TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES - Licence …lpagrocasa.e-monsite.com/medias/files/module-m-53.pdf · 2016-01-04 · Les courbes de Van Deemter 4.4. Théorie de l’élargissement des

A.U : 2015-2016 Département de Chimie Pr : A. Dari

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TECHNIQUES

CHROMATOGRAPHIQUES


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Sommaire N° page

Préambule : Définitions et Principe: La chromatographie analytique : La chromatographie préparative Phase stationnaire : Phase mobile :. Chromatogramme :

Étymologiquement, Historiquement

Chapitre I : Chromatographie Planaire Introduction : Parie I. Chromatographie sur couches minces « CCM » I.1 Généralités : I.2. Les constituants d’une CCM : La cuve chromatographique :

L’échantillon :

L’éluant :

La phase stationnaire : I.3. Elution et Développement de la plaque :

Le développement linéaire (

En développement radial I.4. Révélation.

Révélation UV

Révélation à l'iode

Révélation par atomisation

Révélation par KMnO4 I.5. Calcul de Rf (retarding factor ou rapport frontal). I.6. Relation entre Rf et k’ Partie II : la chromatographie sur papier II.1. Principe de la technique et applications: II.2. Papier: Chapitre II : Théorie de base de la chromatographie « Grandeurs fondamentales » 1-Principales méthodes chromatographiques: Principe 3-Notions fondamentales 3.1 Paramètres fondamentaux :

Le temps de rétention (tR)

b. Le volume de rétention (VR) et Porosité :

c. Volume mort : Vo ou VM

d. Volume interne VI ou (VT) :

e. Volume de la phase stationnaire : VS

f. Relation entre u et VM :

g. Calcul de VM et tM :

h. Coefficient de distribution: KA

2 3 3 5 6 6 7 7 8 8

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i. Le facteur de capacité k' (ou facteur de rétention)

j. Relation entre VR, VM et K : 3.2 Sélectivité d’une colonne 3.3. Efficacité d’une colonne :

Nombre de plateaux théoriques et de plateaux efficaces

Hauteur de plateau :

Hauteur de plateau réduite. 3.4. Résolution 3.5. Effet des facteurs de capacité et de sélectivité sur la résolution

3.5.1. Variation de R avec 3.5.2. Variation de R avec k’ 3.5.3. Variation de R avec N: 3.6. Temps d’analyse. 3.7. Elution linéaire 3.7.1 Isothermes de distribution 3.7.2. Influence de la forme de l'isotherme sur la géométrie du pic et sur le tr L’asymétrie d’un pic est traduite par deux paramètres appelés facteur de traînée et facteur d’asymétrie a) le tailing factor b) le facteur d’asymétrie ou asymmetry factor (Fa ou As) 3.8. Perte de charge dans une colonne (Loi de DARCY) 3.9. Influence de la vitesse de la phase mobile sur HEPT 3.10. Influence du diamètre des particules sur HEPT

Chapitre III : Chromatographie en phase gazeuse 1. Préambule : 2. Définition et Principe : 3. Objectifs 4. Appareillage en chromatographie en phase gazeuse. 4.1. Les colonnes

a) Les colonnes remplies : b) b1 : les colonnes capillaires :

b2 : Colonne semi-capillaire ou 530 µm c) Avantages des colonnes capillaires / colonnes remplies :

d) Calcul du rapport de phase des colonnes capillaires : 4.2. Les phases stationnaires

4.2.1 Les phases stationnaires liquides 4.2.2 Choix de la phase stationnaire :

Les polyesterglycols

Les carbures saturés

Les phases stationnaires solides 4.3. Les phases mobiles. Les courbes de Van Deemter

4.4. Théorie de l’élargissement des bandes et influence de la vitesse d’écoulement de la phase mobile

a. Équation de van Deemter : Ainsi l'étalement d'une bande de soluté a trois origines :

A : Anisotropie d’écoulement (la dispersion par diffusion axiale) A: diffusion turbulente ou diffusion d’Eddy :

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http://www.masterchimie1.u-psud.fr/Chromatoweb/theoriechromato2.html


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B: diffusion longitudinale : C. : cinétique de transfert de masse 4.5. Injecteurs Les injecteurs par vaporisation directe : a) Injecteurs pour colonnes Remplies b) Injecteurs pour colonnes capillaires. 4.6. Détecteurs 4.6.1 Caractéristiques d’un détecteur 4.6.2. Détecteur à ionisation de flamme (FID) Principe : 4.6.3. Détecteur à conductibilité thermique « ou à Catharomètre » 4.6.4. Détecteur à conductibilité thermique 4.6.5. Détecteur à capture d’électrons 4.6.6. Détecteur à photométrie de flamme (FPD) 4.6.7 Détecteur thermoionique (NPD) 4.6.8. Détecteur à photoionisation 4.6.9. Détection par spectrométrie de masse 5. Principe du phénomène de migration dans une colonne de chromatographie en phase gazeuse. 5.1 Constitution d'une colonne 5.2 Comportement d'un soluté A entrant dans la colonne (capillaire) 5.3 Etude du processus de séparation d'un mélange de deux solutés A et B. 6. Classification des phases stationnaires.

6.1 Indice de Kovats et droite de Kovats 6.2 Constantes de phases stationnaires

7. Applications de la CPG. Chapitre IV : Chromatographie en phase liquide Partie I : Chromatographie en phase liquide conventionnelle : « CLC » 1. Généralités. 2. Principe. 3. Mode d’élution 4. Principaux modes de séparation en chromatographie liquide

adsorption

partage

échange d’ion

exclusion par taille 4.1. Chromatographie d’adsorption (chromatographie liquide-solide).

4.1.1. Principe :

4.1.2. Les adsorbants 4.2 .Chromatographie de partage ()

4.2.1 Principe 4.2.2 Chromatographie en phase normale 4.2.3. Chromatographie de partage à polarité de phase inversée 4.3 Chromatographie d’échange d’ion 4.3.1. Les différents types d'échangeurs d'ions 4.3.2. Principe. 4.5 Chromatographie d’exclusion par taille ou filtration sur gel 4.5.1. Remarque préliminaire

35 37

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4.5.2. Principe. 4.5.3. Détermination de la masse molaire d'une molécule. 4.5.4. Théorie de la chromatographie d’exclusion

1 : Les molécules de masse molaire faible sortent toutes à Vt. 3 : Les molécules de masse molaire élevée sortent toutes à Vo. 2 : Les molécules de masse molaire intermédiaire sortent à des Ve

intermédiaires et sont effectivement séparées. 4.5.5. Applications de la chromatographie d'exclusion : 4.6. Chromatographie d'affinité 4.6.1. Principe et applications 4.6.2. Structure de gels d'affinité 4.7. La chromatographie par formation de paires d'ions (IPC Ion-Pair Chromatography) 5. Facteurs dont dépend la séparation en CLC: 6. Remplissage de la colonne : 6.1. Remplissage par voie humide: 6.2. Remplissage par voie sèche : Partie II Chromatographie en phase liquide à haute performance « HPLC ». 1. Généralités 2. Les composantes de base d'un système HPLC. 2.1. Réservoirs de solvants 2.2. Dispositif de pompage

Utilisation de pompes alternative :

Pompe pneumatique directe

Pompe à seringue commandée ((pompe alternative)

Pompe à piston

Pompes réciproques en tandem 2.3. Dispositif d’injection 2.4. Colonnes 2.4.1 Colonne de garde 2.4.2 Colonne analytique. Limitations de la silice

Modification des groupes silanols

Les principales phases stationnaires (mode partage)

mode normal:

mode inverse:

Facteurs affectant la chromatographie en phase inverse.

Silices greffées commerciales (a) : silices apolaires (alkyle) (b) : silices polaires Influence de la taille des particules sur N

Influence de la porosité des particules

Capacité de la colonne. 3. Choix du mode en chromatographie liquide 4. Choix de la phase mobile en C.L.H.P.: Caractéristiques:

Viscosité et mélange de solvants -5. Force éluante de la phase mobile Force éluotropique.

Indice de polarité Snyder (P’)

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Relation entre indice de polarité et facteur de capacité (P ’ et k’). 6. Les détecteurs en chromatographie liquide

6.1. Caractère universel ou spécifique?

6.2. Caractéristiques des détecteurs

6.3. Spectrophotométrie UV-visible a-1. Détecteur monochromatique (spectrophotométrie) a-2. Détection polychromatique (détecteur à barrette de diodes)

6.4. Les transitions possibles sont :

6.5. Loi de Beer-Lambert : Soit un rayon lumineux traversant une solution absorbante de

6.6. Autres détecteurs :

Réfractomètre : Il mesure la variation de l'indice de réfraction du liquide à la sortie de la

Détecteur Spectrofluorimétrique : Après excitation de l’échantillon dans la gamme UV,

Détecteur électrochimique : Réactions d’oxydoréductions qui produisent un courant proportionnel à la concentration du soluté.

7. Ultra Performance Liquide Chromatographie(UPLC) Principe:

Chimie de petites particules:

Instrumentation:

Evolution des tailles de particules

Le challenge de la courbe de van Deemter

Les possibilités de la courbe de van Deemter

Les colonnes UPLC

Exemples d’application

Etude comparative HPLC-UPLC

8. Domaines d’application des techniques chromatographiques : Domaines d'activité en chimie et en agrochimie

Domaines d'activité en sciences de l'environnement

Exemples d’analyse et Moyens matériels

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Préambule :

Comment arrive t-on à séparer des molécules si on ne les voit pas à l’œil nu ?

Grâce à une technique appelée la chromatographie (du grec khrôma, couleur et graphein, écrire),

On arrive à séparer des molécules en se basant sur des phénomènes de rétention « Adsorption ou partage » entre un support dit la phase stationnaire, qui tend à retarder l’échantillon et une phase dite mobile qui tend à emporter l’échantillon avec elle. Deux composés d’un même mélange seront donc séparés selon leur "amour ou affinité" pour l’une ou l’autre de ces deux phases.

Définitions et Principe:

La chromatographie : Ensemble de méthodes qui assurent la séparation des constituants d’un mélange en utilisant deux phases non miscibles: les divers constituants sont entraînés d'une manière différentielle par une phase mobile le long d'une phase stationnaire. «phase» : toute partie homogène d’un système. trois états physiques d’une phase : liquide, gazeux et solide. la séparation de solutés se réalise entre deux phases : *une phase stationnaire, par définition immobile ; choisie pour sa grande affinité pour les divers solutés; *une phase mobile qui entraîne les divers solutés, en fait, les solutés se partagent entre la phase stationnaire et la phase mobile.

La séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successive sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase.

L'échantillon contenant une ou plusieurs espèces est entraîné par un courant de phase mobile (liquide, gaz ou fluide supercritique) le long d'une phase stationnaire (papier, gélatine, silice, polymère, silice greffée etc) ; chaque espèce se déplace à une vitesse propre dépendant de ses caractéristiques et de celles des deux phases. Cette technique d'analyse chimique peut être couplée à un détecteur en vue d'une analyse qualitative ou quantitative du milieu.

http://fr.wikipedia.org/wiki/G%C3%A9latine

http://fr.wikipedia.org/wiki/Gel_de_silice




http://fr.wikipedia.org/wiki/Chimie_analytique


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La chromatographie analytique : La chromatographie analytique est un procédé physico-chimique de séparation, au même titre que la distillation, la cristallisation ou l’extraction fractionnée, des constituants d’un mélange homogène liquide ou gazeux. Les applications de ce procédé sont donc potentiellement très nombreuses, d’autant plus que beaucoup de mélanges hétérogènes ou sous forme solide peuvent être mis en solution par emploi d’un solvant. Cette application de la chromatographie, dont le but n’est plus de récupérer les composés séparés mais de mesurer leurs temps de passage dans la colonne s’est développée lentement.

La chromatographie préparative : est utilisée pour purifier assez de produit pour d'autres utilisations. Son but est d'obtenir de la substance ; c'est pourquoi, à toute échelle, elle implique de collecter des fractions « séparer et récupérer ».

Phase stationnaire : Phase fixe soit sur la surface intérieure d'une colonne soit sur une surface plane.

Phase mobile : Phase qui se déplace à travers la phase stationnaire, en entraînant les analytes. La phase mobile ne doit pas interagir avec la phase stationnaire mais uniquement avec les analytes.

Chromatogramme : Le chromatogramme est une courbe qui traduit la variation au cours du temps d’un paramètre relié à la concentration instantanée du soluté en sortie de colonne. Le temps (ou très rarement le volume d’élution) est porté en abscisse et l’intensité du signal de détection en ordonnée. La ligne de base correspond au tracé obtenu en l’absence de composé élué. La séparation est complète quand le chromatogramme présente autant de pics chromatographiques revenant à la ligne de base qu’il y a de composés dans le mélange à analyser.

Étymologiquement, le mot chromatographie vient du grec ancien Khrôma qui signifie "couleur" et Graphein qui signifie "écrire"

Historiquement, le botaniste russe Mikhail Tswett (1872-1919) fut, en 1906, le premier à utiliser le terme chromatographie.

À partir de 1903, Tswett utilisa des colonnes d'adsorption pour séparer des pigments de plantes. On spécula donc l'étymologie du mot « chromatographie » à partir du grec khrôma- pour couleur et donc pigment. Toutefois, Tswett ne donna jamais cette explication, mais Tswett est le mot russe pour « couleur ».

En 1952, Martin et Synge reçurent le prix Nobel de chimie pour leur invention de la chromatographie de partage.

http://fr.wikipedia.org/w/index.php?title=Analyte&action=edit&redlink=1

http://fr.wikipedia.org/wiki/Mikhail_Tswett

http://fr.wikipedia.org/wiki/1872


http://fr.wikipedia.org/wiki/Pigment

http://fr.wikipedia.org/wiki/Grec_ancien


http://fr.wikipedia.org/wiki/Archer_John_Porter_Martin

http://fr.wikipedia.org/wiki/Richard_Laurence_Millington_Synge

http://fr.wikipedia.org/wiki/Prix_Nobel_de_chimie

http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_de_partage


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Principe : La chromatographie est une méthode de séparation des constituants présents dans des mélanges variés. Elle sert en analyse pour identifier et quantifier des composés au sein d’échantillons divers. Le principe de base repose sur les équilibres de concentration qui apparaissent lorsqu’un composé est mis en présence de deux phases non miscibles. En chromatographie, l’une, dite stationnaire, est emprisonnée dans une colonne ou fixée sur un support et l’autre, dite mobile, se déplace au contact de la première. Si plusieurs composés sont présents, ils se trouvent entraînés à des vitesses différentes, provoquant leur séparation. Ce procédé hydrodynamique a donné naissance à une méthode analytique instrumentale qui a un très grand domaine d’applicabilité et par suite se trouve très répandue. Aucun laboratoire analysant des composés moléculaires ne peut ignorer la chromatographie.

Il existe de nombreux types de chromatographie ; on peut notamment les classer selon : La nature de la phase mobile : la chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC en anglais) ; la chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC en anglais) également appelée CPV

(chromatographie en phase vapeur) ; la chromatographie en phase liquide (CPL ou LC en anglais) ; la chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP ou HPLC en anglais) ; la chromatographie en phase supercritique (CPS ou SFC en anglais). Les interactions développées par la phase stationnaire :

La chromatographie d'adsorption/d'affinité : liaisons de faible énergie (liaisons polaires, ...) assurant la fixation des solutés à la phase stationnaire

La chromatographie de partage ; solubilisation des solutés dans une phase stationnaire liquide ; ils sont amenés à se partager entre la phase stationnaire et la phase mobile dans laquelle ils sont moins solubles;

La chromatographie à échange d'ions ; liaisons ioniques entre charges électriques portées par les solutés et par la phase stationnaire (opposées)

La chromatographie chirale (qui est, soit de la CPG, soit de la CPL) ;

La chromatographie d'exclusion stérique (CES ou SEC en anglais) ; pas de liaisons: diffusion / exclusion de solutés dans la phase stationnaire poreuse (chromatographie d'exclusion diffusion)

Interactions biospécifiques : interactions biospécifiques (enzyme -substrat, antigène anticorps, ...) entre les solutés et la phase stationnaire porteuse d’un ligand (appliquées aux protéines).

Interactions hydrophobes : liaisons hydrophobes entre la phase stationnaire et les solutés (nécessite de la présence de parties hydrophobes dans la structure du soluté) (s'applique aux protéines)

Chelation : liaisons datives entre un métal divalent fixé sur un support (phase stationnaire) et les solutés porteurs de doublets libres (cas classique : His des protéines)

Le support de la phase stationnaire : La chromatographie sur colonne (regroupant notamment HPLC et CPG) : la phase

stationnaire est dans un tube étroit et la phase mobile progresse par gravité ou différence de pression ;

La chromatographie planaire (qui recouvre CCM et chromatographie sur papier) : la phase stationnaire est sur la surface d'un support plat (CCM) ou dans une feuille de cellulose poreuse (chromatographie papier) et la phase mobile se déplace par capillarité ou par gravité.

Enfin, un nouveau type de chromatographie commence à trouver des applications :

La chromatographie à 2 dimensions.

http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_sur_couche_mince

http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_en_phase_gazeuse

http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_en_phase_liquide

http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_en_phase_liquide_%C3%A0_haute_performance

http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_en_phase_supercritique

http://fr.wikipedia.org/w/index.php?title=Chromatographie_d%27adsorption&action=edit&redlink=1

http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_de_partage

http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_%C3%A0_%C3%A9change_d%27ions

http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_chirale



http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_d%27exclusion_st%C3%A9rique

http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_en_phase_liquide_%C3%A0_haute_pression


http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_sur_couche_mince

http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_bi-dimensionnelle


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Chapitre I : Chromatographie Planaire

Introduction :

Les méthodes de chromatographie planaire comprennent: La Chromatographie sur Couche Mince: CCM, la Chromatographie sur Papier CP et l'électrochromatographie

planaire. Une fine couche de phase stationnaire (100 à 250 m) à base de gel de silice est déposée sur une plaque de verre, de plastique ou d'aluminium. La nature des phases mobile et stationnaire ainsi que la théorie sont les mêmes qu'en chromatographie sur colonne.

● Il existe des plaques conventionnelles, recouvertes d'une couche (~250 m d'épaisseur) de particules dont le

diamètre est 10 à 30 m. L’efficacité N ~2000 pour un temps de migration (développement) de 25 min. La distance de migration maximale sur la plaque est~12 à 15 cm.

● et des plaques haute performance HPTLC, recouvertes d'une couche (100 à 200m) de particules dont

dp=~3 à 10m. Les séparations sont plus nettes et réalisées en des temps plus courts: L’efficacité N = 4000 pour t=~10 min; d max = 5 à 7 cm.

Parie I. Chromatographie sur couches minces « CCM »

I.1 Généralités :

Appelé aussi chromatographie planaire, la CCM repose principalement sur des

phénomènes d’adsorption. La phase mobile, un mélange de solvants volatils, est ensuite entraînée à la

surface de la plaque par capillarité dans une atmosphère saturée de solvant.

Après que l’échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui

dépend de leur nature et de celle du solvant., et sont entraînés avec elle, de façon plus ou moins rapide

selon leur affinité respective pour les phases mobile et stationnaire.

Après la séparation des composés et l'évaporation des solvants, la position des composés est localisée par

des méthodes physiques (fluorescence) ou chimiques (réactions colorimétriques).

Lorsque les conditions opératoires sont connues, la CCM permet un contrôle aisé et rapide de la pureté

d’un composé organique. Si l’analyse, réalisée avec divers solvants et différents adsorbants, révèle la

présence d’une seule substance, on peut alors considérer que cet échantillon est probablement pur.

De plus, étant donné que la chromatographie sur couche mince indique le nombre de composants d’un

mélange, on peut l’employer pour suivre la progression d’une réaction.

I.2. Les constituants d’une CCM :

Les principaux éléments d’une séparation chromatographique sur couche mince sont :

La cuve chromatographique : Un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un

couvercle étanche.


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L’échantillon : Environ 1ml de solution diluée (2 à 5 %) du mélange à analyser, puis déposer en un

point repère situé au-dessus de la surface de l’éluant.

L’éluant : Un solvant pur ou un mélange qui migre par capillarité lentement le long de la plaque en

entraînant les composants de l’échantillon.

La phase stationnaire : Une couche d’environ 0,25 mm de gel de silice ou d’un autre adsorbant est

fixée sur une plaque de verre, « plastique, aluminium ». Les différents constituants de l'échantillon ne

migrant pas à la même vitesse le long de la plaque.

Le développement consiste à faire migrer le solvant sur la plaque.

Le niveau de liquide est ajusté à environ 0,5 cm du fond de la cuve

Eviter les effets de bords.

Pendant le développement du chromatogramme, la cuve doit être saturée en solvant et demeurée

fermée et ne pas être déplacée.

« Distance du front de solvant dM en fonction du temps de migration t pour une séparation dans une cuve »

1. Cuve de développement, saturée par la vapeur de la M

2. Cuve non saturée par la vapeur de la M

3. Cuve avec déplacement forcé de la phase mobile.

I.3. Elution et Développement de la plaque :

Le développement linéaire (figure a) est le plus simple et le plus fréquent. Il consiste à

appliquer les échantillons à séparer à une extrémité de la plaque et à permettre leur migration vers

l'extrémité opposée.


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En développement radial (figure b), les composés à séparer sont déposés près du centre ou à

la circonférence d'un support circulaire et la migration est effectuée vers l'extrémité ou le centre du

cercle, selon le cas.

Lorsque le mélange analysé est complexe et qu'il s'avère, par conséquent, impossible de séparer les

différents composés en utilisant une seule phase mobile, il est possible de développer la plaque dans :

Deux directions, orientées à angle droit (90°) l'une par rapport à l'autre (figure c).

L'échantillon à séparer est déposé au coin d'une plaque et le développement, effectué dans un solvant

approprié. La plaque est séchée, soumise à une rotation d'un quart de tour et développée à nouveau

dans un second solvant de sélectivité différente au premier

Quand une plaque à polarité de phase inversée est utilisée (RPTLC) reverse phase (thin layer chromatography), l'éluant comporte de l'eau. Du chlorure de lithium peut être ajouté pour limiter les phénomènes de diffusion et augmenter la résolution. I.4. Révélation.

Toutes les substances ayant une absorption dans la région au-dessus de 230 nm sont étudiées sur des

supports additionnés de corps fluorescents par irradiation de lumière UV à ondes courtes (max<

254 nm). Certains composés sont colorés : il n'est pas nécessaire de les révéler. La plupart sont

incolores. Voici quelques méthodes utilisées pour révéler les plaques.


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Révélation UV

Les dérivés aromatiques absorbent dans l'UV, En exposant la plaque à une source de radiation UV, certains composés apparaissent sous forme de taches brillantes. Si la plaque est fluorescente, sous une lampe UV, toute la plaque apparaît verte sauf là où sont les taches que l'on entoure au crayon. Les dérivés aromatiques absorbent dans l'UV. Placer la plaque sous une lampe UV et entourer les taches colorées.

Révélation à l'iode Beaucoup de composés organiques forment des taches jaune-marron en présence d'iode. Dans un

flacon, placer la plaque et quelques cristaux d'iodes, puis boucher. Les taches apparaissent.

Révélation par atomisation

Cette technique utilise un atomiseur contenant le révélateur en solution. Selon le produit à révéler, la

solution peut-être :

Ninhydrine pour les acides -aminés (taches violettes qui brunissent pour disparaître en

quelques jours)

Acide sulfurique à 50% pour les sucres (taches noires).

Révélation par KMnO4

I.5. Calcul de Rf (retarding factor ou rapport frontal).

La valeur de Rf est donc comprise entre 0 et 1. Pour obtenir des Rf reproductibles, il est nécessaire

d'opérer dans des conditions identiques.

I.6. Relation entre Rf et k’

En CCM La phase stationnaire est immobilisée et la migration se fait par capillarité. La vitesse de

migration du solvant «M» est :

et celle du soluté : où tM est le temps de migration du solvant.

D’où : Sur la colonne :

Pour M : d’où : Substance éluée de la colonne a un Rf=1, Donc sort de la plaque CCM


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Les vitesses étant égales en CCM et en CL:

1Rf= ui/ u = (L/tr )/ (L/to) Or : tr = to ( 1 + k’),

Donc : Ou

1+k’ = 1/Rf k’ = (1/Rf) -1


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Partie II : la chromatographie sur papier

II.1. Principe de la technique et applications:

La technique ressemble à celle de la CCM mais le principe repose sur des phénomènes de partage.

La phase mobile est le plus souvent un solvant organique et l'eau;

La phase stationnaire est constituée par l'eau elle-même adsorbée sur la cellulose du

papier ou liée chimiquement à elle.

Généralement, les composés les plus solubles dans l'eau ou ceux qui forment facilement des associations

par liaisons hydrogène sont fortement retenus par la phase stationnaire et migrent donc lentement.

Lorsque l'eau est un des solvants de la phase mobile, le ou les solvants organiques doivent y être assez

solubles. Des produits comme l'acide acétique, le propanol, le phénol ou la pyridine sont les solvants les

plus fréquemment utilisés en mélange avec de l'eau pour développer un chromatogramme.

La chromatographie sur papier est employée principalement pour l'analyse de composés très

polaires, tels les acides aminés, les sucres et les composés polyfonctionnels. Ses plus grands

inconvénients par rapport à la CCM sont:

Une durée de développement beaucoup plus longue

Une séparation généralement moins bonne.

II.2. Papier:

On peut utiliser du papier filtre ordinaire, mais il est préférable de se procurer du papier conçu pour

cet usage, ayant un faible taux d'impuretés et dont les caractéristiques sont uniformes. La description

de l'analyse par chromatographie sur papier est identique à celle sur couche mince.

Schéma d'une chromatographie sur papier

La chromatographie sur papier est une technique de chromatographie en phase liquide. Pour effectuer une telle séparation, une petite quantité de la ou des solutions à analyser est déposée sur le bord d'une bande de papier de chromatographie. Cet échantillon est adsorbé par le papier ; ce qui signifie que les molécules interagissent avec ce dernier et qu'elles auront tendance à rester au même endroit. Le papier est ensuite trempé dans un solvant (éluant) comme un mélange eau/éthanol et placé dans un récipient fermé. Pendant que le solvant (éluant) monte le long du papier par capillarité, il rencontre l'échantillon et l'entraîne. Les différentes substances constituant l'échantillon migrent à différentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou moins fortement avec le papier. La chromatographie sur


http://fr.wikipedia.org/wiki/Adsorption

http://fr.wikipedia.org/wiki/%C3%89thanol


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papier demande un certain temps (généralement plusieurs heures). Une fois l'opération terminée, généralement quand le front de solvant (éluant) est presque arrivé en haut du papier, le papier est retiré de la cuve et on laisse évaporer le solvant. Le résultat est appelé chromatogramme. Le chromatogramme est utilisé pour comparaison avec d'autres analyses effectuées sur des substances connues et prises dans des conditions identiques, pour identifier les substances de l'échantillon. Les substances peuvent être identifiées en calculant la valeur Rf qui peut être comparée à celles se trouvant dans les tables. Cette valeur est calculée de la façon suivante : Rf = (distance parcourue par l'échantillon) / (distance parcourue par le solvant)

Il y a plusieurs façons d'identifier les endroits où se trouvent les produits ainsi séparés :

1. les produits sont colorés, il n'y a rien de spécial à faire. 2. les produits sont fluorescents, on peut les identifier sous une lampe ultraviolette. 3. sinon, il faudra utiliser un révélateur qui réagira chimiquement avec les produits (en les

détruisant) et dont le résultat sera coloré.

Pour séparer des mélanges complexes de substances similaires, il peut être utile d'employer la chromatographie à deux dimensions. Celle-ci s'effectue en deux étapes entre lesquelles on change de solvant et on tourne le papier de 90°. Les interactions développées par le nouveau solvant seront différentes, ce qui modifiera la séparation dans cette deuxième dimension et permettra une meilleure séparation globale. La chromatographie sur papier peut aussi constituer une technique micro-préparative : pour récupérer les produits ainsi séparés, les portions du papier où ils se situent sont découpées et redissoutes ensuite. Les quantités récupérables sont de l'ordre du milligramme ou moins.

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fluorescence

http://fr.wikipedia.org/wiki/Ultraviolet


17

Chapitre II : Théorie de base de la chromatographie

« Grandeurs fondamentales »

1) Principales méthodes chromatographiques: Selon la nature des phases

phase mobile gazeuse:

GLC (chromatographie de partage)

GSC (chromatographie d’adsorption)

phase mobile liquide:

LLC (chromatographie de partage)

LSC (chromatographie d’adsorption)

IEC (chromatographie par échange d’ions)

SEC (chromatographie par exclusion)

phase mobile fluide supercritique:

SFC (chromatographie en phase supercritique)

2) Principe Mécanisme de rétention : basé sur différentes forces d’attraction - Van derWaals - Debye - Coulomb


18

- Keesom - Et autres

3 - Notions fondamentales 3.1 Paramètres fondamentaux :

a. Le temps de rétention (tR) C'est le temps d'élution au maximum du pic mesuré à partir de l'injection. Un chromatogramme type est schématisé, avec les paramètres principaux d’évaluation, sur la figure suivante :

Principaux paramètres d’un chromatogramme

b. Le volume de rétention (VR) et Porosité :

VR = tR . D = tR . v. s VM = to . D


19

Connaissant le débit D de la phase mobile, supposé maintenu constant, on définit le volume de rétention v : vitesse linéaire de la phase mobile s : section réduite de la colonne

s = s'avec s' : section de la colonne et (porosité) = VM / VT(ou VI) VR représente, à l'étalement près, le volume de phase mobile nécessaire pour éluer chaque composé. VM est le volume de phase mobile dans la colonne.

c. Volume mort : Vo ou VM Il correspond au volume occupé par la phase mobile dans la colonne, c’est à dire au volume interstitiel de celle-ci. Si on suppose un débit D constant : VM = tM D, avec tM = temps mort (ou to)

Grains de phase stationnaire :

Volume total occupé : VS

Volume interstitiel ou volume Mort occupé par la phase

mobile : VM

Colonne chromatographiqueVolume interne : VI

d. Volume interne VI ou (VT) :

Les colonnes sont généralement cylindriques leur volume interne se calcule donc à partir de leurs

caractéristiques géométriques : diamètre interne int et longueur L.

VI = VI = ¼ int2 * L

e. Volume de la phase stationnaire : VS Ce volume n’est pas accessible sur le chromatogramme mais on peut le déduire si on connaît le volume interne VI de la colonne : VS = VI - VM

f. Relation entre u et VM : D = ( VM / L ) * u U = D * L / VM

g. Calcul de VM et tM : On connaît le débit et les caractéristiques de la colonne.

= VM / VI

VM = VI

VI = ¼ nt2 * L

VM = ¼ int2 * L

D = ( VM / L ) * u u = D * L / VM tM = L / u = VM / D tM = VM / D


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tM = ¼ nt2 * L / D

h. Coefficient de distribution: KA

Rétention AFM AFS

Élution KA

KA Traduit l’importance relative des forces intermoléculaires qui existent entre le composé et les 2 phases Le volume de rétention VR est relié directement au coefficient de distribution K par la relation:

VR = VM + K VS

VS : volume de la phase stationnaire (ou masse ou surface spécifique selon les unités de K).

i. Le facteur de capacité k' (ou facteur de rétention)

Pour s'affranchir des paramètres géométriques de la colonne, on utilise, pour caractériser la rétention d'un composé le facteur de capacité. En effet si k’ varie non linéairement avec la concentration en composé dans chaque phase, un pic asymétrique se produit et VR varie avec la concentration du composé. Si on considère une petite section de bandes de longueur dx le rapport des quantités du composé dans les deux phases de cette section est le facteur de capacité de la colonne k'. (Ancienne appellation : facteur de capacité k’, encore rencontrée). En chromatographie, le soluté se partage entre la phase stationnaire et la phase mobile. On parle d’équilibre de partage ou de partition. S (phase mobile) S (phase stationnaire)

Cet équilibre est régit par une constante de partage (de partition) K

K = CS/CM

CS et CM sont les concentrations du soluté S dans la phase mobile et dans la phase stationnaire. On définit le facteur de rétention k’ par le rapport des quantités (ou des masses) de soluté entre phase mobile et phase stationnaire à l’équilibre :

k’ = mS / mM = nS / nM = CS VS / CM VM = K VS / VM k’ = K VS / VM

k’ = Qs/QM Qs +Qm = 1


21

De l'équation VR = VM + K VS on tire Vs = (VR – VM)/K D’où :

Le temps et le volume de rétention sont liés au facteur de capacité par les relations : tR = to (1 + k') VR = VM (1 + k')

Pour une colonne donnée VS et VM sont des constantes et le facteur de rétention k’ ne dépend donc que de la valeur de la constante de l’équilibre de partage K. Il ne dépend en particulier ni du débit, ni de la longueur de la colonne. Comme VI et VM varient de la même façon quand la longueur de la colonne change, ou quand le débit est modifié k’ ne dépend pas de ces deux facteurs. En revanche, k dépend des autres conditions opératoires et en particulier de la composition de l’éluant et/ou de celle de la phase stationnaire qui modifient fortement la valeur de K si elles varient. De même la température fait varier K et k’.

j. Relation entre le volume d’élution VR, Volume mort VM et constante d’équilibre de partage (ou de partition) K :

3.2 Sélectivité d’une colonne Pour caractériser la distance séparant les sommets de deux pics on utilise le facteur de sélectivité. Ce

facteur de séparation permet de préciser les positions relatives de deux pics adjacents 1et 2sur un chromatogramme (fig suivante). Il est défini par les relations suivantes et il ne peut, par définition, être inférieur à 1 : Il s’agit du rapport des temps de rétention réduits.

Facteurs de rétention et de séparation entre deux composés adjacents.


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3.3. Efficacité d’une colonne : On assimile une colonne chromatographique à une colonne à distiller.

Nombre de plateaux théoriques et de plateaux efficaces

L'efficacité d'une colonne chromatographique, dont dépend l'étalement des pics, est mesurée, pour chaque composé, par le nombre de plateaux théoriques N de la colonne. Une colonne est alors dite comporter N plateaux théoriques si, dans des conditions données, elle a la même efficacité qu'une colonne fictive de N plateaux théoriques.

Neff peut également être calculé à partir de tr et de ω, ce dernier paramètre étant déterminé depuis l’intersection des tangentes au point d’inflexion avec la ligne de base.


23

Pour comparer entre elles des colonnes de différentes longueurs on définit la hauteur équivalente à un plateau théorique. Hauteur de plateau :

Ce paramètre est calculé pour des composés de référence car il permet de comparer des colonnes de longueurs différentes, bien qu’il ne s’agisse en aucune façon d’une constante. Sa valeur dépend du composé choisi et des conditions de l’expérience. En chromatographie gazeuse, on a longtemps utilisé une valeur corrigée appelée hauteur de plateau effectif Heff faisant intervenir l’efficacité réelle à la place de l’efficacité théorique.

Hauteur de plateau réduite. En chromatographie dont la phase mobile est un liquide et pour les colonnes dont le remplissage est formé de particules sphériques, on rencontre assez souvent la hauteur de plateau réduite, h, qui tient compte du diamètre moyen dm des particules. On élimine en quelque sorte l’effet de la taille des particules. Des colonnes présentant le même rapport (longueur de la colonne)/ (diamètre des particules) conduisent à des performances semblables.

3.4. Résolution La résolution est la qualité de séparation de deux pics voisins. Pour traduire numériquement la plus ou moins bonne séparation entre deux composés, on utilise le facteur de résolution R qui est calculé à partir du chromatogramme, pour deux molécules (1) et (2) :


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La résolution Rs entre deux pics est définie par les relations :

Ou

Plus R est Grand, plus les solutés sont mieux séparés

Normalement, des pics voisins ont des pratiquement identiques. On trouve alors que :

RS = 1 si tR= 4σ

Une résolution de 1.5 est nécessaire pour une analyse quantitative (tR= 6σ), La séparation est alors complète quand Rs = 1.5 (2 % de recouvrement des 2 pics)

Effet de la longueur de la colonne sur la résolution.

σ4

tΔR R

S


25

3.5. Effet des facteurs de capacité et de sélectivité sur la résolution En supposant w2 = w1, on a :

Quand α tend vers 1, on a

3.5.1. Variation de R avec

• Si =1, il n’y a pas de séparation quelle que soit la valeur de N.

• Si passe de 1,1 à 1,2, la valeur de R double.

• Si > 2, la valeur de R ne change presque pas comme le montre la figure suivante :

3.5.2. Variation de R avec k’ • Si k’ = 0, R = 0

• Si k’ augmente, R augmente mais si k’ devient très grand, [k’/ (1+k’)] approche l’unité et n’influence plus R, À ce moment le temps de rétention devient très long et le pic de plus en plus large.

3.5.3. Variation de R avec N: La valeur de R est proportionnelle à la racine carrée du nombre de plateaux théoriques. Si la longueur de la colonne est multipliée par 2, R est multiplié par 1,4. Cependant, N demeure un facteur important dans le processus de séparation des pics en chromatographie.

Influence de N sur la résolution Simulation de l'influence de N à et k'constants

3.6. Temps d’analyse. (Nombre de plateaux efficaces par unité de temps)

k'1

k'*1)-(α*

4

NR


26

v vitesse linéaire de la phase mobile. Comme HEPT = L / N et to = L / v, alors

D’où

3.7. Elution linéaire 3.7.1 Isothermes de distribution Dans le cas d'une élution linéaire, le coefficient de distribution varie linéairement avec la quantité injectée. A une température donnée, la courbe CS « dans la phase stationnaire » en fonction de CM « concentration dans la phase mobile » est l'isotherme d'adsorption. Cet isotherme peut être linéaire, concave ou convexe.

En général en chromatographie liquide la sensibilité des détecteurs est suffisante pour permettre l'injection de faibles quantités et l'on se trouve dans la partie linéaire de l'isotherme. La pente est égale CS = K. CM avec K, coefficient de distribution.

3.7.2. Influence de la forme de l'isotherme sur la géométrie du pic et sur le tr L’asymétrie d’un pic est traduite par deux paramètres appelés facteur de traînée et facteur d’asymétrie a) le tailing factor Le premier est le tailing factor (est souvent utilisé dans l’industrie pharmaceutique).

Si l’isotherme est convexe : On parle de front diffus ou fronting, indiquant que la phase stationnaire est saturée en soluté. Si l’isotherme est concave : On parle de traînée ou tailing. De petites concentrations en soluté sont davantage retenues que des plus grandes concentrations;


27

Il est mesuré par le rapport AB sur AC, grandeurs mesurées à 5 % de la hauteur du pic.

b) le facteur d’asymétrie ou asymmetry factor (Fa ou As) Le second est l’asymetry factor qui est plutôt utilisé dans l’industrie non pharmaceutique. Il est mesuré par le rapport BC sur AB, grandeurs mesurées à 10 % de la hauteur du pic. Les grandeurs seront du même ordre de grandeur mais seront rarement équivalentes. Les valeurs normales se situent entre 1 et 1.5 pour une nouvelle colonne. Elles sont souvent légèrement supérieures dans les conditions réelles d’utilisation d’une colonne.

Dans le cas d’un fronting, ces 2 paramètres sont inférieurs à l’unité. Fronting ou front diffus:

Ft <1 Fa<1 Dans le cas d’un tailing, les 2 paramètres sont supérieurs à l’unité. Tailing ou traînée:

Ft >1 Fa>1


28

3.8. Perte de charge dans une colonne (Loi de DARCY)

avec

P perte de charge (en barye = 10-6 bars)

viscosité (poise) L longueur de la colonne (cm) v vitesse de la phase mobile (cm.s-1) K° constante de perméabilité (cm2) dp diamètre des particules (cm)

porosité interstitielle (volume interstitiel de la colonne/volume total). 3.9. Influence de la vitesse de la phase mobile sur HEPT L'équation de VAN DEEMTER (ou de KNOX) permet de suivre les variations de HEPT en fonction de la vitesse linéaire de la phase mobile.

On peut accroître l'efficacité d'une colonne en diminuant v. Cependant en-dessous de 3 ml.min-1 HEPT, passe par un minimum puis croit en raison de la diffusion longitudinale. 3.10. Influence du diamètre des particules sur HEPT La résistance au transfert de masse constitue le facteur limitatif à la cinétique des échanges et pour augmenter celle-ci il faut diminuer au maximum la distance que doit parcourir le soluté entre les différents sites, ce qui est possible en diminuant la taille des particules.

Empiriquement il a été démontré que : HEPT = B. dp.

dp diamètre des particules; B et constantes pour une colonne donnée. Les valeurs de ß sont sensiblement constantes et voisines de 1,6 à 1,8.

La figure ci-dessus illustre le gain d'efficacité quand on passe d'une silice avec dp = 20 mm à dp = 3 mm.


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Le remplissage des colonnes avec des phases stationnaires de fine granulométrie entraîne une augmentation importante de l'efficacité, donc de la résolution. Un compromis doit cependant être réalisé car :

si dp diminue : La perte de charge augmente de façon inversement proportionnelle à dp2

et des difficultés de remplissage apparaissent.

L’exemple de séparation chromatographique de phénothiazines obtenu pour deux dp est donné ci-dessous.

Comparaison des chromatogrammes de 3 phénothiazines (k'1 = 3 ; k'2 = 6,5 ; k'3 = 15) en fonction du diamètre des particules d'un gel de silice. Colonne de 25 cm L et 2,1 mm de Ø, v = 0,7 cm.s-1, détection 254 nm. Phase mobile : acétate d'éthyle / méthanol / éthylamine à 33 % (80/20/0,25).

A dp = 40 mm, P = 3 bars. B dp = 10 mm, P = 35 bars.


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Chapitre III : Chromatographie en phase gazeuse

1. Préambule :

Le concept de Chromatographie en phase gaz a été introduit par Archer Martin et Richard Synge en 1941 (Nobel Chimie 1952 pour le développement de la chromatographie de partage liquide liquide). On distingue 2 types de chromatographie en phase gazeuese:

● Chromatographie gaz/solide: chromatographie d'adsorption. Peu utilisée en raison des traînées dans les pics d'élution provoquées par la non linéarité du processus d'adsorption. CGS.

● Chromatographie gaz/liquide, basée sur le partage des constituants à séparer, les solutés, entre une phase gazeuse mobile inerte appelée gaz vecteur et une phase liquide fixée sur la surface d'un support poreux inactif. CGL

2. Définition et Principe : La chromatographie en phase gazeuse ou CPG s’applique à des échantillons gazeux ou susceptibles d’être volatilisés par élévation de la température. Cette technique s’applique donc aux molécules de bas poids moléculaires (PM < 500 g mol-1) et aux composés stables avec la température. Pour les composés thermolabiles ou peu volatils, l’analyse ne sera possible qu’après des réactions de transformation (dérivatisation). Dans cette technique chromatographique : • La phase stationnaire est un liquide à haut point d'ébullition (G/L), ou solide dans ce cas, la phase stationnaire est un polymère poreux (G/S). • La phase mobile est un gaz qui balaie en permanence la colonne et qui est encore appelé gaz vecteur ou gaz porteur. Cette chromatographie permet la séparation des produits légers et en particulier des gaz.

• La phase mobile est un gaz inerte (N2, He, Ar,...)

• Les solutés à analyser sont injectés à l'état pur ou en solution. Les quantités de produit injectées sont de l'ordre de quelques µl (2 à 3 µl).

• Entrée : Haute Pression Sortie : Pression atmosphérique

3. Objectifs

• Séparer des molécules non chargées, volatils et thermiquement stable.

• Si besoin, dérivatiser pour augmenter la volatilité.


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4. Appareillage en chromatographie en phase gazeuse.

4.1. Les colonnes Selon le diamètre de la colonne utilisée, on distinguera :

a) Les colonnes remplies : Au début des années 50, toutes les analyses chromatographiques s’effectuaient sur des colonnes remplies. Aujourd’hui, les colonnes remplies sont en voie d’abandon au profit des colonnes capillaires beaucoup plus performantes. Elles ne sont plus utilisées que dans 10% des cas. Les colonnes remplies sont des tubes en verre, en métal (acier inoxydable, cuivre ou aluminium) ou en téflon qui ont généralement 2 à 3 m de long et 2 à 4 mm de diamètre intérieur. Afin de n’occuper qu’un volume restreint dans le four, les colonnes sont enroulées en spirales d’environ 15 cm de diamètre. Ces colonnes supportent des débits de gaz vecteur variant de 10 à 40 ml min-1. La colonne contient le matériau de garnissage sur lequel la phase stationnaire aura été soit greffée soit imprégnée à un taux qui peut varier entre 3 et 25% (film mince de 0,05 à 1 µm). La colonne est remplie par un solide finement divisé, dont la surface peut être polaire ou non polaire. Le matériau de garnissage est un support solide finement divisé : • qui se présente sous forme de sphères d’environ 0,2 mm de diamètre • qui est poreux (surface spécifique de 2 à 8 m2g-1) • qui doit être inerte et stable. Ces matériaux sont commercialisés sous le nom de • Chromosorb® : qui sont des silicates fossiles (diatomées) dont le squelette est chimiquement comparable à de la silice amorphe. • Spherosorb® : matériau de synthèse constitué de petites billes de silice. La présence de nombreux groupements silanols confère à tous ces supports une réactivité comparable à celle du gel de silice.

Diamètre interne du tube 1/16 à ¼.

Longueur: 2 à 3 mètres.

Le tube est rempli d’un support: Noir de carbone, graphite sépare les composés en fonction de la taille.

Tamis moléculaire au carbone (carboxen 1000) analyse les gaz et les hydrocarbures légers (surface spécifique1200 m2.g-1).

Terre de diatomées (ChromsorbP).

Silice-Alumine-Zéolithes.

Débit: 10 à 40 mL.min-1.

Diamètre des particules: 3 à 5 mm


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e) b1 : les colonnes capillaires : diamètre varie de 250 à 500 mm.

Les colonnes capillaires sont, comme leur nom l’indique, des colonnes de très faible diamètre interne qui varie de 0,1 à 0,35 mm et de longueur de 15 à 100 m. Les colonnes sont des tubes vides à l’intérieur desquels la phase stationnaire est déposée sur la paroi interne sous forme d’un film régulier. Elles sont appelées : • WCOT (Wall Coated Open Tubular) lorsque la phase stationnaire est liquide • SCOT (Support Coated Open Tubular) lorsque la phase stationnaire est déposée sur un support solide inerte. • PLOT (Porous Layer Opent Tubular) lorsque la phase stationnaire est une couche poreuse. Les colonnes capillaires sont préparées à partir de silice fondue très pure, issue de la combustion dans une atmosphère d’oxygène de SiH4 ou de SiCl4. Leurs parois sont renforcées par une gaine extérieure en polyimide (polymère mécaniquement et chimiquement protecteur Tmax = 370°C) qui est appliquée pendant l’étirage du capillaire. Les colonnes ainsi obtenues sont très flexibles et peuvent être enroulées en spirale d’une dizaine de centimètres. La paroi interne de la silice subit divers traitements qui dépendent de la technique de fixation de la phase stationnaire qui sera constituée d’un film uniforme de liquide de quelques dixièmes de micromètre d’épaisseur.

Différents type de colonnes capillaires


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Avantages des colonnes capillaires / colonnes remplies : – N augmente car A (chemins multiples) ? 0, HEPT ↓ ⇒R ↑ –Débit (µ) plus élevé = temps d’analyse plus courts

• Pas de particules paquetées dans la colonne (∆P ↓) – Plus grande sensibilité pour des petites quantités d’analyte – Pas pratique pour l’analyse de gaz inerte, inorganique, faible MM b2 : Colonne semi-capillaire ou 530 µm Ces colonnes sont l’intermédiaire entre la colonne remplie et la colonne capillaire. Elles sont constituées d’un tube de 0,53 mm de diamètre interne et de 5 à 50 m de longueur. Ces colonnes semi-capillaires sont apparues plus récemment (vers 1983) et elles sont également appelées suivant les fabricants : megabore, macrobore ou ultrabore. Le débit du gaz vecteur peut atteindre 15 ml min-1 ce qui permet de les adapter sur les chromatographes anciens encore en service, tout en conservant les mêmes injecteurs et détecteurs. La résolution de ces colonnes est plus faible que celle des colonnes capillaires (plus le diamètre est petit meilleure est la résolution) mais elle est nettement supérieure à celle d’une colonne remplie. Les colonnes-semi capillaires sont préparées suivant la même technologie que les colonnes capillaires avec un diamètre intérieur plus élevé.

f) Calcul du rapport de phase des colonnes capillaires :

Ce rapport de phase correspond au rapport du volume de la phase mobile sur la phase stationnaire. Il apparait dans la formule



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Le volume de la phase mobile est égal à Vm = 2.r2.L (où L est la longueur de la colonne). Le volume de la phase stationnaire est égal au volume de la couronne d'épaisseur e.

Soit Vs = 2.r.L.e

On obtient donc pour le rapport de phase :

et par conséquent :

On peut déduire que le temps d'analyse (tr) augmente si : Le diamètre intérieur de la colonne capillaire (d)

diminue, l'épaisseur du film de phase stationnaire (e) augmente.

En outre s'il n'y a aucune affinité entre un produit et la phase stationnaire, soit K=0 on a tr = tm, ce

qui est le cas de l'air ou en première approximation du méthane.

On peut déduire que : Pour bien analyser une substance volatile, il faut augmenter k', donc

diminuer le diamètre (d) de la colonne et (ou) augmenter l'épaisseur du film de phase

stationnaire (e).

Et pour bien analyser une substance peu volatile, il faut diminuer k', donc augmenter le

diamètre (d) de la colonne et (ou) diminuer l'épaisseur du film de phase stationnaire (e).

4.2. Les phases stationnaires

En chromatographie gazeuse on retrouve deux types de phases : • Les phases stationnaires liquides (les plus courantes) • Les phases stationnaires solides.


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4.2.1 Les phases stationnaires liquides La phase stationnaire liquide immobilisée dans une colonne de chromatographie doit présenter les propriétés suivantes : • une stabilité thermique et faible tension de vapeur : le point d’ébullition du liquide doit être au moins 100°C au dessus de la température maximale d’utilisation de la colonne. La température maximale d’utilisation d’une colonne doit toujours être précisée par le constructeur (en général les températures sont comprises entre 200 et 350°C). • une inertie chimique : les composés à séparer sur la phase stationnaire ne doivent pas subir de modification de structure à son contact.

• des propriétés de solvant telles que k’ et α se situent dans le domaine optimal pour les solutés à séparer. 4.2.2 Choix de la phase stationnaire : Le choix de la phase stationnaire dépend essentiellement de la nature chimique des molécules à séparer. La rétention des molécules étant la conséquence de leur interaction avec la phase stationnaire (solubilité), dans ce cas le principe les semblables dissolvent leur semblables s’applique. Ainsi, il faudra rechercher une analogie structurale entre les substances à chromatographier et la phase stationnaire. Cette phase stationnaire doit se comporter comme un bon solvant vis-à-vis des molécules pour assurer leur fixation, mais cette fixation ne doit pas être irréversible afin que la migration chromatographique puisse se réaliser. La polarité des phases rend bien compte des analogies et il est habituel de classer les phases stationnaires par polarité. On choisira une phase dont la polarité est proche de celle des molécules à chromatographier. Celles dont les polarités sont très différentes ne pourront pas être retenues et traverseront la colonne sans être chromatographiées. Par exemple : un mélange d’alcools se séparera sur des phases stationnaires riches en groupements OH alors qu’un mélange d’hydrocarbures ne pourra être séparé que sur une colonne apolaire. La polarité d’une molécule est mesurée par le moment dipolaire qui reflète l’effet du champ électrique qui règne au voisinage immédiat de la molécule. Les phases les plus répandues sont les polymères siliconés dérivés du diméthyl polysiloxane.

Les polysiloxanes sont connus sous le nom d’huiles ou de gommes silicones. Elles répondent à la répétition d’un motif de base comportant deux chaînes carbonées par atome de silicium. Grâce à leur


36

gamme de température d’utilisation très étendue, ce sont des phases les plus utilisées pour les colonnes capillaires. R1 et R2 sont soit des chaînes alkyle ou aryle simples (méthyle ou phényle) ou comportant des fonctions (cyanopropyle (-C3H6CN), trifluoropropyle(-C3H6CF3)). La diversité de ces groupements et de leur enchaînement sont très grands : il existe un nombre considérable de phases qui offrent de multiples possibilités de séparation en modulant la polarité et les caractéristiques des colonnes (50 < T < 350°C). polarité et les caractéristiques des colonnes (50 < T < 350°C). Les différentes marques commerciales se distinguent par des lettres (OV, SE, XE…) auxquelles cette phase est greffée sur la colonne en silice par l'intermédiaire une liaison -O-Si-O- . Suivant le pourcentage de groupement R par rapport aux groupes CH3, on peut modifier la polarité de la colonne et donc ses propriétés en chromatographie.

Si R= CH3, la colonne est complètement apolaire et sépare les produits suivant leur point d'ébullition

(noms commerciaux : DB-1, OV101, SE-30...). Si le % de R= Phényle est égal à 5%, on a la colonne la plus utilisée en CPG, elle est répertoriée

sous les noms commerciaux suivants: DB5, CPsil5, OV5... Si on incorpore un substituant cyanopropyle (R=-CH2-CH2-CH2-CN) la polarité augmente

beaucoup (à cause du fort moment dipolaire du groupe -CN). Ce sont les phases DB 1701, CPSil 18...

Ces phases à base de silicone présentent deux avantages pour la CPG : Une bonne inertie chimique, elles ne réagissent ni avec les phases stationnaires, ni avec les

produits injectés.

Une très bonne tenue à la température, elles peuvent être chauffées sans dommage jusqu'à 300°C

Ils existent d'autres phases beaucoup plus polaires à base de polyethylène glycol. HO-(-CH2-CH2-O-)n-O-(Silice)

Elles sont greffées sur les parois en silice de la colonne par l'intermédiaire d'une liaison Si-O-C

Les dénominations commerciales de ces phases sont: Carbowax, DB-wax, CP wax 52.

Ces phases sont utilisables entre 20° et 250°C, elles sont moins inertes que les phases siliconées,

elles sont en particulier très sensibles à l'oxygène.

Les polyesterglycols

L’estérification des glycols par des diacides à chaînes courtes, tels les acides succinique ou adipique, forment des polymères utilisés pour les phases stationnaires polaires. A titre d’exemple, on retrouve parmi ces phases : • les BDA : adipates de butane diol • les BDS : les succinates de butane diols


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• les DEGS : diétylène glycol succinate • les FFAP : nitrophtalate de polyéthylène glycol… Les carbures saturés

Les carbures staturés de formule générale CnH2n+2 sont utilisés comme phase apolaire. Parmi ces phases, on retrouve le squalane (C30H62) ou différentes paraffines (Apiezon). Sur cette phase, les composés sont élués dans l’ordre des températures d’ébullition croissantes. Diverses phases greffées à base de polyalkylsiloxanes remplacent le squalane. Les phases stationnaires solides

La chromatographie gaz-solide s’effectue sur des colonnes remplies et sur colonnes capillaires. Pour ces dernières une fine couche d’adsorbant est fixée sur la paroi interne du capillaire. Ces colonnes sont appelées colonne PLOT (Porous Layer Open Tubular). Ces phases sont constituées par des matériaux adsorbants divers : silice ou alumino-silicates désactivés par des sels minéraux, polymères poreux, carbone graphite… Parmi ces phases, on retrouve : • les tamis moléculaires : constitués par des cristaux d’alumino-silicates déshydratés se différenciant par le diamètre de leurs pores. • les polymères poreux : Porapak : ce sont des composés formés par la polymérisation de molécules de vinyl éthyl benzène en présence de molécules de divynil benzène. Ces matériaux permettent la séparation des composés légers et volatils de faibles poids moléculaires qui traverseraient trop rapidement les colonnes à phases liquides. • les porapak Q se prêtent aussi bien à la séparation de molécules polaires comme l’eau, le méthanol et l’acétone qu’à la séparation de gaz comme CO2 ou d’hydrocarbures légers comme le méthane, le propane, butane…

4.3. Les phases mobiles. Le gaz vecteur « phase mobile ou gaz porteur » doit répondre à certains critères : • il doit être inerte chimiquement vis-à-vis de substances à chromatographier. C’est pourquoi on utilise le plus souvent l’hélium, de l’argon, de l’azote et de « l’hydrogène ». • il doit avoir une très grande pureté, il ne doit pas contenir, entre autres des traces d’eau ou d’oxygène souvent préjudiciables aux phases stationnaires. On installe donc un double filtre desséchant et réducteur entre la bouteille de gaz et le chromatographe. • il doit avoir une très faible viscosité. La viscosité ou le débit de gaz ont une influence sur la dispersion dans la colonne (équation de Deemter), donc sur l’efficacité et la sensibilité de la détection. La pression en tête de colonne est soit stabilisée avec un système mécanique de contrôle soit asservie électroniquement afin que le débit dans la colonne, et donc la vitesse linéaire du gaz, reste à sa valeur optimale au cours de l’analyse. En résumé : –He, N2 et H2 donnent environ le même HEPT optimal, mais à des débits (µ) différents – Vitesse optimale augmente de N2< He < H2

– Séparations les plus rapides avec H2 sans perte de résolution (HEPT↓) Or, Il ya un inconvénient car : • réagit de manière catalytique avec les composés insaturés • incompatible avec la MS car détruit l’huile des pompes • gaz explosif lorsque présent à >4% vol.

– À plus haut débit, H2 et He donnent une meilleures R (HEPT ↓) que N2

• soluté se diffuse plus rapidement donc Cµ↓ ⇒HEPT ↓ ⇒R ↑

– Si gaz plus lourd, il y a moins de diffusion, donc B/µ↓ ⇒HEPT ↓ ⇒R ↑ –Viscosité : H2 < N2< He • résistance lors de la circulation dans un capillaire


38

Les courbes de Van Deemter La phase mobile « ou gaz vecteur » est un gaz de faible viscosité, trois gaz sont exclusivement employés, l'azote, l'hydrogène et l'hélium.

Courbes de Van Deemter pour l'azote, l'hélium et l'hydrogène

Les courbes de Van Deemter, H = f(u), montrent : L’efficacité en fonction de la nature et de la vitesse linéaire

du gaz vecteur. ces courbes typiquent de van deemter montrent que l’H2 est parmi ces 3 gaz celui qui permet les

separations les plus rapides à performances égales. noter l’augmentation de la viscosite de ces gaz en fonction

de la temperature. Malheureusement l'hydrogène est un gaz dangereux présentant des risques d'explosion.

Pour ces raisons de sécurité, c'est l'hélium qui en général utilisé.

En général, la nature du gaz ne modifie pas de manière significative les valeurs de coefficient de

distribution des composés. Contrairement à la plupart des autres types de

chromatographie, il n’y a pas d’interaction entre les molécules éluées et la phase mobile. La seule

fonction du gaz est de transporter l’analyte dans la colonne d’où le nom de gaz vecteur.

E n chromatographie gazeuse, la température est le seul facteur de modification important. Le choix

du gaz est souvent dicté par le type de détecteur utilisé.

4.4. Théorie de l’élargissement des bandes et influence de la vitesse d’écoulement de la phase mobile a. Équation de van Deemter :

U en cm/s, H en cm donc : A en cm, B en cm2/s et C en s




39

b. Signification physique des termes A, B, C

Ainsi l'étalement d'une bande de soluté a trois origines :

A : Anisotropie d’écoulement (la dispersion par diffusion axiale) A: diffusion turbulente ou diffusion d’Eddy :

Terme dû aux multiples veines d’écoulement : Anisotropie d’écoulement

Si dp diminue, A…........ H…. N……………………..

A= λ.dp

λ : facteur de remplissage de la colonne dp : diamètre des grains ou des particules Si Colonne pleine : A ≠ 0 Si Colonne capillaire (G.C.) : A = 0

→ Equation de Golay pour la GC en colonne capillaire : Ce terme A est absent par nature dans les colonnes capillaires car il n’y a pas de remplissage de la colonne. La courbe correspondante montre l’abaissement de la courbe consécutif à la suppression du terme A. La diffusion turbulente de la phase mobile au travers d'un support solide est :

Indépendante du débit

Dépend du remplissage de la colonne (l) et de la taille des particules (dp)

C.u

u

BH


40

l'existence de chemins multiples dus au remplissage (hétérogénéité d'écoulement) B: diffusion longitudinale : Diffusion du composé de la région concentrée d’une bande vers la région diluée

γ : facteur d’obstruction ou de tortuosité DM : coefficient de diffusion

mesure la mobilité du composé dans la phase mobile

plus faible dans les liquides que dans les gaz

augmente avec la température

diminue quand la viscosité du milieu augmente.

C’est la dispersion des molécules dans une direction parallèle à l'axe de la colonne, c’est une diffusion selon le gradient de concentration, qui est d'autant plus importante que le débit de la phase mobile est faible. La diffusion dans le sens inverse à l'écoulement est plus importante, elle est due au débit de la phase mobile.

Si la vitesse augmente, B............................, H..........................., N...............................

la résistance au transfert de masse dans chacune des 2 phases.

C. : cinétique de transfert de masse

C. u = (CPS + CPM).u Le terme C, est dû à la résistance au transfert de masse du soluté entre les deux phases, il devient prépondérant lorsque le passage est trop rapide pour que les équilibres puissent s’établir correctement. Les solutés sont entraînés hors équilibre et les séparations ne se font plus correctement.

u

Dγ2

u

BM


41

Transfert de masse favorisé par : une faible épaisseur de phase stationnaire

un petit diamètre de colonne

une température plus élevée

un coefficient de diffusion DM peu élevé (PM peu visqueuse)

un faible débit d’éluant. On observe aussi un élargissement des pics dû aux effets de transfert de masse.

L’équilibre entre FM et FS s’établit lentement et la qualité de la séparation sera mauvaise si l’élution est trop rapide et les équilibres, incomplets ce qui se produit aux grandes valeurs de u

Ce transfert de masse est dès lors favorisé par de faibles épaisseurs de M et de S, par un petit diamètre

de colonne, par des coefficients de diffusion élevés (M peu visqueuse), par des débits d’éluant faibles.

On constate donc que la contribution de la vitesse d’élution sur les termes B/u et C.u est contradictoire.

La courbe expérimentale montre qu’il faut chercher un compromis entre deux phénomènes : la diffusion et la vitesse d’échange entre les phases.

Deux facteurs contribuent à une bonne séparation par chromatographie :

la différence entre les temps de rétention

la largeur des pics

On le voit sur le schéma, une séparation efficace requière une différence suffisante entre les tr et une largeur de pic restreinte.

En résumé : Pour réduire H et augmenter N : On peut diminuer

le diamètre de la colonne

le diamètre des particules

la température (CPG), T: pas très utile pour CL (DM est trop petit)


42

4.5. Injecteurs La phase d’injection est une étape importante de l’analyse. L’introduction trop lente des échantillons cause souvent un élargissement des pics et réduit la résolution. Les caractéristiques des injecteurs ainsi que les modes d’injection diffèrent suivant les types de colonnes auxquelles ils sont connectés. Les injecteurs par vaporisation directe : Ce type d’injecteur est utilisé pour les colonnes remplies et pour les colonnes capillaires de 530 µm qui nécessitent un débit de gaz vecteur de plus de 10 ml/min. L’échantillon est prélevé à l’aide d’une micro seringue puis est injecté à travers un septum en élastomère dans une chambre de vaporisation située au début de la colonne. La chambre d’injection est habituellement maintenue à 50°C au dessus du point d’ébullition du constituant le moins volatil de l’échantillon. a) Injecteurs pour colonnes Remplies L’injection à chaud avec vaporisation directe dans le corps de l’injecteur. Ce type d’injection présente

l’inconvénient de favoriser la décomposition des substances fragiles car la température de l’injecteur est

passablement plus élevée que celle de la colonne.

Ces injecteurs sont constitués d’un tube métallique doublé d’un chemisage en verre (un insert) balayé par le gaz vecteur et chauffé à la température de consigne. L’une des extrémités de l’injecteur est obturée par le septum pour permettre le passage de l’aiguille de la microseringue, l’autre extrémité est raccordée à la colonne. La totalité de l’échantillon injecté part dans la colonne en quelques secondes. b) Injecteurs pour colonnes capillaires. Ces injecteurs sont utilisés pour les colonnes capillaires à faible débit car les volumes introduits avec la microseringue sont souvent trop importants pour ce type de colonne et peuvent les saturer. On utilise alors des injecteurs pouvant fonctionner avec deux modes : avec ou sans division (split ou splitless).


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En mode split : le gaz vecteur arrive avec un grand débit dans la chambre de vaporisation. Une vanne de fuite sépare le courant gazeux en deux parties dont la plus petite est la seule à pénétrer dans la colonne. Un dispositif règle le débit de fuite (généralement entre 50 et 100 ml/min) et le facteur de division varie entre 1/20ème et 1/500ème (95 à 99,8%). En mode splitless : ce mode d’injection est réservé à l’analyse de traces. On injecte l’échantillon avec la vanne de fuite fermée durant 0,5 à 1 minute afin que les composés vaporisés en même temps que le solvant se concentrent sur les premiers centimètres de la colonne. Puis l’ouverture de la vanne de fuite élimine ensuite de l’injecteur les composés moins volatils qui nuiraient à l’analyse. 4.6. Détecteurs

Les détecteurs décèlent la présence des substances chromatographiées dans le gaz vecteur au fur et à mesure de leur élution. Ils sont toujours placés en sortie de colonne. Ces substances modifient une propriété chimique ou physique du gaz et ces variations sont transformées par le détecteur en signaux électriques qui sont amplifiés et transcrits sous forme d’un graphique. Un détecteur idéal doit présenter les caractéristiques suivantes : 4.6.1 Caractéristiques d’un détecteur Bonne sensibilité. Bonne stabilité et reproductibilité. Réponse linéaire sur plusieurs décades de concentrations. Domaine de température de fonctionnement compris entre la température ambiante et au

moins 400°C. Temps de réponse rapide et indépendant de la vitesse d’écoulement. Grande fiabilité et facilité d’utilisation. Réponse uniforme ou sélective pour différents solutés.

Conservation de l’intégrité de l’échantillon Limite de détection (LD) : c’est la quantité de soluté requise pour avoir un rapport signal

bruit au moins égal à 3. Limite de quantification (LQ) : c’est la quantité de soluté requise pour avoir un rapport signal

bruit au moins égal à 10. Domaine de linéarité (LL) : domaine dans lequel la réponse du détecteur est directement

proportionnelle à la concentration. Sélectivité : propriété du détecteur à ne pas répondre de la même manière à toutes les espèces x,

capacité à analyser des molécules spécifiques. Sensibilité : capacité d’un détecteur à répondre à de faibles variations de C ou de m.

4.6.2. Détecteur à ionisation de flamme (FID) Détecteur le plus utilisé et spécifique aux composés carbonés sauf HCHO et HCOOH. Le détecteur à ionisation de flamme est le plus utilisé. On le considère comme un détecteur non spécifique car il peut déceler pratiquement touts les composés combustibles c’est-à-dire les composés organiques. Il n’est pas sensible aux molécules minérales présentant un potentiel d’ionisation élevé comme l’eau, CO, CO2, SO2, N2 et les NOx, ce qui présente un avantage lorsque l’on veut analyser des solutions aqueuses ou des composants de l’atmosphère.


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Principe : Son principe est basé sur l’ionisation des molécules combustibles dans une flamme constituée d’air et d’hydrogène et en la mesure du courant résultant. Les composés sont brûlés dans une flamme, on forme des radicaux, le courant produit est quasi proportionnel au nombre d’atomes de carbone. Le courant gazeux sortant de la colonne arrive dans une flamme d’hydrogène et d’air (T = 210°C). La plupart des composés organiques sont détruits par combustion et produisent des ions capables de conduire l’électricité à travers la flamme. Une différence de potentiel de 100 à 300 V est appliquée entre deux électrodes : une électrode de polarisation (brûleur) et une électrode collectrice, électrode annulaire disposée au sommet de la flamme qui collecte le courant ionique très faible (10-12 A). Le signal est transformé et amplifié en une tension mesurable.

En l'absence de solutés à la sortie de la colonne le gaz vecteur arrivant à débit constant au détecteur, provoque un courant ionique résiduel très faible et constant qui génère une ligne de base parfaitement rectiligne.

Lorsqu'un soluté brûle dans la flamme du détecteur il y a formation, en particulier, d'ions négatifs et d'électrons qui sont captés par une électrode collectrice portée à un potentiel positif par rapport à la tête du brûleur, ceci provoque la création d'un courant (quelques nA) qui est amplifié puis transmis au calculateur-enregistreur. L'intensité de ce courant étant proportionnel à la quantité de substance brûlée donc à la quantité de soluté dans le mélange, cette technique d'analyse est parfaitement adaptée aux dosages quantitatifs. Remarque : Le détecteur à ionisation de flamme ne donne aucune réponse avec les gaz, les composés inorganiques

et des corps très simples comme H2O, NH3, CO2, H2C=O....


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4.6.3. Détecteur à conductibilité thermique « ou à Catharomètre »

Le choix du gaz vecteur est beaucoup plus large que dans le cas des détecteurs à catharomètres. Celui qui est le plus fréquemment utilisé est l’azote qui est à meilleur marché.

Avantages : Le détecteur à ionisation de flamme présente une sensibilité élevée (≈10-13

g de soluté / ml de gaz vecteur). Cette sensibilité évolue selon les molécules : elle est maximale pour les molécules possédant des atomes de carbones liés à d’autres atomes de carbone o u : des atomes d’hydrogène. La sensibilité diminue si le composé possède des groupements fonctionnels tels que : carbonyles, alcool, halogène et amine. Il présente un domaine étendu de réponse linéaire (≈107). Il est robuste et simple d’utilisation. Inconvénient : il détruit l’échantillon lors de sa détection.

4.6.4. Détecteur à conductibilité thermique Ce détecteur est un détecteur sélectif qui est très sensible pour les composés organiques azotés ou phosphorés. Son principe est le même que celui du FID. L’effluent sortant de la colonne est mélangé avec l’hydrogène et est brûlé dans une flamme. Le gaz chaud circule sur une pastille en céramique (en silicate de rubidium ou de césium) chauffée électriquement. Cette pastille sert d’électrode et on lui applique une tension de 180V par rapport au collecteur. A cette température de 600 à 800°C, il se forme au voisinage de la pastille et sans que l’on puisse expliquer le phénomène, un plasma d’ions lorsque la molécule étudiée contient de l’azote ou du phosphore. Il résulte un courant ionique important. Détecteur à conductibilité thermique quasi universel comprenant un montage différentiel (pont de Wheastone) dont les résistances compensent le déséquilibre de conductivité par une perte de chaleur. Le gaz vecteur doit avoir une bonne conductibilité thermique tel que H2 ou He et posséder une conductivité différente de celle des solutés. Les conductibilités thermiques de l’hydrogène et de l’hélium sont environ 6 à 10 fois plus grandes que celles de la plupart des composés organiques. Dès lors, la présence de molécules organiques, même en petite quantité, entraîne une variation relativement importante de la conductivité thermique de l’effluent. Les conductivités de la plupart des autres gaz vecteurs étant trop proches de celles des constituants organiques, l’utilisation d’un détecteur à conductivité thermique impose l’utilisation d’hydrogène ou d’hélium comme gaz vecteur.

Conductibilité thermique de quelques gaz et solutés


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Caractéristiques :

LD : 10-9 g.mL-1

Linéarité faible : 3 à 4 décades (10 à 10000).

Volume de 20 µL à 140 µL.

Répond en concentration

Contrôle de température est très important.

Les avantages de ce détecteur sont : sa simplicité, son large domaine de linéarité (≈105), sa réponse générale aux espèces organiques ou inorganiques et son caractère non destructif qui permet de collecter les solutés après leur détection.

Les inconvénients sont : sa sensibilité relativement faible (≈10-8g de soluté / ml de gaz vecteur). D’autres détecteurs dépassent cette sensibilité d’un facteur 104 à 107. Ces catharomètres ne peuvent pas être utilisés à la sortie des colonnes capillaires car la quantité d’échantillon est alors trop faible pour pouvoir être détectée.

4.6.5. Détecteur à capture d’électrons

Détecteur spécifique aux dérivés halogénés. L’électron est formé à partir d’un gaz par des particules β-

provenant du 63Ni ou du tritium. N2→N2++e-

Mécanisme : M+e-→M- // M-+N2+→M+N2

On mesure la variation de courant électrique entre I° (en l’absence de molécules) et I (courant résiduel en présence de soluté).

I=I°-kC, détecteur non linéaire.


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Caractéristiques : Très spécifique des composés halogénés. LD : 5.10-4 g.s-1 de Lindone. Linéarité : 104. Répond en masse.

Pour ce type de détecteur, le gaz vecteur le plus fréquemment utilisé est l’azote.


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Les avantages : c’est un détecteur sélectif. Il est essentiellement utilisé pour l’analyse des pesticides chlorés. Sa sensibilité est très grande et on peut atteindre des valeurs voisines du picogramme (10-12 g), mais elle varie de façon considérable selon la nature des substances. Elle est très élevée pour les molécules renfermant des halogènes et croît quand on passe de l’iode au fluor (I < Br < Cl < F). La linéarité de la réponse n’est qu’approximative (gamme dynamique de 104 avec l’azote). Inconvénients : l’utilisation de ce détecteur demande des précautions particulières. Il est extrêmement sensible et exige une grande pureté des solvants servant à la préparation et à l’injection des extraits à chromatographier. De plus, sa spécificité vis-à-vis des molécules électrophiles ne permet pas d’utiliser des solvants chlorés. De même, le contact des solutions à chromatographier avec des récipients ou des bouchons en matière plastique est à éviter. La présence d’une source radioactive dans ce détecteur le soumet à une réglementation particulière (contrôle de source radioactive, agrément du laboratoire, maintenance). 4.6.6. Détecteur à photométrie de flamme (FPD) Détecteur spécifique du phosphore et du soufre qui émet respectivement à 526 nm et 394 nm. Le détecteur à photométrie de flamme a été largement appliqué à l’analyse des polluants de l’air On utilise une flamme qui brûle les molécules et excite les atomes émettant un rayonnement.

Caractéristiques : L’élément analysé dépend du choix du filtre. LD : 2.10-11 g.s-1 pour S. 3.10-13 g.s-1 pour P. Linéarité : 5 décades pour P La racine carré de la réponse est proportionnelle à la quantité injectée. Répond en masse.

4.6.7 Détecteur thermoionique (NPD) Détecteur spécifique aux molécules azotées et phosphorées.

Caractéristiques : LD : 2.10-14 g.s-1. Spécificité : N/C 106. N/P >102. Linéarité comparable au FID : 7 décades. Gaz vecteurs : Ar, Ne, He.

4.6.8. Détecteur à photoionisation

Les composés à analyser sont ionisés par un faisceau UV intense au Xe ou Ar d’énergie respective 8,3

eV et 11,7 eV ; des électrodes collectent les ions formés. Il appliqué pour les dérivés aromatiques et les

composés insaturés.

4.6.9. Détection par spectrométrie de masse

En adaptant en sortie de colonne un détecteur de masse (spectromètre de masse de basse résolution), on obtient le spectre de fragmentation de chacun des composés élués. A partir du courant ionique total (TIC), on peut tracer le chromatogramme représentatif des composés élués. En sélectionnant un ion particulier (technique SIM), on obtiendra un chromatogramme sélectif. Bien que cette méthode conduise à une sensibilité plus faible que les détecteurs classiques, elle est devenue irremplaçable dans un nombre important de dosages actuels, notamment dans les analyses de


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l’environnement. On peut également adapter un détecteur infrarouge, en sortie de colonne on obtient le spectre du moyen infrarouge de chaque composé élué. Ces méthodes couplées sont largement utilisées pour doser les traces. Le couplage du chromatographe et du spectromètre de masse est simplifié du fait de la nature de la phase mobile qui est gazeuse. Mais, il réside le problème de différence de pression qui existe entre ces deux appareils ; le chromatographe fonctionne à pression atmosphérique, alors que le spectromètre de masse, sous un vide poussé.

5. Principe du phénomène de migration dans une colonne de

chromatographie en phase gazeuse.

5.1 Constitution d'une colonne


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5.2 Comportement d'un soluté A entrant dans la colonne (capillaire)

5.3 Etude du processus de séparation d'un mélange de deux solutés A et B.

6. Classification des phases stationnaires. Un grand nombre de colonnes sont disponibles dans les catalogues pour chromatographie, ce qui rend difficile le choix de celle qui sera le mieux adaptée pour résoudre le problème analytique. La polarité et la nature chimique de la phase ne permettent pas, à elles seules, de prévoir leur réelle aptitude à séparer certains composés. Un système de repérage a été mis au point : il est connu sous le nom de système des indices de rétention. Il repose sur l’utilisation de composés témoins dont les facteurs de rétention ainsi que les facteurs de sélectivité diffèrent suivant la phase stationnaire. Pour déterminer les constantes d’une phase stationnaire, on commence par injecter une série d’homologues de n-alcanes sur la colonne étudiée en régime isotherme. Le chromatogramme qui en résulte a la particularité que logarithme des temps de rétention réduits (t’R) des homologues augmente linéairement avec le nombre n d’atomes de carbone des n-alcanes.

6.1 Indice de Kovats et droite de Kovats Kovats, en 1958, a proposé l'indice de rétention I comme paramètre d'identification des solutés. Le chromatogramme en régime isotherme d'un mélange de n alcanes montre que les log(t'r) croissent linéairement en fonction du nombre n d'atomes de C.

Par définition: I (n alcane) = 100 x nombre d'atomes de carbone indépendamment du remplissage de la colonne, de T et des autres conditions de chromatographie. I (soluté) peut être obtenu à partir d'un mélange du soluté et d'au moins 2 alcanes normaux (hydrocarbures aliphatiques linéaires saturés CnH2n+2) qui encadrent I (soluté).


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Explication soluté A dans phase mobile → soluté A dans phase stationnaire ΔrG0 pour qu'il y ait séparation

chromatographique, il faut ΔrG0 < 0 , K = [A]Stat / [A] Mob

K est donc la constante d'équilibre et le rapport de distribution puisque ΔrG0 = RT

et que K = . k' = . t' / tM

Ln t' = Ln K + Ln ( tM / ) ;

Ln t' = -ΔrG0 / RT + Ln ( tM / ) pour A

La courbe Ln t’en fonction de n des n alcanes A, B, C, ... varie comme (ΔrG0) à T ct. Il en est de même pour log t'

L’objectif est de caractériser la rétention de différents solutés sur une phase stationnaire. Pour un alcane linéaire : I = 100n, avec n : le nombre d’atomes de carbones. La figure suivante montre la droite de Kovats des 6 n alcanes de C4à C9 :

log (t'r(n))= f(n) = a . n + b La pente de la droite dépend de la colonne et du réglage du chromatographe. L'indice de rétention ne dépend que de la phase stationnaire. Indice de rétention du toluène =749

La droite de Kovats est établie sur une série d’homologues et dans des conditions opératoires fixées en régime isotherme et isobare.

Droite de kovats. Chromatogramme en régime isotherme d’une série de 5 n alcanes (C10-C14) et droite de kovats correspondante pour la phase stationnaire et les conditions d’analyse précises. Log t’R(n) = a*n + b Sans changer les réglages de l’appareil, on injecte un composé inconnu X. Le nouveau chromatogramme va permettre de calculer l’indice de rétention de Kovats de X sur la colonne


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considérée. Il est défini comme étant le produit par 100 du nombre de carbones de « l’alcane linéaire» ayant le même temps de rétention réduit que le composé inconnu injecté. Deux méthodes sont utilisées pour trouver ce nombre de carbones : • la méthode graphique qui s’appuie sur la droite de Kovats, • la méthode basée sur le temps de migration réduit des deux alcanes qui encadrent le

produit X sur le chromatogramme : Pour un composé X : IX = 100β, avec β le nombre fictif d’atomes de carbones de l’alcane linéaire équivalent où :

)('log)1('log

)('log)('log100100

ntnt

ntXtnI

RR

RRX

A la différence de la droite de Kovats, les indices de rétention ne dépendent que de la phase

stationnaire et non de la colonne et des conditions opératoires d’analyse.

Calcul graphique d’un indice de rétention de kovats (I = 100.nx) sur une colonne en régime isotherme

Remarque : nx peut être fractionnaire bien qu’il s’agisse d’un « nombre de carbones équivalent

Il existe des tables de IX afin d’identifier un composé inconnu.

)(2)1()1(

)()1()1( 2

0

ntntnt

ntntntt

RRR

RRR

6.2 Constantes de phases stationnaires Cette constante est calculée en comparant les indices de Kovats de 5 composés témoins appartenant à des groupes fonctionnels différents sur la phase étudiée, d’une part, et sur le squalane d’autre part. Le squalane est la phase prise comme référence car c’est la seule phase apolaire qui est reproductible car c’est un produit pur. Les 5 constantes de McReynolds sont calculées, pour une phase donnée, par différence de Constante de Rohrchneider (1959). Pour 5 molécules étudiées sur une phase stationnaire de référence, la squalane, et une phase stationnaire à étudier.

100

réferenceétudiée IIcste

La somme de ces 5 valeurs calculées a été retenue pour définir la polarité globale de la phase testée. Ces constantes, qui ont un lien avec la structure des molécules, permettent d’apprécier les forces d’interaction soluté/phase stationnaire en relation avec quelques grandes classes de composés.


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Un produit dont l’indice a une valeur élevée indique que la phase étudiée retient fortement les composés qui seront porteurs de la fonction organique considérée. Ainsi pour séparer un hydrocarbure aromatique d’un mélange contenant des cétones, on choisira une colonne pour laquelle la constante pour le benzène est assez différente de celle de la butanone. Ces différences d’indices de rétention figurent dans la plupart des catalogues de fabricants de colonnes de chromatographie.

Tableau : Constante de MCreynolds (i) de quelques phases stationnaires

Tableau : indice de kovats des 5 composes témoins ci-dessus sur Squalane.

Le calcul des indices de rétention implique que les mesures soient effectuées dans des conditions

isothermes.

L’indice de rétention sur une phase et dans des conditions données, constitue une information

intéressante et donne des informations sur l’identification des molécules. Cette méthode est exploitable

si l’on dispose pour les composés que l’on recherche de tables des indices de rétention sur les phases les

plus courantes (Squalane, SE 30, Carbowax…). Cependant, de nos jours, l’exploitation des indices

de rétention a perdu de son intérêt car les colonnes capillaires utilisent des phases nouvelles.

Actuellement ce sont les techniques couplées qui sont plus généralement utilisées pour identifier les

produits de réaction.

7. Applications de la CPG. Les applications sont très nombreuses (Chimiques, Pétrochimiques, Pharmaceutiques et médicales, Biologiques, Agricoles, Agroalimentaires, Environnement, Contrôle de qualité « fabrication et synthèse, recherche fondamentale »), dans tous les domaines et les développements de la chromatographie gazeuse à grande vitesse ou multidimensionnelle rendent cette technique toujours plus attractive.


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Chapitre IV : Chromatographie en phase liquide

Partie I : Chromatographie en phase liquide conventionnelle : « CLC »

1. Généralités.

Le terme «chromatographie liquide» s'applique à toutes les techniques dont la phase mobile est liquide.

De façon schématique, une colonne contient une phase solide fixe, percolée à débit constant par une

phase liquide mobile. Celle-ci est maintenue en surpression grâce à un réservoir. On dépose en haut de

la phase fixe un mélange de constituants avant de relancer le débit de la phase mobile.

2. Principe. En chromatographie sur colonne, un réservoir de phase mobile vient alimenter une colonne qui porte, entassée dans sa structure cylindrique, la phase stationnaire sous forme de petites particules. La phase mobile, à sa sortie de la colonne, traverse un dispositif de détection conçu pour déceler la présence de composés séparés. Elle termine finalement sa course dans un collecteur de fraction si les composés séparés présentent un intérêt quelconque à être récupérés.


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Alors que les autres méthodes chromatographiques sont habituellement employées pour l'analyse et la

séparation de très faibles quantités de produits.

La chromatographie sur colonne « CLC » peut être une méthode préparative; elle permet en effet la

séparation des constituants d'un mélange et leur isolement, à partir d'échantillons dont la masse peut

atteindre plusieurs grammes. Elle présente cependant plusieurs inconvénients:

de grandes quantités de solvant sont nécessaires à l'élution

la durée de l'élution est généralement très grande

la détection des composés exige une attention constante.

Elle est adaptée à la purification de faibles quantités de produit, lorsque les conditions opératoires sont au point.

La méthode étant très empirique, sa mise au point nécessite souvent de nombreux essais.

Ces caractéristiques sont :

Granulométrie > 10µm

Appareillage simple : Tube en verre avec plaque en verre fritté à la base ou tampon de coton

Substances descendent le long de la colonne selon affinité

Recueil de l’éluat par petites fractions

Mais : peu sensible

Durée d’analyse trop longue

Peu d’analyse de trace ou dosage.

Absence de détecteur.

3. Mode d’élution Pour éluer les différents composés en chromatographie liquide, une phase mobile de composition soit uniforme tout au long de la séparation « mode isocratique », soit variable dans le temps « mode gradient d’élution »

Très souvent cependant, en quête d'une efficacité accrue du processus de séparation, il est plus performant de modifier la composition de la phase mobile en cours d'opération. La modification se fait par étapes ou encore de façon continue. On parle dans ce dernier cas de gradient d'élution. C'est à l'aide de différentes pompes précises que le mélange de deux ou de plusieurs solvants d'élution, en proportions continuellement modifiées, est effectué. Afin d'améliorer la séparation et l'aspect d'un chromatogramme, il est souvent approprié d'utiliser un gradient de concentration.


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C'est le cas, par exemple, quand il est impossible de choisir une phase mobile unique qui procure des valeurs de k' optimales pour tous les composés, de sorte que chaque pic soit séparé correctement des autres dans un délai raisonnable. Un exemple de l'utilisation d'un gradient d'élution entre deux solvants pour maximiser la résolution est présenté à la figure suivante. La séparation est amorcée avec 100% d'un premier solvant Mais, immédiatement, un second, le modificateur de polarité, est introduit dans le système. Sa proportion dans la phase mobile, à l'origine de 0% (indiqué sur la figure), augmente continuellement et progressivement jusqu'à remplacer complètement le premier solvant (100% de modificateur). L'élution des différents composés est ainsi provoquée et contrôlée par une proportion de plus en plus

élevée du second solvant, qui au terme du processus constitue la totalité de la phase mobile.

Sans utiliser de gradient, la séparation, dans le cas de la situation décrite, serait très longue avec le

premier solvant, montrant les derniers pics du chromatogramme très étalés.

À l'inverse, dans le cas d'une élution provoquée uniquement par le second solvant, la séparation serait

très rapide, trop rapide, et les pics mal résolus entre eux.

La phase stationnaire en chromatographie liquide peut être plane, comme c'est le cas en chromatographie sur couche mince ou sur papier, ou encore se présenter sous la forme de particules de faibles tailles entassées dans un tube, une colonne. La séparation modulée par un gradient de concentration dans la phase mobile 4. Principaux modes de séparation en chromatographie liquide

Il existe plusieurs modes possibles en chromatographie liquide à haute performance. Ils correspondent

chacun à un type précis d’interaction:

adsorption partage échange d’ion exclusion par taille


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Tableau résumé des différents types de chromatographie

Phase stationnaire

Principe de séparation

Caractéristiques de la phase stationnaire

Principe de la fixation et de l'élution >

Liquide Partage Lquide fixé sur un support inerte

(papier, silice...)

Dstribution des composants du mélange à séparer dans les deux

phases liquides selon leur coefficient de partage

Solide

Adsorption Adsorbant solide polaire

Phénomène de surface : formation de liaisons spécifiques entre les

composants et la surface adsorbante

Adsorption (phase

inverse)

Molécules hydrophobes greffées sur de la silice

Interactions hydrophobes et élution par diminution de la polarité de la

phase mobile

Echange d'ions

Résine (polymères d'oses) porteuse de groupements chargés

négativement ou positivement

Interactions électrostatiques avec les composants de charge opposée

Exclusion (filtration sur

gel) Solide poreux

Les composants de diamètre supérieur à celui des billes du

support sont "exclus" et ceux de diamètre inférieur y diffusent et

sont freinés

Affinité

Support sur lequel est greffée une molécule (le ligand) spécifiquement reconnue par un des composants de

l'échantillon à analyser

Déplacement de l'équilibre de liaison [molécule - ligand greffé]

en faveur de l'équilibre [molécule - tierce molécule]

4.1. Chromatographie d’adsorption (chromatographie liquide-solide).

La chromatographie d'adsorption sur colonne est une technique de fractionnement qui peut servir à l'analyse et à la préparation. La silice et l’alumine sont les phases stationnaires les plus utilisées. Le soluté et le solvant peuvent être attirés par les sites polaires situés à la surface de la phase stationnaire adsorbante.

La chromatographie d'adsorption est caractérisée par une phase stationnaire solide et une phase mobile liquide. C'est une méthode d'HPLC.

4.1.1. Principe : Cette chromatographie liquide-solide est basée sur la répartition des solutés entre l’adsorbant fixe et la phase liquide mobile. Chacun des solutés est soumis à une force de rétention (par adsorption) et à une force d’entraînement par la phase mobile. L’équilibre qui en résulte aboutit à une migration différentielle des solutés de l’échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation.

L’adsorption est un phénomène de surface par lequel des molécules se fixent sur la surface d’un adsorbant, selon divers processus plus ou moins intenses. Le phénomène inverse, par lequel les molécules

http://www.lachimie.fr/analytique/chromatographie/HPLC/HPLC.php


59

adsorbées sur une surface s’en détachent se nomment la désorption. Il existe différents types d’adsorption :

- L’adsorption physique ou physisorption met en jeu des liaisons faibles, du type forces de Van der Waals. Elle est en général réversible et un équilibre de partage s’établit entre la phase mobile et la phase fixe.

- L’adsorption chimique ou chimisorption met en jeu des liaisons fortes dont l’énergie est comparable à celle de formation des liaisons chimiques. Elle est souvent irréversible (formation de liaisons covalentes) ou difficilement réversible (formation de liaisons ioniques) et engendre une couche monomoléculaire.

L’absorption, par contre, est un phénomène de profondeur, par lequel une substance s’incorpore dans une autre substance.

4.1.2. Les adsorbants

Ce sont des solides très divisés (l’adsorption est un phénomène de surface), ainsi, 1 g d’alumine pour chromatographie peur représenter une surface de l’ordre de 100 m2. On peut distinguer : - Les adsorbants à faible capacité d’adsorption, comme le talc ou le carbonate de sodium. - Les adsorbants forts, comme le gel de silice, l’alumine ou le charbon actif. Certains adsorbants présentent une forte polarité électrique, comme le gel de silice ou l’alumine, alors que d’autres, comme le charbon actif ou les phases inverses ont une faible polarité.

Un adsorbant est une substance dont les atomes centraux (au cœur de la matière) sont soumis à des forces égales dans toutes les directions tandis que les atomes de surface sont assujettis à des forces qui ne s’équilibrent pas et peuvent attirer des molécules de la solution environnante pour établir l’équilibre. La phase stationnaire est généralement un gel de silice. Les gels de silices présentent en surface des groupements silanols Si-OH qui sont soit libres soit reliés entre eux par des liaisons hydrogènes, soit liés à des molécules d’eau par liaison hydrogène. Il existe aussi de ponts siloxane obtenus par chauffage léger (déshydratation) (comme des époxydes mais avec des atomes de Si à la place du C). Les gels de silices sont légèrement acides et donc bien adaptés aux produits basiques. Ils sont hydrophiles et polaires.

Si

O

Si

O

Si

O

O

O

H

H

H Groupements silanols Si-OH à la surface de la silice.

Séparation en chromatographie d’adsorption

http://www.lachimie.fr/analytique/chromatographie/HPLC/forces-adsorption.php


60

4.2 .Chromatographie de partage (La phase stationnaire et la phase mobile sont liquides) 4.2.1 Principe Elle est basée sur la différence de solubilité du soluté dans la phase mobile et la phase stationnaire.

Le soluté se distribue selon le coefficient de partage K = Cs/Cm avec Cs : la concentration du soluté dans la phase stationnaire et Cm : la concentration du soluté dans la phase mobile.

Pour séparer 2 constituants, il faut qu’ils aient des coefficients de partage différents. Dans les colonnes actuelles, la phase mobile est un liquide « fixé » par liaison covalente sur un support. Ce sont les colonnes greffées. Il y a 2 types de chromatographie de partage:

Chromatographie de partage sur phase normale

Chromatographie de partage sur phase inversée

Phase inverse Phase normale (classique)

Phase stationnaire

non-polaire Ex : silice greffée par une chaîne

alkyle ou phényle

polaire Ex : C2H4CN

C3H6NH2 C3H6N(CH3)2

diol

Phase mobile

Polaire : Ex. eau

méthanol acétonitrile

tétrahydrofuranne

non-polaire : Ex n-hexane

chloroforme éther

4.2.2 Chromatographie en phase normale En mode « normal »: phase stationnaire polaire et phase mobile apolaire, c’est le premier mode décrit Les groupements silanols du gel de silice sont greffés par des molécules organiques (liaisons covalentes). Ici les molécules organiques sont polaires. Les greffons sont possibles grâce à la grande réactivité des groupements silanols. On procède soit à

une éthérification : SiOH + ROH SiOR + H2O

ou à une silanisation :

Les principales greffes polaires sont :

1. alkylnitrile : – (CH2)n - CN 2. aminopropyle : – (CH2)3 – NH2

Le solvant est peu polaire

http://www.lachimie.fr/mecaniquequantique/liaison-chimique-covalente.php




61

4.2.3. Chromatographie de partage à polarité de phase inversée Environ 80% des séparations chromatographiques en phases liquides sont effectuées par partage sur des phases inversées La phase stationnaire est apolaire et nécessite donc un éluant polaire (AcCN, MeOH, THF, H20). Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier. C’est le mode le plus utilisé en chromatographie liquide La phase stationnaire est un liquide déposé ou greffé sur un support solide Ce sont des gels de silices comportant des greffons alkyles. Les plus utilisées sont les greffons à 8 et 18 atomes de carbone (colonnes C8 et C18).

De gauche à droite sont représentées : Une silice non greffée (phase normale), une silice greffée organosilanée de type C18 (phase inverse) et finalement, une silice greffée par une chaîne aliphatique de type C18 également (phase inverse). La rétention est basée sur le partage du soluté entre les deux phases liquides (solubilité relative) La Migration de trois composés en fonction de leur répartition entre les deux phases est représentée dans la figure suivante.

Séparation en chromatographie de partage La nature de la phase mobile éluante est le paramètre fondamental en chromatographie liquide à

haute performance, contrairement à la chromatographie gazeuse, les interactions entrant en jeu sont

diverses:

soluté phase stationnaire soluté phase mobile phase mobile phase stationnaire

4.3 Chromatographie d’échange d’ion 4.3.1. Les différents types d'échangeurs d'ions Les échangeurs d'ions sont des billes qui portent des groupements ionisables dont la charge est :

Positive : résines échangeuses d'anions qui fixent des molécules chargées négativement :

---R+...M-

Négative : résines échangeuses de cations qui fixent des molécules chargées positivement :

---R-...M+


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Nature de la fonction ionisable : ---R+ Nature de la fonction ionisable : ---R-

Base forte Base faible Acide fort Acide faible

ammonium quaternaire : ---NR3

+

exemple : triméthylammonium

---N(CH3)3+

forme protonnée d'une amine I, II ou III :

---NHR2+

exemple : diéthylaminoéthylammonium

exemple : sulfonate

---SO3-

exemple : carboxyméthyl

---O-CH2-CO2-

4.3.2. Principe. Dans un premier temps, la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que le groupement porté par l'échangeur d'ions soit ionisé :

dans le cas d'une base (échangeur d'anions), le pH doit être inférieur au pKa du groupement ionisable (exemple : le pKa du groupement diéthylaminoéthylammonium est 9,5)

dans le cas d'un acide (échangeur de cations), le pH doit être supérieur au pKa du groupement ionisable (exemple : le pKa du groupement carboxyméthyl est 4)

Les molécules à séparer sont dans le même tampon (donc au même pH) et en fonction de leur point isoélectrique (pI), elle porte une charge nette :

négative : le pI de l'albumine de sérum bovin est 4,9, cette protéine est chargée négativement à pH 7

nulle positive : le pI du cytochrome c est 10,7, cette protéine est chargée positivement à pH 7

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/TexteTD/1SV2H2/4TDapplications/2CORRIGE/4ExoBradford/1EXOn4.htm


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Voir un exemple de la variation de la charge nette d'une protéine en fonction du pH Il y a deux manières d'éluer les molécules fixées sur la résine :

En modifiant le pH de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont chargées ne le soient plus (ou qu'elles portent une charge de même signe que l'échangeur d'ions) ; il n'y a plus alors d'interaction électrostatique entre les molécules et le groupement chargé porté par la résine et les molécules sont éluées.

En ajoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion de même charge que les molécules fixées à la résine : cet ion s'appelle un contre - ion.

L’ordre d'efficacité croissant des contre - ions pour les résines échangeuses de cations est le suivant :

cations monovalents : Li+ < H+ < Na+ < NH4+

cations divalents : Cd2+ < Mn2

+ < Mg2+ < Zn2

+ < Cu2+ < Ca2

+ de plus, l'efficacité augmente avec la charge : K+ < Ca2

+ < Al3+

4.5 Chromatographie d’exclusion par taille ou filtration sur gel 4.5.1. Remarque préliminaire Le principe de la chromatographie d'exclusion (appelée aussi filtration sur gel ou tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation) repose en première approximation sur la masse molaire des molécules à séparer.

En toute rigueur, le paramètre physico-chimique qui intervient est la dimension des molécules, donc leur volume et donc plus précisément leur rayon de Stokes. Mais cette relation univoque [masse molaire - rayon de Stokes] n'est valable que pour des protéines dites "globulaires", c'est-à-dire assimilées à des sphères.

Différents paramètres influencent le volume des molécules et peuvent fausser la détermination de la masse molaire réelle par ce type de chromatographie :

la géométrie : pour une même masse molaire, une protéine "allongée" (exemple, la calmoduline) n'aura pas les mêmes dimensions qu'une protéine globulaire.

les modifications post-traductionnelles : par exemple, les longues chaînes d'oses modifient fortement la géométrie des protéines glycosylées et les rend plus denses ; à l'inverse, les lipoprotéines sont "allégées" par la présence de lipides.

la présence de sels, d'agents chaotropiques, de détergents ...

4.5.2. Principe. La phase stationnaire est constituée de billes de polysaccharides (type "Sephadex™" ou "Sepharose™") gonflées dans le solvant utilisé pour l'élution : Le volume des billes est très finement calibré, ainsi les molécules dont le volume est supérieur à celui des billes ne peuvent y pénétrer et sont éluées rapidement. En revanche, les molécules dont le volume est inférieur à celui des billes y pénètrent et y subissent des frottements qui les retardent. Schéma illustrant le principe de la chromatographie d’exclusion : Les plus petites molécules peuvent pénétrer dans de nombreux pores, se répartissant entre le gel et la phase mobile, ce qui rend leur trajet plus lent à parcourir et les fait éluer en dernier. Les molécules de taille moyenne peuvent pénétrer seulement dans quelques pores, la répartition entre le gel et la phase

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/1ECHANGEions/1CHARGEpI/1CharNETpI.htm

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/5Signalisation/2Calmoduline/1Calmodulin.htm

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/2ModifPOSTtraduc/1ModPostTrad.htm

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/2ModifPOSTtraduc/8Glycosylation/1Glycosylation.htm

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/3SEPHADEX/1GelSephadex.htm

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/2Sepharose/11Sepharose.htm


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mobile est plus rapide que pour les petites molécules, le trajet parcouru est moins long et elles sont éluées plus rapidement. Finalement, les grosses molécules ne peuvent pénétrer dans les pores du gel (elles sont exclues), il n’y a donc pas de répartition entre la phase mobile et le gel, leur trajet est donc réduit au minimum et elles sont éluées en premier. En conclusion, si l'on connait la masse molaire de la molécule que l'on veut séparer d'un mélange par cette technique, il faut choisir le gel le mieux adapté : c'est celui dont le domaine de fractionnement, c'est-à-dire la gamme des masses molaires pour lesquelles il y a diffusion partielle ou totale, englobe la masse molaire de la molécule à purifier (voir un exemple). Cette technique permet la séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme.

4.5.3. Détermination de la masse molaire d'une molécule. Un mélange de molécules que l'on appelle standards, de masses molaires connues, est séparé par chromatographie de filtration sur gel (voir un exemple de séparation) :

chaque molécule est éluée avec un volume d'élution Ve. par ailleurs, le volume d'exclusion du gel (V0) est le volume d'élution d'une molécule non

retardée par le gel, c'est-à-dire une molécule de taille supérieure à celle des billes et qui n'y diffuse pas. Bien souvent, on utilise lebleu dextran, polymère d'ose de masse molaire supérieure à 2 106 Da.

enfin, le volume total du gel (Vt) est la somme du volume des billes et du volume externe aux billes : il est donné par le volume d'élution d'une molécule qui diffuse totalement dans les billes et qui est donc totalement retardée.

On définit le coefficient de partition :

on trace la droite étalon : log (masse molaire) = f (KD) (ou masse molaire = f (KD) sur une échelle semi-logarithmique)

on détermine le volume d'élution d'une molécule X dans les mêmes conditions de chromatographie que pour le mélange des standards

on reporte le KD de la molécule X sur la partie linéaire de la droite étalon et ainsi on détermine sa masse molaire.

Ve -V0 KD =-------- Vt - V0

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/2GuideSELECGelFilt/11GUIDEselect.htm

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/1GamETALON/11GAMetalon.htm

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/1GamETALON/11GAMetalon.htm


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4.5.4. Théorie de la chromatographie d’exclusion On considère une colonne de volume totale Vt remplie d’un gel solvaté : Vt= VO+ Vi+Vg, où VO est le volume mort, c'est-à-dire le volume d’eau externe aux granules, Vi est le volume d’eau interne aux granules et Vg est le volume du gel. Un soluté est distribué entre l’eau interne et l’eau externe selon un coefficient de distribution (de partage) : K. - Si K = 0, le soluté est totalement exclus. - Si 0 < K < 1, le soluté est partiellement inclus. Le taux d’inclusion augmente avec K. - Si K = 1, le soluté est totalement inclus dans le gel. - Si K > 1, le soluté est non seulement inclus, mais aussi adsorbé par le gel. Si on dépose un mélange de deux solutés A et B, dont les constantes de distribution sont respectivement égales à 0 et à 1, A sera élué avec un volume d’élution Ve(A) = Vm et B sera élué avec un volume d’élution Ve(B) = Vm+ Vi= V*. L’expression qui relie le volume d’élution d’un soluté à son coefficient de distribution est : Ve= Vm+ K.Vi Avec la constante K égale à Concentration du soluté dans l’eau interne / Concentration du soluté dans l’eau externe.

Graphique du log de la masse moléculaire en fonction du volume élué :

Les grosses molécules, totalement exclues sont toutes éluées les premières, au niveau du volume mort. Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement et finalement, les petites molécules, totalement incluses, sont éluées en même temps au niveau du volume V. Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc toutes éluées les premières, au niveau du volume mort (Vm ou V0). Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est gênée. Une molécule totalement incluse sera éluée incluse sera éluée avec un volume V* = Vm+ Vi, où Vi est le volume d’eau interne aux granules de gel. Les solutés sont donc élués dans l’ordre inverse des masses moléculaires. D'une façon plus générale : -Les molécules de taille supérieure à celle des pores des billes de Sephadex sont totalement exclues du gel et ne se répartissent que dans le volume extérieur aux billes, c'est-à-dire dans la phase mobile (éluant). Elles sortent les premières, à un volume d'élution Vo appelé volume mort de la colonne. -Les molécules de taille inférieure à celle des pores des billes de Sephadex peuvent pénétrer librement dans les billes et se répartissent dans l'ensemble des liquides de la colonne (volume de liquide à l'intérieur des billes ou phase stationnaire + volume de liquide à l'extérieur des billes ou phase mobile). Elles sortent donc les dernières, à un volume d'élution Vt ou volume total des liquides de la colonne. -Les molécules de taille intermédiaire pénètrent un peu dans les billes, en fonction de leur taille et de leur forme; elles pénètrent d'autant moins qu'elles sont plus grosses, et elles sont éluées dans l'ordre des masses molaires décroissantes.


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1 : Les molécules de masse molaire faible sortent toutes à Vt. 3 : Les molécules de masse molaire élevée sortent toutes à Vo. 2 : Les molécules de masse molaire intermédiaire sortent à des Ve intermédiaires et sont effectivement séparées. 4.5.5. Applications de la chromatographie d'exclusion : Cette technique est très utilisée pour la séparation ou l'élimination de sels ou de petites molécules dans les solutions protéiques : dessalage, échange de tampons ... -cette technique est également appliquée au fractionnement de mélanges de macromolécules et à la

détermination (approximative) de la masse molaire des protéines. dans ce dernier cas, il faut d'abord étalonner la colonne avec des protéines de masse molaire

connue, tracer la courbe ve = f(logm), puis effectuer une détermination graphique. 4.6. Chromatographie d'affinité 4.6.1. Principe et applications Ce mode de chromatographie connaît depuis 1970 un développement sans précédent et est appelé à prendre une place encore plus grande avec l'essor des biotechnologies. Le principe consiste à utiliser une phase stationnaire constituée d'un support (silice, polymère) sur lequel on a greffé une molécule organique particulière qui présente une affinité sélective pour certains constituants d'un mélange dont on cherche à les isoler. Ceux-ci vont être sélectivement adsorbés ou tout au moins retenus sur la colonne, tandis que les autres composants sont très rapidement élués.


67

Un changement de la phase mobile (pH, force ionique ou ajout d'un compétiteur) permet ensuite d'éluer les substances intéressantes, avec un facteur de purification pouvant atteindre 1000. La chromatographie d'affinité s'utilise avec des colonnes basse pression ou des supports à haute performance . C'est le type de chromatographie le plus sélectif, une protéine pouvant être purifiée d'un facteur 103 à 104 en une seule fois. Le principe de la chromatographie d'affinité repose sur la reconnaissance entre une molécule du mélange à séparer et une molécule greffée sur la résine, que l'on appelle le ligand, ces deux molécules interagissant de manière hautement spécifique :

l'adsorption de la molécule à séparer sur le ligand fixé à la résine est effectuée dans des conditions physico-chimiques (pH, force ionique, concentration de la molécule à adsorber...) favorables à la liaison molécule - ligand.

dans ces conditions, les molécules du mélange à séparer qui n'ont pas (ou peu) d'affinité pour le ligand sont éluées au fur et à mesure qu'on le fait passer sur la résine.

on désorbe ensuite les molécules spécifiquement fixées au ligand en modifiant les conditions physico-chimiques de telle sorte que la liaison molécule - ligand soit rompue : le plus souvent, on ajoute une tierce molécule qui entre en compétition avec le ligand greffé pour la molécule à séparer. En d'autres termes, on déplace l'équilibre de liaison molécule - [ligand greffé] en faveur de l'équilibre molécule - [tierce molécule].

Cette tierce molécule peut-être : le ligand greffé lui-même (sous forme libre) à une concentration plus élevée que celle du ligand

greffé une molécule dont la structure est analogue à celle du ligand greffé mais pour laquelle la

molécule a plus d'affinité L'une des principales applications de la chromatographie d'affinité est l'isolement de protéines ou d'acides nucléiques dont voici quelques exemples :


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Ligand Exemples de molécules isolées

protéine A (recombinante) : protéine de Staphylococcus aureus à haute affinité pour le fragment Fc des anticorps de type IgG ;

protéine G (recombinante) : protéine de surface des streptocoques du groupe G, récepteur de type III du fragment Fcdes anticorps de type IgG.

IgG de mammifères exonucléases

concanavaline A (les lectines en général) : protéines qui se fixent sur des résidus spécifiques de la partie osidique des glycoprotéines et qui ont des propriétés agglutinantes (exemple : érythrocytes).

fixation sur des résidus α-D-

mannopyranosyl ou α-D-glucopyranosyl terminaux desglycoprotéines

ADN natif ou dénaturé de thymus de veau polymerases (ADN, ARN) exonucléases

lysine plasminogène ARN ribosomal

iminodiacétate : chélateur de métaux boronate

métalloprotéines protéines à groupements cis-

diol

colorants de l'industrie textile (exemple : bleu de procion ou "Cibacron blue®") : les enzymes qui fixent les mono- ou dinucléotides puriques interagissent avec les cycles portés par les colorants dont la structure est très proche de celle duNAD+.

voir l'exemple du "Bleu A™"

déshydrogénases à NAD(P)+ kinases dépendantes de l'ATP

poly(U) (acide polyuridylique)

ARN messagers par hybridation à leur queue poly(A)

protéines se liant au poly (U) (interféron, transcriptase inverse)

4.6.2. Structure de gels d'affinité Activation du gel pour le couplage du ligand - Bras espaceurs Les supports ou matrices utilisés pour la chromatographie d'affinité peuvent être des billes d'agarose ("Sepharose™", Pharmacia®), de polyacrylamide d'agarose, de verre poreux, de polyvinyle, de polyméthacrylate ... L'immobilisation du ligand sur la matrice nécessite qu'il soit préalablement activé, c'est-à-dire qu'il faut créer des sites réactionnels qui permettent d'établir des liaisons covalentes. Parmi les diverses méthodes d'activation, on peut citer :

l'activation des groupes hydroxyles du support (l'agarose par exemple) par le bromure de cyanogène dans une solution dont le pH est finement contrôlé (pH 8,3). Des groupements

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/1SyntheseProteines/1SyntheseProt.htm

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/1VELATPOxRedNAD/2OxRedNAD.htm/222OxydoRedNAD.htm

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/1AffinCOLORANT/11AFFcolor.htm

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/2Deshydrogenase/3RelSFGluDH.htm

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/2ModifPOSTtraduc/4Phosphorylation/1PhosPhoRylation.htm

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/1SyntheseProteines/1SyntheseProt.htm

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/2Sepharose/11Sepharose.htm

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/3ActivCouplage/11ActivCOUP.htm




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imidocarbonates sont formés sur lesquels on peut fixer des ligands contenant des amines libres, par exemple une protéine par la chaîne latérale de ces lysines. Les groupes hydroxyles qui n'ont pas réagit sont bloqués par action de l'éthanolamine ou la glycine.

les groupes hydroxyles du support peuvent être activés par le carbonyl di-imidazole. l'activation du support peut être faite avec le gtutaraldéhyde qui se polymérise et forme des

chaînes à 5 carbones qui constituent des points de fixation à une certaine distance de la matrice.

une autre méthode d'activation utilise le chlorure de tosyle et elle permet le couplage de molécules qui possèdent un groupement aminé, thiol ou phénol.

Pour rendre certains ligands accessibles au site de fixation sur la molécule avec laquelle ils interagissent, il est nécessaire d'augmenter la longueur de la chaîne carbonée à l'extrémité de laquelle se situe le groupement activé. Cette chaîne additive s'appelle un bras espaceur.

La chromatographie d'affinité est la méthode la plus sélective. Cependant, c'est aussi la plus délicate à mettre en oeuvre car elle nécessite la mise au point des conditions expérimentales idoines pour obtenir un gel correctement activé :

le ligand doit être orienté de manière optimale pour une parfaite reconnaissance stéréochimique de la molécule que l'on veut séparer

il ne faut pas que le ligand subisse l'action des enzymes, c'est pour celà qu'on utilise davantage des analogues de substrats (inhibiteurs compétitifs par exemple) que les substrats eux-mêmes

il faut trouver des conditions d'élution de la molécule fixée au ligand qui préserve sa fonction biologique.

en conséquence, cette méthode chromatographique est coûteuse

4.7. La chromatographie par formation de paires d'ions (IPC Ion-Pair Chromatography) On appelle paire d'ions une entité formée par l'association de deux ions de charge opposée. La paire d'ions a donc une charge nette nulle et peut dans ce cas présenter des propriétés ± hydrophobes qui permettent de l'analyser par sur une colonne de chromatographie en phase inverse. Pour arriver à cette utilisation, on emploie des phases mobiles qui contiennent un détergent anionique ou cationique. Ces détergents sont des molécules ionisées qui comportent par ailleurs des chaînes carbonées hydrophobes (ex tétrabutylammonium, laurylsulfonate,…) et forment avec les composés à séparer des paires d'ions hydrophobes. On peut dans ce mode chromatographique jouer sur un très grand nombre de paramètres : Nature et concentration du détergent - pH et force ionique du tampon - température - modifiant organique (alcool, acétonitrile,…) De tels systèmes s'avèrent plus performants (N) que les systèmes d'échange d'ions et ont des capacités plus grandes (= ils permettent d'injecter de plus grandes quantités d'échantillon sur une colonne de même dimension). La CPI a été développée pour permettre la séparation de mélanges complexes d'acides, de bases et de substances neutres qui, bien souvent, ne sont pas bien séparés par la chromatographie par échanges d'ions. On utilise ici comme phase stationnaire les matériaux de remplissage utilisés pour la chromatographie en phase inverse. On ajoute à la phase mobile une substance organique ionique, formant un sel avec un composant de charge contraire de l'échantillon. Ce sel se comporte alors comme

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/4Espaceurs/11BRASespac.htm

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/3CoursINHIBITEURS/1CoursInhibition.htm


70

une molécule organique non-ionique et est séparé par chromatographie en phase inverse. Les molécules organiques ioniques, encore appelées contre-ions, utilisées en IPC sont :

Soit des cations (ammoniums quaternaires et amines protonées)

Soit des anions (alkylsulfonates, arylsulfonates, alkylsulfates ou anions inorganiques).

Les tableaux suivants rassemblent les principaux contre-ions utilisés. Cations :

Anions :


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5. Facteurs dont dépend la séparation en CLC: Quatre facteurs interviennent: Adsorbant: l'alumine ou le gel de silice La granulométrie de l'adsorbant doit être supérieure à

celle des adsorbants utilisés en CCM. Leur taille est habituellement comprise entre 50 et 200 µm. La quantité d'adsorbant dépend de la difficulté de la séparation de la masse d'échantillon.

On peut considérer que pour chaque gramme d'échantillon, il faut 30 à 50 g d'adsorbant si la polarité des composants à séparer est très différente et jusqu'à 200 g si la séparation est difficile. Eluant: L'éluant est en général un mélange de deux solvants. Au début de l'élution, on commence

par le solvant le moins polaire qui entraîne les substances les moins retenues par l'adsorbant (les moins polaires). Ensuite on fait varier la composition de l'éluant en additionnant graduellement le solvant le plus polaire. Ainsi les composés les plus polaires, retenus sur l'adsorbant, ne migreront que graduellement vers le bas de la colonne.

Dimension de la colonne : Les colonnes spécialement conçues pour cet usage ont à leur base

une plaque de verre fritté ou de porcelaine qui permet l'écoulement libre de l'éluant tout en empêchant

le passage de l'adsorbant. On peut aussi utiliser une burette, au fond de laquelle on place un tampon de

laine de verre et du sable. La quantité d'adsorbant est telle qu'il occupe une hauteur égale à environ 10

fois le diamètre de la colonne. Il faut également prévoir un espace de 10 cm environ au-dessus de

l'adsorbant pour placer le solvant

Vitesse d’élution: Elle doit être la plus constante possible. Il faut qu'elle soit suffisamment lente pour que le soluté soit au plus près de l'équilibre entre les phases liquide et adsorbée. Elle ne doit pas être trop lente car sinon les substances diffusent dans le solvant et on obtient des bandes de plus en plus larges et une séparation médiocre. 6. Remplissage de la colonne : 6.1. Remplissage par voie humide:

6.2. Remplissage par voie sèche : La colonne est remplie au deux tiers par le moins polaire des deux solvants et l'adsorbant en poudre est

ajouté en portions successives dans la colonne à l'aide d'un entonnoir ; pendant l'addition, on frappe

continuellement sur les parois pour obtenir un tassement maximal. Quand la première portion forme

une couche d'environ 2 cm, on ouvre le robinet pour faire couler lentement le solvant. On termine

comme précédemment.

On prépare dans un bécher un mélange homogène de l'adsorbant et du moins polaire des solvants utilisé pour le développement en ajoutant par petites quantités l'adsorbant dans le solvant pour obtenir une bouillie suffisamment fluide pour couler facilement. A l'aide d'un entonnoir, on verse suffisamment de bouillie pour que l'adsorbant qui se dépose progressivement forme une couche d'environ 2 cm. On tapote les parois de la colonne pour favoriser le tassement de l'adsorbant. On ouvre alors le robinet pour que le solvant s'écoule lentement et on poursuit l'addition de la bouillie par portions successives. Quand tout l'adsorbant est introduit, on laisse décanter jusqu'à ce que le liquide qui surnage soit limpide. Pendant l'opération, on veillera à ce que le niveau de solvant soit toujours supérieur à celui de l'adsorbant.


72

Partie II Chromatographie en phase liquide à haute

performance « HPLC ».

1. Généralités Avant 1970 « CLC »

Diffusion très lente 104 + faible qu’en CPG

Liquide 100 fois plus visqueux que gaz

Lenteur des séparations « 1mm/s »

Colonnes peu efficaces

Absence de détecteurs « collection des fractions »

Avec l’HPLC

Nouveaux types de s « granulométrie fine et homogène

Pompes à haute pression pour débiter la M

uM : passe de 1mm/s à 1cm/s

Séparation en continu et non par fraction

Utilisation de détecteurs

En Conclusion :

HPLC = Chromatographie en phase liquide à haute résolution, à haute pression, à grande vitesse, et

enfin ; à haute performance.

On a vu que l'efficacité de séparation « », ou la résolution « R », en chromatographie liquide

augmente, lorsque la taille des particules de phase stationnaire diminue : C’est la chromatographie

liquide «haute pression» ou «haute performance».

2. Les composantes de base d'un système HPLC.


73

2.1. Réservoirs de solvants Flacon étanche (1 à 2L)

Contenant en verre ou acier inoxydable - un ou plusieurs contenants du solvant pur ou un mélange spécifique - Volume 500 ml - Dégazage: enlever les gaz dissous qui peuvent former des bulles et interférer dans la séparation et la détection

o barbotage d’un gaz inerte (He, N2) o pompage sous vide o distillation o chauffage o agitation o bain ultrason

Différents modes :

mode isocratique = M de composition constante au cours l’analyse (analyse possible avec 1 seul réservoir)

mode programmation de solvant (+ complexe) = gradient de polarité (nécessite plusieurs réservoirs)


74

NB : les appareils pouvant travaillés en programmation de solvant peuvent travailler en isocratique mais ce n’est pas réciproque 2.2. Dispositif de pompage

o Obtention de hautes pressions (5000 psi) o rendement (débit demandé = débit délivré) o constance et reproductibilité (0,5%)

o absence de pulsation (↓bruit de fond) o gamme de débits entre 0,1 et 10 ml/min o chambre de mélange efficace et de faible volume o résistance à la corrosion et aux solvants organiques o Débits utilisés : 0,1-2 mL.min-1

Perte de charge (∆P) dans une colonne (back pressure) – La pression nécessaire pour qu’une phase mobile traverse une colonne chromatographique – En première approximation pour des particules sphériques et pour un écoulement laminaire:

–Donc ∆P augmente lorsque dp diminue; lorsque η augmente; lorsque L augmente. – La perte de charge est plus importante en chromatographie liquide qu’en chromatographie gazeuse

(ηd’un liquide >> ηd’un gaz)

η= viscosité de l’éluant L = longueur de la colonne

ε= porosité (~ 0,4 pour une sphère) dp = grosseur des particules (généralement de 3 à 10 µm).

Unités de pression et (conversion)


75

Utilisation de pompes alternative : faible volume interne et utilisable avec des gradients d’élution

La pompe permet de travailler: en mode isocratique, c'est-à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de l'analyse.

en mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des constituants du mélange d'éluants.

Les pompes actuelles ont un débit variable de quelques ml à plusieurs ml/min.

Fonctionne / piston alternatif (svt à pls pistons). Assure un débit cst

Appareil à gradient de polarité :

Système de vannes EM proportionnelles qui permet les mélanges des solvants en amont d’une pompe unique (ces vannes s’ouvrent en tps proportionnel) Qualités : o -pas de pulsation o -résiste à la corrosion o -débit constant Pompe pneumatique directe

Une pression élevée est exercée sur le solvant directement par un gaz sous haute pression, le gaz est obtenu à partir d’un cylindre à travers un régulateur à haute pression.

o application d’une pression au dessus d’un réservoir de solvant o aucune production de pulsation o volume du réservoir limité o système peu dispendieux o problème de solubilisation du gaz de pressurisation o

Pompe à seringue commandée ((pompe alternative) Le piston de la seringue est commandé par un moteur qui permet de contrôler son mouvement, il n’y a pas de pulsations de la pression, le réducteur permet d’obtenir des débits très faibles mais précis le volume du réservoir est limité.

o application d’une pression mécanique au dessus du solvant o aucune production de pulsation o volume du réservoir limité o système peu dispendieux o problème de déformation de la chambre de pompage.


76

Pompe à piston C’est l’un des systèmes de pompage les plus utilisés en C.L.H.P, le volume de solvant illimité, le système plus cher que les autres, la pression obtenue élevée mais fluctuante (débit pulsé), le fonctionnement nécessite deux phases: « aspiration et refoulement ». Ce type de pompe facilite le gradient d’élution et la régulation aisée du débit. Application d’une pression mécanique au dessus du solvant - production de pulsation (piston alternatif) - réservoir indépendant - système dispendieux.

Pompes réciproques en tandem

•mélange de solvant : élution par gradient de solvant (analogie avec programmation. de T en GC) •amortissement des pulsations

2.3. Dispositif d’injection Injection manuelle ou automatique avec un passeur d’échantillon P° élevée en tête de colonne donc impossible d’injecter à la seringue comme en CPG

Système d’injection particulier Injecteur à boucle : Vanne à boucle d’échantillonnage, commandé manuellement Vol : 1 à 100µl Assure des injections très répétables Ces boucles ont des volumes variables

La boucle peut être mise en communication par des vannes avec le réservoir de ϕm et la colonne Remplissage de la boucle à P° atm


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Le trop plein est rejeté vers l’ext

Pdt cette étape, la ϕm circule en permanence sur la colonne.

Puis injection du contenu de la boucle en tournant la vanne d’injection, la ϕm est mise-en communication avec la boucle et la colonne

On dépose l’échantillon en tête de colonne.

ΔP en HPLC est de l’ordre de quelques dizaines à 100-250 bars.

La vanne d’injection à boucle d’échantillonnage constitue le système d’injection le plus utilisé en

HPLC, la boucle d’échantillonnage a un volume limité généralement de quelques µl: 10, 20, 50,

100…).

2.4. Colonnes 2.4.1 Colonne de garde - petite colonne placé entre l’injecteur et la colonne de séparation - contient le même remplissage que la colonne analytique - permet de prévenir l’adsorption irréversible de contaminant sur la colonne provenant de l’échantillon ou du solvant - prolonge la durée de vie de la colonne.


78

2.4.2 Colonne analytique.

Acier inoxydable (résistance à P~350 atm) – Diamètre des particules : 3 à 10 µm • support granuleux • silice et alumine les plus communs – poreux, pores de 70 à 300 Å – porosité superficielle – non poreux • Aire : 50 à 250 m2/g Le tube est généralement en acier inoxydable, on utilise aussi le verre recouvert extérieurement par l’acier, les dimensions sont généralement: longueur: 5 à 30cm, et diamètre intérieur: 3 à 5mm, (auj

,∃en a de 2 mm) et diamètre des particules dp = 3 à 10 µm, l’efficacité est de l’ordre de N = 40000 à 60000 plateaux/m. On utilise aussi des micros colonnes avec L = 3 à 7,5 cm, dp = 3 à 5 µm On limite ainsi la consommation de solvants. Quelque fois, on place en amont une colonne de garde =petite colonne courte (1 à 2 cm) remplit avec

la même ϕs que la colonne analytique

Phases greffées +++

Formées par formation de liaisons covalentes entre les gpt silanols de la silice et des molécules organiques de nature variées

Le plus courant = diméthylchlorosilane

Les caractères de la PS greffée sont déterminés par la nature du gt gréffé

Mais 50 des silanols ne seront pas greffées (encombrement stérique) Pics dyssymétrique

Bonne efficacité, mais utilisable qu’entre pH 2 et 8

Constituée de grains de 3 à 10µm de ∅ de nature poreuse

Cette ϕs dépend des séparations à réaliser -silice greffée de gpmts polaires ou apolaires, échangeur d’ion ou gel -zirconium (moins bonne efficacité mais utilisable entre pH 1 et 12)

Cette ϕs est retenue dans colonne par des disques poreux (frittés) aux 2 extrémités de la colonne.


79

On place souvent des pré-colonnes qui font office de filtres ; elles ont un dp supérieur et protègent la colonne des impuretés. Limitations de la silice

Si pH >2 (hydrolyse Si-O-Si-R) Si pH<8 (dissolution) –Tampon • phosphate (inorganique) vs Tris (organique) •Molarité – Température

⇒Solution : supports polymériques (PS-DVB).

Modification des groupes silanols

Par réactions de greffons : réaction de silanisation et obtention de phases stationnaires liquides (CLL mode partage).

Les principales phases stationnaires (mode partage) mode normal:

amino: -NH2

cyano: -CN

diol: -CHOH-CH2-OH


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mode inverse:

C2 (ou RP-2): -Si-CH2-CH3

C8 (ou RP-8): -Si-(CH2)7-CH3

C18 (ou RP-18): -Si-(CH2)17-CH3 (Plus la chaîne carbonée est longue, plus la phase est apolaire et la rétention importante)

Phase stationnaire « Polaire » non greffée

S contenant des fonctions nitriles S contenant des fonctions amines

Facteurs affectant la chromatographie en phase inverse. o Phase stationnaire. o Type de ligand. o Composition de la phase mobile. o Diamètre des pores. o Taille des particules. o Dimension de la colonne. o Température. o Additifs. Silices greffées commerciales

(a) : silices apolaires (alkyle)

• Longueur des Chaînes hydrocarbonnées

Nom Fonction greffée dp(µm)

Micropack CH Octadécyle 10


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Longues

Nucléosil C18 Octadécyle 5,10

µ Bondapak C18 Octadécyle 10

Longues Lichrosorb RP 18 Octadécyle 5, 10

Longues Ultrasphère-ODS Octadécyle 5

Longues Zorbax ODS Octadécyle 6_8

Intermédiaires

Nucléosil C8 Octyle 5, 10

Lichrosorb RP8 Octyle 5, 10

µ Bondapak phényl Phényle 10

R-SIL C8 Octyle 5, 10

Zorbax C8 Octyle 6-8

Courtes

Lichrosorb RP2 Diméthyle 5, 10

R-SIL-C3

R-SIL-C3Cl

Propyle

Propyle

5, 10

5, 10

(b) : silices polaires

Polarité Nom Fonction greffée dp(µm)

Faible Nucélosil NMe2 Diméthylamino 5, 10

Lichrosorb DIOL Dialcool 10

Nucléosil-NO2 Nitro 5, 10

Moyenne

µ Bondapak CN Nitrile 10

R-SIL-CN Nitrile 5, 10

Forte Zorbax-CN Nitrile 6-8

Forte Lichrosorb NH2 Amino 10

µ Bondapak NH2 Amino 10

R-SIL-NH2 Amino 5, 10

Zorbax-NH2 Amino 6-8

Influence de la taille des particules sur N Avantage : N ↑ Inconvénient : ∆P ↑


82

Influence de la porosité des particules


83

Capacité de la colonne.

3. Choix du mode en chromatographie liquide Règle générale:

si le soluté est insoluble dans l’eau ou apolaire:

Utiliser le mode normal

si le soluté est soluble dans l’eau ou non soluble mais polaire:

Utiliser le mode inverse


84

4. Choix de la phase mobile en C.L.H.P.:

Caractéristiques: • Mélange eau/solvant organique ou solvant/solvant en proportions variables. Acétonitrile, méthanol, éthanol, hexane, dichlorométhane, acétate d’éthyle, chloroforme, isopropanol sont les plus communs – acétonitrile: couramment utilisé pour la séparation de peptide

– isopropanol: séparation de protéines hydrophobes et ↑MM – éthanol: séparation de protéines hydrophobe •Propriétés recherchées: •Pureté • Solubilisation des échantillons • Compatibilité avec le détecteur

• Faible viscosité (η↓) • T ébullition pas trop basse • Inerte chimiquement •Prix abordable • Force éluotropique (polarité) Il est rare de trouver une phase mobile adéquate constituée par un « solvant pur », généralement, l’obtention d’une bonne séparation nécessite de recourir à un mélange d’au moins deux solvants Solvants les plus courants en mode inverse:

méthanol: caractère acide.

acétonitrile: caractère basique.

tétrahydrofuranne: caractère polaire.

eau : permet d’ajuster la polarité du milieu. L'utilisation de solvants en HPLC implique le respect de quelques règles essentielles :

utilisation de solvants spécifiques pour l'HPLC

utilisation d'eau déminéralisée exempte de toute trace de matière organique

filtration nécessaire des solvants sur filtres spéciaux (0,4 à 0,5 µm)

dégazage des solvants après filtration


85

Viscosité et mélange de solvants

-La viscosité des mélanges eau-alcool augmente de manière significative jusqu’à une proportion 1:1 - le choix d’un mélange de solvant doit être effectué en connaissance de cause.

5. Force éluante de la phase mobile

Le choix du solvant en LC est critique car il contrôle la sélectivité et la durée d’une séparation. Les

contraintes pratiques sont:

– Solubilité des analytes

– Force éluante (εo): capacité d’un solvant à désorber les molécules d’analyte de la phase stationnaire.

C’est une fonction de la polarité du solvant par rapport à la polarité de la phase tationnaire.

• Les solvants sont classés par ordre de force éluante pour faciliter leur choix afin de contrôler le

facteur de capacité (k’) des analytes.

Résolution maximale lorsque 2 < k’ < 5.

• Plus la force éluante est élevé, plus k’ ↓

• En chromatographie sur phase stationnaire polaire (NPLCet CLS) :

– Force éluante augmente quand la polarité de l’éluant augmente

• En chromatographie sur phase stationnaire non polaire (RPLC) :

– Force éluante augmente quand la polarité de l’éluant diminue.


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Force éluotropique.

Solvant (phases inversées)

Facteur de Pondération (s)

Eau Méthanol

Acétonitrile Tétrahydrofuranne

0 2,6 3,2 4,5

Indice de polarité Snyder (P’)

L’indice de Snyder (P’) est proportionnel à la Force éluante (εo.)

ST = si x

ST : Force éluante

si : Facteur de pondération

: Fraction volumique du solvant considéré


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Relation entre indice de polarité et facteur de capacité (P ’ et k’).

- non-linéaire

Force éluante requise pour désorber des familles de composés en CLS

6. Les détecteurs en chromatographie liquide Les détecteurs en C.L.H.P. Le détecteur en chromatographie liquide doit satisfaire certains critères: Doit fournir une réponse qui reflète en continu les variations de compo de l’éluat à la sortie Choix en fct° des composés à analyser

Qualités requises :


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linéaire = réponses proportionnelles à la conc à chaque instant

sensible

réponse rapide, reproductible, et stable ds le tps

peu de bruit de fond (variation aléatoire de la ligne de base)

limite de détection faible compatible vec les résultats attendus

Volume mort le plus réduit possible.

6.1. Caractère universel ou spécifique? o détecteur universel: o intéressant dans le cas de mélanges inconnus o est basé sur la mesure d’une propriété « globale » de l’effluent chromatographique (indice de

réfraction, constante diélectrique…) o détecteur spécifique: o avantageux pour doser des traces de produits « visibles » parmi d’autres produits non détectés o utilise les propriétés physico-chimiques particulières des solutés (absorption lumineuse,

fluorescence, électrochimie…) 6.2. Caractéristiques des détecteurs

• domaine de linéarité:

• La plupart des détecteurs sont sensibles à la concentration, la relation réponse/concentration est linéaire dans un domaine de concentration

• sensibilité:

• Définie comme étant la concentration de soluté donnant une réponse égale au double du bruit de fond. Elle est appelée aussi détectabilité ou seuil de détection


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• Influence du débit et de la concentration:

• Le détecteur doit être aussi peu sensible que possible à ces deux facteurs. Cette sensibilité est très variable d’un détecteur à l’autre

• Détecteur par absorptiométrie UV-visible : détecteur le plus couramment utilisé en C.L.H.P.

• Bonne transparence d’un grand nombre

• Plusieurs modèles disponibles: longueur d’onde fixe (généralement 254nm) multi-longueurs d’onde (utilisation de filtres interférentiels) longueur d’onde variable en continu (190 à 700nm) détecteur à barrette de diodes

6.3. Spectrophotométrie UV-visible Le + courant pour les composés qui absorbent dans UV-visible (doubles liaisons)

soit directement (si groupement chromophore)

soit après dérivation

soit pré colonne

soit post colonne

on mesure l’absorbance à 1 ou plusieurs λ

La ϕm ne doit pas absorber à cette λ

Ces détecteurs peuvent être utilisés en gradient d’élution a-1. Détecteur monochromatique (spectrophotométrie)

source UV-visible →système monochromateur (λ max)→ L=trajet optique de la cuve (c* à µ

circulation)=ϕm →détecteur (photomultiplicateur ou photodiode)

permet analyse quantitative →chromatogramme à λ choisie

ne permet pas de tracé spectre instantanément, tracé point à point : λ1→Aire 1, λ2→aire 2...

Le spectre enregistré est celui ds la ϕl

càd identique à celui pris en dissolvant l’ech ds ϕm


90

a-2. Détection polychromatique (détecteur à barrette de diodes) Il mesure l'absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne. Et opère à longueur d'onde constante, celle-ci ayant été fixée par l'opérateur. La lampe Deuterium est utilisée pour des longueurs d'ondes variant de 190-350 nm et la lampe à vapeur de mercure est utilisée à la longueur d'onde non variable de 254 nm. Pour que ce type de détecteur soit utilisable, il faut que : Le produit à détecter absorbe la lumière à une longueur d'onde accessible à l'appareil, et que son coefficient d'absorption ne soit suffisamment grand La phase mobile n'absorbe pas la lumière à la longueur d'onde choisie par l'opérateur.

Permet enregistrer les signaux à ttes les λ instantanément

source polychromatique traverse c* de mesure en permanence absorbe +/- en fct° des propriétés

à la sortie, ∃ réseau (polychromatique ) qui disperse les λ

l’intensité à chaque λ est enregistrée sur une barrette de diode

chaque diode enregistre ds un petit domaine de λ

→info en 3D

A en fct° du tps et en fct° de λ

A=f(T) →spectre du composé au tps T (qualitative)

A=f(t) à λ donnée →chromatogramme

⇒info qualitative (spectre) et quantitative (calcul des aires).


91

6.4. Les transitions possibles sont : • π→π* : systèmes conjugués

• σ→σ* : non visible en UV

• n→π* : carbonyles

• n→σ* : alcools

Choix de la longueur d’onde λ de mesure en fonction du soluté et de la phase mobile qui doit peu absorber à cette longueur d’onde. 6.5. Loi de Beer-Lambert : Soit un rayon lumineux traversant une solution absorbante de

concentration C et de trajet optique égal à l. Si I0 est l'intensité du rayon lumineux à l'entrée de la solution et I son intensité à la sortie, alors : A = D.O = log (I0 / I) = l C

où A est l'absorbance, D.O la densité optique, Io l'intensité lumineuse incidente, I l'intensité lumineuse transmise, e le coefficient d'extinction molaire caractéristique de la substance étudiée à une longueur d'onde donnée en L mol-1 cm-1, l l'épaisseur traversée en cm et C la concentration en mol.L-1.

Type de détecteur Étendue d'application Limite de détection

Absorption uv/visible Modérément sélectif 0,1-1,0 ng

Fluorescence Sélectif 1-10 pg

Conductivité Modérément sélectif 10 ng

Ampérométrie Sélectif 1-10 pg

Indice de réfraction Universel 0.1-10 g

6.6. Autres détecteurs : Réfractomètre : Il mesure la variation de l'indice de réfraction du liquide à la sortie de la

colonne. Basé sur mesure en continue de l’indice de réfraction de l’éluant réponse basée sur la

≠ce d’indice de réfraction vs éluant (n) et ϕm (no) détecteur universel : répond à tous les composés ) peu sensible

non utilisable en gradient d’élution (variation de l’Ir (indice de réfraction) de la ϕm très sensible aux variations de T° (fluctuation de la réponse assez peu ut (srtt substance qui n’absorbent pas ds UV)

→analyse des sucres la fluorescence restituée.

Détecteur Spectrofluorimétrique : Après excitation de l’échantillon dans la gamme UV, on mesure substances fluorescentes (directement ou après transformation chimique)

=m* planes, rigides à doubles liaisons conjuguées

I=Kc →analyse quantitative

Source UV→λ excitation sélectionnée / filtre ou monochromateur →c* à la sortie de la colonne →λ

d’émission (filtre) →photomultiplicateur Avantages : -très sensible -très sélectif peu ut ds analyse pharma, srtt en analyse bio et en analyse environnementale. Après transformation en général (seulement 5% des substances sont fluorescentes)


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Détecteur électrochimique : Réactions d’oxydoréductions qui produisent un courant proportionnel à la concentration du soluté.

7. Ultra Performance Liquide Chromatographie(UPLC)

UPLC peut être considérée comme nouvelle invention pour la chromatographie liquide. UPLC se réfère à Ultra Performance Liquid Chromatography. UPLC apporte des améliorations spectaculaires de la sensibilité, la résolution et la vitesse de l'analyse peut être calculé. Cette technique utilise les mêmes instrumentations qui fonctionnent en HPLC, mais dans ce système, on utilise des particules très fines (moins de 2,5 um) et des phases mobiles à des vitesses linéaires élevées, on diminue la longueur de la colonne, ce qui réduit la consommation de solvant et permet de gagner du temps. Principe: L’UPLC est basée sur le principe de l'utilisation de la phase stationnaire constituée de particules de

moins de 2,5 m (tandis que les colonnes HPLC sont généralement remplies avec des particules de 3 à 5 um). Les principes sous-jacents de cette évolution sont régis par l'équation de Van Deemter, qui décrit la relation entre la vitesse linéaire (de débit) et la hauteur de la plaque (HETP ou efficacité de la colonne).

H = A + B / v + Cv Il est possible d'augmenter le débit, et donc la vitesse de l'analyse sans affecter les performances chromatographiques. L'avènement de l'UPLC a exigé le développement d'un nouveau système instrumentale pour la chromatographie liquide, qui peuvent profiter de la performance de séparation (par la réduction des volumes morts) et compatible avec les pressions (environ 8000 à 15 000 PSI, par rapport à 2500 à 5000 PSI HPLC). L'efficacité est proportionnelle à la longueur de la colonne et inversement proportionnelle à la taille des particules. Les particules plus petites fournissent une efficacité accrue, ainsi que la capacité de travailler à augmenter la vitesse linéaire sans perte d'efficacité, fournissant à la fois la résolution et la vitesse. L'efficacité est le paramètre de séparation primaire derrière UPLC puisqu'il repose sur la sélectivité et la même rémanence que HPLC.


93

La résolution est proportionnelle à la racine carrée de N. Mais puisque N est inversement proportionnelle la taille des particules (dp):

Comme la taille des particules est réduite par un facteur de trois, à partir de, par exemple, 5 um (HPLC-échelle) à 1,7 um (UPLC-échelle), N est augmenté de trois et la résolution par la racine carrée de trois ou 1,7 N est également inversement proportionnelle au carré de la largeur du pic, par exemple: Conditions UPLC:

Colonne: 2.1 x 30 mm 1.7μm ACQUITY BEH C18 Temp: 30 ° C. A 45 s, 5-85% de pente B linéaire, Débit: 0,8 ml / min a été utilisé. Phase mobile: A était de 10 mm de formiate d'ammonium, pH 4,0, B est l'acétonitrile. Détection UV à 273 nm et de 40 pts / s Les pics dans l'ordre: 5-nitroso-2,4,6-triaminopyrimidine, la 4-amino-6-chloro-1,3-benzenesulfanamide, hydrochlorothiazide, triamterine, et methylbenzenesulfanamide; injection uL, 0,1 mg / ml chacun. Alors que la taille des particules diminue pour augmenter N et par la suite la Rs, une augmentation de la sensibilité est obtenue, de même la hauteur « H » est inversement proportionnelle à la largeur du pic:

Une augmentation de sensibilité est obtenue, depuis les pics étroits sont des pics de grande taille. Pics étroits signifient également une plus grande capacité de crête par unité de temps dans les séparations. Un gradient d’élution est souhaitable pour de nombreuses applications. Comme nous l'avons dit, l’efficacité est proportionnelle à la longueur de la colonne et inversement proportionnelle à la taille de particule.

Par conséquent, la colonne peut être réduite par le même facteur que la taille des particules sans perte de résolution. L'utilisation d'un taux trois fois plus élevé en raison des plus petites particules de flux et le raccourcissement de la colonne par un tiers (de nouveau en raison des particules plus petites), la séparation est achevée en 1/9 du temps tout en conservant la même résolution. L'application de UPLC donné lieu à la détection de métabolites de drogues séparation supplémentaires, supérieur et une meilleure qualité spectrale. Chimie de petites particules: La conception et le sous-développement de particules de 2 um est un défi de taille, et les chercheurs ont joué un rôle actif dans ce domaine depuis un certain temps de capitaliser sur leurs avantages. Pour maintenir la rétention la capacité, on doit utiliser de nouvelles particules poreuses qui peuvent résister à des pressions élevées. En 2000, de colonne hybride à base de silice et de polymère a été introduite et


94

qui se composent de synthèse sol-gel classique qui comprend du carbone sous forme de groupes méthyle, ces colonnes sont mécaniquement résistante. Ils sont très efficaces et peuvent fonctionner dans une large plage de pH. Mais, afin de fournir le genre de stabilité accrue mécanique nécessaire pour UPLC, une deuxième génération nommée éthane hybride (BEH) de nouvelle technologie a été développée. Ces 1,7 um particules tirent leur stabilité mécanique renforcée en comblant les groupes méthyle dans la matrice de silice. Instrumentation:

Le système UPLC a été globalement conçu pour répondre aux besoins de performance des chimies innovantes de colonne avec matériel robuste, un logiciel facile à utiliser et des services de soutien spécialisés. Cela consiste en l’utilisation de:

· petites particules, à pression tolérée

· Modules fluidiques haute pression

· Volume système minimisé

· Report Négligeable

· Temps de cycle réduits

· Dernière détecteurs de réponse

· Le logiciel et les diagnostics du système intégré Les fluidique à haute pression du système ACQUITY UPLC optimise les débits de tirer le meilleur de la technologie en petites particules. Evolution des tailles de particules


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Le challenge de la courbe de van Deemter Les particules sont l’élément central de la séparation, car de plus petites particules donnent de meilleures séparations, sur de plus grandes plages de vélocité, ce qui permet l’augmentation de la vitesse et de la résolution de la séparation.

Les possibilités de la courbe de van Deemter


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Les colonnes UPLC

De point de vue pratique, L’UPLC permet d’avoir de meilleurs résultats analytiques

Plus de vitesse, résolution et sensibilité

Meilleure résolution en un temps égal ou inférieur à l’HPLC

Même résolution en beaucoup moins de temps


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Exemples d’application

Rapidité, Sensibilité Efficacité, sensibilité et meilleure résolution

700 à 1000 bars => Résistance à la pression •Pics ultrafins (0,5-3s) => Détecteurs rapides => Faible volume mort •Méthodes rapides => Vitesse d’injection élevée => Grande capacité d’échantillons => Développement de méthodes •Il faut un système aussi universel que l’HPLC

Vélocité linéaire optimale et température de colonne


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Etude comparative HPLC-UPLC


99

Analyse des acides aminés.


100

8. Domaines d’application des techniques chromatographiques : Domaines d'activité en chimie et en agrochimie

Analyse Pétroles et bitumes Analyse des huiles Analyse des additifs Analyse des colorants Analyse des polymères Analyse des antioxydants Analyse des cires Analyse des résines Analyse des graisses Analyses des tensioactifs Analyse des oléagineux Domaines d'activité en SCIENCES de L'ENVIRONNEMENT

Analyse des rejets pétroliers : en haute mer, sur le littoral, sur site Analyse des rejets industriels Analyse des eaux de rejets Analyse des eaux de barrage Exemples d’analyse et Moyens matériels

Principaux types d’analyses moyens matériels

Détection et dosage des résidus de médicament CCM HPLC

GC/MS HPLC/MS

Détection et dosage des pesticides CPG/ECD GC/MS

Détection et dosage des mycotoxines HPLC

Composition en acides gras et identification des matières grasses.

CPG

Détection des facteurs de croissances et des anabolisants

CPG/MS

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TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES - Licence …lpagrocasa.e-monsite.com/medias/files/module-m-53.pdf · 2016-01-04 · Les courbes de Van Deemter 4.4. Théorie de l’élargissement des