Service Commun de Microscopie · 2017. 8. 29. · Tutoriel – Migration vers le logiciel de pilotage Zen pour piloter le Microscope Confocal 1– Précis – 08/2014 Version 1 –

TUTORIEL Migration vers le logiciel de pilotage Zen pour piloter le Microscope Confocal 1 – Zeiss LSM 510

Service Commun de Microscopie

Version 1 Août 2017

SERVICE COMMUN DE MICROSCOPIE

TUTORIEL

Migration vers le logiciel de pilotage Zen pour piloter le Microscope Confocal 1 – Zeiss LSM 510

Version 1

Août 2017

Sommaire

PRESENTATION DU MICROSCOPE ............................................................................................................................................... 1

PRESENTATION DU SOFTWARE .................................................................................................................................................. 2

DESCRIPTION DES FENETRES PRINCIPALES : ................................................................................................................................................ 3

GESTION DE L’ESPACE DE TRAVAIL : ......................................................................................................................................................... 4

LES PANNEAUX : .................................................................................................................................................................................. 4

DEMARRAGE DU MICROSCOPE .................................................................................................................................................. 5

LA GESTION DES DONNEES ......................................................................................................................................................... 5

CONSIGNES DE SECURITE............................................................................................................................................................ 6

DEROULEMENT D’UNE SESSION ................................................................................................................................................. 7

DEMARRAGE DU LOGICIEL ..................................................................................................................................................................... 7

INITIATION PILOTAGE/MANIPULATION DU MICROSCOPE ............................................................................................................................... 9 Ce que vous pouvez faire dans le logiciel ................................................................................................................................ 9 Ce que vous pouvez faire sur le microscope .......................................................................................................................... 10

INSTALLATION DE L’ECHANTILLON ......................................................................................................................................................... 11

REALISATION DE LA MISE AU POINT ........................................................................................................................................................ 13

REALISATION DE LA CONFIGURATION CONFOCALE ..................................................................................................................................... 14 Configuration du trajet optique en mode confocal ............................................................................................................... 14

Allumage des LASERS ........................................................................................................................................................ 14 Les types de configurations : Single vs Multi-Tracks ......................................................................................................... 15 Pour réaliser la suite de votre configuration : ................................................................................................................... 15

Enregistrement et rappel de configuration ........................................................................................................................... 17 Enregistrement de configuration ......................................................................................................................................................... 17 Rappel de configuration ....................................................................................................................................................................... 17

REGLAGE DES PARAMETRES D’ACQUISITION............................................................................................................................................. 19 Le panneau « Acquisition Mode » ........................................................................................................................................................ 19 Le panneau « Channels »...................................................................................................................................................................... 21

Réglage du pinhole : .......................................................................................................................................................... 21 Réglage du gain et de l’offset : .......................................................................................................................................... 23

ACQUISITION ET ENREGISTREMENT D’IMAGES .......................................................................................................................................... 30 Acquisition d’images simples (uniquement le plan focal) ...................................................................................................... 30 Acquisition de Z-stacks (piles d’images en z) ......................................................................................................................... 32 Enregistrement des images ................................................................................................................................................... 35

EXPLORER SES IMAGES ........................................................................................................................................................................ 38 Introduction ........................................................................................................................................................................... 38 Les icônes « Images »............................................................................................................................................................. 38

CHANGER D’OBJECTIF AU COURS DE LA SESSION ....................................................................................................................................... 41 Passage d’un objectif sec à un autre objectif sec................................................................................................................... 41 Passage d’un objectif sec à un objectif à immersion ............................................................................................................. 41 Passage d’un objectif à immersion à un objectif sec ............................................................................................................. 42 Passage d’un objectif à immersion à un autre objectif à immersion ..................................................................................... 43

CHANGER DE LAME AU COURS DE LA SESSION .......................................................................................................................................... 45 Si vous êtes sur un objectif sec .............................................................................................................................................. 45 Si vous êtes sur un objectif à immersion ............................................................................................................................... 45

RAPPEL DES PARAMETRES D’ACQUISITION D’UNE IMAGE ............................................................................................................................ 47

FIN DE SESSION ........................................................................................................................................................................ 48

ETAPES INITIALES ............................................................................................................................................................................... 48

PROCEDURE DE FIN N°1 – SANS ARRET DE L’EQUIPEMENT ......................................................................................................................... 50

PROCEDURE DE FIN N°2 – ARRET COMPLET DE L’EQUIPEMENT ................................................................................................................... 51

PROCEDURES EN CAS D’INCIDENT ............................................................................................................................................ 57

PROCEDURE URGENCE TECHNIQUE – EN CAS D’ABSENCE DU RESPONSABLE DE LA PLATE-FORME ...................................................................... 57 En cas de problème dans une pièce ....................................................................................................................................... 57 Si vous entendez ou voyez de l’eau couler du plafond .......................................................................................................... 58

PROCEDURE EN CAS D’INCIDENT EQUIPEMENT ......................................................................................................................................... 59 En cas d’absence du Responsable de la Plate-Forme : .......................................................................................................... 59 Si vous ne trouvez personne pour résoudre le problème : .................................................................................................... 59

TABLE DES ILLUSTRATIONS ....................................................................................................................................................... 60

COPIES D’ECRAN ................................................................................................................................................................................ 60

PHOTOS ........................................................................................................................................................................................... 61

Tutoriel – Migration vers le logiciel de pilotage Zen pour piloter le Microscope Confocal 1– Précis – 08/2014

Version 1 – 08/14 Service Commun de Microscopie 1

Présentation du microscope Rien n’a changé – Voir Manuel d’Utilisation – Microscope Confocal Zeiss LSM 510 – Précis – P.1

2 Service Commun de Microscopie Version 1 – 01/14

Présentation du software Le logiciel LSM Zen de Zeiss pilote maintenant le Microscope Confocal 1 – Zeiss LSM 510.

De nombreuses opérations de contrôles du microscope pourront se faire directement dans le logiciel.

Copie d'écran 1 : Logiciel Zen

Onglets



Description des fenêtres principales :

- La fenêtre de gauche 1 permet d’interagir avec le microscope, de le configurer en mode épifluorescence

ainsi qu’en mode confocal et de traiter les images. L’onglet « Ocular » vous permet d’utiliser et manipuler le microscope en mode épifluorescence.

L’onglet « Acquisition » vous permet de configurer et utiliser le microscope en mode confocal.

L’onglet « Processing » vous permet de traiter vos images (ex : Projection).

- La fenêtre centrale 1 affiche les images acquises ou en cours d’acquisition.

- La fenêtre de droite 1 vous permet de gérer la sauvegarde des images.

La lecture et l’utilisation de ce logiciel se fait donc de gauche à droite de manière chronologique :

- : Configuration du microscope en mode épifluorescence et mode confocal

- : Visualisation des images en cours d’acquisition et acquises

- : Sauvegarde des images

1 Voir Copie d'écran 1 : Logiciel Zen p.2


Gestion de l’espace de travail : Chaque utilisateur peut réorganiser l’espace de travail comme il le souhaite. Lors de votre arrivée pour une nouvelle

session, il est donc possible de se retrouver avec une organisation des fenêtres qui ne corresponde pas à vos attentes.

Pour rétablir l’affichage standard :

1. Cliquez sur le dossier « Workspace configuration » 1.

2. Sélectionnez « 1- Standard SCM ».

La taille de l’affichage peut aussi être ajustée en utilisant le curseur « Workspace Zoom »1. Cliquez sur « Reset » pour

réinitialiser la taille de l’affichage.

Les panneaux : Les fenêtres et colonnes sont composées de différents panneaux. Ces panneaux regroupent, par catégories, des

fonctions qui vous permettront de réaliser vos acquisitions.

Chaque panneau peut être ouvert ou fermé en

cliquant sur la petite flèche en haut à gauche du

panneau (voir icône A ci-contre).

Chaque panneau dispose d’une option « Show All »

(voir icône B ci-contre) qui doit être cochée pour

vous permettre d’accéder à toutes les options de

paramétrage. Cochez donc la case « Show All » si

elle n’est pas déjà cochée.

Vous pouvez aussi automatiquement cocher les

« Show All » de toutes les fenêtres simultanément

en cliquant dans le menu « View » puis sur « Show

All Global ».

1 Voir Copie d'écran 1 : Logiciel Zen p.2 Zone à droite).

Copie d'écran 2 : Panneau ouvert

Copie d'écran 3 : Panneau fermé

A B



Démarrage du microscope Rien n’a changé – Voir Manuel d’Utilisation – Microscope Confocal Zeiss LSM 510 – Précis – P.9

La gestion des données Rien n’a changé – Voir Manuel d’Utilisation – Microscope Confocal Zeiss LSM 510 – Précis – P.11


Consignes de Sécurité

ATTENTION IMPORTANT

RESCPECTEZ CES CONSIGNES DE SECURITE

LE NON RESPECT DE CES CONSIGNES PEUT CAUSER DES BLESSURES ET DES

DOMMAGES IRREVERSIBLES AU NIVEAU DE VOS YEUX OU CEUX DES

PERSONNES PRESENTES DANS LA PIECE

Le non-respect des consignes de sécurité entrainera votre expulsion immédiate de la Plate-Forme

Le microscope confocal utilise des lasers comme source de lumière.

Les lasers utilisés sont des lasers de classe 3b.

Ces lasers sont toujours dangereux si le faisceau ou une réflexion du faisceau arrive au niveau des yeux.

En mode confocal (Mode Acquisition 1 = Mode LSM) ne passez jamais vos mains ou un objet dans la zone

noire de la platine.

Pour pouvoir manipuler le statif et passer vos mains dans la zone noire de la platine, mettez-vous d’abord en

mode épifluorescence (Mode Ocular 1 = Mode VIS) avec l’option « Online » ACTIVEE

Reportez-vous au paragraphe Présentation du software p.2 pour localiser les icônes « Ocular » et « Acquisition ».

N’hésitez pas à vous rapprocher du Responsable de la Plate-Forme en cas de doute lors de l’utilisation du

microscope.

1 Voir Ce que vous pouvez faire dans le logiciel p.9



Déroulement d’une session

Démarrage du logiciel

1. Lancez le logiciel de pilotage en double cliquant sur l’icône « ZEN » (en haut à gauche du bureau de

l’ordinateur).

2. La fenêtre suivante s’ouvre :

Copie d'écran 4 : Fenêtre d’ouverture du logiciel Zen

Puis le panneau de démarrage (Login « ZEN 2009 ») s’ouvre :

Copie d'écran 5 : Panneau « Login ZEN 2009 » - Démarrage du logiciel Zen

3. Sur le panneau de démarrage : Cliquez sur « Start System »

L’initialisation se lance et les composants du microscope se connectent au logiciel (vous devriez entendre de

petits bruits au niveau du statif qui vous indiquent que tout se déroulement correctement).

Copie d'écran 6 : Initialisation du logiciel


*

A savoir / Notez-bien : Vous pouvez être confronté aux situations suivantes :

- Si l’initialisation du logiciel se déroule sans aucun bruit au niveau du statif, c’est que vous démarrez le logiciel en mode « Image Processing ». Dans ce cas :

Une fois le logiciel ouvert, fermez le en cliquant sur la croix puis relancer le logiciel

Zen1 en choisissant bien « Start System ».

- Si quand vous cliquez sur « Start System» vous avez une fenêtre avec de nombreux messages d’erreurs qui s’ouvre en bas à gauche de l’écran, c’est que vous démarrez le logiciel avec le statif éteint.

Dans ce cas :

Fermez les messages d’erreurs et les panneaux en cliquant sur les croix.

Fermez le logiciel en cliquant sur la croix . Allumez le statif. Redémarrez le logiciel Zen1.

- Pendant la session, si le logiciel ne répond plus ou que vous avez le message suivant « Hardware

is busy » c’est qu’un élément du microscope de communique plus correctement avec le logiciel. Dans ce cas :

Fermez le logiciel en cliquant sur la croix . Coupez le statif (Attention : NE COUPEZ QUE LE STATIF ET RIEN D’AUTRES – NE COUPEZ

SURTOUT PAS LE REMOTE CONTROL). Rallumez le statif. Redémarrez le logiciel Zen1.

*

1 Voir Démarrage du logiciel p.7



Initiation pilotage/manipulation du microscope Il existe 2 façons de piloter et manipuler le microscope :

Depuis le logiciel dans l’onglet « Ocular »1.

Directement sur le statif.

Ce que vous pouvez faire dans le logiciel

Pour accéder aux fonctions de pilotage, vous devez être sur l’onglet « Ocular » avec l’icône « Online »

activée .

Vous pourrez alors :

Allumer/Eteindre la lampe halogène :

cliquez sur l’icône (ci-contre) puis

cliquez sur « on » pour allumer. Recliquez

sur « On » pour éteindre. Vous pouvez

aussi ajuster l’intensité de la lampe en

jouant sur le curseur.

Ouvrir/Fermer le shutter de la lampe fluo :

Cliquez sur l’icône (ci-contre).

Choisir votre objectif (2,5x sec, 10x sec,

20x sec, 40x huile, 63x huile) : Cliquez

l’icône (ci-contre) puis cliquez sur

l’objectif voulu.

Choisir votre cube de fluorescence (Vert

ou Rouge) : Cliquez sur l’icône (ci-

contre) puis choisissez le cube voulu.

1 Voir Copie d'écran 1 : Logiciel Zen p.2

A

B

C

D

Copie d'écran 7 : Onglet Ocular

B

A

D

C


Ce que vous pouvez faire sur le microscope

Rien n’a changé – Pour un rappel, voir le Manuel d’Utilisation – Microscope Confocal Zeiss LSM 510 – Précis – P.16

RAPPEL : Mettez-vous en mode « Ocular » l’option « Online » activée avant de passer mains ou objet dans la zone

noire de la platine1

1 Voir Consignes de Sécurité p.6



Installation de l’échantillon RAPPEL : Mettez-vous en mode « Ocular » l’option « Online » activée avant de passer mains ou objet dans la zone


Avant de sortir vos échantillons, allumez une ou des lampes de bureau et éteignez l’éclairage principal de la pièce.

Chaque lampe de bureau est équipée d’un variateur d’intensité. Utilisez le variateur pour ajuster la luminosité en

fonction de vos besoins.

Photo(s) 1 : Variateur lumière

*

ATTENTION / A NE PAS FAIRE : N’utilisez pas le variateur pour allumer/éteindre la lampe. Utilisez l’interrupteur de la lampe de bureau.

*

Pour installer votre échantillon, suivez les étapes indiquées ci-dessous :

1. Cliquez sur l’icône « Ocular » puis activez l’option « Online » .

2. Descendez les objectifs au maximum (jusqu’à entendre des bips) en tournant une vis macrométrique vers

vous.

3. Choisissez votre objectif :

Dans la fenêtre « Ocular » (mode épifluorescence), cliquez sur l’icône « Objective » puis

sélectionnez l’objectif de votre choix.

Les objectifs à votre disposition sont les suivants :

A. 10x sec (JAMAIS D’HUILE SUR CET OBJECTIF)

B. 20x sec (JAMAIS D’HUILE SUR CET OBJECTIF)

C. 40x Immersion HUILE (UTILISEZ UNE GOUTTE DU MILIEU

D’IMMERSION HUILE UNIQUEMENT)

D. 63x Immersion HUILE (UTILISEZ UNE GOUTTE DU MILIEU

D’IMMERSION HUILE UNIQUEMENT)

E. 2,5x sec (JAMAIS D’HUILE SUR CET OBJECTIF)

X. Il n’y a pas d’objectif 100x


Copie d'écran 8 : Liste Objectifs

A

B

C

D

E

X


L’objectif se met alors en place.

Le reste de la procédure d’installation de l’échantillon ne change pas. Pour un rappel, consultez le Manuel

d’Utilisation – Microscope Confocal Zeiss LSM 510 – Précis – à partir de la P.19






Réalisation de la mise au point Rien n’a changé – Pour un rappel, voir le Manuel d’Utilisation – Microscope Confocal Zeiss LSM 510 – Précis – à partir

de la page 26.





Réalisation de la configuration confocale

Configuration du trajet optique en mode confocal

Allumage des LASERS

Pour allumer les lasers dont vous avez besoin, rendez-vous dans l’onglet « Acquisition » , zone « Setup

Manager » et panneau « Laser » :

Copie d'écran 9 : Panneau Laser

3 lasers sont à notre disposition :

- Argons/2 avec les raies 458, 477, 488 et 514 nm.

- HeNe1 avec la raie 543 nm.

- HeNe2 avec la raie 633 nm.

Pour allumer le laser Argon/2 :

1. Dans le panneau « Laser », cliquez sur la ligne de l’Argon/2 pour la mettre en surbrillance

.

2. Cliquez sur Standby (Ne cliquez jamais sur « On »).

Pour allumer le laser HeNe1 ou HeNe2:

1. Dans le panneau « Laser », cliquez sur la ligne du HeNe1 pour la mettre en surbrillance.

2. Cliquez sur « On ».



Les types de configurations : Single vs Multi-Tracks

Rien n’a changé – Pour un rappel, voir le Manuel d’Utilisation – Microscope Confocal Zeiss LSM 510 – Précis – à partir

de la page 32.

Pour réaliser la suite de votre configuration :

Pour réaliser votre configuration, vous aurez besoin des panneaux « Imaging Setup » et « Light Path ».

Copie d'écran 10 : Fenêtres "Imaging Setup" et "Light Path"

1. Choisissez le nombre de tracks que vous souhaitez dans le panneau « Imaging Setup ». Pour ajouter une track,

cliquez sur l’icône « + » .

Vous pouvez renommer les tracks pour plus de lisibilité.


Pour supprimer une track, mettre en subrillance la track à supprimer dans le panneau « Imaging Setup » puis

cliquez sur l’icône « - » dans la fenêtre « Light Path ».

2. Ajustez le trajet optique pour chacune des tracks créées.

Pour ajuster le trajet optique d’une track, mettre en subrillance la track à paramétrer dans le panneau

« Imaging Setup » puis ajustez les paramètres dans le panneau « Light Path ».

La méthode de paramètrage ne change pas. On retrouve les mêmes éléments à régler. C’est juste le visuel qui

est changé.

Copie d'écran 11 : Réglage du trajet optique - LSM 510 vs LSM ZEN

Pour plus d’information concernant la technique de réglage du trajet optique, voir le Manuel d’Utilisation –

Microscope Confocal Zeiss LSM 510 – Précis – à partir de la page 33.

Logiciel LSM 510 Logiciel LSM ZEN



Enregistrement et rappel de configuration

Enregistrement de configuration

Si vous le souhaitez, vous pouvez enregistrer la configuration du trajet optique. Pour cela :

1. Dans l’onglet « Acquisition » , tout en haut de la colonne de gauche, cliquez sur l’icône de la petite

disquette à droite du champ « Configuration » :

Copie d'écran 12 : Enregistrement configuration 1

2. Dans la fenêre qui s’ouvre, donnez le nom que vous souhaitez (par exemple : « Vos Initiales + Le nom des

fluorochromes dans la configuration + l’objectif utilisé ») puis cliquez sur « Ok » :

Copie d'écran 13 : Enregistrement configuration 2

Rappel de configuration

1. Dans l’onglet « Acquisition » , tout en haut de la colonne de gauche, cliquez sur l’icône du dossier

à droite du champ « Configuration » :

Copie d'écran 14 : Rappel configuration


2. Dans le menu qui s’ouvre, cliquez sur la configuration de votre choix pour la recharger :

Copie d'écran 15 : Choix d'une configuration enregistrée

3. La configuration se recharge alors (Trajet optique + objectif).

*

ATTENTION / A NE PAS FAIRE : Si vous êtes avec un objectif à immersion et que vous souhaitez recharger une configuration réalisée avec un objectif sec, NETTOYEZ D’ABORD VOTRE LAMELLE AVANT DE RAPPELER LA CONFIGURATION.

*

La réalisation ainsi que l’enregistrement et le rappel de la configuration confocale sont maintenant terminés. Si vous

avez le moindre doute ou si vous rencontrez une difficulté rapprochez-vous immédiatement du Responsable de la

Plate-Forme.



Réglage des paramètres d’acquisition

Toutes les valeurs indiquées dans la suite de la procédure sont données à titre indicatif. Elle constitue un bon point de

départ pour commencer à faire des observations. Ces valeurs ne sont en aucun cas universelles et ne seront pas

forcément adaptées à votre problématique. Les valeurs indiquées ci-après sont des valeurs par défaut. Ne les

appliquez pas sans avoir vérifié que ces réglages répondent à vos besoins. Analysez votre question biologique et

adaptez les réglages pour répondre le plus efficacement possible à votre problématique.

En cas de doute n’hésitez pas à vous rapprocher du personnel de la Plate-Forme.

Les différents réglages des paramètres d’acquisition sont accessibles depuis l’onglet « Acquisition » dans la zone

« Online Acquisition » et les panneaux « Acquisition Mode » et « Channels » :

Le panneau « Acquisition Mode »

Copie d'écran 16 : Acquisition Mode - Détails

Légende :

A- Visualisation de l’objectif B- Choix du mode C- Zone de réglage de la définition D- Mise en place de la résolution optimale E- Réglage du saut de ligne(s) F- Réglage de la vitesse du scanner

G- Réglage du moyennage H- Réglage de la dynamique du capteur I- Réglage de la direction du scanner J- Réglage du zoom (crop) K- Réinitialisation du zoom

A

B

C

E D

F

G H

I

J

K


Rappel des réglages de base pour le panneau « Acquisition Mode » :

Pour les réglages, le panneau doit avoir l’option « Show All » activée 1.

Les pastilles bleues dans le tableau ci-dessous se réfèrent à la Copie d'écran 16 : Acquisition Mode - Détails

p.19

Zone Description Fonction Réglage de base

Visualisation de l’objectif en cours

d’utilisation

Vérifiez que l’objectif indiqué correspond bien à celui que vous souhaitez. Sinon, changez d’objectif avant de poursuivre les

réglages.

Choix du mode de scan Choisir « Frame » pour faire des images X/Y.

Choix de la définition (nombre de

pixels en X et Y)

Vous pouvez utiliser l’icône x*y pour choisir les définitions de base. Par exemple 512x512.

Attention, si vous avez besoin de récupérer toute l’information,

cliquez sur l’icône « Optimal » pour que le logiciel calcul la définition optimale.

Réglage du saut de ligne(s) Laisser le réglage sur 1 pour ne pas sauter de ligne.

Réglage de la vitesse du scanner Entre 7 et 8.

Notez que plus la vitesse est lente (chiffre petit) moins il y a de bruit.

Réglage du moyennage

La zone « Number » permet de choisir le nombre d’itérations. Plus ce chiffre est élevé moins il y a de bruit.

Zone « Mode » : Choisir « Line » Zone « Method » : Choisir « Mean »

Réglage de la dynamique du capteur Par défaut, choisir 8 bit pour avoir 256 niveaux d’intensité par

pixel.

Réglage de la direction du scanner Choisir l’aller simple ->

Réglage du zoom (crop)

Par défaut le zoom doit être à 1. Si ce n’est pas le cas, réinitialisez-le en cliquant sur « Reset All »

(Icône ). Dans ce cas refaire votre réglage de définition (Point

) et de vitesse de scanner (Point ).

1 Voir Les panneaux : p.4

A

B

C

D

E

F

G

HZA I

J

F C

K



Le panneau « Channels »

La fenêtre « Channels » va vous permettre de régler les paramètres suivants :

- Taille des pinholes

- Gain (master)

- Offset

- Réajustement des puissances laser si besoin

Copie d'écran 17 : Channels - Détails

Légende :

A- Réglage de la puissance des lasers B- Taille du pinhole en µm C- Taille du pinhole en AU (Airy Unit)

D- Réglage direct du pinhole à 1 AU E- Réglage du gain (master) F- Réglage de l’offset

Pour les réglages, le panneau doit avoir l’option « Show All » activée 1.

Réglage du pinhole :

1. Dans le panneau « Channels », pour chacune des channels, mettez les pinholes à 1 AU en cliquant sur l’icône

2.

2. Dans l’onglet « Acquisition », en haut de la colonne gauche, cochez l’option « Z stack » .

Un nouveau panneau « Z-Stack » s’ouvre dans la zone « Multidimensional Acquisition ».

1 Voir Les panneaux : p.4

2 Voir Copie d'écran 17 : Channels - Détails – Point ci-dessus D

A

B

D

E

F

C


3. Dans le panneau « Z-Stack », ouvrez le menu « Optimize Sectioning and Step » :

4. Dans la section « Optimize Sectioning and Step » du panneau « Z-Stack », cliquez sur l’icône « Match

pinhole » .

5. Dans le panneau « Channels », vérifier pour chacune des channels que les pinholes sont entre 0.8 et 1 AU.

Si oui, le réglage des pinholes est terminé et vous pouvez passer au réglage du gain et de l’offset.

Si les pinholes sont trop petits, c’est que l’intervalle définit dans la fenêtre « Z-Stack » est trop petit.

Augmentez donc cet intervalle.

Si les pinholes sont trop grands, c’est que l’intervalle définit dans la fenêtre « Z-Stack » est trop grand.

Diminuez donc cet intervalle.

Copie d'écran 18 : Panneau « Z-Stack » - Réglage de l’intervalle en Z

6. Dans le panneau « Z-Stack », menu « Optimize Sectioning and Step », cliquez à nouveau sur l’icône « Match

pinhole » .

Répétez les étapes 4, 5 et 6 jusqu’à ce que tous les pinholes aient une valeur correcte.



Réglage du gain et de l’offset :



1. Vérifiez votre focus :

Cliquez sur l’icône « Ocular » puis activez l’option « Online » .

Ouvrez le shutter de la fluorescence.

Choisissez un cube de fluorescence.

Ajustez la mise au point si besoin.

Fermez le shutter de la fluorescence.

*

Attention : A partir de maintenant, le microscope va utiliser les lasers. Ne prénétrez jamais vos mains ou un objet dans la zone délimitée par la platine.

*

2. Dans l’onglet « Acquisition » , tout en haut de la colonne gauche, cliquez sur l’icône « Auto

Exposure » .

Copie d'écran 19 : Icône « Auto Exposure »

Les lasers sont envoyés sur l’échantillon et le logiciel ajuste alors automatique le gain afin que l’image

confocale affiche des informations.

Le logiciel affiche maintenant dans la zone « Image »2 une image de l’échantillon.

1 Voir Consignes de Sécurité p.6 2 Voir Présentation du software p.2


Copie d'écran 20 : Zone « Image »

Légende :

A- Affichage 2D = Merge B- Affichage Split = Visualisation des canaux séparément + merge

C- Informations concernant l’image D- Ouverture du panneau palette (LUT)

3. Cliquez sur l’icône « Split » (Voir point sur copie d’écran précédente) pour spliter l’image.

Copie d'écran 21 : Fenêtre « Image » - Image Splitée

B

A

B

C

D



Il faut maintenant affiner le réglage de « Gain (Master) » (= « Detector Gain ») et de « Digital Offset » (= « Amplifier

Offset »). Pour cela, il faut un retour visuel en live de l’image. En jouant sur un paramètre on verra donc directement

comment cela agit sur l’image.

4. Dans l’onglet « Acquisition » , tout en haut de la colonnede gauche, cliquez sur l’icône « Live »

.

Copie d'écran 22 : Icône « Live »

L’acquisition de l’image se fait maintenant en boucle avec des paramètres d’acquisitions accélérés qui

permettent d’avoir un rafraîchissement de la vue assez rapide.

*

A savoir / Notez-bien : Si vous souhaitez faire une observation en boucle de l’image avec vos paramètres d’acquisitions, cliquez

sur « Continuous » . Tous vos paramètres seront pris en compte pour réaliser la vue en boucle (Attention : le rafraîchissement de l’image peut être plus lent qu’en « Live »).

*

5. En bas de la zone « Image », dans l’onglet « Dimensions », dans la zone « Channels », cliquez sur la petite icône

en dessous de l’étiquette « Merge » pour passer en mode palette « Range Indicator ».

Copie d'écran 23 : Passage en mode « Range Indicator » 1


>

Copie d'écran 24 : Passage en mode « Range Indicator » 2

Une fois le « Range Indicator » activé, vous voyez en bleu les pixels dans l’offset (considérés comme nuls sur

l’image finale) et en rouge les pixels à saturation.

6. Balayez en z toute l’épaisseur de l’échantillon grâce à la vis micrométrique droite du statif (vis la plus à

l’extérieur) et recherchez la position en z la plus saturée.

Tout en haut de l’échantillon Position en z la plus saturée Tout en bas de l’échantillon

> >

Copie d'écran 25 : Recherche du Z le plus intense

*

Attention : Tournez très délicatement la vis micrométrique dans un sens ou dans l’autre. Laissez le temps au microscope et au logiciel de rafraîchir l’image.

*

7. Après avoir trouvé la position en z la plus saturée, ajustez la valeur de « Gain Master » pour chacune des

channels. Le but est d’exploiter au mieux la dynamique du détecteur. Il faut donc avoir uniquement quelques

pixels rouges dans chaque channel :

Range indicator désactivé Range indicator activé



Pour toutes les tracks présentes dans le panneau « Channels »1, sélectionnez les tracks une à une puis :

Dans la partie basse du panneau « Channels » diminuez ou augmentez la valeur du « Gain Master »

de façon à obtenir uniquement quelques pixels rouges pour chaque channel.

Copie d'écran 26 : Réglage « Gain Master»

Vous avez 2 solutions pour ajuster le « Gain (Master) » :

- Utilisez les flèches haute et basse (ajustement précis).

- Cliquez et maintenez le curseur puis faites le glisser lentement à gauche (diminution du gain)

ou à droite (augmentation du gain).

*

ATTENTION / A NE PAS FAIRE : Ne modifiez pas les valeurs du « Detector Gain » brusquement. Modifiez les valeurs de manière progressive.

*

Pour chacune des tracks efforcez-vous d’obtenir des valeurs de « Gain Master » comprises entre 400

et 800 (zone linéaire du gain).

S’il vous faut mettre un gain très supérieur à 800 pour arriver à la saturation, vous pouvez augmenter

le pourcentage de transmission du laser correspondant à la channel (évitez toujours de dépasser 10%).

L’augmentation du pourcentage de transmission vous permettra de diminuer la valeur de gain.

A l’inverse, s’il vous faut mettre un gain inférieur à 400 pour n’avoir que quelques pixels rouges, vous

pouvez diminuer le pourcentage de transmission du laser correspondant à la channel. La diminution

du pourcentage de transmission vous permettra d’augmenter la valeur de gain.

1 Voir Copie d'écran 17 : Channels - Détails p.21


8. Pour toutes les tracks présentes dans le panneau « Channels »1, sélectionnez les tracks une à une puis :

Dans la partie basse du panneau « Channels » diminuez ou augmentez la valeur de « Digital Offset »

si besoin.

Copie d'écran 27 : Ajustement "Digital Offset"

Vous avez 2 solutions pour ajuster le « Amplifier Offset » :

- Utilisez les flèches gauche et droite (ajustement précis).

- Cliquez et maintenez le curseur puis faites le glisser à gauche (Augmentation de l’offset) ou à

droite (Diminution de l’offset).

Vous pouvez ajuster cette valeur si vous le souhaitez mais veuillez toujours à ne pas mettre trop

d’offset au risque de perdre votre signal d’intérêt.

9. Stoppez le live en cliquant sur l’icône « Stop » (c’est l’icône « Live » qui se transforme en icône

« Stop » quand elle est active).

Copie d'écran 28 : Icône «Stop »

1 Voir Copie d'écran 17 : Channels - Détails p.21



Le réglage des paramètres d’acquisition est maintenant terminé. Si vous avez le moindre doute ou si vous rencontrez

une difficulté rapprochez-vous immédiatement du Responsable de la Plate-Forme.


Acquisition et enregistrement d’images

Acquisition d’images simples (uniquement le plan focal)

L’acquisition d’images simples permet d’acquérir uniquement l’information provenant du plan focal actuellement

visible sur le microscope. Pour acquérir ce type d’images, suivez la procédure suivante :

ATTENTION : Toutes les opérations d’installation de l’échantillon, de mise au point, de configuration du trajet optique

confocal et de réglages des paramètres d’acquisition doivent avoir été réalisées avant de suivre la procédure suivante.

Procédure :

1. Dans l’onglet « Acquisition » , tout en haut de la colonne gauche, cliquez sur l’icône « Live »

.

2. Choisissez le plan focal que vous souhaitez imager en balayant en z votre échantillon grâce à une vis

micrométrique (vis la plus à l’extérieur) du statif. Arrêtez-vous sur le plan focal de votre choix.

3. Stoppez le live en cliquant sur l’icône « Stop » .

4. Tout en haut de la colonne « Acquisition », cliquez sur l’icône « Snap » .

L’acquisition de l’image démarre.



Copie d'écran 29 : Image simple acquise

Pendant l’acquisition, une barre de progression est affichée en bas de la zone « Image ». Cette barre vous

indique l’avancement de l’acquisition.

Copie d'écran 30 : Barre de progression

5. La barre de progression disparaît quand elle arrive à 100%. L’acquisition est alors terminée. Votre image reste

affichée dans la zone « Image ».

6. Avant de faire quoi que ce soit d’autre, enregistrez votre image1.

1 Voir Enregistrement des images – p.35


Acquisition de Z-stacks (piles d’images en z)

L’acquisition de Z-stacks vous permet de recueillir toute l’information en Z de votre échantillon. Pour acquérir ce type

d’images, suivez la procédure suivante :

ATTENTION : Toutes les opérations d’installation de l’échantillon, de mise au point, de configuration du trajet optique

confocal et de réglages des paramètres d’acquisition doivent avoir été réalisées avant de suivre la procédure suivante.

Procédure :

1. Dans l’onglet « Acquisition » , tout en haut de la colonne de gauche, vérifiez que « Z-Stack » est

bien coché.

Copie d'écran 31 : Option « Z-Stack »

2. Dans le panneau « Z-Stack », choisissez l’option « First/Last » .

3. cliquez sur l’icône « Live » .

Vous devez maintenant définir le haut et le bas de votre échantillon.

4. Balayez votre échantillon en z votre grâce à une vis micrométrique (vis la plus à l’extérieur) du statif. Arrêtez-

vous à l’extrémité en z de votre choix.

5. Dans le panneau « Z-Stack », cliquez sur l’icône « Set First » , pour mémoriser cette extrémité.

6. Balayez en z votre échantillon dans l’autre sens grâce à une vis micrométrique (vis la plus à l’extérieur) du

statif. Arrêtez-vous à l’extrémité en z de votre choix.

7. Dans la fenêtre « Z-Stack », cliquez sur l’icône « Set Last » , pour mémoriser cette extrémité.



Les bornes haute et basse de votre échantillon sont maintenant enregistrées.

Copie d'écran 32 : Icônes « Set First » & « Set Last »

8. Pour démarrer l’acquisition du z-stack, cliquez maintenant sur l’icône « Start Experiment »

en haut de la colonne « Acquisition ».


Copie d'écran 33 : Icône « Start Experiment »

L’acquisition du Z-stack démarre.

Pendant l’acquisition, une barre de progression est affichée en bas de la zone « Image ». Cette barre vous

indique l’avancement de l’acquisition.

(Format d’affichage du temps 00 : 00 : 00 = Heures : Minutes : Secondes).

Copie d'écran 34 : Barre de progression - Z-Stack

9. La barre de progression disparaît quand elle arrive à 100%. L’acquisition est alors terminée. Votre image est

affichée dans la zone « image ».

10. Avant de faire quoi que ce soit d’autre, enregistrez votre image1.

L’acquisition des images est maintenant terminée. Si vous avez le moindre doute ou si vous rencontrez une difficulté

rapprochez-vous immédiatement du Responsable de la Plate-Forme.

1 Voir Enregistrement des images – p.35



Enregistrement des images *

Attention : Sur le précédent logiciel, il fallait créer une base de données pour pouvoir enregistrer vos images. Ce n’est plus le cas avec le nouveau logiciel « ZEN ».

*

A la fin d’une acquisition, l’image reste ouverte mais n’est en aucun cas sauvegardée. Pensez donc à enregistrer vos

images directement après chaque acquisition.

1. Une fois l’acquisition terminée, un aperçu de l’image s’affiche dans la 3ème colonne dédiée à la sauvegarde des

images1.

Les images non sauvegardées affichent une petite icône « Attention » .

Copie d'écran 35 : Image non sauvegardée

2. En dessous de l’aperçu de l’image, cliquez sur l’icône de la disquette .

Copie d'écran 36 : Sauvegarde – Etape 2

1 Voir Présentation du software p.2


3. La fenêtre « Save As » s’ouvre :

Copie d'écran 37 : Fenêtre « Save As »

4. Grâce au menu déroulant « Save in », rejoignez le lieu de stockage local (D : DATA) puis ouvrez votre dossier

personnel local :

Copie d'écran 38 : Menu « Save in »

5. Dans le champ « File name », nommez votre image avec le nom de votre choix :

Copie d'écran 39 : Champ « File name »



6. Dans le champ « Save as type » choisissez le format « LSM 5 ». Ce format enregistrera l’information sans

compression et sauvegardera avec l’image toutes les conditions d’acquisition (qui pourront ainsi être

rappelées plus tard).

7. Enfin, cliquez sur l’icône « Save » pour finaliser l’enregistrement :

*

ATTENTION / A NE PAS FAIRE : N’ENREGISTREZ JAMAIS VOS IMAGES DIRECTEMENT SUR LE SERVEUR DE STOCKAGE « SCMRAID ». PENDANT LA SESSION, ENREGISTREZ TOUJOURS VOS IMAGES SUR LE DISQUE DUR LOCAL A L’ADRESSE INDIQUEE SUR L’ETIQUETTE JAUNE COLLEE SUR L’ECRAN DE L’ORDINATEUR.

*

L’acquisition et l’enregistrement des images sont maintenant terminés. Si vous avez le moindre doute ou si vous

rencontrez une difficulté rapprochez-vous immédiatement du Responsable de la Plate-Forme.


Explorer ses images Une fois vos images acquises et enregistrées vous pouvez les explorer.

Introduction

L’exploration des images se fait à partir de la fenêtre « Image ».

Pour ouvrir une fenêtre « Image » double-cliquez sur son aperçu dans la 3ème colonne dédiée à l’enregistrement des

images1.

Les icônes « Images »

Dans la partie gauche et basse de la zone « Image » vous trouverez une série d’icônes qui vous permettra d’explorer

de différentes façons votre image.

Copie d'écran 40 : Localisation des outils d’exploration de l’image (zones encadrées en bleu)

1 Voir Présentation du software p.2



Situation

Icônes Condition de présence Fonction

Sur la gauche de la fenêtre

image

Sur toutes les images. Superposition de tous les canaux

(=merge).

Sur les images multicanaux.

Affiche séparément tous les canaux + merge .

Sur les images multi-paramétriques (par exemple Z-satck).

Affiche séparément toutes les images qui composent l’expérience.

Sur les images Z-stack. Affiche la vue orthogonale de l’image

(Coupe en X, Y et Z).

Sur les images Z-stack. Permet d’afficher un plan de section

du Z-stack.

Sur toutes les images. Affiche la distribution des intensités

dans un pseudo mode 3D.

Sur les images Z-stack. Affiche des modélisations 3D du Z-

Stack.

Sur toutes les images.

Affiche l’histogramme (distribution de

l’intensité des pixels) de l’image ou d’une région d’intérêt.

Sur les images multicanaux.

Outil d’exploration de la colocalisation sur les images multicanaux.

Sur toutes les images. Permet de réaliser des profils

d’intensité.

Sur toutes les images. Affiche toutes les conditions

d’acquisition de l’image.


Situation

Icônes Condition de présence Fonction

En bas de la fenêtre image

Onglet

« Dimensions »

Sur les images Z-stack. Curseur de déplacement en Z.

Sur toutes les images. Options de zoom post-acquisition.

Sur toutes les images.

Affiche les options d’affichage ou de masquage des channels.

Permet de modifier les couleurs des canaux (LUT).

Sur toutes les images. Permet de recharger tous les

paramètres d’acquisition de l’image.

Sur toutes les images. Active la fonction de crop.


Onglet

« Display »

Onglet

Sur toutes les images. Permet de modifier l’histogramme

des canaux de l’image.


Onglet

« Overlay »

Onglet

Sur toutes les images. Permet d’accéder aux outils

d’annotation de l’image.



Changer d’objectif au cours de la session Si vous souhaitez changer d’objectif pendant la session, suivez la procédure suivante :



Passage d’un objectif sec à un autre objectif sec

1. Vérifiez qu’aucune acquisition confocale n’est en cours (absence de barre de progression en bas de la fenêtre

du logiciel).


3. Sélectionnez votre objectif dans le logiciel2.

4. L’objectif se met en place automatiquement.

5. Ajustez votre mise au point3 en fluorescence.

6. Réajustez vos paramètres d’acquisitions en prenant en considération ce nouvel objectif4.

7. Faites vos nouvelles acquisitions5.

Passage d’un objectif sec à un objectif à immersion

1. Vérifiez qu’aucune acquisition confocale n’est en cours (absence de barre de progression en bas de la

fenêtre du logiciel).


3. Descendez la tourelle d’objectif au maximum en utilisant une vis macrométrique2.

4. Basculez délicatement la tête du statif vers l’arrière6.

5. Retirez votre lame du porte-objet.

6. Sélectionnez votre objectif à immersion dans le logiciel2.


8. Déposez une petite goutte d’huile sur la lentille de l’objectif6.

1 Voir Consignes de Sécurité p.6 2 Voir Initiation pilotage/manipulation du microscope p.9 3 Voir Réalisation de la mise au point p.13 4 Voir Réglage des paramètres d’acquisition p. 19 5 Voir Acquisition et enregistrement d’images p.30 6 Voir Installation de l’échantillon p.11


*

ATTENTION / A NE PAS FAIRE : Ne déposez pas trop d’huile sur l’objectif. Une petite goutte suffit. Si vous avez déposé trop d’huile, nettoyez immédiatement l’objectif avec du papier optique et redéposez une petite goutte d’huile.

*

9. Positionnez votre lame sur le porte-objet1.

10. Remettez délicatement la tête du statif en place1.

11. Allumez la lampe halogène et réglez l’intensité de façon à visualiser un spot de lumière2.

12. Centrez votre échantillon dans le spot de lumière grâce au joystick x/y2.

13. Montez à l’œil nu les objectifs avec une vis macrométrique jusqu’à ce que l’huile entre en contact avec la

lamelle de votre échantillon. Recentrez au besoin votre échantillon dans le spot de lumière.

*

Information complémentaire : Utilisez la vis macrométrique pour approcher la lame de l’objectif. Tournez doucement la vis macrométrique vers le mur pour monter. L’huile est en contact avec l’objectif quand vous voyez l’huile s’étaler légèrement sur la lamelle.

*

14. Coupez la lampe halogène2.




Passage d’un objectif à immersion à un objectif sec







6. Nettoyez soigneusement votre lame.

7. Nettoyez soigneusement l’objectif avec du papier optique :

a. Prenez un papier optique et pliez-le en 4.

b. Essuyez délicatement l’objectif (n’appuyez pas fort).

c. Repliez votre papier optique.

d. Ressuyez une nouvelle fois l’objectif délicatement.

1 Voir Installation de l’échantillon p.11 2 Voir Initiation pilotage/manipulation du microscope p.9 3 Voir Réalisation de la mise au point p.13 4 Voir Réglage des paramètres d’acquisition p. 19 5 Voir Acquisition et enregistrement d’images p.30 6 Voir Installation de l’échantillon p.11



e. Prenez un nouveau papier optique et pliez-le en 4. Imprégnez-le d’alcool à 50° puis essuyez une

nouvelle fois délicatement l’objectif avec ce papier.

f. Prenez un dernier papier optique et pliez-le en 4.

g. Essuyez délicatement l’objectif.

8. Sélectionnez votre objectif sec dans le logiciel2.






14. Coupez la lumière transmise2.




Passage d’un objectif à immersion à un autre objectif à

immersion




3. Descendez la tourelle d’objectif au maximum en utilisant une vis macrométrique (jusqu’à entre les bips)2.



6. Nettoyez soigneusement l’objectif à immersion que vous venez d’utiliser avec du papier optique :









7. Sélectionnez votre autre objectif à immersion dans le logiciel2.


9. Déposez une petite goutte d’huile sur la lentille de l’objectif1.

1 Voir Installation de l’échantillon p.11 2 Voir Initiation pilotage/manipulation du microscope p.9 3 Voir Réalisation de la mise au point p.13 4 Voir Réglage des paramètres d’acquisition p. 19 5 Voir Acquisition et enregistrement d’images p.30


*


*







*


*





1 Voir Initiation pilotage/manipulation du microscope p.9 2 Voir Réalisation de la mise au point p.13 3 Voir Réglage des paramètres d’acquisition p. 19 4 Voir Acquisition et enregistrement d’images p.30



Changer de lame au cours de la session Si vous souhaitez changer de lame au cours de la session, suivez la procédure suivante :



Si vous êtes sur un objectif sec




3. Descendez la tourelle d’objectif au maximum en utilisant une vis macrométrique (jusqu’à entre les bips) 2.



6. Mettez en place votre nouvelle lame sur le porte objet3.




10. Coupez la lumière transmise2.


12. Réajustez vos paramètres d’acquisitions si besoin5.


Si vous êtes sur un objectif à immersion







6. Nettoyez soigneusement l’objectif à immersion que vous venez d’utiliser avec du papier optique :



1 Voir Consignes de Sécurité p.6 2 Voir Initiation pilotage/manipulation du microscope p.9 3 Voir Installation de l’échantillon p.11 4 Voir Réalisation de la mise au point p.13 5 Voir Réglage des paramètres d’acquisition p. 19 6 Voir Acquisition et enregistrement d’images p.30








7. Déposez une nouvelle petite goutte d’huile sur la lentille de l’objectif3.

*


*







*


*



15. Réajustez vos paramètres d’acquisitions si besoin4.


1 Voir Installation de l’échantillon p.11 2 Voir Initiation pilotage/manipulation du microscope p.9 3 Voir Réalisation de la mise au point p.13 4 Voir Réglage des paramètres d’acquisition p. 19 5 Voir Acquisition et enregistrement d’images p.30



Rappel des paramètres d’acquisition d’une image

Nous avons déjà vu au chapitre « Enregistrement et rappel de configuration » p.17 comment rappeler une

configuration de trajet optique confocal. Cette technique permet de remettre en place rapidement le trajet optique

enregistré pour de futures acquisitions.

Si vous souhaitez comparer des images que vous avez acquises à la session 1 avec des images que vous allez faire à la

session 2, vous devez non seulement recharger la configuration du trajet optique confocal mais aussi l’intégralité des

autres réglages que vous aviez effectués (Résolution, Dynamique, % de transmission des lasers, Taille des pinholes,

Gain, Offset…). Si un des réglages varie d’une session à l’autre il n’est plus possible de comparer de façon quantitative

les images.

Pour vous remettre dans les mêmes conditions d’acquisitions (même trajet optique et mêmes réglages) qu’une image

de référence suivez la procédure suivante :

1. A partir de votre dossier local, faites glisser dans le logiciel « Zen » l’image dont vous voulez recharger les

paramètres.

2. L’image s’ouvre dans le logiciel.

3. Dans la partie basse de la zone « Image », dans l’onglet « Dimensions », cliquez sur l’icône « Reuse »

.

Cette option recharge alors le trajet optique confocal (avec l’objectif) et tous les paramètres qui ont été utilisés

pour acquérir l’image de référence.

*

ATTENTION / A NE PAS FAIRE : Si vous êtes avec un objectif à immersion et que vous souhaitez recharger des paramètres d’acquisition réalisés avec un objectif sec, NETTOYEZ D’ABORD VOTRE LAMELLE AVANT DE RECHARGER LES PARAMETRES AVEC LA FONCTION REUSE (Voir « Passage d’un objectif à immersion à un objectif sec » – p.42).

*


Fin de session

Veillez à respecter vos horaires de sessions. Pensez à garder du temps en fin de session pour réaliser les étapes de

récupération des échantillons, nettoyage et arrêt de l’équipement si besoin.

Etapes initiales Lorsque vous avez terminé vos acquisitions, suivez la procédure suivante :

1. Vérifiez que toutes les images que vous souhaitez conserver sont bien enregistrées (absence du logo sur

les images dans la colonne de sauvegarde des images1).

2. Fermez toutes les images ouvertes dans le logiciel.

a. Cliquez sur la 1ère image de la liste (dans la fenêtre de sauvegarde2).

b. Appuyez sur la touche SHIFT du clavier.

c. Tout en maintenant la touche SHIFT enfoncée, cliquez sur la dernière image de la liste (dans la fenêtre

de sauvegarde2). Toutes les images sont ainsi sélectionnées.

d. Cliquez sur l’icône « Supprimer » en dessous de la dernière image de la liste.

e. Si certaines images n’ont pas été enregistrées, un message vous propose de les enregistrer. Cliquez

sur « Yes » pour les enregistrer ou sur « No » pour les supprimer.

3. REDUISEZ (MAIS NE FERMEZ PAS) le logiciel grâce à l’icône de réduction . Ne cliquez pas

sur la croix.

4. Transférez vos images sur le serveur de stockage SCMRAID :

a. Rejoignez votre dossier personnel local (disque D:/). Pour rejoindre le lieu de stockage local vous

pouvez aussi double-cliquer sur l’icône « Stockage Local » 3.

b. Copiez votre dossier pour l’expérience du jour.

c. Ouvrez le serveur de stockage SCMRAID en double-cliquant sur l’icône « SCMRAID » 3.

1 Voir Copie d'écran 35 : Image non sauvegardée p.35 2 Copie d'écran 1 : Logiciel Zen p.2 – Zone 3 3 Voir Bureau de l’ordinateur



d. Rejoignez votre dossier personnel serveur.

e. Coller votre dossier expérience du jour.

5. Fermez les fenêtres du dossier local et serveur.

6. Vérifiez le planning de réservation en double-cliquant sur l’icône « Planning Semaine» 1.

Le planning de la semaine en cours s’ouvre :

Copie d'écran 41 : Planning de réservation de la semaine en cours

S’il y a un utilisateur juste après vous (exemple le 17 juin ci-dessus) ou s’il y a 1, 2 ou 3 heures de libre entre

vous et le suivant (exemple le 16 et 18 juin ci-dessus) suivez la procédure de fin n°1.

S’il y a 4 heures de libre ou plus entre vous et les suivants (exemple le 19 juin ci-dessus) ou si vous êtes le

dernier utilisateur de la journée (exemple le 20 juin) suivez la procédure de fin n°2.

1 Voir Bureau de l’ordinateur


Procédure de Fin n°1 – Sans arrêt de l’équipement



Cette procédure est à suivre uniquement si :

- Il y a un utilisateur juste après vous.

- Il y a un utilisateur 1, 2 ou 3 heures après vous.

Après avoir correctement suivi les étapes initiales de fin de session (voir Etapes initiales – p.48) suivez la procédure suivante :

1. Réouvrez la fenêtre du logiciel « Zen » en cliquant sur l’icône « Zen » dans la barre de tâches Windows.

2. Mettez-vous en mode « Ocular » l’option « Online » activée platine1.

3. Récupérez votre échantillon :

a. Descendez la tourelle d’objectif au maximum en utilisant une vis macrométrique (jusqu’à entre les

bips) 2.

b. Basculez délicatement la tête du statif vers l’arrière3.

c. Retirez votre lame du porte-objet.

d. Nettoyez soigneusement votre lame.

4. Si vous étiez sur un objectif à immersion, nettoyez soigneusement l’objectif (sinon passez directement à

l’étape 5) :



c. Repliez votre papier optique et ressuyez une nouvelle fois l’objectif délicatement.

d. Prenez un nouveau papier optique et pliez-le en 4. Imprégnez-le d’alcool à 50° puis essuyez une


e. Prenez un dernier papier optique et pliez-le en 4.

f. Essuyez délicatement l’objectif.

g. Répétez les étapes ci-dessus (a à g) pour les autres objectifs à immersion que vous auriez utilisés.


6. Remettez en place l’écran de protection pour la fluorescence4.

7. Nettoyez si besoin la platine avec un Kimtech imprégné d’alcool.

8. Nettoyez si besoin le bureau avec un Kimtech imprégné d’alcool.

9. Récupérez vos affaires personnelles.

10. Fermez bien la porte à clé en quittant le Service.

Votre session est maintenant terminée. Si vous avez le moindre doute ou si vous rencontrez une difficulté rapprochez-

vous immédiatement du Responsable de la Plate-Forme.

1 Voir Consignes de Sécurité p.6 2 Voir Initiation pilotage/manipulation du microscope p.9 3 Voir Installation de l’échantillon p.11 4 Voir Réalisation de la mise au point p.13



Procédure de Fin n°2 – Arrêt complet de l’équipement RAPPEL : Mettez-vous en mode « Ocular » l’option « Online » activée avant de passer mains ou objet dans la zone


Cette procédure est à suivre uniquement si :

- Il y a 4 heures ou plus de libre entre vous et l’utilisateur suivant.

- Vous êtes le dernier utilisateur de la journée.

Après avoir correctement suivi les étapes initiales de fin de session (voir Etapes initiales – p.48) suivez la procédure suivante :

1. Réouvrez la fenêtre LSM Zen en cliquant sur l’icône « Zen » dans la barre de tâches Windows.

2. Dans l’onglet « Acquisition », revenez en haut de la colonne de gauche en utilisant l’ascenseur si besoin pour

visualiser le panneau « Laser » :

Copie d'écran 42 : Panneau « Laser »

3. Dans le panneau « Laser », si vous l’avez allumé, cliquez sur le laser Argon/2 pour le mettre en surbrillance

puis dans le petit menu déroulant, cliquez sur l’icône « Standby » puis « Off » .

Copie d'écran 43 : Panneau « Laser » - Arrêt Laser Argon/2

Ceci va avoir pour conséquence de mettre le laser Argon/2 en refroidissement. Cette étape est indispensable

pour un arrêt correct de ce laser.

Il faut compter environ 5 minutes pour que le laser Argon/2 refroidisse.


1

2 3


>

Photo(s) 2 : Couleur rose = Laser en marche Photo(s) 3 : Couleur Jaune = Laser en refroidissement

Photo(s) 4 : Sans couleur = Le Laser a terminé son refroidissement

Pendant le temps du refroidissement du laser Argon/2 continuez la procédure (voir ci-dessous) :

4. Dans le panneau « Laser », si vous l’avez allumez, cliquez sur le laser HeNe1 pour le mettre en surbrillance puis

dans le petit menu déroulant, cliquez sur l’icône « Off » .

Copie d'écran 44 : Panneau « Laser » - Arrêt Laser HeNe1

2

1



1. Dans le panneau « Laser », si vous l’avez allumez, cliquez sur le laser HeNe2 pour le mettre en surbrillance puis

dans le petit menu déroulant, cliquez sur l’icône « Off » .

Copie d'écran 45 : Panneau « Laser » - Arrêt Laser HeNe2

2. Mettez-vous en mode « Ocular » l’option « Online » activée 1.

3. Fermez le logiciel « Zen » en cliquant sur l’icône de fermeture.

4. Une fois le transfert d’images terminé, coupez l’ordinateur :

a. Cliquez sur le « Logo Microsoft » (en bas à gauche de l’écran).

b. Cliquez sur « Shut Down ».

5. Récupérez votre échantillon :

a. Descendez la tourelle d’objectif au maximum en utilisant une vis macrométrique (jusqu’à entre les

bips) 1.

b. Basculez délicatement la tête du statif vers l’arrière2.

c. Retirez votre lame du porte-objet.

d. Nettoyez soigneusement votre lame.

6. Si vous étiez sur un objectif à immersion, nettoyez soigneusement l’objectif (sinon passez directement à

l’étape 7) :



c. Repliez votre papier optique et ressuyez une nouvelle fois l’objectif délicatement.

d. Prenez un nouveau papier optique et pliez-le en 4. Imprégnez-le d’alcool à 50° puis essuyez une


e. Prenez un dernier papier optique et pliez-le en 4.

f. Essuyez délicatement l’objectif.

g. Répétez les étapes ci-dessus (a à g) pour les autres objectifs à immersion que vous auriez utilisés.

1 Voir Initiation pilotage/manipulation du microscope p.9 2 Voir Installation de l’échantillon p.11

1

2


11

2


8. Remettez en place l’écran de protection pour la fluorescence2.

9. Nettoyez si besoin la platine avec un Kimtech imprégné d’alcool.

10. Nettoyez si besoin le bureau avec un Kimtech imprégné d’alcool.

11. Coupez la lampe HBO (Lampe Fluo).

12. Ne coupez pas le statif

13. Assurez-vous que le refroidissement du laser Argon est bien

terminé (la lumière jaune du laser doit être éteinte – voir Photo(s) 4 :

Sans couleur = Le Laser a terminé son refroidissement – p.52 et vous ne sentez

plus d’air sortir du ventilateur du laser).

1 Voir Installation de l’échantillon p.11 2 Voir Réalisation de la mise au point p.13

Photo(s) 5 : Arrêt lampe HBO

Photo(s) 6 : Ne coupez pas le statif

Photo(s) 7 : Vérification arrêt laser

Ventilation coupée Lumière

jaune éteinte



ATTENTION

Avant de réaliser l’étape 14 ci-dessous, assurez-vous que le laser Argon/2 a bien terminé son refroidissement. Il y a 3

indicateurs de refroidissement terminé :

- Le bruit de la ventilation s’arrête.

- La lumière jaune de refroidissement s’éteint.

- On ne sent plus de courant d’air au niveau du ventilateur du laser Argon.

Tant que le refroidissement n’est pas terminé ne réalisez SURTOUT PAS l’étape ci-dessous.

ATTENDEZ IMPERATIVEMENT LA FIN DU REFROIDISSEMENT.

14. Après-vous être assuré que le refroidissement du laser Argon est bien terminé (voir étape précédente),

mettez le « Remote Control » sur OFF.

15. Remettez la housse de protection du banc lasers en prenant soin de ne pas toucher la fibre optique.

Photo(s) 9 : Housse banc lasers

Photo(s) 8 : Arrêt « Remote Control »

Fibre

Optique


16. Remettez la house de protection du statif.

Veillez à ne pas recouvrir la lampe HBO avec la housse (la fente à l’arrière de la housse est prévue à cet effet).

Photo(s) 11 : Etat du microscope en fin de session avec procédure d’arrêt n°2 – Arrêt complet du microscope

17. Récupérez vos affaires personnelles.

18. Coupez la lampe de bureau.

19. Fermez bien la porte à clé en quittant le Service.

Votre session est maintenant terminée. Si vous avez le moindre doute ou si vous rencontrez une difficulté rapprochez-

vous immédiatement du Responsable de la Plate-Forme.

Photo(s) 10 : Housse statif



Procédures en cas d’incident EN CAS D’URGENCE TECHNIQUE OU D’INCIDENT SUR UN EQUIPEMENT, RAPROCCHEZ VOUS IMMEDIATEMENT DU

RESPONSABLE DE LA PLATE-FORME. EN CAS D’ABSENCE DU RESPONSABLE DE LA PLATE-FORME SUIVEZ LES

PROCEDURES CI-DESSOUS.

Procédure Urgence Technique – En cas d’absence du

Responsable de la Plate-Forme

ATTENTION

Cette procédure concerne uniquement les problèmes relatifs aux locaux du SCM. Ne

concerne pas les incidents relatifs aux microscopes.

En cas de problème dans une pièce

Si vous constatez une anomalie dans une pièce du SCM (fuite d’eau, coupure d’électricité…) contactez immédiatement

l’atelier (Service Technique) du site et décrivez le problème.

En cas de besoin, insistez sur le caractère urgent d’une intervention ; si par exemple de l’eau menace de tomber sur

un microscope.

A contacter en priorité :

1- Responsable Atelier – Pierre THIBAULT

2- Accueil Service Technique 3- Accueil Atelier

Tél. : 01 42 86 20 19 Port. : 06 15 36 60 46

Tél. : 01 42 86 20 16 Tél. : 01 42 86 41 24

Si pas de réponse vous pouvez essayer de contacter :

4- Responsable sécurité – André HOMBRADOS

5- PC Sécurité

Tél. : 01 42 86 20 20 Tél. : 01 42 86 20 22 ou 01 42 86 20 23

Envoyez un e-mail à l’adresse suivante : [email protected] pour signaler le problème.

mailto:[email protected]


Si vous entendez ou voyez de l’eau couler du plafond

Si l’eau menace de tomber sur un microscope :

1- Coupez immédiatement le microscope en respectant bien la procédure d’arrêt complet du microscope

(Voir Procédure de Fin n°2 – Arrêt complet de l’équipement p.51).

2- Protégez le microscope avec les bâches que vous trouverez dans le meuble à clapets gris foncé situé en

face du Microscope Confocal 1 - Zeiss LSM 510 (casier du bas noté : BACHES DE PROTECTION).

3 tailles de bâches sont disponibles : Small, Medium et Large.

3- Contactez le plus rapidement possible le Responsable de l’Atelier (voir fiche de contact ci-dessus).

4- Envoyez un e-mail à l’adresse suivante : [email protected] pour signaler l’incident.




Procédure en cas d’incident Equipement En cas d’incident sur un équipement, rapprochez-vous immédiatement du Responsable de la Plate-Forme. En cas

d’absence du Responsable de la Plate-Forme, suivez les procédures ci-dessous :

En cas d’absence du Responsable de la Plate-Forme :

Si vous rencontrez un problème lors de l’utilisation d’un équipement et que le Responsable de la Plate-Forme n’est

pas disponible, vous pouvez contacter :

- M. TOURAIN Christophe

N° de Poste : 01 42 86 21 08

E-Mail : [email protected]

Localisation : 3ème étage – Pièce P326

N’oubliez pas d’envoyer un e-mail à l’adresse suivante : [email protected] pour notifier l’incident.

Si vous ne trouvez personne pour résoudre le

problème :

Si personne ne peut vous aider, merci de remplir le formulaire « Incident Microscope » disponible sur le site du SCM

à l’adresse suivante :

http://www.biomedicale.univ-paris5.fr/scm/formulaire_incident_equipement

Vous pouvez accéder directement à ce formulaire en double cliquant sur le lien présent sur chaque bureau

d’ordinateur de la Plate-Forme.



http://www.biomedicale.univ-paris5.fr/scm/formulaire_incident_equipement


Table des illustrations

Copies d’écran Copie d'écran 1 : Logiciel Zen ............................................................................................................................................ 2

Copie d'écran 2 : Panneau ouvert ..................................................................................................................................... 4

Copie d'écran 3 : Panneau fermé ...................................................................................................................................... 4

Copie d'écran 4 : Fenêtre d’ouverture du logiciel Zen ...................................................................................................... 7

Copie d'écran 5 : Panneau « Login ZEN 2009 » - Démarrage du logiciel Zen ................................................................... 7

Copie d'écran 6 : Initialisation du logiciel ......................................................................................................................... 7

Copie d'écran 7 : Onglet Ocular ........................................................................................................................................ 9

Copie d'écran 8 : Liste Objectifs ...................................................................................................................................... 11

Copie d'écran 9 : Panneau Laser ..................................................................................................................................... 14

Copie d'écran 10 : Fenêtres "Imaging Setup" et "Light Path" ......................................................................................... 15

Copie d'écran 11 : Réglage du trajet optique - LSM 510 vs LSM ZEN ............................................................................. 16

Copie d'écran 12 : Enregistrement configuration 1 ........................................................................................................ 17

Copie d'écran 13 : Enregistrement configuration 2 ........................................................................................................ 17

Copie d'écran 14 : Rappel configuration ......................................................................................................................... 17

Copie d'écran 15 : Choix d'une configuration enregistrée.............................................................................................. 18

Copie d'écran 16 : Acquisition Mode - Détails ................................................................................................................ 19

Copie d'écran 17 : Channels - Détails .............................................................................................................................. 21

Copie d'écran 18 : Panneau « Z-Stack » - Réglage de l’intervalle en Z ........................................................................... 22

Copie d'écran 19 : Icône « Auto Exposure » ................................................................................................................... 23

Copie d'écran 20 : Zone « Image » .................................................................................................................................. 24

Copie d'écran 21 : Fenêtre « Image » - Image Splitée .................................................................................................... 24

Copie d'écran 22 : Icône « Live » .................................................................................................................................... 25

Copie d'écran 23 : Passage en mode « Range Indicator » 1 ........................................................................................... 25

Copie d'écran 24 : Passage en mode « Range Indicator » 2 ........................................................................................... 26

Copie d'écran 25 : Recherche du Z le plus intense ......................................................................................................... 26

Copie d'écran 26 : Réglage « Gain Master» .................................................................................................................... 27

Copie d'écran 27 : Ajustement "Digital Offset" .............................................................................................................. 28

Copie d'écran 28 : Icône «Stop » .................................................................................................................................... 28

Copie d'écran 29 : Image simple acquise ........................................................................................................................ 31

Copie d'écran 30 : Barre de progression ......................................................................................................................... 31

Copie d'écran 31 : Option « Z-Stack » ............................................................................................................................. 32

Copie d'écran 32 : Icônes « Set First » & « Set Last » ..................................................................................................... 33

Copie d'écran 33 : Icône « Start Experiment » ............................................................................................................... 34

Copie d'écran 34 : Barre de progression - Z-Stack .......................................................................................................... 34

Copie d'écran 35 : Image non sauvegardée .................................................................................................................... 35

Copie d'écran 36 : Sauvegarde – Etape 2 ........................................................................................................................ 35

Copie d'écran 37 : Fenêtre « Save As » ........................................................................................................................... 36

Copie d'écran 38 : Menu « Save in » ............................................................................................................................... 36

Copie d'écran 39 : Champ « File name » ......................................................................................................................... 36



Copie d'écran 40 : Localisation des outils d’exploration de l’image (zones encadrées en bleu) .................................... 38

Copie d'écran 41 : Planning de réservation de la semaine en cours .............................................................................. 49

Copie d'écran 42 : Panneau « Laser » ............................................................................................................................. 51

Copie d'écran 43 : Panneau « Laser » - Arrêt Laser Argon/2 .......................................................................................... 51

Copie d'écran 44 : Panneau « Laser » - Arrêt Laser HeNe1 ............................................................................................ 52

Copie d'écran 45 : Panneau « Laser » - Arrêt Laser HeNe2 ............................................................................................ 53

Photos Photo(s) 1 : Variateur lumière ........................................................................................................................................ 11

Photo(s) 2 : Couleur rose = Laser en marche .................................................................................................................. 52

Photo(s) 3 : Couleur Jaune = Laser en refroidissement ................................................................................................... 52

Photo(s) 4 : Sans couleur = Le Laser a terminé son refroidissement ............................................................................... 52

Photo(s) 5 : Arrêt lampe HBO ......................................................................................................................................... 54

Photo(s) 6 : Ne coupez pas le statif ................................................................................................................................. 54

Photo(s) 7 : Vérification arrêt laser ................................................................................................................................. 54

Photo(s) 8 : Arrêt « Remote Control » ............................................................................................................................ 55

Photo(s) 9 : Housse banc lasers ...................................................................................................................................... 55

Photo(s) 10 : Housse statif .............................................................................................................................................. 56

Photo(s) 11 : Etat du microscope en fin de session avec procédure d’arrêt n°2 – Arrêt complet du microscope ......... 56




Pour toute remarque ou suggestion concernant ce guide

merci d’envoyer un e-mail à l’adresse suivante :

[email protected]

Documents

Service Commun de Microscopie · 2017. 8. 29. · Tutoriel – Migration vers le logiciel de pilotage Zen pour piloter le Microscope Confocal 1– Précis – 08/2014 Version 1 –