SUR LA COLORATION HISTOLOGIQUE CONTRASTEE DES HYPHES CHEZ LES INSECTES ATTEINTS DE MYCOSE

Ent. exp. & appl. 9 (1966): 433--443. North-Holland Publishing Co., Amsterdam

S U R LA C O L O R A T I O N H I S T O L O G I Q U E C O N T R A S T E E DES

H Y P H E S C H E Z LES I N S E C T E S A T T E I N T S DE M Y C O S E

PAR

P. FERRON, A. M. HUGER et E. MULLER-KOGLER

Institut National de la Recherche Agronomique, Station de Recherches de Lutte biologique et de Biocoenotique, La Mini~re par Versailles, France, et

Biologische Bundesanstalt ffir Land- und Forstwirtschafl, Institut far biologische Schgdlings- bek~impftmg, Darmstadt, Allemagne

Pour la mise en 6vidence histopathologique du mode d'infe~tion des insectes par les champignons pathog~nes, des colorations trSs contrast6es des hyphes sont n&essaires. C'est pourquoi nous avons compar6 les m&hodes appropri6es les plus r6centes de la mycologie m6dicale sur des coupes d'une larve de Melolontha melolontha atteinte par Beauveria tenella. La coloration de DE PALMA & YOUNG (1963) s'est av6r6e excellente et simple; les m6thodes de GROCOTT (1955), ainsi que de KELLY, MORGAN & SAINt (1962) donnent 6galement de boris r6sultats.

Le d6veloppement des recherches dans le domaine de la lutte microbiologique contre les insectes nuisibles implique l'exacte connaissance du ou des modes d'infection de l'h6te par les agents pathog6nes. En ce qui concerne les maladies dues ~t des champignons entomopathog6nes, MgrLLF, R-K6GLEg (1965) a discut6 des diff6rents aspects de ce probl6me sur de nombreux exemples. Darts la plupart des cas, les auteurs s'accordent ~t consid6rer que la p6n6tration des hyphes dans le corps de l'insecte s'effectue/t travers le t6gument; n6anmoins, quelques observations ont montr6 que l'infection peut 6galement avoir lieu par les stigmates, les pi6ces buccales ou le tube digestif. I1 apparait donc que, non seulement du point de vue de la lutte microbiologique, mais 6galement de celui de la pathologie des insectes, il est absolument n6cessaire de d6finir les voies possibles d'infection et, tout par- ticuli6rement, de v6rifier dans quelie mesure la contamination par la vole orale provoque le d6veloppement des mycoses.

Diverses techniques histologiques ont 6t6 propos6es pour 6tudier ce probl6me; mais, 6tant donn6 qu'il est n6cessaire de contr61er de grandes quantit6s de pr6para- tions histologiques d'un mSme insecte, en raison de la possibilit6 d'une infection simultan6e par diff6rentes voies, nous nous sommes propos6s d'6tudier partictdi6re- ment les techniques de coloration permettant de distinguer facilement tout 616ment myc61ien dans des coupes de tissus infect6s.

Les techniques de coloration utilis6es jusqu'~ pr6sent, darts le domaine de la pathologie cryptogamique des insectes, font appel aux proc6d6s classiques de l'histologie. La coloration par mordangage, dfi ~t l'h6matoxyline, associ6e ~t une base (alumine ou sel de fer), est le plus souvent employ6e en raison de sa stabilit6 et de la possibilit6 qu'elle offre d'effectuer des doubles colorations. L'h6matoxyline donne une couleur intense aux structures nucl6aires et des teintes plus pffles aux parois des hyphes. C'est pourquoi cette technique peut &re utilis6e non seulement

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pour la coloration de coupes de tissus infectrs, mais 6galemem pour celle de frottis d'hrmolymphe ou de culture (SCHWEIZER, 1948; UMPrlLETT, 1962).

Des colorants cytoplasmiques comme l'6osine, utilisre seule (CERM,~KOVA & v v

SAMSnq~ov~,, 1960; DONAUBAUER, 1959; FERNANDO, 1960; LEFEBVRE, 1934; Mi2LLER-KrGLER & HUGER, 1960; PAILLOT, 1929; SAWYER, 1933; SIJSSMAN, 1952; TANAOA, 1955; WEBER, 1939), OU associre au vert lumirre (ARNAUD, 1927), l'rry- throsine (VAGO, 1956) ont 6t6 employrs aprrs mordangage et coloration par l'hrmatoxyline de Heidenhain, l'hrmatoxyline acide d'Ehrlich ou l'hrmalun de Mayer.

De fagon/t mettre particulirrement en 6vidence les 616ments mycrliens, diverses colorations combinres ont 6t6 prrconisres. PAILLOT (1929) associe des colorants acides et basiques (thionine phrniqure-orang6 d'aniline, fuchsine acide aniline-bleu de toluidine). RlCrlARDS (1954) mit en 6vidence la paroi mycrlienne d'un Ascomy- crte (Laboulbeniales) de la m~me fa~on que le trgument des insectes au moyen de la coloration triple de Mallory (fuchsine acide-bleu de mrthyle-orange G) d6j/t utilisre par SUSSMAN (1952) pour rraliser une diff6renciation prrliminaire entre les tissus de l'h6te et les 616ments mycrliens. VAGO (1956) utilisa 6galement cette technique pour 6tudier la prnrtration d'hyphes/t travers le trgument, obtenant un bon contraste entre le cytoplasme mycrlien, color6 en rouge clair, et les tissus, teint6s en bleu vif. Pour des 6tudes cytologiques fines, GOLDSTEIN (1927, 1929) et UM- PI-ILETT (1962) ont employ6 la coloration triple de Flemming (safranine-violet de Gentiane-orange G). Pour obtenir un bon contraste, nrcessaire pour la prise de microphotographies, DONAUBAImR (1959) prrconisa un traitement avec le rractif de Schiff, suivi d'une coloration h l'hrmalun; les noyaux et les hyphes sont alors colorrs en bleu foncM tandis que les tissus de l'hrte prrsentent une gamme de teintes rosres, Wv.BER (1939) utilisa 6galement l'hrmalun, combin6 h la coloration de van Gieson (fuchsine picrique) et UMPI-ILETT (1962) l'h6matoxyline de Heidenhain associre/t l'orange G. Pour la raise en 6vidence des champignons symbiotiques, dans les organes de stockage (ou <~mycangia>>, BATRA, 1963) de certains Colroptrres (Scolytidae et Platypodidae), la coloration de Gram-Weigert modifire par LEACH (1940) a 6t6 employre par divers auteurs (FERNANDO, 1960; FARRIS, 1963; FARRIS & FUNK, 1965). FRANCKE-GROSMANN (1956) utilisa, dans le m~me but, une solution de Giemsa, dilure dans l'acrtone. Pour la raise en 6vidence des agents pathogrnes (bactrries, champignons et spores de protozoaires) de l'Abeille, FYG (1963) modifia la technique originale de Claudius drrivre de la coloration de Gram.

En ce qui concerne les Entomophthoracfes, OLIVE (1906) rralisa des observations cytologiques sur du matrriel trait6 suivant la coloration triple de Flemming ou color6 h l'hrmatoxyline de Heidenhain. De m~me, UMPHLETT (1962) utilisa ces colorations, ainsi que celle ~t l'hrmatoxyline de Heidenhain-orange G, pour ses recherches morphologiques et cytologiques sur Coelomomyces spp.

Si on en est rest6 ~t un certain classicisme dans le choix des techniques histologiques les plus approprires /t la mise en 6vidence des 616ments mycrliens dans les tissus d'un insecte, les progr~s rralisrs durant les vingt derni~res annres dans le domaine de la mycologie mrdicale ont conduit h la mise au point de colorations

COLORATION HISTOLOGIQUE DES HYPHES CHEZ LES INSECTES 435

plus sp6cifiques, que nous nous sommes propos6s d'utiliser sur du mat6riel entomo- logique atteint de mycose.

La technique de base, en mycologie m6dicale, est la coloration de Hotchkiss- McManus (KLIGMAN & MESCON, 1950; KLmMAN et al. 1951) qui consiste en la mise en 6vidence, apr6s action de l'acide p6riodique, d'ald6hydes r6v616s par le r6actif de Schiff; mais les inconv6nients de ce proc6d6 tiennent h la complexit6 de la coloration et au manque de contraste (DE PALMA & YOtrN~, 1963). Grfice ~t l'emploi d'une solution d'ald6hyde-fuchsine basique (GOMoIU, 1950) et d'une coloration diff6rentielle au jaune de m6tanile, pr6c6d6e de la r6action de Feulgen, GRIDLEY (1953) r6ussit h am61iorer le contraste, puis Dr PARMA & YOUNG (1963) simplifi6rent la technique en utilisant directement la fuchsine basique, apr6s l'oxydation h l'acide p6riodique, et le vert lumiSre, apr6s action du bisulfite de sodium acidifi6.

C'est 6galement par la r6v61ation des ald6hydes que Gm)CDTT (1955) a propos6 une nouvelle technique de coloration, en appliquant les r6sultats obtenus par GOMORI (1946), sur la mise en 6vidence histologique du glycog6ne et de la mucine. Apr6s une oxydation par l'acide chromique, les ald6hydes sont r6v616s par un com- plexe de nitrate d'argent-m6th6namine. On obtient ainsi un excellent contraste entre les hyphes, color6s en noir, et les tissus de l'h6te qui restent incolores. I1 est m~me n6cessaire d'employer une coloration de fond, au vert lumi~re, si on d6sire 6tudier les relations topographiques entre le champignon et les tissus.

La coloration de KELLY, MORGAN & SAINI (1962) fait appel ~t l'action de l'6ther di6thylique-acide sulfurique pour obtenir des esters r6agissant m6tachromatiquement avec le bleu de toluidine. Les 616ments myc61iens apparaissent ainsi color6s en rouge sur un fond bleu p~le ou incolore. I1 est h remarquer qu'au moyen de cette m6thode, les auteurs ont mis en 6vidence, dans les tissus infect6s, des 616ments myc61iens qui ne sont pas r6v616s par les techniques histologiques classiques.

Dans un autre ordre d'id6e, SWARTZ & COOLIDGE (1953), ont propos6 une coloration contrast6e au moyen de phloxine Bet de bleu Coton, apr6s un 6claircissement du mat6riel (lambeaux de peau, ongles, cheveux) dans la p0tasse et un ramollisse- ment dans le lactoph6nol. Cette technique simple donne fin excellent contraste, le mat6riel fongique se d6tachant en rouge sur les tissus color6s en bleu clair. Elle est mSme utilis6e comme technique de routine dans les laboratoires de mycologie m6- dicale (FRIEORICH & UMLAUF, 1961). Nous avons 6galement 6tudi6 cette technique sur nos coupes, mais elle ne donna pas de r6sultats satisfaisants.

Enfin, l'emploi 6ventuel des techniques d'observation en microscopie de fluorescence a 6t6 signal6 par PICKETT et al. (1960) au moyen d'un traitement des pr6para- tions ~t l'orang6 d'acridine apr6s mordan~age et coloration avec l'h6matoxyline de Weigert.

En utilisant, ~t titre de comparaison, une coloration employ6e en pathologie des invert6br6s par AMARGIER & VAC, O (1966), nous nous sommes propos6s d'ap- pr6cier la valeur relative de ces diff6rentes techniques sur des coupes d'un insecte infect6 par un champignon.

436 1,. FERRON, A. iVf. HUGER ET E. MIJLLER-KOGLER

MATERIEL ET TECHNIQUES

Les diff6rentes colorations* ont 6t6 6tudi6es sur des coupes transversales d'une larve de Melolontha melolontha (L.) (ver blanc du troisi6me stade), infect6e exp6ri- mentalement par injection intrah6mocoelienne d'une suspension de conidiospores de Beauveria tenella (Delacr.) Siemaszko. La mort est survenue apr6s quatre jours. La fixation dans le liquide de Bouin n'a eu lieu que quarante-huit heures plus tard, de fa~on ~t ce que les diff6rents tissus de la larve soient envahis par le myc61ium. Pour obtenir une meilleure fixation des tissus, la t6te fur s6par6e du reste du corps pour faciliter la p6n6tration du liquide de Bouin dans le cadavre.

Apr6s trois jours dans le fixateur, le ver blanc infect6 a subi les bains suivants, pour assurer la d6shydratation et l'inclusion dans la paraffine: 1) 6thanol ~t 70% pendant 3 heures, 2) 6thanol ~t 70% pendant 24 heures, 3) 6thanol ~t 80% pendant 24 heures, 4) 6thanol absolu pendant 24 heures, 5) benzoate de m6thyle jusqu'~t 6claircissement de la pi6ce fix6e, soit 48 heures, 6) benzol pendant 30 minutes, 7) m61ange paraffine-benzol pendant 45 minutes ~t 60 °, 8) paraffine pendant 24 heures ~t 60 °, 9) inclusion dans la paraffine.

Les coupes, de 5/~ d'6paisseur, ont 6t6 coll6es sur les lames porte-objets au moyen d'un m61ange de glyc6rine et d'albumine, puis plac6es ~t 60 ° pendant 24 heures. Apr~s d6paraffinage dans le toluene, les coupes ont 6t6 hydrat6es, suivant la technique classique, avant de subir les diff6rentes colorations rappel6es ici suivant les publications originales et avec les variantes que nous y avons 6ventuellement appor- t6es.

Coloration de De Palma & Young (1963): - - solution aqueuse d'acide p6riodique (H~IO6) ~t 1% pendant 5 minutes. - - rincer ~t l'eau du robinet pendant 2 h 3 secondes. - - solution aqueuse de fuchsine basique ~t 0,1 O/o pendant 2 minutes en agitant deux

ou trois fois. - - laver h l'eau courante du robinet pendant 20 ~t 30 secondes. - - bisulfite de sodium acidifi6 (NaHSO3 1 g, HC1 N 20 ml, eau distill6e 100 ml)

pendant 1 ~t 2 minutes en agitant deux ou trois fois. - - laver dans l'eau courante du robinet pendant 5 minutes. - - solution aqueuse de vert lumi6re h 0,25~ en agitant constamment pendant 1

minute. - - laver rapidement ~t l'eau courante du robinet. - - d6shydrater et monter.

Coloration de Grocott (1955): - - acide chromique (CrO3) ~t 5~/o pendant 60 minutes. - - laver ~t l'eau courante du robinet pendant 10 minutes. - - solution de bisulfite de sodium (NaHSO3) h 1°/o pendant 1 minute.

*) Les produits chhuiques et colorants utilis6s sont de fabrication Merck, Darmstadt, sauf en ce qui concerne l'h6matoxyline ferriqne, la fuchsine acide et le vert lumi~re produits par

Kuhlmann R.A.L.


- - laver ~ l'eau courante pendant 5 minutes. - - laver trois fois dans l'eau distill6e. - - argenter les coupes /t 45--50 ° pendant 60 minutes dans un m~lange de 25 ml

de nitrate d'argent-m~th~namine (5 ml de nitrate d'argent (AgNO3) ~ 5°,/0 + 100 ml d'une solution ~ 3% de m~thSnamine ((CH2)6N4) et de 25 rr.,1 d'eau distil- 16e contenant 1 h 2 ml d'une solution de borax (Na2B407.10 H20 )/t 5%. Un prS- cipit~ blanc se forme mais disparait aussit6t par agitation. La solution limpide peut &re conserv~e plusieurs mois au r~fri#rateur.

- - laver trois fois dans l'eau distill~e. - - colorer dans une solution de chlorure d'or (AuCI~.HC1. 3 H20 ) ~ 0,1°/0 pendant

5 minutes. - - rincer dans l'eau distill~e.

- - solution de thiosulfate de sodium (Na2S203.5 H20) ~ 2% pendant 1 ~ 2 minutes. - - laver soigneusement. - - coloration contrast~e ~ la safranine aqueuse ou ~ l'h6matoxyline ~osine. - - d~shydrater et monter.

Nous avons ~galement cherch6 ~ am~liorer le contraste en utilisant, ~ titre de colorants compl~mentaires, soit le vert lumiSre en solution aqueuse h 2% pendant 1 minute, soit la combinaison fuchsine acide, en solution aqueuse h 1°/0 pendant 3 minutes, et vert lumi~re h 2°/° pendant 1 minute, en s'inspirant de la technique de coloration d'AMARGIER et VAGO (1966).

Coloration de Kelly, Morgan & Saini (1962): - - 6thanol absolu pendant 5 minutes. - - s6cher les coupes ~t Fair pendant 5 ~t 10 minutes. - - bain de 5 minutes dans un m61ange, ~t volume 6gal, d'acide sulfurique concentr6

(H2SO4) et d'6ther di6thylique ((C2H5)20). Le m61ange doit &re effectu6 tr6s prudemment, avec des liquides glac6s et ~t une temp6rature basse, en versant l'acide sulfurique concentr6 dans l'6ther di6thylique.

- - acide ac6tique (CHaCOOH) ~ 3 ~/o pendant 1 minute. Changer le bain d'acide toutes les dix pr6parations environ.

- - solution de bleu de toluidine O, ~ 0,01°/0 dans l'acide ac6tique fi 3% pendant 5 minutes.

- - acide ac6tique ~ 3°/0 pendant 1 minute. - - 6thanol absolu pendant 1 minute. - - xyl6ne pendant 1 minute.

- - monter.

Coloration de Pickett, Bishop, Chick et Baker (1960) - - fixation dans le formol, dans le m61ange de Zenker ou l'alcool. - - apr~s hydratation normale des coupes, colorer dans l'h6matoxyline ferrique de

Weigert pendant 5 minutes. - - laver ~ l'eau du robinet pendant 3 ~t 4 minutes.

- - colorer pendant 2 minutes dans une solution aqueuse d'orang6 d'acridine ~ 0,1 °/0.

438 P. FERRON, A. M. HUGER ET E. MiJLLER-KOGLER

- - rincer dans l'eau ou l'eau distill6e pendant 30 secondes. - - d6shydrater dans l'6thanol ~t 95°/° pendant 1 minute. - - d6shydrater deux fois dans l'6thanol absolu pendant 2--3 minutes. - - passer dans 2 bains successifs de xyl6ne. m monter dans le ~Xam>> (Gurr's) ou tout autre milieu non fluorescent.

Nous ne discuterons pas de la valeur de cette technique dans le cas de notre champignon entomopathog6ne, car nous n'avons pas observ6 la fluorescence des hyphes. Quelques particules internes ont seules pr6sent6 cette propri6t6. On peut 6ventuellement imputer cet 6chec au fait que le flxateur de BouIN utilis6 n'est pas recommand6 pour la microscopie en fluorescence.

Coloration d'Amargier et Vago (1966). - - mordangage dans l'alun de fer et d'ammonium h 3%

(NH4Fe(SO4)~.12 H20) pendant 30 minutes. - - ringage soign6 dans l'eau distill6e. - - c o l o r a t i o n dans l'h6matoxyline ferrique de Heidenhain pendant 40 minutes. - - ringage dans l'eau distill6e. - - diff6renciation dans l'alun de fer et d'ammonium ~t 1 ~/o, en contr61ant la dif-

f6renciation au microscope, apr6s ringage ~t l'eau distill6e. - - coloration dans la fuchsine acide ~ 1 ~/o pendant 3 minutes. - - rin~age ~t l'eau distill6e. - - coloration dans le vert lumi6re ~t 2°/° pendant 2 minutes. - - ringage h l'eau distill6e. - - d6shydratation par passage imm6diat dans l'6thanol absolu. Si la coloration

verte parait trop intense, on peut passer par l'interm6diaire de l'6thanol dilu6. - - ringage au xyl6ne et montage.

RESULTATS ET DISCUSSION

Les principaux r6sultats de ce travail ont 6t6 pr6c6demment pr6sent6s dans une brbve communication (Mt~LLEP,-K6CLER, HUGER & FERRON, 1965), mais nous nous proposons de d6velopper ici les observations faites pour les diff6rentes colorations.*

Technique de Grocott sans coloration diffdrentielle T~gument: l'6picuticule a une teinte jaunfitre ~ brungttre, vraisemblablement due

plus ~t sa couleur naturelle qu'aux colorants utilis6s. Les lamelles peuvent atre facilement observ6es dans l'exocuticule et l'endocuticule color6es en jaune pale.

Autres tissus de l'h6te: ils sont pratiquement incolores ~t l'exception d'inclusions dans le tissu adipeux. On peut reconnMtre les diff6rents tissus seulement selon les diff6rences obtenues par la r6fraction des rayons lumineux.

Hyphes: le contenu des hyphes prend une teinte gris-ros6e assez pale, les membranes 6tant au contraire gris fonc6 ~t noirgtres. Les noyaux sont color6s en noir. Du

* Les co lora t ions eont ras t6es et les n u a n c e s dans les t i ssus de l 'hSte infect6, qui son t ici d6crites, ne son t na t u r e l l emen t reprodui tes q u ' i m p a r f a i t e m e n t pa r les pho tog raph ie s en no i r et

blanc.


fait que les tissus de l'h6te sont pratiquement incolores, les hyphes sont facilement identifiables et peuvent 6tre trouv6s facilement dans les prtparations.

Cette coloration peut donc 6tre utiliste efficacement pour une recherche rapide des hyphes dans les difftrents tissus infect6s; cependant, elle pr6sente quelquefois un inconvtnient du fait que les tissus de l'h6te sont pratiquement incolores.

Technique de Grocott avec coloration diffdrentielle fi la safranine T~gument: 6picuticule jaune rouge~ttre; exo- et endocuticule nettement colortes

en rouge carmin clair, l'exocuticule 6tant teintte d'une fa~on plus intense que l'endocuticule.

Autres tissus de l'hdte: les lobes de tissu adipeux, dans leurs contours, ainsi que les ceUules graisseuses isoltes avec leurs membranes, apparaissent trts visiblement dans une gamme de teintes rougefttres dtgradtes; de m~me le cytoplasme et les inclusions cellulaires, comme par exemple les albuminoides. Suivant le degr6 de difftrenciation, ces inclusions albuminoides sont parfois noirfttres ~t noires. De mSme les noyaux cellulaires sont nettement distincts darts des colorations rouges. Les cellules sanguines sont, pour la plupart, colortes en un rouge lumineux intense. Les autres tissus, comme la paroi des trachtes, les tubes de Malpighi, sont bien mis en 6vidence. Les muscles sont teintts d'un rouge assez intense. La musculature du tube digestif est rouge intense et les ceUules intestinales prtsentent 6galement une bonne coloration rouge.

Hyphes: Ils apparaissent trts nettement, avec un cytoplasme gris-rost, des membranes noirfttres et des noyanx noirs.

Cette coloration permet donc une bonne diff6renciation des hyphes qui, en raison de leurs membranes gris-noir~tre, se distinguent particulitrement des tissus de l'h6te colorts en rougefLtre. Ces derniers sont 16g~rement difftrencits dans une gamme de tons rouges. Cette technique peut servir ~t la fois pour une identification rapide des hyphes et des difftrents organes de l 'htte (Fig. 1, A-D). Dans cette mesure, elle est donc plus avantageuse que la technique prtctdente sans coloration difftrentielle.

Technique de Grocott modifide, avec coloration diffdrentielle au vert lurnikre T~gument: l'tpicuticule apparaR jaunfttre ~t brungtre, l'exocuticule vert lumitre,

l'endocuticule vert lumitre clair. Les lamelles de l'endocuticule sont bien reconnais- sables.

Autres tissus de l'hdte: on obtient la mSme gamme de diff6renciation des tissus au moyen d'une exacte difftrenciation du vert lumitre qu'avec la coloration con- trastte ~t la safranine.

Hyphes: le cytoplasme est gris ross et partiellement verdgttre. Les membranes sont gris fonc6 ?~ noires, les noyaux sont noirs.

La coloration est meilleure que ceUe obtenue sans difftrenciation. La coloration difftrentielle avec le vert lumi~re (Fig. 2, B) comme celle ~t la safranine donne 6galement un contraste tr~s net des hyphes et des tissus de l'hfte.

Technique de Grocott rnodifi~e, avec coloration diffdrentielle ~ la fuchsine acide et au vert lumikre (suivant la technique d'Amargier & Vago)

440 P. FERRoN, A. M. HUGER ET E. Mf3LLER-KOGLER

Tdgument: 6picuticule jaunatre, passant au rougeatre au niveau de l'exocuficule; exocuticule d'une couleur bleu fonc6, endocuficule bleu pale, les lamelles de cette derni6re 6tant bien visibles.

Autres tissus de l'h6te: par comparaison avec la coloration de Grocott h la safranine ou au vert lumi6re, les fissus de l'h6te (par exemple l'6piderme, le tissu adipeux, les tubes de Malpighi, l'6pith61ium des trach6es et du tube digestif) sont nettement distincts par la coloration rouge lumineux de leurs noyaux et de leurs inclusions cellulaires, par exemple les petits granules albuminoides, le cytoplasme 6tant color6 plus faiblement et d'une teinte rouge violac6e plus douce. Les divers types d'h6mocytes apparaissent 6galement darts des colorations diff6rentes. Les muscles sont d'un violet intense h violet gris bleu. Suivant leur 6paisseur, les spirales des trach6es sont 6galement violet intense ~t violet gris bleu.

Hyphes: noyaux rouge lumineux, cytoplasme gris tendre, membranes gris pale ~t noiratres.

Cette coloration pr6sente l'avantage, par rapport ~ celles pr6c6demment d6crites, de mettre en 6vidence les d6tails des tissus de l'h6te grace h des gammes de couleurs. Les hyphes sont 6galement bien color6s (Fig. 2 A). A c6t6 d'une coloration 61ective du champignon par la technique de Grocott, cette m6thode permet, par la coloration diff6rentielle, une bonne 6tude de l'6tat des fissus et des cellules de l'h6te. C'est pourquoi on doit lui donner la pr6f6rence lorsqu'on veut conna~tre non seulement l'6tat de l'infection d'une mani6re rapide, mais 6galement celui des tissus de l'h6te.

Technique de Kelly, Morgan et Saini: Tdgument: 6picuficule jaune, exocuticule et endocuticule color6es darts des tons

bleu violet. Autres tissus de l'hdte: les fissus (6piderme, tubes de Malpighi, cellules intesti-

nales, l'6pith61ium des trach6es, muscles) sont color6s en bleu clair ~t bleu moyen. Seules les grosses inclusions cellulaires, comme les granules albumino~des, sont color6es plus intens6ment. Les noyaux n'apparaissent pas particuli6rement.

Hyphes: ils sont color6s en violet rougefitre, aucune structure interne n'est dif- f6renci6e.

Cette coloration est appropri6e/~ la recherche des hyphes darts l'h6te du fait que la couleur violet rougeatre des hyphes se distingue bien des tons bleut6s des fissus de l'h6te (Fig. 2, C, D).

Technique de De Palma et Young: T~gument: 6picuticule jaunatre, exocuticule bleu clair h bleu verdfitre, endocuti-

cule gris violet pale. Autres tissus de l'hdte: les muscles sont color6s en bleu clair gt bleu verdatre.

Tousles autres fissus apparaissent dans des teintes gris bleu clair ~t bleu verdatre Les noyaux des cellules sont bleu verdatre.

Hyphes: Ils se distinguent des tissus de l'h6te par la coloration rouge marqu6e de leurs membranes, et ceci 6galement d'une fagon particuli6re au cours de leur tra- vers6e de l'endo- et de l'exocuticule.

Ent . exp. & appl. 9 (1966): 440

P. FERRON et al. : Colorat ion histoIogique des hyphes .

i!iili il

PLATE VIII

Fig. 1. Co lora t ion de Groco t t - safranine. A. t6gument ; B. t issu adipeux; C. muscles ; D. in-

test in m o y e n ; 6 = 6pi thNium, m = muscu la tu re . Gros s i s semen t 430 X-

Ent. exp. & appl. 9 (1966): 440 PLATE IX

P. FERRON et al. : Coloration histologique des hyphes.

Fig. 2. A. t6gu~mer~t, coloration: Grocot t - fuchsine acide - vert lumi~re; B. muscle, coloration:

Grocot t - vert lumi~re; C. tissu adipeux, coloration: Kelly, Morgan et Saini; D. intestin moyen,

colorat ion comme en C, m = musculature, ~ = 6p~th61ium. Grossissemer~t 430 X.

Ent. exp. & appl. 9 (1966): 441

P. FERRON et al. : Coloration histologique des hyphes.

PLATE X

Fig. 3. Coloration: De Palma et Young. A. tissu adipeux (t. a.) et tubes de Malpighi (t. M.): B. t~gument; C. muscle. Grossissement 430 X.

COLORATION HISTOLGGIQUE DES HYPHES CHEZ LES INSECTES 441

Cette technique est h recommander particuli6rement pour l'6tude de l'infecfion fongique dans les tissus de l'h6te, car: 1) la coloration est simple et rapide, 2) elle donne au plus haut degr6 une diff6renciafion bonne et claire entre les hyphes et les tissus de l'h6te (Fig. 3, A-C) (marne darts toute l'6paisseur du t6gumen0, 3) les hyphes, m~me les plus fins, peuvent &re clairement identifi6s, 4) l'6tat des diff6rents tissus de l'h6te peut ~tre bien appr6ci6. Cependant elle est moins appropri6e la raise en 6vidence des inclusions dans les hyphes.

Technique d'Amargier et Vago: T~gument: 6picuticule jaun~tre, exocuticule violet fonc6, endocuticule bleu vert

clair. Autres tissus de l'hdte: ils prennent une coloration violet rouge, les. muscles, les

noyaux, les inclusions cellulaires (albuminoides) et les membranes prenant les colorants d'une fagon plus intense.

Hyphes: ils se distinguent bien dans l'endocuticule teint6e en bleu vert clair en raison de leur coloration violette ~t violet fonc6. Dans les autres tissus de l'h6te i_Is sont moins apparents car ils pr6sentent la m~me gamme de couleurs, et le contraste est moins satisfaisant,

Cette technique est sp6cialement appropri6e ~t la mise en 6vidence des hyphes dans l'endocuticule. Dans les autres tissus, la diff6renciation est insuffisante de telle sorte qu'on peut seulement suivre le cheminement du myc61ium dans l'h6mocoele, dans les cavit6s des organes et dans les tissus tr6s l~tches.

REMERCIEMENTS

Ces recherches furent r6alis6es, en majeure partie, au cours d'un stage effectu6 par le premier auteur ~t Darmstadt, grace h une bourse accord6e par le <<Bundes- ministerium ffir Ern~ihrung, Landwirtschaft und Forsten>> de la R6publique f6d6rale allemande auquel il exprime sa gratitude ainsi qu'au Professeur Docteur J. M. Franz, Directeur de l'<<Institut fiJr biologische Sch~idlingsbek~impfung>>.

Nous remergions Madame A. Amargier et Monsieur C. Vago (I.N.R.A., Station de Cytopathologie de Saint-Christol-les-Al~s, Gard) de nous avoir aimablement in- diqu6 cette technique avant m~me qu'elle ait fait l'object d'une publication.

Nous remergions M. F. Rtihl pour sa collaboration dans le travail photographi- que.

ZUSAMMENFASSUNG

OBER DIE K O N T R A S T R E 1 C H E HISTOLOG1SCHE FA 'RBUNG V O N H Y P H E N BE1 P 1 L Z B E F A L L E N E N 1 N S E K T E N

Neuere E~irbemethoden der medizinischen Mykologie wurden auf ihre Brauehbarkeit fiir histopathologische Untersuchungen yon Insektenmykosen gepriift. Tes~objekt war eine yon Beauveria tenella durchwachsene L 3 yon Melolontha melolontha. Sehr gute Resultate lieferte die F~b tmg der Schrtitte nach DE PALMA & YOUNG (1963), weil sie eine klare f~irberische Differenzierung zwischen Hyphen und Wirtsgeweben ergibt, dabei abet auch den Zustand der letzteren leicht beurteilen fiisst. Zudem ist sie technisch einfach. Zur schnellen Auffindung yon Hyphen im Wirt eignen sich auch gut die F~irbungen nach GRGCOa~r (1955) sowie KELLY, MORGAN & SA~I (1962). Kombiniert man die GROCOTT F:iirbung mit Gegen-

442 I,. FERRON, A. M. HUGER ET E. MULLER-K~GLER

fiirbungen mittels Safranin oder Lichtgriin oder Siiurefuchsin-Lichtgriin, so erhiilt man eine manchmal erwiinschte Kontrasldarstellung der Wirtsgewebe. Die fiir insektenmykologische Ar- beiten beschriebene F'firbtmg nach AMARGIER & VAGO (1966) bringt ein kontrastreiches Bild der Hyphen in der Endokutikula, aber weniger in den iibrigen Wirtsgeweben.

SUMMARY

ON CONTRASTING HISTOLOGICAL STAINING OF HYPHAE IN INSECTS AFFECTED BY FUNGAL DISEASES

The suitability of staining methods recently developed in medical mycology was tested for histopathological investigations of insect mycoses. One third instar larva of Melolontha melolontha, heavily infected with Beauveria tenella was used as test material. Good results were obtained by staining the sections according to the method of DE PALMA & YOUNa: hyphae and host tissues can easily be recognized by differences in colour. The condition of the host tissue can also easily be judged. Moreover, the technique is simple. The staining methods by GROCOTT (1955) and KELLY, MORGAN & SAIN! (1962) are also suitable for the fast locating of hyphae in the host. Combination of the staining of Grocott with counterstaining methods (for example with safranin, light green or acidic fuchsin light green) gives a contrasting presentation of the host tissues as is sometimes desired. The method of AMARGIER & VAGO (1966), described for insect-pathological work, gives a good contrasting picture of the hyphae in the endocuticle, but less contrast in other host tissues.

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Documents

SUR LA COLORATION HISTOLOGIQUE CONTRASTEE DES HYPHES CHEZ LES INSECTES ATTEINTS DE MYCOSE