Techniques d’analyse génomique pour

caractériser les cellules souches

Said.assou@inserm.fr

Dr. Said Assou

Institute for Regenerative Medecine and Biotherapy (I.R.M.B)

CHU deMontpellier

INSERM U1183« Groupe: Instabilité génétique des

cellules souches pluripotentes»

Pr. John De Vos

L’être humain

� 1013 cellules

� Même patrimoine

génétique

� 3,1 x 109 paires de

bases

Taille de différents génomes

: = Annuaire téléphonique

de 1000 pages (Paris)

Drosophile (10)

Levure (1)

E. Coli (0,3)

Génome Humain (200)

Publication de la séquence du génome humain : 15 février 2001

International Human GenomeSequencing Consortium

Celera

Une ébauche de la séquence du génome humain a été publiée en début de l’année 2001 par deux équipes différentes simultanément dans Nature et Science

~30 000 gènesSéquences répétées

Le génome humain comporte:

Introns

2 % ADN codant

Autre : séquences régulatrices, etc.

Expression

ARNm

Protéine

Ø

Pas d’expression

Albumine

Foie

Albumine

Peau

Expression de gènes

Expression Pas d’expression

Génome

ADN

Transcriptome Protéome Métabolome

Chromosomes

Transcriptome

ARNm Protéine Métabolites

Transcriptome= La population des ARNm exprimés par un organisme à un instant donné

« Puces à ADN »

« OMICS »

Analyse du transcriptome

� RT-PCR: 1 gène, 10 échantillons

� Puces à ADN: 1 échantillon, 30 000 gènes

Puce à ADNPuce à ADNPuce à ADNPuce à ADN

Principaux types de puces à ADN

FILTRES A HAUTEDENSITE

LAMES DE VERRE PUCES AFFYMETRIX

Support Membrane de nylon Lame de verre Silicium

Taille des spots 0.5- 100 µm 20 µm

Nombre de gènesreprésentés sur la puce

≈ 2.500 ≈ 10.000 ≈30.000

Nature des sondes Clones d’ADNc ouproduits de PCR

Oligonucléotides ou

produits de PCR

Oligonucléotides

Méthode de marquagedes cibles

Radioactif Fluorescence Fluorescence

PROKARYA EUKARYA

MouseMouse

HumanHumanRatRat

DrosophilaDrosophila

EcoliEcoli

P. aeruginosaP. aeruginosa

CanineCanineXenopusXenopus

S AureusS Aureus

BovineBovine

Affymetrix Genechips

YeastYeast

P. aeruginosaP. aeruginosa

B. subtilisB. subtilis

C. elegansC. elegans

Plasmodium FalciparumPlasmodium Falciparum

ZebrafishZebrafish

X3PX3P

BovineBovine

ArabidopsisArabidopsis

BarleyBarley

MaizeMaize

RiceRice

SoybeanSoybean

Sugar caneSugar cane

Vitis viniferaVitis vinifera

WheatWheat* Puce U133A+ U133B

* Puce U133Plus

* Puce Whole exon 1000 000 exons

Croissance exponentielle des publications

� Nombre de publications référencées dans PubMed comportant le mot «microarray» dans le titre ou l’abstract, par année

3000

3500

4000

4500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003

� Les microarrays affymetrix sont de plus en plus utilisées

� Dotées de bonne reproductibilité

� Rendent possible la comparaison des données interlaboratoires

Sous le capot des puces à ADN (Affymetrix)

� Des milliers de fragments d’ADN

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

GATAAGCGG…TGCACAAAGGACTCTA

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

GATAAGCGG…TGCACAAAGGACTCTA

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

( � Des milliers de fragments d’ADN ou d’oligonucléotides déposés sur un support solide = Sondes

(

(

0000000 00000000 0 0TT0000 00TT0000 0 0TT00AA00TT00AA0000000 0 0000000 0 0000000 0 0 0

HO 000 0 0

HO0

HO 000 0 0

HO 0TT000 0 00TT000 0 00TT000 0 0 GTTGCAAC

TACTTAGG

GAAATCTA

GTTGCAAC

TACTTAGG

GAAATCTAMASQUE 2MASQUE 1

Protection

chimique

Source

lumineuse

Fabrication des puces Affymetrix

Photolithogravure (Affymetrix)

0000000 00000000 0 0TT0000 00TT0000 0 0TT00AA00TT00AA0000000 0 0000000 0 0000000 0 0 0 000 0 00 000 0 0 0TT000 0 00TT000 0 00TT000 0 0

Substrat

solide

Photodéprotection Bases déprotégées Ajout de thymidine

sur les bases déprotégées

Répétition

n cycles

Ajout

d’adénosine

* La technique débute par l’attache à la surface de la puce de liaisons synthétiques munie de groupes chimiques qui peuvent être enlevés sous l’effet de la lumière

* On envoie ensuite de la lumière à certaines localisations définies via un masque photolithographique afin de déprotéger les liants

* Le rajout de deoxynucleosides avec un groupe photolabile permet la liaison avec les groupes déprotégés

* L'emplacement des différentes sondes oligonucléotidiques sur la puce et l'enchaînement des bases qui les composent sont très précisément connus

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

RNA Total

cRNA biotinylé fragmenté

�et une cible

cDNA

Reverse

Transcriptio en 3’

In Vitro

Transcription

Une Puce�

Amplification / hybridation

(

(

hybridation

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

scannerCTATTCGCC²…

ACGTGTTTCCTGAGAT

GATAAGCGG…TGCACAAAGGACTCTA

CTATTCGCC²…

ACGTGTTTCCTGAGAT

GATAAGCGG…TGCACAAAGGACTCTA

CTATTCGCC²…

ACGTGTTTCCTGAGAT

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

CTATTCGCC²…

ACGTGTTTCCTGAGAT

GATAAGCGG…

TGCACAAAGGACTCTA

bioinformatique

fragmenté

B B BB

BB

B cRNAbiotinylé

Transcription

ARN de départ

• Macroarrays : 100 µg ARN total 100 x 10e6

• Affymetrix : 1 µg ARN total 1 x 10e6

1 – 100 ng 10e3

16 ovules : ~ 4 ng ARN total

Assou, S. et al. Hum. Reprod. 2006

Single oocyte Single embryo

Day 3 embryo

MBD3L2

CCNA1

RFPL2

ZSCAN4

NALP11

Grøndahl M et al. Hum. Reprod. 2010;25:957-968

RFPL2

DPPA2

Assou S et al. PlosOne. 2012, 7(6):e39306 8

Profils d’ARN totaux

ARN Total parfaitARN Total parfait

Pics: marqueur - 18S – 28S parfois un peu de 5S

Ratio: 28S/18S =∼∼∼∼1,7

Contamination génomique ARN dégradé

2 protocoles de marquage

� 1 cycle de transcription in vitro:� Il faut 1 - 5 µg d’ARN total

� 2 cycles de transcription in vitro:� Il faut 50 ng d’ARN total (~ 10 000

cellules)

� NB: pas d’ARN de référence : résultat « absolu » (normalisation sur la totalité de l’image)

Les puces à ADN fournissent d’abondantes quantités de données. La matricephysique (puce à ADN ou matrice d’hybridation) permet de générer une matriceoptique (cartographie de fluorescence) à partir de laquelle est produite unematrice numérique

La bio-informatique et la biostatistique sont des outils indispensables pour letraitement et l’analyse des milliers de données générées par les puces à ADN.

Traitement des données

inclut tous les paramètres de

récapitule les résultats des différents contrôles

Anatomie du logiciel GCOS

l’image de la puce générée par le scanner

contient les intensités moyennées (normalisation)

inclut l’algorithme statistique pour l’analyse: c’est le fichier des résultats.

paramètres de l’expérience

différents contrôles de qualité

Analyses des données

� A partir des données brutes de la puce

� Identifier les gènes sur ou sous exprimés dans chaque groupe d’échantillons : ovocytes, cellules souches, ….

Analyse bioinformatique

� Regrouper les échantillons ayant un profil d’expression de gènes similaire

� Définir la fonction de ces gènes

� Se focaliser sur les gènes codant pour des protéines candidates

� Analyse supervisée

� = connaissant deux groupes d’échantillons,

quels gènes les séparent?

Analyses supervisées et non supervisées

� Analyse non supervisée

� = comment se classent les échantillons et les

gènes?

� Classification hiérarchique

Effectue des permutations aléatoires

entre les puces pour générer un résultat

« au hasard » de référence.

Compare ensuite les puces à cette

référence pour trouver les variations

significatives

Analyses supervisées: SAM

Calcule les variations,

donne les résultats

en fonction :

-du seuil de variation souhaité

(« fold change »)

- du % d’erreur souhaité

(False Discovery Rate)

Analyse non supervisée: classification hiérarchique

E01 E02 E03 E04 E05 E06 E07 E08

G01 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78 0,00

G02 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00 8,22

Mesures Colorisation Regroupement

G03 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41

G04 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85

G05 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78 0,00

G06 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00 8,22

G07 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41

G08 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85

G09 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41

G10 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85

G11 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78 0,00

G12 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00 8,22

G13 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41

G14 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85

G15 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41

G16 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85

G17 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78 0,00

G18 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00 8,22

G19 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41

G20 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85

Du gène à la fonction

� Ingenuity pathway analysis (IPA)

� Le logiciel permet de placer les gènes d’intérêt dans des mécanismes biologiques, des voies de signalisation et des fonctions

https://analysis.ingenuity.com/pa.

des voies de signalisation et des fonctions connues et décrites dans la littérature.

Metabolic regulators

NANOG pathway

TEICM

Réseau d’interaction

Epigenetic regulators

Day 3 Embryo

Day 5 Blastocyst

Assou S et al. PlosOne. 2012, 7(6):e39306 8

� Notre génome est connu: ~30 000 gènes

� Les puces à ADN permettent aujourd’hui

d’analyser le transcriptome (l’expression de

Conclusion

d’analyser le transcriptome (l’expression de

nos 30 000 gènes en une expérience)

� 50 ng ���� 30 000 RT-PCR!

� Libres

� R

� Cluster / TreeView

� Web : Babelomics

Mes logiciels préférés

� Web : Babelomics

� Payants

� Array Assist (Stratagene)

� Pathway Architect (Stratagene)

� Ingenuity

� Partek

� Pathway Studio

� GEO : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/

� ArrayExpress : http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress

Quelques sites web!

� Atlas dédiés

� Amazonia! : http://amazonia.montp.inserm.fr/

� Outils d’analyse

� Privés : RAGE

� Publics: Oncomine

� Babelomics

http://www.geneontology.org/GO.tools.shtmlTool to display, browse and search the ontologies and/or annotations.

* CGAP GO Browser* COBrA* Comparative Toxicogenomics Database* EP GO Browser* GeneInfoViz* GeneOntology at RZPD* GenNav* GOblet* GoFish* MGI GO Browser* Ontology Lookup ServiceTools for annotating genes or gene products using GO

Tools for gene expression/microarray analysis* Avadis * BiNGO* CLENCH * DAVID* EASE * eGOn v2.0* ermineJ * FatiGO* FIVA * FuncAssociate* FuncExpression * GARBAN* GENECODIS * GeneMerge* GFINDer: Genome Function * GOALIE* GOArray * GOdist* GOHyperGAll * GoMiner and MatchMiner

Other tools* APID* Blast2GO* Db for Dummies!* Flash GViewer* FunSpec* FuSSiMeG* Generic GO Term Mapper* Genes2Diseases* GO Slim Mapper* GO Terms Classification Counter* GOBU* GOChase* Ontology Lookup Service

* PANDORA* QuickGO at EBI* TAIR Keyword Browser* Tk-GO

Tools for annotating genes or gene products using GO* g:Profiler* GeneTools* GOanna* GoAnnotator* GoFigure* GoPubMed* GOtcha* HT-GO-FAT* InGOt (proprietary)* InterProScan* JAFA* Manatee* PubSearch

* GOHyperGAll * GoMiner and MatchMiner* Gostat * GoSurfer* GO Term Finder * GOTM (Gene Ontology Tree Machine)* GOToolBox * L2L* Machaon Clustering and Validation Environment* MAPPFinder * MultiGO* NetAffx Gene Ontology Mining Tool* Onto-Compare * Onto-Design* Onto-Express * Onto-Miner* Onto-Translate * OntoGate* Ontologizer * Ontology Traverser* Probe Explorer * SeqExpress* SOURCE* Spotfire Gene Ontology Advantage Application* STEM: Short Time-series Expression Miner* T-Profiler * THEA

* GOChase* GOProfiler* GORetriever* GOSlimViewer* ProteInOn* TXTGate* WEGO* Whatizit

microARNs

Prix Nobel de Médecine 2006Andrew Fire & Craig Mello

� Les microARNs sont de courts brins d’ARNs, d’environ 22 nucléotides appartenant à

la famille des 'smallARN', ne codant pas pour des protéines mais modulant l’expression

de gènes précis.

Andrew Fire & Craig Mello

Exportin-5 : Transport le pre-miARN vers le cytoplasme

Les microARNs: Biogénèse

Le transcrit clivé par Drosha ���� pré-miARN (70 nt)

Les gènes codants pour les miRNAmiARN vers le cytoplasme

Les gènes codants pour les miRNAsont transcrits par l’ARN polymeraseII dans le noyau sous forme d’un longtranscrit ou pri-miRNA

Le duplex est incorporé dans le complexe protéique miRISC

Le brin mature du complexe estpréférentiellement retenu et varéguler négativement son ARNm cible

miRNA Publications/Reserach

miRNAs identifiedin viral genomes

miRNAs identifiedin leukemia

miRNAs discoveredin human, mouse and drosophila

Lin-4: anti-senseRNA c.elegansdevelopment

Nu

mb

er

of

miR

NA

Pu

bli

ca

tio

ns

and drosophila development

Nu

mb

er

of

miR

NA

Pu

bli

ca

tio

ns

Year of Publication

Historique des technologies

Le séquençage à haut débit

« Le début d'une nouvelle ère »

� 2007 : les séquenceurs à haut débit ont envahi le marché mondial.

� Plusieurs technologies différentes

� Modèles de paillasses plus accessibles

� Dans un futur très proche, on espère pouvoir séquencer un génome entier pour moins de 1 000$...

� Médecine personnalisée ?

Séquenceurs 2ème génération

Séquenceur 454 GS FLX HiSeq 2000 SOLiD 5500XL Ion Proton System

Terminateur de Réaction

séquençagePyroséquençage

Terminateur de

chaîne

réversible

Ligature"proton-

séquençage"

Temps run 10 heures 8 jours 10 jours 2 heures

Taille des lectures

(pb)1000 2x100 2x75 300

Nombre de lectures 1.106 3.109 1.4.109 3.106

Données générées 1 Gb 600 Gb 300 Gb 1 Gb

Les biologistes sont confrontés à un réel problème pour stocker et analyser les données qu'ils produisent

Le NGS a permis le séquençage entier du génome humain

� Séquenceurs de 2ème génération

� révolution technologique : séquençage massif

Encourageant mais encore trop cher ?Encourageant mais encore trop cher ?

• Séquenceurs de 3ème générations

� pas encore au point mais très prometteurs

Longues molécules uniques, faible coût, très rapidementLongues molécules uniques, faible coût, très rapidement

Et dans les prochaines années?Et dans les prochaines années?

Applications du NGS

ARN

ARN immuno-précipité

ARNmARNNon codant

miARN

ADN

Génomeentier

ADNcodant

ADN immuno-précipité

ADNméthylé

ExomeSeq

Mutations/SNP

ChipSeq

Genome de novo

ClipSeq

SmallRNASeqRNASeq

Séquençage de novo

Re-séquençage

InteractionsADN/protéines

MéthylationDe l’ADN

ChipSeq

MeDIPSeqBisulfiteSeq

Interactions ARN/protéines

Séquençage d’ARN

Cellules souches Cellules souches embryonnaires humaines embryonnaires humaines embryonnaires humaines embryonnaires humaines

(CSEh)(CSEh)

Comprendre la pluripotence

Créer la pluripotence

CSEh: Modèle de cellules pluripotentes

Cellules souches

embryonnaires pluripotentes

CSEh

Cellules

médicaments

Applications thérapeutiques majeures

Les cellules souches pluripotentes présentent un potentiel thérapeutique majeur

Dégradation d’ARN et protéines maternelles

Activation du génome embryonnaire

Cellule souche

pluripotente

Marqueurs membranaires:Antigènes (SSEA-3, SSEA-4)Glycoprotéines (TRA-1-60 et TRA-1-81)

Différenciation in vivo: Formation des tératomes

Génotype et un caryotype

Différenciation in vitro: Endoderme, Ectoderme, Mésoderme

Marqueurs nucléaires: Facteurs de transcription (OCT4, NANOG, SOX2…)

Génotype et un caryotype normaux

Facteurs intrinsèques

La pluripotence des CSEh est sous le contrôle de réseaux de facteurs de transcription (Oct4, NanogY.)

CSEh

Niche

bFGF

FGFR1

BMPO2

SIP+PDGF

Erk 1/2

?

?

Facteurs extrinsèques

IGF-II

O2

CSEh

Niche

Erk 1/2?

bFGF

� 38 études originales

� 28 lignées CSEh

� Puce à ADN, SAGE, EST, etc.

� H1, H9, BG01

Comprendre la pluripotence

Une méta-analyse des données indépendantes de transcriptome CSEh

Comparaison des listes

Oct4

Assou, S. et al. Stem cells. 2007

Nouveaux marqueurs de surface des CSEh

CD44 hFFCD24

Purification des CSEh cultivées sur fibroblastes humains par cytometrie de flux.

Assou, S. et al. Stem cells. 2007

CD24

hESC

Nouveaux marqueurs de surface des CSEh

Sémaphorine SEMA6A

Hoechst OCT3/4

SEMA6A OCT3/4 – SEMA6A

Assou, S. et al. Stem cells. 2007

Un bon guide dans la forêt du transcriptome!!

Oct4

Atlas d’expression CSEh25 000 gènes

4 500 échantillons

http://amazonia.montp.inserm.frAssou, S. et al. Stem cells. 2007

� CSEh:

�Système reproductible

�Capacité illimitée de multiplication

�Capacité de différenciation modulable�Capacité de différenciation modulable

�Modélisation in vitro du développement

humain

�Applications thérapeutiques majeures

� Prolifération intense�Différenciation + purification

� Source de cellules embryonnaires� Allogénicité (HLA incompatible)

Limites à un usage thérapeutique

� Allogénicité (HLA incompatible)� Immunosuppression

� Banque de lignées compatibles

� Ethique�Manipulation d’embryon

Reprogrammer une cellule d’un patient en cellule pluripotente pourrait être un moyen d’éviter ces limites

����

SCNT (somatic cell nuclear transfert) Fusion Infection virale

ovocyteCSEh

Stratégies pour induire la reprogrammation des cellules somatiques

� Prendre un ovocyte

� L’énucléer

� Injecter le noyau d’une cellule somatique:

� Fibroblaste � phénotype ES

� Les cellules fusionnées peuvent acquérir des propriétés de pluripotentialité qu’elles ne possédaient pas auparavant

� Tétraploïdes

� Reprogrammation de Fib. en cellules « pluripotentes » par la simple expression dans ces cellules de 4 protéines responsables dans les ES du maintien de l’état pluripotent

LA REPROGRAMMATION

• protocole de Thomson (2007)

• Cocktail de 4 lentivirus• Oct4 + Sox 2 + Nanog + Lin 28

Oct4 Sox2 Lin28Nanog

• Oct4 + Sox 2 + Nanog + Lin 28

• Reprogrammation de

fibroblastes

• Génération de la lignée des iPS

Résultats reproductibles : reproduits dans le laboratoire

Différenciation in vitro

EB : structure cystique (J18)DAPI

αααα-SM actin

Formation des tératomes

Assou et al. stem cells & development 2015

induced pluripotent stem cells (hiPS)

Lentiviruses

Fibro iPS cells CSEh

Qualification : Transcriptome

fibroblast

il est encore nécessaire d’approfondir les mécanismes qui conduisent à la pluripotence,

afin de permettre une meilleure compréhension des mécanismes de la reprogrammation

TheTheTheThe NobelNobelNobelNobel PrizePrizePrizePrize inininin PhysiologyPhysiologyPhysiologyPhysiology orororor MedicineMedicineMedicineMedicine

2012201220122012 waswaswaswas awardedawardedawardedawarded jointlyjointlyjointlyjointly totototo SirSirSirSir JohnJohnJohnJohn BBBB....

GurdonGurdonGurdonGurdon andandandand ShinyaShinyaShinyaShinya YamanakaYamanakaYamanakaYamanaka "for"for"for"for thethethetheGurdonGurdonGurdonGurdon andandandand ShinyaShinyaShinyaShinya YamanakaYamanakaYamanakaYamanaka "for"for"for"for thethethethe

discoverydiscoverydiscoverydiscovery thatthatthatthat maturematurematuremature cellscellscellscells cancancancan bebebebe

reprogrammedreprogrammedreprogrammedreprogrammed totototo becomebecomebecomebecome pluripotent"pluripotent"pluripotent"pluripotent"

CSEh & OvocyteCSEh & OvocyteCSEh & OvocyteCSEh & Ovocyte

mécanique de la reprogrammationmécanique de la reprogrammation

Ovocyte

Comprendre la mécanique de la reprogrammation

5 Days

Les ovocytes & CSEh sont deux types cellulaires capables de reprogrammer

les cellules somatiques en cellules pluripotentes

Ovocyte MII

CSEh

Ovocyte MII

CSEh

Tissues Number of

samples

human embryonic stem cells 29

human mature oocytes 9

human foreskin fibroblasts 4

ovary 3

central nervous system 44

peripheral nervous system 18

tissu

s s

om

ati

qu

es

167 Ech.

205 Ech.

skin and keratinocytes 6

lung 11

digestive tract 19

thyroid 5

adipocytes 2

kidney and prostate 6

heart and muscle 10

hematopoietic tissues 30

uterus 6

placenta 3

tissu

s s

om

ati

qu

es

Ovocytes et cellules souches embryonnaires : convergence de leur transcriptome

Principal component analysis (PCA)

Assou, S. et al. BMC Genomics. 2009

Signatures “ovocytaire” et “CSEh”

� Gènes sp ovocytes vsvs gènes sp CSEh

Ovocyte vs tissus

somatiques

CSEh vs tissus

somatiques

Assou, S. et al. BMC Genomics. 2009

Les gènes communs ovocyte/CSEh ont une localisation intracellulaire

Assou, S. et al. BMC Genomics. 2009

Remaniement chromatinien

Réseaux moléculaires (I)

exprimé

non détecté

Surexpression(ovocyte et hESC)

la machinerie cellulaire responsable du remaniement chromatinien est fortement surexprimée dans les ovocytes et les CSEh par rapport aux tissus somatiques

Réseaux moléculaires (II)le protéasome et le système d’ubiquitination

Protéasome 26S(composé du noyau protéolytique 20S et du domaine régulateur 19S).

Le protéasome exerce une activité protéasique et joue un rôle central dans le contrôle de la stabilité des protéines dans la cellule et peut être dans la transcription

Assou, S. et al. BMC Genomics. 2009

Diminution d’expression des sous-unités du protéasome au cours de la différenciation des CSEh

La forte expression des protéasomes dans les CSEh et leur diminution au cours de la

différenciation suggère le rôle important de la machinerie protéasome dans le

maintien de la pluripotence.

Assou, S. et al. BMC Genomics. 2009

les CSEh sont très sensibles à l'inhibition de l'activité du protéasome

MG132, a specific proteasome inhibitorAssou, S. et al. BMC Genomics. 2009

Les fibroblastes ne sont pas sensibles à l'inhibition de l'activité du protéasome

human foreskin fibroblasts (HFF)

P4H: Proline-4-Hydroxylase

Les fibroblastes like ne sont pas sensibles à l'inhibition de l'activité du protéasome

hES-dF (fibroblasts like)

Assou, S. et al. BMC Genomics. 2009

CSEh

les CSEh sont très sensibles à l'inhibition de l'activité du protéasome

Oct4Fibroblastes CSEh

RT-PCR Flow cytometry analysis

Assou, S. et al. BMC Genomics. 2009

� blocage protéasome ���� différenciation

Conclusion

� Puces à ADN : saut technologique +++

� Application aux cellules souches:

� Recherche� Recherche

� Routine

Cellules souches

& gamètes& gamètes

Assistance médicale à la procréation Assistance médicale à la procréation

Robert Geoffrey Edwards (Prix Nobel de médecine 2010)

L’apparition de la fécondation in vitro en 1978 a permis de traiter en partie les problèmes de stérilité humaine. Depuis, les demandes d’Assistance médicale à la procréation augmentent chaque année.

����

� De nombreux couples désirent une grossesse, mais ne peuventavoir d’enfants, parce que l’homme n’a pas de spermatozoïdes oula femme n’a pas d’ovocytes de bonne qualité. Une solution à cesproblèmes est le don de gamètes

Assistance médicale à la procréation

���� Depuis quelques années, les centres gérant le don despermatozoïdes et d’ovocytes connaissent une pénurie dedonneurs. L’offre de gamètes ne permet plus de répondre à lademande des couples.

Disposer d’une source abondante de gamètes modifierait lespratiques actuelles de l’AMP et pourrait résoudre en partie leproblème d’infertilité

����

Fécondation Masse cellulaire

interne

Est-il concevable d’obtenir in vitro des gamètes artificiels à partir des CSEh ou iPS?

blastocyste

CSEh iPS

?

Ovocyte

In vitro

Chez la souris

Des CSE aux gamètes

Assou, S. et al. GOF, 2008

L’impact du microenvironnement dans lequel sont cultivées les CSE semble êtred’importance capitale pour l’obtention de l’ovogenèse ou la spermatogenèse

����

Cellules souches embryonnaires

Culture en 2D

Obtention des ovocytes à partir des CSEm

ovocyte

Blastocyste

Activation spontanée

En 2003 Hübner et al ont pour la première fois

rapporté l’obtention de gamètes femelle

dérivés de CSE de souris

Early Primary Follicle-like

Formation of FollicleFormation of Follicle--like Structureslike Structures

Obtention des structures ovocytaires et folliculaires à partir des CSEm

Follicle-like Structure

Secondary Follicle-like Structure

Hübner et al. 2003 Science

Detection of Androgen Precursors

� Detection of estradiol in cultures suggest functional activity of somatic cells in follicle-like structures

� Levels of estradiol detected around day 12 and peaked around day 20

BlastocystBlastocyst--like like CellsCells

OocyteOocyte--like like CellsCells

Obtention des ovocytes puis des blastocystes à partir des CSEm

Hübner et al. 2003 Science

Après 26 jours Après 43 jours

L’équipe dirigée par le Pr SaitoMitinori à réussi à obtenir des cellulesgerminales à partir des iPS de souris

Placées dans des ovaires, ces cellulesgerminales ont permis d'obtenir desovocytes au bout de quatre semaines

Obtention des ovocytes fonctionelles à partir des iPS

K Hayashi et al. Science 2012;338:971-975

ovocytes au bout de quatre semaines

Après FIV, ces ovocytes ont étéréimplantés dans des utérus de souriset ont permis de donner naissancetrois semaines plus tard à trois bébéssouriceaux en parfaite santé.

Devenus adultes, ces rongeurs ont àleur tour pu donner naissance de façon‘classique’ à une portée.

Cellules souches embryonnaires

Culture en 3D (EB)

Obtention des gamètes mâles à partir des CSEm

L’équipe de K. Nayernia a mis en

évidence l’extraordinaire capacité des

CSE de souris à se transformer en

Sperme

Spermatide

Cellules germinales primordiales

CSE de souris à se transformer en

gamètes mâles fonctionnel

Obtention des gamètes mâles à partir des CSEm

Les chercheurs ont pu obtenir des spermatides en trois jours

Ils montrent que ces gamètes mâles sont fonctionnels et capables de féconder

l’ovocyte, produire un blastocyste et assurer la naissance de sept souriceaux

����

����

Nayernia K et al. Dev Cell 2006

Principales études décrivant la différenciation in vitro de cellules germinales à partir des CSE

AC, aggregation cultures with cells producing growth factors

SD, spontaneous differentiation

EBs, embryoid bodies

Imaginons que la fertilité des femmes ne serait plus limitée à la

La génération des gamètes artificiels à partir des cellules souchesreprésente donc un intérêt majeur pour le traitement de l’infertilité

����

Life is endowed

with a

mysterious and

divine life-force

Imaginons que la fertilité des femmes ne serait plus limitée à laménopause, et que les situations d’azoospermie verraient une solutionà la préservation ultérieure de la fertilité?

Imaginons qu’une personne pourra prétendre également à procréeravec des gamètes issus de ses propres cellules?

Serait-il possible un jour de déterminer à partir de même individu desgamètes mâles et femelles et leurs fécondation mutuelle donnerait unereproduction mono-parentale, avec les conséquences de laconsanguinité?

����

����

����

Perspectives

L’ensemble des données obtenues à ce jour participe à unemeilleure compréhension des mécanismes impliqués dans ladifférenciation et le développement de la lignée germinale.Cependant, se posent de nouvelles questions dont la résolutionest indispensable pour la réalisation d’une ovogenèse ouspermatogenèse fonctionnelle.

����

spermatogenèse fonctionnelle.

Séquençage à haut débit: Analyse du génome d’un

seul ovocyte humain

Hou et al. 2013 Cell. Dec 19;155(7)

Thank you for your attention