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Rle de la clustrine dans la neuroprotection Matre de Stage : Y.Charnay Collaborateurs : C.Bourras, E.Kovari, P.Vallet, M.Mailov Mots Cls : Clustrine, Neuroprotection, Ischmie crbrale, Accidents cardiaux vasculaires, Maladie dAlzheimer, Pichia Pastoris. Techniques : Electrophorse, Western Blot, Immunohistochimie (HRP), PCR, Dialyse, Purification, invalidation d'un gne (K.O). Reprsentation schmatique de la structure de la clustrine humaine. En haut, le prcurseur contenant une squence signal (magenta) ainsi que les rsidus qui formeront les chanes (orange) et (bleu clair). En bas, les chanes et assembles antiparalllement et formant un htrodimre. Il y a des rgions riches en cystine (rouge). Ainsi que 2 rgions Hlices coiled-coil (vert) et 3 rgions amphipatiques (bleu fonc). Introduction : De nombreuses tudes ont mis en vidence le rle central de la clustrine dans la protection contre la mort cellulaire neuronale. Le but de ce stage, essentiellement bas sur lapprentissage des techniques de laboratoire, est de continuer la production de souris knock-out (Clu - / - ) et de visualiser les effets de cette transformation gntique. En outre, lautre aspect du stage concerne la production de clustrine et sa purification.. A plus long terme le but est dinjecter de la clustrine afin de combler le dficit. A partir de lARN de souris et aprs RT- PCR, nous allons insrer lADN de la clustrine dans un plasmide sous la dpendance du promoteur AOX1 (activ par le mthanol) et en prsence de l-factor (permet lexpression de la clustrine hors de la levure). Ce plasmide contient aussi une rsistance la Blasticidine. Afin damplifier notre vecteur nous le transfrons dans Pichia Pastoris. Cette levure peut produire la clustrine directement dans le milieu de culture. Aprs avoir laiss pousser pendant quelques jours nos levures modifies dans le milieu de culture, nous les remettons dans un milieu neuf mais nous remplaons le glycrol ( source de carbone) par du mthanol. Ceci induit la production de clustrine. On obtient 2.8 mg de clustrine. A partir du srum, on peut lire le gnotype sur les gels PAGE alors qu partir du sang complet et aprs PCR la clustrine nest pas amplifie. Il ny a pas de signe objectif ou comportemental qui nous permettrait de distinguer les souris WT des Clu - / -. On leur posera donc des inductances sous cutanes qui nous permettrons de les diffrencier. A plus long terme, le but de ces travaux est dinjecter la clustrine sur des souris ayant subit une ischmie crbrale et den observer les effets. Les accidents cardiaux vasculaires (1 800 000 par an) et la maladie dAlzheimer (800 000 cas en France) sont les pathologies o la clustrine pourra agir efficacement. R.SAINZ Mai - Juin 2005 Seule la clustrine va rester fixe la colonne. Ceci est d laffinit de lhistidine envers les ions nickel prsent sur la colonne. Grce un dosage colorimtrique (BCA), on slectionne les tubes o la densit optique est la meilleure. On ralise une dialyse afin de parfaire la purification.