Microscopie Optique Theorique Et Appliquee 2009

[MICROSCOPIE OPTIQUE THORIQUE ET APPLIQUE AUX SCIENCES BIOMDICALES]

2 novembre 2009

MICROSCOPIE OPTIQUE THEORIQUE ET APPLIQUEE AUX SCIENCES BIOMEDICALESSOMMAIREIntroduction.................................................................................................................................................... 1 1 La microscopie optique (photonique) fond clair ..................................................................................... 3 1.1 1.2 1.2.1 1.2.2 2 2.1 2.1.1 2.1.2 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 3 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.4 3.5 Principe du microscope optique compos ....................................................................................... 3 Principaux lments du microscope fond clair .............................................................................. 6 La partie mcanique ................................................................................................................... 6 Les parties optiques.................................................................................................................... 7 Selon loptique gomtrique............................................................................................................ 7 Trajet des rayons dclairage ...................................................................................................... 7 Trajet des rayons de formation de limage ................................................................................... 9 Selon loptique physique ................................................................................................................. 9 Quelques notions sur les ondes lectromagntiques visibles ...................................................... 9 Interfrence ...............................................................................................................................10 Diffraction ..................................................................................................................................11 Thorie dAbbe ..........................................................................................................................12 Les objectifs ..................................................................................................................................13 Limite de sparation et pouvoir sparateur .................................................................................13 Ouverture numrique .................................................................................................................14 Aberrations ................................................................................................................................16 Autres caractristiques ..............................................................................................................16 Objectifs corrigs linfini ..........................................................................................................17 Le condenseur du microscope photonique fond clair ...................................................................18 Les oculaires .................................................................................................................................19 Principales caractristiques .......................................................................................................19 Oculaire micromtriques et mesure au microscope ....................................................................20 Collecteur et source de lumire .....................................................................................................20 Lclairage de Khler et lutilisation du microscope photonique fond clair ....................................21

La formation de limage ........................................................................................................................... 7

Connatre et utiliser les diffrents lments du microscope optique ........................................................13

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Les autres techniques microscopiques photoniques utilises en sciences biomdicales .........................22 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.3 4.3.1 4.3.2 4.4 4.4.1 4.4.2 4.5 La microscopie fond noir .............................................................................................................22 Principe .....................................................................................................................................22 Elment optique spcifique ........................................................................................................22 Domaine dutilisation..................................................................................................................23 La microscopie en contraste de phase ...........................................................................................23 Principe .....................................................................................................................................23 Elments optiques spcifiques ...................................................................................................24 Domaine dutilisation..................................................................................................................24 La microscopie Contraste Interfrentiel Diffrentiel (DIC) ............................................................24 Principe .....................................................................................................................................25 Domaine dutilisation..................................................................................................................25 La microscopie fluorescence (classique) .....................................................................................26 Principe .....................................................................................................................................26 Elments optiques spcifiques ...................................................................................................26 La microscopie confocale ( balayage laser) ..................................................................................26

Annexes .......................................................................................................................................................28 Liste simplifie des principaux sigles inscrits sur le corps des objectifs (extrait du site Le microscope optique fond clair par Jean-Pierre GAVERIAUX) .................................................................................................28 Longueur du tube optique et principe de la correction linfini des microscopes rcents ............................29 Les couleurs (Extrait de http://www.iconeoclaste.com/index.php)...............................................................29 Lutilisation du microscope photonique fond clair ....................................................................................30 Rfrences bibliographiques .........................................................................................................................34 Ouvrages ..................................................................................................................................................34 Ressources numriques ............................................................................................................................34 Documents en ligne ...............................................................................................................................34 Sites de fabricants de matriel pour la microscopie optique (liste non exhaustive) ..................................34


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MICROSCOPIE OPTIQUE THEORIQUE ET APPLIQUEE AUX SCIENCESBIOMEDICALESINTRODUCTION La microscopie permet grce l'utilisation de microscopes d'observer des objets trop petits pour tre vus l'il nu en fournissant des images agrandies de ces derniers.Anciennement deux grandes classes d'instruments de microscopie taient dcrites selon la nature plutt ondulatoire (notion de longueur d'onde lambda) ou corpusculaire (photons, lectrons ...) des faisceaux de radiations1 utiliss pour former ces images agrandies. Aujourd'hui cette classification simplifie ne tient plus ; certains instruments utilisent les proprits des ondes acoustiques, d'autres lexistence de nuages dlectrons au voisinage des surfaces conductrices (effet tunnel), ou bien encore les champs de forces attractives entre corps proches (force atomique) ou les proprits des ondes lumineuses dites vanescentes. En microscopie optique l'utilisation d'ondes du domaine du visible, de l'ultraviolet et du proche infrarouge ncessite de prendre en considration la fois les aspects ondulatoires et corpusculaires de ces radiations lectromagntiques dans la formation de l'image.

FIGURE 1 : SPECTRE DES ONDES ELECTROMAGNETIQUES

Ainsi nous verrons que l'optique gomtrique 2 qui ne prend pas en compte la dualit ondulatoire et corpusculaire de la lumire ne permet pas d'expliquer compltement la formation de l'image d'objet microscopique ; C'est l'optique ondulatoire (ou optique physique) qui a permis au physicien Ernst ABBEa de concevoir les systmes optiques retrouvs dans nos microscopes modernes.

1

La nature corpusculaire est la caractristique principale des radiations de petite longueur d'onde alors que la nature ondulatoire caractrise les radiations de grande longueur d'onde. 2 En optique gomtrique : a. les rayons lumineux restent indpendants les uns des autres (pas dinteraction entre eux) ; b. dans un milieu homogne, transparent et isotrope, les rayons lumineux sont des lignes droites ; c. la surface de sparation de deux milieux, les rayons lumineux obissent aux lois de Snell-Descartes (pour la rflexion et la rfraction) et suivent le principe du retour inverse (rciprocit source - destination)Acadmie de Grenoble Formation continue STI-BIO-BGB | Introduction Page 1 sur 36


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Enfin nous verrons que malgr la diversit des techniques misent en uvre dans le domaine des sciences biomdicales (microscopie photonique fond clair, fond noir, contraste de phase et fluorescence pour les principales), le microscope optique est toujours constitu des lments suivants: o o o o une optique d'clairage (source et un dispositif de focalisation de rayonnement lumineux sur l'objet; une optique de formation de l'image (association de plusieurs lentilles assurant la fonction d'agrandissement); un dtecteur permettant l'observation ou l'enregistrement de l'image (il, cran, camra, appareil photographique, ) ; une partie mcanique de prcision (permettant le dplacement et le positionnement prcis de l'chantillon microscopique).

En biologie, l'chantillon est le plus souvent partiellement transparent la lumire et est positionn entre l'optique d'clairage et l'optique de formation de l'image ; on parle d'observation en transmission (diascopie). Autour de ce principe gnral, les microscopes modernes peuvent prsenter une grande varit d'clairements et de modes d'observation.

FIGURE 2 : MICROSCOPE OPTIQUE (DROIT)


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FIGURE 3 : MICROSCOPE OPTIQUE INVERSE

1

LA MICROSCOPIE OPTIQUE (PHOTONIQUE ) A FOND CLAIR

Dans la microscopie photonique fond clair l'image forme par la lumire dvie est vue sur un fond de lumire non dvie.

1.1

P RINCIPE DU MICROSCOPE OPTIQUE COMPOSE

La loupe est un instrument doptique assimilable une lentille convergente simple ; elle est classiquement utilise pour observer : des objets opaques ; et fournie par rflexion (piscopie) une image relle 3 situe classiquement dans une gamme de grossissement allant de x2 x50. Dans un microscope optique (compos) lassociation de lentilles convergentes (objectif puis oculaire) permet dobserver : par transparence (diascopie) des objets trs petits (le plus souvent invisibles lil nu) grce une distance objet - objectif (1re lentille convergente) trs faible (infrieure la distance focale de lobjectif) ; et fourni une image relle3 situe classiquement dans une gamme de grossissement allant de x100 x1000.3

Terme utilis en optique pour dsigner toute image qui se forme aprs la face de sortie d'un instrument d'optique (dans le sens de parcours de la lumire). Si un cran est plac au lieu o se forme l'image, elle devient alors gnralement visible.Acadmie de Grenoble Formation continue STI-BIO-BGB | La microscopie optique (photonique) fond clair Page 3 sur 36


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La formation et les caractristiques de limage dun objet fournie par une lentille convergente dpendent : o de sa distance focale4 o et de la position de lobjet par rapport cette lentille.

FIGURE 4 : LENTILLE CONVERGENTE ET FORMATION D'IMAGE

A : pour un objet situ plus de deux fois la distance focale (loin de la lentille convergente) une image relle inverse et rduite de lobjet est obtenue ; B : pour un objet situ exactement deux fois la distance focale on obtient une image inverse de dimension identique lobjet ; C : pour un objet situ entre une et deux fois la distance focale on obtient une image relle agrandie et inverse (cas de lobjectif du microscope) ; D : Aucune image pour un objet situ exactement une fois la distance focale de la lentille ; E : pour un objet situ moins dune fois la distance focale de la lentille une image virtuelle agrandie est obtenue (situation de loculaire du microscope).

4

La distance focale d'un systme optique est la mesure de sa puissance de convergence (focus) ou divergence (diffusion) de la lumire. Un systme avec une longueur de focale plus courte a plus de puissance optique qu'un autre avec une longue focale. Les distances focales, respectivement objet et image, d'un systme optique centr convergent ou divergent sont, par dfinition, les distances algbriques sparant respectivement le plan principal objet H (ou centre optique pour les lentilles minces) du foyer objet F et le plan principal image H (ou centre optique pour les lentilles minces) du foyer image F. Elles sont souvent notes respectivement et .Acadmie de Grenoble Formation continue STI-BIO-BGB | La microscopie optique (photonique) fond clair Page 4 sur 36


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Le microscope optique compos est form de deux groupes de lentilles, lobjectif et loculaire que lon peut assimiler deux lentilles convergentes.

FIGURE 5 : PRINCIPE SIMPLIFIE DE FORMATION DE L'IMAGE AVEC UN MICROSCOPE OPTIQUE

Lobjectif du microscope est un premier systme convergent de trs courte distance focale (mesure en mm) qui fourni de lobjet (AB) une image relle intermdiaire agrandie et inverse de lobjet (A1B1), lintrieur du tube oculaire mais au-del du foyer objet 5 de ce deuxime systme optique (entre le foyer et le centre optique6 de loculaire) ; Loculaire est alors un second systme convergent de distance focale moyenne (quelques cm) qui agit comme une loupe sur limage relle fournie par lobjectif et permet finalement lobservateur de voir une 7 image virtuelle inverse trs agrandie de lobjet (A2B2). Dans son principe le microscope peut tre compar au projecteur de diapositive pour lequel un objet transparent de taille rduite (la diapositive) est travers par les rayons lumineux dune source (diascopie) pour fournir via un systme de lentilles (lobjectif) une image agrandie et inverse sur un cran (image relle inverse contenue dans le tube oculaire). Remarque : Cette analogie permet de deviner quen microscopie comme en matire de projection de diapositive, la qualit de limage observe est trs directement lie aux qualits de lobjet et de lobjectif5

En optique, un foyer est un point vers lequel convergent les rayons lumineux issus d'un point aprs leur passage dans un systme optique. Le foyer objet est le point objet dont l'image se trouve l'infini sur l'axe optique principal 6 Point particulier d'un systme tel qu'un rayon lumineux incident en ce point n'est pas dvi. 7 Terme utilis en optique pour dsigner toute image qui se forme avant la face de sortie d'un instrument d'optique (dans le sens de parcours de la lumire) et ne peut donc pas tre visualise sur un cran.Acadmie de Grenoble Formation continue STI-BIO-BGB | La microscopie optique (photonique) fond clair Page 5 sur 36


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(vritable cur du microscope) mais aussi aux conditions dobservation (en limitant par exemple au maximum la lumire parasite).

1.2

P RINCIPAUX ELEMENTS DU MICROSCOPE A FOND CLAIR

1.2.1 L A PARTIE MECANIQUEElle est constitue : o o o o o du statif compos dun pied et dune potence ; de la platine porte objet surmonte dun chariot guide objet ; du tube binoculaire ; du revolver porte objectif ; des vis macromtriques et micromtriques de mise au point.

Dans le dtail la partie mcanique comprend :

FIGURE 6 : ELEMENTS DE LA PARTIE MECANIQUE DU MICROSCOPE A FOND CLAIR

1 : tube binoculaire 2 : vis de blocage du tube binoculaire 3 : potence du statif 4 : sur platine (ou chariot) guide objet 5 : vis micromtrique de mise au point 6 : vis micromtrique de mise au point 7 : vis de dplacement bidirectionnel du chariot guide objet 8 : pied du statif 9 : vis de centrage du collecteur 10 : vis de rglage de hauteur du condenseur 11 : platine porte-objet 12 : chevalet de fixation de lame porte-objet 13 : revolver porte-objectif.

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1.2.2 L ES PARTIES OPTIQUESOn trouve : o Une optique dclairage compose principalement dune source lumineuse (lampe halogne) intensit dclairage rglable et surmonte dun collecteur et dun condenseur ; o Une optique de formation de limage comprise entre la lentille frontale de lobjectif et le verre dil de loculaire Dans le dtail ces lments sont :

FIGURE 7 : ELEMENTS DES PARTIES OPTIQUES DU MICROSCOPE A FOND CLAIR

1 : potentiomtre de rglage de lintensit lumineuse 2 : diaphragme de champ 3 : cage de la source lumineuse 4 : collecteur de lumire 5 : filtre bleu ou lumire du jour 6 : diaphragme douverture 7 : condenseur 8 : lentille frontale dobjectif 9 : corps de lobjectif 10 : glissire de rglage de lcartement inter pupillaire 11 : oculaire rglage dioptrique 12 : verre dil de loculaire.

22.1

LA FORMATION DE LIMAGES ELON LOPTIQUE GEOMETRIQUE

Dans les sciences biologiques, le microscope fond clair permet de projeter sur la rtine de lobservateur une image, transmise par lobjet microscopique illumin par la lumire de la source (diascopie). Nous savons que ce microscope permet grce lassociation objectif oculaire, la formation en deux stades dune image agrandie relle de lobjet sur la rtine de lobservateur ( 1.1.). Dans le cas du microscope photonique fond clair, la formation de limage sur la rtine de lobservateur ncessite de considrer dune part le trajet des rayons dclairage et dautre part ceux de formation de limage.

2.1.1 TRAJET DES RAYONS DECLAIRAGELassociation collecteur condenseur permet lobtention dun fond uniformment clair (en labsence dobjet); chaque point de la source claire lensemble du champ dobservation et de la rtine.

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Le rglage convenable du collecteur et du condenseur ( systmes optiques diaphragms) permet de former successivement trois images de la source8 (S) : S1. Dans le plan focal du condenseur ; S2. Dans le plan focal arrire de lobjectif ; S3. Dans le cristallin.

FIGURE 8 ET 8 BIS : TRAJET DES RAYONS D'ECLAIRAGE DU MICROSCOPE A FOND CLAIR

En pratique Lobtention dune image correctement contraste et fidle de lobjet microscopique observ, ncessite doptimiser le trajet optique des rayons dclairage en rglant correctement le couple collecteur condenseur aprs la mise au point sur lobjet microscopique ; C'est--dire une fois que la longueur du trajet optique des rayons de formation de limage est fixe. Lclairage de Khler est une procdure permettant de rationaliser et doptimiser lutilisation du couple collecteur condenseur de loptique dclairage du microscope.

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Les plans de formation de ces images sont qualifis de combinaison optique car chaque plan cre une image optique du prcdentAcadmie de Grenoble Formation continue STI-BIO-BGB | La formation de limage Page 8 sur 36


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2.1.2 TRAJET DES RAYONS DE FORMATION DE LIMAGELassociation collecteur condenseur focalise la lumire de la source de telle sorte que chaque point de lobjet (I1) est clair par lensemble de la source et conduit un point : dans limage intermdiaire agrandie inverse fournie par lobjectif (I2); dans limage relle finale projete sur la rtine via loculaire (I3)

FIGURE 9 ET 9 BIS : TRAJET DES RAYONS DE FORMATION DE L'IMAGE DANS LE MICROSCOPE A FOND CLAIR

Pour un microscope photonique fond clair correctement rgl on observe que le trajet optique des rayons dclairage et le trajet optique des rayons de formation de limage ont des parcours croiss se terminant tous les deux sur la rtine de lobservateur.

2.2

S ELON LOPTIQUE PHYSIQUE

2.2.1 QUELQUES NOTIONS SUR LES ONDES ELECTROMAGNETIQUES VISIBLESLoptique gomtrique permet de prvoir le trajet des rayons lumineux entrant en interaction avec des surfaces lisses ; le trac des rayons lumineux ( lignes droites ) permet de positionner limage dun objet fournie par un systme optique mais ne fournie pas dlments sur les qualits ou proprits de cette image. Pour expliquer de faon satisfaisante la formation des images microscopiques il est ncessaire de dcrire dans quelles mesures les rayons lumineux ou ondes lumineuses sont affectes par lobjet microscopique. Loptique physique ou ondulatoire permet dapprhender linteraction des ondes lectromagntiques lumineuses avec les objets.


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Les ondes lectromagntiques peuvent tre en partie dcrites par diffrents paramtres tels que lamplitude q, la longueur donde (lambda) et la phase.

FIGURE 10 : ONDE ELECTROMAGNETIQUE (OSCILLATION COUPLEE DU CHAMP ELECTRIQUE ET DU CHAMP MAGNETIQUE)

Dans le domaine du visible : La longueur donde dtermine la couleur de londe lectromagntique ; Le carr de son amplitude dtermine lintensit lumineuse de londe lectromagntique ; La phase nest pas toujours perue par lil.

2.2.2 INTERFERENCELinterfrence peut sobserver pour des ondes de frquence identique dans un mme milieu lorsquelles se combinent pour former une nouvelle onde unique.

FIGURE 11 : PRINCIPE DE L'INTERFERENCE ENTRE ONDES ELECTROMAGNETIQUES

Lorsque deux ondes voluent dans la mme direction et sont en phase, leurs amplitudes s'ajoutent. L'intensit de la lumire produite par la nouvelle onde sera gale la somme des deux ondes initiales. On parle dinterfrence constructive. Si ces deux ondes voluent avec une diffrence de phase, amplitudes positive et ngative s'ajoutent. Dans le cas particulier dun dphasage dune demi-longueur donde, l'amplitude de l'onde rsultante sera zro, tout comme l'intensit lumineuse. On parle dinterfrence destructive.


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2.2.3 DIFFRACTIONLorsquune onde rencontre un objet qui ne lui est pas totalement transparent, on peut considrer que chaque point de lobjet est susceptible dentrainer une diffusion de cette onde. Cest le phnomne de diffraction. La thorie (simplifie) de la diffraction, considre que chaque point atteint par une onde se comporte comme une source secondaire qui rmet une onde sphrique de mme frquence, mme amplitude et mme phase. Les figures de diffraction rsultent de l'interfrence des ondes sphriques mises par l'ensemble des sources secondaires.

FIGURE 12 : PRINCIPE DE LA DIFFRACTION

Ainsi lorsquune onde lectromagntique visible passe par un trou (une fente) de taille quivalente sa longueur donde le phnomne de diffraction permet dobserver des figures de diffraction gomtriques particulires : - une succession danneaux clairs et sombres concentriques pour un trou ; - une succession de bandes claires et sombres pour une fente.

FIGURE 13 ET 13 BIS : REPRESENTATIONS DE LA FIGURE DE DIFFRACTION OBTENUE PAR UN TROU

FIGURE 14 ET 14 BIS : REPRESENTATIONS DE LA FIGURE DE DIFFRACTION OBTEBUE PAR UNE FENTE


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Les zones claires sont dfinies comme des maxima, tandis que les zones sombres sont des minima. Le maximum central correspond l'image de la fente (ou du trou) et correspond la lumire non diffracte (directe) ; ces rayons sont dit d'ordre zro et limage cre suit les lois de l'optique gomtrique. Les maxima suivants sont dits de 1er, 2me, 3me ordre, prcds d'un signe + ou sont caractriss par les lois de l'optique des ondes. Langle de diffusion des rayons diffracts augmente avec le numro dordre du maxima considr.FIGURE 15 : ANGLES DE DIFFUSION ET MAXIMUM DE 1 ORDRE OBTENUS PAR UNE SERIE DE FENTESER

ET 2

ND

2.2.4 THEORIE DABBEPour expliquer la formation de l'image microscopique, Ernst Abbea assimile lobjet microscopique un ensemble de trous et de fentes ( fin rseau) sources secondaires dondes sphriques (Cf ciavant) lorigine de rayons diffracts de diffrents ordres. Un tel objet va ainsi diviser la lumire incidente qui le traverse en : Une lumire non dvie ( rayons dordre 0 non diffracts) que lon peut assimiler un clairage du fond ne contenant pas dinformation sur l'objet ; Un cne de lumire dvie ( ensemble de rayons diffracts de diffrents ordres) contenant des informations concernant l'objet. Lobjectif (systme optique convergent parfait) permet la lumire non dvie (maxima dorde 0 ; image primaire) et la lumire dvie (maxima dordre suprieur ; images secondaires) dinteragir ( dinterfrer). La formation dune image agrandie fidle et complte ( avec ses variations dintensit) de lobjet microscopique dans le plan image intermdiaire du tube optique rsulte de la formation de la figure de diffraction dans le plan focal arrire de lobjectif et des interfrences constructives et destructives de lensemble de ces rayons convergents.

FIGURE 16 : PRINCIPE DE LA FORMATION D'IMAGE EN MICROSCOPIE SELON LA THEORIE D'ABBE Acadmie de Grenoble Formation continue STI-BIO-BGB | La formation de limage Page 12 sur 36


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La qualit de l'image perue travers l'oculaire est lie au nombre dimages secondaires ayant interfres avec limage primaire ; une image convenable peut tre obtenue ds que les faisceaux dvis correspondant au maximum de premier ordre sont passs travers l'objectif pour interfrer avec la lumire non dvie. En pratique Pour obtenir un nombre d'images secondaires lev, il faut un objectif avec un angle dadmission suffisant ; c'est--dire une grande O.N.

33.1

CONNAITRE ET UTILISER LES DIFFERENTS ELEMENTS DU MICROSCOPE OPTIQUEL ES OBJECTIFS

Cest lobjectif qui fourni limage agrandie inverse qui sera grossie et vue via les oculaires par lobservateur ; la qualit de cette image est fixe par les caractristiques de lobjectif qui se trouve ce titre tre llment principal dterminant la qualit dun microscope optique.

3.1.1 L IMITE DE SEPARATION ET POUVOIR SEPARATEURLes phnomnes de diffraction limitent le pouvoir sparateur du microscope optique en ne donnant pas une image ponctuelle dun point objet mais une tache de diffraction. Limage dun trou parfaitement circulaire donne disque lumineux entoure danneaux concentriques alternativement clairs et sombres ; cette figure de diffraction est appele tache dAiry ou disque de confusion9.

FIGURE 17 : LIMTE DE RESOLUTION ET FIGURES DE DIFFRACTION DE DEUX FENTES PROCHES

De A C le rapprochement des deux fentes conduit pour une fusion des taches de diffractions pour ne former plus quune image unique des deux fentes.9

Le rayon du disque d'Airy (rayon du 1 zro cercle sombre) est li la longueur d'onde et l'ouverture numrique O.N. du dispositif optique.Acadmie de Grenoble Formation continue STI-BIO-BGB | Connatre et utiliser les diffrents lments du microscope optique Page 13 sur 36

er


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Ainsi deux points trs proches donneront des images qui vont se chevaucher pouvant mme fusionner en une tache unique ; la distance entre ces deux points objet est alors infrieure la limite de sparation (note d) du microscope. (i)

Le pouvoir sparateur du microscope (ou rsolution), c'est--dire la capacit distinguer deux points adjacents comme distincts est linverse de la limite de sparation. Il augmente donc avec la diminution de la limite de sparation. Pour un objectif donn ayant un angle dadmission des rayons marginaux laxe optique fix ( soit 2 pour lamplitude du cne de lumire pntrant lobjectif), le pouvoir sparateur du microscope dpend donc : de la longueur donde utilise ; et de lindice de rfraction n du milieu qui spare lobjet microscopique de la lentille frontale de lobjectif.

FIGURE 18 : ANGLE

ET OUVERTURE NUMERIQUE

3.1.2 OUVERTURE NUMERIQUEL'ouverture numrique ON (ou numerical aperture NA) a pour dfinition : (ii) O. N. = n sin

O n est l'indice de rfraction dans le milieu d'observation (1 pour l'air), et est l'angle entre l'axe optique et le rayon (le plus cart de l'axe optique) qui entre dans la lentille (le demi-angle d'ouverture). Do (i) et (ii) d = 0,6 / O. N.

Lhuile immersion permet daugmenter n (de 1 1,52) et donc le pouvoir sparateur. Les objectifs focale trs courte ont un plus grand angle ; plus est grand, meilleures sont la luminosit (plus de rayons lumineux se trouvent collects) et la rsolution. Pour un objectif distance de travail D (ou working distance WD) et profondeur de champ z sont aussi des caractristiques lies lO.N. les meilleurs objectifs grande ouverture numrique (1,0