T H È S E - theses.fr · 2 Je présente tout d’abords mes sincères remerciements aux membres du jury. Je remercie le Professeur Norbert Vey, qui me fait l’honneur de présider

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AIX-MARSEILLE UNIVERSITÉ

FACULTÉ DE MÉDECINE DE MARSEILLE

ECOLE DOCTORALE : Sciences de la Vie et de la Santé

T H È S E

Présentée et publiquement soutenue

Le 31 octobre 2014

Par M. DEVILLIER Raynier

Né le 5 janvier 1985 à Sainte Foy-lès-Lyon (69)

CARACTÉRISATION MOLÉCULAIRE DES LEUCÉMIES AIGUËS MYÉLOÏDES AVEC DYSMYÉLOPOÏÈSE

Pour obtenir le grade de DOCTORAT d’AIX-MARSEILLE UNIVERSITÉ

SPÉCIALITÉ : Oncologie, Pharmacologie et Thérapeutique

Membres du Jury de la Thèse :

Pr. Norbert VEY Président du Jury

Pr. Michaela FONTENAY Rapporteur

Pr. Christian RECHER Rapporteur

Dr. Marie Joëlle MOZZICONACCI Directeur de thèse

Laboratoire d’Oncologie Moléculaire, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille,

UMR1068, Institut Paoli Calmettes, Marseille, France

2

Je présente tout d’abords mes sincères remerciements aux membres du jury.

Je remercie le Professeur Norbert Vey, qui me fait l’honneur de présider cette

thèse. Merci pour le soutien et les conseils tout au long de ce travail.

Je remercie le Professeur Michaela Fontenay et le Professeur Christian

Recher pour avoir accepté de juger cette thèse. Soyez assurés de ma profonde

reconnaissance.

Je remercie le Docteur Marie-Joëlle Mozziconacci d’avoir dirigé ce travail.

Merci pour votre confiance durant ces dernières années.

Je remercie le Docteur Daniel Birnbaum de m’avoir permis de réaliser ces travaux au

sein de soin équipe.

Je remercie le Professeur Didier Blaise pour son soutien depuis le début de mon

internat.

Je tiens à remercier mes collègues du laboratoire et des unités d’hématologie et

d’oncologie.

Enfin, je dédie cette thèse à ma famille, mes amis et ma compagne Emeline

Tabouret pour leur aide, leur soutien et leur fidélité depuis tant d’années.

3

TABLE DES MATIERES

TABLES ET FIGURES .......................................................................................................... 5

LISTE DES ABREVIATIONS ................................................................................................ 6

INTRODUCTION ................................................................................................................... 7

I) Généralités sur les leucémies aigues myéloïdes ................................................... 7

a. Définition .................................................................................................................... 7

b. Epidémiologie ............................................................................................................ 7

c. Etiologies .................................................................................................................... 8

II) Classification des LAM ............................................................................................11

a. Classification FAB (French-American-British) .................................................... 11

b. Classifications OMS ................................................................................................ 12

III) Anomalies moléculaires dans la leucémogenèse .................................................17

a. Différentes classes d’altérations moléculaires .................................................... 17

b. Anomalies génétiques conférant un avantage prolifératif ................................. 18

c. Anomalies génétiques provoquant un blocage de la différenciation ............... 21

f. Anomalies de gènes impliqués dans la régulation épigénétique ...................... 25

IV) Facteurs pronostiques dans les LAM.....................................................................33

a. Facteurs liés au patient .......................................................................................... 33

b. Facteurs liés à la maladie ....................................................................................... 34

c. Classification de l’European LeukemiaNet (ELN) ............................................... 38

OBJECTIFS ET PRESENTATION DES TRAVAUX .............................................................40

ARTICLE 1 : ........................................................................................................................42

Prognostic significance of myelodysplasia-related changes according to the WHO

classification among ELN-intermediate-risk AML patients .............................................42

ARTICLE 2 : ........................................................................................................................46

4

Acute myeloid leukemia with myelodysplasia-related changes are characterized by a

specific molecular pattern with high frequency of ASXL1 mutations ............................46

ARTICLE 3 : ........................................................................................................................54

Clinical, morphological and molecular characterization of acute myeloid leukemias

with myelodysplasia-related changes...............................................................................54

ARTICLE 4 : ........................................................................................................................91

In vitro multidrug screening and mutational profiles of acute myeloid leukemias with

myelodysplasia-related changes .......................................................................................91

DISCUSSION ET PERSPECTIVES ................................................................................... 107

I) Vers une classification moléculaire des LAM-MRC ? ......................................... 107

a. LAM avec altération de TP53 ................................................................................ 107

b. LAM avec mutation d’ASXL1................................................................................. 109

c. LAM avec mutations de NPM1 ou DNMT3A ........................................................ 110

d. LAM avec d’autres mutations ou sans mutation identifiée ............................... 110

II) Perspectives .......................................................................................................... 111

a. Caractérisation pangénomique des LAM ............................................................ 111

b. Vers une médecine moléculaire personnalisée .................................................. 113

BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................... 115

ANNEXES .......................................................................................................................... 128

5

TABLES ET FIGURES

Table 1 : Maladies congénitales prédisposant au développement d’une LAM, associées ou

non à un syndrome génétique (page 9)

Table 2 : Classification FAB (page 11)

Table 3 : Classification OMS 2008 des LAM (page 13)

Table 4 : Anomalies cytogénétiques suffisantes pour classer une LAM en LAM-MRC selon la

classification OMS 2008 (page 15)

Table 5 : Principales anomalies moléculaires et leur fréquence dans les LAM (page 19)

Table 6 : Caractéristiques des LAM avec mutations d’ASXL1 au sein des principales séries

publiées (page 32)

Table 7 : Groupes de risque cytogénétique selon le CALGB, le MRC et le SWOG/ECOG

(page 36)

Table 8 : Classification pronostique de l’European LeukemiaNet (page 39)

Figure 1 : Modèle de leucémogénèse à 2 évènements (page 17)

Figure 2 : Localisation des mutations d’ASXL1 dans les hémopathies myéloïdes (page 28)

Figure 3 : Rôle d’ASXL1 et du complexe PRC2 dans la régulation des gènes impliqués dans

la leucémogenèse (page 31)

Figure 4 : Proposition de classification moléculaire des LAM-MRC (page 108)

Figure 5 : Différentes classes d’altérations moléculaires dans les LAM (page 112)

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LISTE DES ABREVIATIONS

CBF : core binding factor

DEP : dysérythropoïèse

DGP : dysgranulopoïèse

DML : dysplasie multilignée

DMP: dysmégacaryopoïèse

ELN : European LeukemiaNet

FAB : French-American-British

ITD : récepteurs à activité tyrosine kinase

LAL : leucémie aiguë lymphoblastique

LAM : leucémie aiguë myéloïde

LAM-MRC : LAM « myelodysplasia-related changes »

LAM-NOS : LAM « not otherwise specified »

LMMC : leucémie myélo-monocytaire chronique

NES : signal d’exportation nucléaire

NMP : néoplasie myéloproliférative

PNN : polynucléaire neutrophile

SMD : syndrome myélodysplasique

TKD : domaine tyrosine kinase

TKR : récepteurs à activité tyrosine kinase

7

INTRODUCTION

I) Généralités sur les leucémies aigues myéloïdes

a. Définition

Les leucémies aigues myéloïdes (LAM) sont des hémopathies malignes

caractérisées par une prolifération clonale de précurseurs hématopoïétiques

myéloïdes (blastes). Suite à des évènements génétiques lors de la leucémogenèse,

les cellules myéloïdes immatures acquièrent des propriétés d’auto-renouvellement et

de prolifération associées à un blocage de maturation entraînant le phénotype

leucémique. L’avantage prolifératif qui en résulte va inhiber l’hématopoïèse

physiologique, et conduire à un envahissement de la moelle osseuse, du sang

périphérique, puis de différents tissus ou organes par les blastes leucémiques. Ce

processus malin va être rapidement identifiable sur le plan clinique et biologique,

notamment par l’apparition d’un syndrome d’insuffisance médullaire et/ou d’un

syndrome tumoral. L’évolution est toujours fatale à court terme en l’absence de

traitement efficace.

b. Epidémiologie

Les LAM représentent environ 80% des leucémies aiguës de l’adulte et 20% de

celles de l’enfant. Ce sont des pathologies rares, représentant environ 0,6% des

cancers dans les pays occidentaux. Elles sont responsables de 1,5% des décès

d’origine tumorale. L’incidence annuelle est de 2 à 4 cas pour 100 000 habitants.

Cette incidence est maximale aux Etats-Unis, en Australie et en Europe occidentale

(Jemal et al., 2010). L’incidence des LAM augmente avec l’âge avec un âge médian

au diagnostic de 65 à 69 ans selon les études (Estey, 2007; Klepin and Balducci,

2009). L’incidence des LAM est actuellement en augmentation, probablement du fait

8

du vieillissement des populations occidentales et de l’utilisation croissante d’agents

cytotoxiques leucémogènes dans le cadre du traitement des cancers (Xie et al.,

2003).

c. Etiologies

Bien que l’étiologie de la LAM reste inconnue dans la majorité des cas, certains

facteurs génétiques ou environnementaux peuvent en favoriser la survenue.

i. Facteurs génétiques constitutionnels

Certaines maladies constitutionnelles augmentent le risque de développer une LAM.

Ces LAM peuvent s’intégrer au sein d’un syndrome génétique bien défini ou être la

seule manifestation clinico-biologique d’une anomalie génétique constitutionnelle.

Dans ce dernier cas, elles sont appelées leucémies familiales pures (Table 1).

ii. Facteurs toxiques et environnementaux

Certaines causes toxiques ont été associées au développement d’une LAM. Les plus

fréquemment retrouvées sont les expositions au benzène, aux radiations ionisantes

d’origine professionnelle, accidentelle ou médicale (traitement par radiothérapie) ou à

des chimiothérapies (Belson et al., 2007; Bowen, 2006). Les principaux traitements

identifiés comme leucémogènes sont les agents alkylants (melphalan, cisplatine) et

les inhibiteurs de topo-isomérase II (anthracycline, étoposide) (Bowen, 2006). Les

LAM secondaires aux traitements par agents alkylants surviennent en général après

une latence de 5 ans environ. Elles sont souvent précédées d’une phase de

syndrome myélodysplasique (SMD) et présentent des anomalies cytogénétiques

complexes ou des délétions ou monosomies des chromosomes 5 et 7. Les formes

secondaires aux traitements par inhibiteurs de topo-isomérase II surviennent plus

précocement, environ 2 ans après traitement et sont souvent associées à des

translocations équilibrées impliquant le gène MLL en 11q23, et parfois à des

9

anomalies cytogénétiques récurrentes telles que les translocations t(8;21) et t(15;17)

ou l’inversion inv(16)/t(16;16) ou (Vardiman et al., 2002).

Table 1 : Maladies congénitales prédisposant au développement d’une LAM, associées ou non à un syndrome génétique (Owen et al., 2008)

AD = autosomique dominant ; AR = autosomique récessif ; LX = lié à l’X

10

iii. Evolution à partir d’une autre hémopathie

Certaines hémopathies myéloïdes chroniques acquises peuvent évoluer

naturellement en LAM. Parmi celles-ci, on peut citer :

- les néoplasies myéloprolifératives (NMP) de type leucémie myéloïde chronique

(LMC) ou non LMC, avec une fréquence variable selon les types de NMP.

- les SMD et les syndromes mixtes SMD/NMP, telle que la leucémie myélo-

monocytaire chronique (LMMC) avec également une évolution variable en fonction

du stade de la maladie, essentiellement basé sur les cytopénies, les anomalies

cytogénétiques et la blastose médullaire (Greenberg et al., 2012).

- les aplasies médullaires idiopathiques avec ou sans hémoglobinurie

paroxystique nocturne.

11

II) Classification des LAM

a. Classification FAB (French-American-British)

La classification FAB (Bennett et al., 1976) permettait de distinguer huit entités (de

M0 à M7) selon la lignée d’origine de la population blastique et le degré de

maturation résiduelle à l’aide de critères cyto-morphologiques et cytochimiques

(Table 2). Elle définissait la LAM par une blastose médullaire supérieure à 30%. Bien

que certaines entités de la classification FAB aient un pronostique spécifique, telle

que la LAM3, cette classification n’avait pas pour but de stratifier le pronostic des

LAM.

Table 2 : Classification FAB (Bennett et al., 1976)

Type FAB Nom Caractéristiques cytologiques

M0 LAM sans différenciation Myéloblastes indifférenciés

M1 LAM peu différenciée Myéloblastes peu différenciés

Quelques granulations azurophiles

M2 LAM différenciée Myéloblastes granuleux, corps d’Auer

M3 LA promyélocytaire Promyélocytes anormaux, hyper-

granuleux, avec corps d’Auer en fagots

M4 LA myélo-monocytaire

Monocytose sanguine > 5 G/L ou médullaire > 20 %

Sous type: LAM4 à éosinophile anormaux

M5 LA monoblastique

Cellules monocytaires médullaires > 80 %

M5a : monoblastes (peu différenciés)

M5b : (pro)monocytes (différenciés)

M6 Erythroleucémie > 50 % d'érythroblastes

M7 LA mégacaryocytaire Mégacaryoblastes plus ou moins

différenciés

12

b. Classifications OMS

La classification de l’OMS 2001 identifie des entités distinctes, notamment sur des

critères cytogénétiques (Vardiman et al., 2002). Les LAM avec dysplasie multilignée

apparaissent dans cette classification et sont différenciées des LAM radio ou chimio

induites. Le seuil de blastose médullaire définissant la LAM est abaissé à 20%. La

classification OMS révisée en 2008 (Vardiman et al., 2009) intègre de nouvelles

anomalies cytogénétiques et propose des entités basées sur des anomalies

moléculaires (Table 3).

i. LAM avec anomalie génétique récurrente

La première catégorie de la classification OMS 2008 regroupe les LAM avec

anomalie génétique récurrente. Elle comprend les réarrangements t(8;21)(q22;q22),

inv(16)(p13q22) ou t(16;16)(p13;q22), et t(15;17)(q22;q12) qui étaient déjà présentes

dans la classification de 2001. La translocation t(9;11)(p22;q23) est individualisée

des autres réarrangements de MLL dans la classification 2008. De nouvelles entités

cytogénétiques ont été ajoutées : les LAM avec t(6;9)(p23;q34), les LAM avec

inv(3)(q21q26.2) ou t(3;3)(q21;q26.2) et LAM avec t(1;22)(p13;q13). Enfin, par

rapport à la classification OMS 2001, celle de 2008 intègre 2 entités provisoires

basées sur la présence d’anomalies moléculaires : les LAM avec mutations de NPM1

et celles avec mutations de CEBPA.

13

Table 3 : Classification OMS 2008 des LAM (Vardiman et al., 2009)

Acute myeloid leukemia with recurrent genetic abnormalities

AML with t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1

AML with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11

APL with t(15;17)(q22;q12); PML-RARA

AML with t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL

AML with t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214

AML with inv(3)(q21q26.2) or t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1

AML (megakaryoblastic) with t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL1

Provisional entity: AML with mutated NPM1

Provisional entity: AML with mutated CEBPA

Acute myeloid leukemia with myelodysplasia-related changes

Therapy-related myeloid neoplasms

Acute myeloid leukemia, not otherwise specified (NOS)

Acute myeloid leukemia with minimal differentiation

Acute myeloid leukemia without maturation

Acute myeloid leukemia with maturation

Acute myelomonocytic leukemia

Acute monoblastic/monocytic leukemia

Acute erythroid leukemia

Pure erythroid leukemia

Erythroleukemia, erythroid/myeloid

Acute megakaryoblastic leukemia

Acute basophilic leukemia

Acute panmyelosis with myelofibrosis (syn.: acute myelofibrosis; acute myelosclerosis)

Myeloid sarcoma (syn.: extramedullary myeloid tumor; granulocytic sarcoma; chloroma)

Myeloid proliferations related to Down syndrome

Transient abnormal myelopoiesis (syn.: transient myeloproliferative disorder)

Myeloid leukemia associated with Down syndrome

Blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm

Acute leukemias of ambiguous lineage

Acute undifferentiated leukemia

Mixed phenotype acute leukemia with t(9;22)(q34;q11.2); BCR-ABL1

Mixed phenotype acute leukemia with t(v;11q23); MLL rearranged

Mixed phenotype acute leukemia, B/myeloid, NOS

Mixed phenotype acute leukemia, T/myeloid, NOS

Provisional entity: Natural killer (NK)–cell lymphoblastic leukemia/lymphoma

14

ii. LAM-MRC (with myelodysplasia-related changes)

C’est ce sous-groupe spécifique qui sera la base d’étude de notre travail. Apparue en

2001 sous le terme de LAM avec dysplasie multilignée (DML), cette catégorie est

élargie par la classification de l’OMS 2008 en intégrant des critères cytogénétiques.

Elle est actuellement intitulée «AML with myelodysplasia-related changes» (LAM-

MRC). Elle est définie par une blastose médullaire ≥ 20% et la présence d’un

diagnostic préexistant de SMD ou de SMD/NMP ; et/ou de DML définie par au moins

50% de cellules médullaires dysplasiques sur au moins 2 lignées ; et/ou d’anomalies

cytogénétiques associées aux SMD. La présence d’un seul, de deux ou des 3

critères dans une LAM en fait une LAM-MRC . De plus, les patients ne doivent pas

avoir été exposés à un traitement de radiothérapie et/ou de chimiothérapie, sinon ils

sont considérés comme ayant une LAM induite par le traitement (« Therapy-related

AML »).

La DML est définie par la présence d’au moins 50% de cellules dysplasiques sur au

moins 2 lignées. La dysgranulopoïèse (DGP) est caractérisée par la présence

d’anomalies morphologiques au sein des polynucléaires neutrophiles (PNN) : PNN

agranulaire ou hypogranulaire ; PNN avec hypersegmentation nucléaire ; PNN avec

hyposegmentation nucléaire (pseudo Pelger-Huët). Les signes morphologiques

considérés comme des critères de dysérythropoïèse (DEP) sont : la mégaloblastose,

la caryorrhexie, les irrégularités (bourgeonnement) ou les fragmentations nucléaires,

la multinucléation, les vacuoles ou lacunes cytoplasmiques, les sidéroblastes en

couronne et la positivité à l’acide périodique Schiff. Enfin, la dysmégacaryopoïèse

(DMP) est définie par la présence de micro-mégacaryocytes ou d’un noyau hypo ou

non lobulé ou la présence de multinucléation. Certains patients peuvent se

présenter au diagnostic avec des signes de DGP, DEP et/ou de DMP mais sans

15

atteindre les critères nécessaires à la DML (50% de cellules dysplasiques sur au

moins 2 lignées). Cela peut être dû à un nombre insuffisant d’éléments évaluables au

sein d’une ou plusieurs lignées ou à la présence de dysplasie sur moins de 50% des

cellules sur 2 des 3 lignées. Pour ces patients, la présence d’antécédents de SMD ou

de SMD/MNP et/ou d’anomalies cytogénétiques de SMD permet un classement en

LAM-MRC. Ces anomalies cytogénétiques sont listées dans la Table 4. Les

anomalies non équilibrées sont les plus fréquentes, notamment les caryotypes

complexes (≥ 3 anomalies chromosomiques en l’absence d’anomalie cytogénétique

récurrente) et/ou les anomalies de type -5/del(5q) et -7/del(7q). La trisomie 8 et la

del(20q), fréquemment identifiées dans les SMD ne sont pas suffisamment

spécifiques autoriser un diagnostic de LAM-MRC. Les translocations équilibrées sont

plus rares et intéressent principalement la région 5q33. Malgré leur fréquente

association à la présence de DML, les inv(3)(q21;q26.2) et t(3;3)(q21; q26.2) sont à

présent considérées comme des anomalies cytogénétiques récurrentes et sont par

définition exclues des LAM-MRC.

Table 4 : Anomalies cytogénétiques suffisantes pour classer une LAM en LAM-MRC selon la classification OMS 2008 (Vardiman et al., 2009)

Unbalanced changes Balanced changes

del(7q) or -7 t(11;16)(q23;p13.3)

del(5q) or -5 t(3;21)(q26.2;q22.1)

i(17q) or t(17p) t(1;3)(p36.3;q21.1)

del(13q) or -13 t(2;11)(p21;q23)

del(11q) t(5;12)(q33;p12)

del(12p) or t(12p) t(5;7)(q33;q11.2)

del(9q) t(5;17)(q33;p13)

idic(X)(q13) t(5;10)(q33;q21)

Complex karyotype (≥3 abnormalities)

t(3;5)(q25;q34)

16

iii. LAM secondaires à la radio/chimiothérapie

La troisième catégorie de la classification OMS 2008 comprend les LAM induites par

un traitement de chimiothérapie ou de radiothérapie (« Therapy-related AML »). La

présence d’anomalies génétiques récurrentes permet de reclasser certaines de ces

LAM dans la première catégorie.

iv. Autres LAM (LAM-NOS pour « not otherwise specified »)

La quatrième catégorie de la classification OMS 2008 regroupe les LAM qui n’ont pas

de critères pour les catégories précédentes.

v. LAM de lignée ambiguë

Enfin, la classification OMS 2008 identifie une catégorie correspondant aux

leucémies aiguës pour lesquelles l’appartenance à la lignée myéloïde ou lymphoïde

n’est pas bien définie. Pour être assimilée à une leucémie aiguë avec phénotype

mixte, les blastes doivent présenter des caractéristiques d’au moins 2 lignées

(myéloïde, lymphoïde B, lymphoïde T) basés sur des critères phénotypiques.

17

III) Anomalies moléculaires dans la leucémogenèse

a. Différentes classes d’altérations moléculaires

Les LAM sont des hémopathies hétérogènes sur le plan génétique. Les évènements

oncogéniques acquis par la cellule initiatrice sont classiquement divisés en deux

catégories : les anomalies de classe 1, et celles de classe 2 (Gilliland and Griffin,

2002). Les premières confèrent un avantage prolifératif aux cellules. Elles regroupent

par exemple les mutations activatrices de récepteurs à activité tyrosine kinase (TKR)

tels que FLT3, KIT ou RAS. Les anomalies de classe 2 induisent un blocage de

différenciation et une capacité d’auto-renouvellement. Parmi ces anomalies, on

trouve des anomalies de facteurs de transcription avec par exemple les fusions

AML1-ETO, CBFB-MYH11 ou PML-RARA.

Figure 1 : Modèle de leucémogénèse à 2 évènements (Gilliland and Griffin, 2002)

18

D’après ce modèle de leucémogenèse, le phénotype leucémique résulterait de la

combinaison d’une anomalie de classe 1, considérée préférentiellement comme un

évènement secondaire, et d’une anomalie de classe 2, habituellement identifiée

comme une altération initiatrice. Ce modèle se complexifie actuellement avec

l’identification de nouvelles mutations dont l’appartenance à la classe 1 ou la classe

2 n’est pas clairement établie. C’est notamment le cas des mutations portant sur des

régulateurs épigénétiques tels que les gènes ASXL1, TET2, IDH1/2 ou DNMT3A. Il

est possible de regrouper ces mutations pour former de nouvelles classes

d’altérations (Naoe and Kiyoi, 2013). Les principales mutations retrouvées dans les

LAM sont récapitulées dans la Table 5.

b. Anomalies génétiques conférant un avantage prolifératif

i. Mutations de FLT3

Le gène codant pour la protéine tyrosine kinase FMS-like (FLT3) est localisé sur le

chromosome 13q12. Il s’agit d’une protéine de la famille des récepteurs à activité

tyrosine kinase de classe III, avec 5 domaines extracellulaires immunoglobuline-like,

un domaine transmembranaire, un domaine juxta-membranaire et deux domaines

tyrosine kinase (TKD) intracellulaires. FLT3 joue un rôle important dans la

prolifération, la différenciation et la survie cellulaire des précurseurs

hématopoïétiques (Gilliland and Griffin, 2002; Stirewalt and Radich, 2003). Des

mutations somatiques de FLT3 sont retrouvées dans 20-25% des LAM (Fröhling et

al., 2002; Schnittger et al., 2002).

19

Table 5 : Principales anomalies moléculaires et leur fréquence dans les LAM

(Naoe and Kiyoi, 2013)

Function Gene Mutation frequency

Tyrosine kinase FLT3-ITD 20–28%

FLT3-TKD 5–10%

KIT 25–30%

JAK1 1–3%

JAK3 1–2%

RAS pathway NRAS 9–14%

KRAS 5–17%

NF1 < 5%

Protein phosphatase PTPN11 4–5%

Ubiquitin pathway CBL 2–3%

Nuclear-cytoplasmic shuttling phosphoprotein NPM1 25–35%

Transcription factor CEBPA 10–20%

RUNX1 5–13%

GATA2 3–5%

RUNX1-RUNX1T1 10–15%

CBFB-MYH11 3–8%

PML-RARA 5–10%

DEK-NUP214 1%

DNA hydroxymethylation TET2 8–27%

IDH1 6–9%

IDH2 9–12%

DNA methylation DNMT3A 18–23%

H3K4 methylation MLL fusion/MLL-PTD 10-15%

H3K27 trimethylation ASXL1 3–11%

EZH2 < 5%

Transcriptional corepressor BCOR 4–5%

BCORL1 6%

Cohesin complex STAG2 2%

SMC3 3%

SMC1A 3%

RAD21 2%

Tumor suppressor TP53 7–12%

WT1 10–13%

Spliceosome complex SF3B1

10–15% SRSF2

U2AF1

20

Deux types de mutations de FLT3 ont été identifiés. La plus fréquente est une

duplication interne en tandem (ITD) des exons 14 et 15, dans la région juxta-

membranaire. La taille de la duplication est variable et respecte le cadre de lecture.

L’autre type de mutation est une mutation ponctuelle faux-sens dans l’exon 20, au

niveau du domaine TKD, le plus fréquemment sur les acides aminés D835 ou I836.

Sa fréquence est plus faible, de l’ordre de 5 à 10%. Les 2 types de mutations

entraînent une phosphorylation constitutive du récepteur mais la réponse cellulaire

n’est pas équivalente (Bailey et al., 2013; Stirewalt and Radich, 2003). Sur le plan

clinique, les mutations de type FLT3-ITD sont préférentiellement associées aux LAM

à caryotype normal ou au LAM avec translocation t(15;17) ou t(6;9). Les mutations

de type FLT3-TKD représentent la forme majoritaire au sein des LAM du core

binding factor (CBF) (Allen et al., 2013; Jourdan et al., 2013). Alors que le pronostic

péjoratif des mutations de type FLT3-ITD est bien décrit, l’impact pronostique des

mutations FLT3-TKD semble moindre (Bacher et al., 2008; Mead et al., 2007;

Schnittger et al., 2002).

ii. Mutations de KIT

Le gène KIT localisé en 4q12 code pour un récepteur tyrosine kinase de type III dont

le ligand est le stem cell factor (SCF). Il est impliqué dans l’activation des voies de

signalisation induisant la prolifération, la différenciation, la migration et la survie

cellulaire. L’activation constitutive du récepteur peut être due à plusieurs types de

mutations (insertion in-frame, duplication interne en tandem ou mutation ponctuelle

faux sens). La plus fréquente est la mutation D816V, intéressant le domaine tyrosine

kinase (substitution d’un acide aminé, la plus fréquente étant la mutation D816V).

Les mutations de KIT sont rares dans l’ensemble des LAM, mais sont

21

particulièrement représentées dans le sous-groupe des LAM CBF (20-30% des cas)

(Allen et al., 2013; Jourdan et al., 2013).

iii. Mutations de NRAS et KRAS

Les protéines de la famille RAS participent à la transduction du signal de récepteurs

membranaires tels que FLT3 ou KIT. Elles interviennent dans la régulation de la

prolifération et de la différenciation cellulaire. Il existe 3 gènes RAS fonctionnels :

NRAS, HRAS, et KRAS. Les mutations des gènes NRAS et KRAS sont présentes

dans environ 10% et 5% des LAM, respectivement. Elles sont fréquemment

associées aux LAM avec inv(16)/t(16;16) ou avec inv(3)/t(3;3). Ces mutations

ponctuelles (principalement sur les codons G12, G13 ou Q61) entrainent une perte

de l’activité GTPasique intrinsèque, provoquant ainsi une activation constitutive de la

protéine et de la voie de signalisation d’aval (RAF, MAP kinase, ERK) (Beaupre and

Kurzrock, 1999; Renneville et al., 2008).

c. Anomalies génétiques provoquant un blocage de la différenciation

i. Anomalies des gènes CBFA/RUNX1et CBFB

Le gène RUNX1 est localisé en 21q22 et code pour la sous-unité alpha du CBF. Une

fois associée à la sous-unité béta, elle forme le complexe transcriptionnel CBF qui

joue un rôle majeur dans la régulation de l’hématopoïèse (Cai et al., 2000; Kurokawa

and Hirai, 2003; Tanaka et al., 1995). RUNX1 est un des gènes les plus souvent

dérégulés dans les LAM, à travers différents mécanismes incluant des translocations

du locus 21q22, des mutations ponctuelles et des amplifications géniques. La

translocation t(8;21)(q22;q22) produit une protéine de fusion RUNX1-ETO/RUNX1T1

constituée de la partie N-terminale de RUNX1 (contenant le domaine RUNT

nécessaire à la fixation à l’ADN et à l’hétéro-dimérisation avec CBFB) et de la quasi-

totalité d’ETO, qui conserve ses capacités à recruter des corépresseurs

22

transcriptionnels (en s’associant avec NCoR). Il en résulte, entre autres, une

répression transcriptionnelle de gènes nécessaires à la différenciation myéloïde. Les

fonctions de RUNX1 sont également altérées indirectement en présence de la

protéine de fusion CBFB-MYH11 issue de l’inv(16)/t(16;16), par inhibition compétitive

avec le CBFB sauvage.

Des mutations somatiques de RUNX1, mono- ou bi-alléliques, ont été mises en

évidence dans 5% à 10% des LAM. Elles intéressent soit le domaine RHD (surtout

mono-alléliques), soit le domaine C-terminal (surtout bi-allélique), et sont fortement

associées aux LAM avec trisomie du chromosome 13 (Gaidzik et al., 2011; Osato et

al., 1999; Preudhomme et al., 2000; Roumier et al., 2003). Alors que les

translocations t(8;21) et inv(16)/t(16;16) ont un pronostic relativement favorable, les

mutations ponctuelles de RUNX1 sembleraient présenter un pronostic péjoratif, bien

que leur valeur indépendante reste discutée (Gaidzik et al., 2011).

Des mutations ponctuelles constitutionnelles de RUNX1 ont été décrites dans des

cas de «familial platelet disorder» (FPD), prédisposant au développement de LAM

(Song et al., 1999).

ii. Altérations de CEBPA

Le gène CEBPA (CCAAT/enhancer-binding protein alpha), localisé en 19q13, code

pour un facteur transcriptionnel majeur de la différenciation granulocytaire et

monocytaire et joue un rôle important dans la leucémogenèse (Koschmieder et al.,

2009). Deux types de mutations ponctuelles de CEBPA ont été décrits qui

conduisent à son inactivation : les mutations N-terminales (ponctuelles non-sens ou

avec décalage du cadre de lecture) et les mutations C-terminales (ponctuelles faux-

sens respectant le cadre de lecture) (Leroy et al., 2005). Les mutations sont bi-

alléliques dans 2/3 des mutants CEBPA et généralement de type hétérozygote

23

composite (mutation N-terminale sur un allèle et C-terminale sur l’autre), suggérant

une possible coopération entre ces deux évènements (Marcucci et al., 2011). La

présence d’une double mutation de CEBPA confère un pronostic favorable (Fasan et

al., 2014; Wouters et al., 2009). Le fait que ces mutations soient associées à des

profils phénotypiques et d’expression génique spécifiques supporte la classification

OMS qui considère les LAM mutées CEBPA comme une entité biologiquement

distincte (Lin et al., 2005; Valk et al., 2004).

d. Altérations de TP53

TP53 est un gène suppresseur de tumeur, localisé en 17p13. Il code pour un facteur

de transcription qui régule l’expression de gènes impliqués dans l’arrêt du cycle

cellulaire, la réparation de l’ADN et l’apoptose. La perte de fonction de TP53 induit

une instabilité génomique, associée à une inhibition de l’apoptose et à une

dérégulation du cycle cellulaire, malgré la présence de lésions de l’ADN. Dans les

LAM, TP53 peut être inactivé par des délétions ou des mutations ponctuelles du

gène. Les altérations de TP53 sont souvent bi-alléliques, avec soit une mutation sur

chaque allèle, soit une mutation associée à une délétion sur l’autre allèle. Plus

rarement il peut s’agir d’une double délétion. Les mutations intéressent le plus

souvent le domaine de liaison à l’ADN, de l’exon 4 à 8. Les altérations de TP53 sont

souvent retrouvées chez des patients atteints de LAM à caryotype complexe,

notamment les complexes monosomaux avec perte d’un chromosome 5 (ou délétion

5q) et 7. Les mutations de TP53 sont associées à un pronostic péjoratif,

indépendamment de la complexité du caryotype (Grossmann et al., 2012; Rücker et

al., 2012).

24

e. Mutations de NPM1

Le gène NPM1 est localisé en 5q35. NPM1 est une protéine chaperonne ubiquitaire

se déplaçant entre le noyau et le cytoplasme, avec une localisation

préférentiellement nucléolaire. Elle régule l’assemblage et le transport des

composants pré-ribosomaux à travers la membrane nucléaire. NPM1 joue un rôle

majeur de senseur nucléolaire pour l’activation de TP53. En l’absence de stress,

NPM1 forme un complexe stable intra-nucléolaire avec la protéine suppresseur de

tumeur ARF. En cas de stress (UV, radiation, drogues interférant avec la structure de

l’ADN), le complexe ARF-NPM1 est transféré dans le cytoplasme et entre en

compétition avec HDM2, un inhibiteur de TP53. Les complexes ARF-HDM2 et

NPM1-HDM2 séquestrent HDM2 permettant ainsi l’activation de TP53 en réponse au

stress (Falini et al., 2007). Les travaux de Falini et al. ont montré que les mutations

de NPM1 s’accompagnent d’une délocalisation aberrante de NPM1 dans le

cytoplasme (Falini et al., 2005, 2006). Il s’agit de mutations hétérozygotes

récurrentes dans l’exon 12 qui consistent dans la majorité des cas en une insertion

de type A (4 nucléotides, TCTG, en position 960 sur la séquence codante) (Falini et

al., 2005). Plus de 50 mutations ont été identifiées à ce jour. Toutes provoquent un

décalage du cadre de lecture et entraînent à l’extrémité C-terminale de la protéine la

perte du tryptophane 290, associée ou non à celle du tryptophane 288. Cette

modification se traduit par la création d’un site NES (nuclear exportation signal)

supplémentaire conduisant à la délocalisation cytoplasmique de NPM1 (Falini et al.,

2009). Le mécanisme oncogénique des mutations de NPM1 n’est pas entièrement

identifié. Il est possible que la protéine NPM1 mutée puisse entraîner avec elle la

délocalisation d’autres protéines dont la dérégulation pourrait favoriser le processus

leucémogène. Les mutations de l’exon 12 de NPM1 constituent l’anomalie

25

moléculaire la plus fréquente dans les LAM de l’adulte, avec une fréquence globale

de 35%. Ces mutations sont fréquemment observées dans les LAM à caryotype

normal, au sein desquelles l’incidence atteint 50-60%. Elles sont également souvent

associées aux LAM de novo, hyperleucocytaires au diagnostic, aux types FAB

M4/M5, et à une expression faible ou absente du CD34. Tout comme les LAM

mutées CEBPA, les LAM mutées NPM1 possèdent un profil d’expression génique

spécifique associé à un pronostic favorable, notamment en l’absence de mutations

de FLT3 que l’on retrouve de manière concomitante dans 40% des cas (Becker et

al., 2010; Döhner et al., 2005; Renneville et al., 2008; Schnittger et al., 2005;

Verhaak et al., 2005).

f. Anomalies de gènes impliqués dans la régulation épigénétique

i. Anomalies de MLL

Le gène MLL est localisé en 11q23 et code pour une histone méthyl-transférase qui

a un rôle de coactivateur transcriptionnel. Il intervient lors de l’embryogenèse et de

l’hématopoïèse, notamment par la régulation épigénétique de l’expression des gènes

HOX. Le domaine SET de MLL permet la méthylation de la lysine 4 de l’histone 3

(H3K4), qui représente une marque activatrice de la transcription. Environ 10% des

LAL et des LAM présentent un réarrangement de MLL. Au sein des LAM, les

translocations t(9;11)/(MLL-AF9) et t(6;11)/(MLL-AF6), sont les réarrangements les

plus fréquents (Marschalek, 2011; Meyer et al., 2009). En dehors des

réarrangements cytogénétiques, des mutations de type duplication partielle en

tandem (PTD) ont été identifiés dans 5 à 10% des LAM. Elles sont associées aux

LAM à caryotype normal ou à la trisomie du chromosome 11 (Basecke et al., 2006).

Situées dans la partie 5’ du gène, ces mutations MLL-PTD entraînent des répétitions

26

de plusieurs exons, aboutissant à une protéine de plus grande taille avec une

augmentation d’affinité pour l’ADN (Caligiuri et al., 1998; Marschalek, 2011).

ii. Mutations de TET2

Le gène TET2, situé en 4q24, est une hydroxylase qui intervient dans le processus

de déméthylation de l’ADN en convertissant la méthylcytosine en 5-

hydroxyméthylcytosine (Ko et al., 2010). Les mutations de TET2 ont été décrites

dans diverses hémopathies myéloïdes, dont les LAM. Le plus souvent, il s’agit

d’insertions ou de délétions de petite taille ou de mutations ponctuelles non-sens ou

faux-sens, aboutissant à une perte de fonction de la protéine (Delhommeau et al.,

2009). Les mutations de TET2 sont retrouvées dans environ 15-25% des LAM,

notamment dans les LAM à caryotype normal et peuvent être associées aux

mutations de NPM1. Elles sembleraient avoir un pronostic péjoratif (Chou et al.,

2011; Metzeler et al., 2011; Nibourel et al., 2010; Weissmann et al., 2012).

iii. Mutations d’IDH1 et d’IDH2

Les gènes IDH1 en 2q33 et IDH2 en 15q26 codent respectivement pour les enzymes

isocitrate deshydrogénase 1 et 2 qui convertissent l’isocitrate en alpha-cétoglutarate.

Initialement, les mutations d’IDH ont été mises en évidence grâce aux approches de

séquençage pangénomique dans les glioblastomes puis les LAM (Mardis et al.,

2009; Yan et al., 2009). Dans les LAM, leurs mutations intéressent le codon R132

d’IDH1 et les codons R140 et R172 d’IDH2 et modifient l’activité enzymatique

d’IDH1/2, leur conférant la capacité de réduire l’alpha-cétoglutarate en 2-

hydroxyglutarate. De façon compétitive, ce métabolite va inhiber l’activité de TET2,

aboutissant à une diminution de la synthèse de 5-hydroxyméthylcytosine. Ces

modifications affecteraient la méthylation de l’ADN, aboutissant alors aux mêmes

conséquences que les mutations de TET2 (Figueroa et al., 2010). Au sein des LAM,

27

la fréquence des mutations d’IDH1/2 est de 15-20%. Les mutations des codons R132

d’IDH1 et R140 d’IDH2 sont fréquemment associées aux mutations de NPM1 alors

que celles du codon R172 d’IDH2 sont rarement retrouvées en présence d’autres

mutations (Abbas et al., 2010; Boissel et al., 2010, 2011; Marcucci et al., 2010).

Comme pour les mutations de TET2, il semblerait que ces mutations soient

associées à un pronostic défavorable, notamment au sein des LAM avec mutations

de NPM1.

iv. Mutations de DNMT3A

Le gène DNMT3A est localisé en 2p23 et code pour une DNA méthyltransférase qui

catalyse l’addition d’un groupement méthyl en position 5 de la cytosine (5-

méthylcytosine). Elle permet la méthylation de novo de l’ADN, jouant ainsi un rôle

essentiel dans la différenciation des CSH (Challen et al., 2012). Les mutations de

DNMT3A ont été découvertes en 2010 grâce à l’avènement des techniques de

séquençage à haut débit. La majorité des mutations intéressent le domaine portant

l’activité méthyltransférase, notamment l’exon 23 au niveau du codon R882. Elles

sont responsables d’une diminution de l’activité catalytique de la protéine et d’une

hypométhylation de certaines régions de l’ADN (Ley et al., 2010; Yan et al., 2011).

Les mutations de DNMT3A sont retrouvées dans environ 20% des LAM de l’adulte,

notamment dans les formes à différentiation monocytaire et les LAM avec mutations

de NPM1 et de FLT3. Il semblerait qu’elles soient associées à un pronostic péjoratif

(Hou et al., 2012; Ley et al., 2010; Renneville et al., 2012; Shen et al., 2011; Tie et

al., 2014; Yan et al., 2011).

v. Mutations d’ASXL1

Le gène ASXL1, situé en 20q11, est impliqué dans les modifications post-

traductionnelles des histones, notamment en régulant la désubiquitination de la

28

lysine 119 de l’histone H2A (H2A119KUb, via le complexe de désubiquitination formé

avec BAP1) et la tri-méthylation de la lysine 27 de l’histone 3 (H3K27me3, via EZH2,

effecteur du complexe polycomb répressif 2, PRC2) (Abdel-Wahab and Dey, 2013;

Gelsi-Boyer et al., 2012). Les mutations d’ASXL1 sont situées dans l’exon 12 et sont

majoritairement de type non-sens avec ou sans décalage du cadre de lecture,

aboutissent à la formation d’une protéine dont l’extrémité C-terminale est tronquée

(Gelsi-Boyer et al., 2009). Il en résulte une perte du domaine PHD (« plant homeo

domain ») qui serait nécessaire à la liaison à l’ADN et à la reconnaissance de lysines

méthylées (Gelsi-Boyer et al., 2012; Figure 2).

Figure 2 : Localisation des mutations d’ASXL1 dans les hémopathies

myéloïdes (Gesli-Boyer et al. 2012)

29

Ces mutations empêchent le recrutement et la stabilisation du complexe PRC2,

s’accompagnant ainsi d’une diminution globale des marques répressives H3K27me3,

notamment au niveau des gènes de la famille HOX (HOXA) (Abdel-Wahab et al.,

2012). Cela aboutit à une expression aberrante de ces gènes (Figure 3). De façon

similaire, les mutations d’ASXL1 semblent entrainer une surexpression de certains

miRNA, notamment miR-125a. Ce dernier est impliqué dans la régulation des

précurseurs hématopoïétiques et induit des syndromes myéloprolifératifs dans des

modèles de transplantation chez la souris (Guo et al., 2012; Gerrits et al., 2012).

Récemment, il a été montré que la dérégulation de miR-125a par les mutations

d’ASXL1 entraine une diminution de l’expression de Clec5a, protéine membranaire

indispensable à la différenciation granulocytaire, aboutissant ainsi un blocage de

maturation et à l’apparition de dysplasie morphologique (Inoue et al., 2013). Enfin,

grâce à des modèles de coopérations avec les mutations de N-RAS (N-RAS-G12V),

il a été montré que les mutations d’ASXL1 participent à l’apparition de dysplasie et à

la transformation leucémique sur un terrain de syndrome myéloprolifératif engendré

par des mutations de N-RAS (Abdel-Wahab et al., 2012; Inoue et al., 2013). Cela

pourrait expliquer en partie l’association entre la présence des mutations d’ASXL1 et

la transformation aigue des LMMC, lesquelles impliquent fréquemment des

mutations de RAS.

L’altération la plus fréquente d’ASXL1 est la mutation c.1934dupG; p.G646Wfsx12,

qui représente 50 à 60% des mutations d’ASXL1 identifiées dans les hémopathies

myéloïdes. La table 6 rapporte les plus importantes séries publiées décrivant les

caractéristiques clinicobiologiques des LAM avec mutation d’ASXL1. Elles sont

retrouvées dans 5-10% des LAM et sont plutôt associées au sexe masculin, à un âge

plus élevé au diagnostic, au type M0 de la classification FAB, et à caryotype normal

30

ou avec trisomie 8 isolée (Chou et al., 2010; Schnittger et al., 2013). La présence de

mutations d’ASXL1 semble corrélée à celle de mutations de RUNX1 ainsi qu’aux

formes sauvages de NPM1 et de FLT3 (Chou et al., 2010; Schnittger et al., 2013).

Enfin, il semblerait que ces mutations soient associées à un pronostic péjoratif au

sein des hémopathies myéloïdes (Bejar et al., 2011; Brecqueville et al., 2014; Chou

et al., 2010; Gelsi-Boyer et al., 2010; Schnittger et al., 2013; Thol et al., 2011;

Vannucchi et al., 2013).

31

Figure 3 : Rôle d’ASXL1 et du complexe PRC2 dans la régulation des gènes

impliqués dans la leucémogenèse

(A) ASXL1 permet au complexe PRC2 d’appliquer les marques répressives H3K27m3 sur les histones, régulant ainsi l’expression des gènes de la famille HOX et certains miRNA. (B) En cas de mutations d’ASXL1, le complexe PRC2 n’est pas stabilisé. Cela se traduit par une diminution globale des marques H3K27me3 ainsi que la surexpression des gènes de la famille HOX (auto-renouvellement) et de certains miRNA. Ces derniers vont réprimer l’expression de gènes nécessaires à la maturation granuleuse. Ces mécanismes contribuent en partie à l’apparition des phénotypes dysplasiques et leucémiques.

32

Table 6 : Caractéristiques des LAM avec mutations d’ASXL1 au sein des principales séries publiées

Etude Chou et al. Metzeler et al. Pratcorona et al. Schnittger et al.

N 501 423 836 740

Critère de sélection LAM de novo LAM-CN de novo LAM LAM non FAB M3

ASXL1-mut, % (N) 11% (N = 54) 11% (N = 45) 5% (N = 46) 17% (N = 124)

Caractéristiques associées

Age avancé Age avancé Age avancé, sexe

masculin

Sexe masculin Sexe masculin Age avancé Antécédent de SMD

FAB M0 Faible leucocytose Faible leucocytose FAB M2 et M5a

+8 Faible % de blastes médullaires FAB M0 Phénotype immature

RUNX1-mut CEBPA-mut NPM1-wt et FLT3-wt +8

NPM1-wt et FLT3-wt NPM1-wt et FLT3-wt RUNX1-mut

NPM1-wt, FLT3-wt et

DNMT3A-wt

Rémission complète

ASXL1 mut vs. wt 58% vs. 80%, p = 0,013 53% vs. 71%, p = 0,040 61% vs. 80%, p = 0,004 Non disponible

Survie globale médiane (mois)

ASXL1 mut vs. wt 14 vs. 58; p = 0,009 11 vs. 14; p = 0,006 16 vs. 22; p = 0,019 11 vs. 62, p < 0,001

Survie multivariée HR (95CI); p

1,5 (0,8-2,7); p = 0,207 ELN fav : 4,4 (2,4-8,3); p < 0,001

ELN int-1 : 0,9 (0,6-1,5); p = 0,790 1,6 (1,1-2,4); p = 0,010 2,2 p < 0,001

33

IV) Facteurs pronostiques dans les LAM

a. Facteurs liés au patient

i. Âge

L’âge avancé est un facteur pronostique péjoratif majeur, notamment parce qu’il

représente la principale limite aux traitements intensifs (Appelbaum et al., 2006;

Estey, 2007). Pour la plupart des groupes coopératifs, un patient atteint de LAM est

considéré comme «âgé» au-delà de 60 ans. Bien que les traitements intensifs

puissent être proposés aux patients de plus de 60 ans, ils sont associés à une

mortalité précoce plus importante que chez les sujets jeunes. De plus, les LAM du

sujet âgé présentent souvent des caractéristiques biologiques de plus mauvais

pronostic, telles que les anomalies cytogénétiques ou moléculaires défavorables.

L’âge avancé est aussi associé à des taux plus élevés de chimiorésistance primaire

et de rechute (Appelbaum et al., 2006; Büchner et al., 2009). Le traitement de

patients âgés reste à ce jour un enjeu majeur qui doit intégrer des problématiques

spécifiques comme la polymédication, la pharmacocinétique, la

pharmacodynamique, l’autonomie et la qualité de vie (Elliot et al., 2014; Klepin et al.,

2014; Peyrade et al., 2012; Walter and Estey, 2014). Il doit donc s’intégrer dans une

approche spécifique onco-gériatrique.

ii. Etat général et comorbidités

Ces facteurs ont un impact pronostique majeur en conditionnant la réalisation d’un

traitement curatif. Les scores tels que le « performance status » (PS) ou l’index de

comorbidité pour les greffes allogéniques de cellules souches hématopoïétiques

(HCT-CI) sont des outils importants prédisant la mortalité précoce liée au traitement

et la survie globale (Giles et al., 2007; Sorror et al., 2005). Cependant, il n’existe à ce

jour aucune recommandation précise quant au choix d’un traitement intensif en

34

fonction des comorbidités, laissant cette décision à l’appréciation des cliniciens. Deux

publications récentes soulignent les limites du score HCT-CI, incitant à reconsidérer

l’évaluation des comorbidités de façon maladie spécifique (Ostgård et al., 2014;

Versluis et al., 2014).

b. Facteurs liés à la maladie

i. Leucocytose

L’hyperleucocytose au diagnostic est considérée comme un facteur de mauvais

pronostic. Le seuil de leucocytes permettant de définir l’hyperleucocytose n’est pas

clairement défini et varie selon les études, de 30 à 100 G/L, avec une exception pour

les LAM promyélocytaires qui sont considérées hyperleucocytaires à partir de 10

G/L. L’hyperleucocytose représente un facteur de risque de mortalité précoce car elle

est associée à la survenue de complications graves telles que la leucostase, le

syndrome de lyse tumoral ou la CIVD (Greenwood et al., 2006). L’admission initiale

systématique en unité de soins intensifs des patients hyperleucocytaires au

diagnostic pourrait permettre une meilleure prise en charge (Lengliné et al., 2012).

ii. Antécédent de SMD ou SMP et dysplasie multilignée

Les LAM issues de la transformation d’un SMD ou d’une NMP sont généralement de

plus mauvais pronostic que les LAM de novo (Larson, 2007). Ces formes se

présentent souvent au diagnostic avec une DML, définie sur le plan cytologique par

la présence de dysmyélopoïèse sur plus de 50% des cellules d’au moins 2 des 3

lignées hématopoïétiques. Cependant, certaines LAM sans antécédent de SMD

présentent également des signes de DML au diagnostic, suggérant un certain degré

de similitude entre ces LAM et les LAM secondaires aux SMD ou NMP. La

classification OMS de 2001 les a regroupées sous le terme « AML with multilineage

dysplasia » (Vardiman et al., 2002). Ces LAM avec DML sont fréquemment

35

associées à un âge avancé ou à des anomalies cytogénétiques défavorables, leur

conférant un pronostic péjoratif. Cependant, l’impact pronostique indépendant de la

présence d’antécédent de SMD et/ou de DML reste controversé (Haferlach et al.,

2003; Miesner et al., 2010; Wandt et al., 2008; Xu et al., 2014).

iii. LAM radio/chimio induites

Le pronostic des LAM induites par des traitements de radiothérapie ou de

chimiothérapie est globalement plus sombre que celui des LAM de novo (Larson,

2007). Comme pour les LAM avec DML, la valeur pronostique indépendante du

caractère induit de la LAM reste discutée. Ces pathologies sont souvent associées à

des anomalies cytogénétiques de risque défavorable (anomalies des chromosomes 5

et 7 ou translocation impliquant MLL). D’autres facteurs extrinsèques à la LAM

peuvent expliquer le pronostic plus sombre de ces pathologies induites : la

persistance de la maladie primitive ou de séquelles organiques des traitements et/ou

des complications antérieures comme la déplétion des CSH normales, l’altération du

stroma médullaire ou l’immunosuppression chronique.

iv. Anomalies cytogénétiques

Le caryotype des cellules leucémiques est le facteur pronostique majeur permettant

de prédire la réponse à la chimiothérapie d’induction et la survie globale des patients.

La cytogénétique représente la base des stratifications pronostiques actuelles des

LAM (Döhner et al., 2010). En fonction du caryotype, les groupes coopératifs

internationaux ont établi différentes classifications pronostiques en séparant les

patients de façon similaire en 3 groupes de risque cytogénétique : favorable,

intermédiaire et défavorable (Byrd et al., 2002; Grimwade et al., 1998, 2010; Slovak

et al., 2000). Toutes ces classifications considèrent que les anomalies t(8;21),

inv(16)/ t(16;16) et t(15;17) sont de bon pronostic. En revanche, elles diffèrent sur les

36

définitions des anomalies défavorables, notamment sur la définition des caryotypes

complexes (Table 7).

Table 7 : Groupes de risque cytogénétique selon le CALGB, le MRC et le SWOG/ECOG

Cytogenetic risk CALGB

(Byrd et al., 2002) MRC

(Grimwade et al., 1998) SWOG/ECOG

(Slovak et al., 2000)

Favorable

t(8;21) t(8;21) t(8;21) lacking del(9q)

and complex karyotype

inv(16)/t(16;16) inv(16)/t(16;16) inv(16)/t(16;16)

del(9q) t(15;17) t(15;17)

Intermediate

Normal karyotype Normal karyotype Normal karyotype

-Y +8 -Y

+11 +21 +6

+13 +22 +8

+21 del(7q) del(12p)

del(5q) del(9q)

del(7q) abn(11q23)

del(11q)

abn(12p)

del(20q)

t(9;11)

Unfavorable

-7 abn(3q) abn(3q)

+8 -5/del(5q) –5/del(5q)

inv(3)/t(3;3) -7 –7/del(7q)

t(6;9) abn(9q)

t(6;11) abn(11q)

t(11;19) abn(17p)

abn(20q)

abn(21q)

t(6;9)

t(9;22)

complex karyotype complex karyotype complex karyotype

≥ 3 abn ≥ 5 abn ≥ 3 abn

abn = abnormality CALGB = Cancer and Leukemia Group B (USA) MRC = Medical Research Coucil (UK) SWOG = Southwest Oncology Group / ECOG = Eastern Cooperative Oncology Group (USA)

37

Récemment, une nouvelle entité cytogénétique, appelée caryotype monosomal, a

été définie par la présence d’au moins deux monosomies autosomales ou d’une

monosomie autosomale associée une anomalie de structure (Breems et al., 2008).

Cette entité cytogénétique confère un pronostic très sombre mais n’est pas toujours

utilisée en tant que telle dans les stratifications actuelles car elle est en grande partie

redondante avec le groupe de risque cytogénétique défavorable (Grimwade et al.,

2010). Par défaut, les patients ayant des caryotypes non classés dans les groupes

favorable ou défavorable forment le groupe de risque cytogénétique intermédiaire.

Ce groupe contient les LAM à caryotype normal, les trisomies 8 et les anomalies

cytogénétiques rares dont la valeur pronostique est difficilement identifiable par

manque d’effectif.

v. Anomalies moléculaires utilisées en pratique courante

Les LAM à caryotype normal représentent environ 40 à 50% des LAM de l’adulte,

dont le pronostic est intermédiaire par défaut. Au cours des dernières années,

l’identification de mutations récurrentes a permis d’affiner le pronostic de ce type de

LAM. A ce jour il est possible d’identifier des mutations récurrentes dans la majorité

des LAM à caryotype normal. Ces mutations permettent de mettre en évidence

l’hétérogénéité de ce groupe cytogénétique sur le plan biologique et pronostique. Les

mutations de NPM1, FLT3 et CEBPA sont considérées comme nécessaires pour la

stratification pronostique et la prise en charge thérapeutique des LAM en pratique

courante. Les mutations de NPM1 et de CEBPA sont mutuellement exclusives et

sont considérées comme associées à des entités distinctes au sein de la

classification OMS 2008 (Vardiman et al., 2009). Lorsqu’elles surviennent au sein

d’une LAM à caryotype normal, elles confèrent un pronostic favorable en l’absence

des mutations de FLT3-ITD. Il faut noter que seules les doubles mutations de

38

CEBPA sont associées à ce pronostic favorable (Fasan et al., 2014; Wouters et al.,

2009). Ainsi, la combinaison du statut mutationnel de ces 3 gènes permet d’identifier

2 génotypes favorables au sein des LAM à caryotype normal (NPM1+/FLT-ITD- et

CEBPA+/FLT3-ITD-) pour lesquels la greffe allogénique n’est plus indiquée en

première rémission complète (RC) (Schlenk et al., 2008). Les autres génotypes

(NPM1-/FLT3-ITD+, CEBPA-/FLT3-ITD+ et NPM1-/CEBPA-/FLT3-ITD-) restent de

risque intermédiaire. Au sein des LAM avec mutations de FLT3-ITD, l’analyse du

ratio allèles mutés/sauvages pourrait encore affiner cette stratification moléculaire et

guider les choix thérapeutiques (Linch et al., 2014; Pratcorona et al., 2013;

Schnittger et al., 2011).

c. Classification de l’European LeukemiaNet (ELN)

Cette classification a été publiée 2010 et constitue actuellement la référence pour la

stratification pronostique des patients atteints de LAM et traités en dehors d’essais

thérapeutiques (Döhner et al., 2010). Elle classe ces patients en 4 groupes en se

basant sur les anomalies cytogénétiques et moléculaires : favorable, intermédiaire-1,

intermédiaire-2 et défavorable (Table 8). L’impact pronostique de cette classification

a été validé chez les sujets de moins de 60 ans comme chez les plus âgés (Lazenby

et al., 2014; Mrózek et al., 2012; Röllig et al., 2011; Wetzler et al., 2014). Elle permet

actuellement de guider les traitements de post-rémission, notamment la réalisation

d’une greffe allogénique en première RC. A ce jour, les patients de risque favorable

ne sont pas candidats à l’allogreffe alors que les patients de risque défavorable

pourraient être indiqués pour des approches expérimentales dès l’initiation du

traitement. Les patients des groupes intermédiaires restent quant à eux indiqués

pour une allogreffe en première RC si un donneur compatible est disponible.

39

Table 8 : Classification pronostique de l’European LeukemiaNet

(Döhner et al., 2010)

ELN risk Cytogenetic/molecular abnormality

Favorable

t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1

inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11

Normal karyotype and: Mutated NPM1 without FLT3-ITD

Mutated CEBPA

Intermediate-1 Normal karyotype and:

Mutated NPM1 and FLT3-ITD

Wild-type NPM1 and FLT3-ITD

Wild-type NPM1 without FLT3-ITD

Intermediate-2 t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL

Cytogenetic abnormalities not classified as favorable or adverse

Unfavorable

inv(3)(q21q26.2) or t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1

t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214

t(v;11)(v;q23); MLL rearranged

-5 or del(5q)

-7

abn(17p)

complex karyotype (≥ 3 abnormalities)

40

OBJECTIFS ET PRESENTATION DES TRAVAUX

Nos travaux ont porté sur les LAM avec dysplasie, identifiées par la classification

OMS 2008 sous le nom de LAM-MRC (« AML with myelodysplasia-related

changes »). Actuellement définies par la présence de critères cliniques, cytologiques

et cytogénétiques, les LAM-MRC forment un groupe hétérogène tant sur le plan

biologique que pronostique. La complexité de cette définition rend difficile son

utilisation courante. En effet, les termes de LAM de novo et secondaires restent

encore souvent utilisés pour séparer les patients avec ou sans antécédent de SMD.

Cela peut porter à confusion puisque certaines LAM de novo peuvent avoir des

critères morphologiques ou cytogénétiques de SMD, les classant de ce fait comme

des LAM-MRC au même titre que la présence d’antécédent de SMD. De plus, il n’est

pas exclu que certaines LAM aient évolué à partir d’un SMD qui n’a pas été

préalablement diagnostiqué. Cela pourrait se produire en cas de cytopénies

chroniques, peu profondes et cliniquement asymptomatiques. Dans ces cas, le

diagnostic d’hémopathie se ferait uniquement au moment de la transformation en

LAM et celle-ci serait considérée comme de novo. La présence de DML ou

d’anomalies cytogénétiques de SMD pourrait alors permettre de les reclasser en

LAM-MRC, mais ne sont pas d’interprétation facile. Alors qu’un minimum de 10% de

cellules dysplasiques est suffisant pour les diagnostics de SMD, 50% sur au moins 2

lignées sont nécessaires pour affirmer la DML et poser ainsi le diagnostic de LAM-

MRC. Le fait que cette DML ne soit pas toujours retrouvée chez les patients ayant un

antécédent de SMD et/ou des anomalies cytogénétiques de SMD pourrait remettre

en question ce seuil arbitraire de 50%.

41

Nous avons fait l’hypothèse que la caractérisation moléculaire des LAM-MRC

pourrait permettre d’identifier des marqueurs spécifiques associés à ces pathologies.

Ils pourraient alors être considérés comme des critères moléculaires de LAM-MRC

pour affiner les définitions actuelles et stratifier le pronostic de patients (comme c’est

déjà le cas pour les LAM mutées NPM1 ou CEBPA dans le LAM à caryotype

normal). Enfin, ces marqueurs pourraient éventuellement être prédictifs de la

réponse aux traitements ciblés sur des voies de leucémogenèse particulièrement

impliquées dans les LAM-MRC et à terme pourraient être à l’origine du

développement de nouvelles thérapeutiques.

Dans ce mémoire, nous avons posé les questions suivantes :

- Quelle est la valeur pronostique des critères actuels définissant les LAM-

MRC ? (article 1)

- Existe-il des marqueurs moléculaires spécifiques des LAM-MRC ? (article 2)

- La caractérisation moléculaire des LAM-MRC permet-elle la stratification

pronostique de ces patients ? (article 3)

- Les anomalies moléculaires des LAM-MRC peuvent-elles être utilisées pour

prédire la sensibilité aux nouvelles drogues dans une démarche de médecine

personnalisée ? (article 4)

42

ARTICLE 1 :

Prognostic significance of myelodysplasia-related

changes according to the WHO classification among

ELN-intermediate-risk AML patients

Devillier R, Gelsi-Boyer V, Murati A, Prebet T, Rey J, Etienne A, D’Incan E,

Charbonnier A, Blaise D, Mozziconacci MJ, Vey N

American Journal of Hematology 2014 Sep 13 [Epub ahead of print]

43

44

45

Article 1 :

“Prognostic significance of myelodysplasia-related changes according to the WHO

classification among ELN-intermediate-risk AML patients”

Résumé et discussion spécifique

Les LAM-MRC sont classiquement considérées comme des LAM de haut risque du

fait de leur association à un caryotype défavorable et à l’âge avancé des patients

limitant les possibilités de traitements curatifs (Appelbaum et al., 2006; Miesner et al.,

2010). Cependant, l’impact de la dysplasie morphologique, indépendamment de ces

facteurs, reste controversé (Haferlach et al., 2003; Miesner et al., 2010; Wandt et al.,

2008; Xu et al., 2014).

Afin de s’affranchir de l’impact de la cytogénétique, nous avons sélectionné pour

cette étude uniquement des patients atteints de LAM de risque intermédiaire selon la

stratification de l’ELN (Döhner et al., 2010) et comparé le devenir des patients selon

qu’ils aient ou non des critères définissants les LAM-MRC.

Nos résultats ne montrent pas de différence en termes de taux de rémission

complète, de survie sans leucémie et de survie globale entre les patients avec et

sans critères de LAM-MRC. Cela suggère que ces critères n’ont pas d’impact

pronostique au sein des LAM de risque intermédiaire, ce qui pourrait être expliqué

par l’hétérogénéité biologique de cette entité. La caractérisation moléculaire des

LAM-MRC pourrait ainsi mettre en évidence des altérations spécifiques et aider à la

classification diagnostique et pronostique de ces pathologies.

46

ARTICLE 2 :

Acute myeloid leukemia with myelodysplasia-related

changes are characterized by a specific molecular pattern

with high frequency of ASXL1 mutations

Devillier R, Gelsi-Boyer V, Brecqueville M, Carbuccia N, Murati A, Vey N, Birnbaum

D, Mozziconacci MJ.

Am J Hematol. 2012 Jul;87(7):659-62.

47

Acute myeloid leukemia with myelodysplasia-related changes arecharacterized by a specific molecular pattern with high frequency of

ASXL1 mutations

Raynier Devillier,1,2 Veronique Gelsi-Boyer,1,3,4 Mandy Brecqueville,1 Nadine Carbuccia,1 Anne Murati,1,3

Norbert Vey,1,2,4 Daniel Birnbaum,1 and Marie-Joelle Mozziconacci1,3*

To determine whether the distinct and heterogeneous WHO category called ‘‘AML with myelodysplasia-

related changes’’ (MRC-AML), presents speci c molecular alterations we searched for mutations in genes

known to be mutated in malignant myeloid diseases. In 48 MRC-AML patients analyzed, we found 17 muta-tions in ASXL1 (35%), eight in RUNX1 (17%), seven in TET2 (15%), 12 in IDH (n 5 2) or IDH2 (n 5 10) (25%),four in DNMT3A (8%), four in NPM1 (8%), and one in FLT3 (2%). Mutations were more frequent in the inter-

mediate cytogenetic (IC) subgroup of 36 patients than in the unfavorable karyotype subgroup, with an aver-

age ratio mutations/patients of 1.36 [0–3] vs. 0.33 [0–2] (P < 0.001). Then, we compared these 36 patients

with IC MRC-AML with a control panel of 37 no-MRC-AML patients, who had both IC and no dysplasia. ICMRC-AMLs were associated with higher incidence of ASXL1 mutations (47% vs. 0%, P < 0.001) and lower

incidence of DNMT3A (6% vs. 38%, P 5 0.001), NPM1 (11% vs. 62%, P < 0.001) and FLT3 (3% vs. 49%, P <

0.001) mutations. No difference was found in the incidence of IDH1/2 or TET2 mutations according to the

presence of dysplasia. Complete remission rate after intensive treatment was lower in the MRC-AML groupthan in the no-MRC-AML group (48% vs. 78%, P 5 0.023) and in wild type NPM1 patients (50% vs. 84%, P 5

0.009). Our study showed that MRC-AML as de ned in the WHO 2008 classi cation presents a speci c

mutation pattern characterized by a high frequency of ASXL1 mutations and a low rate of NPM1, FLT3, and

DNMT3A mutations. Am. J. Hematol. 87:659–662, 2012. VVC 2012 Wiley Periodicals, Inc.

IntroductionThe 2008 revised WHO classi cation1 recognizes a spe-

ci c category of acute myeloid leukemia (AML) called AMLwith myelodysplasia-related changes (MRC-AML). MRC-AMLs present myelodysplasia-related phenotype and cyto-genetic abnormalities and/or exhibit dysplasia in 50% ormore of the cells in two or more myeloid lineages and/orhistory of myelodysplastic syndrome (MDS). This categoryincludes heterogeneous diseases with distinct clinical andcytogenetic entities. MRC-AMLs are classically consideredas high-risk diseases because they are frequently second-ary and/or unfavorable cytogenetic cases associated witholder age, un t for intensive care.2 To our knowledge, noprevious study has ever reported the predictive value ofdysplasia independently of age, cytogenetic, or previouslydiagnosed MDS. To date, cytogenetic and molecular altera-tions but not dysplasia are considered as independent fac-tors in uencing both prognosis and therapeutic choices.3–5

To determine whether this WHO category, currently de nedsolely upon morphological and cytogenetic criteria,presents speci c molecular alterations, we searched formutations in genes known to be mutated in malignant mye-loid diseases. We report clinical, biological, and molecularcharacteristics of AML according to the presence of criteriafor MRC-AML as described in the WHO classi cation.

MethodsSelection criteria. Patients with the following criteria were included

(1) Marrow blast > 20% at the time of diagnosis except for erythroleuke-

mia according to the FAB classi cation (AML6); (2) No favorable cyto-

genetic abnormalities, i.e., t(8;21), inv(16)/t(16;16), t(15;17); (3) Total

bone marrow sample available at diagnosis; and (4) Signed informed

consent for somatic genetic analyses.

Cases were separated in two groups according to the presence or

not of dysplastic features at diagnosis. Patients with at least one criteria

for AML with MRC according to the WHO classi cation constituted the

MRC-AML group: presence of multilineage dysplasia with (secondary

MRC-AML subgroup) or without (primary MRC-AML subgroup) history

of MDS or myelodysplastic/myeloproliferative syndrome (MDS/MPN);

myelodysplasia-related cytogenetic abnormalities (complex karyotype,

-5 or del(5q), -7, 11q23 abnormalities except t(9;11), t(6;9), 3q26

abnormalities and 17p abnormalities). Cases without any of these crite-

ria formed the no-MRC-AML group.

Treatment modality and response. Patients received intensive

induction therapy (anthracycline and cytarabine), non-intensive treat-

ment (azacytidine, low-dose cytarabine), or supportive care only associ-

ated or not with oral chemotherapy such as 6-mercaptopurine and/or

methotrexate and/or hydroxyurea. Induction treatment modalities were

chosen according to patient’s age, performance status, and cytogenetic

abnormalities. After induction therapy, response was de ned according

to Cheson criteria:6 Bone marrow blast < 5%; no Auer rods; platelet

count > 100 G/L; absolute neutrophil count > 1 G/L and absence of

extramedullary disease de ned complete remission (CR). Patients

reached CR with incomplete recovery when they presented with all cri-

teria for CR except for residual neutropenia < 1 G/L or thrombopenia

< 100 G/L.

Direct gene sequencing. We used direct Sanger gene sequencing

to search for somatic mutations in ASXL1 (Exon 12), RUNX1 (Exons

1–8), TET2 (Exons 3–11), IDH1 (Exon 4) and IDH2 (Exon 4), DNMT3A

(Exons 15–23), FLT3 (internal tandem duplications—ITD—Exons 14

and 15 and point mutation in Exon 20-encoded kinase domain—TKD)

and NPM1 (Exon 12). Methods have been described previously.7

1Centre de Recherche en Cancerologie de Marseille, Laboratoire d’Onco-logie Moleculaire, UMR1068 Inserm, Institut Paoli-Calmettes, Marseille,France; 2Departement d’Hematologie, Institut Paoli-Calmettes, Marseille,France; 3Departement de BioPathologie, Institut Paoli-Calmettes, Marseille,France; 4Faculte de Medecine, Aix-Marseille Universite, Marseille, France

Con ict of interest: Nothing to report.

*Correspondence to: Dr. Marie-Joelle Mozziconacci, Institut Paoli-Calmettes,232 Bd de Sainte-Marguerite, Marseille 13009, France.E-mail: [email protected]

Received for publication 9 March 2012; Accepted 14 March 2012

Am. J. Hematol. 87:659–662, 2012.

Published online 30 March 2012 in Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com).DOI: 10.1002/ajh.23211

Research Article

VVC 2012 Wiley Periodicals, Inc.

American Journal of Hematology 659 http://wileyonlinelibrary.com/cgi-bin/jhome/35105

48

Statistical analyses. We used a Chi-square test to compare patient

characteristics and mutation frequencies in different groups, and to nd

predictive factors associated with CR achievement. Overall survival

(OS) was calculated from date of AML diagnosis to death or last con-

tact using Kaplan Meier8 estimates and Log Rank test.

ResultsPatient characteristics. Eighty- ve patients were studied.

Forty-eight and 37 patients formed the MRC-AML and theno-MRC-AML groups, respectively. Patient characteristicsare summarized in Table I. MRC-AML patients were olderthan no-MRC-AML patients (median age of 72 vs. 63, P <0.001). Twenty-three (48%) patients of the MRC-AML grouppresented with a previously diagnosed MDS (n 5 18) orCMML (n 5 5) and were considered as secondary MRC-AML cases. The 25 remaining MRC-AML patients pre-sented with multilineage dysplasia. Twelve (25%) MRC-AML cases had unfavorable cytogenetic abnormalities whileall the no-MRC-AML cases presented with intermediate riskkaryotype. No-MRC-AML patients were more frequentlytreated by intensive induction herapy (91% vs. 55%, P <0.001). In the MRC-AML patients, no difference was foundin the characteristics of primary and secondary MRC-AMLin terms of age (P 5 0.605), cytogenetic (P 5 0.308), andintensive induction (P 5 0.06).

Mutation frequencies in 48 MRC-AML patients. We found17 mutations in ASXL1 (35%), eight in RUNX1 (17%),seven in TET2 (15%), 12 in IDH1 (n 5 2) or IDH2 (n 5 10)(25%), four in DNMT3A (8%), four in NPM1 (8%), and onein FLT3 (2%) (Table II). The pro les of concomitant muta-tions are shown in Fig. 1. Mutations were more frequent inthe intermediate cytogenetic (IC) subgroup than in theunfavorable karyotype subgroup, with an average ratio

mutations/patients of 1.36 [0–3] versus 0.33 [0–2] (P <0.001). Mutated ASXL1 (P 5 0.002) and IDH2 (P 5 0.039)cases were associated with the IC subgroup. Interestingly,no signi cant difference in the mutation rates was foundbetween primary and secondary MRC-AMLs.

Mutation frequencies in IC AML. We restricted furtheranalysis to AML with IC because most of the mutatedcases were found in this entity. The 36 patients with ICMRC-AML were compared with the control panel of 37 no-MRC-AMLs, who had both IC and no dysplasia. We foundthat IC MRC-AML mutation pro le was different from IC no-MRC-AML (Table III; Fig. 2). MRC-AMLs were character-ized by the presence of ASXL1 mutations (47% vs. 0%, P< 0.001). There was also a trend toward a higher incidenceof RUNX1 mutations in MRC-AML cases (22% vs. 8%, P5 0.087). In contrast, in IC no-MRC-AMLs, we found morefrequent mutations of DNMT3A (38% vs. 6%, P 5 0.001),

TABLE I. Patient Characteristics

MRC-AML

(n 5 48)

No-MRC-AML

(n 5 37) P

Gender

Men 33 69% 19 51% 0.08

Age

Median (year) [range] 72 [29–86] 63 [21–83] < 0.001

Occurrence of MRC-AML

Primary MRC-AML 25 52%

Secondary MRC-AML 23 48%

MDS 18 38%

CMML 5 10%

Cytogenetic risk group

Intermediate 36 75% 37 100% 0.001

Normal karyotype 18 38% 31 84%

Other 18 38% 6 16%

Unfavorable 12 25% 0 0%

Complex karyotype 8 17%

Monosomal karyotype 3 6%

17p abnormality 1 2%

Induction therapy

Intensive 26 55% 32 91% < 0.001

TABLE II. Mutations of ASXL1, RUNX1, TET2, IDH1, IDH2, DNMT3A, NPM1,

and FLT3 in 48 Cases of MRC-AML According to Cytogenetic Risk Group

MRC-AML

(n 5 48)

Intermediate

group (n 5 36)

Unfavorable

group (n 5 12)

PMutated cases % Mutated cases % Mutated cases %

ASXL1 17 35 17 47 0 0 0.002

RUNX1 8 17 8 22 0 0 0.080

TET2 7 15 6 17 1 8 0.431

IDH1 2 4 1 3 1 8 0.441

IDH2 10 21 10 28 0 0 0.039

DNMT3A 4 8 2 6 2 17 0.257

NPM1 4 8 4 11 0 0 0.303

FLT3 1 2 1 3 0 0 0.750

Figure 1. Pro les of concomitant mutations in 48 cases of MRC-AML according

to the cytogenetic risk group. Primary and secondary MRC-AMLs are represented

with grey and black bars respectively. [Color gure can be viewed in the online

issue, which is available at wileyonlinelibrary.com.]

TABLE III. Mutations of ASXL1, RUNX1, TET2, IDH1, IDH2, DNMT3A, NPM1,

and FLT3 in 36 Cases of Intermediate Cytogenetic MRC-AML Cases

Compared With 37 Cases of No-MRC-AML

MRC-AML (n 5 36) No-MRC-AML (n 5 37)

PMutated cases % Mutated cases %

ASXL1 17 47 0 0 < 0.001

RUNX1 8 22 3 8 0.087

TET2 6 17 5 14 0.480

IDH1 1 3 3 8 0.318

IDH2 10 28 6 16 0.181

DNMT3A 2 6 14 38 0.001

NPM1 4 11 23 62 < 0.001

FLT3 1 3 18 49 < 0.001

660 American Journal of Hematology

research article

49

NPM1 (62% vs. 11%, P < 0.001), and FLT3 (49% vs. 3%,P < 0.001). ASXL1 mutations were associated with RUNX1mutations (P 5 0.039) and mutually exclusive withDNMT3A (P 5 0.011) and NPM1 (P 5 0.001) mutations inour series. Only one case of MRC-AML carried a FLT3-ITD; it was associated with an ASXL1 mutation, whereasthe overall trend was a mutual exclusivity of ASXL1 andFLT3-ITD mutations. NPM1 mutations were associated withmutated DNMT3A (P 5 0.001) and FLT3-ITD (P 5 0.001)and wild type RUNX1 (P 5 0.011). No difference was foundbetween MRC-AMLs and no-MRC-AMLs in the mutationfrequencies of IDH1/2 (31% vs. 24% respectively, P 50.369) and TET2 (17% and 14% respectively, P 5 0.480).

Response after induction therapy and survival. Amongthe 58 patients treated by intensive induction chemother-apy, 35 achieved CR (60%), 10 achieved CRi (9%), and 18failed (31%). Low CR rates were associated with unfavora-ble karyotype (0% vs. 66%, P 5 0.007). After excludingunfavorable karyotype patients, CR rate after intensivetreatment remained lower in the MRC-AML group than inthe no-MRC-AML group (48% vs. 78%, P 5 0.023) and inwild type NPM1 patients (50% vs. 84%, P 5 0.009). Wedid not found predictive value of other mutated genes onCR achievement after induction therapy in IC patients. Inthe MRC-AML patients, secondary MRC-AML was associ-ated with lower CR rate than primary MRC-AML (14% vs.64%, P 5 0.043).

No difference was found in 2-year OS between MRC-AML and no-MRC-AML groups after induction therapy (48%vs. 44% respectively, P 5 0.345). In MRC-AML patients, 2-year OS was 40% and 11% for the primary and secondaryMRC-AML subgroups, respectively (P 5 0.025) (Fig. 3). Nomutation was found to signi cantly in uence OS.

DiscussionWe have compared here clinical, biological, and molecu-

lar features of MRC-AML vs no-MRC-AML. The WHO clas-si cation1 pooled in MRC-AML both secondary and/orunfavorable karyotype AML and primary AML presentingwith multilineage dysplasia. We wondered whether the

mutation status of genes involved in myeloid malignanciescould help better distinguish MRC-AML from no-MRC-AMLand/or primary and secondary MRC-AML. Our resultsshowed that mutations of ASXL1, RUNX1, TET2, IDH1,IDH2, DNMT3A, NPM1, and FLT3 mainly occurred in theIC group. This suggests different molecular pathways formonosomal and/or complex karyotype MRC-AMLs. Thenwe focused our analyses on IC MRC-AMLs and found dif-ferent mutation pro les according to the presence of dys-plasia. We found that MRC-AMLs have a mutation patterncharacterized by a high frequency of ASXL1 mutations,which reached 47% among patients with IC risk. ASXL1mutations have been found in only 10% of de novo AMLcases reported in the literature.9 ASXL1 mutations aremore frequently found in older patients and in MDS and/orCMML.9–12 The median age of 72 years in the MRC-AMLgroup and the high proportion of secondary MRC-AML(48%) could explain in part the very high frequency ofASXL1 mutations in our population. It also seemed thatRUNX1 mutations are more frequently found in MRC-AML(17% in our series and 22% in IC risk patients) than in no-MRC-AML (8%). RUNX1 mutation frequency was previ-ously described in de novo AML and reached 7%.13 More-over, we found a lower rate of DNMT3A (6%), NPM1(11%), and FLT3 (3%) mutations in our MRC-AML than inour no-MRC-AML patients; in the literature DNMT3A,NPM1 and FLT3 mutations were found in 34%,14,15 60%,16

and 30%17 of IC AML, respectively. Conversely, TET2 andIDH mutations were similarly distributed in MRC-AML andno-MRC-AML in our series, as well as in previousreports.18–20

We showed that MRC-AML as de ned in the WHO 2008classi cation presents a speci c mutation pattern charac-terized by a high frequency of ASXL1 and RUNX1 muta-tions and a low rate of NPM1, FLT3, and DNMT3A muta-tions. Importantly, no difference was found in mutation pro- le between primary and secondary MRC-AML. Thissuggests that leukemogenesis of MRC-AML could have aspeci c molecular pathway contributing to the dysplasticphenotype whatever the presence or not of a previouslydiagnosed MDS or MDS/MPN. Alternatively, MRC-AMLmay systematically derive from a previous chronic stagethat sometimes goes unnoticed.

It is well documented that MRC-AMLs are associatedwith unfavorable cytogenetic and older age, leading to apoor prognosis.2 In our series, we found that the presence

Figure 2. Pro les of concomitant mutations in 36 cytogenetic risk MRC-AML

patients compared with the 37 cases of no-MRC-AML. [Color gure can be viewed

in the online issue, which is available at wileyonlinelibrary.com.]

Figure 3. Overall survival of primary versus secondary MRC-AML in 48 MRC-

AML patients.

American Journal of Hematology 661

research article

50

of dysplasia was signi cantly associated with less CR afterinduction therapy (48% vs. 78%, P 5 0.023). However,these results were not translated into an OS bene t. Thelow numbers and the bias related to patient selection for in-tensive induction could explain in part this result. It seemsthat secondary MRC-AML reached lower CR rate (14% vs.64%, P 5 0.043) and had unfavorable outcome comparedwith primary MRC-AML (2-year OS: 11% vs. 25%, P 50.025).

Beyond the speci c morphologic and cytogenetic fea-tures that de ne MRC-AML, molecular abnormalities suchas ASXL1 and RUNX1 mutations, although not speci c,could help delineate this recent distinct entity. The high fre-quency of ASXL1 mutations in MRC-AML suggests epige-netic deregulation in this kind of myeloid malignancies. Thiscould open perspectives through molecular characterizationof MRC-AML and adapted treatment strategies with newdrugs such as demethylating agents or HDAC inhibitors.

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662 American Journal of Hematology

research article

51

Article 2 :

“Acute myeloid leukemia with myelodysplasia-related changes are characterized by a

specific molecular pattern with high frequency of ASXL1 mutations”


Nous avons montré précédemment que les critères de l’OMS 2008 définissant les

LAM-MRC ne semblent pas présenter de valeur pronostique propre mais que cette

évaluation reste délicate du fait d’une importante hétérogénéité. L’identification de

sous-groupes au sein des LAM-MRC en tant qu’entités distinctes sur le plan

biologique et pronostique semble primordiale pour améliorer les stratifications

actuelles et les orientations thérapeutiques. Afin de déterminer si les LAM-MRC

présentent des altérations moléculaires spécifiques, le statut mutationnel de gènes

impliqués dans les hémopathies myéloïdes a été évalué au sein d’une cohorte de 48

patients atteints de LAM-MRC. Nous avons sélectionné des gènes dont les mutations

sont majoritairement rapportées dans les LAM : DNMT3A (Ley et al., 2010), NPM1

(Falini et al., 2005), FLT3 (Fröhling et al., 2002), IDH (Boissel et al., 2010), RUNX1

(Gaidzik et al., 2011) ou dans les SMD ou NMP1 : ASXL1(Gelsi-Boyer et al., 2009),

TET2 (Delhommeau et al., 2009). Nous avons fait l’hypothèse que les LAM-MRC, qui

partagent des caractéristiques de LAM et de SMD, pourraient présenter une

combinaison spécifique de ces mutations.

Nous avons retrouvé 17 mutations sur ASXL1 (35%), 8 sur RUNX1 (17%), 7 sur

TET2 (15%), 12 sur IDH1 (n = 2) ou IDH2 (n = 10) (25%), 4 sur DNMT3A (8%), 4 sur

NPM1 (8%), et une sur FLT3 (2%). Les mutations d’ASXL1 étaient spécifiquement

identifiées au sein des 36 LAM-MRC de risque cytogénétique intermédiaire, où leur

incidence était de 50%.

52

Nous avons ensuite comparé ces profils mutationnels à ceux de 36 patients sans

critère de LAM-MRC (LAM-non-MRC). Les mutations d’ASXL1 ont été exclusivement

retrouvées chez les patients du groupe LAM-MRC (47% vs. 0%, p < 0,001) tandis

que celles de RUNX1 semblaient plus fréquentes dans ce même groupe (22% vs.

8%, p = 0,087). Inversement, ces patients présentaient moins fréquemment de

mutations de DNMT3A (6% vs. 38%, p = 0,001), de NPM1 (11% vs. 62%, p < 0,001)

et de FLT3 (3% vs. 49%, p < 0,001). Les mutations d’ASXL1 semblaient associées à

celles de RUNX1 (p = 0,059) et étaient exclusives de celles de DNMT3A (p = 0,016),

de NPM1 (p < 0,001) et de FLT3 (p = 0,032). Inversement, les mutations de NPM1

étaient associées à celles de DNMT3A (p = 0,001) et de FLT3 (p = 0,012), et

exclusives de celles de RUNX1 (p = 0,005). Les mutations des gènes IDH et TET2

étaient mutuellement exclusives, sans différence de fréquence entre les groupes

LAM-MRC et LAM-non-MRC.

Ces résultats semblent indiquer la présence de 2 profils mutationnels exclusifs,

associant les mutations d’ASXL1 et de RUNX1 aux LAM-MRC et les mutations de

DNMT3A, NPM1 et FLT3 aux LAM-non-MRC. Dans cette étude, les mutations

d’ASXL1 n’étaient observées que dans les LAM-MRC (47% vs. 0%). Dans des

cohortes aspécifiques de LAM dont les critères de LAM-MRC n’étaient pas rapportés,

les taux de mutations d’ASXL1 variaient de 11 à 18% (Chou et al., 2010; Schnittger

et al., 2013). Ces études comparant des LAM avec et sans mutations d’ASXL1

montrent que les mutations sont associées à l’âge avancé, le sexe masculin, les

antécédents de SMD, les mutations de RUNX1, et aux formes sauvages de

DNMT3A, NPM1 et FLT3. Elles semblent également corrélées à un pronostic

péjoratif. Ces résultats sont proches de ceux que nous avons mis en évidence lors

de notre analyse comparative LAM-MRC vs LAM-non-MRC et suggèrent que les

53

mutations d’ASXL1 pourraient être un marqueur moléculaire potentiel de LAM-MRC.

Cependant, mutations d’ASXL1 et critères de LAM-MRC ne sont pas entièrement

superposables, puisque 1 patient sur 2 dans notre série avait une LAM-MRC sans

mutation d’ASXL1. Parmi ces patients non mutés pour ASXL1, d’autres altérations

moléculaires équivalentes aux mutations d’ASXL1 pourraient aboutir au même

phénotype leucémique. Les études pangénomiques pourraient en partie répondre à

cette problématique. En parallèle, les patients présentant des mutations de type

« LAM-non-MRC » telles que celles de NPM1 ou de DNMT3A pourraient

éventuellement être reclassés hors du groupe des LAM-MRC. Cette hétérogénéité

moléculaire au sein même des LAM-MRC participe à la difficulté d’établir une valeur

pronostique spécifique (Wandt et al., 2008; Xu et al., 2014). Du fait du faible effectif

et de l’hétérogénéité des traitements reçus, nous n’avons pas pu mettre en évidence

l’impact pronostique péjoratif des mutations d’ASXL1 tel que rapporté dans les

hémopathies myéloïdes (Bejar et al., 2011; Brecqueville et al., 2014; Chou et al.,

2010; Gelsi-Boyer et al., 2010; Schnittger et al., 2013; Thol et al., 2011; Vannucchi et

al., 2013).

Au-delà des aspects clinico-morphologiques et cytogénétiques qui définissent

actuellement les LAM-MRC, l’identification de marqueurs moléculaires associés à la

dysplasie telles que les mutations d’ASXL1 pourraient être utile pour affiner les

classifications actuelles, permettant de les différencier en entités biologiquement

distinctes, associées à des pronostics spécifiques.

54

ARTICLE 3 :

Clinical, morphological and molecular

characterization of acute myeloid leukemias with

myelodysplasia-related changes

Devillier R, De Mas V, Gelsi-Boyer V, Demur C, Murati A, Corre J, Prebet T, Bertoli

S, Brecqueville M, Recher C, Vey N, Mozziconacci MJ, Delabesse R and Birnbaum D

Manuscrit soumis à Oncotarget, revisions majeures en cours

55

Clinical, morphological and molecular characterization of acute myeloid

leukemias with myelodysplasia-related changes

Raynier Devillier1,2,3, Véronique De Mas5*, Veronique Gelsi-Boyer2,3,4*, Cecile

Demur5*, Anne Murati3,4*, Jill Corre5*, Thomas Prebet1,3, Sarah Bertoli5, Mandy

Brecqueville2,3, Christian Recher5,6, Norbert Vey1,2,3, Marie-Joelle Mozziconacci3,4,

Eric Delabesse5,6 and Daniel Birnbaum3

1Hematology department, Institut Paoli Calmettes, Marseille, France

2Aix-Marseille University, Marseille, France

3Département d'Oncologie Moléculaire ; Centre de Recherche en Cancérologie de

Marseille (CRCM) ; Institut Paoli-Calmettes; UMR1068 Inserm; Marseille, France

4Biopathology department, Institut Paoli Calmettes, Marseille, France

5Hematology department, Institut Universitaire du Cancer Toulouse – Oncopole,

Toulouse, France

6Toulouse University, Toulouse, France

* These authors contributed equally to this work

Running title: Characterization of AML with myelodysplasia-related changes

Corresponding author:

Marie-Joelle Mozziconacci

Institut Paoli Calmettes, Biopathology department

232 boulevard Sainte Marguerite

13009 Marseille, France

Tel: +33 4 91223377

E-mail: [email protected]

Keywords: acute myeloid leukemia; myelodysplasia-related changes; mutational

status; ASXL1; TP53

56

Abstract

Acute myeloid leukemias (AML) with myelodysplasia-related changes (AML-MRC)

are defined by the presence of multilineage dysplasia (MLD), and/or myelodysplastic

syndrome (MDS)-related cytogenetics, and/or previous MDS. To determine if

molecular characterization could identify distinct biological and prognostic subgroups

we analyzed the mutational status of ASXL1, RUNX1, DNMT3A, NPM1, FLT3 and

TP53 in 125 AML-MRC patients according to the presence of MLD, cytogenetics and

outcome. ASXL1 mutations (n=26, 21%) were associated with a higher proportion of

marrow dysgranulopoiesis (mutant vs. wild-type: 75% vs. 55%, p=0.030) and were

mostly found in intermediate cytogenetic AML (23/26) in which they predicted inferior

2-year overall survival (OS, mutant vs. wild-type: 14% vs. 37%, p=0.030). TP53

mutations (n=28, 22%) were mostly found in complex karyotype AML (26/28) and

predicted poor outcome within unfavorable cytogenetic risk AML (mutant vs. wild-

type: 9% vs. 40%, p=0.040). In multivariate analysis, the presence of either ASXL1 or

TP53 mutation was the only independent factor associated with shorter OS (HR,

95%CI: 2.53, 1.40-4.60, p=0.002) while MLD, MDS-related cytogenetics and previous

MDS history did not influence OS. We conclude that ASXL1 and TP53 mutations

identify two molecular subgroups among AML-MRCs, with specific poor prognosis.

This could be useful for future diagnostic and prognostic classifications.

57

Introduction

In the WHO 2008 classification, acute myeloid leukemia (AML) with myelodysplasia-

related changes (AML-MRC) is defined as a distinct entity by the presence of

multilineage dysplasia (MLD), and/or myelodysplastic syndrome (MDS)-related

cytogenetics, and/or previously diagnosed MDS or MDS/Myeloproliferative neoplasm

(MDS/MPN)[1]. The prognostic value of these three criteria is not established. The

independent prognostic value of MLD is controversial and varies among different

subsets of AML[2–7]. AML with MDS-related cytogenetics or previously diagnosed

MDS or MDS/MPN have often unfavorable cytogenetics, and are associated with

poorer outcome than AML without criteria of AML-MRC[2,8,9].

Although gene mutations are now a major tool for AML classification into distinct

entities with specific prognosis[10–12], no molecular pattern is currently associated

with AML-MRC. We hypothesized that molecular characterization of AML-MRC could

help identify subgroups of AML-MRC with distinct biological features and specific

outcome. We had previously reported that AML-MRC have a specific mutation

pattern sharing mutations found in both AML and high risk MDS and a particularly

high frequency of ASXL1 mutation[13]. We report here a cohort of patients with AML-

MRC for whom we analyzed the presence of mutational events according to AML-

MRC criteria (MLD, cytogenetics and patient history) and identified mutation-based

subgroups with specific poor outcome.

58

Patients and Methods

Selection criteria

We conducted a retrospective analysis of patients from two French centers. Selection

criteria for analyses were: (i) Diagnosis of AML with criteria for AML-MRC according

to the WHO classification[1]: previously diagnosed MDS or MPN/MDS; and/or

multilineage dysplasia (MLD); and/or MDS-related cytogenetic abnormalities

(complex karyotype (CK) defined by three or more chromosomal abnormalities, -7 or

del(7q); -5 or del(5q); i(17q) or t(17p); -13 or del(13q); del(11q); del(12p) or t(12p);

del(9q); idic(X)(q13); t(11;16)(q23;p13.3); t(3;21)(q26.2;q22.1); t(1;3)(p36.3;q21.1);

t(2;11)(p21;q23); t(5;12)(q33;p12); t(5;7)(q33;q11.2); t(5;17)(q33;p13); t(5;

10)(q33;q21); t(3;5)(q25;q34); (ii) Genomic DNA available for mutational analyses.

AML with inv(3)/t(3;3), t(6;9) and t(v;11q23) or with favorable risk according to the

ELN classification (inv(16)/t(16;16), t(8;21), t(15;17), normal karyotype AML with

NPM1 or CEBPA mutations) were excluded as well as therapy-related AML[14].

Morphological analyses

Smears of bone marrow aspirates made at diagnosis were collected and stained by

May-Grünwald-Giemsa. Each smear was retrospectively analyzed by two expert

cytologists in both centers. We assessed the percentage of dysplastic cells in each

lineage. MLD was assessed according to the WHO classification criteria: at least

50% of dysplastic cells in at least 2 lineages. We established the percentage of

dysgranulopoiesis (DGP), dyserythropoiesis (DEP) and dysmegakaryopoiesis (DMP)

for each smear.

Mutational analyses

59

Direct sequencing was done using the Sanger method as previously described[15].

We searched for mutation of ASXL1 (exon 12), RUNX1 (exon 1-8), DNMT3A (exon

15-23), NPM1 (exon 12), FLT3 (internal tandem duplication ITD, exon 14-15) and

TP53 (exon 4-10).

Statistical analyses

Chi-square or Fischer tests were used to compare categorical variables. We used

non-parametric test (U Mann Whitney) to compare the median percentage of

dysplastic cells in each lineage according to mutational status for each gene. As

multivariate model, linear regression was used to find correlation between

morphologic dysplasia and the presence of mutation. Survivals were calculated using

the Kaplan Meier estimator[16]. Time to event started from the date of diagnosis. We

compared survivals using the Log-Rank test. Cox regression was used for

multivariate of OS[17]. Statistics were computed using the R.3.1.0 software.

60

Results

Patient, disease and treatment characteristics

We studied 149 patients. After morphological review, 24 patients were excluded from

the main analysis because of not enough dysplasia to reach the MLD criteria. These

patients were analyzed separately (Supplemental Table 1). The remaining 125

fitting the AML-MRC criteria were considered for the main analysis and their

characteristics are reported in Table 1. Median age was 71 years (range: 18-90).

Fifty-nine patients (47%) had a previously diagnosed MDS. Seventy-one patients

(57%) had MDS-related cytogenetics, including 42 patients (34%) with complex

karyotype AML (CK-AML). Ninety-four patients were evaluable for morphological

dysplasia by the double centralized review. Multilineage dysplasia (MLD) was found

in 38/94 patients (40%). Sixty-seven patients (54%) received intensive induction

chemotherapy. Mutations were found in ASXL1 (n = 26, 21%), RUNX1 (n = 15, 12%),

DNMT3A (n = 11, 9%), NPM1 (n = 4, 3%), FLT3 (n = 9, 7%) and TP53 (n = 28, 22%).

No mutation was found in 47 (38%) patients (31 with non-complex karyotype NCK-

AML and 16 with CK-AML).

Mutation profiles according to previous history of MDS, cytogenetics and MLD

TP53 mutations were exclusive from all other mutations and all but two (26/28, 93%)

were found in CK-AML. Mutations in the other genes were almost exclusively found

in NCK-AMLs (Table 2A, Figure 1). In NCK-AMLs, ASXL1 was the most frequently

mutated gene (26/83, 31%). These mutations were associated with the absence of

MDS-related cytogenetics (MDS-related cytogenetics: yes vs. no: 4/29, 14% vs.

61

22/54, 41%, p = 0.013). Other mutations were equally distributed whether MDS-

related cytogenetics was present or not (Figure 1).

We analyzed the presence of mutations according to the cytogenetic risk group

(Table 2B). In the 94 patients evaluable for MLD, patients with criteria for MLD had

more ASXL1 mutations (MLD: 15/38, 39% vs. no MLD: 8/48, 14%, p = 0.007). We did

not find any correlation between the presence of MLD and other mutations. Median

percentages of bone marrow DGP, DEP and DMP in the 94 patients were 64%, 24%

and 45% respectively. ASXL1 mutations were associated with higher DGP (ASXL1-

mut: 75% vs. ASXL1-wt: 55%, p = 0.030) but similar DEP (ASXL1-mut: 20% vs.

ASXL1-wt: 25%, p = 0.933) and DMP (ASXL1-mut: 53% vs. ASXL1-wt: 40%, p =

0.139). There was no difference in percent of morphologic dysplasia according to any

other genes (Supplemental Table 2). In a linear regression analysis including the

mutation status of the 6 genes, mutation of ASXL1 remained associated with higher

DGP (Coefficient beta = 20, p = 0.023, Supplemental Table 3). The frequencies of

these mutations were not different according to the presence or not of prior MDS or

MDS/MPN.

Outcome after intensive chemotherapy

Only the 67 patients who received intensive induction chemotherapy were considered

for the outcome analyses. Among them, 42 achieved CR (63%). Cytogenetic risk

group, the presence of MDS-related cytogenetics, previous history of MDS or

MDS/MPN, and MLD did not influence the CR rate (data not shown). The presence of

an ASXL1 mutation was associated with a lower CR rate (ASXL1-mut vs. ASXL1-wt:

40% vs. 69%, p = 0.039). Other gene mutations did not influence the CR rate.

The 2-year OS was 24% in the 67 intensively treated patients. Cytogenetics did not

predict outcome, with a 2-year OS of 27% and 20% in the intermediate and

62

unfavorable groups, respectively (p=0.351, Table 3). Similarly, MDS-related

cytogenetics, previous history of MDS or MDS/MPN, and MLD did not significantly

influence OS (data not shown). Among the intermediate cytogenetic (IC-AML)

patients, the presence of an ASXL1 mutation was associated with worse 2-year OS

(14%) compared to patients without ASXL1 mutation (37%, p = 0.030, Figure 2A,

Table 3).

In the unfavorable cytogenetic (UC-AML) group, TP53-mutated patients had a lower

2-year OS (9%) than TP53-wild type patients (26%, p = 0.040, Figure 2B, Table 3).

In multivariate analyses adjusted for age and WBC, IC-AML with mutated ASXL1 (HR

= 2.67, 95%CI = [1.15-6.24], p = 0.023) and UC-AML with mutated TP53 (HR = 5.44,

95%CI = [2.16-13.65], p < 0.001) had shorter OS than IC-AML with wild type ASXL1

(considered as reference, HR = 1). Of note, patients with UC-AML with wild type

TP53 (HR = 1.14, 95%CI = [0.52-2.50], p = 0.743) had similar OS compared to those

with intermediate cytogenetic and no ASXL1 mutation (considered as reference, HR

= 1).

Using only the mutational status of ASXL1 and TP53 to stratify patient outcome, we

found that patients who presented with either ASXL1 or TP53 mutation had worse 2-

year OS (15%) than those with both ASXL1 and TP53 wild type (29%, p = 0.005,

Table 3, Figure 3). In multivariate analysis including age, WBC and cytogenetics, the

presence of either ASXL1 or TP53 mutation remained the only independent

predictive factor associated with both lower CR rate (HR = 0.29, 95%CI = [0.09-0.89],

p = 0.031) and shorter OS (HR = 2.53, 95%CI = [1.40-4.60] , p = 0.002).

Patients with dysplasia but without criteria for MLD

These 24 patients were separately analyzed because they did not reach AML-MRC

criteria after morphological review. Indeed, they had no previous history of MDS or

63

MDS/MPN and no MDS-related cytogenetics. Morphological review showed

dysplasia that did not reach criteria for MLD. All of them had intermediate

cytogenetics and 15 (63%) had normal karyotype (Supplemental table 1). Among

these 24 patients, median percentage of DGP, DEP and DMP was 50% (range: 7-

97%), 20% (range: 0-45%) et 26% (range: 0-83%), respectively. We found 4

mutations in ASXL1 (17%), 5 in RUNX1 (21%), 1 in DNMT3A (4%), 2 in NPM1 (8%),

4 in FLT3 (17%) and no TP53 mutation. ASXL1 mutated patients had a median

percent of DGP of 62% (range: 35-90%) vs. 50% (range: 7-97%) in those with wild

type ASXL1.

64

Discussion

We previously reported that AMLs with MRC harbor a specific mutational profile with

a high proportion of ASXL1 and RUNX1 mutations and less DNMT3A, FLT3 and

NPM1 mutations than AMLs without criteria of AML-MRC[13]. In this series including

only patients with AML-MRC, we have evaluated the correlation between these

mutations and the different criteria defining AML-MRC (previous history of MDS or

MDS/MPN, MDS-related cytogenetics, and MLD). We found that none of the three

MRC criteria could help identify a specific mutational profile within AML-MRC,

suggesting that these criteria do not have a molecular basis, at least within the limit of

the genes studied. This heterogeneity in terms of biological features as well as in

prognostic significance suggests that AML-MRC is not a true distinct entity. Although

they are defined as AML-MRC because of MDS-related cytogenetics, CK-AML

should be considered separately because of the presence of a specific mutational

profile consisting in a high frequency of TP53 mutations and the absence of other

mutations. As expected, TP53 mutations predicted a worse outcome among patients

with unfavorable cytogenetics, supporting that genetic stratification is useful to predict

differential patient outcome although classified in the same cytogenetic risk group.

This is in line with previous reports showing the close correlation between TP53

mutation, CK-AML and poor outcome[18,19]. In NCK-AML, we found that ASXL1 was

the most frequently mutated gene (31%). It was the only mutation associated with the

presence of MLD and a higher proportion of DGP in bone marrow. This is in

agreement with previous biological reports showing the role of ASXL1 in the

appearance of dysplasia and myeloid transformation[20–23]. However, the overlap

65

between ASXL1 mutations and morphological MLD was not complete, because 39%

of patients with MLD had ASXL1 mutation and 14% patients without MLD had ASXL1

mutation. Thus, there is no strong association between morphological analyses and

the presence of an ASXL1 mutation. Interestingly, ASXL1 mutations were associated

with the absence of MDS-related cytogenetics among the NCK-AML, as if ASXL1

mutations and karyotype with MDS-related abnormalities were mutually exclusive.

Finally, there was no correlation between ASXL1 mutation and previous history of

MDS or MDS/MPN.

Taken together, these results suggest that the presence of an ASXL1 mutation could

be considered as an independent molecular marker of dysplasia in AML that is not

redundant with the criteria defining AML-MRC. This could be helpful in the

perspective of developing a molecular classification of AML-MRC. This statement is

also supported by the presence of a specific gene expression profile associated with

ASXL1-mutated AML[24]. Like TP53 stratification of outcome in UC-AML, ASXL1

mutations were associated with a shorter OS in intermediate risk patients, with a 2-

year OS (14%) close to that observed in unfavorable cytogenetic patients (20%).

Different studies that did not specifically focus on AML-MRC also reported this poor

outcome associated to ASXL1 mutations[25,26]. Thus, stratification upon ASXL1 and

TP53 mutation, which identified two distinct biological subgroups among AML-MRC,

was the only significant predictor of outcome while usual cytogenetic risk

classification or the different criteria defining AML-MRC (prior MDS or MDS/MPN,

MDS-related cytogenetics and MLD) failed to predict patient outcome in our series.

Although ASXL1 and TP53 mutations could classify distinct subgroups of AML-MRC,

patients without any of these mutations still represent a heterogeneous group of

AML-MRC harboring different morphological, cytogenetic and molecular features.

66

The mutations of DNMT3A and/or NPM1, which are usually found in de novo AML

and are mutually exclusive with ASXL1 and TP53 mutations, could identify patients

for whom the definition of AML-MRC should be questioned. Falini et al. reported that

MLD did not identify distinct biological and clinical entities among NPM1-mutated

AML, with overlapping gene expression profiling and similar outcome[4]. In contrast,

some patients had morphological dysplasia but not enough to reach MLD criteria,

leading to their exclusion from the AML-MRC category in the absence of other

criteria. Among these patients, those who presented with ASXL1 mutations might be

included in the same subgroup as ASXL1-mutated AML-MRC. This supports the

need of redefining AML-MRC upon molecular abnormalities. We propose a model in

which the presence of these molecular abnormalities could help reclassify AML-MRC

(Figure 4).

Finally, we did not find any mutation in the 6 genes studied in 47 patients, suggesting

the need to identify other molecular markers to stratify these patients. Because

ASXL1 is a key regulator of the polycomb repressive complex 2 (PRC2), it is possible

that AML carrying alterations of other genes involved in methylation marks via

PRC2 and myeloid transformation such as EZH2[27,28], JARID2[29] or BAP1[30,31]

could share characteristics of ASXL1-mutated AML. This could help identify AML-

MRC through a common altered molecular pathway and could help develop future

targeted treatments.

We conclude that the criteria defining AML-MRC do not identify distinct clinical and

biological subgroups and do not predict outcome of patients with AML-MRC. In

contrast, ASXL1 and TP53-mutated AML identify two distinct biological subgroups of

AML-MRC with very poor outcome. This molecular characterization could be useful to

67

redefine AML-MRC in a future classification aiming at merging biological

characterization and specific prognostic value.

68

Acknowledgements

This work was supported by Inserm, Institut Paoli-Calmettes and grants from the

Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer (DB) and INCa-DGOS-Inserm 6038.

69

Conflict of interest

The authors have nothing to disclose.

70

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tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science.

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75

Table legends

Table 1: patient and disease characteristics

Table 2: Frequencies of mutation in ASXL1, RUNX1, DNMT3A, NPM1, FLT3-ITD and

TP53 in the 125 patients and according to the karyotypes (A) and to the cytogenetic

risk groups (B)

Table 3: Univariate analyses of overall survival

76

Table 1: patient and disease characteristics

All patients (N = 125)

N %

Median age (years, [range]) 71 [18-90]

FAB Classification

0 6 5%

1 13 10%

2 44 35%

4 25 20%

5 9 7%

6 9 7%

Unclassifiable 19 15%

Previously diagnosed MDS 59 47%

Multilineage dysplasia* 38 40%

Cytogenetics

Normal 28 22%

Abnormal non-complex 55 44%

Complex 42 34%

Monosomal 36 29%

Non monosomal 6 5%

MDS-related cytogenetics 71 57%


Intermediate 65 52%

Unfavorable 60 48%

Treatment

Intensive chemotherapy 67 54%

Non-intensive chemotherapy 31 25%

Demethylating agent 19 15%

Other 12 10%

Supportive care 27 22%

* Multilineage dysplasia was evaluated on 94 patients

MDS = myelodysplastic syndrome

77

Table 2: Frequencies of mutation in ASXL1, RUNX1, DNMT3A, NPM1, FLT3-ITD

and TP53 in the 125 patients and according to the karyotypes (A) and to the

cytogenetic risk groups (B)

A NCK-AML (N=83) CK-AML (N=42)

p

N % N %

ASXL1 26 31% 0 0% <0.001

RUNX1 14 17% 1 2% 0.004

DNMT3A 11 13% 0 0% <0.001

NPM1 4 5% 0 0% 0.243

FLT3-ITD 9 11% 0 0% 0.059

TP53 2 2% 26 62% <0.001

CK = complex karyotype; NCK = Non complex karyotype

B

Intermediate (N=65)

Unfavorable

(N=60) p

N % N %

ASXL1 23 35% 3 5% <0.001

RUNX1 11 17% 4 7% 0.067

DNMT3A 8 12% 3 5% 0.130

NPM1 4 6% 0 0% 0.070

FLT3-ITD 8 12% 1 2% 0.022

TP53 2 3% 26 43% <0.001

78

Table 3: Univariate analyses of overall survival

N 2-year OS (95%CI) p

All patients 67 24% (15-37)

Cytogenetics

Intermediate 35 27% (15-49) 0.351

Unfavorable 32 20% (10-41)

Intermediate risk

ASXL1-wt 21 37% (20-70) 0.030

ASXL1-mut 14 14% (4-52)

Unfavorable risk

TP53-wt 21 26% (12-56) 0.040

TP53-mut 11 9% (1-59)

Genotype

No mutation 41 29% (17-49) 0.005

ASXL1 or TP53 mut 26 15% (7-38)

79

Figure legends

Figure 1: Co mutation profile of ASXL1, RUNX1, DNMT3A, NPM1, FLT3-ITD and

TP53 genes in the 125 patients:

Karyotypes: normal (light grey), abnormal non-complex (dark grey) and complex (black). Cytogenetics risk group: intermediate (light blue) and unfavorable (dark blue). MLD: green bars indicate the presence of criteria for MLD and grey bars are samples that were not evaluable for MLD. These latter had at least one other criteria for AML-MRC to enrolled them in this study. MDS = myelodysplastic syndrome; MLD = multilineage dysplasia.

Figure 2: Overall survival according to the presence ASXL1 mutation in the

intermediate cytogenetic patients (A) and according to the presence of TP53

mutation in the unfavorable cytogenetic patients (B)

Figure 3: Overall survival according to the presence of ASXL1 or TP53 mutation

Figure 4: Proposition of reclassification of AML-MRC according to molecular

alterations

80

Figure 1: Co mutation profile of ASXL1, RUNX1, DNMT3A, NPM1, FLT3-ITD and TP53 genes in the 125 patients:

Karyotypes: normal (light grey), abnormal non-complex (dark grey) and complex (black). Cytogenetics risk group: intermediate (light blue) and unfavorable (dark blue). MLD: green bars indicate the presence of criteria for MLD and grey bars are samples that were not evaluable for MLD. These latter had at least one other criteria for AML-MRC to enrolled them in this study. MDS = myelodysplastic syndrome; MLD = multilineage dysplasia.

81

Figure 2: Overall survival according to the presence ASXL1 mutation in the

intermediate cytogenetic patients (A) and according to the presence of TP53

mutation in the unfavorable cytogenetic patients (B)

82

Figure 3: Overall survival according to the presence of ASXL1 or TP53

mutation

83

Figure 4: Proposition of reclassification of AML-MRC according to molecular

alterations

84

Supplemental Table 1: Characteristics (A) and mutation profile (B) of the 24

patients with dysplasia not reaching criteria for MLD

A) Characteristics

Patients with dysplasia without WHO criteria for MLD

(N = 24) N %

Age, Median (range) 68 (45-68)

WBC, Median (range) 3.7 (0.7-140)

FAB Classification

1 2 8%

2 10 42%

4 6 25%

5 1 4%

6 3 13%

Unclassifiable 2 8%

Cytogenetics

Normal 15 63%

Trisomy 8 4 17%

Trisomy 21 2 8%

Trisomy 12 1 4%

inv(9) 1 4%

t(2;9) 1 4%

WBC = white blood cells

B) Mutation profile

ASXL1

RUNX1

DNMT3A

NPM1

FLT3

TP53

85

Supplemental Table 2: Median proportion of dysplastic cells in each lineage

according to the presence of mutations

Percent DGP

p

Percent DEP

p

Percent DMP

p

N Median N Median N Median

All patients 90 64% - 84 24% - 90 45% -

ASXL1

wt (n=71) 67 55% 0.030

64 25% 0.933

70 40% 0.139

mut (n=23) 23 75% 20 20% 20 53%

RUNX1

wt (n=83) 79 65% 0.478

74 23% 0.819

80 45% 0.299

mut (n=11) 11 55% 10 28% 10 30%

DNMT3A

wt (n=87) 83 63% 0.389

79 25% 0.842

83 44% 0.916

mut (n=7) 7 75% 5 20% 7 45%

NPM1

wt (n=90) 87 64% 0.232

83 24% 0.086

86 45% 1.000

mut (n=4) 3 13% 1 80% 4 43%

FLT3

wt (n=87) 84 65% 0.441

79 24% 0.609

83 45% 0.062

ITD (n=7) 6 43% 5 30% 7 0%

TP53

wt (n=74) 70 64% 0.880

64 20% 0.112

70 45% 0.271

mut (n=20) 20 60% 20 30% 20 32%

DEP = dyserythropoiesis; DGP = dysgranulopoiesis; DMP = dysmegakaryopoiesis; mut = mutant; wt = wild type; ITD = internal tandem duplication

86

Supplemental Table 3: Linear regression for proportion of dysgranulopoeisis

according to the presence of gene mutations

Coefficient

beta Standard deviation

p

ASXL1 20.389 8.824 0.023

RUNX1 -8.026 11.148 0.474

DNMT3A 17.904 13.879 0.201

NPM1 -26.058 22.304 0.246

FLT3 -0.846 15.894 0.958

TP53 2.346 9.405 0.804

87

Article 3 :

“Clinical, morphological and molecular characterization of acute myeloid leukemias

with myelodysplasia-related changes”


A ce jour, aucun marqueur moléculaire n’est associé spécifiquement aux LAM-MRC,

bien que les mutations de certains gènes soient considérées comme des outils

majeurs dans les classifications diagnostiques et les stratifications pronostiques des

LAM (Grossmann et al., 2012; Hou et al., 2014; Patel et al., 2012). Nous avons

précédemment rapporté que les LAM-MRC présentaient un profil mutationnel

spécifique caractérisé par un taux élevé de mutation d’ASXL1 et une faible

proportion de mutations de DNMT3A, NPM1 et FLT3 (cf article 2). Dans cette série,

nous avons évalué les corrélations entre ces mutations et les différents critères

définissant les LAM-MRC (antécédent de SMD et/ou cytogénétiques de SMD et/ou

dysplasie multilignée). Il semblerait qu’aucun de ces critères ne permettent

d’identifier un profil moléculaire spécifique, suggérant qu’ils ne reposent pas sur un

rationnel/substrat moléculaire. Par définition, les LAM à caryotype complexe sont

rattachées aux LAM-MRC par analogie aux anomalies cytogénétiques de SMD.

Cependant, leur forte association aux mutations de TP53 et l’absence d’autres

anomalies devraient conduire à les classer séparément. De plus, ces mutations

semblaient associées à un pronostic péjoratif au sein des LAM à cytogénétique

défavorable, soulignant l’intérêt d’une sous-stratification pronostique moléculaire au

sein d’un même groupe de risque cytogénétique. Ces résultats sont concordants

avec ceux rapportés dans la littérature (Bowen et al., 2009; Rücker et al., 2012).

88

Après exclusion des LAM à caryotype complexe, le gène ASXL1 était le gène le plus

fréquemment muté dans notre série (31%), essentiellement dans les cytogénétiques

intermédiaires. ASXL1 était le seul gène dont les mutations étaient associées à la

présence de dysplasie multilignée selon les critères OMS et à un pourcentage plus

élevé de cellules dysgranulopoïétiques. Ces résultats semblent concorder avec

certaines études biologiques rapportant le rôle d’ASXL1 dans l’apparition du

phénotype dysplasique et la transformation leucémique (Abdel-Wahab et al., 2012,

2013; Inoue et al., 2013; West et al., 2014). Bien que significativement associées, les

mutations d’ASXL1 et la dysplasie multilignée ne sont pas strictement

superposables. Nous avons également identifié 16% de mutations d’ASXL1 dans la

cohorte analysée séparément, constituée de 24 patients sans critère de LAM-MRC

pour cause de dysplasie médullaire présente mais insuffisante. De plus, les

mutations d’ASXL1 ont été principalement identifiées dans les cas sans anomalies

cytogénétiques de SMD, alors même que les caryotypes complexes étaient exclus

de l’analyse. Enfin, il n’y avait pas de corrélation entre les mutations d’ASXL1 et la

présence d’antécédent de SMD ou de SMD/NMP. Ces résultats suggèrent que les

mutations d’ASXL1 pourraient représenter un marqueur moléculaire de dysplasie

dans les LAM, indépendamment des critères de LAM-MRC utilisés actuellement,

soulignant son potentiel intérêt et la nécessité de son intégration lors d’une révision

de la classification actuelle des LAM. Il a aussi été rapporté que les LAM mutées

ASXL1 présentaient un profil d’expression génique spécifique, suggérant qu’elles

forment une entité biologiquement distincte (Boultwood et al., 2010; Metzeler et al.,

2011).

Dans notre étude, si les mutations de TP53 stratifiaient le devenir des patients

porteurs de cytogénétiques défavorables, celles d’ASXL1 étaient associées à une

89

survie plus courte chez les patients à cytogénétiques intermédiaires. Différentes

études non restreintes aux LAM-MRC retrouvaient également ce pronostic péjoratif

associé aux mutations d’ASXL1 (Chou et al., 2010; Pratcorona et al., 2012;

Schnittger et al., 2013). Après analyse multivariée, la stratification pronostique selon

les mutations d’ASXL1 et de TP53 était le seul facteur prédictif de la survie alors que

la classification de risque cytogénétique usuelle ainsi que les différents critères des

LAM-MRC ne permettaient pas d’identifier des sous-groupes de pronostics différents.

En revanche, les patients pour lesquels aucune de ces deux mutations n’est

retrouvées forment un groupe de LAM-MRC présentant des caractéristiques

morphologiques, cytogénétiques et moléculaires hétérogènes. Les mutations de

DNMT3A et/ou de NPM1, fréquemment associées aux LAM de novo et exclusives

des mutations d’ASXL1 et de TP53, pourraient permettre d’identifier des patients

pour lesquels l’appartenance au groupe LAM-MRC pourrait être remise en cause.

Falini et al. ont rapporté que la présence de dysplasie multilignée ne permettait pas

d’identifier d’entité biologiquement et cliniquement distincte au sein des LAM mutées

NPM1, avec des profils d’expression génique superposables et une survie similaire

(Falini et al., 2010). A nouveau, ces résultats soulignent la nécessité de redéfinir les

LAM-MRC selon les anomalies moléculaires.

Enfin, pour les 47 patients qui n’avaient aucune mutation parmi les 6 gènes étudiés,

il nous semble nécessaire d’identifier d’autres marqueurs moléculaires. ASXL1 étant

un élément régulateur majeur du complexe polycomb répressif 2 (PRC2), il serait

possible que d’autres altérations de la régulation de ce complexe puissent aboutir au

même phénotype. Ainsi, les LAM avec des altérations d’autres gènes impliqués dans

la transformation myéloïdes via le PRC2, comme EZH2 (Wang et al., 2013; Xu et al.,

2011), JARID2 (Puda et al., 2012) ou BAP1 (Abdel-Wahab and Dey, 2013; Dey et

90

al., 2012) pourraient partager des caractéristiques avec les LAM mutées ASXL1.

L’analyse de ces différentes anomalies impliquées dans une même voie cellulaire

pourrait permettre d’identifier un sous-groupe homogène de LAM-MRC, guidant le

développement de futurs traitements ciblés.

Ainsi, les critères définissant actuellement les LAM-MRC ne semblent pas distinguer

des entités biologiques différentes et ne permettent pas de prédire la survie des

patients. Inversement, les mutations d’ASXL1 et de TP53 pourraient identifier des

entités biologiquement distinctes et aider à la stratification pronostique des LAM-

MRC. Cette caractérisation moléculaire pourrait être utile pour affiner la définition des

LAM-MRC dans les futures classifications, qui tendent à faire converger entités

biologiques et impact pronostique.

91

ARTICLE 4 :

In vitro multidrug screening and mutational profiles

of acute myeloid leukemias with myelodysplasia-

related changes

Devillier R et al.

Statut : Manuscrit en préparation

92

Introduction

Nous avons précédemment montré que certaines anomalies moléculaires pouvaient

permettre d’affiner la classification des LAM-MRC. Nous avons fait l’hypothèse que

les mutations d’ASXL1 et de TP53 permettraient d’identifier des sous-entités des

LAM-MRC distinctes des LAM non MRC qui sont majoritairement caractérisées par la

présence de mutations de NPM1 et dans une moindre mesure de DNMT3A1. Cette

reclassification pourrait permettre d’améliorer la stratification pronostique des LAM-

MRC et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, dans un contexte de

médecine personnalisée. Ainsi, de nombreuses molécules sont apparues récemment

dans l’éventail thérapeutique comme les agents déméthylants ou les inhibiteurs

d’histone déacétylases (HDACi). L’identification de marqueurs prédictifs de réponse

à ces traitements spécifiques restent alors indispensable2,3. Dans cette optique, nous

avons cherché à déterminer si les différents sous-groupes moléculaires de LAM-

MRC présentaient des profils de sensibilité à certaines drogues spécifiques. Nous

avons réalisé un criblage de drogues sur des cellules leucémiques primaires de

patients atteints de LAM-MRC et tenté de corréler les concentrations inhibitrices

(IC50) obtenues avec les anomalies mutationnelles observées dans cette population.

93

Méthodes

Critères de sélection

Les critères d’inclusion des patients étaient : 1) LAM-MRC selon la classification de

l’OMS 20084 ; 2) Echantillons cellulaires leucémiques au diagnostic congelés en

DMSO disponibles pour les analyses moléculaires et le criblage de drogues ; 3)

patients ayant signé un consentement éclairé autorisant l’étude ces échantillons

congelés dans un but de recherche. Le comité d’orientation stratégique (COS) de

l’Institut Paoli Calmettes a approuvé cette étude, incluse dans le projet translationnel

du SIRIC leucémie.

Séquençage

A l’aide d’un séquenceur à haut débit (Ion Torrent, Life Tech.), nous avons recherché

des mutations sur les régions codantes des gènes sur ASXL1 (sauf exon 12),

RUNX1, TET2, IDH1, IDH2, DNMT3A et TP53. L’exon 12 d’ASXL1 a été séquencé

par la méthode classique de Sanger. Les mutations de NPM1 (exon 12) et FLT3

(ITD, exon 13-14) ont été identifiées par les techniques courantes de génotypage par

analyse de taille de fragments et par séquençage.

Criblage de drogues

Le criblage a été réalisé grâce à des tests de viabilité basés sur la quantité cellulaire

d’ATP (Cell Titer Glo assay). Pour chaque patient et pour chaque drogue, nous

avons défini une valeur IC50 ajustée sur la mortalité des cellules contrôles provenant

du même patient, cultivées dans les mêmes conditions mais sans drogue. Nous

avons séparé les patients en deux groupes de sensibilité à chaque drogue :

sensibilité élevée (IC50 < médiane) et faible (IC50 > médiane). Les drogues testées

ainsi que leur mécanisme d’action sont listées dans la Table 1.

94

Analyses statistiques

Nous avons comparé les groupes de sensibilité aux drogues et le statut mutationnel

pour chaque gène et chaque drogue en utilisant les tests du Chi-2 ou de Fisher.

Nous avons effectué un test non paramétrique de Mann-Whitney pour tenter

d’identifier une association entre un échec de première cure de chimiothérapie

d’induction et les valeurs d’IC50 pour la cytarabine. Les survies ont été calculées à

partir de la date de la chimiothérapie intensive à l’aide de la méthode de Kaplan

Meier et du test du Log Rank5. Pour la survie globale (OS), la survenue du décès a

été considérée comme un évènement. Pour la survie sans évènement (EFS), nous

avons pris en compte l’échec primaire d’induction, la rechute et le décès comme

évènements.

95

Résultats

Nous avons analysé 52 patients dont les caractéristiques sont présentées dans la

Table 2. Parmi ces patients, 41 étaient analysables pour les tests de sensibilité aux

drogues. La Table 3 présente la fréquence des mutations des gènes ASXL1, RUNX1

TET2, IDH1, IDH2, DNMT3A, NPM1, FLT3 et TP53. La liste des mutations des

gènes RUNX1, TET2, IDH1, IDH2, DNMT3A et TP53 identifiées à l’aide du Ion

Torrent est rapportée dans la Table 4.

Nous avons mis en évidence des profils de sensibilité différents pour le prima-1 selon

la présence des mutations des gènes DNMT3A, NPM1, FLT3 et TP53. Cette drogue

permet de rétablir l’apoptose TP53-dépendante en restaurant la conformation et la

liaison à l’ADN des mutants TP536,7. Les LAM mutées TP53 avaient une sensibilité

élevée pour le prima-1 dans 85% des cas (6/7). Inversement, 100% (4/4) des

mutants DNMT3A, 78% (7/9) des mutants NPM1 et 100% (4/4) des mutants FLT3

avaient une sensibilité faible pour le prima-1 (p = 0,006, Figure 1A).

Le profil de sensibilité à la daunorubicine (Figure 1B) montre que les mutations de

NPM1 tendent à être associées à une IC50 faible pour la daunorubicine (p = 0,073).

Nous n’avons pas identifié d’autre association significative entre présence de

mutations et sensibilité relative aux drogues. La Figure 2 illustre les profils

mutationnels des 41 échantillons analysables pour les tests de sensibilité aux

drogues ainsi que les IC50 pour quelques une de ces drogues.

Sur les 41 patients, 33 avaient reçu une induction par chimiothérapie intensive

comprenant une anthracycline et de la cytarabine. Une sensibilité in vitro à la

cytarabine semblerait être associée à une meilleure EFS à 2 ans (sensibilité élevée

vs. faible : 42% vs. 22%, p = 0.146, Figure 3). En revanche, nous n’avons pas

96

identifié de différence en termes de taux de rémission complète ou de survie globale

selon la sensibilité in vitro à la cytarabine.

97

Discussion

Nous avons fait l’hypothèse que les anomalies moléculaires décrites précédemment

pourraient prédire des sensibilités spécifiques à différentes drogues. Nous avons

donc testé la sensibilité à certaines drogues utilisées en pratique courante comme la

daunorubicine, la cytarabine ou la 5-azacytidine. De plus nous avons testé des

drogues expérimentales supposées actives sur différentes voies cellulaires

potentiellement impliquées dans les LAM (inhibiteurs d’histone deacétylases ou de

tyrosine kinases, activateurs de la voie TP53…). Nous avons mis en évidence que

les mutations de TP53 prédisaient la réponse in vitro au prima-1 alors que celles de

DNMT3A et de NPM1 semblaient être associées à une résistance à cette drogue.

Nous n’avons pas réussi à identifier des profils de sensibilité spécifiquement

associées aux mutations d’ASXL1 car seulement 2 mutants ASXL1 sur 5 ont été

analysables. Le fait que nous n’ayons pas mis en évidence plus de corrélations entre

réponse aux drogues et présence de mutations pourrait être dû à différentes limites

de notre étude. La première est l’effectif réduit dans chaque sous-groupe

moléculaire, limitant ainsi la puissance des tests statistiques. Ensuite, nous avons

testé les drogues sur des échantillons de moelle totale. La réalisation des mêmes

tests de viabilité sur des sous-populations cellulaires triées permettrait peut-être d’en

améliorer la sensibilité et la spécificité. Enfin, nous n’avons étudié que la viabilité

cellulaire, sans analyse de la différenciation, de la prolifération ou d’apoptose, qui

sont également de potentielles cibles thérapeutiques. Cela pourrait être le cas

notamment des épidrogues. Pour celles-ci, l’évaluation des modifications

morphologiques, phénotypiques ou des profils d’expression et de méthylation

seraient probablement plus adaptée.

98

Nous avons trouvé que la sensibilité in vitro à la cytarabine pourrait être un facteur

prédictif de meilleure EFS chez les patients traités intensivement. Ce résultat pourrait

encourager le développement de stratégies de médecine personnalisée basée sur

des chimiogrammes. Cela permettrait d’identifier précocement les patients à haut

risque de maladie réfractaire et de reconsidérer la stratégie thérapeutique de ces

patients. L’absence de significativité pourrait être expliquée par le faible effectif et par

l’influence d’autres facteurs intrinsèques aux patients comme les aspects

pharmacocinétiques ou pharmacogénomiques.

Malgré les limites de notre étude, ces premiers résultats sont encourageants. La

double analyse des profils mutationnels et de réponse aux drogues pourrait être une

approche intéressante dans l’optique d’une médecine personnalisée guidée par les

anomalies moléculaires. Cependant, ces tests nécessitent d’être affinés en intégrant

d’autres paramètres, drogues spécifiques. Cette démarche pourrait ainsi permettre

de mieux orienter les développements thérapeutiques, adaptés à des sous-groupes

moléculaires d’intérêts.

99

Références

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myelodysplasia-related changes are characterized by a specific molecular pattern

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2. Pemovska T, Kontro M, Yadav B, et al. Individualized systems medicine

strategy to tailor treatments for patients with chemorefractory acute myeloid

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drug sensitivity for individually optimized anticancer therapies. Sci. Rep..

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Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia:

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function to mutant p53 by a low-molecular-weight compound. Nat. Med..

2002;8(3):282–288.

7. Lambert JMR, Gorzov P, Veprintsev DB, et al. PRIMA-1 reactivates mutant

p53 by covalent binding to the core domain. Cancer Cell. 2009;15(5):376–388.

100

Table 1 : Liste des drogues évaluées

Molécules Cibles / Mécanisme d'action

Chimiothérapies

Clofarabine Analogue nucléosidique

Cytarabine Analogue nucléosidique

Daunorubicine Inhibiteur de topoisomérase II

Inhibiteurs de kinases

Quizartinib FLT3

Rigosertib Polo-like kinase 1 et PI3K

BKM-120 PI3K

MK-2206 AKT

Ruxolitinib JAK1/JAK2

Temsirolimus mTOR

Epidrogues

Décitabine Agent déméthylant

5-Azacitidine Agent déméthylant

Entinostat HDACi

S78454 HDACi

GSK-J1 Inhibiteur de la déméthylation H3K27

Inducteur d'apoptose

Prima-1 Inducteur d'apoptose p53 dépendante

NSC-207895 Inhibiteur de MDMX

Nutlin-3 Inhibiteur de MDM2

Autres

TMI-1 Inhibiteur de la métalloprotéase ADAM-17

Lenalidomide Activateur d'ubiquitination

Bortezomib Inhibiteur du protéasome

101

Table 2 : Caractéristiques des patients


N %

Median age (years, [range]) 66 [18-83]

FAB Classification

0 3 6%

1 11 21%

2 15 29%

4 9 17%

5 1 2%

6 7 13%

Unclassifiable 6 12%

Previously diagnosed MDS 8 15%

MDS-related cytogenetics 27 66%

Cytogenetics

Normal 16 31%

Complex monosomal 15 29%

Abnormal non-complex 21 40%

monosomy 7 4 7,7%

trisomy 8 5 9,6%

del(5q) 3 5,8%

del(9q) 3 5,8%

del(3p) 1 1,9%

del(20q) 1 1,9%

del(11q) 1 1,9%

trisomy 13 1 1,9%

i(17) 1 1,9%

t(3;12)(q23;p13) 1 1,9%


Intermediate 29 56%

Unfavorable 23 44%

La somme des pourcentages peut être différente de 100% à cause des arrondis

102

Table 3 : Fréquence des mutations des gènes ASXL1, RUNX1, TET2, IDH1/2,

DNMT3A, NPM1, FLT3 et TP53


N %

ASXL1 5 10%

RUNX1 7 13%

TET2 10 19%

IDH1 5 10%

IDH2 4 8%

DNMT3A 6 12%

NPM1 9 17%

FLT3-ITD 4 8%

TP53 8 15%

103

Table 4 : Mutations identifiées par séquençage sur Ion Torrent dans 52 cas

Mutations Ratio allélique (mut / wt+mut)

RUNX1

R201Q 0.47

R201Q 0.41

R201Q 0.67

F330Sfs*265 0.38

R162K 0.68

R204X 0.21

F163fs / R166Q 0.38 / 0.36

TET2

H800fs 0.76

S327X / D1376G 0.40 / 0.42

E1247X 0.38

P1723S 0.38

H1868R 0.27

C1378R 0.96

V1718L 0.44

V1718L 0.43

C1273Y / exon4:c.3500+1G>A 0.43 / 0.23

exon8:c.4044+2T>A 0.73

IDH1

R132H 0.28

R132S 0.37

R132C 0.18

R132C 0.08

R132C 0.17

IDH2

R140Q 0.45

R140Q 0.27

R140Q 0.16

R140Q 0.35

DNMT3A

R882H 0.40

R882H 0.45

R882C 0.29

C497Y 0.44

TP53

R175H / R110H 0.33 / 0.08

Y220C / Q167X 0.13 / 0.15

Y220C 0.73

Y236H / H178fs 0.43

R248G 0.44

R273H 0.72

R273H 0.84

S241Y 0.84

mut = mutant ; wt = wild type

104

Figure 1 : Sensibilité in vitro au prima-1 (A) et à la daunorubicine (B) en

fonction des mutations des gènes ASXL1, RUNX1 TET2, IDH1/2, DNMT3A,

NPM1, FLT3 et TP53

A- Prima-1

B- Daunorubicine

105

Figure 2 : Profil mutationnel et sensibilité à 6 drogues de 41 patients

ASXL1

RUNX1

TET2

IDH

DNMT3A

NPM1

FLT3

TP53

Monosomal

karyotype

prima-1

daunorubicin

cytarabine

S78454

entinostat

decitabine

.

Les barres grises, noires et blanches représentent une sensibilité faible, élevée et

non évaluable, respectivement.

106

Figure 3 : EFS des patients induits par chimiothérapie intensive selon la

sensibilité in vitro à la cytarabine

107

DISCUSSION ET PERSPECTIVES

Nos résultats ont montré que les LAM-MRC définies selon les critères de l’OMS 2008

regroupent des pathologies très hétérogènes tant sur le plan biologique que

pronostique. Ceci pourrait être en partie expliqué par la relative complexité de cette

définition, qui intègre à la fois des critères cliniques (antécédents de SMD ou

SMD/NMP), morphologiques (DML) et cytogénétiques. A l’exception de certaines

anomalies cytogénétiques complexes et/ou celles des chromosomes 5, 7 et 17, les

critères OMS ne se semblent pas avoir d’impact pronostique. Nos analyses

moléculaires ont montré que les LAM-MRC étaient hétérogènes sur le plan

mutationnel. Cette caractérisation moléculaire pourrait permettre d’affiner la définition

des LAM-MRC et de mieux en stratifier le pronostic.

I) Vers une classification moléculaire des LAM-MRC ?

Nous proposons ici une classification des LAM-MRC basée sur le statut mutationnel

qui permettrait de reclasser certains patients du groupe LAM-MRC dans le groupe

LAM-non-MRC et inversement (Figure 4).

a. LAM avec altération de TP53

Au sein des LAM-MRC, la majorité des anomalies cytogénétiques défavorables sont

des caryotypes complexes et/ou monosomaux (70%). Dans ces sous-groupes, les

mutations de TP53 sont retrouvées dans plus de 60% des cas et sont exclusives des

autres mutations. Cela suggère un mécanisme de leucémogenèse spécifique, au

sein duquel l’instabilité chromosomique joue un rôle majeur. Ces LAM ont un

pronostic très sombre quel que soit le traitement. L’identification des mutations de

TP53, associées à ces anomalies cytogénétiques, pourrait permettre le

108

développement de traitements guidés par un rationnel moléculaire, tel que le prima-

1.

Nous proposons de considérer ces pathologies comme une entité distincte,

identifiables à l’aide d’outils cytogénétiques et moléculaires simples, au même titre

que les LAM à caryotype normal avec mutation de NPM1 ou double mutation

CEBPA. Ce groupe pourrait ainsi comprendre les LAM avec mutations et/ou délétion

de TP53.

Figure 4 : Proposition de classification moléculaire des LAM-MRC

109

b. LAM avec mutation d’ASXL1

Nous avons montré que les mutations d’ASXL1 pourraient constituer un marqueur de

dysplasie et être ainsi un critère moléculaire définissant les LAM-MRC. Plusieurs

études biologiques confirment que les mutations d’ASXL1 induisent des aspects

myélodysplasiques morphologiques chez la souris et favorisent la transformation en

LAM (Abdel-Wahab et al., 2012, 2013; Inoue et al., 2013; Wang et al., 2014; West et

al., 2014). Chez l’homme, les mutations d’ASXL1 ne sont pas distribuées

aléatoirement au sein des hémopathies myéloïdes chroniques. Alors qu’elles sont

rares dans les SMD de bas risque, la maladie de Vaquez et la thrombocytémie

essentielle (<10%), leur fréquence augmente dans les formes plus agressives : leur

fréquence est de 15-25% dans les SMD de haut risque, 20-25% dans les

myélofibroses et 40-45% dans les LMMC (Bejar et al., 2011; Brecqueville et al.,

2012, 2014; Gelsi-Boyer et al., 2009; Tefferi and Vainchenker, 2011; Thol et al.,

2011; Vannucchi et al., 2013). Dans l’ensemble de ces pathologies, ces mutations

caractérisent les formes à haut risque de transformation leucémique. Dans les LAM-

MRC, elles sont retrouvées dans environ 35-45% des cas et sont toujours exclusives

de celles de NPM1 et de DNMT3A (Carbuccia et al., 2010; Devillier et al., 2012; Hou

et al., 2014; Renneville et al., 2014; Schnittger et al., 2013). Elles semblent être

associées à un pronostic défavorable, notamment par une chimiorésistance primaire.

Dans notre étude, nous avons montré qu’au sein des LAM-MRC, les mutations

d’ASXL1 sont associées à une dysgranulopoïèse plus importante mais variable.

Nous avons également retrouvé des mutations d’ASXL1 chez des patients ayant des

LAM avec dysplasie sans critère de DML. Bien que n’appartenant pas aux LAM-MRC

selon les critères actuels, la présence des mutations d’ASXL1 permettrait de les

intégrer dans une classification moléculaire. L’ensemble de ces résultats suggère

110

que la seule présence d’une mutation d’ASXL1 pourrait être considérée comme un

critère suffisant pour définir une LAM-MRC.

c. LAM avec mutations de NPM1 ou DNMT3A

Dans notre étude, environ 15% des patients atteints de LAM-MRC présentent des

mutations de NPM1 et/ou de DNMT3A. Elles sont fréquemment associées aux

mutations de FLT3, constituant ainsi un profil qui se rapproche de celui des LAM-

non-MRC. Dans l’optique d’une classification moléculaire, nous proposons de ne pas

considérer ces pathologies comme des LAM-MRC malgré la présence de certains

critères actuels tels que la DML ou un antécédent de SMD. Le fait que la DML

n’influence ni les caractéristiques biologiques ni la survie des patients atteints de

LAM mutées NPM1 supporte en partie notre hypothèse.

d. LAM avec d’autres mutations ou sans mutation identifiée

Environ 40% des patients ne présentent aucune des mutations citées ci-dessus. Ils

peuvent avoir des mutations de RUNX1, TET2, d’IDH1/2 ou de FLT3 ou aucune

d’entre elles. Ces mutations ne permettent ni d’identifier des entités distinctes ni

d’aider à une classification moléculaire des LAM-MRC. En effet, les mutations de

TET2 et d’IDH1/2 sont retrouvées dans les LAM-MRC aussi bien que dans les LAM-

non-MRC, avec une fréquence comparable. Les mutations de FLT3 sont

préférentiellement retrouvées dans les LAM-non-MRC et sont associées à celles de

NPM1 et de DNMT3A, mais il n’est pas exceptionnel de les observer en présence de

celles d’ASXL1. Les mutations de FLT3 ont déjà été identifiées au sein de différentes

entités comme les LAM promyélocytaires ou les LAM-CBF, suggérant le caractère

additionnel et non classant de cette altération. Enfin, il semblerait que les mutations

111

de RUNX1 soient plus fréquemment retrouvées au sein des LAM-MRC et soient

associées à celles d’ASXL1. Cependant, nous avons trouvé quelques cas de LAM

mutées RUNX1 en l’absence de tout critère de LAM-MRC et il n’est pas exceptionnel

d’observer des co-mutations RUNX1/DNMT3A ou RUNX1/NPM1 (plus rarement).

Ainsi, nous n’avons pas considéré les mutations de RUNX1 suffisamment

spécifiques pour intégrer une classification moléculaire. Enfin, pour l’ensemble de

ces patients, nous proposons d’utiliser les critères actuels de classification OMS

2008 des LAM-MRC.

II) Perspectives

a. Caractérisation pangénomique des LAM

Ce travail, réalisé majoritairement avec des techniques de séquençage direct

standard, a permis d’identifier des mutations revêtant une particulière importance

pour les classifications futures. Cependant, la majorité des LAM restent classées par

la cytogénétique, le phénotype et/ou la cytologie. L’avènement des techniques de

biologie moléculaire à haut débit a permis d’identifier de nouvelles altérations

moléculaires, dont certaines peuvent jouer un rôle majeur sur le plan diagnostique,

comme par exemple la découverte des mutations de CALR dans la thrombocytémie

essentielle et la myélofibrose primitive (Nangalia et al., 2013). Une étude récente du

« Cancer Genome Atlas Research Network » a analysé 200 cas de LAM de novo par

séquençage de l’ensemble du génome ou des exons (Cancer Genome Atlas

Research Network, 2013). Pour chaque patient, elle identifie au moins une mutation

associée à l’une des voies majeures de leucémogenèse. Ce modèle complexifie

celui de Gilliland et Griffin (mutations de classe I et de classe II) (Gilliland and Griffin,

2002), en considérant 9 catégories de gènes : les transcrits de fusion (anciennement

112

classe II), les suppresseurs de tumeur, les gènes de la méthylation de l’ADN, les

modificateurs de la chromatine, les facteurs de transcription myéloïdes, les

activateurs de la signalisation (anciennement classe I), les gènes du complexe

cohésine et les gènes du spliceosome (Figure 5).

Figure 5 : Différentes classes d’altérations moléculaires dans les LAM

TSG : tumor supressor gene

Les approches pangénomiques permettent une analyse exhaustive du génome et la

réalisation d’analyses intégrées en couplant ces résultats à ceux issus de l’analyse

de l’ARN (profil d’expression génique ou séquençage haut débit de l’ARN codant ou

des micro-ARN) et de la méthylation de l’ADN (méthylome). L’inconvénient principal

est la quantité importante de données générées et la difficulté d’application des

résultats en pratique clinique courante, au moins dans l’immédiat. Pour les

113

altérations rares (<10%), un regroupement par voies cellulaires communes semble

préférable afin d’en évaluer le pronostic. A terme, cela pourrait permettre une

classification basée sur des groupes d’anomalies moléculaires, reposant sur des

arguments physiopathologiques, pronostiques et thérapeutiques.

b. Vers une médecine moléculaire personnalisée

Les approches pangénomiques ont révélé l’hétérogénéité des LAM sur le plan

moléculaire. Cette caractérisation génomique globale pourrait permettre d’orienter le

développement de nouveaux traitements ciblés sur des anomalies moléculaires.

Certaines mutations pourraient devenir des marqueurs prédictifs de réponse ou de

résistance à certains traitements, avec à terme un impact direct sur les stratégies

thérapeutiques. Enfin, une approche combinant un diagnostic moléculaire extensif et

un criblage thérapeutique in vitro guidé par les anomalies identifiées permettrait

d’appliquer un traitement spécifique à chaque patient.

114

CONCLUSIONS GENERALES

Les LAM avec dysmyélopoïèse regroupent des pathologies hétérogènes sur le plan

biologique et pronostique. Une reclassification basée sur la présence d’altérations

moléculaires exclusives entre elles, comme les mutations d’ASXL1 et de TP53,

permettrait d’affiner le diagnostic et la stratification pronostique de ces maladies. A

ce jour, les statuts mutationnels de FLT3, NPM1 et CEBPA sont nécessaires à la

prise en charge diagnostique et thérapeutique des LAM. Nos résultats suggèrent que

la recherche systématique des mutations d’ASXL1 et de TP53 permettrait optimiser

cette prise en charge. Ces travaux pourraient servir de point de départ aux

classifications futures, basées majoritairement sur la présence d’altérations

moléculaires. Enfin, nous avons montré que les tests de sensibilité in vitro peuvent

avoir un intérêt en tant que facteurs prédictifs de réponse et guider les choix

thérapeutiques ainsi que le développement de nouveaux traitements ciblés.

115

BIBLIOGRAPHIE

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ANNEXES

Annexe 1 :

Mutations in ASXL1 are associated with poor prognosis across the spectrum of

malignant myeloid diseases

Véronique Gelsi-Boyer, Mandy Brecqueville, Raynier Devillier, Anne Murati, Marie-

Joelle Mozziconacci and Daniel Birnbaum

Journal of Hematology & Oncology 2012, 5:12

Annexe 2 :

Myeloid malignancies: mutations, models and management

Anne Murati, Mandy Brecqueville, Raynier Devillier, Marie-Joelle Mozziconacci,

Véronique Gelsi-Boyer and Daniel Birnbaum*

BMC Cancer 2012, 12:304

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T H È S E - theses.fr · 2 Je présente tout d’abords mes sincères remerciements aux membres du jury. Je remercie le Professeur Norbert Vey, qui me fait l’honneur de présider