/MS spectra are necessary
MS 10 spectres/s MS/MS a maximum of 4 precursor ions per cycle
MS MS/MS MS/MS MS/MS MS/MS
100 ms 250 ms 250 ms 250 ms 250 ms
Total operating time: 1.2 s between 2 scans
Our condition in DDA mode:
10 s
until 16 spectra acquisitions in MSMS
until 8 spectra acquisitions in MSMS
86
Energie de collision …
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000
20
40
60
80
100
671
611
83
Re
lative
in
ten
sity (
%)
Colission energy (eV)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000
1
2
3
4
5
551
491
299
281
253
Re
lative inte
nsity (
%)
Colission energy (eV)
DDA analysis
- TiglOH
- iBuOH
Perte théo: 100,0524 Perte exp: 100,0554
Perte théo: 88,0524 Perte exp: 88,0516
MS-1 scan (100ms)
MS/MS-1 scan (250 ms)
Choice of the column semiperfoliata
- TiglOH
- AcOH
- iBuOH
- BzOH
- PhAcOH (-180.0423)
- 3x AcOH (-180.0634)
Représentation des réseaux moléculaires (analyses SFC-qTOF) des fractions anti-CHIKV
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse par réseaux moléculaires MS/MS
480 650 820
m/z de l’ion précurseur
Représentation avec calque m/z
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse par réseaux moléculaires MS/MS
Ajout de spectres MS2 de références isolées de la même plante: - Esters de jatrophane du groupe A
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse par réseaux moléculaires MS/MS
Ajout de spectres MS2 de références isolées de la même plante: - Esters de jatrophane du groupe B
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse par réseaux moléculaires MS/MS
Molecular network
MS2 fingerprint d’ester de jatrophane du group A m/z 327, 309, 299, ... MS2 fingerprint d’ester de
jatrophane du group B m/z 313, 295, 285, ...
MS2 fingerprint m/z 313, 295, 285, ...
OH
OHO
HH
OiBu
12 13
1
4
6
20H
TiglO
Esters de deoxyphorbol ? Activité anti-CHIKV ?
MS2 fingerprint m/z 311, 293, 283, ... Autre type d’esters
de jatrophane ?
Molecular network
jatrophane ester A
Latex
Extraction totale
For example: Red arrow corresponding to ∆m = 42.011 uma (acetate group)
Jatrophane ester B
Représentation de la répartition par fraction
MS2 fingerprint d’ester de jatrophane du group B m/z 313, 295, 285, ...
MS2 fingerprint d’ester de jatrophane du group A m/z 327, 309, 299, ...
MS2 fingerprint m/z 311, 293, 283, ... Autre type d’esters
de jatrophane ?
Fraction H
Fraction I
Fraction G
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse par réseaux moléculaires MS/MS
MS2 fingerprint m/z 313, 295, 285, ...
Esters de deoxyphorbol ? Activité anti-CHIKV ?
Purification par SFC-semiprep, guidée par molecular networking MS/MS
m/z 523.266 C29H40O7
Fraction contenant groupe de jatrophane
inconnu
m/z 483.235 C26H36O7
m/z 521.251 C29H38O7
m/z 693.252 C35H42O13
m/z 717.279 C34H46O15
m/z 675.263 C34H46O15
Deuxième SFC-prep
OH
OHO
HH
OiBu
12 13
1
4
6
20H
TiglO
OH
OO
HH
OiBu
20H
TiglO
m/z 637.262 C33H42O11
UV 230 nm min
abs
min
int
abs
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse par réseaux moléculaires MS/MS
Grenoble 9 Avril 2015– David Touboul 97
Aetiology: Annonaceae
Environment: link with consumption of Annonaceae
Edible fruits (as Annona muricata)
Traditional medicine
High consumption for all patients
Neurotoxicity of acetogenins
Lipophilic polyketides
Highly cytotoxic
Strong inhibitors of mitochondrial complex I
Major safety concern for the FDA and ANSES
What about the football world cup in Brazil ???
Grenoble 9 Avril 2015– David Touboul 98
Classification
Types
Bermejo, Nat. Prod. Rep. 2005
+/- substitutions
Hydroxyls, ketones...
γ-methyl-γ-lactone
Polyoxygenated domain :
Tetrahydrofurans, epoxides...
32/34 ( )n (
)m
Structural diversity
Grenoble 9 Avril 2015– David Touboul 99
Structural diversity
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0.0
0.5
1.0
1.5
Inte
nsity (
co
un
ts x
10
6)
Time (min)
EIC m/z 619
Limitations
Annonacin
Goniothalamicin
Arianacin
Gigantetrocin-B
Muricartetrocins
Muricin-A
Muricin-C
MS study
Grenoble 9 Avril 2015– David Touboul 100
Structural diversity
Optimization of the collision
energy
0 20 40 60 80100
0
20
40
60
80
100 [M+Li]+
0 20 40 60 80100
0
1
2
3
4 [M+Li-H2O]
+
0 20 40 60 80100
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 [M+Li-CO
2]+
0 20 40 60 80100
0
1
2
3 [M+Li-CO
2-H
2O]
+
0 20 40 60 80100
0
1
2
3 [M+Li-CO2-2H
2O]
+
0 20 40 60 80100
0.0
0.5
1.0
1.5 [M+Li-CO2-3H
2O]
+
0 20 40 60 80100
0
20
40
60 X
4
0 20 40 60 80100
0
20
40
60
80 X4-H
2O
X4-2H
2O
X4-3H
2O
0 20 40 60 80100
0
1
2
3
4 Z1
0 20 40 60 80100
02
4
68
10
Re
lative
in
ten
sity (
%)
collision energy (eV)
X3
0 20 40 60 80100
0
20
40
60 X2
0 20 40 60 80100
0
1
2
3 X
1
Two values are retained : 60 and 80 eV
MS/MS study
Li+
Grenoble 9 Avril 2015– David Touboul 101
Structural diversity
X4
120 160 200 240 280 320 360 400 440 480 520 560 600
0
400
800
4000
6000
8000
10000
12000
Inte
nsity (
co
un
ts)
m/z
X2
Y1
[M+
Li-
CO
2-H
2O
]+
[M+
Li-C
O2-2
H2O
]+[M
+Li-C
O2-2
H2O
]+
X4-H
2O
X4-2
H2O
X4-3
H2O
X3
[M+
Li]+
[M+
Li-H
2O
]+[M
+L
i-C
O2]+
60 eV
120 160 200 240 280 320 360 400 440 480 520 560 600
0
200
400
600
800
1000
1200
1400 80 eV
X2
m/z
Y1
X4-3
H2O
X3Z1
X4-2
H2O
X4-H
2O
X4
102
A2
A3
X4
X3
Z1
C1-H2O
C1
B1
A3-H2O
Spectra acquired with an ion mobility mass spectrometer MOBICS project (LCP, Orsay, G. Van der Rest, P. Maitre)
