RECHERCHE DE MARQUEURS PRÉCOCES DE LA GESTATION …

ÉCOLE NATIONALE VÉTÉRINAIRE D’ALFORT

Année 2012

RECHERCHE DE MARQUEURS PRÉCOCES DE LA

GESTATION DANS LES CELLULES IMMUNITAIRES

CIRCULANTES CHEZ LES RUMINANTS

THÈSE

Pour le

DOCTORAT VÉTÉRINAIRE

Présentée et soutenue publiquement devant

LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE CRÉTEIL

Le 20 Décembre 2012

par

Laura Hélène SILVA

Née le 26 août 1987 à Brou-sur-Chantereine (Seine-et-Marne)

JURY

Président : Pr

Professeur à la Faculté de Médecine de CRÉTEIL

Membres

Directeur : Mme Fabienne Constant

Maître de conférences à l’ENVA

Assesseur : Mme Bénédicte GRIMARD-BALLIF

Professeur à l’ENVA

REMERCIEMENTS

Au président du jury, Professeur à la faculté de médecine de Créteil,

Qui nous fait l’honneur de présider notre jury,

Hommage respectueux.

A Madame Fabienne Constant,

Maître de conférences à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort,

Qui a accepté d’encadrer ce travail de thèse,

Sincères remerciements.

A Madame Bénédicte Grimard-Ballif,

Professeur à L’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort,

Qui nous a fait l’honneur d’accepter de participer à notre jury de thèse,


Aux enseignants de l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, ainsi qu’à mes maîtres de stage,

Qui m’ont permis d’apprendre ce métier passionnant,


A mes parents, qui ont toujours cru en moi, ont su me soutenir dans mon projet, et m’ont

permis de mener à terme mes longues études sans autre souci que d’apprendre et me former.

Merci pour l’amour inconditionnel et la confiance que vous avez placés en moi.

A mes sœurs, Johanna et Carole, ainsi que mes cousines, Florence et Audrey, avec lesquelles

j’ai passé tant de bons moments et auxquelles je pourrai toujours tout dire. Merci pour les fous

rires et les confidences.

A mes grands-parents, qui ont si bien fait le relais avec mes parents, pour les bons petits plats

et les bonbons du mercredi, notamment a papy, que je n’oublie pas, pour m’avoir donné le

goût du piano. Merci d’avoir cru en moi.

A toute ma famille qui, bien que coupée en deux, m’a apporté beaucoup d’amour et de

moments inoubliables.

A mon homme David, qui m’a soutenue dans l’apprentissage difficile de la pratique de mon

métier et m’a permis de passer des études à la vie active dans la sérénité. Ton amour m’aide à

avoir confiance en moi et à franchir tous les obstacles. Merci pour le bonheur que tu

m’apportes chaque jour par tes petites attentions et ton effort constant pour me rendre

heureuse.

A mon groupe de clinique : Sandrine, Jérèm, Stan, Gaëlle, Ben, Charlotte, Marie-Aude, Chloé

et Matthias. Pour tous les souvenirs que l’on partage, que ce soit les soirées, les premiers pas

au CHUVA, les longs topos à l’heure du déjeuner, les fous rires au RU… Il y en a tellement

que je ne saurais les citer tous. Vous m’avez fait passer 5 années extraordinaires chacun à

votre façon et ce sont des choses qu’on n’oublie pas.

A ma GGO, avec laquelle je partage mes souvenirs de prépa, mais aussi une amitié qui n’a

pas été ébranlée par le passage à l’École. Je me souviens encore du jour où tu m’as félicitée

pour le concours et de ta réaction lorsque j’ai appris que j’intégrais l’ENVA. Rien que pour

cela, mais aussi bien d’autres choses, merci.

A mes amis du lycée, avec lesquels j’ai encore partagé de mémorables soirées bien après le

baccalauréat.

A mes poulottes, Cassandra et Héloïse, qui ont fait de moi une Ancienne. J’espère avoir

participé à vous transmettre les valeurs alforiennes. Je vous souhaite aussi de vous épanouir

dans ce beau métier.

A mes compagnons à quatre pattes, Enzo, Clio, Chérubin, Tango, Pampa, Muguette, Poupette,

Casi, Lady, Benji, Oswald, Alphonse, Nougat et Glupie, qui m’ont accompagnée tout au long

de ma vie et m’ont donné la passion des animaux qui a fait que j’ai voulu devenir vétérinaire.

1

TABLE DES MATIERES

LISTE DES FIGURES ............................................................................................................... 3

LISTE DES TABLEAUX .......................................................................................................... 5

LISTE DES ABRÉVIATIONS .................................................................................................. 6

INTRODUCTION ...................................................................................................................... 9

PREMIERE PARTIE : Étude bibliographique ........................................................................ 11

I. Mécanismes impliqués dans la mise en place et le maintien de la gestation chez les

ruminants .................................................................................................................................. 11

A. Les cycles de la vache et de la brebis ........................................................................... 11

1. Le cycle de la vache ................................................................................................. 11

2. Le cycle de la brebis ................................................................................................. 11

B. Mise en place de la gestation chez les ruminants ......................................................... 12

1. De la fécondation à l’implantation ........................................................................... 12

2. Implantation et formation du placenta ..................................................................... 13

C. Place de la communication fœto-maternelle dans la mise en place de la gestation ..... 14

1. Rôles de l’IFNτ en début de gestation ...................................................................... 14

2. Rôles du système immunitaire dans le maintien de la gestation .............................. 14

II. Méthodes usuelles de diagnostic précoce de la gestation chez les ruminants .................. 16

A. Mise en évidence de l’EPF (early pregnancy factor) ................................................... 16

B. Dosage de la progestérone dans le plasma ou dans le lait ............................................ 16

1. Principe du diagnostic .............................................................................................. 16

2. Résultats obtenus chez la brebis ............................................................................... 16

3. Résultats obtenus chez la vache ............................................................................... 17

4. Intérêts et limites de la méthode ............................................................................... 17

5. Cas particulier de la progestérone fécale chez la vache ........................................... 18

C. Dosage des protéines spécifiques de la gestation ......................................................... 18

D. L’échographie transrectale et trans-abdominale .......................................................... 19

E. La palpation transrectale .............................................................................................. 20

III. Gènes stimulés par l’interféron chez les ruminants ......................................................... 21

A. Stimulation de l'expression des ISG par l’IFNτ ........................................................... 21

1. L’IFNτ possède une action paracrine ....................................................................... 21

2

2. L’action de l’IFNτ fait intervenir la voie de signalisation JAK-STAT

(Stewart et al., 2001 ; Binelli et al., 2001) ....................................................................... 21

3. Principaux ISG étudiés chez les ruminants pendant la gestation ............................. 22

B. Expression des ISG dans l'endomètre .......................................................................... 24

C. Expression des ISG dans les lymphocytes mononucléés circulants (LMC) ................ 24

1. Comparaison de l’expression des ISG dans les LMC entre les femelles gestantes

et les femelles non gestantes ............................................................................................ 24

2. Utilisation de la différence d’expression des ISG dans les LMC pour

diagnostiquer la gestation ................................................................................................. 25

IV. Présentation de deux gènes non stimulés par l’IFNτ : FOS et PBEF-1 ........................... 27

A. Le gène FOS (FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog) ............................ 27

B. Le gène PBEF-1 (pre-B-cell colony enhancing factor 1)............................................. 28

DEUXIEME PARTIE : Étude expérimentale .......................................................................... 31

I. Matériels et méthodes ....................................................................................................... 31

A. Animaux ....................................................................................................................... 31

B. Prélèvements ................................................................................................................ 31

C. Isolement des leucocytes mononucléés circulants (LMC) ........................................... 32

D. Dosage de progestérone ............................................................................................... 32

E. Extraction des ARN ..................................................................................................... 32

F. Rétrotranscription des ARNm ...................................................................................... 32

G. PCR en temps réel ........................................................................................................ 33

H. Analyses statistiques .................................................................................................... 34

II. Résultats ........................................................................................................................... 35

A. Diagnostics de gestation ............................................................................................... 35

B. Dosage de progestérone ............................................................................................... 35

C. Niveau d'expression de gènes candidats par RT-qPCR en temps réel ......................... 35

III. Discussion ........................................................................................................................ 41

CONCLUSION ........................................................................................................................ 47

BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................... 49

3

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Comparaison chronologique des étapes de la mise en place d’une gestation chez

la vache et la brebis. ................................................................ Erreur ! Signet non défini.

Figure 2 : Mécanisme d’activation de la voie JAK-STAT (d’après la thèse de pharmacie de

Valentino, 2009) ...................................................................... Erreur ! Signet non défini.

Figure 3 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de CXCL10 mesurés par PCR en temps

réel dans les leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL :

brebis cyclées, IA vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis

inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ±

SEM. ** p<0,01. ..................................................................... Erreur ! Signet non défini.

Figure 4 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de CXCL10 dans les

leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis

cyclées, IA vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis

inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). Erreur ! Signet non défini.

Figure 5 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de PLAC8 mesurés par PCR en temps



inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ± SEM.

a,b : des lettres différentes indiquent une différence significative (p<0,05). ......... Erreur !

Signet non défini.

Figure 6 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de PLAC8 dans les



inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). ......................................... 38

Figure 7 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de STAT-1 mesurés par PCR en temps




a,b,c : des lettres différentes indiquent une différence significative (a,c : p < 0,05 ; b,c :

p < 0,01). ................................................................................. Erreur ! Signet non défini.

Figure 8 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de STAT-1 dans les


4



Figure 9 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de FOS mesurés par PCR en temps réel

dans les leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL :


inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ±

SEM. ........................................................................................ Erreur ! Signet non défini.

Figure 10 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de FOS dans les




Figure 11 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de PBEF-1 mesurés par PCR en temps




a,b : des lettres différentes indiquent une différence significative (p<0,01). ......... Erreur !

Signet non défini.

Figure 12 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de PBEF-1 dans les



inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). ......................................... 41

5

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Orientation, séquence, température de fusion des amorces pour chaque gène

amplifié en RT-qPCR et taille attendue des amplicons. ................................................... 34

Tableau 2 : Répartition du nombre de brebis gestantes selon le nombre d'embryons

observés. ........................................................................................................................... 35

6

LISTE DES ABRÉVIATIONS

ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire

AP : Activator protein

ARNm : Acide ribonucléique messager

CD : Cluster of differenciation

CYCL : Lot des brebis cyclées non inséminées

Da : Dalton

eCG : Equine chorionic gonadotropin

ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay

EPF : Early pregnancy factor

FOS : FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog

G15 : Lot des brebis inséminées et gestantes à 15 jours de gestation

GAS : Gamma-activated sequence

GDE : Gènes différentiellement exprimés

GM-CSF : Granulocyte macrophage colony stimulating factor

GnRH : Gonadotropin releasing hormone

GTP : Guanosine triphosphate

hCG : Human chorionic gonadotropin

IA : Insémination artificielle

IFNτ : Interféron tau

IL : Interleukine

INRA : Institut national de recherche agronomique

IP-10 : Interferon-gamma inducible protein 10 kDa)

IRF : Interferon regulatory factor

ISG : Interferon stimulated gene

ISGF : Interfeon stimulated gene factor

ISRE : Interferon-stimulated response element

J0 : Jour de l’insémination

JAK : Janus kinase

LMC : Leucocytes mononucléés circulants

LS : Lot des brebis inséminées avec du liquide séminal

Mx : Myxovirus

NAD : Nicotinamide adénine

NAMPT : Nicotinamide phosphoribosyltransferase

NK : Natural killer

OAS : Oligoadenylate synthetase

PAG : Pregnancy associated glycoproteins

PBEF : Pre-B-cell colony enhancing factor

PGE2 : Prostaglandine E2

PGF2-α : Prostaglandine F2alpha

PSP-B : Pregnancy specific protein B

RIA : Radio-immuno assay

RT-qPCR : Reverse trancriptase quantitative polymerase chain reaction

STAT : Signal transducer and activator of transcription

TNF : Tumor necrosis factor

7

8

9

INTRODUCTION

De nos jours, les élevages bovins laitiers sont soumis à de fortes contraintes économiques,

notamment lors de fluctuations du prix du lait. D’après Lemercier (2009), une vache coûte à un

éleveur français 1,50 euros par jour improductif. Afin d’assurer un rendement correct, il est

essentiel que chaque vache soit non gravide le moins longtemps possible et donc de maîtriser la

reproduction. Dans ce but, il faut non seulement être capable de détecter efficacement les chaleurs

pour inséminer au bon moment et permettre que la fécondation ait lieu, mais aussi détecter les

vaches non gravides (non fécondées ou après une interruption précoce de la gestation) le plus tôt

possible. Cela contribue à réduire l’intervalle vêlage – insémination fécondante et donc l’intervalle

vêlage – vêlage afin d’atteindre l’objectif d’un veau par vache et par an, ce qui assure la santé

économique des élevages laitiers.

Une bonne maîtrise de la reproduction est d’autant plus cruciale que la fertilité a tendance à

diminuer au sein du cheptel bovin laitier. En effet, les vaches et les taureaux laitiers sont depuis

longtemps sélectionnés selon le critère production laitière. Ainsi, on assiste depuis les années 80 à

une forte augmentation de la production laitière avec des vaches laitières hautes productrices qui

produisent jusqu’à plus de 8 000 kg de lait par lactation. En parallèle, la fertilité des femelles

diminue (1 point par an depuis 10 ans) et elles expriment de moins en moins leurs chaleurs. Il

devient donc compliqué pour les éleveurs de détecter les chaleurs de leurs vaches afin de les

inséminer au bon moment ou de s’apercevoir qu’elles ne sont pas gestantes en détectant les retours

après insémination artificielle (IA). Cette difficulté est amplifiée par la taille de plus en plus

importante des élevages pour une main d’œuvre en recul, ce qui rend l’observation des vaches

moins aisée.

Il existe de nombreuses méthodes de diagnostic de gestation utilisables chez les ruminants,

mais pas suffisamment précoces pour permettre de réinséminer au cycle suivant en cas d’échec. On

perd donc au moins un cycle, soit 21 jours chez une vache lors de diagnostic de non gestation. De

plus, certaines vaches nécessitent plus de deux inséminations artificielles pour être fécondées en

raison de la baisse de fertilité chez ces animaux. Un diagnostic de gestation précoce serait d’autant

plus crucial pour ces animaux qui ont tendance à rester non gravides plus longtemps entre deux

gestations et à diminuer le rendement des exploitations. Dans les élevages ovins, un diagnostic de

gestation précoce permet de séparer les brebis gestantes et non gestantes afin d’adapter au mieux

leur alimentation et leurs conditions d’élevage (Karen et al., 2003).

C’est pourquoi il est important de rechercher une méthode permettant de diagnostiquer la

gestation dans les 21 jours qui suivent l’insémination chez la vache et dans les 17 jours chez la

brebis, de manière fiable, non invasive et utilisable sur le terrain. De nombreux travaux ont déjà été

menés sur ce sujet, notamment pour trouver des gènes exprimés dans les cellules immunitaires du

sang périphérique dont l’expression diffère entre les animaux gestants et non gestants en début de

gestation. Cependant, ils n’ont pas permis de définir un ou plusieurs gènes suffisamment fiable(s)

pour être utilisé(s) en pratique.

Le travail présenté dans ce manuscrit et effectué chez la brebis, modèle ruminant plus

accessible que la vache, avait pour but d’identifier des gènes dont le niveau d’expression diffère

entre les animaux gestants et non gestants dès 15 jours après l’insémination. Ces gènes ont été

analysés à partir des leucocytes mononucléés circulants (LMC) du sang périphérique ; ainsi, la

manipulation en élevage consiste en une prise de sang, ce qui est peu invasif. Dans une première

10

partie bibliographique, nous rappellerons les mécanismes intervenant dans la mise en place et le

maintien de la gestation, nous présenterons les méthodes existantes pour diagnostiquer la gestation

chez les ruminants et enfin, nous ferons le bilan des connaissances acquises chez ces animaux à

propos des gènes stimulés en début de gestation. Puis dans une seconde partie, nous présenterons

l’étude expérimentale réalisée sur des brebis. Ce travail servira de base à d’autres travaux menés

cette fois sur des échantillons provenant de vaches laitières.

11

PREMIERE PARTIE : Étude bibliographique

I. Mécanismes impliqués dans la mise en place et le maintien de la gestation

chez les ruminants

A. Les cycles de la vache et de la brebis

La reproduction des femelles de ruminants est soumise à un cycle que l’on peut décomposer

en une phase lutéale et une phase folliculaire. Ce cycle dépend en partie de l’utérus, car c’est

l’endomètre qui produit l’hormone lutéolytique : la prostaglandine F2α (PGF2α). Ce sont les pulses

de PGF2α induits par l’ocytocine qui vont entraîner la régression du corps jaune ovarien et ainsi

mettre fin à la phase lutéale. Ce mécanisme dépend également de l’action en amont des hormones

sexuelles femelles que sont les œstrogènes ainsi que la progestérone et c’est tout cet équilibre qui va

être modifié afin de passer du cycle à la gestation (Spencer et al., 2004).

1. Le cycle de la vache

Le cycle de la vache dure en moyenne 21 jours et il s’agit d’un cycle œstral non saisonnier

chez la vache laitière. Il comporte une phase lutéale qui dure 16 à 17 jours durant laquelle le corps

jaune est fonctionnel et une phase folliculaire qui dure 4 à 5 jours durant laquelle se produit la

maturation finale du follicule dominant aboutissant à l’ovulation. C’est à la fin de cette phase du

cycle que la vache exprime un comportement d’œstrus. Les chaleurs durent en moyenne 14 heures

chez les vaches laitières, un peu moins chez les génisses et il existe de grandes variations entre les

races et les individus. Néanmoins, on peut noter que cette période est courte et impose une

observation assidue des animaux pour inséminer au bon moment, c’est-à-dire dans les heures qui

suivent l’observation du comportement d’œstrus. De plus, l’intensité de ces comportements est

devenue faible voire inexistante chez certaines vaches hautes productrices qui refusent le

chevauchement par une femelle congénère, même lors de leurs chaleurs. C’est pourquoi il est

délicat d’utiliser ce comportement pour détecter un échec de l’insémination ou une mortalité

embryonnaire précoce, auquel cas la vache reviendrait en chaleurs 21 jours après l’insémination et

pourrait être ré-inséminée sur chaleurs observées sans perdre un cycle.

2. Le cycle de la brebis

Le cycle de la brebis est plus court (17 jours) et saisonnier, la saison de reproduction se

situant entre septembre et février ; l’ovin est donc une espèce saisonnière à jours courts. L’œstrus

dure 24 à 36 heures et l’ovulation se produit 18 à 36 heures après le début des chaleurs. La détection

des chaleurs n’est pas réalisée en élevage ovin car les brebis sont en général saillies de façon

naturelle, dans les conditions d’élevage. Si l’insémination artificielle est choisie chez ces animaux,

ils doivent impérativement subir un protocole de synchronisation des cycles.

12

B. Mise en place de la gestation chez les ruminants

1. De la fécondation à l’implantation

La fécondation est permise suite à une saillie ou une insémination artificielle au moment des

chaleurs dans les 2 espèces. Elle a lieu dans l’oviducte. La cellule-œuf formée subit des divisions et

devient un embryon. Ce dernier arrive dans l’utérus vers J5 (Figure 1) encore entouré de la zone

pellucide et reste libre encore plusieurs jours avant de s’implanter, l’implantation étant tardive chez

les ruminants. Durant cette phase au cours de laquelle l’embryon est libre dans l’utérus, il se sépare

de la zone pellucide qui l’entoure : on parle d’éclosion (Figure 1). Puis il subit une importante

élongation, passant ainsi d’une forme sphérique à une forme tubulaire et enfin filamenteuse. Dès

cette période de la gestation au cours de laquelle l’embryon n’a pas encore de contact physique avec

l’endomètre maternel, les différenciations cellulaires se mettent en place. Les premières cellules à

se différencier forment le trophoblaste qui constituera la partie embryonnaire du placenta appelé par

la suite trophectoderme. C'est également pendant cette phase que l’embryon communique avec

l’organisme maternel par l’intermédiaire de substances signalant la gestation dont la plus connue est

l’interféron tau (IFNτ). Ces substances sont produites par les cellules trophoblastiques (Roberts,

2007).

Figure 1 : Comparaison chronologique des étapes de la mise en place d’une gestation chez la

vache et la brebis.

Chez la vache :

Chez la brebis :

Durée du IA entrée de l’embryon éclosion implantation Durée

cycle dans l’utérus gestation

= 21 jours = 280 jours

J0 J5 J10 J22

Durée du saillie entrée de l’embryon éclosion implantation Durée

cycle dans l’utérus gestation

= 17 jours = 145 jours

J0 J5 J9 J16

13

2. Implantation et formation du placenta

Avant l’implantation, la nutrition du conceptus est assurée par les histotrophes, produits par

les glandes endométriales, situées dans l’espace inter-caronculaire et indispensables à la survie et au

développement de l’embryon en début de gestation (Gray et al., 2001). En effet, une étude menée

sur des brebis a montré que l’inactivation de ces glandes provoquait des avortements, un défaut de

développement et des différences dans l’activation de gènes normalement activés dans un utérus

gestant par rapport à un utérus non gestant (Gray et al., 2006).

La morphogénèse et la différenciation fonctionnelle des glandes endométriales nécessite une

action conjuguée des hormones d’origine maternelle et fœtale avec intervention de l’œstradiol-17β,

de la prolactine (Gray et al., 2001), de la progestérone, de l’hormone de croissance, du lactogène

placentaire et de l’IFNτ (Spencer et al., 2004). La progestérone agit sur l’utérus gestant en

autorégulant négativement l’expression de ses récepteurs au niveau de l’épithélium glandulaire et

c’est cette absence de récepteurs à la progestérone qui permet l’apparition de la fonction

différenciée des glandes (Spencer et al., 2004). En revanche, les récepteurs restent présents au

niveau du myomètre et du stroma : la progestérone régule ainsi les réponses des différents types

cellulaires qui constituent l’utérus et coopère avec l’IFNτ pour mettre en place et maintenir la

gestation (Gray et al., 2006).

L’implantation consiste en un contact fœto-maternel intime à la fois physique et

physiologique qui constitue le point de départ de la placentation. Elle intéresse d’une part le

trophectoderme et d’autre part les couches les plus superficielles de la paroi utérine qui

comprennent l’épithélium luminal et l’épithélium glandulaire superficiel (Lee et DeMayo, 2004).

L’épithélium utérin comporte chez les ruminants des zones stromales aglandulaires appelées

caroncules (Gray et al., 2001). Les couches plus profondes de la paroi utérine (épithélium

glandulaire profond, myomètre et stroma) subissent également des modifications lors de la gestation

mais n’interviennent pas dans l’implantation. Cette dernière comprend plusieurs étapes qui doivent

se succéder dans un ordre bien défini afin d’assurer la pérennité de la gestation : après éclosion

(sortie du blastocyste de la zone pellucide), il y a d’abord orientation du conceptus au contact de

l’épithélium luminal et glandulaire superficiel de l’endomètre, puis apposition et adhésion du

trophectoderme avec l’endomètre (Bazer et al., 2008). C'est au terme de l'implantation que se

forment les cotylédons qui sont des groupes de villosités trophoblastiques qui se développent en

face puis au sein des caroncules utérines qui vont croître simultanément. L’association de ces deux

structures (caroncule et cotylédon) constitue des unités placentaires appelées placentomes au niveau

desquels se feront les échanges de gaz et de nutriments durant la gestation (Lee et DeMayo, 2004).

Au début de l'implantation, lorsque les premiers contacts cellulaires se mettent en place

entre le trophoblaste et l'endomètre, apparaissent des cellules binucléées au sein de l'épithélium

trophoblastique qui représentent 15-20 % de cette population cellulaire. Dans les cotylédons, ces

cellules binucléées ont un destin particulier car elles migrent vers l'endomètre et fusionnent avec

une (chez la vache) ou plusieurs (chez la brebis et la chèvre) cellules épithéliales utérines. C'est à

cause de ce phénomène que l'on parle de placenta synépithélio-chorial chez les ruminants. Il sera

évoqué de nouveau à propos du diagnostic de gestation par dosage de protéines spécifiques de la

gestation.

14

C. Place de la communication fœto-maternelle dans la mise en place de la gestation

1. Rôles de l’IFNτ en début de gestation

La communication s’établit entre l’organisme maternel et le conceptus dans les 2 sens avec

des signaux différents qui concourent à la mise en place et au maintien de la gestation. Elle

commence pendant la période pré-implantatoire, d’après des études menées à J18 post-IA sur des

vaches (Klein et al., 2006 ; Bauersachs et al., 2006). Elles ont montré que des changements dans le

transcriptome de l’endomètre bovin étaient induits par l’embryon avant l’implantation, avec

stimulation de l’expression de 87 gènes dont la moitié est stimulée par les interférons de type I, dont

l’IFNτ, produit par l'embryon de ruminants. Ces gènes interviennent dans la modulation du système

immunitaire maternel, dans l’adhésion cellulaire et dans le remodelage de l’endomètre.

L’IFNτ est produit par les cellules mononuclées du trophectoderme embryonnaire à partir de

J10 chez la brebis et J14 chez la vache, et de façon soutenue sur plusieurs jours (Roberts, 2007). Sa

production est maximale au moment de l’implantation, qui commence respectivement à J16

(Spencer et al., 2004) et J19-20 (King et al., 1980). Il devient indétectable à partir de 4 semaines de

gestation chez la brebis (Roberts, 2007). Il a pour rôle de signaler à l’organisme maternel la

présence du conceptus par l’intermédiaire d’un mécanisme paracrine afin d’empêcher la lutéolyse.

Sa liaison aux récepteurs endométriaux aux interférons de type I induit une diminution du

nombre de récepteurs à l’ocytocine et aux œstrogènes dans les épithéliums luminal et glandulaire

superficiel, ce qui diminue la synthèse de PGF2α et donc modifie le ratio PGE2/PGF2α en faveur

de PGE2 (Johnson et al., 2001). Cela empêche la lutéolyse, permet le maintien du corps jaune et

donc de la production de progestérone, hormone fondamentale pour la mise en place et le maintien

de la gestation. Cette hormone agit en stimulant et en maintenant les fonctions utérines qui

permettent le développement embryonnaire précoce, l’implantation, la placentation et la poursuite

de la gestation avec un développement fœtal et placentaire optimal (Spencer et al., 2004). La

progestérone augmente par ailleurs l’expression dans l’utérus de nombreux gènes stimulés par

l’interféron (ISG) (Oliveira et al., 2008). La progestérone et l’IFNτ activent donc des voies de

signalisation complémentaires pour moduler l’expression de nombreux gènes exprimés au niveau

de l’épithélium luminal et glandulaire superficiel et qui participent à la réceptivité utérine et au

développement fœtal (Bazer et al., 2008).

De plus, on observe une augmentation de l’expression des gènes stimulés par l’IFNτ dans

d’autres tissus : c’est le cas dans le corps jaune, mais aussi dans les leucocytes mononucléés

circulants (LMC). Cela indique qu’en plus d’une action paracrine sur l’endomètre, l’IFNτ possède

également un mécanisme d’action endocrine sur l’organisme maternel en début de gestation. Les

rôles endocrines de l'IFNτ ne sont pas très bien connus, mais on peut envisager, les fonctions

classiques d’un interféron étant d’assurer un rôle antiviral, antiprolifératif et immunosuppressif, que

l’IFNτ possède des fonctions biologiques particulières afin de protéger la gestation (Bazer et al.,

2008). Cette action de l’IFNτ sur les LMC offre une opportunité de détecter la gestation de façon

précoce et peu invasive à partir du sang périphérique (Oliveira et al., 2008).

2. Rôles du système immunitaire dans le maintien de la gestation

L'embryon, qui possède des caractéristiques génétiques du père, peut être considéré comme

du "non soi" par l'organisme maternel. Cependant, l’endomètre doit lui fournir un environnement

favorable ; une régulation fine du système immunitaire maternel est donc nécessaire pour le

maintien de la gestation.

15

L'embryon produit plusieurs cytokines, la plus connue étant l'IFNτ, qui inhibe la

prolifération des lymphocytes et stimule l'activité des cellules natural killer (NK), et aurait donc un

rôle important dans la tolérance immunologique de l'embryon par l'organisme maternel (Nagaoka et

al., 2003). Ces effets de l’IFNτ sur l’immunité ont un impact positif sur l’établissement de la

gestation et la placentation (Stevenson et al., 2007). Cela renforce son importance dans la mise en

place d’une gestation puisqu’il a été montré chez l’Homme et la souris que les cellules de

l’immunité entraient en jeu lors de la gestation, d’une part afin de lutter contre les infections trans-

placentaires avec notamment intervention des NK, et d’autre part pour participer à la placentation

normale (Boysen et Storset, 2009).

En parallèle, l'organisme maternel réagit à la présence de l'embryon localement. Dans

l'utérus, on observe une augmentation de la proportion de certaines populations leucocytaires. Ainsi,

on observe chez les femelles gestantes une augmentation des lymphocytes à récepteurs T γδ et CD8

chez la brebis (Oliveira et al., 2008 ; Fox et al., 2010), et des macrophages CD68 et CD14 chez la

vache (Oliveira et al., 2008). La réaction maternelle à la présence de l'embryon est aussi visible

dans la circulation sanguine. On observe une modification de certaines populations leucocytaires

dans le sang : augmentation des lymphocytes CD4+ et CD25+ chez la vache à un mois de gestation

(Oliveira et Hansen, 2008). Ceci est également observé chez la femme et on constate que les

femmes qui subissent des avortements spontanés répétés ont un nombre réduit de ces cellules dans

le sang (Yang et al., 2008). Ces cellules influenceraient donc la réussite de la gestation dans

l’espèce humaine, mais aussi dans l’espèce ovine. En effet, d’après Nagaoka et al. (2003), il est

souvent rapporté que le système immunitaire s'orienterait vers une réponse de type humoral pendant

la gestation chez la brebis. Or, dans cette étude, il a été montré d’une part que l’activité des cellules

NK augmentait en début de gestation et d’autre part qu’il était possible d’induire un avortement in

vivo par l’utilisation d’anticorps anti-CD8+. Les auteurs en ont déduit que la présence de cellules

NK et CD8+ sont nécessaires à l’immunotolérance envers le conceptus et donc au maintien de la

gestation dans l’espèce ovine.

Les rôles des cellules immunitaires dans le maintien de la gestation ne sont pas très bien

connus et sont peu décrits chez les ruminants. Ils l'ont davantage été chez l’Homme et la souris.

Dans une première étude, des cellules lutéales cultivées in vitro ont produit plus de progestérone en

présence de LMC issus de femmes enceintes qu'en présence de LMC issues de femmes non

enceintes. Ce dernier effet était amplifié par l’utilisation d’hCG recombinant qui semble augmenter

la production de cytokines par les LMC (Fujiwara, 2009). Une autre étude menée chez l’Homme

sur des cultures cellulaires in vitro montre que les LMC entraînent des changements fonctionnels

sur les cellules épithéliales endométriales, régulant la réceptivité de ces cellules par l’intermédiaire

de cytokines (Kosaka et al., 2003).

L'administration intra-utérine de LMC avant transfert d'embryon a d'ailleurs permis

d'améliorer le taux de gestation chez des femmes ayant recours à la procréation médicalement

assistée et ayant subi plusieurs échecs d'implantation (Fujiwara, 2009), ainsi que chez des vaches

(Ideta et al., 2010). Dans cette dernière étude, il a été montré que l’administration intra-utérine de

LMC augmentait significativement la transcription du facteur stimulant des macrophages (GM-

CSF) dans les cellules lymphoïdes de la paroi utérine. De plus, les embryons présentaient une

meilleure croissance à J15 dans le groupe auquel on avait administré les LMC. Ils en ont déduit que

les LMC amélioraient l’environnement utérin, optimisant ainsi le développement précoce de

l’embryon, même avant son implantation, et expliquant l'amélioration du taux de gestation. La

reconnaissance de la gestation a donc lieu avant l’implantation et très précocement puisque la

différence de croissance embryonnaire peut être constatée dès J15. Fujiwara (2009) a également

conclu que les LMC participeraient en coopération avec le système endocrine maternel (hCG) à la

16

communication fœto-maternelle et contribueraient à la transmission de l'information de la présence

d'un embryon, induiraient la différenciation de l'endomètre nécessaire à l'implantation,

participeraient à la mise en place du placenta et de l'angiogénèse. Cette réaction immunitaire a une

importance fonctionnelle pour l’établissement et le maintien de la gestation localement.

II. Méthodes usuelles de diagnostic précoce de la gestation chez les ruminants

Il existe aujourd’hui plusieurs méthodes pour diagnostiquer la gestation à différents stades

chez les ruminants. Nous allons nous intéresser ici aux méthodes de diagnostic précoce de la

gestation car notre objectif est de différencier le plus tôt possible les animaux gestants des animaux

non gestants. On peut effectuer une simple prise de sang et utiliser des molécules présentes dans le

sang maternel ou bien visualiser, voire palper le fœtus.

A. Mise en évidence de l’EPF (early pregnancy factor)

Parmi les molécules que l’on peut rechercher dans le sang maternel, celle qui apparaît le plus

précocement est l’EPF (early pregnancy factor). Cette molécule est détectable chez la brebis

gestante dès 24 heures après la fécondation grâce un test d’inhibition des rosettes. Cependant, ce

test est trop compliqué à mettre en place en élevage et surtout, il n’est pas suffisamment fiable en

raison de nombreuses réactions croisées (nombreux faux positifs, Karen et al., 2003). Dans l’espèce

bovine, le même type de test existe et permet d’après Ghaffari et al. (2008) de distinguer les

femelles gravides et non gravides au cours de la première semaine de gestation. Cependant, la

spécificité de cette molécule est faible (autour de 50%) en raison de nombreux faux positifs

(Cordoba et al., 2001 ; Ambrose et al., 2007). Ce test n’est donc plus utilisé chez les ruminants.

B. Dosage de la progestérone dans le plasma ou dans le lait

1. Principe du diagnostic

La progestérone est sécrétée par le corps jaune aussi bien lors de la phase lutéale du cycle

que lors de la gestation au cours de laquelle il persiste de façon prolongée. On peut donc se baser

sur le dosage de cette hormone pour détecter les femelles gravides qui auront une progestéronémie

élevée persistante par rapport à aux femelles non gravides et cyclées chez lesquelles la lyse du corps

jaune avant l’œstrus va entraîner une baisse de la progestéronémie. Cette méthode est utilisable à

partir de J18 chez la brebis (Karen et al., 2003) et selon les études, on peut l’utiliser chez la vache

entre J19-J21 et J23-J24 (Isobe et al., 2005 ; Romano et al., 2006).

2. Résultats obtenus chez la brebis

Cette méthode est sensible (100%) mais pas très spécifique (95,4%) car le niveau de

progestérone dépend de plusieurs facteurs tels que l’irrégularité du cycle, la mortalité embryonnaire,

la présence d’une infection utérine ou de kyste lutéal. C’est pourquoi la fiabilité de la

progestéronémie est variable suivant les différentes études existantes. La progestéronémie est plus

fiable pour diagnostiquer l’absence de gestation avec une valeur prédictive négative de 100% alors

que la valeur prédictive positive n’est que de 81,6%. Il convient tout de même de signaler que dans

l’espèce ovine, le manque de consensus sur la méthode de mesure de la progestéronémie ainsi que

17

sur ses niveaux de référence qui peuvent varier en fonction de la prolificité de la race, rendent son

utilisation plus délicate (Alexander et al., 2008).

On peut également utiliser, chez les brebis laitières, le dosage de la concentration de

progestérone dans le lait, qui est sensiblement la même que celle dans le plasma (environ 3,7 ng/mL

chez les femelles gestantes et < 1 ng/mL chez les non gestantes) entre J18 et J22. Ainsi, Shemesh et

al. (1979) ont mis en évidence que la concentration en progestérone dans le lait permettait de

diagnostiquer, pendant la saison de reproduction, la gestation avec une précision similaire à la

concentration plasmatique de progestérone (82%) et la non gestation avec une précision de 92 à

100% dans le lait alors qu’elle est de 100% dans le sang. Cependant, chez les brebis dessaisonnées,

la précision n’est que de 50% dans le lait pour détecter l’absence de gestation, alors qu’elle est de

92% pour la progestérone plasmatique. Les valeurs restent similaires pour objectiver une gestation

(100% dans le lait et 92% dans le sang). La conduite d’élevage a donc une influence sur les

possibilités de faire ce dosage dans le lait et sur l’interprétation du résultat.

3. Résultats obtenus chez la vache

L’étude menée par Humblot et al. (1988) fait état d’une valeur prédictive positive de la

progestéronémie à J24 de 67,2% et d’une valeur prédictive négative de 98%. Cela confirme que la

progestérone est surtout intéressante pour un diagnostic de non gestation quand son taux est faible

alors qu’un taux de progestérone élevé peut être le témoin d’une phase lutéale prolongée ou d’une

anomalie génitale comme chez la brebis. Les variations de concentration en progestérone peuvent

aussi être dues à la méthode utilisée pour la détection (ELISA, agglutination sur latex, radio-

immunologie, Romagnolo et Nebel, 1993).

Des résultats similaires sont observés lors de dosage de la progestérone dans le lait, chez la

vache laitière, entre J18 et J24. Seida et al. (1990) ont obtenu des valeurs prédictives positives allant

de 56% à J18 à 79% à J24 et des valeurs prédictives négatives allant de 90% à J18 à 93% à J24.

Une autre étude se basant sur un diagnostic à 21 jours a fait état d’une précision moyenne, avec une

valeur prédictive positive de 71% et une valeur prédictive négative de 81% (Wimpy et al., 1986).

Enfin, d’après Pieterse et al. (1990), le dosage de la progestérone dans le lait autour de J25 a donné

de nombreux faux négatifs, ce qui pose problème dans les conditions d’élevage.

4. Intérêts et limites de la méthode

La progestéronémie présente un intérêt biologique dans la mesure où elle reflète directement

le développement placentaire et embryonnaire. En effet, on s’aperçoit en comparant des gestations

qui vont jusqu’au terme avec d’autres qui se soldent par une résorption embryonnaire que les profils

de progestéronémie sont significativement différents avec des valeurs bien plus basses dès J19

lorsque l’embryon ne se développe pas (Alexander et al., 2008). Cependant, la progestérone est

aussi le témoin de nombreux événements autres que la gestation au niveau de l’appareil génital

femelle. Il faut également attendre 21 jours pour avoir un diagnostic fiable puisque le niveau de

progestérone entre J0 et J21 est le même que chez une femelle cyclée. Cette méthode présente donc

un risque de faux positifs et, bien que précoce, ne permet pas d’utiliser le cycle en cours.

Le dosage de la progestérone, que ce soit dans le sang ou dans le lait, ne nécessite qu’un

simple prélèvement en élevage et les tests de détection en laboratoire ont depuis longtemps été mis

au point. Il s’agit donc d’une méthode pratique et assez peu coûteuse mais elle manque de

spécificité. Elle est efficace pour diagnostiquer l’absence de gestation à J21 mais manque de

fiabilité lorsque l’on souhaite confirmer la gestation.

18

5. Cas particulier de la progestérone fécale chez la vache

Une étude fait aussi mention de l’utilisation de la progestérone fécale avec une concentration

moyenne significativement différente entres vaches gestantes et non gestantes entre J19 et J24. La

précision est de 100% pour détecter l'absence de gestation avec un faible taux de progestérone. Les

interactions alimentaires peuvent néanmoins modifier la détection de la progestérone dans les fèces

(Isobe et al., 2005).

C. Dosage des protéines spécifiques de la gestation

Chez les ruminants, dès le début de l'implantation, les cellules trophoblastiques produisent

des glycoprotéines associées à la gestation (pregnancy associated glycoproteins ou PAG) de la

famille des protéinases aspartiques, mais elles semblent ne pas avoir d’activité enzymatique. Jusqu'à

aujourd'hui, 22 gènes ont été identifiés, dont l'expression est plus ou mois précoce et plus ou moins

longue au cours de la gestation. Ces protéines sont stockées dans des granules cytoplasmiques et

sont libérées dans le stroma utérin, lors de la fusion de ces cellules trophoblastiques avec des

cellules épithéliales utérines. Elles parviennent ensuite dans la circulation sanguine maternelle.

Elles peuvent ainsi être mises en évidence chez les femelles gravides à partir d'une prise de sang,

par dosage radio-immunologique (radio-immuno assay ou RIA). La première PAG identifiée et

dont le dosage est utilisé à l'heure actuelle en France comme méthode de diagnostic de gestation des

ruminants est connue dans le milieu de l'élevage sous le nom de PSP-B (pregnancy specific protein

B) (Butler et al., 1982). Mais à l'heure actuelle, différents anticorps reconnaissant différentes

protéines sont utilisés pour le dosage des PAG, dans le monde, expliquant les différences observées

entre les études.

Chez la brebis, d’après Karen et al. (2003), elle serait fiable dès J22 et plus spécifique que la

progestérone (100%) avec une valeur prédictive positive de 100%, mais Ranilla et al. (1994) ont

rapporté une valeur prédictive positive bien inférieure (66,6%) à J21. Ainsi, ils ont mis en évidence

des différences de niveau de PAG suivant la race (étude en parallèle sur des Churra et des Mérinos)

et suivant le sexe du fœtus. Quant à El Amiri et al. (2007), ils ont obtenu une concentration

plasmatique de PAG significativement différente entre les brebis gestantes et non gestantes dès J18.

La PSP-B peut être utilisée à partir de J26 avec une sensibilité de 100% mais une spécificité plus

faible (83%) (Ruder et al., 1988).

Chez la vache, les PAG sont détectables dans le sang maternel vers J33 ou J45 selon les

études (Romano et al., 2006). D’après Gajewski et al. (2008), elles peuvent être recherchées par

dosage radio-immunologique dans le sang, mais aussi dans le lait à partir de J28 avec une sensibilité

et une spécificité très élevées. De plus, les différents tests basés sur la RIA sont bien corrélés entre

eux, donc fiables, et indiquent que la concentration des PAG augmente entre J21 et J30, puis

diminue à partir de J30 (Ayad et al., 2009). Sa précision est maximale entre J30 et J35 et son

efficacité à détecter les femelles non gestantes à J30 est bien supérieure à celle du dosage de la

progestérone à J24 (Humblot et al., 1988).

La limite de ce test dans l’espèce bovine est liée à sa demi-vie particulièrement longue. Ces

protéines persistent 20 +/- 8 jours après l’interruption de la gestation : un niveau bas de PAG chez

une vache gestante pourrait donc être prédictif d’un avortement mais leur présence ne suffit pas à

démontrer que le fœtus est bien viable (Romano et Larson, 2010). Cette demi-vie très longue fait

aussi que les PAG sont présentes dans le sang maternel 70 à 100 jours après le vêlage et donc

éventuellement au début de la gestation suivante. Il est important de prendre en compte ce

paramètre car d’après une autre étude de Romano et al. (2006), le taux de mort embryonnaire et

19

fœtale au cours du 1er

trimestre de gestation chez les bovins varie de 10 à 20%. Ce taux a tendance à

augmenter avec la parité et lors de gestation gémellaire.

Les PAG présentent l’avantage de témoigner de la présence d’un tissu embryonnaire viable

étant donnée leur lieu de production, ce qui constitue une indication plus précise du bon

déroulement de la gestation. Leur détection ne nécessite qu’une prise de sang et elles apportent une

meilleure précision que l’échographie dans les 30 premiers jours de gestation. En revanche, les

techniques de détection passent par la radio-immunologie, ce qui coûte cher au laboratoire, présente

le danger de la radioactivité et demande un délai avant d’obtenir les résultats. Il serait donc

intéressant de développer une méthode de détection de type ELISA, sous forme de kit, pour

s’adapter aux conditions de terrain et au budget des éleveurs (Karen et al., 2003).

En dehors des méthodes de laboratoire, qui nécessitent une prise de sang, on peut également

se baser sur des méthodes d’imagerie pour diagnostiquer la gestation.

D. L’échographie transrectale et trans-abdominale

On peut employer l’échographie par voie transrectale sur brebis debout ou couchée, dans des

conditions de manipulations plus délicates que chez la vache, étant donné le format de l’animal, ou

par voie trans-abdominale. L’échographie transrectale manque de sensibilité avant J24, avec une

précision de 50% entre J17 et 24, qui atteint 85% à J32. La précision est meilleure lorsqu’il s’agit

d’exclure une gestation, puisque la spécificité de l’échographie est de 80% de J21 à J23 et de 98% à

partir de J32 (Garcia et al., 1993). La voie transrectale peut également permettre de réaliser un

examen Doppler afin de détecter le pouls fœtal, mais cette méthode apporte des résultats

satisfaisants à partir de J40 seulement. Par voie trans-abdominale, on peut utiliser l’échographie

mode A (basée sur l’amplitude et la profondeur) avec un dispositif appelé Preg-Alert ou

l’échographie mode B avec un échographe équipé d’une sonde sectorielle de 3,5 MHz ou de 5

MHz. Le Preg-Alert ne peut être utilisé avant J30 d’après le constructeur et il est précis seulement à

partir de J60. En revanche, l’échographie trans-abdominale avec une sonde de 3,5 MHz peut être

utilisée à partir de J40 avec une valeur prédictive positive de 94% (Ganaie et al., 2009). Avec une

sonde de 5 MHz, Yotov (2005) a obtenu une valeur prédictive positive de 87% à J27 et de 98% à

J35, tandis que Gearhart et al. (1988) ont obtenu une valeur prédictive négative de 100% à partir de

J25 et une valeur prédictive positive de 100% à partir de J51. Ces différences s’expliquent par le

changement de manipulateur car la réalisation et l’interprétation d’images échographiques

nécessitent de l’expérience.

Chez la vache, l’échographie ne s’utilise que par voie transrectale, à l’aide d’un échographe

équipé d’une sonde linéaire de 5 MHz ou de 7,5 MHz. Différentes études ont été réalisées autour de

J25 et les auteurs ont observé des valeurs prédictives positives autour de 95% et des valeurs

prédictives négatives autour de 89% (Taverne et al., 1985 ; Hanzen et Delsaux, 1987 ; Pieterse et

al., 1990 ; Nation et al., 2003). Les premiers signes évocateurs de la gestation (accumulation de

liquide dans l’utérus et apparition des membranes embryonnaires sans forcément visualiser

l'embryon) peuvent apparaître entre J21 et J25, mais la sensibilité (44,8%) est beaucoup plus faible

qu’entre J25 et J33 (97,7%), tandis que la spécificité se situe autour de 85%. On peut donc

considérer qu’il s’agit d’une technique réellement fiable à partir de J30 chez la vache. On note

également une différence dans l’efficacité de l’échographie entre les vaches et les génisses. En

réalisant des échographies entre J21 et J27 chez des génisses et entre J24 et J30 chez des vaches, on

obtient une sensibilité et une valeur prédictive positive maximale à J26 chez les génisses et J29 chez

les vaches. Cette différence est due à la position du tractus génital qui est plus basculé dans

l’abdomen une fois que l’animal a été gestant (Romano et al., 2006).

20

Lorsqu’on compare la précision de l’échographie avec le dosage des PAG pour les femelles

qui ont déjà vêlé, il n’y a pas de différence significative de précision entre J26 et J58. En revanche,

l’échographie donne moins de faux positifs si on s’intéresse aux femelles qui n’ont pas vêlé. Cette

différence semble due à la mortalité embryonnaire de 8,6% dans cette étude et à la persistance des

PAG dans le sang maternel après la résorption embryonnaire (Szenci et al., 1998). L’échographie

est une méthode fiable, facilement réalisable sur le terrain, économique et peu invasive mais elle

nécessite de l’expérience de la part du manipulateur pour obtenir les images et les interpréter. Elle

présente en outre l’avantage de permettre d’évaluer la viabilité embryonnaire ou fœtale et de limiter

les erreurs de diagnostic.

E. La palpation transrectale

Cette méthode ne peut pas être utilisée dans l’espèce ovine en raison du format de l’animal.

Elle est en revanche couramment employée chez les bovins. Il s’agit de palper l’utérus à travers la

paroi du rectum afin de déterminer s’il est gravide ou non, par la mise en évidence d'une

augmentation du diamètre des cornes utérines, par la perception de liquide dans l'utérus ou/et la

perception du fœtus, des cotylédons et des enveloppes fœtales. Cette méthode peut être mise en

pratique à partir de J35, voire J33, par un manipulateur qui en a l’expérience. Il est également

possible de mettre en évidence les membranes fœtales en pinçant la paroi utérine entre deux doigts

et en la relâchant progressivement, en faisant glisser ses doigts perpendiculairement à l'axe de la

corne. Lors de gestation, on peut sentir que l'on relâche d'abord les enveloppes fœtales avant la

paroi utérine. Cette méthode controversée n'a pourtant pas eu d'impact négatif sur la viabilité du

fœtus dans une étude réalisée dans les conditions de terrain entre J35 et J41 (Romano et al, 2007)

Warnick et al. (1995) ont observé pour un diagnostic entre J30 et J36, 10% de faux négatifs

et 16% de faux positifs, ces chiffres étant réduits respectivement à 5% et 4% à partir de J37. Il

convient donc de prendre en compte un nombre assez important de faux négatifs en début de

gestation, ce qui est confirmé par l’étude de Romano et al. (2006).

La palpation transrectale est très couramment utilisée, nécessite de l’expérience mais pas de

matériel spécifique. Elle est peu risquée pour le fœtus et peu invasive pour la mère. Cependant, elle

reste un peu plus tardive que l’échographie.

L’échographie, trans-abdominale chez la brebis et transrectale chez la vache, reste le moyen

le plus précis, sûr, rapide, pratique et économique de réaliser un diagnostic de gestation, dans les

conditions de terrain, mais il n’est pas très précoce. Le dosage des molécules dans le sang maternel,

bien que plus précoce, n’est pas utilisé car même s’il ne nécessite qu’une prise de sang, les tests

radio-immunologiques qui permettent leur détection ont un coût rédhibitoire dans les conditions

d’élevage. Au vu des résultats des différentes études, il faut tout de même attendre J30 chez les

ovins et les bovins pour avoir un diagnostic suffisamment fiable avec l’échographie, ce qui est tardif

par rapport à ce que l’on voudrait obtenir dans l’idéal (respectivement avant J17 et avant J21). Nous

sommes donc à la recherche de moyens beaucoup plus précoces de diagnostiquer la gestation chez

les ruminants.

Ces méthodes sont intéressantes pour l'éleveur, afin de lui permettre de gérer la production

laitière (élevage laitier) ou de veaux (élevage allaitant) et d'organiser son travail (surveillance des

vêlages). Cependant, quelle que soit la méthode utilisée, le diagnostic de gestation est trop tardif

pour les femelles non gestantes : on a perdu un cycle et donc 17 jours de production pour la brebis

21

et 21 jours pour la vache. On voit donc l’intérêt de détecter les femelles non gestantes le plus tôt

possible, afin de pouvoir utiliser le cycle en cours.

C’est pourquoi nous cherchons à identifier une autre méthode de diagnostic de gestation.

Cette méthode est basée sur des niveaux d'ARNm différents entre les femelles gestantes et les

femelles non gestantes, de gènes exprimés par les cellules mononuclées circulantes. Ces gènes sont

principalement des gènes stimulés par l’IFNτ.

III. Gènes stimulés par l’interféron chez les ruminants

Les ISG (interferon stimulated genes) sont des gènes dont l’expression est stimulée par

l’IFNτ produit par les cellules du trophoblaste en début de gestation. L’IFNτ est présent en grande

quantité dans la lumière utérine et stimule l'expression de nombreux gènes dans l'endomètre. Il n'a

pas pu être mis en évidence de manière directe dans le sang des femelles gestantes, néanmoins,

l'expression des ces ISG est également modifiée au niveau des cellules immunitaires circulantes lors

de gestation (Oliveira et al., 2008). Cela offre une possibilité de détection de changements

d’expression des gènes dans le sang périphérique par une prise de sang. Étant donné qu’il s’agit de

gènes étroitement liés à la gestation, on peut entrevoir l’opportunité de la détecter par une prise de

sang en se basant sur l’expression des ISG, d’où les études réalisées sur ces gènes chez les

ruminants.

A. Stimulation de l'expression des ISG par l’IFNτ

1. L’IFNτ possède une action paracrine

L’IFNτ est un petit polypeptide de 22 à 26 kDa sécrété par les cellules mononucléées du

trophoblaste qui agit de manière paracrine sur différents tissus (Schmitt et al., 1993), dont

l'endomètre, premier tissu au contact du trophoblaste. Oliveira et al. (2008) se sont intéressés à la

bioactivité de l’IFNτ en différenciant les animaux gestants et non gestants dans l’espèce ovine.

D’après cette étude, l’activité antivirale du sang est 500 à 1000 fois plus élevée dans la veine utérine

que dans l’artère utérine à J15, permettant de penser que l’IFNτ est libéré dans l’organisme

maternel par la veine utérine et permet l’induction des ISG dans les tissus extra-utérins, notamment

le corps jaune, pendant la reconnaissance maternelle. De plus, si l’IFNτ est injecté par voie sous-

cutanée, il perd son effet anti-lutéolytique et stimulateur des ISG au niveau de l’endomètre, mais

pas au niveau du corps jaune (Oliveira et al., 2008). L'action de l’IFNτ sur l'endomètre ne semble

donc emprunter que la voie paracrine, alors qu'il semble pouvoir agir différemment sur le corps

jaune, peut-être par le biais d’autres médiateurs.

2. L’action de l’IFNτ fait intervenir la voie de signalisation JAK-STAT (Stewart

et al., 2001 ; Binelli et al., 2001)

L’IFNτ agit sur ses cellules cibles en se liant à son récepteur aux IFN de type I de

l’épithélium endométrial, ce qui active la voie de transduction JAK-STAT (Janus kinase - signal

transducer and activator of transcription). La voie de signalisation JAK-STAT est initiée lorsqu’un

ligand tel qu’une cytokine vient se lier à son récepteur membranaire et active ce dernier (figure 2).

22

Cela consiste en la phosphorylation permanente d’une tyrosine avec des effets à long terme

et une translocation nucléaire de STAT-1 et 2, alors que cette phosphorylation est transitoire et

donne des effets à court terme pour STAT-3 qui subit également une translocation nucléaire. De

plus, l’IFNτ augmente l’expression de STAT-1 et 2 mais pas de STAT-3. Il y a alors formation

d’homodimères (notamment de STAT-1) et d’hétérodimères STAT-1/STAT-2 qui s’associent avec

une protéine de liaison à l’ADN nommée IRF-9 (interferon regulatory factor) (autres appellations :

ISGF3γ ; p48) pour former un facteur de transcription complexe appelé ISGF3 (interferon

stimulated gene factor 3). ISGF3 se lie à l’ADN d’un gène nommé ISRE (interferon-stimulated

response element) et les homodimères de STAT-1 se lient à l’ADN de l’élément GAS (γ-activated

sequence) afin de réguler la transcription des ISG. In vitro, sur une lignée cellulaire d’épithélium

luminal, l’IFNτ augmente la transcription des promoteurs dirigés par GAS au bout de 3 h de culture,

mais supprime leur activité au bout de 24 h, alors que la transcription des promoteurs sous

l’influence de l’ISRE est activée à 3 h et à 24 h. Il apparaît donc que l’IFNτ peut exercer une

activation différente suivant le gène considéré.

Figure 2 : Mécanisme d’activation de la voie JAK-STAT (d’après la thèse de pharmacie de

Valentino, 2009)

3. Principaux ISG étudiés chez les ruminants pendant la gestation

Dans cette partie, nous développerons succinctement les éléments essentiels concernant les

principaux ISG étudiés chez les ruminants, ainsi que deux ISG étudiés dans la partie expérimentale

de ce travail : CXCL10 et PLAC8. Les principaux ISG étudiés chez les ruminants en relation avec la

gestation sont :

- ISG15, codant pour un homologue fonctionnel de l’ubiquitine qui se conjugue à des protéines

intracellulaires afin d’en réguler d’autres, essentielles à l’établissement et au maintien de la

23

gestation. Il fonctionne comme une ubiquitine intracellulaire et comme une cytokine

extracellulaire (Han et al., 2006). D’après Klein et al. (2006), il fait partie des gènes dont

l’expression est la plus fortement augmentée en début de gestation.

- MX1 et MX2 (myxovirus resistance), dont l’expression est induite dans toutes les cellules qui

possèdent le récepteur aux IFN de type I. Ces gènes codent pour deux protéines de la famille des

GTPases qui possèdent une activité antivirale et constituent des composants clé du statut

antiviral induit par les IFN grâce à leur activité inhibitrice sur la réplication des virus à ARN,

notamment les influenzavirus et bunyavirus (Haller et al., 2007). Leur fonction dans le cadre de

la gestation n’est en revanche pas connue mais une étude menée par Racicot et Ott (2011) a

montré que la protéine Mx interagissait avec la tubuline β dans les cellules glandulaires

épithéliales de l’utérus ovin pendant l’interphase et la mitose. Cela fait supposer que Mx

entrerait en jeu dans les déplacements intracellulaires de vésicules pour lesquels la tubuline a un

rôle central.

- OAS-1 (2’,5’-oligoadenylate synthetase), codant pour une protéine impliquée dans les divisions

cellulaires ainsi que la dégradation sélective des ARN viraux et cellulaires par l’intermédiaire

d’une endoribonucléase. Il empêche ainsi la synthèse de protéines nécessaires à la réplication

virale dans les cellules hôtes et est impliqué, dans l'endomètre, dans la transition du protéome du

cycle au protéome du début de gestation (Mirando et al., 1991 ; Schmitt et al., 1993).

- IP-10 (IFN-γ inducible protein 10 kDa), aussi appelée CXCL10 car il code pour une chémokine

appartenant à la famille des chémokines C-X-C, a également été étudié pour sa présence au

moment de la mise en place de la gestation. Cette chémokine joue un rôle important pour le

recrutement et la redistribution des cellules immunitaires dans l’endomètre ovin. En effet, elle

exerce une activité chimiotactique sur les cellules NK, ainsi que sur les LMC et régule de cette

façon la migration de ces derniers. Étant donné l’importance de la distribution des cellules

immunitaires dans l’utérus pour l’implantation et la placentation, on peut en déduire

l’importance de la molécule codée par CXCL10 dans ces mécanismes. Le recrutement des

cellules immunitaires dans l’utérus sous l’influence de l’IFNτ aurait donc lieu par

l’intermédiaire de CXCL10. En effet, Nagaoka et al. (2003) ont montré qu’in vitro, la

stimulation de la migration des LMC était inhibée à plus de 70% par la présence d’anticorps

anti-CXCL10. Cela confirme que la stimulation de ce gène est un des nombreux éléments qui

concourent à la réussite d’une gestation, probablement par son rôle dans la régulation de

l’immunité.

- PLAC8 est un gène qui a été identifié chez la souris comme un gène très fortement exprimé dans

le placenta (expression restreinte au spongiotrophoblaste, dans cette espèce, Galaviz-Hernandez

et al., 2003). Chez la vache, une étude transcriptomique comparant l'expression des gènes dans

l'endomètre (caroncules vs zones inter-caronculaires) chez des vaches gestantes au moment de

l'implantation (J20) et des vaches non gestantes, a montré que PLAC8 était plus exprimé dans

l'endomètre des vaches gestantes (Mansouri-Attia et al., 2009). Il a été montré que l'expression

de PLAC8 par des fibroblastes et des cellules glandulaires épithéliales in vitro était induite par

l'IFNτ ajouté dans le milieu de culture. PLAC8 est également exprimé par l'embryon au stade

blastocyste. Après transfert d'embryons bovins ayant subi des biopsies, les embryons ayant

abouti à la naissance d'un veau exprimaient davantage PLAC8 que ceux ayant abouti à une

résorption embryonnaire (Ghanem et al., 2011). Le gène PLAC8 est donc surexprimé

localement en début de gestation et semble pouvoir constituer un témoin de la viabilité de

l’embryon.

24

B. Expression des ISG dans l'endomètre

L’expression de nombreux gènes stimulés par l’IFNτ a été étudiée en comparant les animaux

cyclés et gestants. Elle est globalement plus importante chez les animaux gestants que non gestants,

avec cependant des différences temporelles et spatiales.

Ott et al. (1998) ont comparé l’expression de MX dans l’endomètre entre des brebis

gestantes et cyclées. Chez les brebis cyclées, l'expression de MX augmentait entre J1 et J13 puis

diminuait jusqu’à J15. Chez les brebis gestantes, le niveau d’ARNm était plus élevé que chez les

cyclées à J13, était 10 fois supérieur à J15 et restait élevé jusqu’à J19. Dans le myomètre, tandis que

le niveau d’ARNm de MX était inchangé pendant le cycle, il était multiplié par 23 entre J11 et J15

chez les brebis gestantes. La gestation entraîne donc une régulation à la hausse de l’expression de

MX dans l’épithélium luminal et glandulaire, le stroma et le myomètre, avec présence de la protéine

dans toutes ces régions de l’utérus lors de la gestation (Ott et al., 1998). L’étude de Yankey et al.

(2001) a montré que l’IFNτ était bien à l’origine d’une modification de l’expression des gènes au

niveau de l’appareil génital femelle puisqu’une injection de cette hormone dans la lumière utérine a

entraîné une augmentation de l’expression de MX dans le corps jaune.

Toujours chez la brebis, il a été montré que l’expression d’OAS-1 était également

significativement plus élevée chez les brebis gestantes par rapport aux brebis non gestantes, à J16,

dans l’endomètre (Mirando et al., 1991). D’après Nagaoka et al. (2003), la présence de l’ARNm de

CXCL10 était prépondérante au moment de l’attachement du conceptus et au début de la

placentation, avec une localisation dans les monocytes qui se distribuaient au stroma sub-épithélial.

Cette expression endométriale de CXCL10 était plus élevée à J14, J17, J20 et J25 chez des brebis

gestantes par rapport aux non gestantes. En revanche, CXCL10 n'a été localisé que dans les

monocytes et non dans les lymphocytes, ni dans les cellules épithéliales ou stromales.

Dans l’espèce bovine, il a été montré qu'OAS-1 était stimulé par l’IFNτ chez les femelles

gestantes dans toutes les régions de la paroi utérine, avec une expression 30 fois supérieure par

rapport aux femelles non gestantes dans l’épithélium (luminal et glandulaire) et 10 fois supérieure

dans le stroma, à J15 et à J18 (Schmitt et al., 1993). Concernant PLAC8, il a été montré que son

expression était induite par l’IFNτ dans les fibroblastes et les cellules glandulaires épithéliales, ainsi

que dans les zones caronculaires, avec une expression plus forte chez les vaches gestantes que chez

les cyclées (Mansouri-Attia et al., 2009).

Ainsi, de nombreux gènes voient leur expression stimulée au niveau de l’endomètre au

début de la gestation, aussi bien chez la brebis que chez la vache, principalement sous l’influence de

l’IFNτ sécrété par le trophoblaste. Certaines études suggèrent de manière indirecte que l’IFNτ passe

dans le sang et modifie l’expression des ISG dans les LMC. C’est pourquoi il paraît intéressant

d'essayer de développer une méthode de diagnostic de gestation non invasive et précoce basée sur la

quantification de l'expression des ISG dans les LMC.

C. Expression des ISG dans les lymphocytes mononucléés circulants (LMC)

1. Comparaison de l’expression des ISG dans les LMC entre les femelles

gestantes et les femelles non gestantes

Chez les ovins, il a été observé que l’expression de MX dans les cellules immunitaires

circulantes était stimulée de façon rapide et prolongée 24 à 48 h après la synthèse d'IFNτ (à J15),

avec une quantité d’ARNm de MX quatre fois supérieure par rapport à une brebis cyclée (Yankey et

25

al., 2001). Le niveau d'expression était deux fois supérieure à J26 chez les brebis gestantes par

rapport aux cyclées et il était resté élevé jusqu’à J30. Le pic d’expression se situait à J21 et

l’augmentation de l’expression de MX était plus marquée lors de gestation multiple (Yankey et al.,

2001).

Chez la vache, de nombreuses études mentionnent une modification d’expression des ISG au

niveau des LMC. L’expression de MX1 et MX2 a été comparée chez des vaches laitières gestantes et

non gestantes par Gifford et al. (2007). L’expression de MX1 était augmentée dans les LMC

uniquement chez les vaches gestantes à J20, alors que MX2 était déjà surexprimé chez ces animaux

à J16. L’induction de MX2 était donc plus précoce mais aussi plus forte que celle de MX1 chez les

vaches gestantes. Une autre étude portant sur MX2 seulement a montré que son expression dans les

LMC de génisses augmentait plus fortement entre J0 et J18 chez les animaux gestants que chez les

femelles inséminées non gestantes ou encore les femelles non inséminées. Le diagnostic de

gestation a ensuite été réalisé à J21, J30, puis J60 et les auteurs ont remarqué que les femelles qui

ont subi une perte embryonnaire entre deux diagnostics présentaient une augmentation moins forte

de l’expression de MX2 dans leurs LMC (Stevenson et al., 2007).

Han et al. (2006) ont montré que l’expression d’ISG15 augmentait chez les vaches gestantes

après J16 avec un pic à J20, puis diminuait jusqu’à J32 pour revenir au même niveau qu’à J16. En

l’absence de gestation, elle diminuait, et chez les vaches gestantes qui ont subi ultérieurement un

avortement précoce, elle avait tendance à être intermédiaire ou à augmenter plus tardivement. Cela

met en évidence une relation entre la viabilité de l’embryon et l’expression d’ISG15 dans les LMC

maternels. Dans l'étude de Gifford et al. (2007), le niveau d'expression d’ISG15 dans les LMC

n'était pas significativement différent à J16 entre les vaches gestantes et non gestantes, mais il était

plus élevé chez les gestantes à partir de J18.

Ces études ont permis de mettre en évidence des différences d’expression des ISG dans les

LMC maternels entre des femelles gestantes et non gestantes, ce qui constitue un préalable à leur

utilisation pour détecter la gestation ou l’absence de gestation chez les femelles de ruminants.

2. Utilisation de la différence d’expression des ISG dans les LMC pour

diagnostiquer la gestation

En ce qui concerne la détection de la gestation chez la brebis, peu d’études se sont focalisées

sur le prélèvement de sang et la détection d’une différence d’expression dans les LMC. La brebis

étant un modèle animal moins coûteux que la vache, beaucoup d’études ont été réalisées

directement sur le tissu utérin après euthanasie. Cela a permis de mettre en évidence la

surexpression des ISG en début de gestation au niveau de l’utérus et de sélectionner ainsi les gènes

dont il est intéressant d'étudier l’expression dans les LMC. Oliveira et al. (2008) se sont basés sur

deux ISG dont les modifications d’expression sont détaillées plus haut : ISG15 et OAS-1. D’après

cette étude menée en parallèle sur des brebis gestantes et non gestantes, l’expression de ces deux

ISG était significativement supérieure chez les animaux gestants au niveau de l’endomètre, mais

aussi dans le sang recueilli à la jugulaire et dans les grandes cellules lutéales du corps jaune à J15.

Cela met donc bien en évidence une relation entre la gestation et une augmentation de l’expression

d’ISG15 et d’OAS-1 détectable dans le sang périphérique à J15 car cette augmentation n’a pas lieu

chez des animaux non gestants comparables. D’après cette étude, ces ISG sont des outils valables

pour distinguer mortalité embryonnaire et défaut de fécondation, ainsi que pour identifier les

animaux non gestants, mais sont contre-indiqués pour diagnostiquer la gestation car ils ne sont pas

suffisamment fiables.

26

Comme pour la brebis, des études se sont intéressées à l’efficacité des ISG pour détecter la

gestation chez la vache. Han et al. (2006) ont choisi de travailler sur des vaches laitières et de les

désigner comme gestantes ou non selon le niveau d’expression d’ISG15. Les prélèvements sanguins

ont été réalisés à J18 ou tous les jours entre J17 et J25 afin d’extraire les ARNm et de mesurer la

progestéronémie. Par ailleurs, des échographies ont été réalisées à J32 et le diagnostic était resté

confidentiel jusqu’à l’obtention des résultats pour ISG15. Les auteurs ont réalisé des analyses

statistiques qui leur ont permis de conclure que par la quantification du niveau d'expression

d’ISG15, on obtenait :

- une sensibilité de 81%, une spécificité de 75%, une valeur prédictive positive de 62% et

une valeur prédictive négative de 89% avec un prélèvement unique à J18,

- une sensibilité de 100%, une spécificité de 86%, une valeur prédictive positive de 78% et

une valeur prédictive négative de 100% avec les prélèvements en série.

Ils ont comparé ces résultats à ceux obtenus avec la mesure de la progestéronémie pour

laquelle on obtient dans cette étude une sensibilité ainsi qu’une valeur prédictive négative de 100%

dans les deux cas (J18 et prélèvements en série entre J17 et J25). Les prélèvements en série

améliorent la spécificité qui passe de 41% à 64% et la valeur prédictive positive qui passe de 47% à

58%. La détection de la gestation en se basant sur des niveaux élevés d’ISG15 dans les LMC

s’avère donc plus fiable que la progestéronémie à ce stade mais reste imprécise. On remarque que

les valeurs prédictives négatives sont plus élevées que les valeurs prédictives positives. On pourrait

donc utiliser un seuil d'expression d’ISG15 faible pour désigner les animaux non gestants avec une

meilleure efficacité. Cependant, cette méthode nécessite une prise de sang tous les jours pendant

huit jours, ce qui est très lourd au niveau de la contention et du coût, pour être vraiment fiable. Le

prélèvement unique à J18 apporte une solution intermédiaire moins fiable mais aussi moins

compliquée à mettre en place.

Le potentiel de MX2 comme marqueur de la gestation chez la vache à J18 a été étudié par

Stevenson et al. (2007) qui ont montré qu’en plus d’une sensibilité et d’une spécificité faibles

(respectivement 57% et 63%), ainsi que des valeurs prédictives positive et négative également

insuffisantes (respectivement 63% et 57%), cette méthode diagnostique présentait une faible

corrélation avec les autres méthodes utilisées. Il s’agit donc d’une méthode de diagnostic de

gestation non fiable à J18.

Dans une étude plus récente, Green et al. (2010) ont également fixé J18 comme date limite

pour connaître le statut de la vache, ce qui permettrait de construire un protocole de synchronisation

sur trois jours. Il consisterait en une injection de PGF2α pour lyser le corps jaune l’après-midi de

J18 ou le matin de J19, puis une injection de GnRH 2 à 2,5 jours après (J21), suivie de

l’insémination artificielle. On profiterait ainsi du corps jaune mature et du gros follicule dominant

normalement présents à ce moment du cycle en cours qui ne serait ainsi pas perdu, tandis que les

actuels programmes de resynchronisation permettent une ré-insémination entre J28 et J56. Leurs

expériences ont porté sur trois ISG : MX2, ISG15 et OAS-1 et ils ont comparé l’évolution de leur

expression sous forme de ratio par rapport au gène de référence qui était ici la cyclophiline A. Dans

une première expérience, ce ratio augmentait entre J14 et J20 pour MX2 et ISG15 chez les femelles

gestantes uniquement, mais les auteurs n'ont pas pu définir de valeur seuil entre les femelles

gestantes et les non gestantes. Dans une deuxième expérience, la prise de sang était réalisée à J17

ou à J18. Un résultat similaire a été observé pour MX2 et OAS-1 à J17. Mais à J18, l’expression de

ces ISG n’était significativement augmentée que pour les primipares et non pour les multipares.

Même pour les primipares, aucun seuil n'a pu être défini (30% de faux positifs, même chez les

27

primipares). Un effet de la parité a été observé dans cette étude, en faveur d’une meilleure détection

chez les primipares. Dans la troisième expérience, les auteurs ont choisi de mesurer l’expression de

MX2 et OAS-1 deux fois pour chaque femelle : à J18 du cycle précédent l'insémination (échantillon

1) et à J18 après l'insémination (échantillon 2), puis d'utiliser le ratio échantillon 2 sur échantillon 1

pour chacun des gènes. Les ratios étaient significativement plus élevés pour les primipares gestantes

que pour les primipares non gestantes. Aucune différence n'a été observée pour les multipares.

Cependant, même cette méthode a obtenu encore 54% de faux positifs avec OAS-1 et 31% avec

MX2 pour les primipares. En revanche, 100% de vrais positifs et 0% de faux positifs ont été observé

pour OAS-1 chez les génisses. Cette méthode de diagnostic nécessite tout de même deux

échantillons, donc elle n’est pas applicable en pratique. Chez la génisse, la seule mesure à J18

pourrait être un test raisonnable car elle donne 82% de vrais positifs et 0% de faux positifs. Elle ne

nécessite qu’un échantillon mais manque de précision.

On constate donc que malgré l’augmentation significative de l’expression d’un grand

nombre d’ISG précocement au cours de la gestation chez les ruminants, on ne peut pas définir de

valeur seuil à partir de laquelle on serait sûr du statut de l’animal avant J20. Les résultats montrent

un trop grand nombre de faux positifs, même chez les primipares. Par conséquent, les ISG

précédemment étudiés ne constituent pas des marqueurs suffisamment fiables en début de gestation

pour servir de méthode diagnostique.

IV. Présentation de deux gènes non stimulés par l’IFNτ : FOS et PBEF-1

Lors de la gestation, l’expression de nombreux gènes est modifiée devant la complexité du

phénomène biologique se mettant en place. Parmi ces gènes, les ISG ont une grande importance

mais présentent l’inconvénient de ne pas être spécifiques de l’IFNτ, mais de tous les interférons de

type 1. Leur stimulation n’est donc pas spécifique de la gestation, ce qui explique la grande

variabilité entre les individus et le manque de fiabilité des diagnostics de gestation se basant sur la

quantification de l’expression des ISG. D’après les résultats d’une analyse transcriptomique réalisée

dans le laboratoire, nous avons identifiés des gènes différentiellement exprimés entre des brebis

gestantes et non gestantes à J15 et qui ne sont pas décrits comme étant régulés par les interférons.

Parmi ces gènes, certains voient leur expression amplifiée alors que l’expression d’autres gènes

diminue. Ces gènes pourraient donc servir de marqueurs de la gestation. Nous en avons choisi deux

pour validation du différentiel d’expression par qPCR dans la deuxième partie de ce travail : FOS et

PBEF-1. Cette partie présente succinctement ces deux gènes.

A. Le gène FOS (FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog)

FOS code pour deux protéines homologues : l’homologue B (B-fos) et l’homologue C (C-

fos), qui sont des facteurs de transcription. Elles peuvent se dimériser avec d'autres facteurs de

transcription (le plus souvent de la famille JUN) : cette dimérisation forme le complexe

transcriptionnel AP-1 (activator protein-1). Avec C-jun, C-fos reconnait précisément la séquence de

nucléotides TGACTC. L'activité de C-fos peut être modulée lorsqu'elle est phosphorylée. Comme la

plupart des facteurs AP-1, C-fos est présent dans les cellules en faible quantité mais peut être induit

et activé très rapidement en réponse à des stimuli spécifiques, tels que différentes hormones,

facteurs de croissance, cytokines... (Karin, 1995). FOS intervient dans de nombreuses fonctions et

mécanismes cellulaires, tels que :

http://fr.wikipedia.org/w/index.php?title=Complexe_transcriptionnel_AP-1&action=edit&redlink=1

http://fr.wikipedia.org/w/index.php?title=Complexe_transcriptionnel_AP-1&action=edit&redlink=1

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- la prolifération et la différenciation cellulaire : il a été montré que la croissance et la

multiplication cellulaires dépendaient de la synthèse de polyphosphoinositides induite par C-fos,

à la fois in vitro sur l’élongation neurale et in vivo sur des tumeurs du système nerveux (Alfonso

Pecchio et al., 2011). D’après une étude menée par Diaz Sanchez-Bustamante (2008), b-FOS

jouerait un rôle dans la transdifférenciation de cellules adipeuses en cellules osseuses, ce qui

offrirait alors une application en régénération cellulaire.

- les processus tumoraux : lors de processus cancéreux, FOS devient une des cibles

transcriptionnelles de STAT-1 en l’absence de STAT-3. STAT-1, qui est normalement un gène

oncosuppresseur, induit alors la transcription de nouveaux gènes cibles connus pour diriger les

réponses mitotiques vers la transformation tumorale, dont FOS (Schiavone et al., 2011). FOS

est par exemple un acteur clé dans la pathogénèse du carcinome hépatocellulaire chez l’homme

(Li et al., 2009). Il pourrait ainsi servir de marqueur afin de désigner les cellules cancéreuses

dans lesquelles il est surexprimé.

- le métabolisme lipidique : FOS est aussi un gène qui intervient dans le métabolisme, notamment

lipidique. En effet, il fait partie des gènes dont l'expression est modifiée en réponse à la statine

ou selon le niveau de cholestérol dans le sang périphérique chez l’homme. La statine est une

molécule hypolipidémiante utilisée pour diminuer la cholestérolémie qui a aussi une action sur

la fixation de l’antigène, la réponse immunitaire ou inflammatoire, dont les voies qui font

intervenir les interleukines (Won et al., 2012).

- l’inflammation (Hossaini et al, 2011)…

Enfin, d’après Xie et al. (2011), l’expression de FOS pourrait être un marqueur des émotions

puisqu’elle a été détectée dans certains neurones lors de comportements sexuels et agonistiques

chez le poulet domestique.

FOS a montré son intérêt en tant que marqueur pour de nombreux processus différents :

processus tumoral, inflammation, anomalie métabolique, athérosclérose, tabagisme (Saliques et al.,

2011), activité neuronale (Hossaini et al., 2011). C’est ce rôle de marqueur en lien avec

l’inflammation qui servira dans la deuxième partie de ce travail en relation avec la modification de

l’état inflammatoire lors de la gestation.

B. Le gène PBEF-1 (pre-B-cell colony enhancing factor 1)

La molécule codée par PBEF est une protéine de 52 kDa très conservée au cours de

l’évolution. Elle a d’abord été découverte en tant que facteur de croissance qui renforce la

maturation des précurseurs des cellules B en synergie avec IL-7 et le facteur des cellules souches,

ce qui suggérait une fonction de cytokine (Hui Jia et al., 2004). Elle a par la suite été redécouverte

en tant qu’enzyme catalysant l’étape limitante de la voie de récupération du di-nucléotide

nicotinamide-adénine (NAD), élément vital du métabolisme cellulaire des mammifères, ce qui lui a

valu le nom de NAMPT (nicotinamide phosphoribosyltransferase), ainsi qu’un élargissement de ses

activités biologiques potentielles avec des mécanismes extracellulaires et intracellulaires (Reddy et

al., 2008). En outre, on croyait initialement que ce peptide était produit uniquement par le tissu

adipeux viscéral (adipocytes et macrophages infiltrants) étant donné la corrélation entre la quantité

de tissu adipeux viscéral et le niveau de PBEF circulant, d’où son autre nom de visfatin. Cependant,

sa production semble concerner également d’autres tissus et cellules, tels que le muscle

squelettique, le foie, les cellules immunes, les cardiomyocytes et le cerveau. Ces caractéristiques

font que cette molécule peut être impliquée dans de nombreux processus pathophysiologiques et

notamment dans :

29

- les désordres métaboliques : PBEF joue un rôle significatif dans le métabolisme lipidique en

intervenant dans la différenciation des adipocytes, sans que les mécanismes soient connus. En

effet, d’après Tabassum et al. (2012), PBEF-1 est associé à l’obésité chez l’Homme : suivant les

allèles possédés par les individus, ils sont plus ou moins à risque de développer de l’obésité. De

plus, cette adipocytokine a une fonction mimant celle de l’insuline en se fixant à son récepteur :

il s’agit donc d’un régulateur clé de la résistance à cette hormone. Par ailleurs, elle interviendrait

dans le métabolisme thyroïdien : dans l'étude de Han et al. (2012), les individus

hyperthyroïdiens et hypothyroïdiens avaient une concentration plasmatique de ce peptide

significativement plus élevée par rapport à des témoins euthyroïdiens. Le rôle des hormones

thyroïdiennes étant de réguler le métabolisme corporel en augmentant la lipolyse, ce qui

participe au gain et à la perte de poids, on comprend l’interaction qu’elles peuvent avoir avec la

production de PBEF par les adipocytes.

- les processus tumoraux : de nombreuses études ont observé une surexpression de PBEF-1 lors

de certains cancers (Bi et Che, 2010). PBEF-1 régule différentes voies de signalisation. Les

rôles de ce facteur dans la carcinogenèse ne sont donc pas parfaitement décrits, mais il a été

observé un lien entre le niveau d'expression de PBEF-1 par certaines tumeurs et leur résistance à

la chimiothérapie. Enfin, quelques études ont montré une relation entre l'expression de PBEF-1

et l'évolution clinique des patients lors de leucémie myéloïde aiguë (Eisele et al., 2007), de

différents grades d’astrocytome (Reddy et al., 2008), de cancer de l’estomac (Nakajima et al.,

2009) ou du côlon (Nakajima et al., 2010), suggérant une potentielle valeur pronostique du

dosage sérique de PBEF-1, une concentration élevée allant dans le sens d'une évolution

défavorable.

- les maladies inflammatoires et infectieuses (infection par le VIH, septicémie…) (Hui Jia et al.,

2004 ; Moschen et al., 2007 ; Šenolt et al., 2011) : PBEF-1 peut être sécrété par les lymphocytes

activés, mais aussi par les neutrophiles en réponse à des stimuli inflammatoires tels que le

lipopolysaccharide, les cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-1β et IL-6) ainsi que les

immuno-modulateurs non spécifiques, ce qui lui confère un rôle significatif dans l’immunité

innée. Il peut également activer des leucocytes, induire la production des cytokines pro-

inflammatoires (IL-1β, TNF-α et surtout IL-6) et stimuler l’expression des molécules co-

stimulantes de surface CD54, CD40 et CD80. Une surexpression de PBEF a été observée dans

de nombreux processus inflammatoires tels que la maladie inflammatoire des intestins, le

dysfonctionnement endothélial (les cytokines pro-inflammatoires affectant la fonction

vasculaire), l’ostéo-arthrite, l’arthrite rhumatoïde, l’athérosclérose, la chorioamniotite (infection

du tissu placentaire et du liquide amniotique) (Hui Jia et al., 2004 ; Moschen et al., 2007 ;

Gunes et al., 2012 ; Jacques et al., 2012) ainsi que dans l’obésité qui est étroitement liée à

l’inflammation systémique avec une surexpression de TNF-α et IL-6 dans le tissu adipeux des

sujets obèses, ce qui contribue à la résistance de ces personnes à l’insuline (Moschen et al.,

2007). Ces données permettent de faire l’hypothèse que cette adipocytokine peut avoir un rôle

dans un large spectre de maladies infectieuses et inflammatoires.

- la défaillance cardiaque, l’athérosclérose, et les processus neuro-dégénératifs (Dahl et al., 2012).

Le rôle exact de PBEF n’est pas identifié dans ces processus pathologiques mais sa

surexpression significative dans de nombreuses maladies infectieuses et inflammatoires en fait un

bon marqueur, ce qui nous intéresse ici dans le cadre de la gestation qui induit aussi des

modulations inflammatoires et immunitaires dans l’organisme en dehors de la présence d’une

anomalie.

30

Malgré les nombreuses méthodes existantes qui permettent de diagnostiquer la gestation

chez les ruminants, aucune n’est à l’heure actuelle suffisamment précoce pour diagnostiquer la

gestation avant le retour en chaleur. Nous sommes donc à la recherche d’un test diagnostic à la fois

plus précoce, mais aussi pratique à utiliser en élevage et peu coûteux. Le plus simple serait de le

réaliser sur du sang ou du lait, ce qui permet un prélèvement non invasif. C’est en cela qu’intervient

l’intérêt des marqueurs présents sur les LMC.

31

DEUXIEME PARTIE : Étude expérimentale

Ce travail a été réalisé dans le but de déterminer si on pouvait différencier des brebis

gestantes de brebis non gestantes dès le début de la gestation (à J15) en se servant de la différence

d’expression de gènes liés à celle-ci. Dans un premier temps, une analyse transcriptomique a été

réalisée (non présentée ici), permettant d'identifier une centaine de gènes différentiellement

exprimés dans les LMC de brebis gestantes et de brebis non gestantes. Parmi ces gènes, nous avons

choisis de valider le différentiel d’expression par RT-qPCR de cinq de ces gènes sur un effectif de

brebis plus grand. STAT-1, CXCL10 et PLAC8 ont été choisis car ils sont connus pour être stimulés

par l’IFNτ en début de gestation dans l'endomètre, et FOS et PBEF-1 ont été sélectionnés car

justement ils ne sont pas connus pour être influencés par l'IFNτ. Ce sont les résultats de la

quantification des ARN de ces cinq gènes qui sont présentés ici.

I. Matériels et méthodes

A. Animaux

Le travail personnel se base sur une étude réalisée à la station INRA de Jouy-en-Josas, sur

32 brebis de race Préalpes du Sud, toutes multipares (entre 3 et 5 gestations). Les chaleurs de ces

animaux ont été synchronisées à l’aide de la méthode Syncro-part® (CEVA, Libourne, France) :

une éponge de 40 mg de fluorogestone a été placée dans le vagin pendant 14 jours et une injection

de 400 UI d’eCG a été réalisée le jour du retrait du dispositif. Les brebis ont alors été réparties de

façon aléatoire en trois lots : 16 brebis ont été inséminées 48 h après le retrait de l’éponge (J0=jour

de l’insémination) avec du sperme provenant d’un même bélier (lot IA pour Insémination

Artificielle) ; 7 brebis n’ont pas été inséminées (lot CYCL pour Cyclées) ; 9 brebis ont été

inséminées avec le sperme du même bélier traité thermiquement (2 heures à 37 °C) afin d’épuiser

les réserves énergétiques des spermatozoïdes pour les rendre non fécondants (lot LS pour Liquide

Séminal). Ce dernier lot a été réalisé en raison de la réaction inflammatoire de l’endomètre, qui

modifie le profil d’expression de certains gènes, provoquée par le contact avec le liquide séminal

(Scott et al., 2009).

B. Prélèvements

Des prises de sang (5 mL de sang sur tube sec : Venoject®, Terumo, Guyancourt, France)

ont été réalisées à la veine jugulaire à J0, J3, J6, J9 et J12 afin d’effectuer des dosages de

progestérone. Une dernière prise de sang a été pratiquée à J15 pour effectuer l’extraction des

leucocytes mononucléés circulants (LMC) (50 mL de sang sur tube citrate : Buffered Na3-citrate

5 mL, Venoject®, Terumo).

Les brebis ont été abattues à J15, peu de temps après la dernière prise de sang. L’utérus a été

isolé et les deux cornes ont été rincées simultanément à l’aide de 50 mL de tampon PBS (Phosphate

Buffer Saline) afin de récupérer d’éventuels embryons. La gestation a été objectivée par la

visualisation directe d’un ou plusieurs embryons à la loupe binoculaire. Les embryons, ainsi que les

corps jaunes, ont été comptabilisés pour chaque brebis.

32

C. Isolement des leucocytes mononucléés circulants (LMC)

Les LMC ont été isolés immédiatement après la prise de sang, par une méthode utilisant un

gradient de Percoll selon le protocole décrit par Inghels (2012) et congelés à -80 °C dans du Trizol

LS® (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France) jusqu’à l’extraction des ARNs. Deux échantillons (un

dans le lot CYCL et l'autre dans le lot IA) ont été perdu, respectivement en raison d’une

concentration trop élevée du Percoll, ce qui a provoqué une lyse des érythrocytes et par absence de

culot de LMC après centrifugation.

D. Dosage de progestérone

Les prélèvements de sang ont été centrifugés à 1500 tours/minute pendant 10 minutes à

température ambiante (20 °C) après avoir décanté durant 30 minutes à 20 °C. Le sérum a alors été

prélevé puis congelé et le taux de progestérone a été déterminé par ELISA (kit Ovucheck® Plasma,

Biovet, St-Hyacinthe, Canada).

E. Extraction des ARN

Les LMC ont été décongelés progressivement puis homogénéisés à l’aide d’une aiguille 18

gauges et d’une seringue de 2 mL avant d’être transférés dans des tubes Eppendorf de 2 mL. Les

ARNs de chaque échantillon ont été extraits au Trizol LS® (Invitrogen) selon le protocole suivant :

- ajout de 200 µL de chloroforme par mL de Trizol,

- après une incubation de 3 minutes à température ambiante, centrifugation à 12000

tours/minute pendant 15 minutes à 4°C,

- prélèvement du surnagent transféré dans un tube de 2 mL,

- ajout d'un volume égal d’éthanol 70%.

Puis tous les échantillons d'ARN ont été purifiés et traités à la DNase I à l’aide du RNeasy

Mini kit® (Qiagen, Courtabœuf, France), selon le protocole indiqué par le fabricant. Enfin, on a

quantifié les ARN obtenus par spectrophotométrie (Nanodrop ND-3300, Labtech, Wilmington,

USA) et on a évalué l’absence de dégradation des ARN par migration sur gel d’agarose à 2 % en

TBE 1X, suivie d’une coloration au bromure d’éthidium (BET ; Invitrogen). On a également évalué

la qualité d’une partie des ARN par l’Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent, Santa Clara CA, USA).

Les ARN ont été stockés en solution aqueuse après adjonction d’1 µL d’inhibiteur de

RNases dans chaque tube (Rnasine Plus Promega, Charbonnières-les-Bains, France). Les tubes ont

été étiquetés et conservés à -80 °C jusqu'à la rétrotranscription. Lors de cette étape, un échantillon

(lot CYCL) n’a pas pu être exploité en raison d’une quantité trop faible d’ARN obtenue après

extraction.

F. Rétrotranscription des ARNm

La rétrotranscription des ARN a été réalisée à partir d'un µg d’ARNm préalablement dosé au

Nanodrop ND-3300 (Labtech), en utilisant la Superscript II (Invitrogen) avec de l’oligo (dT)

(Invitrogen), selon les recommandations du fabricant. Brièvement :

- ajout d'un µL de MIX 1 (mélange volume à volume d’oligo dT 12-18, Invitrogen et de

dNTP 10 mM) par µg d’ARN,

33

- incubation à 65 °C pendant 5 minutes,

- ajout de 7 µL de MIX 2 (4 µL de Buffer 5X First Strand, Invitrogen + 2 µL de DDT 0,1

M, Invitrogen + 1 µL d’eau exempte de RNase) par µg d’ARN,

- incubation à 42 °C pendant 2 minutes,

- ajout d'un µL de Superscript II RT (Invitrogen, 200 U/µL) par µg d’ARN,

- incubation à 42 °C pendant 50 minutes, puis à 70 °C pendant 15 minutes.

Deux réactions de rétro-transcription par échantillon ont été réalisées et les deux produits

ont été poolés. Les ADNc obtenus ont été dilués 5 à 500 fois dans de l’eau exempte de DNase. Les

échantillons ont été conservés à -20 °C jusqu’à leur utilisation en qPCR.

G. PCR en temps réel

Cinq gènes ont été choisis parmi les gènes différentiellement exprimés (GDE) identifiés par

une analyse transcriptomique, pour confirmer un niveau différentiel d’expression à partir des 29

échantillons d’ARN issus de l’ensemble des brebis qui ont pu être incluses dans ce protocole : FOS,

PBEF-1, PLAC8, STAT-1 et CXCL10. Trois gènes de ménage couramment utilisés chez l’ovin ont

également été choisis pour normaliser les données : β-actine, GAPDH et RPL19. Pour chaque gène,

un couple d’amorces a été dessiné à l’aide de l’application « Primer Blast » (NCBI,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast), synthétisé et fourni par Eurogentec (Liège,

Belgique). Les amorces utilisées sont représentées dans le tableau 1.

L’efficacité d’amplification de chaque couple d’amorces a été testée sur une gamme de

référence, obtenue par mélange d’échantillons représentant les différentes conditions

physiologiques présentes au sein du protocole expérimental, et par dilutions successives (dilutions

au ¼) à partir de la solution mère issue de la RT. Les produits de PCR ont été analysés par

migration sur un gel d’agarose à 2 % en TBE 1X, suivie d’une coloration au bromure d’éthidium

(BET ; Invitrogen) et d’une lecture au phospho-imageur FLA-3000 (Fujifilms France, Bois d’Arcy,

France). La taille des fragments a ensuite été mesurée et comparée à la taille attendue des

amplicons, puis les produits de PCR ont été adressés au laboratoire Beckman Coulter Genomics

(Takeley, Royaume-Uni) pour séquençage afin de vérifier que l’amplicon obtenu correspondait bien

au gène d’intérêt.

Les échantillons, ainsi que les points de gamme, ont été déposés (5 µL) en dupliquas sur une

plaque de 96 puits (Applied Biosystems, Carlsbad, USA) avec 10 µL de master mix (SYBRGreen®,

Applied Biosystems + amorces du gène à 0,3 ou 0,15 µM selon le gène étudié). Les réactions de

PCR en temps réel ont été réalisées sur un appareil de type Step One Plus (Applied Biosystems)

selon le programme suivant :

- 10 minutes à 90 °C ;

- 45 cycles de 15 secondes à 95 °C suivis par 1 minute à 60 °C ;

- dissociation des amorces : 15 secondes à 95 °C, 20 secondes à 90 °C, puis 15 secondes à

95 °C.

Le logiciel associé à l’appareil permet de vérifier l’efficacité de l’amplification, la cohérence

des niveaux d’expressions déterminés entre les deux dépôts correspondant au même échantillon,

l’absence d’amplification pour les témoins négatifs (pureté de l’eau) et qu’on amplifie bien un seul

gène.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast

34

Le niveau d’expression des transcrits dans les échantillons a été déterminé à l’aide de la

courbe standard correspondant à la gamme de référence au sein de laquelle chaque point correspond

à une quantité arbitraire attribuée par convention. Le logiciel qbaseplus

(Biogazelle, Zwijnaarde,

Belgique) a ensuite permis de rapporter les niveaux d’expression pour les échantillons à un facteur

de normalisation déterminé à partir des gènes de ménage GAPDH et RPL19, l’actine ayant été

éliminée par le logiciel en raison d’une trop grande variabilité.

Tableau 1 : Orientation, séquence, température de fusion des amorces pour chaque gène amplifié

en RT-qPCR et taille attendue des amplicons.

Nom du gène

Sens Séquence de l’amorce (5’ vers 3’)

Température de fusion

Taille attendue de l’amplicon

FOS sens

anti-sens TCATCCTAGCGGCTCACCGACC

CTTCAGATTCAGGGGTGGCAGC

55,3

55,3 126 pb

PBEF-1 sens

anti-sens CTTGAGGGCTCTGTCATTCC

TGATTGGATACCAGGACTGAACA 64,0

48,4 121 pb

STAT-1 sens

anti-sens GTGGCGGAGAGTCTGCAGCA

GGTGAGTTGGCATGCAGGGC

66,0

66,0 190 pb

PLAC8 sens

anti-sens AGCGGTCCGGTACCTCAAAA

CAGATGCAACTTGACACGCA

62,0

60,0 121 pb

CXCL10 sens

anti-sens CACTCCTCAACTCTTCAGGC

CCATTCCTTTTCATTGTGGC

62,0

58,0 262 pb

GAPDH sens

anti-sens GCTGACGCTCCCATGTTTGT

TCATAAGTCCCTCCACGATGC 67,4

66,1 243 pb

RPL19 sens

anti-sens CCCCAATGAGACCAATGAAATC

CAGCCCATCTTTGATCAGCTT 66,2

65,3 73 pb

β-actine sens

anti-sens GCTTTACCACCACAGCCGAG

CGACGCAGCAGTCATCT 69,8

61,5 100 pb

H. Analyses statistiques

Toutes les données ont subi une transformation logarithmique et ont été traitées

statistiquement par la procédure One-Way ANOVA suivie d’un post-test Tuckey-Kramer à l’aide du

logiciel Graph Pad Prism (Version 4.0 ; GraphPad Software, La Jolia, USA). Les figures ont

également été dessinées par le logiciel Graph Pad Prism (Version 4.0 ; GraphPad Software) à partir

des données non transformées mais normalisées de manière à ce que la moyenne du lot LS soit

égale à 1.

35

II. Résultats

A. Diagnostics de gestation

La gestation a été objectivée par observation directe des embryons lors du lavage de l’utérus

le jour de l’abattage. Sur les 16 brebis inséminées avec du sperme normal, 8 étaient gestantes (lot

G15) et les 8 autres étaient non gestantes (lot IA vide). Les 9 brebis ayant reçu du sperme inactivé

(lot LS), ainsi que les 7 brebis non inséminées (lot CYCL), étaient effectivement non gestantes.

Le nombre d’embryons a également été comptabilisé pour chaque brebis gestante (tableau

2).

Tableau 2 : Répartition du nombre de brebis gestantes selon le nombre d'embryons observés.

Nombre d'embryons Nombre de brebis

1 2

2 4

3 1

5 1

B. Dosage de progestérone

Le dosage de la progestérone plasmatique a montré que la progestéronémie augmentait entre

J0 et J12, que les brebis soient gestantes ou non. Certains profils de progestéronémie anormaux ont

été observés : deux brebis n’ont pas réellement présenté d’augmentation de la progestéronémie (une

brebis dans le lot IA vide et une dans le lot LS), deux brebis ont présenté un retard à l’augmentation

de la progestéronémie par rapport aux autres (une dans le lot CYCL et une dans le lot LS) et une

brebis du lot CYCL a présenté une chute prématurée de la progestéronémie. Cependant, aucune

différence significative n’a été observée entre les 4 lots, quelque soit le jour du prélèvement.

C. Niveau d'expression de gènes candidats par RT-qPCR en temps réel

Parmi les gènes dont le niveau d’expression différait dans les LMC entre les brebis des lots LS et

G15, selon l’analyse transcriptomique, nous avons retenu cinq gènes. Les trois premiers sont des

gènes stimulés par l'IFNτ et ils étaient surexprimés chez les brebis du lot G15 : CXCL10, PLAC8 et

STAT-1. Les deux autres gènes étudiés ne sont pas connus pour être dépendants de l'IFNτ et ils

étaient sous-exprimés chez les brebis du lot G15 : FOS et PBEF-1. Nous avons mesuré le niveau

d’expression relatif de ces gènes dans les LMC issus de l’ensemble des brebis incluses dans cette

étude (n=29).

CXCL10 était significativement surexprimé dans les LMC des brebis gestantes (lot G15) par

rapport aux brebis non gravides des trois autres lots (lots CYCL, IA vide et LS) (p < 0,001) (figure

36

3). La variabilité des niveaux d'expression relatifs individuels dans chacun des lots est illustrée dans

la figure 4.

Figure 3 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de CXCL10 mesurés par PCR en temps réel

dans les leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis cyclées, IA

vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis inséminées avec du sperme

inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ± SEM. ** p<0,01.

Figure 4 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de CXCL10 dans les

leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis cyclées, IA vide :

brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis inséminées avec du sperme inactivé,

G15 : brebis gestantes).

**

37

PLAC8 était significativement surexprimé dans les LMC des brebis gestantes (lot G15) par

rapport aux brebis non inséminées (lot CYCL) (p < 0,05) et les brebis non gestantes du lot IA vide

(p < 0,01). En revanche, le niveau d'expression moyen de PLAC8 n’était significativement pas

différent entre les brebis du lot LS et celles du lot G15 (figure 5). La variabilité des niveaux

d'expression relatifs individuels dans chacun des lots est illustrée dans la figure 6.

Figure 5 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de PLAC8 mesurés par PCR en temps réel



inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ± SEM. a,b : des lettres différentes indiquent une

différence significative (p<0,05).

a

b

a,b

a

38

Figure 6 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de PLAC8 dans les leucocytes

mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis cyclées, IA vide : brebis vides

inséminées avec du sperme normal, LS : brebis inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis

gestantes).

STAT-1 était significativement surexprimé dans les LMC des brebis gestantes (lot G15) par

rapport aux brebis non inséminées (lot CYCL) (p < 0,05) et les brebis inséminées non gestantes

(lots IA vide et LS) (p < 0,001) (figure 7). La variabilité des niveaux d'expression relatifs

individuels dans chacun des lots est illustrée dans la figure 8.

Figure 7 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de STAT-1 mesurés par PCR en temps réel



inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ± SEM. a,b,c : des lettres différentes indiquent

une différence significative (a,c : p < 0,05 ; b,c : p < 0,01).

a

c

a,b a,b

39

Figure 8 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de STAT-1 dans les leucocytes



gestantes).

Aucune différence significative d'expression n'a été observée pour FOS entre les quatre lots

de brebis (figure 9). La variabilité des niveaux d'expression relatifs individuels dans chacun des lots

est illustrée dans la figure 10.

Figure 9 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de FOS mesurés par PCR en temps réel dans

les leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis cyclées, IA


inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ± SEM.

40

Figure 10 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de FOS dans les leucocytes



gestantes).

PBEF-1 était significativement surexprimé dans les LMC des brebis gestantes (lot G15) par

rapport aux brebis inséminées non gestantes (lots IA vide et LS) (p < 0,01), mais son niveau moyen

d'expression pour le lot G15 n'était pas différent de celui des brebis non inséminées (lot CYCL)

(figure 11). La variabilité des niveaux d'expression relatifs individuels dans chacun des lots est

illustrée dans la figure 12.

Figure 11 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de PBEF-1 mesurés par PCR en temps réel



inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ± SEM. a,b : des lettres différentes indiquent une

différence significative (p<0,01).

a

b

a,b

a

41

Figure 12 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de PBEF-1 dans les

leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis cyclées, IA vide :

brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis inséminées avec du sperme inactivé,

G15 : brebis gestantes).

III. Discussion

Chez les ruminants, en début de gestation, de nombreux gènes voient leur expression

modifiée avant même l’implantation, afin d’adapter l’environnement utérin à la gestation. Parmi ces

gènes, nombreux sont ceux qui sont sous l’influence de l’IFNτ qui stimule leur expression.

Certaines analyses transcriptomiques ont mis en évidence que l'expression d’autres gènes étaient

modifiée pendant la gestation, sans lien apparent avec cette cytokine sécrétée par le conceptus

(Mansouri-Attia et al., 2009 ; Forde et Lonergan, 2012). Ces modifications d’expression se

produisent localement (endomètre) mais également dans les leucocytes mononucléés circulants

(LMC), et ce, très rapidement (24-48 h après le début de la production de l’IFNτ). Dans les LMC, il

est possible d’objectiver la modification d’expression de certains gènes en début de gestation par un

prélèvement de sang périphérique (Gifford et al., 2007 ; Oliveira et al., 2008). Il est ainsi fait

l'hypothèse que la mesure du niveau d'expression d'un gène ou de certains gènes dans les LMC

pourrait permettre de diagnostiquer une gestation chez les ruminants (et plus particulièrement dans

l'espèce bovine), plus précocement (si possible avant la fin du cycle œstral en cas d'absence de

gestation) que par les méthodes déjà existantes. Dans l’espèce bovine, cela permettrait de

réinséminer un animal non gestant sans perdre un cycle et ainsi, réduire la durée de la période

improductive en réduisant l’intervalle vêlage – insémination fécondante.

Dans le travail présenté dans ce document, nous avons comparé l'expression dans les LMC

de cinq gènes entre des brebis gestantes et brebis non gestantes, par PCR en temps réel, afin de

déterminer si l'un d'eux pouvait constituer un bon marqueur de la gestation. Ces cinq gènes ont été

choisis à partir des résultats d'une analyse transcriptomique réalisée précédemment à partir des

mêmes échantillons et des données bibliographiques. Nous avons choisi trois gènes stimulés par

l’IFNτ (CXCL10, PLAC8 et STAT-1) et deux gènes qui ne le sont pas (FOS et PBEF-1) mais dont

42

l’expression était différente entre les brebis gestantes et celles du lot LS, dans l'analyse

transcriptomique.

Les niveaux d'expression relatifs dans les LMC obtenus par qPCR ont confirmé les résultats

de l'analyse transcriptomique pour CXCL10, STAT-1 et PBEF-1. En revanche, la différence

d'expression entre les brebis gestantes (lot G15) et les brebis du lot LS observée dans l'analyse

transcriptomique n'a pas été confirmée par qPCR pour PLAC8 et FOS. Les différences de résultats

entre ces deux techniques peuvent s'expliquer par le fait que l'analyse transcriptomique n'a été

réalisée que sur une fraction, pas toujours représentative, des brebis utilisées pour la quantification

par qPCR (4 brebis sur les 8 du lot G15 et 4 brebis sur les 9 du lot LS). Néanmoins, une différence

significative d'expression au 15ème

jour de gestation a été observée dans les LMC pour CXCL10,

STAT-1 et PBEF-1 entre les brebis gestantes (lot G15) et au moins certains lots de brebis non

gestantes.

Parmi ces 3 gènes, seul CXCL10 parait être un marqueur de la gestation intéressant. En effet,

la variabilité inter-individuelle des niveaux d'expression est élevée pour les autres gènes, ce qui ne

permet pas de définir des seuils d'expression discriminant entre les brebis gestantes et les brebis non

gestantes. Le seul gène pour lequel les valeurs d'expression se distinguent entre les lots est CXCL10.

Le niveau d'expression le plus élevé parmi les brebis non gestantes était similaire au niveau

d'expression le plus faible parmi les brebis gestantes. Il conviendrait de compléter les données

obtenues avec un plus grand échantillon, afin de déterminer la fiabilité d'un test diagnostique basé

sur le niveau d'expression de CXCL10. En effet, en pratique, il est surtout intéressant de détecter

précocement et sans erreur les femelles non gestantes pour les remettre à la reproduction le plus

rapidement possible. On cherche donc un test qui donne peu de faux positifs (bonne spécificité) et

avec une bonne valeur prédictive négative.

Pour les autres gènes, malgré des niveaux moyens d'expression parfois statistiquement

différents entre les brebis gestantes et les brebis non gestantes, plusieurs brebis de chaque lot

avaient des niveaux comparables, ne permettant pas de définir des valeurs seuils fiables. Des

résultats aussi variables ont été obtenus dans plusieurs études analysant d'autres ISG : MX (Yankey

et al., 2001 ; thèse S. Inghels, 2012), ISG15 et OAS-1 (Oliveira et al., 2008) et RTP4 (Gifford et al.,

2008). Les niveaux moyens d'expression étaient statistiquement différents entre les brebis gestantes

et les brebis non gestantes, mais il a été établi qu'aucun de ces gènes ne pouvait être utilisé en tant

que marqueur précoce et fiable de la gestation dans les LMC chez la brebis. Les études réalisées

chez la vache sur les mêmes gènes sont arrivées aux mêmes conclusions (Han et al., 2006 ; Gifford

et al., 2007 ; Stevenson et al., 2007 ; Green et al., 2010). Il a toutefois été observé un effet de la

parité, avec une plus forte expression des ISG chez les génisses comparées aux vaches et des

primipares comparées aux multipares (Green et al., 2010).

Plusieurs hypothèses peuvent expliquer la variabilité d'expression des ISG chez les femelles

gestantes. Yankey et al. (2001) ont mis en évidence une expression de MX plus élevée en présence

de deux embryons plutôt qu’un seul. Les embryons étant à l’origine de la production d’IFNτ qui

stimule l’expression des ISG, qu'un lien soit établi entre le nombre d'embryons et l'expression des

ISG n'est pas surprenant. De même, Ott et al. (1998) ont observé un lien entre l’expression de MX et

la progestéronémie. Les brebis ayant plus d'un embryon ont une progestéronémie plus élevée, du

fait de la présence d'un nombre plus élevé de corps jaunes. La corrélation entre la progestéronémie

et l'expression de MX peut être directe ou bien s'expliquer par le nombre d'embryons, sans que l'on

puisse aujourd'hui trancher entre les deux hypothèses. Nous n'avons pas observé de relation entre le

nombre d'embryons ou la progestéronémie et l'expression des différents gènes étudiés. Cela peut

être dû à notre effectif plus restreint que celui des études citées précédemment. La variabilité

43

observée parmi les brebis gestantes pourrait être liée à la vitesse de croissance des embryons ou à

leur viabilité. Nous n'avons pas mesuré la taille des embryons récupérés, mais Satterfield et al.

(2006) ont montré chez des brebis traitées à la progestérone au cours des 12 premiers jours de

gestation, que les embryons étaient plus gros et produisaient davantage d’IFNτ. Il existe donc une

relation entre la taille de l’embryon et sa capacité à produire de l’IFNτ et donc à stimuler les ISG.

On peut supposer, à la lumière de ces résultats, que les embryons peu viables sont plus petits et

donc incapables de produire de l’IFNτ en quantité suffisante pour assurer une mise en place correcte

de la gestation. Cela pourrait expliquer que certaines brebis gestantes avaient des niveaux

d'expression d'ISG faibles.

Les niveaux d'expression élevés des ISG (CXCL10, PLAC8 et STAT-1) chez des brebis non

gestantes peuvent s'expliquer de deux façons : une mortalité embryonnaire très précoce après la

mise en place de la synthèse de l'INFτ (peu probable dans notre étude car elle a été réalisée au début

de la production de l'INFτ et à ce stade, nous aurions probablement retrouvé une trace d'un éventuel

embryon non vivant dans le liquide de rinçage utérin) et une stimulation par un autre interféron de

type I (en cas d'infection virale subclinique par exemple), les ISG n'étant pas spécifiques de l'INFτ.

Les gènes inductibles par l'INFτ semblaient être des candidats pertinents pour une utilisation

comme marqueurs non invasifs de la gestation. Mais le fait qu'ils soient également inductibles par

d’autres interférons de type I conduit à étudier en parallèle des gènes non inductibles par l’IFNτ tels

que FOS et PBEF-1.

Bien que l’application d’un test précoce de détection de la gestation serait surtout

intéressante pour l’espèce bovine, nous avons choisi la brebis comme modèle animal. Ce choix a été

fait en raison de la plus grande facilité d’élevage de cette espèce qui est moins coûteuse et prend

moins de place. De plus, la gestation est plus courte les mécanismes de mise en place de la

gestation, avec l’intervention de l’IFNτ, sont très similaires. L’objectif est d'identifier un ou des

marqueurs de la gestation dans le modèle ovin, avant d'essayer de les transposer à l’espèce bovine.

On peut déplorer un nombre d’animaux assez faible avec 32 animaux en tout répartis en

quatre lots, ce qui fait que les lots comprennent moins de 10 animaux et il devient délicat de faire

des statistiques sur de faibles effectifs. Néanmoins, les brebis utilisées étaient comparables du fait

qu’elles ont été élevées dans les mêmes conditions et que leurs cycles œstraux ont été synchronisés.

Nous avons choisi de réaliser les prélèvements 15 jours après les chaleurs, car ce stade

correspond à la fin du cycle des femelles non gestantes et au début de la production d'INFτ chez les

femelles gestantes. Ainsi, les femelles non gestantes seraient identifiées avant le retour en chaleurs

et pourraient être remises à la reproduction. L'abattage des animaux a permis, entre autres,

d'observer les embryons et donc d'avoir un diagnostic de certitude concomitant du prélèvement de

sang périphérique. En effet, on peut déplorer dans certaines études que le diagnostic de gestation

soit réalisé bien après la prise de sang donnant lieu au profil d’expression des gènes marqueurs. Il

peut donc y avoir entre-temps un avortement et une femelle détectée non gestante tardivement

pouvait être gestante au moment de la prise de sang. Cela est d’autant plus important que 40% des

avortements précoces chez la brebis se produisent entre J15 et J17. Nous nous sommes donc

affranchis dans notre cas d’un biais important.

L’inconvénient du protocole utilisé dans cette étude impliquant l’euthanasie des animaux est

que l’on ne sait pas si la gestation aurait été menée jusqu’au terme et avec combien de fœtus

vivants. En effet, il serait intéressant de savoir si un niveau d'expression des gènes marqueurs

44

différent serait le signe d'un avortement à venir. En effet, il a été montré qu’un embryon destiné à

mourir produisait une moins grande quantité d’IFNτ, ce qui devrait se manifester par une

stimulation moins conséquente des ISG (Han et al., 2006, Satterfield et al., 2006). Il a également été

montré que le niveau d'expression de MX2 augmentait de façon plus importante chez les génisses

pour lesquelles la gestation était maintenue par rapport à celles qui avortaient (Stevenson et al.,

2007).

L'isolement des LMC, l’extraction des ARNm et leur rétrotranscription en ADNc, ainsi que

la PCR en temps réel ont été réalisés en laboratoire à l’aide du matériel adapté et d’une méthode

standardisée. Han et al. (2006) ont tout de même supposé que la PCR en temps réel utilisant le

SYBR-green comme réactif pouvait affecter la précision des résultats. Cependant, comme il s’agit

d’une méthode fréquemment employée dans les études du même type, cela rend notre travail plus

facilement comparable à la littérature. Plusieurs méthodes d’extraction des ARNm ont été

comparées par Hammerle-Fickinger et al. (2010) : des différences importantes au niveau du

rendement et de la qualité des ARNm obtenus, ainsi que de la reproductibilité de la méthode ont été

mises en évidence. En outre, les rendements moyens étaient différents d’un animal à l’autre en

raison de modifications du nombre de leucocytes en fonction du cycle et de l’exposition au stress.

Cela pose le problème de la reproductibilité qui est importante dans ce type d’étude pour laquelle

les différences observées doivent être dues le plus possible au statut gestationnel des animaux et

non à des différences autres entre les individus.

Il convient également de prendre en compte la durée et les conditions de stockage entre la

prise de sang et l'isolement des LMC : Debey et al. (2004) ont montré qu’un stockage de 20 à 24

heures à température ambiante suffisait pour augmenter l’expression des gènes liés au stress et à

l’apoptose, avec en parallèle une diminution de l’expression de ceux liés au cycle cellulaire, au

métabolisme et à la fonction immune. Pour limiter l'impact de ces biais, une étude a été menée en

parallèle sur les mêmes brebis afin de comparer deux procédures de prélèvements du sang et

d'extraction des ARN : celle présentée dans ce manuscrit (avec isolement des LMC) et une utilisant

des tubes contenant un conservateur des ARNm (sans isolement des LMC) (thèse S. Gillier, en

cours de réalisation). L’objectif est d’obtenir des ARNm de la meilleure qualité possible, ce qui

permettra d’avoir les résultats les plus précis possible.

Par ailleurs, la méthode utilisée dans l'étude présentée ici est difficile à transposer en élevage

en raison de la complexité de son protocole et du coût qu’elle implique. En effet, il faut passer par

une extraction de l’ARNm des LMC que l’on a préalablement isolés des autres cellules sanguines,

suivi d’une rétrotranscription en ADNc puis d’amplifier les gènes qui nous intéressent à l’aide des

amorces correspondantes par PCR en temps réel. Tout cela nécessite du savoir-faire, des produits

spécifiques, ainsi qu’un cadre et du matériel adaptés. Ce test deviendrait intéressant s’il pouvait par

la suite être développé sous forme de kit rapide. Cela permettrait en effet de détecter la gestation par

une prise de sang qui est un examen peu invasif et facilement réalisable en routine, ne demandant

pas de compétences particulières contrairement à l’échographie ou la palpation transrectale. A

terme, l’application pratique de notre étude serait la mise au point d’un test de diagnostic précoce de

gestation réalisable en ferme, lorsqu'un ou des marqueurs précoces et spécifiques de la gestation

auront été identifiés.

45

Les ISG étudiés jusqu'à aujourd'hui en tant que marqueurs précoces de la gestation sont liés

à l’immunité et à l’inflammation. De nombreux travaux concernent le rôle de l’immunité dans la

mise en place de la gestation, en raison de la nécessité pour l’organisme maternel de supprimer

certains composants de l’immunité afin de laisser s’implanter un conceptus semi-allogénique. La

progestérone agit dans ce sens puisqu’elle manifeste des propriétés immuno-modulatrices qui

facilitent l’acceptation du conceptus avant l’implantation et prévient les avortements précoces,

avant même la mise en place du placenta. Il apparaît alors important que d’autres mécanismes de

l’immunité innée soient activés afin de protéger la mère contre les agents infectieux. D’après

Gifford et al. (2007), en début de gestation chez l’Homme, l’immunité innée est d’ailleurs activée à

un niveau proche de la septicémie, tandis que chez les ruminants, on observe une activation des

composants de la réponse immunitaire innée dans les leucocytes circulants. On peut donc supposer

l’existence de phénomènes similaires chez ces animaux, avec un rôle des gènes stimulés par l’IFNτ

que l’on peut suspecter, mais qui reste difficile à objectiver (Gifford et al., 2007). Cela expliquerait

l’effet sur le système immunitaire longtemps suspecté de l’IFNτ qui régule la prolifération des

lymphocytes et la production de cytokines in vitro (Nagaoka et al., 2003). Cependant, Ott et al.

(1998) font l’hypothèse d’un rôle beaucoup plus large des ISG, qui ne seraient ainsi pas seulement

des marqueurs, mais qui comprendrait en plus de la modulation du système immunitaire muqueux

endométrial, la stimulation des sécrétions et la stabilisation du myomètre dans le but de soutenir

l’attachement embryonnaire, mais aussi d’aider à la croissance et au développement fœtal et

placentaire. Malheureusement, rien n’a pu être prouvé dans ce domaine depuis.

46

47

CONCLUSION

Nos résultats confirment que la présence d’un conceptus entraîne chez la femelle ruminant

une modification de l’expression de nombreux gènes qui peut être détectée dans les cellules

immunitaires circulantes, et ce de façon précoce. Certains de ces gènes sont stimulés (CXCL10,

STAT-1, PLAC8) tandis que d’autres sont inhibés (PBEF-1, FOS). Ils semblent jouer un rôle

important dans la mise en place de la gestation, notamment en participant à la régulation de

l’immunité par des mécanismes non encore totalement élucidés. Les niveaux d’expression à J15

étaient en moyenne significativement différents entre les brebis gestantes et les brebis non gestantes

pour CXCL10 et STAT-1. Concernant PLAC8 et PBEF-1, la différence n’était pas significative entre

le lot de brebis gestantes à J15 et un des trois autres lots de brebis non gestantes, ce qui les rend

inutilisables pour discerner les animaux gestants des non gestants. Le gène FOS ne présentait pas

non plus d’intérêt car le niveau moyen d’expression du lot des brebis gestantes n’était

significativement différent d'aucun des autres lots. Malgré les différences significatives observées

pour STAT-1 qui pourraient en faire un marqueur de la gestation intéressant, on observe une grande

variabilité des valeurs individuelles entre les différents lots qui nous empêche de définir une valeur

seuil à partir de laquelle l’animal pourrait être déclaré gestant avec une fiabilité suffisante. Par

conséquent, l’expression de ce gène ne peut pas aboutir à un test diagnostique fiable dans les

conditions de cette expérience et donnerait trop de faux positifs. Le gène CXCL10 semble plus

intéressant car il permet de discriminer les quatre lots avec une surexpression très marquée pour les

femelles appartenant au lot des brebis gestantes. Il semblerait par conséquent judicieux de mesurer

son expression chez un plus grand nombre de brebis à la fois gestantes et non gestantes afin d’avoir

suffisamment de données pour calculer la sensibilité, la spécificité ainsi que les valeurs prédictives

positive et négative. Si un test diagnostique de gestation basé sur l’expression de CXCL10 se

révélait suffisamment fiable pour être appliqué sur le terrain dans l’espèce ovine, d’autres études

pourront être développées avec l’objectif de mesurer son intérêt dans l’espèce bovine, qui est une

cible plus intéressante pour un diagnostic aussi précoce. Il reste également à s’affranchir du travail

de laboratoire long et fastidieux qui permet de mesurer l’expression des gènes et dont le coût est

également rédhibitoire dans les conditions d’élevage.

48

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