Rhizosphh-e du sapin (Abies veligiosa). 11. Mycorhizes: isolement et culture'

J. J. PE~~A-CABRIALES ET MAR~A VALD~S-HGO Departa~ne~zto de Microbiologia, Escrrela Naciolzal de Ciencias Bioldgicas, h~stituto Politkc~lico Nacional, Mixico 17, D.F.

ApprouvC le 17 aoirt 1973

PE~~A-CABRIALES, J. J., et M. VALDISS-HGO. 1974. Rhizosphere du sapin. 11. Mycorhizes: isolement et culture. Can. J. Microbiol. 20: 49-54.

L'ktude morphologique des mycorhizes ectotrophes du sapin (Abies religiosa) montre qu'elles sont dichotomes ou coralloTdes, simples ou ramifiees. A partir des mycorhizes ont Cte isole quatre cham- pignons symbiotes qui d'apres leur type d'infection sont actifs de virulence moyenne. Les descriptions macro- et micro-scopiques de chaque souche fongique montrent differentes caracteristiques de culture ainsi que differentes stimulations sur le developpement de la plante.

PERA-CABRIALES, J. J., and M. VALDES-HGO. 1974. Rhizosphere du sapin. 11. Mycorhizes: isolement et culture. Can. J. Microbiol. 20: 49-54.

Morphological study of several ectotrophic mycorrhlzae of fir (Abies religiosa) showed that they are dichotomic or corralloid, simple or ramified. Four syn~biotic fungi were isolated from the mycorrhizae, and judging from the type of Infection, they were active and of medium virulence. The macro- and micro-scopic descriptions of each fungal strain show different cultural characteristics as well as, different stimulations to the development of the plant.

Introduction

A la suite de Frank (9) qui en 1885 a trouvC que les racines des arbres forestiers vivent en symbiose avec des champignons du sol, beaucoup d'anatomistes, physiologistes, pathologistes, chi- mistes, microbiologistes et forestiers ont entrepris I'Ctude de cette symbiose donnant diffkrentes interpritations 2 la mycorhize. Depuis le debut, il a CtC Ctabli que la prise dYClCments nutritifs est faite normalement au moyen des hyphes de la mycorhize qui se dCveloppe autour et dans les racines courtes. Dans un bon nornbre de travaux, on a constate une meilleure nutrition des plantes mycorhizees due a une bonne prise d'C1Cments nutritifs A travers les hyphes des champignons mycorhizogenes (3, 1 1-13, 15, 16), et a soulignC I'exactitude des rCsultats de Hatch, qui en 1937 avait dCja constat6 que les pins silvestres mycorhizCs prCsentaient I'analyse des teneurs supirieures en K, N et P par rapport B celles des s~ijets non mycorhizCs.

Les rapports, donc, entre plantes et champi- gnons ne sont pas simplement d'intCret biolo- gique mais aussi d'une grande importance pratique. Ainsi, depuis un temps assez rCcent, ont CtC mis en pratique des essais conduisant a tester I'influence de diffkrents champignons mycorhizog~nes en culture pure sur les plantes coniferes (1, 2, 8). Provoquer la mycorhization serait assez simple si nous ttions dCja parvenus

au meme stade qu'en matiere d'inoculants des graines de 1Cgumineuses (4). Mais les mycorhizes dans la foret et dans les pCpinieres restent encore dans une confusion de couleurs, de formes et de tailles, non seulement pour le forestier et le gCrant de pCpinieres mais aussi pour le spCcialiste en rnycorhizes (19).

Des observations antCrieures (18) sur les mycorhizes du sapin (Abies religiosa) les desi- gnent comme ectotrophes, telles que, toutes les mycorhizes des for& situCes dans les zones temptrCes et constatent la prCsence de quatre champignons symbiotes.

La prCsente etude dCcrit les formes des mycorhizes du sapin (Abies ~.eligiosa) et carac- tirise les charnpignons mycorhizogenes d'aprks leur isolement et culture.

Matkiel et mCthodes Carpopltores

Puisque la periode de fructification des charnpignons rnycorhizogenes est tres influencee par la precipitation pluviale, c'est pendant la saison des pluies que nous avons fait la collecte des champignons dans le but de connaitre le nombre d'especes dans une forkt de sapins. Tous les champignons collectes ont ete portes au labora- toire pour &tre identifies.

Etllde morphologiqlre et cytologiql~e A partir de plantules de sapin d'environ 2 ans, on a fait

des observations dans leur systeme radiculaire afin de determiner le type morphologique des complexes presents.

Une partie des mycorhizes a ete bien lavee a I'eau courante et fixte pendant 48 h dans les solutions suivantes:

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fixateur No 1, acide acttique 1.5 ml, formaldehide 8.5 ml, ethanol (50%) 90.0 ml; fixateur No 2 (Craf III), acide chromique 1.0 g, acide acetique 7.0 ml et eau distillee 92.0 ml (solution A), form01 neutre (40%) 30 ml et eau distillte 70 ml (solution B).

Aprts fixation on a procCdt I'inclusion des mycorhizes sur paraffine ayant un point de fusion de 5658C. A I'aide d'un microtome manuel on a fait des coupes transversales de 8 et de 12 pm. La coloration des coupes a ete faite avec une solution de safranine - verte lumiere en essence de clou (10).

Isolernerlt des cl~arrtpigr~or~s syrnbiotes Afin d'isoler les champignons mycorhizogenes on a

procede au choix de racines supportant des mycorhizes jeunes et exemptes de detritus organiques. Apres ceci on a fait des lavages repetes et soigneux a I'eau distillee. La sur- face des mycorhizes a ete sterilisee par immersion dans une solution 1 :I000 de HgCI, pendant 2 min. Apres rin~ages repCtes on les a depodes dans des boites contenant le milieu de culture de Hagem. Les boites ont Cte portees a une temperature d'environ 20C. La croissance des champignons symbiotes a partir des mycorhizes a durC 2 semaines environ.

Les champignons ainsi isolCs ont ete caracterises d'aprks la morphologie coloniale et n~icroscopique du mycklium aerien sur milieu de culture gtlosk. Leur morphologie microscopique a ete observee sur le m&me milieu liquide a partir du myceliunl submerge en culture stationnaire et agitee

Irioc~rlatiorr des c/~arripig~~or~s isolis a ~Iesplar~t~rles obteti~res par gerniitlatiorl aseptiqrre

Dans le but de verifier si les charnpignons isoles des mycorhizes du sapin ttaient rnycorhizogenes, on a procCdC d'apres la technique de Hackskaylo (7) modifiee par Bryan ei Zak (5). chaque charnpignon a e t t inoculC a differentes plantules de Pinus hartwegii obtenues par germination aseptique. Le choix de cette esptce a CtC dil au pourcentage de germination de graines, qui dans le cas des graines du sapin n'Ctait que de 1%.

Nous avons essaye, comrne traitement d'asepsie pour les graines, une solution de peroxyde d'hydrogene a 3%. Les graines ont ete mises a germer sur sable sterile.

Les plantules obtenues ont etC dCpostes dans des matras de 500 ml (deux plantules par fiole) avec du milieu de Melin et Norkrans modifie par Marx et Zak - - ~

(B. Zak, 1967, communication personnelle), de composi- tion suivante: 200 ml de vermiculite, 143 ml de solution nutritive, 14.8 ml de turbiere. La solution nutritive etait constitute par: CaC12 0.05 g, MgS04.7H20 0.15 g, NaC10.025 g, dextrose 2.5 g, KH2P04 0.5 g, chlorhydrate de thyamine 25 pg, (NH4),P04 0.25 g, citrate de fer et ammonium (solution 1%) 1.2 ml, H 2 0 1000 ml.

Apres 15 jours de croissance, les plantules qui Ctaient contaminees ont CtC mises de c6te. Chaque fiole a deux plantules a ete inoculee avec 0.5 ml d'une suspension d'hyphes des champignons isolts de mycorhizes, 10 fioles pour chaque champignon. Les fioles plantules inoculees sont restCes a la temperature ambiente (20C), et aprks 5 semaines on a observe dans les plantules la formation de mycorhizes.

Carpophores Le Tableau 1 nous montre les champignons

trouvts un peu partout dans la forzt B dominance de sapin (Abies religiosa). Ces champignons appartiennent, d'aprks les listes de Trappe (17) 8 des esp6ces fongiques symbiotiques.

Sous cette for@t, si l'on tcarte la couche de litikre B proximitt d'une jeune plante, un dense feutrage myctlien s'insinue entre les debris vegttaux fermentts; ce feutrage est de deux types, l'un a plus la surface de couleur blanc et l'autre de couleur ocre (Fig. 1). Quand on suit le trajet des filaments myctliens, on peut verifier qu'ils aboutissent a des mycorhizes d'arbres et B des carpophores.

Macronlorphologie D'aprks la description morphologique de

Dominik (6) les deux types de mycorhizes trouves correspondent B des mycorhizes dichoto- mes et coralloides. La premitre est de couleur legkrement rouge2tre et la deuxikme d'un brun clair. La mycorhize dichotome est simple et la coralloi'de est simple et B ramification indifinie. La taille des mycorhizes, tenant compte des elements individuels, oscille dans la premikre entre 0.3 a 1.0 cm et dans la deuxikme de 0.5 a 2.0 cm. Les dements individuels dans les deux cas sont droits et sinueux et ne prtsentent d'uniformite ni dans leur diamktre ni dans leur taille (Fig. 2). Quand ils sont jeunes, l'extremitt de ces Cltments est d'une couleur plus claire que le reste.

Anator9zie Les observations microscopiques a partir de

coupes transversales et longitudinales des myco-

TABLEAU 1

Carpophores des champignons mycorhizogenes trouvts dans un trajet a travers une for& a dominance de sapin

(Abies religiosa)

Agaricus alrglrst~rs Hygrophor~rs c l ~ ~ ~ s o d o n Agariclrs sp. Hysterar~gilrrrr seprrrabile Agrocybe sp. Inocybe geoplgvln Car~thareN~rs floccos~rs Lactarius sal~trorricolor Clavaria sp. Leucopaxillus sp. Clitocybe sp. Lycoperdon perlatll~rz Cortinarius sp. Lycoperrlon lrr?~brirnr~n Geastrunz triplex Melanolelrca tnelat~oleuca Helvella crispa Morclrella esc~rlenta Helvella lactrt~osa R~rssula delica

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rhizes du sapin ne montrent pas de difftrence dans leur anatomie. Toutes les deux forment un manteau fongique bien dtvtloppi et le rtseau de Hartig ne se prtsente pas uniformtment dans les ctllulek de l'exocortex, il arrive m&me parfois que le rtseau se rende jusqu'au ctllules ptriphtriques du cylindre central, qui est absolu- ment exempt d'infection (Fig. 3).

Champigi~ons symbiotes isolks Etant donnt que sous for&t il y a 20 espkces

difftrentes de champignons mycorhizogknes, on pourrait s'attendre A l'isolement du m&me nombre de symbiotes. Pourtant, avec la techni- que dtcrite prtctdemment (Fig. 4) nous n'avons isolt que quatre champignons difftrentes, et aprks la confirmation en tant que symbiotes nous les avons dtsignts comme PV-1, PV-2, PV-3 et PV-4.

Ceci peut s'expliquer par les exigences nutritives sptciales de ces champignons (4, 9), aussi bien que par l'absence d'une technique adtquate de cette symbiose en particulier, ou bien simplement par une fornle d'interprtta- tion. I1 est possible aussi que chaque champignon isolt ne reprtsente pas une seule espece en particulier, mais tout un groupe de symbiotes avec caracttristiques de culture t r i s semblables, fait qui a dtja t t t constatt dans d'autres cas (19).

Caracte'ristiques de culture des champignons isolds

Les caracttristiques macro- et micro-scopiques de chaque symbiote is016 des mycorhizes du sapin ont t t e ttudites aprks 8 jours de culture sur milieu gtlost et liquide de Hagem et A Line temperature d'environ 20C.

(a) Caracte'ristiques macroscopiques Le Tableau 2 nous montre les difftrences

dans la morphologie des cultures de chaque charnpignon micorhizogkne. Les Figures 5A, 6A, 7A et 8A nous montrent aussi la morphologie des colonies formtes par chaque isolt.

La temptrature d'incubation (20C et 29C) a une certaine influence sur le dtveloppement de la colonie, le champignon PV-3 t tant le plus sensible de tous les quatre isolts (Fig. 7D).

(b ) Caracte'ristiques inicroscopiq~~es L'analyse microscopique du myctlium atrien

et du myctlium submergt de chaque charnpignon isolt nous montre que chacun prtsente des caracttristiques t r b particulikres (Tableau 3). Dans ce tableau on peut remarquer l'existence de quelques caracttristiques qui sont prtsentes d'une f a ~ o n constante dans les quatre champi- gnons symbiotes isolts, telles que prtsence dans le myctlium atrien et submergt de deux types

TABLEAU 2

Caracttristiques macroscopiques des champignons PV-I, PV-2, PV-3 et PV-4 isoles des mycorhizes du sapin (Abies religiosa) apres 8 jours de culture sur milieu gelose et liquide de Hagem

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PV-I PV-2 PV-3 PV-4

Culture gelosee Colonie Elevee Elevee Plane Elevee Couleur Vert foncd Ocre foncC au centre, blanc

dans la peripherie Brun verdbtre Gris-brun Bords Ramifies Entiers Ramifies Ramifies Forme Circulaire Circulaire Circulaire Circulaire Aspect Veloute Cotoneux Pelucheux Poilu Pigment Sans diffusion Diffuse dans le milieu Sans diffusion Sans diffusion

dans le n~ilieu dans le milieu dans le milieu Culture liquide

Couleur Blanc Blanc Blanc Blanc Aspect Cotoneux Cotoneux Cotoneux Cotoneux Adhere a la -

fiole - Au fond - Aux paroids Culture liquide agitte

Couleur Blanc Rouge brique Blanc Blanc SphCrules RadiCes petites Blanches a

taches brunes spicules grisks pas constantes - Blanches

Pigment - - Gris, diffuse dans - le milieu

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d'hyphes, les unes minces et plus ou moins uniformes en diamktre, les autres grosses avec dtformations frtquentes (Figs. 5D-E, 6D-E, 7C et SB-D); ces dtformations augmentant en culture liquide surtout agitte. D'autres carac- ttristiques communes a tous les quatre champi- gnons sont l'abondance de granulations protti- ques (Figs. 6C-E, 7C, SC), ainsi que la prtsence de formations en T (Fig. 5D-E) et Cpaisseur difftrente des parois des grosses hyphes.

La prtsence de fibules est limitte au myctlium atrien; PV-1 prtsente plus frtquemment ce type de structures (Fig. 5B). Les hyphes du myctlium atrien de PV-2 sont les seules qui se prtsentent en paquets constituts par 3 a IS hyphes gtntrale- ment sinueuses (Fig. 6B). Le champignon PV-3 est particulikrement caracttrist par la presence dans le myctlium submergt de structures appeltes par Zak (19) conidiophores ramifits. Le PV-4 a part d'autres caracttristiques com- munes aux autres champignons symbiotes isolts, hyphes minces (Fig. SB), hyphes grosses avec dtformations (Fig. SC) et conidiophores simples (Fig. SD), prtsente dans son myctlium atrien des hyphes en forme de spirale.

Evidence de l'association Les plantules utilistes dans cette exptrience

(15 plantules par traitement) ont t t t obtenues aseptiquement avec une solution de peroxyde d'hydrogkne a 3% et mises B germer sur sable sttrile.

Apres 6 semaines d'incubation plantule- champignon sur milieu de Melin et Norkrans,

nous avons observt la formation de mycorhizes ayant une correspondance avec un meilleur dtveloppement des plantules mycorhiztes. La mycorhize formte in vitro aprks inoculation individuelle de chaque champignon isolt de la mycorhize du sapin (Abies religiosa) nous montre qu'il s'agit effectiveinent de champignons mycorhizogknes associts au sapin.

Le different dtveloppement des plantules en symbiose avec les difftrents champignons est remarquable, chacun d'eux augmente dif- ftremment son dtveloppement. La plante en symbiose avec PV-2 et PV-3 se montre plus stimulte dans son dtveloppement (Tableau 4).

Conclusions

De l'ensemble de tous les rtsultats quelques faits ressortent. (1) La basse quantitt en N, P et K de ce so1 (14) est adtquate a l'implantation de la mycorhize. (2) Le nombre de carpophores de champignons mycorhizogknes trouvts jusqu'h present dans la forst de sapin en ttude est de 20, et le nombre isolt en laboratoire B partir des mycorhizes est de 4. (3) La description morpholo- gique des mycorhizes ectotrophes du sapin indique qu'elles sont dichoton~es et coralloides. Les champignons appartiennent aux champi- gnons actifs de virulence moyenne. (4) Chacun des quatre champignons mycorhizogknes isolts prtsentent des caracttristiques de culture trks particulikres qui peuvent conduire B sa caracttri- sation et identification. (5) Chacun des champi- gnons mycorhizogknes isolts prtsente difftrents

TABLEAU 4

Effet de champignons mycorhizogenes isoles des mycorhizes d'dbies religiosa sur le developpement de Pitzus hartwegii (15 plantules par traitement) mis en culture pendant 5 semaines sur vern~iculite et milieu nutritif

Melin-Norkrans-Marx

5 semaines Avant inoculation a p r b inoculation

Poids sec, Azote total, Poids sec, Azote total, Traitement mg z poids sec mg z poids sec

Ttmoin 5.6 1.10 PV-1 6.8 1.21 PV-2 8.5 1.48 PV-3 8.3 1.45 PV-4 6.3 1.19 Moyenne de 5.1 1.06

toutes les plantules

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effets sur le dCveloppement de la plante symbiote, celle en symbiose avec PV-2 et PV-3 se montre plus stimulCe dans son dCveloppement.

Remerciements

Les auteurs tiennent a adresser leur recon- naissance Mlles Irma Deleon, Aura PCrez Zapata et Rosa Isabel Ochoa pour leur collabo- ration dans 1'Ctude hystologique. Nous remer- cions aussi M. Gaston GuzmAn pour sa collabo- ration dans I'identitC des carpophores et M. Miguel Bautista pour les prises de photos. Nos remerciements vont tgalement au Labora- torio de Semillas de I'Instituto Nacional de Investigaciones Forestales qui a bien voulu nous fournir des graines de pills et sapin.

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NOTE: Figs. 1-8 follow.

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FIG. 1. Filaments myceliens dans le sol sous bois de sapin (Abies ~.eli~~io.c.rr).

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FIG. 3. Mycorhizes du sapin (Abies religiose): dichotomes et coralloi'des.

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FIG. 3. C o ~ ~ p e s transversales d h n e mycorhize du sapin (Abics t.eli,rrio~rr) niontrant le nianteau fongiq~~e c le rCsea~~ de Hartig. C

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FIG. 4. Croi,ssa~lce d'un chan~pignon symbionte a partir d'une mycorhize d'Abies religiosn mise en c u l t ~ ~ r e depuis 2 senlames.

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FIG. 5. CaractCristiques macro- et micro-scopiques du champignon PV-1 isole de la mycorhize du sapin (Abies religiosn) mis en cilltilre depi~is 2 sennines sur lnilieu nutritif de Hagem. (A) Colonie developpee sur milieu gelosC. (B) Detail du mycelium aerien : fibules. (C-E) Details du rnyceliil~n submergC; (C) conidiophore simple; (D et E) hyphes en T. Coloration, bleu coton.

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FIG. 6. CaractCristiqi~es macro- et micro-scopiqi~es du cha~npignon PV-2 isole de la mycorhize du sapin (Abies religiosa) mis en cultusc dcpilis 2 senlaines sur milieu ni~tritif de Hagcm. (A) Colonie dCvelopp6e sur milieu gClos6. (B) Mycelii~n~ aCrien incri~ste; hyphes en paqi~ets. (C-E) Details du n~yce l i i~n~ submergC; (C et D) conidiophores sin~ples; (E) defornlations des hyphes. Coloration, bleu coton.

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FIG. 7. CaractCristiques macro- et micro-scopiq~~es du chanipignon PV-3 isole des nlycorhizes du sapin (Abies reli,:iosrr) mis en culture depuis 2 senlaines sur milieu nutritif de Ha~en i . (A) Colonie developpee sur n~ilieu gelose. (B) Detail du mycelium aerien: conidiophores simples. (C) Detail du myceliun~ submerg6. (D) Effet de la tenlperat~~re d'incubation sur le developpement de la colonie. Coloration, bleu coton.

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FIG. 8. Caracteristiqi~es macro- et micro-scopiques du chanipignon PV-4 isole de la mycorhize du sapin (Abies religiose) niis en culture depi~is 2 semaines sur niil ie~~ nutritif de Hagem. (A) Colonie developpee sur milieu gilose. (Bet D) Details du mycelium aerien. (C) Details du mycelium submerg6. Coloration, bleu coton.

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