BIOCHIMIE, 1973, 55, 1047-1056.

Sdparation et purification de la D-lactico-ddshydrogdnase et de la glucose-6-phosphate ddshydrogdnase de Leuconostoc lactis

Etude de quelques propridtds.

Mirei l le HONTEBEYRIE et F r a n c i s G>.ssEn.

Service de Physiologie CeIIulaire, Inst i tut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75015 Paris.

(13-4-1973).

Summary. - - The NAD dependent D-lactic acid dehydrogenase and the NAD(P) dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc laclis have been purified irom the same crude extact by chromatography on hydroxyapatite. The two enzymes ~vere the~l separately purified unti l obtention of fractions producing a single band of protein in polyacrylamide gel electroph:oresis and a single line of precipitation by immu- aoelectrophoresis. The main properties of the two enzymes 'were studied and compared to the properties of isofunctionnal enzymes of other lactic acid bacteria. The D-lactic acid dehydrogenase of Leuconostoc lactis shows the same physical and kinetic properties than the Lactobacillus enzymes. These properties are quite different from those of other known bacterial D-lactic acid dehydrogenases.

INTRODUCTION.

Les bac t6r ies lac.tiques (Genres Streptococcus, Lactobaciltus, et Leuconostoc) cons t i t uen t un vaste g roupe de m i c r o o r g a n i s m e s don t Ia t eneur en g u a n i n e A- cy tos ine du n o y a u s '6 tend de 34 h 53 p. cent. Malgr6 cet i nd i ce d 'une large d ive rgence 6vol:ative, i l a 6t6 poss ib le d '6 tab l i r des r e l a t ions p h y l o g 6 n i q u e s en t re les espbces de ce groupe en c o m p a r a n t les ca rac t6 r i s t i ques c in6 t iqnes et sur- tout s t ruc tu ra l e s de ce r t a ins de i eurs enzymes i so fonc t i onne l s : 1 'enzyme m a l i q u e chez Strepto- coccus faecalis et Lactobacillus casei [1], les D et L l ac t i co -d6shydrog6nases NAD-d6pendan tes (LDH) chez 1 'ensemble des esp6ces de Lactoba- cillus [2, 3~.

Quat re D-LDH (E.G. 1.1.1.28) et deux L-LDH (E.G. 1.1.1.27) ont 6t6 p r 6 c 6 d e m m e n t isol6es et pur i f i6es de d i f f6rentes espbces de Lactobacillus et 1curs p ropr i6 t6s fonc t ionne l l e s compar6es [2]. Les an t i s6 rums obtenus cont re les D-LDH pures de Lactobacillus ]ensenii, L. leichmanii et L. [ermenti ont p e r m i s de d 6 t e r m i n e r des g roupes de souches don t les D-LDH poss6den t une sp6cifici t6 i m m u n o - logique iden t ique . Chaque groupe de sp6cif ici t6 iden,tique r a s semble les m6mes souches quel le que soi t la D-LDH p u r e ut i l is6e comme immunogbne . Ces g roupes d o n n e n t en t re eux des r6ac t ions crois6es d ' iden t i t6 par t i e l l e . La syn th6se des donn6es ana ly t iques fourn ies p a r Ies r6ac t ions crois6es de chacun des t rois an t i s6 rums a p e r m i s d '6 tab l i r une car te des re la t ions an t ig6n iques

ac tuel les de ces e n z y m e s i so fonc t ionne l s i n d i q u a n t la p r o x i m i t 6 re la t ive de leur o r ig ine p h y l o g 6 n i q u e r e spec t ive [3].

Un an t i s6 rum ob tenu con t re une p ro t6 ine iso- fonc t ionne l l e d i f f6rente - - la L- lac t ico-d6shydro- g6nase - - a fou rn i des groupes de sp6cif ici t4 iden- t ique supe rposab le s ~ eeux obtenus avec les s6- rums ant i -D-LDH. Ceci sugg6ra i t une sp6eifici t6 p ro t6 ique p r o p r e h c h a c u n de ces g roupes de souches .

C e p e n d a n t c h a c u n de ces d i f f6rents enzymes avai t 6t6 isol6 d 'esp~ces diff6rentes . I1 6tait donc n6cessa i re de s ' a s su re r que les groupes de sp6ci- ficit6 idenf ique d6 te rmin~s p o u r un enzyme 6ta ient supe rposab le s h ceux dus h un au t re enzyme isol6, cette fois, du m~me m i c r o o r g a n i s m e .

La D- lac t i co -d6shydrog6nase NAD-d6pendan te (E.G. 1.1.1.28) de Leuconostoe a 6t6 chois ie en r a i son de ses r6ac t ions crois6es avec d ivers s6rums an t i -D-LDH de Lac lobac i l l u s : i l 6tait souha i tab le , d 'une par t , de p r6c i se r ees r6ac t ions crois6es, d ' au t re par t , de c o m p a r e r les donn6es fonc t ionne l l e s en t re ces enzymes i so fonc t i onne l s homologues . Le second enzyme chois i , la glucose- 6 -phospha te d 6 s h y d r o g 6 n a s e (E.C. 1.1.1.49) NAD- NADP d6pendan te , est un enzyme p r o p r e ~ la voie h 6 t 6 r o f e r m e n i a i r e des bac t6r ies lac t iques ; il est donc poss ib le qu ' i l ai t suivi une 6volut ion diff6- ren te de la D-LDH, enzyme qui fa i t pa r t i e d 'une voie ca tabo l ique c o m m u n e h tous les Leuconostoc et ~ t o u s l e s Lactobacillus qu' iIs soient h o m o ou h6 t6 ro fe rmen ta i r e s .

1048 M. Hontebegrie et F. Gasser.

Ce m6moire pr6sente la s6parat ion et la puri- fication de ces deux enzymes et l '6tude de leurs propri6t6s comparables h celles des enzymes iso- fonct ionnels dans le groupe des bact~.ries lacti- ques. Les r6su~tats immun,(~Iogiques feront l 'objet d 'un p rocha in article.

MATERIEL ET METHODES.

Souche bactdriemze et mdthode de culture.

Leuconostoc lactis NCDO 546 (National Collec- t ion of Dairy Organisms, Reading, Angleterre) a 6t~ cultiv6 sur le mil ieu suivant :

Tryp tone Difco, 5 g ; Extra i t de levnre Difco, 5 g ; MgSO 4, 7 H,O, 200 m g ; MnSOt, H20 , 50 m g ; HK2PO,~, 2 g ; H2KPO4, 1,6 g ; eau distill6e, 1 000 m.I. Aprbs st6ri l isat ion h 120°C pendan t 20 minutes, le pH du mil ieu est de 6,5. Au moment de la culture, on ajoute 15 g/1 de glucose st6rile.

Les cultures son,t effectu6es h 30°C, en a6robiose, en fermenteur (Biolafitte, Maisons-Laffitte) de 15 litres ensemenc~ avec 500 ml d 'une pr6-culture agit6e pendan t 18 heures dans une fiole Fe rnbach de 2 litres. L,e d6bit d 'a i r du fermenteur est r6gl6 h 500 ml /mn/1 et l 'agi tat ion h 600 t / ran. Cinq fer- men/curs out permis de r6colter 150 g de bact6ries (poids humide) reeueil l ies en fin de phase expo- nentiel le d.e croissant:e, par eentr i fugat ion conti- nue. Ce stock est conserv6 h --25°C.

Prdparation de l'extrait brut.

T'outes les operat ions de prepara t ion de l 'extrai t brut et de purif icat ion de l 'enzyme soar effeetu6es ~4°C.

Les cellules bact6r iennes lav6es en tampon phosphate (Na~-K) 5.10 -2 M, pH 7, sont raises en suspension dans ce m~me tampon ~ raison de 100 rng/mt et d6sint6gr6es par l 'aat ion des ultra- sons (Branson Sonifier type B 12) pendan t 20 h 30 minutes. L 'extrai t est d6barrass6 des d6bris cell ulaires par eentrifu.~ation h 31 000 g pendan t 20 minutes.

Dosages enzgmatiques.

Les activit6s enzymatiques sont mesur~es 30°C, avec un spectrophotom~tre Zeiss PMQ I I e n suivant h 340 nm la var ia t ion d 'absorpt ion due au NADH ON au NADPH dans les mbtanges suivants :

D-Laetieo-d6shydrog6nase :

Pendant la pur i f ica t ion : D(-) lactate, 100 mM ; NAD, 2 mM ; Tris-HC1, pH 8, 16 mM.

Ce dosage est u~tilis6 tout au long de Ia puri- fication car de nombreuses bactdries lactiques poss~dent une L-LDH.

Pour l '6tude des propri6t6s : Pyruvate (sel de Na), 20 raM; NADH, 0,2 mM; Tris-HC,1, pH 7,6, 16 raM.

C.ette r6action directe seule permet d'6tre dans des condi t ions de saturat ion en substrats.

- - Glucose-6-phosphate d6shydrog6nase (G-6-P- D H ) : Glucose-6-phosphate (sel disodique) 10. mM; NAD ou NADP, 0,2 mM ; Tris-HC1, pH 8, 14,4 mM; MgCI:, 2,4 raM.

Une unit6 d 'aet ivi t6 enzymat ique correspond h la r6duct ion d 'une micromole de NAD ou de NADP par minute ou h l 'oxydat ion d 'une micro- mole de NADH par minute, dans Ies condi t ions du dosage. L'activit6 sp6cifique repr6sente I 'activit6 par mg de prot6ine.

Dosages des protdines.

Les prot6ines out 6t6 do s6es duns les 6tapes ini t ia les et finales de la purif icat ion par la m6- rhode d,e Lowry [4]. Duns les 61apes intermS- di,aires, apr/ts 6t iminat ion des aeides nucl6iques la concent ra t ion en prot6ines a 6t6 estim6e scion l '6quation de Warburg et Chris t ian [5] :

(D.O.2so 11m × 1,5) - - (D.O.26 onm × 0,75) := mg de pro t6ines par ml.

Chromatographies.

a) Hydroxyapat i te .

L 'hydroxyapa t i t e (Biogel HTP) est mis en suspension et 6qui.libr6 duns dtt t ampon phospha te (Na.2-K) 2.10 -2 M, pH 7, contenant 10-3 M de dithio- thr6itol pu,is plac6 d~ans une colonne Pha rmac ia (5 cm X 60 era). L'61utio.n est effectu6e par passages successifs de tampons phosphate , pH 7 ( + di thiothr6i tol) de molar i t6 croissante : 2 puts 3, 6 et 9.10 -2 M. Le volume de chaque tampon est d6termin6 par le profii d 'absorpt ion, h 280 nm, de l'61ua.t enregistr6, sur Elugraph Seive.

b) DEAE-cellulose.

La DEAE, cellutose en pou.dre (Cellex D) est activ6e en suivant la m6thode d4crite par Peter - son et Sober [6] puts 6quilibr6e dans le tampon Tris-HCl 2.10 _2 M, pH 7,2 + di th iothr6i to l 10-.~ M 4- EDTA 10-3 ~ . La suspension est plac6e clans une colonne Pha rmac ia (2,5 em X 45 era) ; l'61u- t ion est effectu6e par un gradien,t d iscont inu de NaC1 dans le mSme tampon.

Electrophor~ses.

a) EIeetrophorbse analyt ique en gel de po.Iy- acrylamide.

Les 61ectrophor6ses analyt iques en gel de poly- acry lamide sont faites selo,n les i n d i c a t i o n s pro-

BIOCHIMIE, 1 9 7 3 , 5 5 , n ° 9 .

D d s h y d r o g d n a s e s de L e u c o n o s t o c lac t is . 1049

pos6es par Davis [7], avec un appareiI Polyanalys t Buchler, h pH 8,9. Les tubes pour le contrTle de la puret6 des enzymes sont charg6s avec 120 h 200 l~g de p ro t6 ines ; ils seront color6s par le coomassie blue suivant la m6thode de Chrambach et col. [8]. Les tubes destin6s h ]a local isat ion de l 'activit6 enzymat ique con.tiennent 0,05 unit6 d 'enzyme ; cette activit6 est r6v616e par la m6- rhode de Fine et Cos te]lo modifi6e [9] en pr6sence de :

- - pour la D-LDH : D-lactate, 100 mM ; NAD, 0,6 mM; nitro-bleu-t6trazolium, 0,5 raM; ph6na- zinc m6thosutfate, 0,1 mM darts du tampon Tris- HC1, pH 8, 17,5 mM pour un volume final de 4 ml.

pour la G-6-P-DH : le D-lactate est remplac6 par du glucose-6-phosphate, 0,1 mM et le coen- zyme est soit NAD, soit NADP, 0,6 raM.

Les r6actions sont arr6t6es par addi t ion d 'acide ac6tique h 7 p. cent.

b) Electrophorbse pr6parat ive.

Elle est r6alis6e dans un apparei l E.C. Appara- tus (E.C. Apparatus Corporat ion, Phi4adelphia) d6- cr i t or ig inel lement par Raymond [10], selon la m6thode de Jack London (communica ton person- nelle). Le gel de s6parat ion cont ient 7 p. cent de Cyanogum 41 (Gelling Agent-E.C. Apparatus Cor- porat ion) en tampon Tris-HC1, pH 8,9 tandis que le gel de concen,tration est h 4 p. cent de Cyano- gum en tampon Tris-phosphate, pH 6,7. Le tam- pon d'61ectropborbse est du tampon Tris-glycine, pH 8,4.

Dans le but d'61iminer le persulfate d 'ammo- n ium et de d iminuer le d6gagement de chaIeur, une pr6-61ectrophor6se, sans prot~ine, est effec- tn6e pendan t environ 9 heures. Elle permet, pour un voltage eonstan,t de 120 V, de ramener l 'amp6- rage de 120 ~ 50 mA. L'6,chantillon (9 mg de pro- t6ines) addi t ionn6 de saccharose cristallis6 et de hleu de b romoph6nol en po.udre (marqueur de migrat ion) , peut alors 6tre d6pos6 dans la ra inure du gel de concent ra t ion et soumis ~ l '61eetropho- r~se pendan t 16 heures, sous un voltage constant de 120 V. Une bande longi tudinale d6coup6e sur un c6t6 du gel permet de localiser l 'enzyme par co lora t ion sp6cifique. La ban.de t ransversale cor- respondante eonten~ant l 'enzyme est d6coup6e et broy6e au mort ier h froid, puts plac6e au cong6- lateur h - -30°C pendan t c inq heures. On ajoute alors 5 ml de tampon Tris-HC1, pH 7,2 + EDTA 10 -8 M ; apr6s quelques minutes de d6cong61ation et broyage h la baguette de verre, o.n Iaisse en contact 1 h 30 h 0°C. Aprbs centr i fugat ion 35 000 g pendan t 20 minutes, on recueil le le sur- nageant qui cont ient l 'activit6 enzymatique.

D~termination de Ia masse moldcuIaire de la D-LDH.

La masse mo16culaire a 6t6 dTtermin6e par f i l t rat ion sur Sephadex G-200 (colonne Pharma- cia : 0,9 cm × 60 cm) en tampon Tris-HC1 2.10 -2 M, pH 7,2 + NaC1 0,I M. Les marqueurs utilis6s s o n t : Ie cy tochrome C (12 400), la phos- phatase alcal ine d'E. colt (80 000), la L-LDtt de eoeur de bceuf (140 000) et la ferr i t ine (marqueur d 'exclusion).

La m6thode d'61ectrophorbse en gel de paly- acrylamide-SDS de Shapiro, VifiueIa et Maizel a 6galement 6t6 utilis6e [11]. La courbe de r6f6- rence a 6t6 6tablie avec les marqueurs suivants : le Iysozyme (13 800), la t ryps ine (24 500), Ia pep- sine (37 500), l 'ovalbumine (46 500), la s6rum albu- mine bovine (62 000 pour le monombxe), la L-LDH de cceur de bceuf (140 000 pour le t6trambre). Les gels cont iennent 5 p. cent de po lyacry lamide ; le courant est de 8 mA par tube.

Materiel.

Le sulfate d ' ammonium (Specia Grade Enzyme) est un produi t Schwarz/Mann. Le di th iothr6i to l (r6actif de Cleland) a 6t6 fourni par Calbiochem ainsi qne le D (-) lactate, le pyruvate et le glucose- 6-phosphate. Les coenzymes p rov iennen t de chez Sigma. L 'hydroxyapa t i t e (Biogel HTP) et la DEAE- cellulose (Cellex D) sont fournis pa r Bio-Rad. L 'acry lamide , le b i sacry lamide et le N, N, N', N', t6tramTthylbne-diamine (Temed) sont des produi ts Eastman Organic Chemicals Kodak.

BESULTATS.

Sdparation des deux enzymes (tableau I).

Apr6s dialyse de l 'extrai t brut contre du tampon phosphate 1,6.10 -3 M, les acides nueI6iques sont pr6cipit6s par Ie sulfate de s t rep tomycine en suivant la m6thode d 'Oxcnburgh et Snoswell [12_]. Apr6s eentr i fugat ion le r appor t des absorpt ions 280 nm

du surnagean~ augmente de 0,46 ~t 0,63 ; 260 nm il sera notablement accru apr6s la dialyse de l '6tape suivante.

La concent ra t ion en tampon phosphate du sur- nageant est port6e fi 2.10 -2 M, et du di thiothr6i tol , n6cessaire h la stabilit6 de la D-LDH, est ajout6 la concent ra t ion de 10 -a M. Les prot6ines sont pr6cipit6es pa r addi t ion de sulfate d ' ammonimn solide jusqu'fi 95 p. cent de saturat ion. Le cuIot dissous dans un volume min imum est dialys6 contre du tampon phosphate 2.10 _2 M, p i t 7 + di th iothr6i to l 10 -a M, et appliqu6 sur une colonne

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 9.

1050 M. Hontebegrie el F. Gasser.

d ' h y d r o x y a p a t i t e (Voi r ~ O h o d e s ) . Cel le-c i ne r e t i e n t pas la D-LDH, 61ude a v e c le t a m p o n p h o s -

p h a t e 3.10 -2 M, t a n d i s que la G-6-P-DH n ' e s t 6lu6e qu 'h la c o n c e n t r a t i o n de 9.10-2 M (f igure 1).

Puri f ica t ion de la D-lact ico-ddshgdrogdnase.

L'61uat de la c o l o n n e d ' h y d r o x y a p a t i t e c o n t e - n a n t la D - L D H a 6t6 d iv i s6 en d e u x f r a c t i o n s se lon

l e u r a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e :

HA D1 : t ubes 74 h 78, d ' a c t i v i t 6 sp6c i f i que m o y e n n e 112.

HA D 2 : t ubes 66-73 et 79-85, d ' a c t i v i t 6 sp6ci -

f ique I n o y e n n e 71.

Ces d e u x f r a c t i o n s s o n t i n d b p e n d a m m e n t p r 6 c i -

p i t 6e s p a r a d d i t i o n de su l f a t e d ' a m m o n i u m j u s q u ' h

Un/ml ProtOnes mg/ml / D. LDH G6PDH ¢~"

~5o. 5 l ~ = g

i~ll ¢x

r l g

'° / i l o,o .... 1 0 , 0 6

r - / I o,o o ~o , o o 35o +60 ~oo ~ o

Fractions Fro. 1. - - Chromatographie sur hydroxyapatite :

profil d'dlution avec tampons phosphate Na:~i, pH 7, de molaritds croissantes, additionn~s de dithiothrditot lO-s M.

D6bit : 120 m I / h ; f rac t ions : 10 ml. Prot6ines m g / m l .

- - - - D-LDH. ............ G-6-P-DH.

FI6. 2. - - Electrophor~se analytique en gel de poly- acrglamide, pH 8,9, des f~'actions fl activild D-LDH provenant de l'dlution des colonnes de DEAE-Cellulose.

A et B : Colorat ion des prot6ines sur f ract ions C DI et C DII (200 ~g).

C : R6vdlation de l 'activit6 D-LDH sur f rac t ion C DI (0,05 unit6 d'activit6).

95 p. c e n t de s a t u r a t i o n . Apr6s c e n t r i f u g a t i o n , les cu lo t s s o n t r e p r i s d a n s tin v o l u m e m i n i m u m de

t a m p o i l Tr is-HC~ 2.10 -2 M, p H 7,2 c o n t e n a n t d i t h i o - t h r 6 i t o l 10-~ M et E D T A 10 -3 M p u t s d i a l y s 6 s

c o n t r e le t a m p o n . La s o l u t i o n est p l a c 6 e s u r u n e

TABLEAU I.

S@ara l ion et pur i f i ca t ion de la D-lacl ieo-ddshydrogdnase et de Ia glucose-6-phosphate d~shgdrog~nase de Leuconos toc lactis.

Etapes

Ext ra i t brut . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Surnageant apr~s pr6cipitation par Streptomycine . . . . . . . . . . . . . Dialysat apr~s precipitation totale au (NH~)~ SO~ . . . . . . . . . . . . . . . . . i

Hydroxyapa t i t e

HA D1 . . . . . . . . . HA D2 . . . . . . . . .

HA G1 . . . . . . . . . . . . . . . . . HA G2 . . . . . . . . . . . . . . . . .

DEAE-Cellulose HA D1 - - ) , - C DI . . .

C DII . . . HA D2 ~ C D I I I . . .

HA G1 - - ~ - C G I . . . . HA G2 _ _ ~ C GII . . . . ,

~80

260

0,46

0,63

1,16

1,85 1,6 1,5 1,4

1,85 ,7 ,8

1,87 1,8

V" Prot6i- Unit6s O t t l I D e [ n e s

total Itotales totales ml mg D-LDH

1.730 111.237 26.746

2.100

242

10 18 81 98

2,8 5,6

26

18 8

2.677

2.646

4 0 , 5 i 152,5 164 224

6,9 21,8 16 27 15,6

!6 880

~6 504

4 560 0 944

1 635 4 972 2 038

Activit6 sp~cifique

O-LDn !

2,38

10

10

112,5 71,5

235 227 126,6

Unit6s Reudement [ G-6-I Activit6

D-LDIt totales i sp6cifique G-6-P-DH __P-DH

100 p. cent/29.520 [ 2,63

100 p. cent

98 p. cent:

58 cent p.

t 32 cent p.

26.200

26.030

- I

13.500 7.840

m

8.300 4.410

9,8

9,8

82,3 35

307 282,6

Rendement G-6-P-DH

100 p. cent

90 p. cent

88 p. cent

72 p. cent

43 p. cent

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 9.

D d s h y d r o g d n a s e s de L e u c o n o s t o c l a c t i s . 1051

co lonne de DEAE-ceHulose et l '61ution pra t iqu6e , en c inq 6tapes, p a r un g r a d i e n t d i s c o n t i n u de NaC1 de 0,14 h 0,30 M. La D-LDH est 61u6e h une c o n c e n t r a t i o n de 0,26 M de NaCl.

Le pool HA D1 fourn i t a ins i un p ic d ' aOiv i t6 C DI dont seuls les tubes p r6sen tan t la me i l l eu re act ivi t6 sp6cif ique ont ~t6 gard6s. Le pool HA D2 fou rn i t deux f r ac t ions C DII et C DIII pr61ev6es sur le m6me pic d'61ution mats p r6 sen t an t des act ivi t6s sp6cif iques in6gales (vo l t tableau I).

La pure t6 des f r ac t ions C DI, C DII et C DIII a 6t6 contr616e p a r 61ectrophor6se en gel de poly- a c r y l a m i d e (figure 2). Seule Ia f r ac t ion C DI mon t r e une seule bande de p ro t6 ine co lor6e p a r le coomass ie blue et c o r r e s p o n d a n t h l ' ac t iv i t6 enzymat ique .

Puri f i ca t ion de la glucose-6-phosphate d~shg- drogdnase.

L'ensembte des f r ac t ions ac t ives ob tenues p a r 61ution de la co lonne d ' h y d r o x y a p a t i t e a 6t6 r a s sembl6 en deux pools d 'aprbs leur act ivi t6 sp6- cifiqne :

HA GI : tubes 484 h 536, d 'ae t iv i t6 sp6cif ique m o y e n n e 82 ;

HA G2 : tubes 468-483 et 537-550, d 'ac t iv i t6 sp6- cifique m o y e n n e 35.

D-LDH. Apr6s d6cong61ation, ces pools sont dia- lys6s cont re du t a m p o n Tris-HC1 2.!0 _2 M, p H 7,2 c o n t e n a n t EDTA 10 -~ M e t plac6s sur co lonne de DEAE-cel lu lose 6qui l ibr6e dans le m6me tampon . L'@lution est effectu6e p a r un g r a d i e n t d i s c o n t i n u de NaG1 de 0,10 ~ 0,20 M. La g lucose-6-phospha te d6shydrog6nase est 61u4e h 0,18 M de NaC1.

15'

10

LV(Un./ml)

.a)

/ ! / \

l l , ,

6 7 8 9 pH

3 LV(Un./ml)

B)

2

I

5

6 /\°, / \ .° \ ,

I' \ # ,/

/ I / i I i i _

6 7 8 9 I0 pH

Fro. 4. - - Variation de l'activitd de la D-LDH en fonction du pH.

A - - Activit6 mesur~e dans ~e sens pyruvate )~ lactate.

B - - Activit6 mesur@e dans le sens lactate pyruvate. e - - • tris-mal6ate 5.10-2 M, pH 5,2 /t 7,6. A ~ tris-HC1 2.10-2 M, pH 7,2 h 9,1. [] [] glycine-NaOH 2.10-2 M, pH 8,6 /t 10,2.

FiG. 3 . - Electrophor~se ana lytique en gel de poIy- acrylamide, pH 8,9, des fractions a actioitd G-6-P-DH prooenant d e l'dlution des colonnes de DEAE-CeIlu- lose.

A et B : Coloration des prot6ines sur fractions G D1 et G II (180 !~g).

C: : R6vdlation de l'activit6 G-6-P-DH sur fraction G DI (0,05 unit@ d'activit6).

Chaque poo.1 est c o n c e n t r 6 sur m e m b r a n e PM 10 (Diaflo, Amicon) et conserv6 h - - 3 0 ° C (sans per te d 'ac t iv i t6 sp6cif ique) p e n d a n t l a pu r i f i ca t ion de la

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 9.

Le pool HA G1 a a ins i f ou rn i un p ic C GI et !e pool HA G2 un p ic C GII (Voir t ab leau I) don[ l '61ectrophorbse en gel de p o l y a c r y l a m i d e a mont r6 qu ' i ls 6talent , I 'un et I 'autre, const i tu6s d ' u n e bande p r i n c i p a l e c o r r e s p o n d a n t h l ' ac t iv i t6 enzyma t ique et de p lus i eu r s bandes m i n e u r e s de p ro t6 ines con t aminan te s . Ces dern i~res bandes n 'on t pu 6tre 61imin6es ni p a r f i l t ra t ion snr G-100 ou G-200, ni sur QAE Sephadex , ni pa r p r6c ip i - t a t ion f rac t ionn6e au sulfate d ' a m m o n i u m .

Cependan, t la d i spos i t i on des bandes de pro- t6ines (figure 3) sur gel ana ly t i que au to r i sa i t h pra- t i que r une 6 lec t rophorbse p r 6 p a r a t i v e su r gel d ' a c r y l a m i d e . Les bandes c o n t a m i n a n t e s ont pu 6tre 61imin6es ; elIes ne r ep r6sen t en t p robab le - men t qu 'une f r ac t ion p o n d d r a l e m i n i m e car cette 6tape de la pu r i f i ca t ion n ' e n t r a i n e qu 'un accroisse- m e n t tr~s faible de l ' ac t iv i t6 sp6cif ique (de 307 5

320).

Elude de quelques propridt~s de la D-LDH.

1 - - pH OPTIMUM.

La va r i a t i on de l 'activ£t6 de la D-LDH en fonc- l ion du pH a 6t6 6tudi6e clans d i f f6rents t ampons , dans les deux sens de la r6ac t ion ( f i~l re 4).

1052 M . H o n t e b e g r i e e t F . G a s s e r .

Le p H o p t i m u m est de 7,6 p o u r la r 6 a c t i o n d ' o x y d a t i o n d u N A D H , de 8 p o u r la r 6 a c t i o n de r 6 d u c t i o n d u NAD.

2 - - C I N I ~ T I Q U E S .

L ' 6 t u d e de la v i t e s s e de la r 6 a e t i o n e n z y m a t i q u e en f o n c t i o n des c o n c e n t r a t i o n s en s u b s t r a t s p r6 - s e n t e u n e c i n 6 t i q u e m i c h a e l i e n n e . E n p r 6 s e n c e de

Les g r a p b i q u e s en co o r d o n n 6 e s de L i n e - w e a v e r et B u r k [13] on t 6t6 t r ac6s p o u r d i f f 6 r e n t e s c o n c e n t r a t i o n s d u s e c o n d s u b s t r a t : p a r e x e m p l e ,

1 1 VNAD en f o n c t i o n d e (NAD), p o u r d i f f 6 r e n t e s

c o n c e n t r a t i o n s d u s e c o n d s u b s t r a t - - le D - l a c t a t e - - ( F i g u r e 5a). Les i n t e r s e c t i o n s a v e c l ' axe des o r d o n n 6 e s des d r o i t e s o b t e n u e s p o u r d i f f 6 r e n t e s

a)

10

5

Z

~ -~' 10 2 lx mote-I/ran / /

1 I0 210 310

~ 10 2 mole -1

b)

2

Km Ioctme

Intersections VN'~O × 102 !a moleJ / mn

i 1 4 r - "

Vm

2O 1 ~<mole_l

B~o~el

Fro. 5. - - a) Reprdsentat ion, en coordonn6es de Linetweaver et Bur]c, des vi tesses ini t iales en fone t ion de la concentrat ion de NAD, pour d i f fdrentes concentrat ions de D-lactate : A A : D-lactate : [2.10-1 M]. 0 - - ( 3 : D- l ac t a t e : [10-1 M]. B - - [ ] : D - l a c t a t e : [8.10-2 M]. × - - × : D- l ac t a t e : [5.10-2 M].

1 b) Graphique secondaire des interact ions ~ r - ~ en fonc t ion des d i f f~rentes concentrat ions de D-lactate.

D- lac t a t e , on o b s e r v e u n e i n h i b i t i o n p a r exc6s de s u b s t r a t .

octivite r~siduelle I 0 0 log octivite initiole x

°'~° \

I I t =

0 10 2 0 3 0 Temps en minutes

Fro. 6. - - Reprdsen la t ion du pourcentage d ' inact iua- l ion de la D-LDH en fone t ion du temps de chauf fage soi t h 37°C soi t a ~2°C, en presence ou absence de subs tra t . A - - A : h 37°C sans addi t ion. • • : & 42°C sans addi t ion. (3 © : h 42°C q- D-lactate [10-2 M]. [] [] : h 42°C + NAD [5.10-4M].

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 9.

con, e e n t r a t i o n s de D - l a c t a t e s o n t e n s u i t e r e p o r t 6 e s s u r u n g r a p h i q u e s e c o n d a i r e :

1 1 l ' i n t e r s e c t i o n -- f d o n ~ e a i n s i

VNA D (D- lac ta te ) ]es K m et V m a x po,ur le s e c o n d s u b s t r a t - - - le D - l a c t a t e - ( F i g u r e 5b).

P a r ce t te m 6 t h o d e , les v a l e u r s su ivan . tes on t 6t6 o b t e n u e s :

K m p y r u v a t e : 2.10 -~ M ; K m N A D H : 2,2.10 -4 M ; K m D - l a c t a t e : 5.10 -e M ; K m N A D : 1,25.10 -2 M ; V m (NAD) : 77 ~m.mn-1 ; V m (NADH) : 160 ~m.mn-1 .

3 - - S T A B I L I T I ~ T H E R M I Q U E .

a) E n f o n c t i o n d e la t e m p e r a t u r e .

L a f r a c t i o n C D I est d i l u6e a u 1 /100 ~ d a n s le t a m p o n Tr is -HC1 2.10 -2 M p r 6 a l a b l e m e n t chau f f6 h la t e m p 6 r a t u r e d(~sir6e. Apr6s u n e i n c u b a t i o n de 5 m i n u t e s , le t u b e est p l o n g 6 d a n s la g l a c e et l ' ac} iv i t6 r 6 s i d u e l l e es t m e su r6e i m m ~ d i a t e m e n t (en p r 6 s e n c e de p y r u v a t e et N A D H ) .

D o n s ces c o n d i t i o n s , o n o b s e r v e q u e la D - L D H p e r d 98 p. c e n t de son ac t i v i t~ p a r c h a u f f a g e 5 m i n u t e s h 45°C.

Ddshydrogdnases de Leuconostoc lactis. 1053

o

g

0 E

o E

._o

b) En [onction du temps de chauffage.

L'ac t iv i t6 e n z y m a t i q u e de la f r ac t ion C D1 dilu6e comme p r 6 c 6 d e m m e n t dans Ie t a m p o n Tris- HC1 2.10 -~- M est mesur6e aprbs chauffage p e n d a n t des t emps va r i ab les soi t h 37°C soit h 42°C.

Le l o g a r i t h m e du p o u r e e n t a g e d 'ae t iv i t6 r6si- duel le en fone t ion du temps ~ figure 6 - - est une d ro i t e p o u r chaque t emp6ra tu re , m o n t r a n t qu 'on est en p rdsence d 'une esp6ce p ro t6 ique un ique h act ivi t6 D-LDH.

c) Protection par les substrats contre I'inactiva- lion thermique.

Si on incube l ' enzyme, p e n d a n t des t emps va- r iables , /~ 42°C en p r6senee soi t de D-lactate , soit

a)

L-LOH

~ AIk h q o. "ne p h o s p h a t o s e 5 ~o ~ -I-D(--) LDH

~ ~ y t . C.

] t I _

0 5 10 15- Froctions

b) Electrophor~se en gel de polyacrgIamide en prdsence de SDS.

Apr~s mig ra t ion , la D-LDH de Leuconostoc lactis donne une seule bande color6e au eoomass ie blue. La d 6 t e r m i n a t i o n g r a p h i q u e (figure 7b) donne une va leur de 34 600 dal tons , ce qui est en faveur d 'une s t ruc tu re d im6r ique .

Caractdrisation de la glucose-6-phosphate ddshydrog~nase.

Cet enzyme fonc t i onne aussi b ien avec le NAD qu 'avee le NADP. Le r a p p o r t des vi tesses est de 1,83 p o u r la f r ac t ion purif i6e.

Les va leurs op t ima les du p H obtenues pou r les r6ae t ions avec NAD et NADP sont r e s p e c t i v e m e n t

0

3 L) "(1)

-5 E o.) tD

O

E o

Q) "O

c~ O - 4

0

b)

FIC,. 7. - - Ddtermination de la masse moldculaire de la D-LDH.

~ Ovolbumine . . . . ~kooPLepsi ne

D (--) L OH " ~Lb;Hy(p:~:°m$'re )

Ly~zymeo~

.... I | I.

0,5 1,0 Migrotion relotive

a - - Fi l t rat ion sur Sephadex G-200. b - - Electrophor~se en gel de polyacrylamide + SDS (Tampon d'~lution ct marqueurs : Voir Mat~rieI et

M~thodes).

de NAD, on observe une p ro t ec t i on de l ' enzyme con t re la d~n,aturat ion t he rmique , eomme le mon t r e la figure 6.

4 - - ACTION DU Z'. eaLOROMEnCUmBENZOATE.

La p re sence de r a d i c a u x s u l f h y d r i l e s in tac t s semble n~cessa i re h l ' ae t iv i t6 de la D-lact ico- d~shydrog6nase comme le m o n t r e l ' ac t ion du pCMB lorsque l ' e n z y m e est p r6 incub~ en sa pr6- sen.ce. L ' i n a e t i v a t i o n est i den t ique aprbs incuba - t ion soit h 0°C~ soi t h 25°C (Voir tab]eau II) ; elle ne p r~sen le pas de v a r i a t i o n e in~t ique d=ans les c o n d i t i o n s ext)6rim,entales ut i l is6es.

5 - - D I ~ T E R M I N A T I O N D E L ~ M A S S E M O L I ~ C U L A I R E .

a) Filtration sur Sephadex G-200.

La D-LDH de Leuconostoc lactis est 61u~e en m~me t emps que Ia p h o s p h a t a s e a lca l ine d'E. colt. L 'e s t ima t ion g r a p h i q u e d o n n e une vaIeur de 80 00'0 da l tons (figure 7a).

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 9.

7,8 et 10. E1]es ont 6t6 d6 te rmin6es en t a m p o n Tr i s -mal6a te 2.10 -1 M de p H : 5,2 h 8,6 et en tam- pon Glyc ine -NaOH 2.10 -1 M de p H : 8,6 h 10,4. Aueun effet du t a m p o n n 'a 6t6 remarqu6 .

TABLEAU II.

Action du p.chloromercuribenzoate sur ractivitd de Ia D-lactico-d~.shydrog&mse.

Molari[6 p. CMB

0 10-~

2.10-~ 5.10-5 8 . 1 0 -~

10-4 5 . 1 0 -4 8.10-4

10-3

P. cent d'activit6

100 93 87 82 62 57 2 0 , 5

6 , 2 0

1054 M. H o n t e b e g r i e et F. Gasser.

Les e in6t iques en fone t ion de la c o n c e n t r a t i o n en subs t ra t s son.t de type m i e h a e l i e n n e s . L.es r e p r 4 s e n t a t i o n s de L i n e w e a v e r et Burk [13] ont p e r m i s de d 6 t e r m i n e r Ies Km do.nt les va leurs sont les su ivan tes : Km glueose-6-phospha te (avee NAD) : 1,9.10 -4 M ; Km NAD : 1,1.10 -4 M ; K m glu- eose-6-pho.sphate (avee NADP) : 2.10 -4 M ; Km NADP : 1.4.10 -5 M.

La r6ac t ion de la g lueose-6-phosphate d6shydro - g6n.ase li6e au NAD est inh ib6e p a r !e NADPH de m a n i 6 r e non comp6t i f ive .

La masse mo l6cu la i r e est im6e p a r f i l t ra t ion suv S e p h a d e x G-200 est de 123.000 dal tons . Les mar- queurs t~tilis6s sont les m6mes que ceux uti l is6s pour la d6termination de la masse mo.16enlaire de ]a D-LDH (Voir Mat6rie] et M6thodes).

DISCUSSION.

La D-lactate d6shydrog6nase NAD-d6pendan te et la g lucose-6-phosphate d 6 s h y d r o g 6 n a s e NAD- NADP d6pendan t e de Leuconostoc tactis ont 6t6 s6par6es du mSme ex t ra i t b ru t p a r ch roma tog ra - ph ic sur h y d r o xyapa t i t e : pu is purif i6es s~par4- raent et ob tenues h u n degr6 de purer6 41ev6 n6ces- sa i re h l e u r 6tude i m m u n o l o g i q u e u l t6r ieure . Les f r ac t ions les plus pur i f i6es de ces deux enzymes

seule l igne de p r6e ip i t6 en r ega rd de la taehe d 'ac[ iv i t6 r6v616e p a r co lo ra t ion sp6cif ique.

Les d i f f6rentes esp6ces de Leuconostoe [i4, 15J semblen t avoi r des D-LDH h earac. t6r is t iques voi- s ines. La masse mol4eu la i re d6 te rmin6e p o u r l 'en- zyme de Leuconostoc Iactis est i den t ique h ce]les des enzymes de Leuconostoc mesentero~'des et Leuconostoc oenos [161. La m i g r a t i o n 61ectropho- r6 t ique 6tudi6e chez de nombreuse s souches d 'esp6ees d iverses de Leuconostoc y eompr i s Leu- conostoc lactis a 6t~ t rouv6e i den t ique p a r Garvie [16], h l 'exeeptio.n de L. oenos qui se d i s t ingue p a r a i l lenrs des aut res esp6ces de Leuconostoc p a r ses ca rac t6 r i s t iques p h y s i o l o g i q u e s et 6eolo- giques. Ces deux propr i6 t6s sont les seules compa- rabies d i spon ib l e s dans l a li , t t6ratnre. Les r6sul ta ts p r61 imina i res d 'une 6tude i m m u n o l o g i q u e mon- t r e n t c e p e n d a n t qu ' f ls p r6sen ten t une large d iver- sit6 de s t ruc ture .

La D- lac t i co -d6shydrog6nase de Leuconostoc lactis pr6sente l es p ropr i6 t6s ca rae t6 r i s t iques g6- n6ra les des D-LDH des bac t6r ies lac t iques , sp6cia- l emen t du groupe des LaclobacilIus ( tableau l ID : e in6 t ique m i c h a e l i e n n e , pH o p t i m u m a y a n t des va leurs vois ines , Km dont les va lenrs sont g6nd- r a l e m e n t tr6s 6,Iev6es p o u r le D-lactate et le NAD, g rande the rmosens ib i l i t 6 , masse mol6cu la i re iden- t ique.

TABLEAU III.

Tableau comparati[ des propridtds des D-LDH de di f fdrentes bact~ries Iacliques.

Leuconostoc lactis

pH optimum : P y r u v a t e ~ lactate . . . . . . . . . . 7,6 Lactate __>- pyruvate . . . . . . . . . 8

Km: Lactate 10-~M . . . . . . . . . . . . . 0,5 Pyruvate 10-:~M . . . . . . . . . . . . . . 2 NADH 10-'~M . . . . . . . . . . . . . 22

Inactivation thermique : I

Chauffage 5 mn h 50o C. . . . . . . . . 100 p. cent

Masse mol6culaire : (Sephadex G-200) . . . . . . . . . . . . . . 80 000

Lactobacillus leichmanii

(2)

7,6 8

0,7 1,2 7,1

50 p. cent

80 000

Lactobacillus acidophilus

(2)

7,3 7,8

12,5 4,6

16

100 p. cent

80 000

Lactobacillus jensenii

(2)

7,8 8,2

Lactobacillus fermenti

(2)

8,6 8,6

0,7 7,2

16,6

25 p. cent

80 000

0,2 1,9

10

98 p. cent

80 000

Lactobacillus plantarum

(23)

8,5

0,2 4,7

100 p. cent

68 o0o (9

(*) En vitesse de s6dimentation.

d o n n e n t tme seule bande de p ro t6 ine co4orable p a r le eoomass ie b lue apr6s 6.1eetrophor6se en gel de p o l y a c r y l a m i d e . P a r immuno-61ec t rophor6se eont re leurd an t i s6 rums sp6eif iques p r6par6s p a r in jec t ions au lap in , chaqne e n z y m e donne une

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 9.

L ' ensembic de ces p r o p r i O 6 s fa i t des D-LDH des bac t6r ies Iac t iques un groupe d ' enzymes tr6s homog6nes du po in t de r u e fonc t i onne l se d is t in- guan t au moins p a r deux po in t s f o n d a m e n t a u x d ' au t res D-LDH connues . D ' a b o r d i eur masse

Ddshydrogdnases de Leuconostoc laetis.

TABLEAU IV.

Comparaison des glucose-6-phosphate d~shydrogdnases de L e u e o n o s t o e laet is et L e u e o n o s t o e m e s e n t e r o i d e s .

pH optimum : - R6aetion lide au NAD . . . . . . . . - R6action li6e au NADP . . . . . . .

Km : G6 P (NAD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G6 P (NADP) . . . . . . . . . . . . . . . . . NADP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Inhibition par NADPH de la r~aetion li~e au NAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Vitesse NAD ¥it esse NADP

Masse mol~culaire (Sephadex G-200)

L. lactis

7,8 10

1 , 9 . I0-~M 1,1.10-~M

2.10-~M 1,4.10-~M

non eomp6titive

1 , 8 3

123.000

L. mesentero~des (21l

7,8 ~ 9

6 , 4 . 1 0 - ~ M 1,15.10-4M

3 , 6 . 1 0 - S M 7,4.10-6M

non competitive

1,83

126.000

1055

m o l 6 c u l a i r e - - 80000 da l tons est im6e p a r f i l t ra t ion su r S e p h a d e x G-200 est i n f6 r i eu re h celle de la D-LDH d'E. coli - - 133 000 da l tons --- [17] e~t ~ cel le de Pyth ium debaryanum ( c h a m p i g n o n )

115 000 da t tons ~ [!1'8]. Ensu i t e , les c in6 t iques m i c h a e l i e n n e s des D-LDH de Leuconostoc laclis et des au t r e s bac t6r ies l ac t iques se d i s t i nguen t des c in6 t iques s igmoida l e s des D-LDH d'E. coli [17] et de Butyr ibacter ium rettgeri ~19] - - effet coop6- ra t i f d u pyru:vate ~ de celle de Pylh ium deba- ryanum [18] - - effet coop6ra t i f du NADH et du lac ta te - - et de cel le d'Allomyces [20] - - effet coop6ra t i f d u NADH - - . De plus , le GTP est un i n h i b i t e u r a] ' lost6rique de la D-LDH chez Pyth ium debaryanum. P o u r la D-LDH de Leuconostoc lactis a u c u n effet eo,op6ratif n ' a 6t6 mis en 6vi- d e n c e ni en p r6sence des subs t ra ts , ni en p r6sence de GTP. C e p e n d a n t , e.lte est f a ib l emen t inh ib6e pa r r A T P , I 'ADP et I'AMP h des taux tout .~ fair s im i l a i r e s (10 h 15 p. cen t d ' i n h i b i t i o n ) sans effet coop6ra t i f . Cette i n h i b i t i o n se r e t r o u v e chez les D-LDH des Lactobacillus [2] et h des degr6s d ive r s chez les D-LDH d'E. coli [17], de Butyri- bacterinm rettgeri [191 et des c h a m p i g n o n s [!18, 20].

La gIucose -6-phospha te d 6 s h y d r o g 6 n a s e de Leu- conostoc lactis a d m e t p o u r c o e n z y m e soit le NAD, soit le NADP, dans des r a p p o r t s d ' ac t iv i t6 6quiva- lents. Les que lques pro.pri6t6s 6tudi6es m o n t r e n t qu 'e l le est tr~s semblab le h cel le de Leuconostoc mesenteroides ( tab leau IV) d6cr i t p a r Olive et Levy [21, 22].

Cette 6tude p r61 imina i r e des p ropr i6 t~s g~nd- rales , c in6 t iques et phys iques , des deux e n z y m e s de Leuconostoc lactis p e r m e t de c o n c l u r e h une g r a n d e s imil4tude de ces e n z y m e s i s o f o n c t i o n n e l s chez les bac t~r ies lac t iques . El le sera compl6t~e p a r une dtude c o m p a r a t i v e de la s t r uc tu r e p a r des m6 thodes i m m u n o l o g i q u e s .

Reraercieraents.

Ce travail a b~n~fici~ d'une subvention de l 'Univer- sit6 Paris VII.

l ~ s u ~ .

La D-lactico-d6shydrog~nase NAD-d6pendante et la glucose-6-phosphate d~shydrog~nase NAD(P) ddpen- dante de Leuconostoc lactis ont 6t6 s6par~es du m~me extrait brut par chromatographie sur hydroxyapati te et purifi~es jusqu'h ohtention de fractions donnant une seule bande de prot6ine en 61ectrophor6se en gel de polyacrylamide et une seulc ligne de pr~cipit~ apr~s immuno61eetrophor6se. Les prineipales propri6tds de ces deux enzymes ont 6t6 6tudi6es et eompar~es avec celles des enzymes isofonetionnels des autres baet6ries lactiques.

BIBLIOGBAPHIE.

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