Techniques de microscopie électronique en laboratoire de recherche

Stage PAF-APBG15 et 16 juin 2010

Université de RouenMarie-Laure Follet-Gueye et Maïté

Vicré-Gibouin

GlycoMEV

Ce diaporama a été réalisé par Odile Mottet à partir de photos des stagiaires

Préparation d’échantillons végétaux (racines de pois et de lin) pour la microscopie électronique à transmission (MET)

Les étapes1- Fixation chimique2- Déshydratation3- Inclusion en résine et polymérisation4- Ultramicrotomie5- Marquage et contraste

Les racines de pois sont sectionnées en fragments de 1 à 2 mm de longueur

1- La fixation chimiqueIl s’agit de fixer les constituants organiques des ultra structures par un produit interagissant chimiquement avec ceux-ci . (Etablissement de liaisons faibles, oxydations =>réticulation des protéines les rendant insolubles, inactivation des enzymes bloquant les réactions…) .Le choix du fixateur est fonction des objectifs de l’étude : * Pour l’observation des ultra structures, une post-fixation à l’osmium suit la fixation* Pour effectuer la localisation cellulaire d’une molécule par immuno cytochimie, les fixateurs choisis ne doivent pas altérer les épitopes sur lesquels se fixent les anticorps.

Les fragments de racine sont placés dans des tubes Eppendorf (à droite) remplis de fixateur pour une durée d’une heure.Après plusieurs rinçages, la post-fixation à l’osmium s’effectue à l’obscurité.Toutes ces manipulations se font sous hotte, avec des gants et tous les produits utilisés (très toxiques) sont récupérés dans des récipients particuliers.

2- La déshydratation

Les échantillons sont placés dans des bains d’éthanol de concentration croissante. L’eau doit être éliminée pour permettre un bonne polymérisation de la résine.

3. L’inclusion dans une résine

Les échantillons sont progressivement imprégnés de résine puis inclus dans une résine Epoxy disposée dans des moules. La polymérisation s’effectue en une nuit à 60°C . Pour des études d’immunocytochimie, l’emploi de résines de type LR White s’avère nécessaire pour préserver les épitopes. La polymérisation s’effectue à froid et sous UV pour les épitopes de nature protéique.

Un échantillon est positionné vers l’extrémité de chaque futur bloc de résine.

Pointe racinaire

4- L’ultramicrotomie

Le bloc de résine est taillé afin de créer un zone en forme de pyramide tronquée au ras de l’échantillon. C’est au niveau de cette zone que les coupes sont réalisées.

Microtome à couteau de verre permettant la réalisation de coupes semi-fines (de l’ordre de 500 nm)

Un couteau de verre : derrière le côté tranchant, un réservoir rempli d’eau accueille les coupes

La surface de l’échantillon enrésiné doit être orientée parallèlement au couteau. Il doit être ensuite minutieusement rapproché de celui-ci.

Bloc de résine contenant l’échantillon

Couteau de verre

Réservoir d’eau servant à récupérer les coupes

Les couteaux de verres sont fabriqués au laboratoire

1. Des plaques de verre carrées sont sectionnées sur une diagonale

2. Le tranchant est vérifié à la loupe

3. Un réservoir destiné à recueillir les coupes est confectionné à l’aide de papier adhésif et de vernis.

La réalisation de coupes semi-fines avec le microtome

1. La résine est positionnée et ensuite le bras du microtome est mis en mouvement avec la manivelle (main droite).

2. La coupe juste réalisée telle qu’elle apparaît au manipulateur dans les oculaires.

coupe

3. Les coupes sont récupérées avec un cil collé à l’extrémité d’une pipette Pasteur en verre.

4. Les coupes sont déposées dans une goutte de poly-L-lysine permettant une meilleure adhésion.

5. Afin d’observer ces coupes au microscope optique, la goutte est évaporée sur une plaque chauffante. Les coupes sont ensuite colorées au bleu de toluidine, puis rincées et séchées à nouveau.

coupe Poly-lysine

Une coupe semi fine observée au microscope optique. Ici il s’agit d’une coupe de caryopse de blé dont on peut repérer la couche à aleurone, les téguments et l’albumen.

couche à aleurone

albumen

téguments

Les échantillons enrésinés peuvent être coupés à l’ultramicrotome pour donner des coupes ultrafines (80 nm d’épaisseur).

La récupération des coupes avec une anse de platine permet de les déposer ensuite sur des grilles.

Le couteau est en diamant. L’épaisseur des coupes est choisie et les coupes se font de façon automatique

Les coupes telles que les observe le manipulateur dans les oculaires.

Coupes

Grilles en cuivre présentant un maillage sur lequel est déposée la coupe ultra-fine

Anse de platine

5- Marquage et contraste5A. Marquage par immunofluorescence: étape nécessaire au repérage des zones à analyser ensuite à l’échelle subcellulaire (MET)

Ces lames à puits en téflon contiennent des coupes semi fines de racine de pois de 0,5µm d’épaisseur.

Ces coupes sont successivement mises en présence :- de tampon TBST, lait à 3% destiné à saturer les sites non spécifiques,- d’anticorps primaires JIM5 ou JIM7. Ces anticorps sont des anticorps monoclonaux de rat dirigés contre les homogalacturonanes constituants des pectines pariétales.- d’anticorps secondaires, anticorps de chèvre anti-IgG de rat, couplés au fluorescéine Iso Thio Cyanate (FITC, molécule fluorescente)

Les lames à puits sont recouvertes d’une lamelle scellées par du vernis.

5.B. Immunomarquage à l’or (pour observation au MET)

Ces grilles Nickel portent des coupes ultrafines de racines de pois de 80 nm d’épaisseur.

Les grilles sont placées successivement au contact de gouttes contenant : - un sérum de chèvre destiné à saturer les sites non spécifiques -d’anticorps primaires (les mêmes que pour l’immunofluorescence)- d’anticorps secondaires porteurs d’une particule d’or (10nm) opaques aux électrons. Le contraste (acétate d’uranyle puis citrate de plomb) est ensuite réalisé.

Les grilles sont les supports qui (après éventuellement immunomarquage) sont placés dans le microscope électronique à transmission.

Grille portant les coupes placée dans le support à insérer dans le microscope.

Portoirs de grilles

Canon à électrons

Condenseur

Colonne sous vide contenant les lentilles électromagnétiques

Caméra CCD

Porte- échantillon

Ecran sur lequel se forme l’image

Image numérisée

Écran de contrôle du microscope

Vue générale de cellules de racine

GlycoMEV

Statolithes (grains d’amidon) dans une cellule de la coiffe

GlycoMEV

Détails de cellules de la coiffe

GlycoMEV

Paroi végétale

GlycoMEV

Appareil de Golgi

GlycoMEV

Des polysomes

GlycoMEV

Mitochondrie et paroi. Ici l’organisation fibreuse (microfibrilles de cellulose) de la paroi est visible.

GlycoMEV

Un exemple d’immunomarquage avec fluorescence (avec anticorps JM5) des homogalacturonanes de la pectine pariétale (observation en microscopie optique à fluorescence) ( ici une préparation dans un bouton floral d’Arabidopsis)

Source : http://www.bmb.leeds.ac.uk/staff/jpk/gal1.htm

Résultats de l’immunomarquage à l’or des homogalacturonanes de la pectine pariétale

Les petites taches très sombres correspondent aux particules d’or fixées sur les anticorps secondaires eux-mêmes fixés sur les anticorps primaires. On peut ainsi localiser les molécules entrant dans la composition de la pectine..

paroi particules d’or

GlycoMEV

Les molécules marquées sont repérables ici surtout au niveau de la lamelle moyenne

GlycoMEV

Le marquage ici situé au niveau d’un saccule golgien permet d’émettre l’hypothèse de l’intervention de l’appareil de golgi dans la synthèse des composants de la pectine

GlycoMEV