Olivier DAUWALDER1,2,3

1- Institut des Agents Infectieux (IAI) Hospices Civils de Lyon 2- Laboratoire de Bactériologie, Centre de Biologie et de Pathologie Est, Hospices Civils de Lyon; - 3- CIRI Centre International de Recherche en

Infectiologie; INSERM U111; CNRS UMR5308; Université de Lyon; Ecole Normale Supérieure de Lyon; Lyon, France

olivier.dauwalder@chu-lyon.fr - #BioDAO

-RICAI 2015-XX décembre 2015

Projets R&D mixte HCL/Biomérieux : bioMérieux

Evaluation réactifs SANS financement BD,

BioMérieux

Luminex,

R-Biopharm .

Connaître les outils actuels (et dans un futur proche) utilisées en bactériologie

conventionnelle et moléculaire

Comprendre leurs avantages/inconvénients

des outils et leurs délais de réponse

Savoir les prescrire à bon escient (techniques

moléculaires)

Utiliser les résultats obtenus pour affirmer et/ou orienter votre

hypothèse diagnostique.

Prélèvements de choix

•Prélever

•Avant antibiothérapie,

•Le ou les sites suspects,

•Bannir les écouvillons secs

Utiliser les supports de prélèvements adaptés

•Si écouvillons: privilégier les Eswab/Transwab

•Milieu de transport

•Compatible avec la « PCR »

•Poudriers: hermétiques, compatible avec les pneumatique

•Consulter et lire le manuel de prélèvements de votre laboratoire

Importance des conditions pré analytiques

•Hémocultures: bon remplissage des flacons

•Prélèvements respiratoires: acheminement en moins de 2 heures.

•Prélèvements tissulaires: poudriers secs (sans eau++)

•Prélèvements osseux: poudriers à billes (eau déjà remplie, comptabibles avec la PCR)

•Consulter le catalogue des examens (BioBook pour les HCLs)

Importance de la prescription

•Informations cliniques,

•Hypothèses diagnostiques,

•Technique adaptée à l’hypothèse diagnostic: culture vs sérologie vs PCR etc.

•Ne pas hésiter à contacter le laboratoire pour se renseigner sur les outils diagnostiques disponibles

•Prévilégier la qualité à la quantité

•IOA: 3-5 sites prélevés, >5 pvts: justifier la prescription

Culture

Tests immunologiques/phénotypiques à

orientation rapide

Biologiemoléculaire

• Culture et automatisation

• Identification et « MALDI TOF »

• Antibiogrammes: outils actuels et futurs

Processus analytique comprenant

•Cytologie

•ECBU: automatisation du processus (≠ CUF)

•Autres prélèvements: manuels

•Examen direct (suivant les prélèvements)

•1 ou plusieurs milieux de culture

•Conditions d’incubations (aérobie, anaérobie, microaérophilie, etc.)

•Durée d’incubation des différents milieux

Processus de plus en plus homogène et codifiée quel que soit le laboratoire

•REMIC

•European Manual of Clinical Microbiology

Accréditation des laboratoires selon l’ISO15189: augmentation de la fiabilité++

•En cours

•Obligatoire à terme pour tous les laboratoires

Milieux chromogéniques

•Urines, recherche de BMR, prélèvements plurimicrobiens

•Repérage aisée des colonies différentes

•Mélange bactériens•BMR: Détection des colonies d’intérêt

•Identification présomptives (et pas définitive)

Référentiel en Microbiologie Médicale (REMIC) – Société Française de Microbiologie Ed ; 2015: p. 179-192 et p.515-526. - European Manual of Clinical Microbiology (EMCM) – Edition 2012 (1st

edition) – European Society of Clinical Microbiology and Infectious Disease (ESCMID); 2012: p. 133-143.

Introduction fin 2010

•BD Kiestra versus Copan

•Industrialisation de la microbiologie

•Introduction de la technologie à l’IAI

Automatisation parcellaire du processus

•Ensemencement: liquide, eSwab

•Incubation (aérobie, CO2)

•Convoyage

•Imagerie introduction des concepts de

•Lecture virtuelle

•Suivi dynamique de la croissance bactérienne

Gains attendus

•Gain de productivité : réduction du temps de réalisation de certaines étapes pré analytiques et analytiques

•Gain de traçabilité des opérations réalisées

•Réduction de temps d’obtention des résultats (TTR)

•Détection plus rapides des boites « positives »

•Traitement analytique plus précoce des boites « positives »

Bilan

•Technologie induisant des changements d’organisation des laboratoires de bactériologie

•Evolution vers un modèle à flux analytique continu

•Nécessité de laboratoires offrant des services 24/7

•Gain de TTR et conséquence cliniques

•Encore peu de données, tout est à démontrer.

•Etude de McConnell et al.

•Augmentation de 16% du nombre de bactéries isolées en comparaison aux méthodes manuelles dans un laboratoire de microbiologie hospitalier

•Echantillons positifs : +19%

•MRSA : +2%

•VRE : +5%

McConnell M, Main C, Yamamura D. Increased recovery and detection of pathogens using Copan’s WASPLab™ total laboratory automation (TLA), European Congress ofClinical Microbiology and Infectious Diseases, abstract P0430

Avantages

• Examen direct préalable pour certain examens

• Orientation ?

• Prudence avec les ED des prélèvements respiratoires: 50-60% de concordance avec la culture

• Sensible: 1 UFC

• Isolement de souches

• Sensibilité aux antibiotiques

• Recherche des facteurs de virulence

• Typage, enquête épidémiologiques (lien de clonalité).

Inconvénients

• Nécessité de personnel spécialisé

• Parfois lent, voire très lent, notamment pour les bactéries à croissance lente

• Impacté par le type de prélèvement, les conditions pré analytiques

• Savoir ce que l’on cherche :

• Cas des bactéries nécessitant des milieux spécifiques,

• Cas des bactéries intracellulaires,

• Cas des bactéries « fragiles ».

• Impactée par les antibiothérapies préalables: cas des infections décapitées.

Outils d’identification bactérienne

•Galerie d’identification biochimique manuelle ou automatisée

•Immunologique: tests agglutinations

•Streptocoques: groupage

•E. coli K1

•Salmonella/Shigella

•Moléculaire: Cf. ci-après.

Fin 2009-2010: introduction de la spectrométrie de masse MALDI TOF

• Sur colonies

• Sur prélèvements

Spectrométrie de masse :◦ déplacement d’une particule chargée dans des champs

électromagnétiques

≈ détermination de la masse des molécules m/z, masse (m) sur la valeur absolue de la charge d’un ion analysé (z)

MALDI MatrixAssistedLaserDesorptionIonisation

TOFTimeOfFlight

Désorption / Ionisation laser assistée par matrice

Temps de vol

Dépôt de la souche bactérienne◦ A l’état « brute »◦ Après extraction : acide formique, acide trifluoro

acétique

Cristallisation dans une matrice◦ « Alpha Cyano » : acide alpha-cyano-4-hydroxy

cinnamique Recommandée pour l’identification bactérienne

◦ « DHB » : acide 2.5-dihydroxybenzoïqueRecommandée pour le l’identification bactérienne et

le typage bactérien

« Alpha cyano » «DHB »

Irradiation du dépôt cristallin par impulsions laser

Désorption et ionisation des molécules de matrice et desmicroorganismes (protéines, peptides, sucres) de l’échantillonTransfert des protons de la matrice

Co-cristallisation del’échantillon et de la

matrice photosensible

Excitation desmolécules de matricespar l’impulsion laser

+Laser

Ionisation etdésorption des

protéines

Etape 1 Etape 2 Etape 3

Accélération des ions formés dans un champ électrique

Séparation des ions selon leur rapport m/Z dans le tube de vol

10-7 mbars

Plaque support

matrice + échantillon

Détection des ions et mesure du temps écoulé entre un T0 et l’impact sur le détecteur

Obtention du spectre formé de pics :◦ Abondance sera représentée en

fonction ◦ du rapport m/Z

Comparaison du spectre obtenu avec les spectres de la BDD◦ Identification◦ Score de similitude (%, nombre)

Etude Suisse 2010

Cherkaoui A, et al.J Clin Microbiol. 2010 Apr;48(4):1169-75 – Veloo AC, Knoester M, Degener JE, Kuijper EJ. - Comparison of two matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry methods for the identification of clinicallyrelevant anaerobic bacteria. - Clin Microbiol Infect. 2011 Oct;17(10):1501-6.. Carbonnelle E, Grohs P, Jacquier H, Day N, Tenza S, Dewailly A, Vissouarn O, Rottman M, Herrmann JL, Podglajen I, Raskine L. Robustness of two MALDI-TOF mass spectrometry systems for bacterial identification.J Microbiol Methods. 2012 May;89(2):133-6.

Biotyper (94%) > Saramis (89%)

Etude Hollandaise 2010 - Anaérobies

N=79 Biotyper SARAMIS

ID au genre 61% 71%

ID à l’espèce 51% 61%

Saramis > Biotyper

Etude Française 2012 – Souches cliniques

Biotyper (94,9%) > Saramis (93,3%)

Biotyper

• ID Espèce OK: 92,7% (ns)

• ID Espèce + genre : 95,5%

• Mauvaises ID:

• Serratia et Haemophilus

• S. pneumoniae(alors que S. mitis/oralis)

• Pas d’ID : 3,2%

• Cas des anaérobies : 61,6%

VITEK MS

• ID Espèce OK : 93,2%(ns)

• ID Espèce + genre : 93,6%

• Mauvaises ID : 1 S. pneumoniae

• Pas d’ID : 5,8%

• Cas des anaérobies : 75,3%

SARAMIS

• ID OK : 83,8%*

• ID Espèce + genre : 86,9%

• Mauvaises ID: S. pneumoniae (alors que S. mitis/oralis)

• Pas d’ID : 12,8%

Martiny D, Busson L, Wybo I, El Haj RA, Dediste A, Vandenberg O. -- Comparison of the Microflex LT and Vitek MS Systems for Routine Identification of Bacteria by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Timeof Flight Mass Spectrometry. - J Clin Microbiol. 2012 Apr;50(4):1313-25

Performances◦ 94,9% avec BDD

additionnelle

◦ 79,3% avec BDD Bruker

◦ 59,6% avec protocole BMX

◦ Pas de mauvaise ID

◦ Modification scores 1,9 ID de 95,9% et 89,4%

(BDD Bruker seule)

1,7 ID de 96,5% et 94,9% (BDD Bruker seule) avec 3% d’erreur d’ID

Performances◦ 94,4%

◦ 3 souches mal identifiées : M. immunogenum M.

chelonae,

Mycobacterium europaeum

M. scrofulaceum,

Mycobacterium terrae Mycobacterium arupense

Souches non identifiées par la BDD Bruker

◦ 87,4% ID correctes avec protocole « maison »

Mather CA, Rivera SF, Butler-Wu SM. Comparison of the Bruker Biotyper and Vitek MS Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry Systems for Identification of Mycobacteria Using Simplified Protein Extraction Protocols. J Clin Microbiol. 2014 Jan;52(1):130-8.

Bruker VITEK MS (RUO)= SARAMIS

Performances équivalentes des BDD commercialisées Mais◦ Taux élevé d’erreurs du VITEK MS (12,1% versus 1%) pour BioTyper◦ Capacité du biotyper de créer une base de données spectrale

complémentaire 100% d’ID correctes

Identifications correctes

Vitek MS Maldi Biotyper

Candida Espèce 87,3 % 92,3 %

Genre 93,7 % 93,6 %

Non Candida

Espèce 72,5 % 80 %

Genre 85 % 80 %

Mancini N, De Carolis E, Infurnari L, Vella A, Clementi N, Vaccaro L, Ruggeri A, Posteraro B, Burioni R, Clementi M, Sanguinetti M. Comparative evaluation of the Bruker Biotyper and Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry systems for identification of yeasts of medical importance. J Clin Microbiol. 2013 Jul;51(7):2453-7.

Biotyper

• Aspergillus, Fusarium et Mucorales

• Protocoles d’extraction et de dépôts spécifiques

• ID correctes : 87% 96,8%

VITEK MS

• n=44 – 9 espèces Aspergillus sp.

• Dépôts

• A partir de gélosé Sabourraudsans actidione

• Extraction directe à l’acide formique sur la cible.

• Performances

• 81,8% versus 88,6% méthodes conventionnelles

De Carolis E, Posteraro B, Lass-Flörl C, Vella A, Florio AR, Torelli R, Girmenia C, Colozza C, Tortorano AM, Sanguinetti M, Fadda G. Species identification of Aspergillus, Fusarium and Mucorales with direct surface analysisby matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Microbiol Infect. 2012 May;18(5):475-84 - Iriart X, Lavergne RA, Fillaux J, Valentin A, Magnaval JF, Berry A, Cassaing S. - Routineidentification of medical fungi by the new Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight system with a new time-effective strategy. - J Clin Microbiol. 2012 Jun;50(6):2107-10.

Protocole 1 Protocole 2

Protocole 1◦ Gram + : 72/197 (37%)◦ Gram – : 117/125 (94%)

Protocole 2◦ Gram + : 94/197 (67%)◦ Gram - : 87/125 (87%)

• Performances limités sur les streptocoques.• Ne remplace pas la culture

1mL centrifugation à 500rpm/15min

SN centrifugation 14000 rpm/20 min

Culot : 1mL d’eau + Vortex +

centrifugation 14 000 rpm/20 min

Culot + 5µL acétonitrile + 5µL TFA 20% incubation 15

min/T ambiante

Centrifugation 14 000 rpm/2 min 2µL sur une lame + 2µL CHCA

1mL centrifugation à 500rpm/5min

SN centrifugation 14000 rpm/5 min

Culot : 1mL d’eau + Vortex +

centrifugation 14000 rpm/5 min

Culot + 5µL acide formique

incubation 5 min/T ambiante

Ajout 5µL acetonitrile

Centrifugation 14000 rpm/2 min 2µL sur une lame +

2µL CHCA

Kok J, Thomas LC, Olma T, Chen SC, Iredell JR. Identification of bacteria in bloodculture broths using matrix-assisted laser desorption-ionization Sepsityper™ and time of flight mass spectrometry. PLoS One. 2011;6(8):e23285

Flacons Bactec BD Protocole (Cf. ci contre) MALDI TOF Biotyper

◦ Score >2 : ID◦ Score >1,7 : genre◦ Score <1,7 : pas d’ID

Performances (n=507 hémocultures)◦ Gram +

ID espèce : 46,3%

ID au genre : 68,4%

Erreur ID : 1,4%

Pas d’iD : 31,6%

◦ Gram – ID espèce : 79,7%

ID au genre : 87,2%

Erreur ID : Aucun

Pas d’iD : 12,8%

◦ Limites Hémocultures plurimicrobiennes Hémocultures à Streptocoques,

Entérocoques et autres bacilles à Gram positif

Kok J, Thomas LC, Olma T, Chen SC, Iredell JR. Identification of bacteria in blood culture broths using matrix-assisted laser desorption-ionization Sepsityper™ and time of flight massspectrometry. PLoS One. 2011;6(8):e2328

1mL + 200µL de tampon de lyse

vortex 10s

Centrifugation13000 rpm/1 min

Culot : 1mL d’eau + Vortex +

centrifugation 13000 rpm/1 min

Culot + 300µL eau + 900µL éthanol

centrifugation 13000 rpm/2 min

Culot centrifugation 13000

rpm/2 min

Culot 2µL acide formique + 50µL

acétonitrile Vortex

Centrifugation 13000 rpm/2 min

Dépôt de 1µL de SN + 1L de CHCA

Avantages

• Identification dès J0

• Impact sur la prise en charge du patient réduction du délai de l’antibiothérapie adaptée (sepsis)?

Inconvénients

• Protocoles aux étapes nombreuses

• Pas d’automatisation

• Performances variables, loin des 100%

• Inefficience pour les hémocultures à 2 germes ou plus

• Ne remplace pas la culture bactérienne

• Gain moyen de 24h à 48hPrélèvements mono-microbiens

• Aide à différencier flore commensale/pathogènes

• Rendu précoce des négatifs

• Ex: Flore vaginale, Flore tractus respiratoire hautPrélèvements avec flore associée

• Identification d’un plus grand nombre de bactérie de même morphologieOrthopédie

• Ex. Culture C. difficile

Bactéries à pousse lente, nécessitant un inoculum important

pour la réalisation des galeries

• Identification facilité des BGN NF, dans la journée, contre > 72h parfois.Crachats Mucoviscidose

• Si identification direct sur Hémoculture : gain de 24h à 72h voire +Cas des hémocultures

Etude australienne Temps : qq minutes

Gain de temps moyen : 20h versus VITEK 2

Cas des ID sur les flacons d’hémocultures◦ Réductions du temps moyen de rendu de l’ID◦ Réduction du temps de changement pour une

antibiothérapie appropriée

Etude de Vlek et al. (Hollande)◦ Groupe contrôle 253 bactériémies avec ID MALDI

sur colonies◦ Groupe 164 bactériémie ou ID MALDI sur

hémocultures 2 fois/jour et 1 jour les WE et JF.◦ Réduction du temps d’ID de 28,8h◦ Augmentation de 11,3% d’antibiothérapie

appropriée moins de 24h après positivité de hémoculture CTRL : 64%

ID MALDI Hémo : 75,3%

Vlek AL, Bonten MJ, Boel CH. Direct Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Improves Appropriateness of Antibiotic Treatment of Bacteremia. PLoS One. 2012;7(3):e32589. Epub 2012 Mar 16. - Neville SA,Lecordier A, Ziochos H, Chater MJ, Gosbell IB, Maley MW, van Hal SJ. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J Clin Microbiol. 2011Aug;49(8):2980-4.

Bornes actualisées chaque année: CA-SFM

•Evolution vers l’EUCAST avec quelques spécificités françaises

•Gros changements en 2015

Méthodologies utilisées

•Automates: VITEK 2, Phoenix, WalkAway, etc.

•Facilité, rapide à faire, non disponible pour toutes les bactéries

•CMI approchées disponibles, globalement fiables

•Diffusion: méthode des disques avec/sans lecture automatisée (SIRSCAN, Adagio, etc.)

•Méthode de référence

•Applicable à quasi toutes les bactéries à croissance « rapide ».

•Bandelettes CMI (Etest, MICE, CMI)

•Gradient de concentrations

•Fiables mais couteux

•Intérêt pour IOA, EI, etc.

Futur: antibiogrammes en « cellule unique »

•Principe: croissance/pas croissance en présence d’antibiotiques

•Différentes technologies: puits unique, microfluidique, etc.

•Objectifs

•Rapidité

•Travailler sur différentes populations bactériennes: hétérogénéité

•Exemple: système Accelerate

•Identification en 1 heure et antibiogrammes en 5 heures

•Détection optique de la croissance bactérienne

•A partir des flacons d’hémoculture positifs: étude de Douglas et al.

•Par rapport au V2: 95%

•Par rapport à la diffusion: 91%

•A partir des mini LBA : étude de Douglas et al.

•33 patients, 73 échantillons – 7 positifs (4 S aureus, 2 Stenotrophomonas, 1 Kp

•ATB concordant dans 4/5 tests

•Modification du TT AB chez 3/7 patients

Rapid identification and antimicrobial susceptibility testing of bacteria in bloodstream infections using the Accelerate ID/AST technology - Price C, Douglas I, Tuttle E, Shorr A, Mensack M,Bessesen M, Miquirray S, Overdier K, Duarte N, Shamsheyeva A, Gamage D, Allers E, Hance K, Michel C, Turng B, Metzger S - ECCMID 2015, Copenhagen, Denmark, ePoster - Ivor S. Douglas,Connie S. Price, Katherine H. Overdier, Robert F. Wolken, Steven W. Metzger, Kenneth R. Hance, and David C. Howson "Rapid Automated Microscopy for Microbiological Surveillance ofVentilator-associated Pneumonia", American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, Vol. 191, No. 5 (2015), pp. 566-573

• Tests de détection de pathogènes

• Test de détection de la résistance

Streptococcus pneumoniae

•Test BINAX Now: test ICT•Diagnostic des pneumopathies aiguës communautaires de l’adulte

•Pas de recherche d’emblée exceptée pour les patients en réanimation•Sensibilité

•entre 77 et 89% si pneumopathies bactériémiques, •entre 44 et 64% si pneumopathies non bactériémiques.

•Spécificité > 90%•Inutile dans le suivi d’une pneumopathie à Pneumocoque

•Positivité précoce (1-3 jours) mais persistance pendant au moins 6 semaines sans traitement (maximum environ 3 mois), et au moins 7 jours sous antibiothérapie

Legionella pneumophila sérogroupe 1

•Nombreux tests sur le marché aux performances inégales (BINAX Now)

•Diagnostic rapide des légionelloses dues à Legionella pneumophila de sérogroupe 1 exclusivement (environ 90% des cas)

•Ne dispense pas de la recherche de Legionella dans les prélèvements respiratoires (crachat, aspiration trachéobronchique, mini LBA, LBA)

•Inutile pour le suivi une pneumopathie à Legionella

•Positif entre 1 et 3 jours après le début d’une légionellose, persistance pendant plusieurs semaines (6-8 semaines sans traitement, au moins 7 jours sous antibiothérapie).

XVème conférence de consensus en thérapeutique anti-infectieuse. Prise en charge des infections des voies respiratoires basses de l'adulte immunocompétent. Med Mal Infect 2006;36:235-44 - Zalacain R, Capelastegui A, Ruiz LA, Bilbao A, GomezA, Uranga A, España PP. - Streptococcus pneumoniae antigen in urine: diagnostic usefulness and impact on outcome of bacteraemic pneumococcal pneumonia in a large series of adult patients. - Respirology. 2014 Aug;19(6):936-43. - Weatherall C,Paoloni R, Gottlieb T. Point-of-care urinary pneumococcal antigen test in the emergency department for community acquired pneumonia. Emerg Med J. 2008 Mar;25(3):144-8. Bartlett JG. Diagnostic tests for agents of community-acquiredpneumonia. Clin. Infect. Dis. 2011; 52(Suppl. 4): S296–304. - Werno AM, Murdoch DR. - Medical microbiology: laboratory diagnosis of invasive pneumococcal disease. - Clin Infect Dis. 2008 Mar 15;46(6):926-32. - Anjay MA, Anoop P. - Diagnosticutility of rapid immunochromatographic urine antigen testing in suspected pneumococcal infections. Arch Dis Child. 2008 Jul;93(7):628-31. - Charkaluk ML, Kalach N, Mvogo H, Dehecq E, Magentie H, Raymond J, Gendrel D, Kremp O, Decoster A. -Assessment of a rapid urinary antigen detection by an immunochromatographic test for diagnosis of pneumococcal infection in children. Diagn Microbiol Infect Dis. 2006 Jun;55(2):89-94. - Michael D. Smith, Petra Derrington, Rachel Evans,Marjorie Creek, Rhonwen Morris, David A. B. Dance, and Keith Cartwright Rapid Diagnosis of Bacteremic Pneumococcal Infections in Adults by Using the Binax NOW Streptococcus pneumoniae Urinary Antigen Test: a Prospective, Controlled ClinicalEvaluation - J. Clin. Microbiol. July 2003 ; 41:7 - Yu VL - A clinical solution to antimicrobial resistance in community-acquired pneumonia: narrowing the spectrum of antimicrobial therapy: comment on "Current and potential usefulness ofpneumococcal urinary antigen detection in hospitalized patients with community-acquired pneumonia to guide antimicrobial therapy". Arch Intern Med. 2011 Jan 24;171(2):172-3

Recherche d’antigènes dans le LCR

• Evolution des recommandations: ne doivent plus être effectuées à l’exception du test BINAX Now S. pneumoniae

• Performances faibles

• Consommateur de LCR

• Acte obsolète non remboursé

• Privilégier les « PCRs »

Cas du test BINAX Now S. pneumoniae

• Résultat en 15 minutes

• Performances supérieures à la culture

• Sensibilité : 95%

• Performances équivalentes à celles de la PCR spécifique S. pneumoniae

Enhanced diagnosis of pneumococcal meningitis with use of the Binax NOW immunochromatographic test of Streptococcus pneumoniae antigen: a multisite study. – Samra Z, Shmuely H, Nahum E, Paghis D, Ben-Ari J. Use of the NOWStreptococcus pneumoniae urinary antigen test in cerebrospinal fluid for rapid diagnosis of pneumococcal meningitis.Diagn Microbiol Infect Dis. 2003 Apr;45(4):237-40.Moïsi JC, Saha SK, Falade AG, Njanpop-Lafourcade BM, Oundo J, Zaidi AK, AfrojS, Bakare RA, Buss JK, Lasi R, Mueller J, Odekanmi AA, Sangaré L, Scott JA, Knoll MD, Levine OS, Gessner BD. Clin Infect Dis. 2009 Mar 1;48 Suppl 2:S49-56.

Détection antigénique

• Par tests ELISA

• Par tests ICT

• Réponse en 30 minutes – 4 heures

• Très utilisé dans les pays nordiques

Campylobacter sp.

• Evaluation lyonnaise : 2 tests ELISA/2 tests ICT/PCR et culture

• N=180 selles pédiatriques

EHEC: detection vérotoxines/O157

• Performances proches de la culture

• Cout élevé

• Supplanté par les PCR

B. Falquet, P. H. Boyer, L. Bénéjat, L. Hees, O. Dauwalde, F. Mégraud, F. Vandenesch, A M. Freydière -Evaluation comparative des performances de deux tests immunochromatographiques [ICT] pour la détection desCampylobacter sp. dans des selles pédiatriques. – RICAI 2012 poster - Woo JS, Palavecino EL. Four-year experience with simultaneous culture and Shiga toxin testing for detection of Shiga toxin-producing Escherichiacoli in stool samples. J Clin Microbiol. 2013 Mar;51(3):985-7.

• Détection par test ICT de la GDH: présence ou non de C. difficile

• Recherche des toxines A/B par test ICT

Clostridium difficile:

recherche des C.

difficiletoxinogènes (Toxine A/B)

sur les selles

• Association de tests ICT

• Si discordance : PCR

Algorithme européen

de diagnostic

Jones G, Taright N, Boelle PY, Marty J, Lalande V, Eckert C, Barbut F. Accuracy of ICD-10 codes for surveillance of Clostridium difficile infections, France. Emerg Infect Dis. 2012 Jun;18(6):979-81.

Test PBP2a : détection de la résistance à la méthicilline sur colonies par test ICT

• S. aureus: Sensibilité =95% / Spécificité = 100%

• S. non aureus: Sensibilité = 88% / Spécificité = 100%

• Nécessité d’une induction par une Beta-Lactamine

Test BetaLacta Test

• Dégradation d’une céphalosporine chromogénique par les Beta Lactamases et par certaines HyperCase (AmpC)

• Performances :

• Sensibilité : 93%

• Spécificité : 99,6%

Test RAPIDEC Carba/ Carba NP Test

• Détection phénotypique de la production de carbapénémases par acidification

• Performances

• Sensibilité : 97-99%

• Spécificité : 100%

J-P. Rasigade, O. Raulin, A.M. Freydiere, L. Parmeland, C. Roure-Sobas, H. Salord, J. Etienne, S. Tigaud, F. Laurent Methicillin-resistance detection in 5 minutes : new rapid immuno-chromatographic kit directly fromStaphylococcus aureus primary isolates ECCMID 2010. M. Ben Soltana, C. Dallenne, A. Birgy, F. Compain, S. Vimont, C. Verdet, C. Favier, M. Juvin, G. Arlet - of third-generation cephalosporins non-susceptibleEnterobacteriaceae ECCMID 2012 Dortet L, Agathine A, Naas T, Cuzon G, Poirel L, Nordmann P. J Antimicrob Chemother. Evaluation of the RAPIDEC® CARBA NP, the Rapid CARB Screen® and the Carba NP test forbiochemical detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. 2015 Nov;70(11):3014-22

• PCR universelle versus PCR spécifique

• Cas du PLEX-ID ou IRIDICA

• PCR « simplex » versus PCR multiplex

• PCR « manuelles » versus PCR automatisées

• Approches syndromiques

PCR « universelle »

• Identification d’une séquence d’ADN bactérien par amplification dans une prélèvement biologique

• Gène commun à

• Toutes les eubactéries: ARN ribosomique16S

• Fongique: 18S

• Sans a priori sur le résultat

• PCR suivie d’une étape de séquençage du produit de PCR => identification

• Durée minimale de réalisation: 72 heures

PCR spécifiques

• Détection par amplification d’une séquence d’ADN spécifiques d’un genre, d’une espece, d’un génogroupe

• Présomption clinique forte

• Résultats POSITIF ou NEGATIF en 24 heures

PCRs bactériennes qualitatives et non quantitative (à ce jour)

Liste non exhaustive…

PCR Gène cible PrélèvementUniverselle ARNr 16S Tout type supposé monomicrobien

Staphylococcus spp tuf Ostéo-articulaire, endophtalmie, valve cardiaque

S. aureus gyrA Ostéo-articulaire, abcès, liquide de ponction…

Streptococcus spp tuf Ostéo-articulaire, endophtalmie, abcès, ponction, valves

S. pneumoniae lytA LCR, liquides pleural, endophtalmie, abcès…

S. pyogenes ntpB Abcès et liquide de ponction

Neisseria meningitidis siaD LCR, sang, biopsie purpurique

Listeria monocytogenes hlyA LCR

Kingella kingae rtxA Ostéo-articulaire, sang (spondylodiscite)

Legionella pneumophila / spp mip / 16S Prélèvements pulmonaires

Bordetella pertussis / parapertussis IS 1001/481 Naso-pharyngé

Borrelia spp ospA Ostéo-articulaire, biopsie cutanée

Francisella tularensis fopA Ganglion, abcès

Bartonella henselae / quintana ribC Ganglion, abcès, sang, valve cardiaque

Tropheryma whipplei ARNr 16S Sang, salive, selles, LCR, biopsie digestive, valve

Coxiella burnetii IS 1111 Valve cardiaque

E. coli entéropathogènes stx 1/2, eae Selles

Clostridium difficile GDH, toxine Selles

Mycobacterium sp. hsp65 Pvts respiratoires, pvts profonds, etc. (pas les LCR)

Nocardia sp. ARNr 16S Pvts respiratoires, pvts profonds, etc.

Neisseria gonorheae 1 cibleplasmidique

Urine, pvts génitaux, yeux, pvts ano rectaux, etc.

Chalmydia trachomatis 2 ciblesplasmidiques

Urine, pvts génitaux, yeux, pvts ano rectaux, etc.

PCR biotox: B. anthracis, Burkholderiamallei/pseudomallei, etc.

ARNr 16S (régions spécifiques)

Tous pvts

PCRs pour « aller + vite » car culture longue

•Coqueluche: PCR Bordetella

•Méningite: PCR Neisseria meningitidis, S. pneumoniae, etc.

•PCR Mycobactéries

PCR en complément de la culture restée négative, souvent à cause d’une antibiothérapie préalable.

•PCR universelle

•PCR Staphylocoques, Streptocoques (EI)

•PCR Propionibacterium acnes

PCR car bactéries non cultivable ou difficilement

•PCR Bartonella

•PCR Coxiella

•PCR Tropheryma whipplei

PCR de dépistage: PCR syndromiques

•Infections respiratoires

•Gastro entérites

•Méningite/méningoencéphalites

•Etc.

Morel AS, Dubourg G, Prudent E, Edouard S, Gouriet F, Casalta JP, Fenollar F, Fournier PE, Drancourt M, Raoult D. Complementarity betweentargeted real-time specific PCR and conventional broad-range 16S rDNA PCR in the syndrome-driven diagnosis of infectious diseases. Eur J ClinMicrobiol Infect Dis. 2015 Mar;34(3):561-70.

PCR universelle

• Site initialement stérile

• Pas sur les prélèvements pour lesquels il existe des seuils de pathogénicité (urines, LBA…)

PCR spécifiques

• Potentiellement tous les types de prélèvements

• Savoir ce que l’on cherche

• Pas de PCR spécifique ciblant une bactérie pouvant appartenir à la flore « normale »

• PCR staphylocoque sur biopsie cutanée

• PCR pneumocoque sur un prélèvement respiratoire

Recueil du prélèvement

• Liquide de ponction, pus, tissu, biopsie, sang…

• Bannir les écouvillons

• Volume ≥ 200 μL

• Sang sur EDTA (héparine = inhibiteur)

• Ne rien ajouter (liquide, fixateur, milieu de transport…)

Nombre de prélèvements

• Conditions identiques à la culture

• Multiplier le nombre de prélèvement en orthopédie (limité à 5)

• Culture et PCR sur un même prélèvement

Acheminement au laboratoire

• < 4 heures : t°ambiante,

• <24 heures : +4°C,

• Au delà: -20°C (sauf les sangs)

Prélèvement

Lyse cellulaire+ extraction d’ADN manuelle

ou automatiséeAmplification

et

détection de l’ADN amplifiéSéquençage

(PCR universelle) et analyse de la séquence Simultanée :

PCR en temps réel

Après :PCR en point

final

4 heures1 série quotidienne

24 – 48 heures

1 heureValidation du résultat

10 min

3 heures

5’3’

3’5’

ADN cible : 1 copie

Dénaturation : 94°C

5’3’

5’

3’

3’

5’

3’5’

ADN cible : 1 copie

Dénaturation : 94°C

Hybridation des amorces

5’3’

5’

3’

3’

5’

3’5’

5’

3’

3’

5’

ADN cible : 1 copie

Dénaturation : 94°C

Hybridation des amorces

5’3’

5’

3’

3’

5’

3’5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

Elongation (dNTP, polymérase) : 72°C

5’

5’

ADN cible : 1 copie

Hybridation des amorces

5’3’

5’

3’

3’

5’

3’5’

5’

3’

3’

5’

ADN cible : 1 copie

Dénaturation : 94°C

Elongation (dNTP, polymérase) : 72°C

5’

3’

3’

5’

ADN cible : 1 copie

Dénaturation

Hybridation des amorces

Elongation (dNTP, polymérase)

30 à 40 cycles

soit

230 à 240

copies

Nom

bre

de c

opie

s

Nombre de cycles

Détection en temps réelMarqueur

fluorescent

Détection en point final

Gel migration

Cycle SeuilCycle

threshold(Ct)

Quantité d’ADN

Gel migration des produits de PCR

Vérification de la taille attendue

SybrGreen™

Liaison non spécifiqueà l’ADN db

Spécificité par amorces et température de fusion

(1/2 ADN db – ½ ADN sb)

Economique et facile

Reporter fluorescent

Contrôle + Ech 1

Ech 2

Témoin neg

Contrôle +

Ech 1

Ech 2

Témoin neg

SybrGreen™

Liaison non spécifiqueà l’ADN db

Spécificité par amorces et température de fusion

(1/2 ADN db – ½ ADN sb)

Economique et facile

Sondes spécifiques

Liaison spécifique des sondes à l’ADN db

Multiplexage (≠ cibles)

Coût plus élevéDéveloppement plus délicat

Reporter ou sonde fluorescent

Codé en opéron

Nombre de copies du gènes variable en fonction de l’espèce bactérienne (1 à 10)

Structure et fonction conservée chez toutes les bactéries

Pas de transfert horizontal

Nombreuses séquences déposées dans les bases de données

Séquences conservées chez toutes les bactéries

Amorces

Séquences spécifiques d’un genre / d’une espèce

“Signature” après séquençage du produit

de PCR

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1500 pb

911 1390 ≈ 480 pb

PCR Migration des produits de PCR

Témoin négatif

Marqueur de poids moléculaireTémoin positif

Patients

Technique Big Dye® Terminator

PCR avec produit de PCR + amorce + polymérase +

dNTP (3’OH) en compétition avec

ddNTP* interrupteurs (3’H) : ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP

Pool de brins d’ADN de taille variable

Purification du produit de PCR

Électrophorèse capillaire

CTTGCACTGC

CTTGCACTGCG

CTTGCACTGCGA

CTTGCACTGCGAT

CTTGCACTGCGATT

CTTGCACTGCGATTA

CTTGCACTGCGATTAC

Séquence ARNr 16S : CGATTAC

Chromatogramme

Le Bibi PQB◦ BioInformatic Bacterial Identification Prokaryote Quick Identification◦ https://umr5558-bibiserv.univ-lyon1.fr/lebibiPQP/lebibiPQP.cgi

◦ Incrémentée tous les 3 mois (GenBank)◦ Informations contrôlées (espèce) : DSMZ database

Identification de genre si > 97 %Identification d’espèce si > 99 %

Prevotella spp

(T : sequence type, TT : strain type, GenBank ID)

Contrôle négatif et positif de PCR 16S

•Détection de contaminants et inhibiteurs dans le mix

Contrôle d’extraction

•Amplification parallèle du gène de la β-globine (eucaryote)

•Toujours positif

•Si négatif

•Prélèvement acellulaire : intra-oculaire, LCR

•Présence d’inhibiteurs de PCR

Interprétation de la séquence

•Confrontation des données cliniques et biologiques

•Distinguer un contaminant d’un pathogène

•Une PCR négative d’exclut pas un diagnostic

Méthodologie

•6 heures/échantillon

•Extraction

•PCR multiplex avec amorces ciblant 16S, 18S, tuf, rplB, valB, mecA/C, vanA/B, KPC, etc.

•Révélation par spectrométrie de masse électrospray: mesure de la masse de la séquence = composition en nucléotide de la séquence amplifiée mais pas la séquence en elle-même.

•Algorithmes de triangulation et comparaison à la base de données: obtention de l’identificaion

Avantages

•Plus rapide que la PCR universelle

•Détection des échantillons plurimicrobiens

•Méthode quantitative

Inconvénients

•Long: 6 heures/manip

•Attention aux contaminations

Application: diagnostic des sepsis

•Etude de Jordana-Liuch et al.

•410 hémocultures

•Comparaison IRIDICA versus Culture

•75-80% de résultats similaires

•Sensibilité : 83%

•Spécificité : 79%

•Identification de 41 microorganismes non détectés par culture

•40 contaminations

Ecker DJ, Sampath R, Li H, Massire C, Matthews HE, Toleno D, Hall TA, Blyn LB, Eshoo MW, Ranken R, Hofstadler SA, Tang YW. New technology for rapid molecular diagnosis of bloodstream infections. Expert Rev Mol Diagn. 2010 May;10(4):399-415. - Jordana-Lluch E, Giménez M, Quesada MD, Rivaya B, Marcó C, Domínguez MJ, et al. (2015) Evaluation of the Broad-Range PCR/ESI-MS Technology in Blood Specimens for the olecularDiagnosis of Bloodstream Infections. PLoS ONE10(10): e0140865

Avantages

• Amplification de tous les ADN bactériens

Inconvénients

• Pouvoir discriminant inter-espèces parfois limité

• Staphylococcus et Streptococcus

• Pouvoir discriminant inter-genres parfois limité

• Mycobactéries, entérobactéries…

• Amplification des contaminants

• Biais des banques de données

• Séquences surreprésentées, erronées, inconnues

• Sensibilité moindre par rapport aux PCR spécifiques

• Etude de Morel et al.

• PCR 16s: seulement 53,6% des diagnostics d’EI et 51,2% des diagnostics d’IOA

Morel AS, Dubourg G, Prudent E, Edouard S, Gouriet F, Casalta JP, Fenollar F, Fournier PE, Drancourt M, Raoult D. Complementarity between targeted real-time specific PCR and conventional broad-range 16S rDNA PCR in the syndrome-driven diagnosis of infectious diseases. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2015 Mar;34(3):561-70.

PCR « semi-spécifiques » des genres Staphylococcus & Streptococcus◦ Gène tuf◦ Gel migration◦ Suivie d’un séquençage pour identification d’espèce (même principe que la

PCR universelle

PCR spécifiques◦ En point final ou en temps réel◦ Trousse commerciales ou « home made »

Patients : 400 pb

Témoin + : 600 pb

PCR « simplex »

• Une seule cible

• Témoins interne le plus souvent intégrés

• Sensibilité > PCR 16S

• S. aureus > Staph > 16S

• K. kingae > 16S

• Exemple: PCR Kingella kingae, PCR Trophyrema whipplei, etc.

PCR multiplexées

• 2-6 cibles 30-50 cibles

• Multiplexage baisse de la sensibilité par rapport aux PCRs simplex

PCR « manuelles »

• Extraction externalisée mais pouvant être automatisée

• Thermocyclers « polyvalents »

• Trousses commerciales ou « home made »

• Nécessité de personnel spécialisé en biologie moléculaire (laboratoires spécialisés)

• Accessible au mieux 5 jours sur 7 aux heures ouvrables

PCR « automatisées »

• Extraction et PCR intégrées

• De plus en plus multiplexés: introduction des approches syndromiques

• Totalement automatisées

• Personnel polyvalent ou peu spécialisé

• Accessibles aux laboratoires polyvalents

• Accessibilité étendue, probablement 24/7 dans le futur

Caractéristiques

• Extraction et PCR automatisées

• Modulaire

• Rapide : 90 minutes en moyenne

• Facile à utiliser

• Couteux

• 6 canaux de fluorescence: limitation des tests multiplex

Panels

• Résistance: SARM, ERV, Carbapénémases

• Génitaux : Gono/Chlamydia, Strepto B

• Selles: C. difficile

• Respiratoires : Grippe, Mycobactéries

• LCR : entérovirus

• Panels en oncologie, etc.

• Futur : panel selles, charges virales VIH,

63

Caractéristiques◦ Système unitaire

◦ Extraction + PCR (courbes de fusion)

◦ Totalement automatisé

◦ Cout instrument : environ 50 k€

◦ Cout du test : 100-150 (120) €

64

Respiratoire (FDA cleared)

•Cibles virales : Adenovirus, Coronavirus HKU1, Coronavirus NL63, Coronavirus 229E, Coronavirus OC43, HumanMetapneumovirus, Rhinovirus/Enterovirus, Influenza A, Influenza A/H1, Influenza A/H3, Influenza A/H1-2009, Influenza B, Parainfluenza Virus 1, Parainfluenza Virus 2, Parainfluenza Virus 3, Parainfluenza Virus 4, RespiratorySyncytial Virus,

•Cibles bactériennes : Bordetella pertussis, Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae

Hémoculture : identification et qq. marqueurs de résistance (FDA cleared)

•Bactéries : Enterococcus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus & Staphylococcus aureus, Streptococcus & Streptococcus agalactiae & Streptococcus pneumoniae & Streptococcus pyogenes, Acinetobacter baumannii, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae & Enterobacter cloacae complex, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Proteus, Serratia marcescens

•Champignons: Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida tropicalis

•Gènes de résistance : mecA, vanA/B, kpc

Selles (FDA cleared)

•Bactéries : Campylobacter (jejuni, coli and upsaliensis), Clostridium difficile (Toxin A/B), Plesiomonas shigelloides, Salmonella, Yersinia enterocolitica, Vibrio (parahaemolyticus, vulnificus and cholerae), Vibrio cholerae, EAEC, EPEC, ETEC, Shiga-like toxin-producing E. coli (STEC) stx1/stx2, E. coli O157

•Virus : Adenovirus F40/41, Astrovirus, Norovirus GI/GII,

•Parasites : Cryptosporidium, Cyclospora cayetanensis, Entamoeba histolytica, Giardia lamblia

LCR (en études cliniques)

•Bactéries : Escherichia coli K1, Haemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae

•Virus : Cytomegalovirus (CMV), Enterovirus, Epstein-Barr virus (EBV), Herpes simplex virus 1 (HSV-1), Herpes simplex virus 2 (HSV-2), Human herpesvirus 6 (HHV-6), Human parechovirus, Varicella zoster virus (VZV)

•Champignons: Cryptococcus gattii, Cryptococcus neoformans65

Caractéristiques: combinaison de 3 instruments◦ Unyvero L4 Lysator : environ 2

minutes de manipulation – 30 minutes de Lyse

◦ Unyvero A50 Analyzer : ajout réactifs + extrait : durée 5 heures environ

◦ Unyvero C8 Cockpit : panneau de contrôle et de lecture des résultats

◦ Réactifs sous forme de cassettes

Panel : un seul, pneumopathies nosocomiales

Qualitatif, pas d’aspect quantitatifs

66

Caractéristiques

• Extraction séparée

• Amplification séparée

• Révélation par technique LUMINEX

• Multiplexage élevée

• Nombreuses publications

• Marquage FDA

Panels disponibles

• Respiratoires (classique et Fast)

• 8 virus et sous types : Influenza A, Influenza A subtype H1, Influenza A subtype H3, Influenza B, Respiratory Syncytial Virus (RSV), HumanMetapneumovirus (hMPV), Rhinovirus, etAdenovirus

• Selles (classique et bientôt Fast)

• Bactéries : Campylobacter , Clostridium difficile, Toxin A/B , Escherichia coli O157 , Enterotoxigenic E.coli (ETEC) LT/ST , Shiga-likeToxin producing E.coli (STEC) stx1/stx2 , Salmonella, Shigella, Vibriocholerae , Yersinia enterocolitica,

• Virus : Adenovirus 40/41, Norovirus GI/GII, Rotavirus A,

• Parasites: Cryptosporidium, Entamoeba histolytica, Giardia

67

Objectifs souhaitables pour le diagnostic des infections respiratoires

•Rapide (>2h),

•Facile,

•Nombreuses cibles,

•Analyse de plusieurs prélèvements simultanément

•Faible cout,

Limites

•Colonisation vs infection

•Co infections interprétations parfois complexes

Tests disponibles en 2015

•Virus et bactéries intracellulaires

•LUMINEX xTAG RP

•FilmArray RP

•GenMark eSensor RP

•Etc.

•Mycobactéries

•Test Cepheid GeneXpert MTB/RIF

Zumla A, Al-Tawfiq JA, Enne VI, Kidd M, Drosten C, Breuer J, Muller MA, Hui D, Maeurer M, Bates M, Mwaba P, Al-Hakeem R, Gray G, Gautret P, Al-Rabeeah AA, Memish ZA, Gant V. Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections--needs, advances, and future prospects. Lancet Infect Dis. 2014 Nov;14(11):1123-35

68

171 prélèvements (rétrospective) – 85 grippe

+ (75 A et 10 B).

FilmArray RP, Prodesse FLU+/FLU Fast >> VERIGEN

: meilleure sensibilité

Si détection virus Influenzauniquement: combinaison

des test FLU+/FLU Fast : sous typage des virus

grippaux,

Si faible volume, 24/7 : FilmArray: rapide,

performant et détection des autres virus.

Van Wesenbeeck L, Meeuws H, Van Immerseel A, Ispas G, Schmidt K, Houspie L, Van Ranst M, Stuyver L. - Comparison of the FilmArray RP, Verigene RV+, and Prodesse

ProFLU+/FAST+ multiplex platforms for detection of influenza viruses in clinical samples from the 2011-2012 influenza season in Belgium. - J Clin Microbiol. 2013 Sep;51(9):2977-85.69

Contexte:

•Hôpital pédiatrique•Laboratoire 24/7 : 3 instruments FilmArray

Comparatif :

•DFA (ICT) ciblant 9 virus réalisés 3 à 4 fois par jour

•FilmArray réalisé 24/7

Avantages

•Réduction du TTR de 7h vers 1,6 heure

•63% d’échantillons + : Rhino/Enterovirus : 20%; VRS 18%; influenza B : 10%; h-metapneumovirus: 7%; Influenza A : 10%; Coronavirus : 6%, etc. => Gain de26% de pathogènes en plus.

•Co-Détection Coronavirus et Rhinovirus•Seule la grippe induit un TT mais détection des autres virus => étiologie à la symptomatologie observée versus un test détectant seulement la grippe.

•Sur les 97 patients Grippe + : •44/97 (45%) TT avant sortie des urgences;

•79 (81%) sont TT par oseltamivir, prescription moins de 3 heures après le prélèvement

•Impact des résultats sur l’isolement des patients et la réduction de la transmission

•Cout ! DFA : 98,26£ versus 115£ le test

Inconvénients:

•Faible sensibilité pour la détection des Adénovirus (version 1.6)

•Incapacité à différencier les Rhinovirus des Entérovirus

•Pas de quantification de la charge virale

•Nécessité d’une connexion informatique sinon erreur de saisie des résultats dans 0,04% en raison du grand nombre de paramètres

Etude de Doern et al.

•Version 1,7 du kit Biofire : augmentation de la détection des Adénovirus de 66,6% à 90,5%

•Détection de tous les adénovirus sauf le 31

•Réduction de la limite de détection

Xu M, Qin X, Astion ML, Rutledge JC, Simpson J, Jerome KR, Englund JA, Zerr DM, Migita RT, Rich S, Childs JC, Cent A, Del Beccaro MA. Implementation of filmarray respiratory viral panel in a core laboratory improves testing turnaround time andpatient care. Am J Clin Pathol. 2013 Jan;139(1):118-23. - Doern CD, Lacey D, Huang R, Haag C. - Evaluation and implementation of FilmArray version 1.7 for improved detection of adenovirus respiratory tract infection. -J Clin Microbiol. 2013Dec;51(12):4036-9

70

Pneumopathies nosocomiales - n=56 patients => 49 TMM évaluables

•Aspiration : 30

•LBA : 7

•Crachat : 12

Culture

•Plurimicrobien : 4 (8,2%)

TMM

•Plurimicrobien : 27 (55,1%)•Détection de gènes de résistance:

•Réajustement de l’antibiothérapie systématique grâce au TMM

•Antibiothérapie inadaptée dans ¾ des NP de groupe 3

Comparaison selon 3 groupes de pneumopathies

•Groupe 1 : mild-to-moderate nosocomial pneumonia (NP), no usual risk factors, onset any time, or early-onset and severe NP;

•Groupe 2 : mild-to-moderate NP with risk factors and onset any time;

•Groupe 3 : late-onset severe NP or early-onset NP with risk factors

Bilan

•Réduction du TTR de 24-48h à 4 heures•Modification du TT en moins de 6h chez 33/56 (67,3%)

•Pas de détection des Mycobactéries par Unyvero•Intérêt pour Legionella : culture négative et recherche non réalisée en systématique

•Beaucoup de détection de S. pneumoniae•A RESERVER au diagnostic des pneumopathies nosocomiales AVANT mise sous antibiothérapie

Jamal W, Al Roomi E, AbdulAziz LR, Rotimi VO - Evaluation of Curetis Unyvero, a multiplex PCR-based testing system, for rapid detection of bacteria and antibiotic resistance and impact of the assay on management of severe nosocomialpneumonia. J Clin Microbiol. 2014 Jul;52(7):2487-92.

71

Contexte

• 5 laboratoires dans 5 pays (Asie, Afrique, Amérique, Europe)

• Tests moléculaires soit in situ, soit aux USA

• 15 enteropathogènes : enteropathogens: adenovirus, astrovirus, Campylobacterjejuni and Campylobacter coli, Cryptosporidium spp, Entamoeba histolytica, enteroaggregative Escherichia coli (EAEC), entero pathogenic E coli (EPEC), enterotoxigenic E coli (ETEC), Giardia spp, norovirus GII, rotavirus, Salmonella spp, sapovirus, Shigella spp and enteroinvasive E coli (EIEC), et Vibrio cholerae

• n= 867 patients avec diarrhées et 619 témoins

3 méthodes moléculaires:

• XTAG GPP

• RT-PCR conventionnelles

• TaqMan

Référence : positivité des 2/3 techniques moléculaires

TMMs :

• Meilleures sensibilité et spécificité que technique conventionnelles

• Détection des infections mixtes (co infections)

• Association avec signes de diarrhées avec le plupart des pathogènes

Liu J, Kabir F, Manneh J, Lertsethtakarn P, Begum S, Gratz J, Becker SM, Operario DJ, Taniuchi M, Janaki L, Platts-Mills JA, Haverstick DM, Kabir M, Sobuz SU,Nakjarung K, Sakpaisal P, Silapong S, Bodhidatta L, Qureshi S, Kalam A, Saidi Q, Swai N, Mujaga B, Maro A, Kwambana B, Dione M, Antonio M, Kibiki G, MasonCJ, Haque R, Iqbal N, Zaidi AK, Houpt ER. - Development and assessment of molecular diagnostic tests for 15 enteropathogens causing childhood diarrhoea: amulticentre study. - Lancet Infect Dis. 2014 Aug;14(8):716-24.

72

Etude de Khare et al.•Comparaison Luminex versus FilmArray

•Référentiel : culture, détection antigénique, microscopie et PCR individuelle

•n=230 selles prospectives adultes et enfants

•Référentiel : 8,3% selles +•Luminex : 30,3% selles +

•FilmArray : 33,0% selles + •Sensibilité > 90% pour la majorité des cibles des 2 tests sauf•FilmArray: Aeromonas : Se=23,8% (retrait du kit FDA)

•Luminex: Yersinia enterocolitica : Se=48,1%•Fréquence élevée de co-infections

•Routine: 8,3%

•FilmArray : 21,1%

•Luminex: 13,0%

Etude de Biswas et al.

•Comparaison de 3 TMM de GEA bactériennes

•EBP sur BD Max

•Kit Fast Track

•BSP + kit EHEC/ETEC/EIEC (r-Biopharm)

•Référentiel: Culture et si négative, 2/3 TMM +

•n=116 selles prospectives + 318 selles rétrospectives

•Sensibilité PCR > culture sauf pour Salmonella (Excepté BD Max)

•BD>FTD>rBiopharm

•Réduction du TTR de 66,5h à environ 3 heures

Etude de Navidad et al.

•Kit LUMINEX Xtag GPP

•Collections de 254 selles cliniques

•Référentiel : méthodes conventionnelles

•Adénovirus, Rotavirus, norovirus GI/GII, Cryptosporidium, V. cholerae, Y. enterocolitica, ETEC: 100%

•Giardia : 95%

•EHEC : 94%•Shigella : 93%

•Salmonella : 92%

•CDT : 91%

•Campylobacter : 90%

•Co-infections : 31/254 (12%)

•Inhibition des PCR: 8% des échantillons•Excellentes performances sur les parasites

•Se globale : 94,5%- Spécificité = 99%•prise de selle : 100mg

Khare R, Espy MJ, Cebelinski E, Boxrud D, Sloan LM, Cunningham SA, Pritt BS, Patel R, Binnicker MJ. Comparative evaluation of two commercial multiplex panels for detection of gastrointestinal pathogens by use of clinical stool specimens. J Clin Microbiol. 2014 Oct;52(10):3667-73. - Navidad JF, Griswold DJ, Gradus MS,Bhattacharyya S. Evaluation of Luminex xTAG gastrointestinal pathogen analyte-specific reagents for high-throughput, simultaneous detection of bacteria, viruses, and parasites of clinical and public health importance. J Clin Microbiol. 2013 Sep;51(9):3018-24. - Biswas JS, Al-Ali A, Rajput P, Smith D, Goldenberg SD. A paralleldiagnostic accuracy study of three molecular panels for the detection of bacterial gastroenteritis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2014 Nov;33(11):2075-81. doi: 10.1007/s10096-014-2177-9.

73

TMM : Luminex xTAG GPP® Référence: culture

conventionnelle + Immuno + microscopie selon les pathogènes

n=800 patients TMMs :Pas d’évaluation des performances:

TMM mais Tests conventionnels: 81 patients + TMM : 152 patients + dont 141 avec

agent transmissible (Crypto/Giardia considérés comme non transmissibles, donc sans isolement.

Augmentation du cout de réactifs: surcout de22 283 £

Réduction du nombre de jours d’isolements: 2202 jours d’isolement 1447 jours soit une économie de 66 765£

Goldenberg SD, Bacelar M, Brazier P, Bisnauthsing K, Edgeworth JD. - A cost benefit analysis of the Luminex xTAG Gastrointestinal Pathogen Panel for detection of infectious gastroenteritis in hospitalisedpatients. - J Infect. 2014 Nov 29.

74

Etude de Ninove et al. : Xpert & Enterovirus

• N=310 LCR – 81 EV +

• Comparaison avec RT-PCR « home made »

• 81,6% résultats concordants – 16% de résultats indéterminés

• Pas besoin de PCR de contrôle ultérieure

Etude de Cohen-Bacrie et al. : intérêt du POC

• Méningite à Entérovirus : réduction de la durée d’hospitalisation de 2,91 à 1,43 jours

• Grippe:

• 11% de grippe + : isolement et traitement + précoce

• Autre étude montrant une réduction du TTR de 9h à 2h si POC

Ninove L, Nougairede A, Gazin C, Zandotti C, Drancourt M, de Lamballerie X, Charrel RN. Comparative detection of enterovirus RNA in cerebrospinal fluid: GeneXpert system vs. real-time RT-PCR assay. Clin Microbiol Infect. 2011 Dec;17(12):1890-4.-Cohen-Bacrie S, Ninove L, Nougairède A, Charrel R, Richet H, Minodier P, Badiaga S, Noël G, La Scola B, de Lamballerie X, Drancourt M, Raoult D. Revolutionizing clinical microbiology laboratory organization in hospitals with in situ point-of-care. PLoSOne. 2011;6(7):e22403.

75

Avantages

• Sensibles et Spécifiques

• Détection des co infections

• Rapide

• Si automatisé, réalisable 24/7

• Cout efficient

Inconvénients

• Co infections: interprétation complexe ?

• Détection uniquement des cibles inclues dans le panel

• Couteux

• Pas d’antibiogramme

• Détection d’ADN/ARN: processus infectieux actif ou non

Persistance de l’ADN bactérien au cours des infections

• ADN ≠ infections

Cas des endocardites à Coxiella burnetii

• Persistance de l’ADN bactérienne pendant plus de 18 mois après le traitement antibiotique

• Durée maximale de persistance d’ADN dans un valve cardiaque: 16 ans

• Patient avec EI à Coxiella burnetii: Traitement pendant 3 ans parfaitement conduite avec une évolution clinique favorable

• Chirurgie au bout de 16 ans.

Edouard S, Million M, Lepidi H, Rolain JM, Fournier PE, La Scola B, Grisoli D, Raoult D. Persistence of DNA in a cured patient and positive culture in cases withlow antibody levels bring into question diagnosis of Q fever endocarditis. J Clin Microbiol. 2013 Sep;51(9):3012-7.

• Hémocultures

• Cas des endocardites

• Clostridium difficile

• IOA

• Selles

• LCR

• Infections respiratoires

• Résistances aux antibiotiques

Recommandations de l’ESC 2015◦ EI à Hémocultures

négatives: 31% des cas

PCR sur le sang◦ S. aureus

◦ T. whipplei

◦ Streptococcus

◦ Enterococcus

◦ Escherchia coli

2015 ESC Guidelines for the management of infective endocarditis The Task Force for the Management of Infective Endocarditis of the European Society of Cardiology (ESC) - European Heart Journal

Etude Marseillaise◦ Approche syndromique: panel de

PCRs ciblant des étiologies d’EI

◦ Combinaison des PCR 16S, 18S et PCR spécifiques

Intérêt des PCR spécifiques S. gallolyticus, E. faecalis, Coxiella, Bartonellas et E. faecium

Morel AS, Dubourg G, Prudent E, Edouard S, Gouriet F, Casalta JP, Fenollar F, Fournier PE, Drancourt M, Raoult D.omplementarity between targeted real-time specific PCR and conventional broad-range 16S rDNA PCR in the syndrome-driven diagnosis of infectious diseases. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2015 Mar;34(3):561-70.

Données du PHRC PIRLA (F. Laurent/AM Freydiere)

•Approche syndromique : kit IOA incluant culture et PCR universelle et PCR spécifiques (7)

183 patients – 55% de positifs – 101 bactéries

détectées

Proposition d’un algorithme diagnostic

Anne-Marie FREYDIERE, Nicolas VERNET, Amélie EPERCIEUX, Guillaume MACCIO, Solenne MARION, Ghislaine DESCOURS, Yvonne BENITO, Kariman ABELIN-GENEVOIS, Alice FASSIER, Bruno DOHIN, Eric PIATON, François VANDENESCH, SandrineBOISSET, Anne CARRICAJO, Frédéric LAURENT - PHRC PIRLA : épidémiologie et algorithme diagnostique décisionnel des infections ostéo-articulaires primitives en pédiatrie sur une série de 191 patients – RICAI 2014

Objectifs et contexte

•Place de la PCR16S dans le diagnostic des IOA adultes

•264 cas suspects d’IOA et 35 témoins

•5 prélèvements par patients (poudriers à billes)

•Culture et PCR16S

Résultats

•215/264 cas d’IOA confirmés

•192 cas d’IOA documentée dont 163 cas d’IOA monomicrobienne:

•Staphylocoques: 63 S. aureus/45 S. non aureus (108/192)

•Stretocoques/Entérocoques : (S. agalactiae+) 22/192

•BGN 16/192

•Anaérobies (P. acnes) 13/192

•PCR 16S + : 151/215

•143 avec documentation bactériologique par culture

•8 sans documentation

•Cas des infections poly microbiennes: 1 seule bactérie le + souvent

Conclusions

•Manque de sensibilité de la PCR16S

•A utiliser lorsque la culture est négative (technique de recours)

Evaluation of 16S rRNA Gene PCR Sensitivity and Specificity for Diagnosis of Prosthetic Joint Infection: a Prospective Multicenter Cross-Sectional Study - Pascale Bémer Chloé Plouzeau, Didier Tande, Julie Léger, Bruno Giraudeau, Anne Sophie Valentin, Anne Jolivet-Gougeon, Pascal Vincent, Stéphane Corvec, Sophie Gibaud, Marie Emmanuelle Juvin, Genevieve Héry-Arnaud,c Carole Lemarié, Marie Kempf, Laurent Bret, Roland Quentin,e Carine Coffre, Gonzague de Pinieux, Louis Bernard,Christophe Burucoa,the Centre de Référence des Infections Ostéo-articulaires du Grand Ouest (CRIOGO) Study Team J Clin Microbiol. 2014 Oct;52(10):3583-9.

Association des ICT et en cas de discordance, de la PCR Xpert

Evolution prochaine de l’algorithme au profit:

• Première intention : PCR spécifique

• Et si positive: tests ICT de détection des toxines A/B

• Différentiation des porteurs sains.

Jones G, Taright N, Boelle PY, Marty J, Lalande V, Eckert C, Barbut F. Accuracy of ICD-10 codes for surveillance of Clostridium difficile infections, France. Emerg Infect Dis. 2012 Jun;18(6):979-81.

Résultats en moins de 2 heures

•Biofire FilmArray

•Adaptation au « coup » par « coup » (petits nombresd’échantillons)

•Totalement automatisé : réalisable 24/7 par dupersonnel non spécialisé

•Parfaitement compatible avec une approche de« dépistage » par TMM avant mise en culture pour labactériologie

•Prescription limitée car cout +++

Résultats dans la journée (3-6 heures)

•BD Max

•Approche séquentielle : bactérie, virus, parasite

•Coup/coup ou petite série (24 echantillons maxi)

•Totalement automatisé : réalisable 24/7 par du personnel non spécialisé

•Panel + limité mais cout limité

•Compatible avec une approche de « dépistage » par TMM avant mise en culture pour la bactériologie

Résultats à J+1

•Extraction automatisée à J0 ou J+1 suivant l’heure d’arrivée de selles

•PCR réalisées en série

•Deux type de trousses utilisables

•Trousses multiplexées à 10-20 cibles différenttes

•Combinaison de trousses de PCR multipàlexées à 4-5 cibles: Cumuls de 6 PCR multiplex

•Nécessité de personnel qualifié en biologie moléculaire

•Approche séquentielle « Bactériologie/Virologie/Parasitiologie » possible

•Cout réactifs limités mais cout « technicien » +++

Association des outils

• Antibiogramme

• Test phénotypique: RAPIDEC/Carba NP test

• Test moléculaire de détection des gènes codant les carbapénémases

Algorithme en vigueur au sein du CHU de Lyon

• Si Entérobactérie I/R à l’ertapénème : réaliser un test phénotypique de détection de la résistance aux carbapénèmes

• Si test Phénotypique positif: réaliser un test moléculaire automatisé de détection des gènes codant les carbapénèmases: OXA/VIM/KPC/NDM

Connaître les performances de chaque technique

• Limite de détection, sensibilité et spécificité, indications

• Degré d’urgence clinique

• La PCR n’est pas forcément la technique la plus sensible !

Intégrer les méthodes de biologie moléculaire (BM) dans un algorithme diagnostique

Evaluer les kits commercialisés

Association

• Techniques « maison » & kits commerciaux

• Kits « clés en main » & kits conventionnels

Faux positifs

•Pas de différenciation contaminant / pathogène

•N’est pas toujours le témoin d’une infection active

Faux négatifs

•Un résultat négatif n’exclut pas un diagnostic

•Cas avec culture + (rares colonies) / PCR –

PCR ≠ méthode de vérification d’un

résultat de culture douteux