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Institut Pasteur « Génétique de la souris » 27 janvier (1h30). Régulation génétique par les petits ARN non-codants. Christophe ANTONIEWSKI [email protected]. Découverte de l’interférence par l’ARN. Interférence par l’ARN. Injection. transfection. feeding. Viruses. ARN double-brin - PowerPoint PPT Presentation
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Régulation génétique par les petits ARN Régulation génétique par les petits ARN non-codantsnon-codants
Christophe [email protected]
Institut Pasteur« Génétique de la souris »
27 janvier (1h30)
Découverte de l’interférence par l’ARNDécouverte de l’interférence par l’ARN
InjectionInjection
transfectiontransfection
Inverted-repeatInverted-repeattranscriptiontranscription
VirusesViruses
ExogenousExogenous
EndogenousEndogenous
feedingfeeding
Homology dependent CosuppressionHomology dependent Cosuppression
ARN double-brinARN double-brin
Post Trancriptional Gene SilencingPost Trancriptional Gene Silencing(dégradation de l’ARNm de séquence homologue)(dégradation de l’ARNm de séquence homologue)
Interférence par l’ARNInterférence par l’ARN
S2 ExtractS2 Extract
Luc dsRNA*Luc dsRNA*
Elbashir et al. Genes & DevelopmentElbashir et al. Genes & Development(2001) 15: 188-200(2001) 15: 188-200
1ère partie: siRNA (small interfering RNA)1ère partie: siRNA (small interfering RNA)
DicerDicerImmunoprecipitationImmunoprecipitation
Cyc dsRNA*Cyc dsRNA*
Bernstein et al. NatureBernstein et al. Nature(2001) 409: 363(2001) 409: 363
• 19 nucléotides double-brin• 2 nucléotides débordants en 3’(OH)• Activité RNAi per se• Activité séquence-spécifique• Ciblent ARN sens et antisens• 2’-O-Met (in vivo)
Caractéristiques des siRNA
(O-Met-2’)
(2’-O-Met)
Le complexe RISC (Le complexe RISC (RRNA Induced Silencing Complex)NA Induced Silencing Complex)Le complexe RISC (Le complexe RISC (RRNA Induced Silencing Complex)NA Induced Silencing Complex)
ArgonautesArgonautes
AGO-1, AGO-2 : ubiquitaires
Piwi, Aubergine, AGO-3: Lignée Germinale
AGO-1, AGO-2 : ubiquitaires
Piwi, Aubergine, AGO-3: Lignée Germinale
Deux groupes de protéines selon la présence d’aa conservés N-term:
Williams RW, Rubin GM PNAS 2002
RNA Induced Silencing ComplexRNA Induced Silencing ComplexRISC RISC
mRNAdegradation
Cleavage and releaseof the "passenger" strand
Helicase ?(Armitage/sde3)
R2D2 se fixe à l'extrémité la + stableRecrutant Dcr à l'extrémité la - stableR2D2 "reconnaît" le 5'P du brin "passager"
G
G
2ème partie: les microRNA2ème partie: les microRNA
Lin-14, lin28 Lin-41, hbl1
lin-4
3’ UTR
CDSlin14
Ordres de grandeurOrdres de grandeurOrdres de grandeurOrdres de grandeur
Genome miRNA identifiés expérimentalement
C. elegansD. melanogasterM. musculusH. sapiens
~150~150~700~700
Structure des gènes des miRNAs - primary miRNA Structure des gènes des miRNAs - primary miRNA (pri-miRNA)(pri-miRNA)
miRNAautonomes
miRNA"passagers"
~50%
~50%
Pri-miRNA :« Cappés »Queue Poly-APol II-dépendants
Rare
Pri-miRNA --> Pré-miRNAPri-miRNA --> Pré-miRNA
Han et al. Cell 125, 887–901, June 2, 2006Seitz and Zamore Cell 125, p827, June 2, 2006
Pri-miRNA --> Pré-miRNA : le complexe « microprocessor »Pri-miRNA --> Pré-miRNA : le complexe « microprocessor »
Han et al. Cell 125, 887–901, June 2, 2006Seitz and Zamore Cell 125, p827, June 2, 2006
Biogenèse des miRNABiogenèse des miRNABiogenèse des miRNABiogenèse des miRNA
Mais quelle Argonaute ?Mais quelle Argonaute ?
GGBiais 5’UBiais 5’UGGBiais 5’UBiais 5’U
RISCRISC
1
« specialized » miRNA and siRNA pathways in « specialized » miRNA and siRNA pathways in DrosophilaDrosophila« specialized » miRNA and siRNA pathways in « specialized » miRNA and siRNA pathways in DrosophilaDrosophila
Répression traductionnelle Vs Répression traductionnelle Vs clivage clivage
Saxena et al JBC 2003
La séquence « graine » (seed)La séquence « graine » (seed)
Dur de trouver une cible de miRNA !
Stark et al Plos Biol 2004
Doench et al G&D 2004
Les miRNA agissent aussi en déstabilisant les mRNA ciblesLes miRNA agissent aussi en déstabilisant les mRNA ciblesLes miRNA agissent aussi en déstabilisant les mRNA ciblesLes miRNA agissent aussi en déstabilisant les mRNA cibles
miR124 fortement exprimé dans le cerveau Transfection de miR 124 dans des cellules HelamiR124 fortement exprimé dans le cerveau Transfection de miR 124 dans des cellules Hela
Lim et al. (2005) NATURE VOL 433, p770Lim et al. (2005) NATURE VOL 433, p770
174 gènes réprimés (Niveau ARN) 174 gènes réprimés (Niveau ARN)
Modèles d’action des miRNAModèles d’action des miRNA
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Eulalio et al, Cell 2008
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Fonction des miRNAs au cours du développement
Adapted from Alvarez-Garcia and Miska, Development 2005
miRNA et CancersmiRNA et Cancers
Amplified in B Cell lymphoma miR17cMyc target + regulates E2F1Trangenic mice overexpression miR17 harbor c-myc-induced lymphomas
They target Bcl2, upregulated in many types of cancers
Classification of human cancers using miRNA profilingLu et al (2005). Nature 435, 834
3ème partie: les piRNA3ème partie: les piRNA
Bergman et al. Genome Biology 2006, 7:R112
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Aravin et al. Developmental Cell (2003), Vol. 5, 337–350.
• 25 paires de bases• Biaisés en 5’: U (80% des cas)• 2’-O-méthylés à l'extrémité 3’• Correspondent majoritairement à des éléments transposables (transposons et rétrotransposons) rasiRNA• surtout abondants dans la lignée germinale (ovaires et testicules)
Co-immunoprécipitation par anti-Piwi À partir d’extraits d’ovaires
Clonage/séquençage des petits RNA associés
Saito et al., Genes and Dev (2006)
Les piRNAs représentent 80% des petits ARN coprécipités avec un Anti-PiwiIl correspondent bien à des éléments répétés du génome (rasiRNA).
piRNAs
Saito et al., Genes and Dev (2006)
Les piRNA sont majoritairement « antisens »
Vagin et al., Science (2006)
La voie classique RNA-i est sans effet sur le contrôle des rétroéléments
Pas de contrôle par dcr1 sur mdg1, roo et mst40: la voie miRNA est également sans effet
Dans la lignée germinale, les piRNA répriment l’expression des Elements Transposables
Les acteurs importants pour le silencing des rétroéléments sontPiwi, Aubergine, armi, et Spn-E (Homeless)
Séquençage direct de molécules uniquesSéquençage direct de molécules uniques
Pyroséquençage « 4-5-4 »Pyroséquençage « 4-5-4 »
From Margulies, M., et al. (2005).Nature 437, 376-380.
Solexa, Solid, Helico…Solexa, Solid, Helico…
10 à 100 millions de lectures, de ~ 50 nt
Pyroséquençage… Et la lumière fut !
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Origine génomique des loci producteurs de piRNA
Biogenèse et mécanisme d’action des piRNA chez la drosophileBiogenèse et mécanisme d’action des piRNA chez la drosophile
Deep sequencing of Ago2-associated small Deep sequencing of Ago2-associated small RNAsRNAs
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Biogenèse des endo-siRNA:Biogenèse des endo-siRNA:3 type de loci producteurs3 type de loci producteurs
Les éléments répétés, transposons et rétrotransposons
Les zones de recouvrement des 3’ UTR (gènes convergents)
Des ARN non-codants « structurés »
Endo-siRNAs silence transposable element in Endo-siRNAs silence transposable element in the somathe soma
(as do piRNAs in the germ line)(as do piRNAs in the germ line)
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Regulation ofgene expression
Regulation ofgene expression
Transposon repressionHeterochromatin formation
Transposon repressionHeterochromatin formation
Defense against virusesTransposon repression
Heterochromatin formation
Defense against virusesTransposon repression
Heterochromatin formation
Mathieu Bartoletti Bassam BerryCorinne Besnard-GuerinAnne-Laure BougéCaroline JacquierJosette PidouxEdwige SeguyHélène Thomassin
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