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THÈSE
En vue d’obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE Délivré par l’université Toulouse III-Paul Sabatier
Discipline : Pharmacologie
Présentée et soutenue par Darine EL HAJJ DIAB
Le 29 Mai 2015
Titre: Nano-thérapie ciblée des tumeurs endocrines par hyperthermie magnétique
intra-lysosomale
JURY
Président: Pr. Bruno SEGUI, Professeur des Universités, INSERM UMR 1037, Toulouse
Rapporteur : Pr. Laurence MOTTE, Professeur des Universités, CSPBAT, CNRS UMR 7244, Paris
Rapporteur : Pr. Sophie VASSEUR, Professeur des Universités, CRCM U624, Marseille
Rapporteur : Pr. Michel VIDAL, Professeur des Universités, INSERM UMR8638, Paris
Examinateur : Pr. Julian CARREY, Professeur des U,iversités, INSERM LPCNO,Toulouse
Directeur de thèse : Dr Véronique GIGOUX, chercheur, Université Toulouse III, Toulouse
Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies
Unité de recherche : Université Toulouse III, Equipe EA 4552
Directeur(s) de thèse : Dr Véronique GIGOUX
2
A ma directrice de thèse, Madame GIGOUX Véronique,
Pour m‟avoir proposé ce sujet, pour avoir accepté de diriger ce travail et pour le temps
que vous m‟avez accordé malgré votre planning chargé, veuillez trouver ici mes sincères
remerciements. Je garderai un excellent souvenir de votre positivité.
A mon co-directeur de thèse, Monsieur FOURMY Daniel, directeur de l’équipe EA
4552 - Réceptologie et Ciblage Thérapeutique en Cancérologie (RCTC),
Pour avoir accepté dans votre équipe et de codiriger ce travail, pour vos conseils
scientifiques, veuillez trouver ici mes sincères remerciements.
Je tiens à remercier tout particulièrement Monsieur CLERC Pascal, ingénieur de
l‟équipe pour son expérience enrichissante et pleine d‟intérêt au niveau des techniques
utilisées dans l‟équipe. Je remercie également tous mes collègues de l‟équipe ; GHERARDI
Marie-Julie, ISMAIL Sadek, JEAN-JEAN Pauline.
Je dédie cette thèse :
A mes parents,
Pour m‟avoir soutenue moralement tout au long de mes études.
A toi papa, pour qui notre avenir compte tant. A toi maman, pour m‟avoir toujours fait
confiance dans mes choix.
A mes frères, Hamoudi, Rami et Wassim
A mon oncle Dr. KAAFARANI Nizar et ma tante KAAFARANI Itidal, ma deuxième famille
en France.
A mes ami(e)s Libano-Toulousains et mes amis de ma promo,
Pour ces trois années passées à vos côtés, que ce soit dans le laboratoire, à la BU, ou en
soirées.
3
Pour mon fiancé et mon futur mari SOJOD Youssef,
Merci de m‟avoir soutenu tout au long de ma thèse, particulièrement pendant les périodes les
plus difficiles de la rédaction. Merci pour ta présence près de moi, pour ta confiance, pour
m‟avoir toujours écouté après des longues journées de travail.
Merci pour ta présence dans ma vie,
4
RESUME Les tumeurs endocrines sont habituellement diagnostiquées grâce à l‟emploi d‟une
technique d‟imagerie utilisant un peptide radio-marqué (somatostatine ou Osteoscan) dont le
récepteur est présent dans 80% des tumeurs. Le récepteur à sept domaines transmembranaires
RCCK2 est également sur-exprimé avec une forte incidence dans les tumeurs endocrines. De
plus, notre équipe a montré que la gastrine et la CCK, les deux ligands agonistes naturels du
RCCK2, induit une internalisation massive du RCCK2 ; le récepteur est ensuite orienté
majoritairement avec ses ligands vers les lysosomes pour y être dégradé.
Notre équipe a alors formulé l’hypothèse que la surexpression de RCCK2 dans les
tumeurs endocrines comparativement aux tissus sains et sa capacité d’internalisation massive
pouvaient être avantageusement utilisées pour développer une nouvelle approche
diagnostique et thérapeutique.
Mon projet de thèse présentaient plusieurs objectifs : 1°) optimiser une
nanoplateforme magnétique permettant le ciblage efficace de cellules tumorales
surexprimant le RCCK2 ; 2°) valider la stratégie de nanothérapie ciblée par hyperthermie
magnétique afin d’éradiquer spécifiquement des cellules tumorales surexprimant le
RCCK2, puis étudier les mécanismes cellulaires impliqués dans la signalisation de mort ;
3°) élaborer des stratégies permettant d’augmenter l’efficacité thérapeutique anti-tumorale.
Dans un premier temps, j‟ai développé une nano-plateforme constituée d‟une
nanoparticule magnétique (NPM) d‟oxyde de fer de type SPION (superparamagnetic iron
oxide nanoparticles). J‟ai élaboré différents lots de NPM présentant différentes densités en
ligand à leur surface et analysé leur capacité de liaison, d‟internalisation et d‟accumulation
dans les lysosomes. Les nanoparticules vectorisées s‟accumulent dans les cellules de façon
dépendante du récepteur (2.2pg de fer/cellule).
J‟ai ensuite cherché à valider la stratégie de nanothérapie ciblée par hyperthermie
magnétique. Pour cela, j‟ai appliqué un champ magnétique alternatif à haute fréquence (275
kHz, 40 mT) sur des cellules ayant ou non internalisé des NPM. L’application du champ
magnétique, induit la mort de 30% des cellules tumorales ayant internalisé des NPM, sans
élévation détectable de température du milieu extracellulaire, suggérant que l‟hyperthermie
magnétique serait probablement induite très localement à l‟échelle du lysosome. Nous avons
5
appelé ce phénomène : hyperthermie magnétique intra-lysosomale. Ensuite, j‟ai cherché à
préciser les mécanismes cellulaires pouvant être impliqué dans l‟induction de la mort des
cellules. Mes résultats montrent que l‟application du champ magnétique sur des cellules ayant
accumulé des NPM dans leur lysosome induit une production de radicaux libres oxygénés
(ROS) responsables de la perméabilisation de la membrane lysosomale et conduisant à la
fuite des cystéines protéases lysosomales dans le cytosol, impliqués ainsi dans le mécanisme
de mort par hyperthermie magnétique intra-lysosomale.
Enfin, dans le but d‟augmenter l‟efficacité thérapeutique, j‟ai combiné ce traitement
d‟hyperthermie magnétique intra-lysosomale à un traitement chimiothérapeutique, la
doxorubicine. Les résultats montrent un effet additif des traitements hyperthermique et
chimiothérapeutique. Une telle stratégie de combinaison d’approches thérapeutiques
présente l’avantage d’utiliser des doses faibles d’agent chimiothérapeutique, afin de limiter
les effets secondaires vis-à-vis des cellules saines.
6
ABSTRACT
Endocrine tumors are usually diagnosed through the use of an imaging technique using
a radiolabeled peptide (somatostatin or Osteoscan) whose receptor is present in 80% of
tumors. The CCK2R which belongs to the seven transmembrane domains receptor family is
also overexpressed with a high incidence in endocrine tumors. In addition, our team has
shown that gastrin and cholecystokinin (CCK), both natural agonists of the CCK2R, induce a
massive CCK2R internalization; then the receptor is directed with the ligand to lysosomes to
be degraded.
Our team hypothesized that CCK2R overexpression in endocrine tumors compared to
healthy tissue and its ability to internalize could advantageously be used to develop a new
diagnostic and therapeutic approach.
My thesis project had several objectives: 1) To optimize a magnetic nano-platform
for an effective targeting of tumor cells overexpressing the CCK2R; 2) To validate the
targeted nanotherapy strategy by magnetic hyperthermia to specifically eradicate tumor
cells overexpressing the CCK2R, and study the mechanisms involved in cell death; 3) To
develop strategies in order to increase the anti-tumor therapeutic efficiency.
Firstly, I have developed a nano-platform composed of a SPION (superparamagnetic
iron oxide nanoparticles) type magnetic nanoparticle (MNP). I developed different batches of
MNP with different ligand densities at their surface and analyzed their binding capacity,
internalization and lysosomal accumulation. Targeted nanoparticles uptake is receptor
dependent, reaching a rate of 2.2 pg iron/cell, after 24 hours of incubation.
Thus, I validated the strategy of targeted nanotherapy by magnetic hyperthermia. For
this, I applied a high frequency alternating magnetic field (275 kHz, 40 mT) on cells with or
without internalized MNPs. The application of the magnetic field induces the death of 30%
of tumoral cells having internalized MNPs, without any perceptible temperature rise in the
incubation medium, suggesting that the magnetic hyperthermia would probably be induces
very locally at the scale of the nanoparticules or the lysosome. We called this phenomenon
intra-lysosomal magnetic hyperthermia. Then, I studied the cellular mechanisms involved in
the induction of cell death by intra-lysosomal magnetic hyperthermia. My results showed that
the application of a magnetic field increased the production of reactive oxygen species (ROS),
leading to lysosomal membrane permeabilization and to the leakage of lysosomal enzymes in
7
the cytosol of cells having internalized MNPs, indicating that ROS production and lysosomal
cysteine proteases are involved in the mechanisms of cell death.
Finally, in order to increase the therapeutic efficacy, I combined this intra-lysosomal
magnetic hyperthermia treatment to a chemotherapeutic treatment, the doxorubicin. The
results showed an additive effect of hyperthermia and chemotherapy treatments. This
combining therapeutic strategy presents the advantage of using low doses of
chemotherapeutic agent, in order to decrease the side effects towards healthy cells.
8
Table des matières Introduction Générale .................................................................................................................................................. 15
Introduction Bibliographique ................................................................................................................................... 19
Chapitre I: Les tumeurs endocrines, un groupe de tumeurs rares présentant une surexpression du récepteur CCK2. ................................................................................... 20
A. Propriétés communes et modalités thérapeutiques des tumeurs neuroendocrines .... 20 A.1. Définition et propriétés communes ...................................................................... 20 A.2. Techniques de diagnostic des tumeurs neuro-endocrines .................................... 21
A.2.1. Diagnostic par imagerie ............................................................................. 21 A.2.2. Diagnostic par Anatomophathologie ......................................................... 22
A.3. Thérapie actuelles des tumeurs neuroendocrines ................................................. 24 A.3.1. Chirurgie .................................................................................................... 24 A.3.2. Traitement médicales anti-sécrétoires ........................................................ 24 A.3.3. Chimiothérapie ........................................................................................... 26 A.3.4. Radiothérapie ............................................................................................. 26
B. Le récepteur CCK2 .................................................................................................... 27 B.1. La structure du récepteur CCK2 ......................................................................... 27 B.2. Deux ligands naturels du RCCK2 ...................................................................... 27 B.3. Les voies de signalisation du RCCK2 ................................................................ 32 B.4. Internalisation et devenir du récepteur dans la cellule ....................................... 34 B.5. Distribution tissulaire et les implications physiologiques .................................. 36
B.5.1. Distribution tissulaire au niveau du système digestif ................................. 36 B.5.2. Distribution tissulaire au niveau du système nerveux central .................... 37
B.6. Le récepteur CCK2 dans le cancer ....................................................................... 37 B.6.1. Rôle dans la carcinogenèse ........................................................................ 37 B.6.2. Les radio-ligands développés pour des buts thérapeutiques et diagnostiques ................................................................................................................................ 39
Chapitre II: Une plateforme diagnostique et thérapeutique « les nanoparticules » .... 42 A. Généralité sur les nanoparticules ............................................................................... 42
9
A.1. Les différents types de nanoparticules développées pour les applications biomédicales. ................................................................................................................. 42
A.1.1. Nanoparticules organiques ......................................................................... 43 A.1.2. Nanoparticules inorganiques ...................................................................... 45 A.1.3. Les nanoparticules d‟oxyde de fer ............................................................. 46
A.1.3.1. L‟influence des caractéristiques physico-chimiques sur la biodistribution des nanoparticules. ..................................................................... 46 a) Adressage passif .......................................................................................... 46
a.1. Le système réticulo-endothélial (RES) ............................................... 48 a.2. Effet EPR (Enhanced Permeability and Retention) ............................ 50 a.3. Ciblage par aimantation ...................................................................... 50
b) Adressage actif ............................................................................................ 50 c) Devenir intracellulaire des nanoparticules .................................................. 53
B. Les applications biomédicales des nanoparticules magnétiques ............................... 54 B.1. Imagerie: Nanoparticules à vocation diagnostique ............................................... 54 B.2. Les nanoparticules: Inducteurs d‟hyperthermie ................................................... 55
B.2.1. Le concept d‟hyperthermie ......................................................................... 55 B.2.2. Mécanismes d‟échauffements des nanoparticules magnétiques ................ 56 B.2.3. L‟hyperthermie in vitro .............................................................................. 59 B.2.4. L‟hyperthermie in vivo ............................................................................... 60
a) Validation du concept d‟hyperthermie par injection intra-tumorale ........... 60 b) Hyperthermie par injection intraveineuse ................................................... 61 c) Les limitations de l‟hyperthermie in vivo ................................................... 62
B.2.5. Mécanismes de mort induit par l‟hyperthermie magnétique : principe et voie d‟induction ..................................................................................................... 64
B.3. Nanoparticules: Des véhicules pour la chimiothérapie ...................................... 67 Chapitre III : La mort cellulaire ....................................................................................... 70
A. L‟apoptose ................................................................................................................. 70 A.1. Caractéristiques de la cellule apoptotique ............................................................ 70 A.2. Les voies d‟induction de l‟apoptose ..................................................................... 71
A.2.1. La voie des récepteurs de mort, « voie extrinsèque » ................................ 73 A.2.2. La voie mitochondrial, « voie intrinsèque » .............................................. 75
A.3. Le mode d‟activation des caspases ....................................................................... 77 B. Les différents types de mort non-apoptotique ........................................................... 78
B.1. La nécrose ............................................................................................................ 78 B.1.1. Caractéristiques de la cellule nécrotique .................................................... 79
10
B.1.2. La voie d‟induction de la nécrose .............................................................. 82 B.2. L‟autophagie ......................................................................................................... 84
B.2.1. Caractéristiques de la cellule autophagique ............................................... 84 B.2.2. La voie d‟induction de l‟autophagie ........................................................... 86
B.3. La pyroptose ......................................................................................................... 88 B.3.1. Caractéristiques de la cellule en pyroptose ................................................ 88 B.3.2. La voie d‟induction de la pyroptose ........................................................... 90
C. Compartiment lysosomale et mort cellulaire ............................................................. 90 C.1. Les lysosomes ....................................................................................................... 90 C.2. La perméabilisation de la membrane lysosomale (LMP) ..................................... 92
C.2.1. Les inducteurs du LMP .............................................................................. 92 a) La déstabilisation lysosomale médiée par les radicaux libres oxygénés (ROS) ................................................................................................................. 92 b) Les détergents lysosomotropes ................................................................... 93
C.2.2. Les cathepsines ........................................................................................... 94 C.3. L‟implication des lysosomes dans la mort cellulaire ............................................ 95
C.3.1. Rôle des lysosomes dans la cascade apoptotique ....................................... 95 C.3.2. Rôle des lysosomes dans la pyroptose ....................................................... 96
Résultats Et Discussion ............................................................................................................................................... 99
PARTIE I ...................................................................................................... 100 Preuve de concept de nanothérapie ciblée par hyperthermie magnétique .... 100 Targeting G- Protein- Coupled Receptor Overexpressed in Endocrine Tumors by Magnetic Nanoparticles to Induce Cell Death ........................................ 103 PARTIE II..................................................................................................... 121 Etude des mécanismes conduisant à la mort des cellules par hyperthermie magnétique.................................................................................................... 121 Real-Time Analysis of Magnetic Hyperthermia Experiments on Living Cells under a Confocal Microscope ...................................................................... 124 PARTIE III ................................................................................................... 142 Améliorer l‟efficacité thérapeutique en associant l‟hyperthermie magnétique à un traitement chimiothérapeutique ............................................................... 142 Combination of magnetic intra-lysosomal hyperthermia and doxorubicin treatment increase eradication efficiency of endocrine tumoral cells ......... 145
Conclusions Générales Et Perspectives .......................................................................................................... 174
Bibliographie ................................................................................................................................................................ 181
11
LISTE DES ABREVIATIONS
AP-2
ARNm
AGS
AIF
Apaf-1
ASC
AIM
AMF
ATG
Bid
Bcl-2
CdSe
CdS
CD
CgA
CCK
CMT
CNC
CCK2Ri4sv
C-Flip
CARD
CDA
Dox
DAG
DTPA
DOTA
DAMP
DRAM
DAPI
Adapter protein-2
ARN messager
Adenocarcinoma Gastrique Humain
Apoptosis-Inducing Factor
Apoptotic protease activating factor-1
Adapter protein
Interferon-Inductible Protein
Alternating Magnetic Field
Autophagy related gene
BH3 interacting domain death agonist
B-cell lymphoma-2
Sélénuire de cadmium
Sulfure de cadmium
Cellules dendritiques
Chromogranine A
Cholécystokinine
Cancer médullaire de la thyroïde
Complexe de Carney
intron 4 containing splice variant
Cellular FLICE-inhibitory
Caspase Recruitment Domain
Caspase activated DNase
Doxorubicine
Diacylglycérol
di-éthylène-tri-amino penta-acétique
tétra-aza-cyclododécane-tétra-acétique
Damage/Danger-Associated Molecular Patterns
Damage regulated autophagy modulator
4, 6-diamidino-2-phénylindole
12
DD
DR
DISC
DED
DFF40
DFF45/ICAD
DTPA
EPR
EGF
ERK
ECL
Endo-G
Fas
FADD
GDNF
GIST
GLP-1
GIP
GRK
HER2
IP3
IRS-1
ICL3
IRM
In
INF-α
IV
IP
IAP
JAK
JNK
LAR
Death Domain
Death Receptor
Death Inducing Signaling Complex
Death Effector Domain
DNA Fragmentation Factor
DNA Fragmentation Factor 45/ Inhibitor of CAD
di-éthylène-tri-amino penta-acétique
Enhanced Permeability and Retention effect
Epidermal Growth Factor
Extracellular Signal-Regulated Kinase
Entrochromaffin Cell like
Endonucléase G
Fatty acid Synthase
Fas Associated Death Domain
Glialcell line-Derived Neurotrophic Factor
Tumeurs Stromales Gastrointestinales
Glucagon-Like Peptide 1
Glucose-dependent Insulinotropic Peptide
G protein Coupled receptor Kinase
Human Epidermal growth factor Receptor 2
Inositol triphosphate
Insulin Receptor Substrate 1
3éme boucle intracellulaire
Imagerie par Résonnance Magnétique
Indium
Interféron alfa
Intraveineuse
Iodure de Propidium
Inhibitor of Apoptosis Protein
Janus Kinase
C-jun N-terminal Kinase
Long acting release
13
LHRH
LMP
LDH
LAMP
LIMP
MTS
MEN
MTC
MDR-1
MAPK
MG11
MET
MTT
MOMP
mTOR
MIBG
NLS
NMP
NF1
NLR
OMS
OMI/HtrA-2
PEG
PAMAM
PPI
PRKAR1A
Pgp
PLC
PIP2
PKC
PI3K
PARP1
PIKK
Luteinizing hormone releasing hormones
Lysosomal membrane permeabilization
Lactate déshydrogénase
Lysosomal-associated membrane protein
Lysosomal-integral membrane protein
séquences de localisation mitochondriale
néoplasie endocrinienne multiple
Medullary Thyroid Carcinoma
multidrug resistance
Mitogen-Activated Protein kinase
Minigastrine
microscopie électronique à transmission
bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium
mitochondrial outer membrane permeabilization
mammalian Target of Rapamycin
Méta-iodobenzylguanidine
Séquence de localisation nucléaire
nanoparticules magnétique
neurofibromatose de Reckinghause
Nod-Like receptor
Organisation mondiale de la santé
HtrA serine peptidase-2
Polyéthylène Glycol
Polyamidoamine
Polypropylène imines
Protein Kinase A regulatory subunit type 1alpha
glycoprotéine P
phospholipase C
Phosphatidylinositol 4, 5-biphosphoate
Protéine Kinase C
phosphatidylinositol 3-Kinase
poly (ADP-ribose) polymérase-1
phosphatidylinositol related kinase
14
ROS
RES
RCPG
RGD
RCCK2
RET
RAS
RAF
RIP
RE
RTM
SRS
sst2
Src
SPION
SAR
Smac/DIABLO
TDM
TEP
TRPV
TUNEL
TdT
TNL3
TNF
TNFR
TRADD
TRAIL
t-Bid
UTP
VIPomes
VHL
ΔΨm
radicaux libres oxygénés
Système Réticulo-endothélial
Récepteur couples à la protéine G
Arginine-Glycine-Aspartic acid
Récepteur à la cholécystokinine
Rearranged During Transfection
Rat Sarcoma
Rapidly Accelerated Fibrosarcoma
Receptor Interacting Protein Kinase
Réticulum Endoplasmique
récepteur transmembranaire
Scintigraphie des récepteurs de la somatostatine
Somatostatine
Sarc
Superparamagnetic Iron Oxyde Nanoparticules
Specific Absorption Rate
Second mitochondria-derived activator of caspase/ Direct IAP
Binding protein with LOw PI
Tomodensitométrie
Tomographie par emission de positions
Transient Receptor Potential Vanilloide
Terminal deoxynucleotidyl Transferase d‟UTP nick end labeling
Terminal deoxynucleotidyl Transferase
Toll-Like 3 receptor
Tumor necrosis Factor
Tumor necrosis Factor Receptor
TNF Receptor Associated Death
TNF-related apoptosis inducing ligand
Bid tronqué
deoxy-uridine triphosphate
Vasoactive Intestinal Peptide
Von-Hippel-Lindau
Potentiel transmembranaire mitochondrial
15
Introduction
Générale
16
Le domaine de la cancérologie est confronté à de nombreuses limites diagnostiques
dus à un manque de marqueurs et de techniques permettant la détection précoce des cancers,
mais aussi à des limites thérapeutiques dues à un arsenal thérapeutique anti-cancéreux réduit.
La thérapie des tumeurs neuroendocrines repose actuellement sur la chirurgie, en l‟absence
d‟invasion ou de dissémination. Or dans la moitié des cas, elles sont diagnostiquées
tardivement ce qui implique la présence des métastases et réduit l‟efficacité curative de la
chirurgie. Des traitements chimiothérapeutiques sont alors associés à la chirurgie, mais avec
une efficacité thérapeutique limitée.
Les tumeurs neuroendocrines sont caractérisées par une surexpression de récepteurs
peptidiques par rapport aux tissus normaux. Cette découverte a suscité l‟intérêt des chercheurs
ces dernières années. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) occupent une place
prépondérante. En effet, les RCPG sont la cible de 30 à 40% des médicaments actuellement
sur le marché du fait de leurs rôles dans la régulation des différents processus physiologiques
et physiopathologiques. Aujourd‟hui, des ligands peptidiques radiomarqués sont utilisés afin
de cibler un récepteur largement surexprimé par ces tumeurs, le récepteur de «la
somatostatine», pour le diagnostic par scintigraphie et la radiothérapie. Dans notre laboratoire,
les efforts se sont concentrés sur la pharmacologie et l‟implication tumorale du récepteur de la
gastrine, le RCCK2. Plusieurs études suggèrent que la gastrine, agoniste sélectif du RCCK2,
est un facteur de croissance dans les cancers gastro-intestinaux humains via un effet
promoteur sur la progression de lésions précancéreuses. De plus, le RCCK2 est surexprimé
dans les tumeurs endocrines et dans plusieurs cancers digestifs. Donc, le RCCK2 constitue
une autre cible de choix pour le diagnostic et la thérapie de ces tumeurs. En effet, des
analogues radio-marqués de ses ligands, la gastrine et la CCK, sont en cours d‟évaluation
préclinique et clinique, et ont produit des résultats encourageants. D‟autre part, les ligands
naturels du RCCK2, la gastrine et la CCK, induisent une internalisation rapide et massive du
RCCK2 dépendante de la voie bêta-arrestine.
Les nanotechnologies suscitent de grande espérance pour la médecine moderne et
notamment pour la lutte contre le cancer. En particulier, l‟utilisation des nanoparticules et
plus particulièrement des nanoparticules magnétiques, s‟avère très prometteuse pour les
applications biomédicales. En effet, les nanoparticules magnétiques possèdent des propriétés
intrinsèques uniques qui en font de puissants outils pour l‟imagerie et la thérapie thermique.
Les nanoparticules d‟oxyde de fer sont actuellement utilisées comme agent de contraste afin
d‟améliorer la sensibilité du diagnostic des cancers par IRM. De plus, les nanoparticules
17
magnétiques offrent une opportunité thérapeutique prometteuse: l‟hyperthermie magnétique.
Elles offrent également un avantage supplémentaire permettant de combiner un traitement par
hyperthermie et chimiothérapeutique. De nombreuses équipes de recherche tentent
aujourd‟hui d‟optimiser les propriétés physico-chimiques, afin d‟améliorer la biodistribution
et l‟efficacité de ciblage des nanoparticules. Plusieurs études montrent que la stratégie de
vectorisation qui correspond à l‟ajout de ligands ou d‟anticorps à la surface des nanoparticules
permet de les adresser de façon spécifique aux tissus cancéreux.
Nous avons formulé l‟hypothèse que la surexpression et l‟activation des voies
d‟endocytose du RCCK2 dans les tumeurs endocrines pouvaient être avantageusement
utilisées pour développer une nouvelle approche thérapeutique, basée sur l‟emploi de
nanoparticules magnétiques vectorisées par la gastrine, ligand sélectif du RCCK2. Cette
vectorisation devrait permettre le ciblage des cellules tumorales dans le but de les éradiquer
lorsqu‟elles sont soumises à un champ magnétique alternatif à haute fréquence.
Dans mes travaux de thèse, nous avons réussi à développer un système permettant de
cibler spécifiquement les cellules cancéreuses surexprimant le RCCK2, grâce à la
vectorisation de ces nanoparticules magnétiques avec le ligand spécifique de ce récepteur, la
gastrine. Les mécanismes impliqués dans l‟internalisation de ce système, et le potentiel
thérapeutique de ces nanoparticules sous le champ magnétique, ont été étudiés. D‟autre part,
mes résultats montrent que le champ magnétique (40 mT, 275kHz) induit spécifiquement la
mort de 30% des cellules tumorales ayant internalisé des nanoparticules magnétiques sans
élévation perceptible de la température.
Nous avons ensuite cherché à disséquer les mécanismes impliqués dans le processus
de mort. Ces travaux ont conduit à la découverte de l‟implication de la voie lysosomale.
Cependant, l‟approche thérapeutique d‟hyperthermie magnétique n‟a permis d‟éradiquer que
30% des cellules tumorales. En combinant ce traitement à un agent chiomothérapeutique,
nous avons augmenté l‟efficacité d‟éradication des cellules tumorales.
Le manuscrit de thèse s'articulera en trois parties. La première partie sera consacrée à
une étude bibliographique visant à définir le contexte scientifique des travaux. Nous
exposerons dans le chapitre I une synthèse des différentes techniques diagnostiques et
thérapeutiques des tumeurs endocrines, et une présentation du récepteur RCCK2 qui fera
l‟objet de notre étude. Le chapitre II exposera les connaissances actuelles concernant les
18
nanoparticules magnétiques. Enfin, nous présenterons dans le chapitre III les différents types
de mort cellulaire et le rôle du compartiment lysosomal dans ce processus.
La seconde partie présentera les résultats obtenus durant mes travaux de thèse. La
troisième partie traitera les perspectives du projet.
19
Introduction
Bibliographique
20
Chapitre I: Les tumeurs endocrines, un groupe de tumeurs rares
présentant une surexpression du récepteur CCK2.
A. Propriétés communes et modalités thérapeutiques des tumeurs neuroendocrines
A.1. Définition et propriétés communes
Les tumeurs neuro-endocrines sont des tumeurs rares qui représentent 0.5% de
l‟ensemble des tumeurs. L‟incidence des tumeurs neuroendocrines est d‟environ 2 cas pour
100 000 habitants par an.
Les tumeurs endocrines forment un groupe hétérogène de tumeurs exprimant,
synthétisant, stockant et sécrétant des produits hormonaux communs aux neurones et aux
cellules endocrines. On distingue les tumeurs fonctionnelles présentant un syndrome clinique
de sécrétion hormonale (insulinomes) et les tumeurs non-fonctionnelles. Les tumeurs neuro-
endocrines peuvent être dispersées dans l‟ensemble de l‟organisme. Elles siègent
majoritairement dans le tube digestif (60,9% : intestin, pancréas, estomac), dans les poumons
(27,4%), et peuvent présenter des localisations moins fréquentes comme la thyroïde, thymus,
foie, utérus, l‟hypophyse, vésicules biliaires [1], [2]. Concernant les tumeurs digestives, les
plus fréquentes sont les tumeurs neuroendocrines bien différenciés sécrétrices de sérétonine
qui représentent 75% des cas, puis les insulinomes, les gastronomes et les glucagonomes par
échelle d‟incidence, tandis que les VIPomes (Vasoactive Intestinal Peptide) et les
somatostatinomes sont très rares [3]. De plus, les tumeurs endocrines présentent une grande
variété de grades histologiques.
La dernière classification OMS (2010) des tumeurs neuro-endocrines comporte cinq
catégories : les tumeurs neuroendocrines G1, les tumeurs neuroendocrines G2, les carcinomes
neuroendocrines à petites cellules, les carcinomes neuroendocrines à grandes cellules et les
carcinomes mixtes adéno-neuroendocrines [4].
La grande majorité des tumeurs neuro-endocrines sont sporadiques, mais elles peuvent
également se développer dans un contexte héréditaire de néoplasie endocrinienne multiple
(MEN). Il existe plusieurs syndromes de MEN impliqués dans l‟apparition de tumeurs
neuroendocrines héréditaires: MEN I, MEN II ; la maladie Von-Hippel-Lindau (VHL), la
neurofibromatose de Recklinghausen (neurofibromatose de type 1 ou NF1) et le complexe de
Carney (CNC). La plupart des prédispositions au développement d‟une tumeur neuro-
endocrine a été corrélée à l‟inactivation de gènes suppresseurs de tumeur (les gènes Men1
codant pour la menin, VHL, NF1 et CNC1 ou PRKAR1A (protein kinase A regulatory
21
subunit type 1 alpha), sauf dans le cas de MEN II qui provient de l‟activation dominante du
proto-oncogène RET (rearranged during transfection) codant pour un récepteur à activité
tyrosime kinase (Récepteur GDNF : glial cell line-derived neurotrophic factor) [5].
A.2. Techniques de diagnostic des tumeurs neuro-endocrines
A.2.1. Diagnostic par imagerie
L‟imagerie conventionnelle joue un rôle important dans le dépistage de la tumeur
primitive. Elle s‟appuie sur l‟échographie endoscopique, la tomodensitométrie ou l‟imagerie
par résonance magnétique [6]. Cependant, elle reste limitée dans le dépistage de certaines
tumeurs comme les tumeurs digestives.
L‟échographie endoscopique constitue une technique avancée d‟imagerie
conventionnelle. Elle présente une bonne sensibilité de 87% et elle permet le diagnostic des
tumeurs pancréatiques de petite taille (quelque millimètre de diamètre) [7]. Elle permet un
diagnostic sensible des tumeurs pancréatiques qui exprime peu le récepteur à la somatostatine
(insulinomes).
La tomodensitométrie (TDM) est un procédé d'étude des tissus, utilisant des rayons X
qui permet l‟acquisition de coupes fines et multiphasiques amenant à une excellente
visualisation de la muqueuse digestive [6].
L‟imagerie par résonance magnétique (IRM) est également une approche utilisée pour
la détection des tumeurs endocrines. Elle est plus sensible que la tomodensitométrie pour la
détection des métastases hypervascularisées grâce à son excellente résolution en contraste [8].
Cependant l‟imagerie conventionnelle peut atteindre ses limites pour le diagnostic des
tumeurs neuroendocrines, il devient nécessaire de développer d‟autres techniques d‟imagerie.
L‟imagerie isotopique s‟appuie sur les données fonctionnelles et moléculaires
permettant ainsi une analyse complémentaire à l‟imagerie conventionnelle et souvent
déterminante pour établir le diagnostic des tumeurs endocrines. Elle consiste à administrer à
un patient un traceur radioactif permettant la détection des tumeurs et d‟éventuelles
métastases. Parmi les techniques d‟imagerie isotopique, on trouve la scintigraphie ou la
tomographie par émission de positions.
La scintigraphie est une technique très sensible, elle repose sur l‟utilisation de radio-
isotopes qui permet la détection de tumeurs de 5 à 10 mm [9]. Le traceur I 123- MIBG (méta-
iodobenzylguanidine) est le premier agent d‟imagerie utilisé pour les tumeurs
22
neuroendocrines. Il est le traceur de référence pour l‟exploration des phéochromocytomes, les
parangliomes et les neuroblastomes ; il peut être également utilisé pour la détection des
tumeurs neuro-endocrines du tube digestif et pancréatiques. La scintigraphie des récepteurs de
la somatostatine (SRS) forme actuellement la technique de référence; l‟expression des
récepteurs de type sst2 (somatostatine 2) a été mise en évidence au niveau de la plupart des
tumeurs neuroendocrines, ce qui permet l‟utilisation de cette propriété pour le diagnostic des
tumeurs neuroendocrines [10]. Le principe est basé sur le ciblage des sst2 à l‟aide d‟un
analogue de la somatostatine, l‟Octreoscan® ayant une affinité élevée pour sst2. La
visualisation des tumeurs en SRS dépend principalement de leur densité en récepteur [11].
La tomographie par émission de positons (TEP) est une autre technique d‟imagerie
isotopique à très fort pouvoir de résolution. Elle utilise un radionucléide isotopique (11C, 13N, 15O, 18F) dont le noyau, en excès de protons, se désintègre vers un état stable en émettant un
électron positif ou « positon ». Ce dernier entre en annihilation avec un électron du milieu
pour émettre deux photons gamma, ce sont ces photons gamma qui constituent le principe de
base de la détection en TEP [12], [13].
A.2.2. Diagnostic par Anatomophathologie
Le diagnostic histologique des tumeurs endocrines repose sur des arguments
histologiques et immuno-histochimiques. Les tumeurs endocrines présentent une architecture
lobulaire avec un stroma très vascularisé. A fort grossissement, les cellules apparaissent
monomorphes, de taille moyenne, avec un noyau à chromatine fine et un cytoplasme riche en
vésicules de sécrétions.
L‟immuno-histochimie est couramment utilisée afin de mettre en évidence les cellules
neuroendocrines normales ou pathologiques, elle caractérise notamment les sécrétions
hormonales. Il existe aujourd‟hui une large gamme de marqueurs biologiques spécifiques,
dont la chromogranine A (CgA) qui est le marqueur le plus utilisé. CgA est une protéine
soluble qui fait partie de la matrice des grains de sécrétion de la plupart des cellules
endocrines. Les anticorps anti-CgA sont des marqueurs très spécifiques des cellules
endocrines normales et tumorales. Toutefois le marquage observé dépend du contenu en
granules de la cellule, d'où un manque de sensibilité dans l'identification de certaines tumeurs
peu différenciées [14]. Parfois, il est nécessaire d‟y associer un second marqueur, la
synaptophysine qui est une glycoprotéine membranaire, présente dans les vésicules
23
présynaptiques des neurones stockant des neuromédiateurs et dans les petites vésicules claires
des cellules neuro-endocrines normales et néoplasiques.
L‟analyse anatomopathologique repose également sur la détermination du profil
hormonal, tels que la sécrétion de sérotonine, calcitonine, gastrine, somatostatine et autres
hormones. Elles sont principalement détectées par immuno-histochimie [14].
Les tumeurs neuroendocrines sont également caractérisées par la surexpression d‟un
certain nombre de RCPG. Des expériences d‟autoradiographie dans les différents types de
tumeurs montrent une surexpression significative et homogène des récepteurs de la
somatostatine (sst) dont le sst2 qui est le sous-type de récepteur prédominant dans ces
tumeurs. Par contre, ces récepteurs sont généralement absents dans les GIST (tumeurs
stromales gastrointestinales) [15]. Le récepteur CCK2 est aussi exprimé en forte densité dans
plusieurs types de tumeurs neuroendocrines, cela sera évoqué en détail dans la section
suivante (section B/ Le récepteur CCK2 : B.6. Le récepteur CCK2 dans le cancer).
Le récepteur GLP-1 (glucagon-like peptide 1) est exprimé avec une très forte densité
dans la quasi-totalité des insulinomes et des gastrinomes [16], [17], [18]. Récemment, les
travaux de notre équipe ont mis en évidence l‟expression du récepteur GIP (glucose-
dependent insulinotropic peptide) dans la quasi-totalité des tumeurs neuroendocrines
pancréatiques, iléales, bronchiques, et dans les insulinomes malins (figure 1) [19].
La surexpression de multiples récepteurs dans les tumeurs neuroendocrines offre
l‟avantage de réaliser un ciblage plurivalent. Le ciblage des récepteurs surexprimés permet
l‟imagerie et la thérapie hautement spécifique de ces tumeurs, grâce à l‟utilisation d‟analogues
radiomarqués de peptides hormonaux possédant une forte affinité avec ces récepteurs [9]. Les
cancers présentant une forte densité de récepteur de la somatostatine, en particulier le sous-
type sst2, sont de bons candidats pour la radiothérapie ciblée. La scintigraphie du récepteur de
la somatostatine (SRS) est actuellement la procédure standard pour la détection des tumeurs
neuroendocrines et de leurs métastases avec des analogues de somatostatine radioactifs
disponibles tels que l‟111 In-DTPA-octreotide. Actuellement, d‟autres récepteurs sont à l‟étude
pour le développement de nouveaux radio-ligands, car la densité en récepteur sst2 est parfois
insuffisante ce qui limite la sensibilité de la SRS pour certaines tumeurs. Ces radioligands
ciblent notamment les récepteurs GLP-1, GIP [20], [21], [19]. Le récepteur CCK2 apparait un
bon candidat pour la scintigraphie car il permettrait la détection de 94% des insulinomes, des
MTC (Medullary Thyroid Carcinoma) [22] et améliorerait la détection des tumeurs
24
neuroendocrines gastro-entéro-pancréatiques [23]. Cette partie sera développée en détail (voir
la partie B.6.2. Les radio-ligands développés pour des buts thérapeutiques et diagnostiques).
A.3. Thérapie actuelles des tumeurs neuroendocrines
A.3.1. Chirurgie
Lorsque les tumeurs neuroendocrines sont diagnostiquées à un stade localisé et en
absence de métastases, la chirurgie est l‟unique traitement curatif de ces tumeurs. Dans le cas
de métastases, l‟intervention chirurgicale doit être réalisée après contrôles d‟éventuelles
hypersécrétions hormonales qui sont essentiels pour éviter des complications majeures en
chirurgie [24].
A.3.2. Traitement médicales anti-sécrétoires
Le traitement médical anti-sécrétoire est un préalable nécessaire à la prise en charge
des tumeurs neuroendocrines fonctionnelles. Il s‟agit de contrôler la synthèse hormonale et de
diminuer les manifestations cliniques. Dans ce but, les analogues de la somatostatine sont les
plus utilisées. Les inhibiteurs de la pompe à protons, dans le cas des gastrinomes, et les
interférons-α (INF-α) sont également employés [25].
Les analogues de la somatostatine jouent un rôle-clef car ils diminuent l‟intensité des
symptômes dus à l‟hypersécrétion hormonale [26]. En effet, la somatostatine est un inhibiteur
de la sécrétion de nombreuses hormones du tractus digestif telles que la gastrine, la
cholécystokinine, le GIP et la sécrétine. L‟octreotide est un analogue de la somatostatine qui
permet ainsi de réduire 72% des symptômes liés à l‟hypersécrétion. Mais cet homologue
présente une demi-vie courte [27]. On dispose aujourd‟hui d‟analogues plus stables et
puissants comme le lanreotide, l‟octréotide LAR (« long acting release »), le lanréotide MP, le
pasiréotide [28]. Ces molécules permettent une amélioration symptomatique et biochimique
de 80% des patients atteints de VIPome (Vasoactive Intestinal Peptide) et de 50% des patients
atteints d‟insulinome qui expriment le récepteur sst2 [28].
Néanmoins, ces analogues présentent un faible effet anti-proliferatif, une
immunogénicité non négligeable et des effets secondaires indésirables (douleurs abdominales,
crampes, constipation), d‟où la nécessité de se tourner vers des traitements
chimiothérapeutiques [28].
25
Figure 1: Incidence et densité de RCPG dans les tumeurs endocrines
La densité moyenne des récepteurs dans les tumeurs neuroendocrines. Les valeurs supérieures à 5000 dpm/mg de tissu sont représentées par un histogramme noir. (A) dans l‟intestin moyen, (B) dans les insulinomes, (C) dans les gastrinomes [29].
26
A.3.3. Chimiothérapie
En générale, les tumeurs endocrines sont peu sensibles à la chimiothérapie. Cela peut
être dû, en premier lieu au faible index mitotique qui caractérise ces tumeurs et l‟utilisation
d‟agents chimiothérapeutiques visant les cellules présentant une prolifération rapide. En
second lieu, les tumeurs neuroendocrines sur-expriment des gènes de résistance aux
médicaments MDR-1 (multidrug resistance) codant la glycoprotéine P (Pgp) ; des protéines
d‟efflux qui sont capables d‟excréter un grand nombre de molécules anti-cancéreuses [2].
Dans le cas des tumeurs bien différenciées avec une métastase évolutive, la
chimiothérapie de référence pour une tumeur extra-pancréatique est la combinaison des
traitements streptozocine et 5-fluorouracile et/ou doxorubicine. Des études récentes suggèrent
que le taux de réponse atteint 40% [30].
Pour les carcinomes neuroendocrines peu différenciées et métastasiques, le traitement
actuel associe le cisplatine et l‟étoposide. Le taux de réponse atteint 40 à 60% des patients et
la médiane de survie est 20 mois maximum [31].
Pour le phéochromocytome (tumeur médillo-surrénale), le traitement associe le
cyclophosphamide, la vincristine et la docarbazine. Il permet une régression tumorale et une
maîtrise du syndrome d‟hypersécrétion dans 50% des cas. Le sunitib serait aussi une option
envisageable (tableau 1) [24].
Le tableau 1 ci-après présente une synthèse des options thérapeutiques envisageables
en première et seconde intention, ainsi qu‟un certain nombre de nouvelles thérapies en cours
d‟évaluation préclinique ou clinique.
A.3.4. Radiothérapie
La radiothérapie métabolique consiste à irradier des cibles tumorales au moyen des
molécules radioactives comportant des radionucléides émetteurs de rayonnement β ; ces
molécules radioactives sont sélectionnées pour cibler spécifiquement ou préférentiellement les
cellules tumorales.
Comme pour le diagnostic, la surexpression des RCPG par les tumeurs endocrines est
avantageusement utilisée pour délivrer localement une dose de radiation à visée
thérapeutique. Les tumeurs neuroendocrines exprimant souvent une forte densité de récepteur
à la somatostatine, en particulier le sous-type sst2, le ciblage de ce récepteur par des
analogues radiomarqués est également en applications thérapeutiques [32].
27
Plusieurs radioéléments ont été ainsi commercialisés pour de telles applications
thérapeutiques. L‟octréatate [177 Lu- DOTA, Tyr 3] est le composé le plus récent: il montre
une bonne efficacité sur les tumeurs gastro-entéro-pancréatique [33]. Cependant, une toxicité
des analogues de la somatostatine radiomarqués a été observée au niveau des reins : cette
toxicité est liée au complexe chélateur-radionucléide qui s‟accumule dans les tubules
proximaux des reins et l‟énergie dispersée par le radionucléide devient alors toxique pour les
cellules rénales [34].
Enfin, l‟hétérogénéité des fixations tumorales liées à une insuffisance d‟expression ou
à une accessibilité réduite du récepteur cible (mauvaise vascularisation de la tumeur réduisant
l‟accumulation du radionucléide par la tumeur) constituent des limites face à la radiothérapie
métabolique.
B. Le récepteur CCK2
B.1. La structure du récepteur CCK2
Le récepteur CCK2 (RCCK2) appartient à la famille des RCPG et il présente sept
segments hydrophobes, correspondant à des domaines transmembranaires, avec deux
extrémités : N-terminale extracellulaire et C-terminale intracellulaire [35]. Chez l‟homme, le
gène est localisé sur le chromosome 11 (au niveau du locus p15.4); il est composé de cinq
exons et de quatre introns ; il code pour une protéine de 447 acides aminés avec une masse
moléculaire de 48 KDa ( figure 2) [36].
B.2. Deux ligands naturels du RCCK2
Deux types de récepteurs de la CCK ont été découverts : le RCCK1 et le RCCK2. Le
RCCK2 présente une homologie de 50% avec le RCCK1. Ces récepteurs possèdent deux
ligands naturels, la CCK et la gastrine. Le RCCK1 lie la CCK sulfatée avec une affinité 500 à
1000 fois supérieure à celle de la gastrine [37]. Par contre, le RCCK2 lie la CCK et la gastrine
avec des affinités similaires [38].
En 1964, Gregory et Tracy ont identifié et caractérisé la gastrine comme un
polypeptide de différentes longueurs (34 et 17 acides aminés) à partir de la muqueuse antrale
de porc (figure 3b) [39]. La Cholécystokinine (CCK) a été caractérisée par Mutt et Jorps en
1968 comme un peptide de 33 acides aminés [40]. Bien que la gastrine et la cholécystokinine
partagent une séquence C-terminale pentapeptidique commune (Gly-Trp-Met-Asp-PheNH2)
nécessaire à leur activité biologique, ces hormones dérivent de deux gènes et précurseurs
différents [41], [42].
28
La synthèse de la gastrine est assurée chez l‟homme par les cellules G de la muqueuse
de l‟antre pylorique et du duodénum [41], [43]. Cette hormone est synthétisée sous la forme
d‟un précurseur « la préprogastrine » qui comporte 101 acides aminés, la maturation de ce
précurseur se fait par des clivages en progastrine, puis en gastrine de 34 et 17 acides aminés
majoritairement (G34, G17), ou 14 acides aminés (G14). La gastrine présente également des
modifications post-traductionnelles : une sulfatation de la tyrosine en position 6 à partir de
l‟extrémité C-terminale (50% des peptides) et une α-amidation de l‟extémité
carboxyterminale [41], [42]. Notons que l‟activité biologique de la gastrine se situe
principalement dans la partie C-terminale amidée [44].
29
Tableau 1 : Options de chimiothérapie des tumeurs endocrines
TE G1 et G2 (tumeurs endocrines bien différenciées), TE G3 (Tumeurs endocrines peu différenciées), CMT (cancer médullaire de la tyroïde) [30].
30
a)
b)
Figure 2: Représentation schématique du gène et de la protéine du récepteur CCK2 humain.
(a) Représentation schématique du gène du récepteur CCK2 humain localisé sur le chromosome 11. (b) Représentation schématique du récepteur CCK2 humain avec sa séquence d‟acides aminés [45].
31
a)
b)
Figure 3: Séquence de la Cholécystokinine (CCK) et de la gastrine
Ces deux hormones présentent plusieurs formes de différentes longueurs. Elles sont caractérisées par une sulfatation de la totalité des molécules de CCK (a) et de la moitié des molécules de gastrine (b), ainsi que par l‟amidation de l‟extrémité carboxy-terminale [43].
32
La choléscystokinine est sécrétée par des cellules I au niveau de la muqueuse
duodénale [46], par des cellules corticotrophes et mélanotrophes de la glande pituitaire, dans
les cellules médullaires surrénales. Cette hormone neuropeptidique est également synthétisée
par des neurones au niveau du tractus gastro-intestinal. Elle est très abondante au niveau du
système nerveux central, en particulier dans les aires corticales et dans les neurones
dopaminergiques mésencéphaliques [42]. Cette hormone est synthétisée sous forme d‟un
précurseur « préproCCK » de 115 acides aminés subissant plusieurs étapes de modifications
post-traductionnelles : plusieurs clivages et une sulfatation de la tyrosine en position 7 à partir
de l‟extrémité C-terminale (figure 3a). Plusieurs formes de CCK résultant de la maturation
post-traductionnelle sont physiologiquement présentes dans le sang : CCK-58, CCK-33,
CCK-22, CCK-8 [41], [42], [43].
B.3. Les voies de signalisation du RCCK2
Nous avons expliqué dans la section (B.1 la structure du récepteur CCK2) que le
récepteur CCK2 appartient à la famille des RCPG. La liaison de ces agonistes, conduit donc
notamment à l‟activation des voies de signalisation intracellulaires dépendantes des protéines
G (figure 4).
La liaison des ligands naturels, la CCK ou la gastrine sur le RCCK2 est capable
d‟activer les phospholipases PLCβ et PLCγ1 qui hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5-
biphosphates (PiP2) en inositol triphosphate (IP3) et diacylglycérol (DAG). L‟IP3 produit
participe à la mobilisation du calcium dans le cytosol [47], [48], et le DAG active plusieurs
isoformes de protéine kinase C (PKC) qui régulent les voies de signalisation des MAPK
(Mitogen-Activated Protein Kinase) : ERK1/2 (Extracellular Signal-Regulated Kinase), JNK
(c-jun N-terminal Kinases), ERK5, et p38MAPK [43]. La cascade de phosphorylation
Ras/Raf/ERK-Kinases/ERK1/2 conduit à la régulation de la prolifération, la différentiation, la
survie ou l‟apoptose cellulaire [49].
Le RCCK2 active également la voie Src. La phosphorylation de la protéine adaptatrice
IRS-1 par Src conduit à l‟activation de la PI3-Kinase (Phosphatidylinositol 3-Kinase) qui
phosphoryle les phosphatidylinositols. Cette voie régule la prolifération (effets prolifératifs et
anti-apoptotique), l‟adhésion et la migration cellulaire [43], [49],[50], [51].
33
Figure 4: Représentation schématique de la signalisation du RCCK2
Le récepteur CCK2 stimulé active un grand nombre d‟effecteurs cellulaires appartenant à différents voies de signalisation comme la voie PLC, MAPKinases, PI3-Kinases ou encore la voie JAK/STAT3 [43].
34
Des travaux réalisés dans l‟équipe ont montré que la régulation de la prolifération
cellulaire par le RCCK2 implique également la voie JAK/STAT3 [52], [53]. Après
recrutement par le RCCK2 activé, les protéines JAK (Janus Kinase) s‟activent par
autophosphorylation, puis phosphorylent les facteurs de transcription STAT (Signal
Transducers and Activators of transcription).
B.4. Internalisation et devenir du récepteur dans la cellule
Le RCCK2 est rapidement internalisé après stimulation par ses agoniste, comme la
plupart des RCPG. L‟une des voies majeures d‟internalisation est la voie dite dépendante de
la clathrine. Une étude publiée en 1997 et une deuxième étude récente réalisée au sein de
notre équipe décrivent les mécanismes impliqués dans l‟internalisation du RCCK2 [54],[55].
Suite à sa stimulation par la gastrine ou la CCK, le récepteur s‟internalise avec son
ligand rapidement et de façon abondante (92% des récepteurs). Le mécanisme
d‟internalisation débute par la désensibilisation du récepteur qui implique notamment la
phosphorylation par les GRK (G protein-coupled receptor Kinase) sur de résidus sérines et
thréonines situées dans les domaines intracellulaires et l‟extrémité C-terminale du récepteur
[56]. La phosphorylation du récepteur permet une liaison directe des protéines β-arrestines 1
et 2 au récepteur, entraînant le découpage de la protéine G [54], [55]. Puis les β-arrestines
engagent le récepteur dans le processus d‟endocytose grâce au recrutement de la clathrine et
l‟adaptateur AP-2 [56]. Toutefois, des travaux de l‟équipe suggèrent qu‟une interaction
directe entre AP-2 et le récepteur ou l‟intervention de la voie des cavéoles peuvent être des
mécanismes alternatifs dans le cas d‟absence des β-arrestines (figure 5) [55].
Les RCPG internalisés rejoignent ensuite la structure vésiculaire «endosome précoce»,
où s‟effectue le tri entre les récepteurs destinés au recyclage et ceux destinés à la dégradation
[57]. Deux classes de RCPG ont été définies : les RCPG de classe A qui s‟engagent dans une
voie de recyclage rapide et les RCPG de classe B qui sont orientés vers une voie de recyclage
lente ou vers la dégradation dans les lysosomes [58], [59]. Des travaux menés dans l‟équipe
montrent que le RCCK2 est majoritairement orienté vers une voie de dégradation, dans les
lysosomes et que le recyclage du RCCK2 est faible et lent [55], [60], [61]. Le RCCK2
appartient donc à la Classe B des RCPG [55].
35
Figure 5: Représentation de l’internalisation des RCPG par la voie dépendante de la clathrine
Une stimulation du RCPG par son ligand induit l‟activation de la protéine G, le GRK phosphoryle l‟extrémité C-terminale du récepteur. Le β-arrestine se lie et recrute les composants de la machinerie d‟endocytose tels AP2 et la clathrine. Après internalisation, le récepteur est soit dégradé dans les lysosomes soit recyclé à la membrane plasmique [62].
36
B.5. Distribution tissulaire et les implications physiologiques
B.5.1. Distribution tissulaire au niveau du système digestif
L'estomac est l'une des cibles principales de la gastrine, et plusieurs des fonctions
physiologiques de l'hormone ont été bien caractérisées dans cet organe. La gastrine est
produite dans les cellules G de l‟antre gastrique; elle stimule la sécrétion d'acide gastrique par
les cellules pariétales de la paroi de l‟estomac [63]. De plus, les résultats réalisées sur des
souris dans lesquelles le gène de la gastrine a été supprimé ou surexprimé, montrent un rôle
important de l‟hormone dans le contrôle de la prolifération, la différenciation et la maturation
des différents types cellulaires de l'estomac. Des études réalisées chez l‟homme et le chien ont
montré que le RCCK2 est exprimé majoritairement dans la muqueuse fundique, notamment
dans les cellules pariétales [63] et les cellules ECL (cellule enterochromaffin-like) [64]. La
gastrine se lie au récepteur CCK2 des cellules ECL et induit la libération d‟histamine. Une
fois libérée, l‟histamine stimule de manière paracrine les cellules pariétales qui sécrètent
l‟acide chlorhydrique.
Dans le pancréas endocrine humain, la localisation du RCCK2 reste encore
controversée [43]. Les cellules à glucagon ont été signalées être le principal site d'expression
de RCCK2 dans le pancréas humain fœtal et adulte [38]. La fixation de la gastrine ou de la
CCK entraine la libération du glucagon. La gastrine contribuerait également à la prolifération
et la différentiation des ilots de langerhans [43], [65]. Une autre étude situe le RCCK2 sur les
cellules à somatostatine chez le cheval, le porc, le rat, le chien et l‟homme [66].
Au niveau du pancréas exocrine humain, une étude menée dans les cellules acineuses a
rapporté la présence d‟un niveau prédominant d‟ARN messager (ARNm) du RCCK2,
comparée à celle de RCCK1 (30 fois plus élevé). Cependant, des expériences d‟hybridation in
situ détectent des niveaux très faibles d‟ARNm du RCCK1 et du RCCK2 à la fois par rapport
à d'autres récepteurs tels que les récepteurs m3 acétylcholine [43]. De plus, la présence du
RCCK2 a été identifié par autoradiographie dans des acini isolés à partir de patient atteint de
pancréatite chronique, ce qui indique que les acini humains ont la capacité d‟exprimer le
RCCK2 [16].
Le RCCK2 a également été détecté dans les glandes surrénales [67] et les reins [68].
37
B.5.2. Distribution tissulaire au niveau du système nerveux central
Des études de liaison par autoradiographie et des mesures du taux d‟ARNm ont
montré une forte densité de RCCK2 au niveau du cortex, des bulbes olfactifs et du noyau
accumbens [69], [70], [71]. La CCK, abondamment produite par les neurones, constitue le
ligand prédominant du RCCK2 dans le cerveau [69], [41].
La CCK est impliquée chez l‟homme dans la modulation de nombreuses fonctions
centrales comme l‟anxiété, la dépression, la psychose, la cognition et le nociception. D‟autre
part, elle agit sur les centres cérébraux de la faim et favorise l‟arrêt de la prise alimentaire
[69].
B.6. Le récepteur CCK2 dans le cancer
Un nombre croissant de preuves indiquent que la CCK et la gastrine agissent en tant
que facteurs de croissance et d'invasion via l‟activation de leurs récepteurs, favorisant ainsi le
développement et la progression des cancers. Plusieurs études visant à la détermination des
niveaux d‟expression de récepteurs CCK dans les tumeurs humaines ont été rapporté [43].
Clarifier le rôle des récepteurs CCK dans la croissance tumorale, pourrait ouvrir de nouvelles
perspectives diagnostiques et thérapeutiques.
B.6.1. Rôle dans la carcinogenèse
L‟infection chronique par Helicobacter pylori est connue pour déclencher la
carcinogenèse gastrique. Cette infection est accompagnée d‟une augmentation de la sécrétion
plasmatique de gastrine par les cellules G. Cette hypergastrinémie stimule la prolifération des
cellules ECL [72]–[75]. L‟hypergastrinémie peut également être induite par la sécrétion de
gastrine par les tumeurs neuroendocrines (gastrinome, syndrome de Zollinger-Ellison), par
une gastrite atrophique ou une anémie pernicieuse [48].
Plusieurs études ont contribué à montrer l‟implication du RCCK2 dans la
carcinogenèse pancréatique exocrine, en mettant en évidence sa surexpression dans un
contexte tumoral, d‟une part, et ses effets lorsqu‟il est surexprimé d‟autre part.
Des lignées cellulaires issues de carcinomes humains expriment ce récepteur d‟une
manière endogène [76]. Une autre étude menée chez l‟homme a montré l‟expression du
récepteur CCK2 chez la plupart des patients atteints d‟un cancer pancréatique, associée à
l‟expression de la gastrine, suggérant l‟existence d‟une boucle autocrine in vivo [77].
38
Par ailleurs, la gastrine et la CCK exercent des effets trophiques sur le pancréas, et
sont des facteurs de croissance puissants pour les cancers pancréatiques humains [78]. La
prolifération d‟une lignée cellulaire issue d‟un carcinome pancréatique chimio-induit chez le
rat, qui exprime le RCCK2 et le RCCK1, est stimulée par la gastrine [76]. Un modèle de
souris transgéniques ElasCCK2 exprimant le RCCK2 humain dans ses acini pancréatiques a
été développé par notre équipe, 15% des animaux développent un adénocarcinome
pancréatique et toutes les souris développent des lésions prénéoplasiques retrouvées en
pathologie humaine [76], [79]. Toutes ses études indiquent que le RCCK2 pourrait jouer un
rôle majeur dans l‟initiation des cancers pancréatiques.
Dans le cas des tumeurs colorectales, les précurseurs de la gastrine (Pro-G et G-Gly)
sont les formes majeures sécrétées et impliquées dans le développement des tumeurs [80].
Plusieurs études menées in vitro et chez la souris ont montré que l‟action proliférative et
invasive de ces précurseurs semble indépendante du récepteur CCK2 [81], [82],[83]–[85]. Par
contre, une étude montre que la délétion ou l‟inactivation du RCCK2 dans le modèle murin
est responsable de la réversion du phénotype induit par la surexpression de la pro-gastrine, ce
qui met en question la présence d‟un récepteur spécifique de ces précurseurs différents du
RCCK2 [86]. Enfin, de nombreuses études de la carcinogenèse du colon sur des lignés
cellulaires et des animaux transgéniques, démontrent une implication du RCCK2 et de son
ligand gastrine dans le processus d‟invasion cellulaire [87], [88], [89], [90].
De nombreuses études sur des modèles cellulaires et animaux ont montré la présence
du RCCK2 dans les tumeurs neuroendocrines. La surexpression du RCCK2 a été détectée au
niveau de l'ARNm et des protéines ; elle est retrouvée dans les cancers du poumon à petites
cellules, les carcinomes médullaires de la thyroïde (MTC) [22], [91], les cancers ovariens du
stroma, les astrocytomes, et les leiomyosarcomes [92]. Il est également surexprimé
occasionnellement dans les adénocarcinomes du sein et de l‟endomètre [32]. Au niveau
digestif, les études d‟autoradiographie montrent que le RCCK2 est souvent exprimé en très
forte densité dans 63% des tumeurs neuroendocrines gastrointestinales (GIST), les
insulinomes, et le carcinoïdes (figure 6) [93], [94], [20].
En raison de la très forte incidence et de la densité de RCCK2 dans les carcinomes
médullaires de la thyroïde, ce type de tumeur a été choisi pour le développement de
radioligands spécifiques visant à cibler in vivo et chez les patients ce récepteur dans les
cancers qui le surexpriment [95], [96].
39
Un variant d‟épissage ayant une activité constitutive a été mise en évidence dans les
cellules tumorales du côlon humain, alors qu‟il est absent dans les tissus normaux. Ce variant
intitulé CCK2Ri4sv (intron 4 containing splice variant) contient 69 acides aminés
supplémentaires dans l‟ICL3 (3éme boucle intracellulaire) [97]. Il a également été identifié
dans les tissus cancéreux pancréatiques [98] et les cellules mononuclées [99]. Le RCCK2i4sv
induit des oscillations de calcium intracellulaire et augmente la prolifération cellulaire
indépendamment de la présence de son ligand, ces résultats ont été montré par l‟équipe de
Hallmich dans les cellules Balb3T3 mais ils n‟ont pas pu être confirmé dans d‟autres systèmes
cellulaires [74]. Par contre, son expression était uniquement détectée dans les tumeurs
gastrointestinales (GIST) et dans les cancers des poumons à petites cellules dans l‟étude
menée par Korner, ce qui rend l‟expression du CCK2Ri4sv controversée dans le cancer
digestif [100].
En 1995, un autre variant d‟épissage a été identifié présentant une extrémité N-
terminale tronquée. Ce variant est capable de lier la gastrine et la CCK, mais avec une affinité
dix fois inférieure à celle du récepteur sauvage et remplace la forme sauvage du récepteur
dans la lignée cellulaire d‟adénocarcinome gastrique humain AGS, ce variant peut arbitrer les
actions trophiques de ces peptides [101], [102].
De plus, la mutation ponctuelle transformant l‟acide aminé Valine en position 286 en
Phénylalanine a été identifié dans un cancer colorectal humain. Cet acide aminé est localisé au
niveau de la 3éme boucle intracellulaire, connue pour son rôle dans la transduction du signal
des RCPG. Cette mutation est capable d‟inactiver toutes les voies de transduction du signal
sans affecter la liaison du ligand à son récepteur [103].
B.6.2. Les radio-ligands développés pour des buts thérapeutiques et diagnostiques
La forte incidence et densité d‟expression du RCCK2 dans certains types tumoraux
fait de ce récepteur une cible de choix pour le diagnostic et la thérapie ciblée de ces
pathologies. Plusieurs équipes ont commencé à développer des radio-ligands spécifiques de ce
récepteur. En 2000, Kwekkeboom DJ et ses collègues ont développé la première génération
d‟analogues de la CCK non sulfatée couplée à des chélateurs tels que le DTPA ou le DOTA.
Ces analogues marqués à l‟indium 111 ont été injectés chez des patients atteints de
carcinome médullaire de la thyroïde (MTC). Les résultats semblent encourageants, mais
l‟accumulation dans les tumeurs était insuffisante pour des applications cliniques [96].
40
Figure 6: Incidence du RCCK2
Une représentation en histogramme de la densité moyenne de RCCK2 détecté dans les cancers par autoradiographie. La gamme de gris représente l‟intensité de RCCK2, de 0 à 5000 dpm/mg de tissu. L‟histogramme en noir représente une intensité supérieure à 5000. Ca : carcinome, Tu : tumeur [32].
41
Behr et ses collègues ont développé des analogues à la gastrine [111In-DTPA0], ces
analogues ont montré une forte accumulation dans l‟estomac et la tumeur chez les patients
atteints de MTC [104]. Le marquage par Technétium99mTC a permis d‟améliorer le ciblage et
la visualisation des MTC [105]. Cependant, l‟analogue de la gastrine radiomarqué présente
une rétention rénale très élevée qui est liée à la présence de 5 acides glutamiques dans la
séquence de la gastrine [32] [106]. Des nouveaux analogues dépourvue de cette séquence ont
été développés, la minigastrine MG11 [107]. La rétention rénale est 20 fois moindre pour ces
analogues MG11 radiomarqués, avec toutefois une baisse du marquage de la tumeur d‟un
facteur 3 [107].
Le développement de peptides radio-marqués à des fins thérapeutiques et
diagnostiques a beaucoup amélioré la radiothérapie qui peut alors devenir une alternative en
complément ou lorsque la chimiothérapie conventionnelle ne fonctionne pas. Le ciblage de
récepteurs à peptides par des radio-ligands, PRRT « peptide receptor radiotherapie », a été
validé avec succès, l’exemple le plus connus étant l’utilisation d’analogue de la somatostatine
radioactive pour la détection et la thérapie des tumeurs endocrines.
Parallèlement, la nanotechnologie est en plein essor dans le domaine de la
cancérologie. Elle repose sur l’utilisation de nanoparticules magnétiques comme nouvelles
plateformes polyvalentes diagnostiques et thérapeutiques. Ces nanoplateformes constituent
des agents de contraste pour l’imagerie médicale. De plus, elles comportent des propriétés
magnétiques utilisables en thérapie hyperthermique et peuvent être utilisés comme support
pour délivrer des agents chimiothérapeutiques dans les cellules tumorales si elles sont
vectorisées pour cibler ces cellules.
42
Chapitre II: Une plateforme diagnostique et thérapeutique « les
nanoparticules »
La nanotechnologie est un nouveau domaine en pleine effervescence pour le vivant.
L‟utilisation de nanoparticules se situe à l‟interface de trois grandes disciplines : la biologie,
la physique, et la chimie. Les nanoparticules de tailles nanométriques (1-100 nm) constituent
de puissants outils, en véhiculant un agent de contraste et/ou en délivrant sélectivement un
principe actif dans les cellules cibles. Elles incarnent ainsi la version moderne des « magic
bullets » imaginées au début du XXème siècle par le médecin allemand Paul Ehrlich [108] .
Nous présenterons dans ce chapitre les principaux types de nanoparticules développées
et plus précisément, les nanoparticules d‟oxyde de fer (biodistribution, localisation
intracellulaire, métabolisme et toxicité) que nous avons utilisées dans notre projet de
recherche. Ce chapitre s‟intéressera ensuite aux différentes applications biomédicales de
nanoparticules reposant sur leurs propriétés diagnostiques et thérapeutiques. Enfin, nous
présenterons l‟état des connaissances concernant les résultats acquis sur l‟hyperthermie
magnétique in vitro et in vivo, les mécanismes de mort cellulaire et les essais cliniques.
A. Généralité sur les nanoparticules
A.1. Les différents types de nanoparticules développées pour les applications
biomédicales.
Une nanoparticule est un assemblage de quelques centaines à quelques milliers
d‟atomes, formant un objet de dimension comprise entre 1 et 100 nm. La comparaison des
nanoparticules avec les structures organiques naturelles, indique qu‟elles se situent
principalement dans la gamme de taille correspondant aux protéines (figure 7).
Il existe une grande variété de nanoparticules allant des particules d‟or aux liposomes,
en passant par les nanoparticules polymériques. Cette variété dépend de la composition du
cœur des nanoparticules: il peut s‟agir d‟assemblages organiques ou inorganiques (figure 8).
Nous allons décrire ici les nanoparticules les plus courantes.
43
Figure 7: Gamme de tailles des nanoparticules comparée à celles des principales
structures chimiques et biologiques.
A.1.1. Nanoparticules organiques
Les liposomes sont des vésicules constituées d‟une bicouche phospholipidique et de
molécules de cholestérol encapsulant un espace aqueux. La taille des liposomes varie
généralement entre 50 et 100 nm. Ces particules de nature amphiphile sont depuis de
nombreuses années utilisées comme outils pour la biologie, la biochimie et la médecine en
tant que transporteurs de principes actifs thérapeutiques ou d‟agents d‟imagerie. De plus, leur
caractère non toxique et biocompatible fait de ces colloïdes des systèmes intéressants pour les
applications in vivo [109], la plus courante repose sur l‟encapsulation de la doxorubicine dans
un liposome entouré d‟une couche polymère (le polyéthylène glycol ou PEG) [110],[111].
Cependant, les liposomes présentent quelques limitations : ils ont montré une faible
capacité de stockage pour certaines molécules comme les molécules lipophiles qui se trouvent
piégées dans une bicouche phospholipidique, ils présentent également une stabilité modérée,
une production délicate, et un relargage précoce des principes actifs hydrophiles dans le sang
[112].
44
a)
Figure 8: Exemples de nanoparticules utilisées pour des applications biomédicales
a) Nanoparticules organiques, de gauche à droite : liposomes, dendrimères et nanotubes de carbone. b) Nanoparticules inorganiques, de gauche à droite : quantum dots, nanoparticules d‟or, nanoparticules d‟oxyde de
fer.
b)
45
Les dendrimères sont des complexes polymériques hautement ramifiés de taille
comprise entre 1 et 10 nm qui se construisent par l‟ajout contrôlé de couches successives de
monomères (dendron), ce monomère possédant au moins trois sites réactifs [113]. Ces
constructions polymériques fortement branchées ont une structure bien contrôlée. Les
dendrimères les plus utilisés sont composés de polyamidoamine (PAMAM) ou de
polypropylène imines (PPI) ; ils peuvent également être composés de polyamines,
polypeptides, polyamides, polyesters, ou de carbohydrates [114]. Contrairement aux
liposomes, ces nanostructures présentent une capacité importante de chargement, permettant
d‟encapsuler des agents de contraste et anti-cancéreux [115]. Les dendrimères sont également
utilisés en tant que transporteur de «gène médicament», ils ont la capacité d‟établir des
interactions électrostatiques avec les acides nucléiques (ADN, ARN antisens) pour former un
complexe qui les protègent de la dégradation et facilite la transfection cellulaire [116].
Les nanotubes de carbone appartiennent à la famille des fullerènes et sont formés de
feuilles de graphite enroulées en cylindres. Ces structures peuvent exister sous une forme
simple (une feuille de graphite) ou de nanotubes à parois multiples (plusieurs feuilles de
graphite concentriques) qui forment un cylindre caractérisé par un diamètre interne de l‟ordre
du nanomètre et une longueur de l‟ordre de quelques micromètres.
En raison de leur nature métallique et semi-conductrice, les nanotubes sont
caractérisés par leurs propriétés spectroscopiques, thermales et électriques qui facilitent leur
détection dans les environnements biologiques [117], et ils ont la capacité d‟absorber les
radiations proches de l‟infrarouge pour les convertir en chaleur [118]. Ils sont également
utilisés comme transporteurs de médicaments, leur capacité de chargement est supérieure à
celle des liposomes et des dendrimères [119].
A.1.2. Nanoparticules inorganiques
Les quantum dots : sont des nanocristaux semi-conducteurs à base de séléniure de
cadmium (CdSe) et de sulfure de cadmium (CdS) dont les dimensions varient entre 2 et 10nm.
Ils sont caractérisés par un fort rendement quantique, un spectre d‟émission élevé et une
photostabilité [117]. Grâce à ses caractéristiques, les quantum dots sont d'excellents agents de
contraste pour l'imagerie et outils pour des essais biologiques (migration, différenciation etc..)
[120].
Nanoparticules d‟or : Les nanoparticules d‟or sont des nanoparticules métalliques,
elles mesurent moins de 50 nm et elles peuvent être préparées selon des géométries diverses,
46
telles que nanosphères, nanotubes ou de nanocages. Sous l‟irradiation lumineuse, le champ
électrique entraine l‟oscillation collective des électrons à la surface des nanoparticules à une
fréquence de résonance, absorbant ainsi la lumière et émettant des photons avec la même
fréquence [121]. Les nanoparticules d'or sont d‟excellents capteurs biocompatibles et non
toxiques car ils peuvent être détectés par de nombreuses techniques, telles que l‟imagerie par
luminescence bi-photonique, ou les rayons X [122]. De plus, elles constituent un outil pour la
thérapie photothermique induite par l‟irradiation laser [123], [124].
Les nanoparticules magnétiques sont des nanocristaux sphériques de 10 à 20 nm. Elles
sont constituées de cobalt, nickel ou d‟un cœur d‟oxyde de fer à base de maghémite (Fe2O3)
ou de magnétite (Fe3O4), qui peuvent être encapsulées dans une matrice de silice, de polymère
ou de polysaccharide (dextran) [125]. Les nanoparticules d‟oxyde de fer sont adaptées pour
des applications in vivo, car elles sont biocompatibles, biodégradables et présentent une bonne
stabilité chimique [126]. De plus, les nanoparticules magnétiques ont été approuvées pour des
utilisations cliniques d‟imagerie et d‟applications thérapeutiques (dans la section B.3 les
applications biomédicales des nanoparticules magnétiques, nous développerons les modes
d‟utilisation et d‟adressage des nanoparticules magnétiques) [122], [127].
A.1.3. Les nanoparticules d’oxyde de fer
Les nanoparticules d‟oxyde de fer (ou ferromagnétiques) appartiennent à la famille des
particules inorganiques. Elles sont connues en tant qu‟agent de contraste pour la détection et
le diagnostic. Elles ont également été expérimentées pour la thérapie de tumeurs solides. Elles
sont recouvertes avec des molécules polymériques afin de les rendre biocompatibles et
biodégradables. L‟enrobage joue un rôle essentiel pour assurer la solubilité des nanoparticules
et éviter leur agrégation, mais également pour leur fonctionnalisation par la liaison des ligands
et la conjugaison d‟agents chimiothérapeutiques (figure 9).
A.1.3.1. L’influence des caractéristiques physico-chimiques sur la bio-
distribution des nanoparticules.
a) Adressage passif
La biodistribution des nanoparticules est affectée par de multiples facteurs, incluant le
mode d‟administration, les propriétés physico-chimiques des nanoparticules (taille, forme) et
l‟environnement physiologique dans lequel elles sont introduites. Les caractéristiques de
surface des nanoparticules influencent leur interaction avec les cellules et peuvent affecter
leur demi-vie plasmatique [122],[128].
47
Figure 9 : Représentation schématique d’une nanoparticule d’oxyde de fer
Une nanoparticule d‟oxyde de fer formée d‟un cœur magnétique (gris), protégée par un polymère biocompatible (bleu) sur laquelle sont greffés des peptides permettant le ciblage des tumeurs.
48
a.1. Le système réticulo-endothélial (RES)
La circulation sanguine contient un environnement complexe de protéines
plasmatiques (les opsonines) et de cellules immunitaires. Lorsque les nanoparticules pénètrent
dans la circulation sanguine, la première étape de la clairance sanguine des nanoparticules est
l‟adsorption d‟opsonines à leur surface qui sont capables d‟interagir avec les récepteurs
membranaires des monocytes et des macrophages [129]. Cette étape d‟opsonisation induit
alors la phagocytose des nanoparticules par ces cellules du système réticulo-endothélial
(RES). Cette phagocytose peut avoir lieu à la fois dans la circulation sanguine par les
monocytes, les leucocytes et les cellules dendritiques, et dans les tissus par les macrophages
résidents (les cellules de Kupffer dans le foie, les cellules dendritiques dans les ganglions
lymphatiques, les macrophages et les cellules B dans la rate). Plusieurs facteurs affectent
l‟opsonisation : la taille, la densité de charges à la surface et l‟équilibre hydro-
phobicité/hydrophilie des nanoparticules [130], [131].
La biodistribution finale typique des nanoparticules est d‟environ 80-90% dans le foie,
5-8% dans la rate, et 1-2% dans la moelle osseuse [132], [130]. La stratégie d‟adressage passif
consiste à tirer avantage de cette biodistribution pour délivrer les agents de contraste ou les
médicaments aux organes du RES (rate, foie, ganglions lymphatiques et moelle osseuse)
[133]. Si ces organes ne correspondent pas à la cible souhaitée, la stratégie consiste alors à
rendre les nanoparticules furtives.
Afin d‟empêcher la déstabilisation et l‟agrégation de la suspension colloïdale,
favoriser la solubilisation des nanoparticules dans les milieux aqueux et biologiques, et rendre
les nanoparticules biocompatibles, biodégradables et furtives, il est nécessaire d‟enrober le
cœur de la nanoparticule avec des molécules polymériques [127]. Les propriétés de ces
enrobages, notamment la nature du polymère, les charges de surface, la taille hydrodynamique
des nanoparticules sont des paramètres qui influencent la captation et l‟élimination des
nanoparticules par les cellules du système RES.
La nature du polymère va être conditionnée en fonction des organes que l‟on souhaite
cibler. Pour l‟adressage aux organes du RES, le dextran est le polymère le plus fréquemment
utilisé. Ce sucre s‟apparente aux lipopolysaccharides exprimés à la surface des bactéries, ce
qui favorise sa reconnaissance par les macrophages et la phagocytose des nanoparticules
[134], [135], [136]. Des enrobages à base de silice ou de citrate ont été également développés
[137], [138]. Pour l‟adressage à d‟autres organes, la nature du polymère devra être adaptée
afin de rendre les nanoparticules furtives vis-à-vis du système RES. Torchilin souligne que
49
[9], l‟objectif principal est d‟augmenter la durée de vie des nanoparticules ou nano-
transporteurs, une fois administrés dans le compartiment sanguin, ce qui est important pour
relarguer lentement l‟agent thérapeutique dans le sang, ou pour permettre une accumulation
passive au sein de tissus pour lesquels l‟endothélium vasculaire est discontinu.
Pour cela, il est nécessaire d‟empêcher la reconnaissance des nanoparticules par le
RES en les recouvrant d‟un agent de furtivité pour créer une couche protectrice autour des
nanoparticules et limiter l‟adsorption des opsonines à leur surface. Plusieurs polymères
d‟enrobage ont été testés tels que le polyéthylène glycol (PEG), le poloxamère ou la
polyxamine. Le PEG constitue l‟enrobage le plus couramment utilisé car il a l‟avantage d‟être
biocompatible, soluble en milieu aqueux, non toxique, et possède une faible immunogénicité
et antigénicité [129], [139], [140], [136]. De plus, il constitue un outil adapté pour le ciblage
spécifique de cellules après fonctionnalisation avec des ligands [136].
La charge de surface est également un facteur important pour la demi-vie plasmatique
des nanoparticules d‟oxyde de fer. Un enrobage neutre prolongerait la demi-vie plasmatique
des nanoparticules, limiterait la reconnaissance par le RES et leur accumulation dans le foie,
contrairement aux nanoparticules chargées [129].
La taille hydrodynamique est une autre caractéristique importante des nanoparticules,
qui influence la clairance plasmatique et le devenir des nanoparticules après leur injection
dans l‟organisme. La taille hydrodynamique d‟une nanoparticule comprend le nanocristal qui
constitue le cœur de la particule, ainsi que les couches d‟enrobage organiques et de molécules
qui l‟entourent (par exemple un ligand ou un anticorps permettant la fonctionnalisation des
nanoparticules [141]). Les nanoparticules de taille importante sont captées plus efficacement
par les macrophages que des nanoparticules de petite taille possédant les mêmes propriétés de
surface [129], [142], [143], [144]. De manière générale, les nanoparticules ont une demi-vie
prolongée, lorsque leur taille est comprise entre 10 et 100 nm, car elles sont suffisamment
petites pour échapper à la phagocytose par le RES et pour diffuser à travers les capillaires
sanguins vers les tissus [136].
En conclusion, plus la particule est petite, neutre et hydrophile, plus sa demi-vie
plasmatique sera importante [133].
50
a.2. Effet EPR (Enhanced Permeability and Retention)
L‟angiogenèse est un mécanisme indispensable à la croissance des tumeurs, et au
développement des métastases. Durant ce processus, la vascularisation est perturbée et les
capillaires discontinus présentent des pores dont la taille peut atteindre 600 nm. La
fenestration de l‟endothélium permet l‟extravasation des nanoparticules qui vont s‟accumuler
dans l‟espace interstitiel. Ce phénomène est appelé effet EPR, pour « enhanced permeability
and retention effect » [122], [126]. Idéalement, les nanoparticules doivent avoir une taille
inférieure à 400 nm pour franchir les fenestrations. Cependant, l‟adressage passif des
nanoparticules grâce à l‟effet EPR présente des limitations car il dépend du degré de
vascularisation de la tumeur [145]. L‟accumulation des nanoparticules dans les tumeurs est
également favorisée par la diminution de l‟efficacité du système de drainage lymphatique
[134].
Ainsi, des concentrations locales en médicaments très importantes peuvent être
atteintes dans la tumeur, par exemple 10-50 fois supérieures comparativement aux tissus sains
en seulement un jour ou deux, si les nanoparticules liant le médicament sont capables
d‟échapper au RES [146].
a.3. Ciblage par aimantation
Les nanoparticules magnétiques chargées en médicaments peuvent être concentrées
grâce à un champ magnétique externe à fort gradient appliqué au niveau de la tumeur. Cette
technique permet de concentrer efficacement des nanoparticules d‟oxyde de fer dans la
tumeur [147], [148], en s‟affranchissant de l‟étape de vectorisation des nanoparticules.
Néanmoins les principaux inconvénients de cette technique sont l‟agrégation des
nanoparticules, le risque d‟embolisation, et une localisation peu profonde de la tumeur [133],
[149].
b) Adressage actif
Le ciblage passif présente plusieurs inconvénients. En effet, l'accumulation résultante
de l'effet EPR peut être insuffisante pour avoir une haute concentration de nanoparticules dans
la tumeur. Par conséquent, l'administration des particules magnétiques vectorisées par un
ligand apparaît comme un outil puissant pour surmonter ce problème. Le ciblage passif repose
principalement sur la macro-pinocytose pour l‟accumulation cellulaire. Par contre, le ciblage
actif repose sur la reconnaissance moléculaire d'un ligand couplé à la surface des
51
nanoparticules par des protéines ou récepteurs présents à la surface des cellules-cibles dans le
but de favoriser l'endocytose cellulaire et d‟améliorer l'accumulation des nanoparticules dans
les cellules-cibles (figure 10) [150], [151]. En effet, de nombreux travaux ont contribué à
montrer que les cellules cancéreuses surexpriment à leur surface de nombreuses protéines
comparativement aux cellules saines, en particuliers des récepteurs membranaires [29].
L‟adressage actif consistera donc à conjuguer à la surface des nanoparticules des ligands
capables de se lier de façon spécifique à ces récepteurs de surface.
Plusieurs paramètres dus à la fonctionnalisation des nanoparticules peuvent influencer
leur accumulation intracellulaire dans les cellules tumorales : la nature du ligand (taille,
charge), le mode de conjugaison (par liaison covalente ou non), sa densité à la surface des
nanoparticules [152]. Nous citerons ci-après plusieurs exemples de vectorisations développés
dans la littérature tels que la vectorisation des nanoparticules avec l‟acide folique (FA), le
facteur de croissance EGF, le peptide RGD (Arginine-Glycine Aspartic acid) ), des analogues
de la somatostatine qui ciblent respectivement les récepteurs à l‟acide folique, des récepteurs
à activité tyrosine kinase, des intégrines, des récepteurs couplés à la protéine G (RCPG)
[153]. Ils permettent un adressage des nanoparticules vers la tumeur et éventuellement leur
endocytose par les cellules tumorales qui surexpriment ces récepteurs.
Le récepteur à l‟acide folique est parmi les protéines les plus fréquemment ciblées
[146],[154], [155], car il est fortement surexprimé dans de nombreux types de tumeurs
comparativement aux tissus sains [156]. La vectorisation des nanoparticules avec de l‟acide
folique a été étudiée à la fois pour l'administration de médicaments et l'imagerie de plusieurs
cancers métastatiques, tels que les cancers du sein, des ovaires et les cancers colorectaux.
Le ciblage de nanoparticules avec un ligand liant un RCPG a également été
expérimenté. Nous avons précédemment mentionné dans l‟introduction bibliographique que
les tumeurs endocrines sont caractérisées par la surexpression de récepteurs de cette famille.
Ainsi, la vectorisation de nanoparticules d‟or [135], d‟oxyde de fer [157], ou encore à des
liposomes [158] par des analogues de la somatostatine a permis de cibler des cellules
tumorales in vitro et in vivo.
Le peptide RGD (Arginine-Glycine-Aspartic acid) est un peptide impliqué dans
l‟attachement cellulaire via les intégrines. La conjugaison de 20 peptides RGD à la surface
des nanoparticules d‟oxyde de fer, allonge la demi-vie plasmatique du peptide RGD et permet
d‟augmenter l‟accumulation intracellulaire des nanoparticules vectorisées de façon spécifique.
52
Figure 10 : Schéma d’adressage passif et actif de nanoparticules
c) Adressage passif : perturbation au niveau de la vascularisation tumorale permettant l‟extravasation et la rétention de nanoparticules.
d) Adressage active : internalisation spécifique de nanoparticules vectorisées [145].
53
De plus, les interactions du peptide avec la membrane cellulaire sont multipliées et les
effets biologiques liées à l‟activation du récepteur intégrine sont potentialisées, ce qui rend le
peptide conjugué aux nanoparticules actif à des concentrations plus faibles que le peptide
seul, ce phénomène est intitulé «l‟amélioration plurivalente» [159]. Il existe plusieurs autres
études rapportant la vectorisation de nanoparticules d‟oxyde de fer [133],[149]. Par exemple,
les études récentes montrent que la vectorisation des nanoparticules magnétiques d‟oxyde de
fer par l‟EGF permet un ciblage spécifique et efficace des cellules tumorales qui expriment le
récepteur au niveau du carcinome de sein [160], et la tumeur cérébrale [161].
Cependant, l’analyse des données de la littérature semble indiquer que l’adressage
actif présente une efficacité limitée. Il améliore l’accumulation des nanoparticules dans la
tumeur mais l’efficacité du ciblage des cellules tumorales dans la tumeur reste limitée [162].
c) Devenir intracellulaire des nanoparticules
L‟internalisation des nanoparticules d‟oxyde de fer, soit vectorisées ou non à un ligand
spécifique, implique la voie dépendante de la clathrine [163]–[166], et les lysosomes semblent
être la destination finale des nanoparticules [164],[165],[167],[168].
Le trafic intracellulaire des nanoparticules peut être influencer par la façon dont les
éléments sont complexés à leur surface [169]. La présence de séquences d‟adressages
spécifiques peuvent induire un adressage intracellulaire des nanoparticules vers des
compartiments ou organites intracellulaires après internalisation tels que le noyau ou les
mitochondries si les nanoparticules présentent à leur surface des séquences de localisation
nucléaire (NLS) ou mitochondriale (MTS) [170], [171]. Cet adressage intracellulaire présente
d‟autant plus d‟intérêt lorsqu‟il s‟agit de délivrer un médicament proche de sa cible
intracellulaire, afin d‟améliorer son efficacité thérapeutique et de réduire sa dégradation dans
le compartiment lysosomal.
Dans les lysosomes présentant un pH acide, les nanoparticules d'oxyde de fer sont
dégradées [168], [172]. L‟étude de Lartigue et al. rapporte que le polymère de revêtement
peut contrôler la vitesse de dégradation des nanoparticules d'oxyde de fer dans un milieu à pH
[173]. De plus, l'excès intracellulaire de fer entraine l‟augmentation du taux de ferritine et la
diminution d‟expression du récepteur, la transferrine, ce qui peut protéger les cellules contre
la cytotoxicité due à des concentrations élevées en fer [174]. Une fois libéré, le fer issu du
cœur des nanoparticules devient partie intégrante du pool ferrique normal de la cellule [130].
Il est ensuite progressivement retrouvé dans les globules rouges (hémoglobines) et éliminé
54
très lentement. Une étude montre qu‟au bout de 84 jours, il y a seulement 16 à 21% de fer
dans les selles [175].
La toxicité des nanoparticules d‟oxyde de fer dépend principalement de la
concentration utilisée. Des études montrent que les nanoparticules ne sont pas toxiques en
dessous de 100 µg/ml [176],[177],[178]. Au-delà de cette concentration, la toxicité est liée
aux propriétés physico-chimiques des nanoparticules qui influencent la biodégradation des
nanoparticules d‟oxyde de fer : enrobage de surface, le stade d‟oxydation du fer du cœur de la
nanoparticule et leur interaction avec les protéines [177], [179], [180].
La toxicité des nanoparticules d‟oxyde de fer peut également provenir de la réaction
de fer issu de leur dégradation qui peut réagir avec le peroxyde d‟hydrogène, présent dans les
lysosomes, pour produire des radicaux libres hautement réactifs (ROS) par la réaction fenton
[181],[182],[183]. Les ROS ainsi générés peuvent, à des niveaux élevés, endommager les
cellules, suite à une peroxydation des lipides, des perturbations de l'ADN, des altérations des
protéines [184], [105], [106].
De manière générale, les nanoparticules magnétiques d’oxyde de fer montrent une
bonne biocompatibilité : elles sont biodégradables et présentent une faible toxicité
notamment les nanoparticules enrobées par le dextran, de PEG, de silice, et leur captation
par les macrophages n’est pas associée à une activation des cellules immunitaires
[185],[186],[187].
B. Les applications biomédicales des nanoparticules magnétiques
B.1. Imagerie: Nanoparticules à vocation diagnostique
De nos jours, l‟IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) est l‟une des techniques
d‟imagerie non invasive les plus performantes et l‟utilisation des nanoparticules qui ont des
propriétés superparamagnétiques, comme agents de contraste, permet d‟augmenter le signal
de détection. Les nanoparticules d'oxyde de fer ont été utilisées pour la première fois en
clinique afin d‟observer des tumeurs et les métastases au niveau du foie, puisqu‟elles
s‟accumulent préférentiellement dans cet organe. Depuis, différentes formulations de
nanoparticules d‟oxyde de fer ou SPIONs (Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticules) ont
été approuvées pour l‟utilisation en IRM. Par exemple ; Feridex IV®, les premières
nanoparticules commercialisées en 1995, est constitué de particules d‟oxydes de fer de 5 à 6
nm de diamètre enrobées par une couche de dextran pour aboutir à une taille globale
d‟environ 120-180 nm. Elles sont injectées par voie intraveineuse, et sont utilisées comme
55
agent d‟imagerie du foie et de la rate [188], [189]. Lumiren®, Combidex® et Ferumoxytol®
sont utilisés respectivement pour l'imagerie de l‟intestin [127], des métastases des ganglions
lymphatiques [190], et pour la détection des inflammations du système nerveux central et des
tumeurs ou métastases du cerveau [191]. De nombreux SPIONs (Superparamagnetic Iron
Oxide Nanoparticules) sont en cours de développement ou en essais cliniques [192].
B.2. Les nanoparticules: Inducteurs d’hyperthermie
B.2.1. Le concept d’hyperthermie
Actuellement, les principales voies thérapeutiques pour le traitement des cancers sont
la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie. Ces voies sont généralement combinées et
peuvent parfois être associées à une 4ème technologie utilisant la chaleur : la thermothérapie
ou hyperthermie. L'hyperthermie se définit par l'augmentation transitoire de la température
au-dessus de 37°C. L'utilisation de l'hyperthermie comme une modalité thérapeutique remonte
aux origines de la médecine. Ce n‟est pas surprenant, car la réponse naturelle du corps à des
agents pathogènes est la fièvre. Le traitement par hyperthermie peut être appliqué localement
ou sur le corps entier. Dans le cas du cancer, ce type de traitement est exploré depuis plus de
5000 ans [193], bien que leur traduction à la clinique ne s‟est produit que dans les dernières
décennies. Il y a environ 150 ans, Busch a montré que les tumeurs cessent de croître pour une
température supérieure à 42°C, tandis que les tissus sains sont moins affectés par ces
températures [194]. Des études plus récentes ont montré une amélioration des résultats quand
l‟hyperthermie est indiquée en complément de la chimiothérapie ou de la radiothérapie [195].
De plus, l‟hyperthermie appliquée à la tumeur peut induire des changements de sa
physiopathologie, conduisant à la mort cellulaire [196], [197].
En fonction de la température, deux traitements hyperthermiques ont été élaborés: (1)
l'hyperthermie douce, entre 41° et 45°C, induit préférentiellement la mort des cellules
tumorales, selon un processus apoptotique, (2) la thermoablation, pour une température
supérieure à 45°C, détruit les tumeurs par nécrose [198].
Il existe plusieurs techniques de thermothérapie [199], [200] qui peuvent être classées
suivant le mode de chauffage: (i) par contact depuis l‟extérieur avec un liquide chauffé, (ii)
par échauffement à distance (ultrasons, micro-ondes, rayonnements infrarouge, etc.) et (iii)
par implantation in vivo de dispositifs (fibres optiques, antennes, etc.) capables de transporter
ou de convertir en chaleur une énergie induite depuis l‟extérieur [201], [202], [203]. Mais, ces
techniques d‟hyperthermie présentent plusieurs difficultés car elles ne peuvent pas s‟appliquer
56
à tous les types de cancers notamment aux tumeurs profondes et non accessibles, aux tumeurs
liquides ou diffuses; elles peuvent créer de forts gradients thermiques, délicats à maîtriser car
la transmission de la chaleur peut endommager les tissus voisins. Par conséquent, l'utilisation
de nanoparticules magnétiques représentent une voie prometteuse d‟hyperthermie car elles
possèdent, la propriété de produire de la chaleur localement lorsqu‟elles sont soumises à un
champ magnétique alternatif à haute fréquence ; cependant, les nanoparticules doivent être
accumulées dans la zone tumorale. Il y a près de 60 ans Gilchrist et al ont présenté le premier
travail biomédical de particules magnétiques pour l‟hyperthermie anti-tumorale [204]. Dans
ce travail, les auteurs ont induit l‟échauffement de particules micrométriques d‟oxyde de fer
Fe2O3, injectées chez le chien au niveau de métastases localisées dans les ganglions
lymphatiques. Depuis, des nanoparticules d‟oxyde de fer ont été développées, car leur chimie
est simple et elles possèdent de bonnes propriétés magnétiques.
Au cours des dernières années, plusieurs études, in vitro et in vivo, rapportent la
possibilité d‟éradiquer des cellules tumorales par hyperthermie en utilisant des nanoparticules
magnétiques [205], [206], [207]. (Développés dans les paragraphes B.2.3-5).
B.2.2. Mécanismes d’échauffements des nanoparticules magnétiques
Comprendre les mécanismes de génération de la chaleur par les nanoparticules
magnétiques peut fournir des informations afin de concevoir des nanoparticules magnétiques
plus performantes à finalité thérapeutique. Les nanoparticules d‟oxyde de fer sont capables de
transformer l‟énergie électromagnétique en chaleur lorsqu‟elles sont exposées à un champ
magnétique alternatif à haute fréquence.
Les matériaux magnétiques sont structurés en domaines magnétiques, ces derniers
étant composés de moments magnétiques ordonnés. La taille des nanoparticules a une forte
influence sur leurs structures en domaines, les plus petites sont composées d'un seul domaine
(mono-domaines), et les grosses particules (multi-domaines). Il a été montré que les
nanoparticules les plus efficaces sont les particules monodomaines [208] (figure 11a et b).
L‟échauffement des nanoparticules magnétiques est dû essentiellement aux pertes par
hystérésis [209],[210]. Lors de l‟application d‟un champ magnétique alternatif, les
nanoparticules fixes s‟aimantent, les moments magnétiques composant les particules
s‟alignent progressivement suivant la direction du champ magnétique par rotation cohérente.
Quand le champ magnétique est inversé, les moments magnétiques relaxent vers leur nouvelle
position d‟équilibre. Ce changement d‟orientation est en partie irréversible, et la courbe
57
parcourt donc un cycle intitulé «cycle d‟hystérésis», dont l‟aire est égale aux pertes
énergétiques des nanoparticules (figure 11c) [193].
L‟efficacité hyperthermique d‟une particule est définie par le SAR (Specific
Absorption Rate), selon la formule SAR= A. f, avec A l‟aire du cycle d‟hystérésis observé
pour une fréquence f du champ magnétique alternatif. Pour augmenter l‟efficacité
hyperthermique des nanoparticules, il faut augmenter l‟aire du cycle d‟hystérésis [193]. La
valeur du SAR dépend de nombreux facteurs, tels que la taille, la forme, la structure du cœur,
les propriétés magnétiques, la composition chimique de surface, leur état
d‟agglomération/dispersion, la fréquence et l‟amplitude du champ magnétique appliqué et, la
viscosité du milieu environnant [211], [209], [212].
Ainsi, en appliquant un champ magnétique, les nanoparticules peuvent dissiper une
énergie suffisante pour induire une augmentation de la chaleur locale. La chaleur libérée lors
de l‟échauffement magnétique doit être mesurée dans le but de déterminer l‟efficacité du
système. Expérimentalement, le SAR est évalué en mesurant l‟augmentation de température
d‟un liquide contenant les nanoparticules sous l‟effet de l‟application du champ magnétique.
[213], [214].
La valeur du SAR est déduite de l‟équation suivante :
SAR =
Formule de calcul du SAR, avec Cpi : capacités calorifiques des éléments du système ; mi :
masse des éléments du système ; ΔT : hausse de température ; Δt : temps d’application du
champ
58
a) b)
c)
Figure 11 : Schéma de nanoparticule sphérique suivie par une représentation du cycle d’aimantation
a) Une configuration monodomaine. b) Une configuration multidomaine. c) Cycle d‟aimantation obtenue pour une nanoparticule.
59
B.2.3. L’hyperthermie in vitro
Les études in vitro fournissent une connaissance adéquate sur la toxicité des
nanoparticules magnétiques, la tolérance, les paramètres du champ appliqué et d'autres
paramètres importants qui sont nécessaires à optimiser. Les résultats suggèrent que les
nanoparticules d‟oxyde de fer vectorisées ou non à un ligand spécifique induisent de
l‟hyperthermie sous un champ magnétique alternatif.
Jordan et ses collègues ont été parmi les premiers à montrer que le revêtement de
nanoparticules affecte la cinétique d'internalisation cellulaires et ils ont également démontré la
mort cellulaire par un champ magnétique alternatif à des températures entre 43-45°C [215].
Yan, et al. ont mené des expériences sur des cellules hépatiques humain, ils ont montré que
60 minutes d'application de champ magnétique apte à inhiber la prolifération cellulaire et à
augmenter le rapport de l‟apoptose, dont l‟effet dépend de la dose des nanoparticules utilisées
[216]. De plus, Asin et al. ont évalué le taux de mort des cellules dendritiques (CD) chargés
des nanoparticules d‟oxyde de fer, qui est dépendant du temps d'exposition et de l'amplitude
du champ magnétique appliqué, ainsi que de la concentration des nanoparticules [217].
Les nanoparticules vectorisées s‟associent à des cellules à travers les récepteurs de la
membrane, on parle alors de l‟adressage actif et s‟internalisent dans les compartiments
cellulaires tels que les endosomes et les lysosomes. Domenech et al. et Creixell et al. ont
démontré récemment que les nanoparticules magnétiques d‟oxyde de fer vectorisées ciblent
les cellules tumorales, suivies par une accumulation dans les compartiments cellulaires,
majoritairement dans les lysosomes (1.6 pg de fer/cellule), et l‟application du champ
magnétique peut sélectivement réduire la viabilité cellulaire de 50% des cellules cancéreuses
surexprimant le récepteur EGF [218], [160], [219]. D‟autres essais in vitro affirment aussi,
que la combinaison des nanoparticules magnétiques à un champ magnétique alternatif (AMF)
induit la mort cellulaire [220], [221].
Les modèles expérimentaux de cancers ainsi utilisés ont permis de faire la preuve de
concept de la thérapie par hyperthermie au moyen des nanoparticules magnétiques. Les
données de la littérature montrent qu’il est possible d’induire la mort cellulaire sans
élévation détectable de température [160], [218], [220]. Pour cela, les auteurs ont émis
l’hypothèse d’hyperthermie localisée à l’échelle des nanoparticules ce qui induit la mort des
cellules tumorales sans la détection d’un échauffement globale. Nous discuterons cette
60
hypothèse en détail dans la partie (B.2.5. Mécanismes de mort induit par l’hyperthermie
magnétique : principe et voie d’induction) de ce chapitre avec une étude bibliographique
d’études récentes qui cherchent à quantifier l’élévation locale de la température.
B.2.4. L’hyperthermie in vivo
Pour une utilisation réussie de nanoparticules en thérapie clinique, l'une des exigences
les plus essentielles est l‟échauffement efficace afin d‟éradiquer les cellules cancéreuses au
site de la tumeur sans endommager les cellules normales adjacentes. Les études in vivo
fournissent des connaissances complémentaires à l‟in vitro en ce qui concerne la
pharmacocinétique, la toxicité et la biodistribustion des nanoparticules [222]. À ce jour,
plusieurs groupes ont étudié l'hyperthermie magnétique chez les rongeurs et les lapins.
Quelques essais cliniques chez l‟homme ont été également menés. Les méthodes typiques
d'application consistent à injecter une solution de nanoparticules dans la tumeur, ou par voie
intra-veineuse, avant d‟appliquer le champ magnétique à l'animal.
a) Validation du concept d’hyperthermie par injection intra-tumorale
La validation du concept d‟hyperthermie magnétique a été premièrement menée en
injectant directement les nanoparticules dans la tumeur. Cette approche permet de contrôler
les quantités de nanoparticules injectées et d‟utiliser des doses relativement élevées par
rapport à d'autres modes d‟injection des nanoparticules qu‟on discutera dans la partie
suivante. Cette approche permet ainsi d‟utiliser des matériaux magnétiques à faible SAR pour
induire une hyperthermie magnétique. Des concentrations de nanoparticules entre 20 et 80
mg/cm3 sont capables d'induire une ablation thermique avec une élévation de la température
supérieure à 50°C. Les résultats montrent que la fragmentation d‟ADN est supérieure à 50%
[223], [224]. Renard et al. en 2009 ont utilisé des SPIONs (superparamagnetic Iron Oxyde
NPs) enrobés de silice pour induire une hyperthermie locale sur le carcinome canalaire du
sein chez des souris [225]. Plusieurs études ont été menées sur des modèles de xénogreffes
afin de valider la faisabilité de l‟hyperthermie in vivo. Dennis et al. montrent sur le carcinome
du sein une élévation de la température qui atteint 55°C après une injection directe des
nanoparticules magnétiques à l‟intérieur de la tumeur. L‟exposition de la tumeur à un champ
magnétique alternatif d‟amplitude variable (entre 40 et 69 mT, 150kHz) est suffisante pour
ralentir la croissance de la tumeur [226]. De même, une autre étude suggère que les
nanoparticules d‟oxyde de fer vectorisées avec un anti-HER2 peuvent sélectivement cibler et
provoquer la régression tumorale sous un champ magnétique alternatif [227].
61
L'application intra-tumorale de la matière magnétique a également été utilisée pour des
traitements d'hyperthermie magnétique en clinique. Deux études ont été réalisées sur des
patients atteints de glioblastome [207], [228]. Après injection des nanoparticules dans la
tumeur, les patients ont subi plusieurs sessions de thermothérapie par application d‟un champ
magnétique alternatif à haute fréquence (avec une intensité de 3–22.5 mT et une fréquence de
100kHZ) en combinaison avec de la radiothérapie externe. Les températures intra-tumorales
atteintes se situaient entre 42,4 à 45,5°C. En général, la thermothérapie a été bien tolérée par
les patients avec des effets secondaires mineurs. En particulier, aucun saignement local,
gonflement du cerveau ou augmentation de la pression inter-crânienne se sont produits. Trois
patients sont décédés au cours de l'étude en raison de la progression de la maladie [229] ;
l‟analyse anatomopathologique a permis de révéler que les nanoparticules injectées étaient
distribuées sous forme d'agrégats dans des espaces tumoraux nécrotiques. Les résultats de
cette étude sont encourageants au niveau de la survie et de la régression tumorale, suggérant
ainsi que cette nouvelle approche thérapeutique en combinaison avec la radiothérapie peut
être cliniquement efficace [207].
En conclusion, l'injection intra-tumorale des matériaux magnétiques a permis de
valider le concept d’hyperthermie magnétique que ce soit dans des études précliniques sur
des animaux de laboratoire ou dans des essais cliniques. Les injections intra-tumorales
directs ont les avantages d'atteindre des concentrations locales élevées de nanoparticules ce
qui limitent la toxicité systémique. Malgré les résultats prometteurs qui ont été obtenus dans
ces expériences, la technique d’injection intra-tumorale présente des inconvénients divers,
dont la distribution irrégulière de nanoparticules magnétiques dans la tumeur
(principalement localisées dans l’espace extracellulaire [223]) aboutissant à une efficacité
thérapeutique hétérogène, et l’incapacité de traiter les tumeurs métastasiques. De plus, une
élévation forte de la température lorsque de fortes quantités de nanoparticules sont injectées
pouvant entraîner des dommages sur les tissus avoisinants (par dissipation de la chaleur)
[230].
b) Hyperthermie par injection intraveineuse
Les injections intra-tumorales de NPM suivies par un traitement au champ magnétique
ont montré un bénéfice dans le contrôle de la croissance tumorale. L‟effet hyperthermique
existe, mais la distribution non homogène des NPM limite l'éradication de la tumeur. En
revanche, l'administration intra-veineuse (IV) moins invasive présente l‟avantage de pouvoir
62
cibler toutes les cellules tumorales présentes dans la tumeur primaire et dans les métastases,
d‟autant plus si les nanoparticules sont vectorisées [231], [232].
Bien que l'administration IV n‟aboutisse pas à une charge homogène de
nanoparticules dans la tumeur, la distribution est plus globale, comparativement à l'injection
directe où la distribution est ponctuée [224], [230]. Des études montrent la faisabilité d‟une
approche d‟hyperthermie magnétique après injection des nanoparticules magnétiques par voie
intra-veineuse : cancer du sein avec nanoparticules vectorisées avec un anti-HER2 [227] et les
mélanomes ciblés avec nanoparticules vectorisées à la porphyrine [233].
Balivada et al démontre une diminution significative (50%) de la taille des mélanomes
après une administration intraveineuse de NPM vectorisées à la porphyrine suivie par une
exposition au champ magnétique (6 mT, 366 kHz) pendant 10 minutes. Ces NPM vectorisées
ciblent spécifiquement les cellules cancéreuses surexprimant les récepteurs à la porphyrine
[233]. De plus, une étude récente démontre que les NPM vectorisées à l‟acide folique sont
capables de s‟accumuler dans le myélome après l‟injection intraveineuse. L‟application d‟un
champ magnétique alternatif (10mT, 230kHz) pour une durée de 20 min, inhibe
significativement la croissance tumorale. Le volume tumoral chez les souris traitées était
réduit d‟un facteur 10 comparativement à celui des souris témoins, et une survie nettement
améliorée a été rapportée chez les souris traitées [234].
En conclusion, les études d’hyperthermie menée par injections IV montrent une
certaine inhibition de la croissance tumorale. Le maximum de fer injecté était de 100 mg
Fe/kg, cette quantité est limitée par la toxicité ce qui rend difficile d'obtenir la concentration
requise dans la tumeur afin d’appliquer un traitement au champ magnétique efficace [224].
En comparant avec l'injection intra-tumorale directe, l'injection IV présente un avantage
supplémentaire de charger simultanément et précisément de nombreuses tumeurs.
Cependant, la quantité de nanoparticules atteignant la tumeur sera moindre,
comparativement à une injection intra-tumorale, et pourrait être un facteur limitant à
l’efficacité thérapeutique [233], [235].
c) Les limitations de l’hyperthermie in vivo
L‟utilisation de l‟hyperthermie magnétique comme approche thérapeutique anti-
tumorale présente plusieurs limitations, selon le mode d‟administration des nanoparticules.
Lorsque les nanoparticules sont injectées par voie intra-tumorale, les limitations sont
63
essentiellement liées à la localisation de la tumeur (afin de permettre l‟injection) et à la
diffusion de la chaleur aux tissus avoisinants.
Lors d‟une injection par voie IV, la première limitation réside dans la quantité de
nanoparticules atteignant la tumeur où le taux d‟accumulation des nanoparticules dans les
tumeurs se sont souvent révélés faibles pour atteindre des températures thérapeutiques, même
après des injections répétées [162]. Le processus d'opsonisation masque le ligand lié à la
surface de la nanoparticule lors d‟un ciblage actif [236].
D‟autre limitations sont apparues lors des essais pré-cliniques : (1) les caractéristiques
structurelles des nanoparticules nécessaires pour l‟hyperthermie magnétique et le ciblage actif
sont opposés les uns aux autres. Par exemple, les nanoparticules de grands diamètres
favorisent les capacités de chauffage mais pas le ciblage tumoral [237]. (2) L'efficacité de
l'hyperthermie ciblée dépend étroitement de la physiologie de la tumeur, telle que le degré de
vascularisation, la sélectivité d'expression de cible, et les niveaux de la surexpression de cible.
Pour surmonter ces problèmes, il faut absolument améliorer l'efficacité du ciblage, la
double vectorisation des nanoparticules par des ligands peptidiques contre deux récepteurs a
été proposée récemment en exploitant le fait que les cellules tumorales sur-expriment
typiquement plusieurs types de récepteurs de surface [238]. Le ciblage simultané de deux
récepteurs sur la surface cellulaire pourrait conduire à une plus grande affinité et spécificité
pour les nanoparticules. En effet, plusieurs études utilisant le ciblage à double ligand ont
démontré de manière significative une amélioration de l'efficacité thérapeutique
comparativement à des nanoparticules conjuguées avec un seul ligand. Par exemple, en 2006
Saul et al. ont montré que des liposomes chargées en doxorubicine et fonctionnalisés avec de
l'acide folique et un anticorps monoclonal ciblant les récepteurs EGF, présentait une
cytoxicité supérieure à une simple vectorisation [239]. Dans une autre étude, Laginha et al.
ont synthétisé des liposomes vectorisés avec deux anticorps différents, un anti-CD19 et un
anti-CD20, pour cibler les cellules B, les résultats montrent un effet additif pour
l‟internalisation des lyposomes doublement vectorisés par rapport avec des lyposomes
monovectorisés [240].
Plusieurs types d‟intégrines sont surexprimés au niveau de la vascularisation tumorale
et de nombreuses cellules cancéreuses métastasiques [142], [241], [242]. Il existe une autre
stratégie de vectorisation qui consiste à favoriser le passage de la barrière endothéliale pour
atteindre la tumeur. Des études rapportent l‟efficacité de la vectorisation des nanoparticules
64
avec le peptide cyclique RGD qui se lie aux récepteurs d‟intégrines exprimées par la lignée
HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) [243], [244].
Enfin, malgré les résultats prometteurs, depuis l’étape de la synthèse des
nanoparticules jusqu’aux essais in vivo, l’application clinique de l’hyperthermie magnétique
n’est pas encore établie en tant que traitement conventionnel. D’autre part, il est nécessaire
de normaliser la production d’appareils permettant les applications cliniques réussis chez
l’homme, actuellement MagForce Nanotechnologies AG, une société allemande, a conçu un
appareil émetteur de champ magnétique alternatif (MFH 300FTM) (figure 12). Cet appareil
émet un champ magnétique alternatif à l’ensemble du corps humain, de 100 kHz avec des
intensités variables de 0 à 22 mT [245].
B.2.5. Mécanismes de mort induit par l’hyperthermie magnétique : principe et voie
d’induction
Des études ont abordé les mécanismes de mort induit par l‟hyperthermie magnétique.
Elles ont notamment cherché à analyser l‟élévation de la température induite lors de
l‟application du champ magnétique, à déterminer le rôle du compartiment lysosomal dans le
mécanisme de mort, dans lequel s‟accumulent les nanoparticules.
Des études utilisant des nanoparticules d‟oxyde de fer ciblant les récepteurs à l‟EGF
(Epidermal Growth Factor) ont récemment montré leur capacité d‟internalisation dans les
cellules tumorales et à tuer les cellules suite à l‟application d‟un champ magnétique. La mort
cellulaire peut être induite sans élévation détectable de la température du milieu d‟incubation.
L‟hypothèse du mécanisme de mort impliquerait une voie de mort lysosomale [160], [218],
[246].
Huang et al. ont montré une augmentation très localisée de la température de surface
des nanoparticules traduit par une diminution de la fluorescence du thermomètre moléculaire
DY 549 conjugué à des NPM ciblant des cellules tumorales et exposés à l‟AMF, alors qu'un
fluorophore libre ne subit aucun changement [247]. Plusieurs autres études expérimentales ont
affirmé cette hypothèse, lorsque les cellules sont exposées à un AMF pendant que la
température du milieu cellulaire ne change pas [248], [249]. Ces données suggèrent qu‟il est
possible d‟éradiquer des cellules tumorales sans affecter les cellules saines voisines et donc de
limiter les effets secondaires. Récemment, Andreas Riedinger et al. ont développé une
technique basée sur l‟utilisation d'une molécule thermosensible fixé à des distances variables
du cœur en oxyde de fer des nanoparticules magnétiques. L‟étude rapporte aussi un
65
échauffement local atteignant 45°C, qui a été trouvé quand la molécule thermosensible est
positionnée à des distances inférieures à 0,5 nm, mais la température décroît
exponentiellement avec la distance [246].
D‟autre part, Domenech et al. ont étudié récemment le mécanisme à l‟origine de la
mort cellulaire. Leurs données sur les nanoparticules ciblant les récepteurs EGF soutiennent la
participation des lysosomes et de cystéines protéases. En effet, les nanoparticules
magnétiques d'oxyde de fer peuvent sélectivement provoquer la perméabilisation de la
membrane lysosomale (LMP) dans les cellules cancéreuses sous l'action d'un champ
magnétique alternatif (AMF). LMP a été observée en corrélation avec une augmentation des
radicaux libre oxygénés (ROS) sous une réaction chimique appelée « réaction fenton », suivi
par une augmentation dans l‟activité cytosolique de la cathepsine B, une protéase lysosomale
qui est susceptible à diminuer la viabilité des cellules cancéreuses [160]. Ces observations
suggèrent la possibilité de déclencher les voies de mort lysosomales dans les cellules
cancéreuses, via l'administration de nanoparticules qui ciblent les lysosomes [160]. La section
(B.3. l‟intervention des lysosomes dans la mort cellulaire : apoptose et pyroptose) du chapitre
III, discutera en détaille le rôle du compartiment lysosomal dans la mort cellulaire. Il est
intéressant de noter que la formation des ROS, la perméabilisation de la membrane
lysosomale et la mort cellulaire ont eu lieu en absence de toute augmentation de la
température du milieu cellulaire [160], [218], [220].
Donc, les études montrent que la mort cellulaire est due à l'énergie dissipée
localement par les nanoparticules magnétiques qui est capable de perméabiliser les
lysosomes et libérer les protéases qui sont des initiateurs de la voie de mort lysosomale.
Après une description des différentes études menées sur les nanoparticules magnétiques
d’oxyde de fer, dans le cadre du traitement de cancers par hyperthermie, et les mécanismes
d’échauffement possibles lorsqu’elles sont soumises à un champ magnétique alternatif, nous
allons citer les études récentes qui utilisent l’hyperthermie magnétique en combinaison à la
chimiothérapie afin d’améliorer leur effet thérapeutique.
66
Figure 12 : Appareil permettant l'application d'un traitement hyperthermique chez l'homme.
Traitement hyperthermique pelvien après injection de nanoparticules magnétiques grâce à l‟appareil générateur de champ magnétique alternatif MFH 300F®.
67
B.3. Nanoparticules: Des véhicules pour la chimiothérapie
Les inconvénients principaux au traitement chimiothérapeutique conventionnel sont
liés à leur toxicité à cause de leur manque de spécificité, à leur élimination rapide et à la
résistance que développe les cellules tumorales. À cet égard, les nanoparticules sont de plus
en plus étudiées en tant que véhicules de délivrance de médicaments [250], notamment les
liposomes et les nanoparticules d‟oxyde de fer.
L'utilisation de micro et nanoparticules magnétiques pour la délivrance des agents
chimiothérapeutiques a commencé en 1976 lorsque Zimmermann et Pilwat ont démontré
l'administration de médicaments cytotoxiques dans les érythrocytes [251]. Cependant, la
première expérience sur des modèles animaux été faite par Lubbe et al. avec des
nanoparticules magnétiques conjuguées à l‟Epirubicine, qui ciblent le pancréas [252].
Les formulations lyposomales ont été développées pour améliorer l‟index
thérapeutique des agents chimiothérapeutiques conventionnels. L‟encapsulation de la
doxorubicine dans un liposome entouré du PEG est couramment utilisée. Cette formulation
présente des effets anti-tumoraux significatifs dans les cancers métastasiques, tels que les
cancers du sein, des ovaires, des carcinomes hépatocellulaires, en absence des effets
secondaires observés lors des traitements conventionnels par la doxorubicine [110], [111]. Le
ciblage des liposomes a été amélioré par vectorisation avec de l‟acide folique ou un anticorps
dirigé contre le récepteur de la transferrine [253]. Actuellement, il existe plusieurs
médicaments anticancéreux (ayant reçu l‟autorisation de mise sur le marché) basé sur des
formulations liposomales de doxorubicine ou d‟anthracyclines pour le traitement des cancers
ovariens et du sein [254], Lipoplatine est utilisé pour le traitement des tumeurs épithéliales et
le cisplatine pour le cancer du poumon [255].
Par ailleurs, les nanoparticules d'oxyde de fer sont aussi utilisées pour minimiser les
effets secondaires liés à la dose pendant la chimiothérapie. Les études illustrent deux
stratégies différentes, la première consiste à combiner le traitement chimio-thérapeutique libre
et la chaleur libérée par les nanoparticules lors de l‟application d‟un champ magnétique. La
seconde stratégie est basée sur la vectorisation de l‟agent à la surface des nanoparticules en se
basant sur leur potentiel en tant que véhicules de délivrance de médicaments, pouvant
permettre une accumulation plus importante de médicaments lorsqu‟il est conjugué aux
nanoparticules comparativement à ce même médicament libre [250], [256]. Ce facteur
combiné à l‟avantage thérapeutique représenté par leur capacité d‟échauffement augmente le
68
potentiel de ce système afin d'agir comme une thérapie localisée avec des doses
chimiothérapeutiques réduites, permettant ainsi de minimiser les effets secondaires sévères et
d'améliorer les résultats cliniques pour les patients atteints de cancer.
Itaru Sato et al. ont émis l'hypothèse que les nanoparticules magnétiques pourraient
sensibiliser les cellules cancéreuses à l‟agent chimiothérapeutique sous l‟action d‟un champ
magnétique alternatif (AMF). Les résultats suggèrent une sensibilisation plus importante des
cellules tumorales de la voie orale, en combinant l‟hyperthermie au cysplatine [257]. De plus,
la sensibilité des cellules au niveau du lymphome a été améliorée pour l'adriamycine et la
daunorubicine, lorsque le traitement a été combiné avec des NPM [258]. Des résultats
similaires ont été obtenus par l‟étude de Khaled Al Jarrah et al. sur des cellules cancéreuses
(MCF-7), où la sensibilité à la doxorubicine dépend à la fois de la dose des NPM et de
l‟amplitude du champ magnétique appliqué [259].
D‟autre part, de nombreuses méthodes chimiques ont été appliquées pour conjuguer
l‟agent thérapeutique à la surface des nanoparticules magnétiques : par liaison covalente
(conjugaison directe aux nanoparticules ou avec un agent de liaison clivable), par interactions
physiques (hydrophile / hydrophobe, électrostatiques) [178]. La conjugaison de médicaments
doit prendre en compte les propriétés physico-chimiques, les groupes fonctionnels disponibles
sur l‟enrobage des nanoparticules et le profil de libération. L'objectif primordial est de lier
l‟agent thérapeutique, sans compromettre la fonctionnalité des nanoparticules. La surface des
nanoparticules d'oxyde de fer a été modifiée avec des médicaments anticancéreux tels que la
doxorubicine (Dox) [260], la catéchine [261] et Paclitaxel [260]. La conjugaison de la
doxorubicine à des nanoparticules permet d‟augmenter la concentration intracellulaire en
médicament par rapport au médicament libre et d‟améliorer l‟efficacité thérapeutique [262],
[263]. Le volume tumorale chez la souris a été réduit de 63% en présence de doxorubicine
conjuguée, comparativement à une diminution du volume tumoral de 38% pour la
doxorubicine libre [264]. Les résultats suggèrent que la conjugaison de la doxorubicine à des
nanoparticules d‟oxyde de fer renforce l'activité anticancéreuse de ce médicament et fournit
un nouveau moyen pour l‟administration ciblée de médicaments à des cellules tumorales
[265]. Une autre étude montre un effet synergique lors de la combinaison de l‟hyperthermie et
du cisplatine conjuguées à des nanoparticules magnétiques. L‟effet cytotoxique atteint 76%
contre 23% pour le cisplatine seul et 15% pour le traitement d‟hyperthermie en absence de
l‟agent cytotoxique [266].
69
Souvent, la surface de nanoparticules d'oxyde de fer destiné à la chimiothérapie
contiendra également un agent de ciblage qui peut identifier des récepteurs surexprimés à la
surface externe des cellules cancéreuses [267]. Tsung-Ju Li et al. ont récemment conçu
l‟anticorps anti-HER2 (anti-human epidermal growth factor receptor 2) couplé à des
nanoparticules magnétiques d'oxyde de fer portant en même temps à leur surface le 5-
fluorouracil (5-FU) comme un agent chimiothérapeutique pour une administration ciblée à
des cellules tumorales exprimant HER2. Dans cette étude, les auteurs ont réussi à montrer un
traitement efficace contre le cancer à la fois in vitro et in vivo, et que la libération du 5-FU
dépend à la fois de l‟acidité et de la température du milieu [227]. Lee et al. ont développé
aussi un système de nanoparticules d‟oxyde de fer intitulées «théranostiques», puisqu‟elles
ont permis la libération intracellulaire de la Gemcitabine suite à l'endocytose médiée par le
récepteur uPA (urokinase plasminogene activator receptor) dans les cellules tumorales
pancréatiques tout en assurant l'augmentation du contraste en imagerie par résonance
magnétique (IRM) des tumeurs. Les résultats montrent que suite une libération de la
Gemcitabine, la prolifération cellulaire diminue [268].
Ces « nanotransporteurs » permettent de résoudre les problèmes associés aux
médicaments, tels que leur faible solubilité aqueuse, leur toxicité, les problèmes liés aux
mécanismes de résistance multiple des cellules tumorales aux médicaments [171],[241],[269].
Néanmoins, dans la plupart des cas la séquestration des principes actifs dans les lysosomes
peut entrainer leur dégradation. Pour contourner les lysosomes les nanoparticules peuvent
être conçus afin de modifier la localisation intracellulaire [171], [270].
70
Chapitre III : La mort cellulaire
Dans ce chapitre, on développera quatre types de mort cellulaire programmée:
l‟apoptose, la nécrose, l‟autophagie et la pyroptose. La mort cellulaire « programmée », est
indispensable au développement des organismes pluricellulaires [271]. Par l‟élimination des
cellules surnuméraires, l‟homéostasie des tissus est garantie et la taille des organes est
maîtrisée. Au cours de la vie adulte, la mort cellulaire programmée préserve l‟élimination de
cellules potentiellement dangereuses comme les lymphocytes T auto-réactifs et les cellules
endommagées ou infectées afin de contrôler le renouvellement et l‟intégrité cellulaire et
tissulaire. La dérégulation des mécanismes de régulation de la mort cellulaire est susceptible
d‟entraîner des phénomènes pathologiques.
L‟apoptose et la nécrose ont longtemps été opposées. L‟apoptose est généralement
considérée comme une mort programmée, garantissant l‟homéostasie tissulaire, alors que la
nécrose est décrite comme une mort accidentelle non physiologique. Or, récemment, des
voies régulées d‟induction de la nécrose ont été décrites qui remettent en question cette
dualité [272].
L‟autophagie est un mécanisme de survie cellulaire suite à une carence en nutriments.
L‟auto-digestion de ses organites permet à la cellule de palier ses besoins en substrats.
Lorsque la carence persiste, la cellule enclenche un processus de mort cellulaire
«autophagyassociated cell death » [273].
La pyroptose, est une voie de mort cellulaire programmée qui dépend de l‟activation
de la caspase-1. Cette voie de mort a été plus particulièrement étudié dans le système
immunitaire [274].
A. L’apoptose
L‟expression « apoptose », a été introduite par Kerr et al. afin de décrire une mort
cellulaire présentant un aspect morphologique spécifique qui sera détaillé dans le paragraphe
suivant [275]. Ce processus, essentiel à la vie des organismes pluricellulaires, est responsable
de l‟élimination de cellules à l‟âge adulte, notamment de cellules dont l‟ADN est
endommagé, pour maintenir l‟intégrité génomique et l‟homéostasie cellulaire [276].
A.1. Caractéristiques de la cellule apoptotique
Entre les années 1962 et 1964, Kerr observait une mort cellulaire particulière dans les
lobes de foie de rat soumis à l‟ischémie. Un processus qui différait de la nécrose, lui a d‟abord
71
valu le nom de « shrinkage necrosis » [277]. En effet, l‟apoptose se définit par un ensemble
de changements morphologiques observées par microscopie électronique: arrondissement de
la cellule avec rétraction des pseudopodes, réduction du volume cellulaire (pyknosis),
condensation de la chromatine, fragmentation nucléaire (karyorrhexis), pas ou peu de
modifications de la structure des organites cytoplasmiques, un «bourgeonnement»
membranaire « blebbing » et une formation des corps apoptotiques qui caractérise la phase
finale de l‟apoptose, ils sont rapidement phagocytés par les cellules voisines, ce qui se traduit
par une absence totale de développement de processus inflammatoires (figure 13). Le terme
«apoptose » est utilisé pour des évènements de mort cellulaire qui font intervenir plusieurs de
ces changements morphologiques [278].
Différentes approches ont été développées afin d‟observer et de quantifier des
phénomènes spécifiques de l‟apoptose telles que le marquage Annexine V associé à un
intercalant de l‟ADN (généralement l‟iodure de propidium), très couramment utilisé, qui
permet de différencier les cellules en apoptose précoce (positives à l‟annexine V, permettant
de révéler l‟exposition précoce des phosphadityl sérines sur la face externe de la membrane
plasmique), en apoptose tardive (positive à l‟annexine V et à l‟iodure de propidium (ce
dernier révélant la perte d‟intégrité de la membrane plasmique associée à un état avancé de
mort cellulaire par apoptose) et les cellules nécrotiques (positives à l‟iodure de propidium),
les méthodes TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transférase dUTP nick end labeling) ou
« DNA ladder » permettant d‟analyser la fragmentation de l‟ADN, la microscopie
électronique permettant l‟étude morphologique [279].
A.2. Les voies d’induction de l’apoptose
L‟apoptose se déclenche sous l‟influence de signaux diverses, aussi bien de sources
endogènes qu‟exogènes tels que le stress oxydative, les lésions de l‟ADN, la stimulation des
récepteurs de mort, la protéine cytolytique «la perforine ». L‟apoptose peut classiquement être
divisée en trois phases: une phase d‟initiation, une phase d‟exécution et une phase de
dégradation. La phase d‟initiation de l‟apoptose est un phénomène au cours duquel le signal
apoptotique (endogène ou exogène) est transmis aux caspases initiatrices par des molécules
adaptatrices, ces caspases interviennent dans l‟exécution de l‟apoptose et conduisent à la
dégradation de la cellule. La description des principales voies d‟induction de la mort cellulaire
par apoptose seront abordée.
72
Figure 13 : Les trois types de mort cellulaire (apoptose, autophagie et nécrose) Les différents changements morphologiques induits par ces trois types de mort cellulaire suite à divers stimuli, comme l‟irradiation γ pour l‟apoptose, la déprivation en nutriments pour l‟autophagie et l‟ischémie pour la nécrose. L‟apoptose est caractérisée par le maintien de l‟intégrité de la membrane plasmique et le rétrécissement de la cellule. Une perméabilisation précoce de la membrane plasmique dans le cas de la nécrose provoque une lyse cellulaire. L‟autophagie est accompagnée par une accumulation massive dans le cytoplasme, des vésicules à doubles membranes [280].
73
A.2.1. La voie des récepteurs de mort, « voie extrinsèque »
L‟activation de la voie extrinsèque de l‟apoptose se fait en réponse à la fixation de
ligands spécifiques, de types cytokines, sur des récepteurs transmembranaires appelés
récepteurs de morts. Ces récepteurs de morts appartiennent à la famille des récepteurs TNF
(Tumor Necrosis Factor) regroupant les récepteurs TNFR1 et TNFR2, le récepteur Fas, les
récepteurs TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) DR-4, DR-5. Ils se caractérisent
par une séquence cytoplasmique commune appelée Death Domain (DD).
Une liaison à leurs ligands spécifiques, active le récepteur et conduit au recrutement de
protéines adaptatrices au niveau du domaine DD. Les protéines adaptatrices appelées FADD
(Fas Associated Death Domain) ou TRADD (TNF Receptor Associated Death) possèdent leur
propre domaine DD par lequel elles sont recrutées au niveau des récepteurs activés. Les
protéines adaptatrices recrutent ensuite les caspases initiatrices (caspases 8 et 10). Le
complexe ainsi formé est appelé DISC (Death Inducing Signaling Complex) [281] (figure 14).
La formation du DISC permet l‟activation des caspases 8 et 10 par auto-clivage [281], ces
caspases activées déclenche alors la phase d‟exécution de l‟apoptose par activation des
caspases 3,6 et 7 qui a leur tour clivent les substrats cellulaires. Ces substrats peuvent être des
protéines impliquées dans l‟apoptose (tels que les inhibiteurs d‟apoptose IAPs), des protéines
kinases (Akt, FAK impliquées dans la survie cellulaire), des protéines de structure (β-caténine
impliquée dans les interactions cellule-cellule, les lamines), des protéines impliquées dans des
mécanismes de réparation cellulaire (DNA-dependent protein kinase, Poly-ADP-Ribose
Polymerase...), des protéines de régulation du cycle cellulaire (des inhibiteurs de cycline-
dependent kinase) [282].
Dans les thymocytes, l‟activation de la voie extrinsèque conduit à l‟exécution de
l‟apoptose sans intervention de la mitochondrie dans la signalisation apoptotique. Par contre,
dans les cellules hépatiques, la voie apoptotique nécessite une amplification du signal via
l‟activation de la voie mitochondriale de l‟apoptose pour déclencher la cascade d‟activation
de caspases. Dans ce second mécanisme, la caspase 8 activée clive Bid (BH3 interacting
domain death agonist), une petite protéine de la famille Bcl-2 (B-cel lymphoma-2), qui va
induire l‟activation de la voie mitochondriale de l‟apoptose [283] (figure 14). La forme
tronquée de Bid appelée t-Bid est rapidement transloquée du cytosol vers la membrane
mitochondriale où elle se lie à des protéines pro-apoptotiques Bax et Bad de la famille Bcl-2,
il y a alors une modification du potentiel membranaire mitochondrial conduisant au relargage
de cytochrome c dans le cytoplasme, à l‟assemblage du complexe multiprotéique
74
Figure 14 : La voie des récepteurs de mort, «voie extrinsèque»
Après la fixation du ligand spécifique sur les récepteurs Fas, DR4 et DR5, le DISC (Death Inducing Signaling Complex) est formé via l‟adaptateur FADD. Lors de la fixation du TNF sur TNFR1, la formation du DISC est médiée par l‟adaptateur TRADD. Les caspases initiatrices 8 et 10 sont alors recrutées et auto-activées. Selon le type cellulaire, soit l‟activation directe des caspases exécutrices 3, 6 et 7 par les caspases initiatrices mène directement à la mort de la cellule, soit la voie mitochondriale est déclenchée via le clivage de Bid en t-Bid. La cascade des caspases post-mitochondriales est activée et aboutit à la mort de la cellule.
75
« apoptosome » comprenant Apaf-1, la caspase-9 et le cytochrome c. Cette voie de mort
mitochondrial sera détaillée dans la section suivante de cette partie. Une isoforme de la
caspase-8, le c-FLIP (cellular FLICE-inhibitory) entre en compétition avec les caspases 8 et
10 pour empêcher leur recrutement au niveau de DISC [284], [285].
A.2.2. La voie mitochondrial, « voie intrinsèque »
Au cours de l‟apoptose mitochondriale, la perméabilisation de la membrane
mitochondriale constitue une étape essentielle. Cette perméabilisation est induite suite à
l‟exposition à des radiations UV, des agents chimiques créant des dommages importants de
l‟ADN, suite à l‟activation d‟oncogènes et de protéines virales [286]. Généralement,
l‟altération de la membrane externe de la mitochondrie est associée à une modification de la
perméabilité de la membrane interne conduisant alors à des variations du potentiel
mitochondrial transmembranaire (Δψm). Les protéines de l‟espace intermembranaire sont
relarguées dans le cytosol dont le cytochrome c, les protéines Smac/DIABLO (second
mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low PI), les
protéases sérine OMI/Htra2 (high-temperature requirement protein A2), AIF (apoptosis-
inducing Factor), Endonuclease G [287].
Le cytochrome c (cyt c) est séquestré au niveau de l‟espace intermembranaire
mitochondrial où il exerce sa fonction biologique de transport d‟électron entre les complexes
III et IV de la chaine respiratoire [288]. Le relargage du cytochrome c participe à l‟activation
de la cascade des caspases en activant une caspase initiatrice, la caspase 9 (figure 15a) ;
l‟activation de la caspase-9 se fait au sein du complexe multi-protéique « Apoptosome », la
formation de ce complexe débute par la fixation du cytochrome c au niveau des motifs WD40
présents sur Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor-1). Suite à cette fixation, Apaf-1
change sa conformation et expose son domaine CARD (Caspase Recruitment Domain) [289].
La fixation de l‟ATP est indispensable pour l‟activation d‟Apaf-1, la stabilisation de la
nouvelle conformation et l‟oligomérisation de sept unités Apaf-1/cytc/ATP [290]. Cette
nouvelle conformation en heptamère permet le recrutement de procaspase 9 via une
interaction entre les domaines CARD des protéines Apaf-1 et les domaines CARD des
procaspases 9 (figure 15b) [289]. Les caspases 9 peuvent s‟activer par auto-clivage, du fait de
leur proximité dans l‟apoptosome formé. L‟apoptosome est désormais actif, la caspase-9
encore liée à l‟apoptosome recrute et active les caspases effectrices 3 et 7.
76
Figure 15 : Une représentation de la voie intrinsèque de l’apoptose et du processus d’assemblage de l’apoptosome
(a) L‟activation de la mitochondrie va induire le relargage de facteurs apoptogènes hors de l‟espace intermembranaire responsable de l‟activation de la voie des caspases, (1) directement via la formation de l‟apoptosome et (3) indirectement par l‟inhibition des inhibiteurs de caspases (IAP). (2) L‟exécution de l‟apoptose est aussi induite par une voie indépendante des caspases [433].
(b) Suite à la fixation du cytochrome c au niveau des motifs WD40, il y a un échange de l‟ADP en ATP. Un changement de confirmation permet de recruter la caspase-9 au domaine CARD d‟Apaf-1. L‟apoptosome est formé de 7 unités Apaf-1-cytochrome c [434].
a) b)
77
Les protéines Smac/DIABLO et Omi/HtrA2 (figure 15a) inhibent l‟activité des IAPs
(Inhibitor of Apoptosis) qui ont à leur tour une activité anti-apoptotique, en agissant sur les
caspases initiatrices et effectrices [291], [292].
D‟autres facteurs apoptogènes sont relargués: AIF (apoptosis-Inducing Factor) et
EndoG (Endonucléase G) (figure 15a). AIF est enchâssé dans la membrane interne de la
mitochondrie où il exerce une activité NADH-oxydase [293].
L‟activation de la voie intrinsèque implique une augmentation du calcium
intracellulaire, AIF est clivé par la calpaïne-I (une protéase calcium dépendante) et peut ainsi
s‟exporter vers le cytosol, puis vers le noyau [294]. Dans le noyau, AIF induit une
condensation périphérique de la chromatine ainsi qu‟un clivage de l‟ADN par interaction
directe sans spécificité de séquence [295]. EndoG est une nucléase mitochondriale de 30 KDa
[296]. L‟activation de la voie intrinsèque de l‟apoptose conduit aussi à la libération d‟EndoG
dans le cytosol puis à sa translocation dans le noyau où elle agit avec l‟exonucléase et la
DNase I afin de fragmenter l‟ADN [297].
A.3. Le mode d’activation des caspases
Les caspases, une famille des protéases majoritairement impliquées dans l‟apoptose,
sont les coordinateurs de ce processus. Les caspases (« cysteinyl–aspartate-cleaving
proteases ») possèdent un résidu cystéine dans leur site actif et un résidu aspartate dans leur
site de clivage [298]. Chez les mammifères, il existe 14 caspases (dont 12 chez l‟homme)
classées en trois sous types (figure 16a): les caspases initiatrices, les caspases effectrices et les
caspases inflammatoires [299]. Les caspases 1, 4, 5 et 12 ne participent pas au processus
apoptotique, elles sont activées lors de la réponse immunitaire.
Toutes les caspases ont une structure conservée et sont synthétisées sous forme de
précurseurs inactifs ou zymogènes appelés pro-caspases. Les caspases initiatrices et
effectrices présentent deux sous-unités communes, une grande sous-unité α (17-20 kDa) qui
contient le site catalytique de l‟enzyme et qui se situe au milieu de la protéine, et une petite
sous-unité β (10-12 kDa) localisée dans la partie carboxy-terminal. La présence d‟un pro-
domaine homotypique, localisé à l‟extrémité amino-terminale de la protéine caractérise les
caspases initiatrices [299], le pro-domaine peut être constituée de deux motifs différents:
CARD (pour « caspase recrutement domain ») et DED (pour « death effector domain ») qui
permettent une interaction entre les caspases. L‟activation des pro-caspases nécessite le
clivage du pro-domaine et un clivage entre la grande sous-unité α et la petite sous-unité β,
78
conduisant à une forme active, les caspases fonctionnent classiquement suite à une
dimérisation symétrique de deux hétérodimères (αββ′α′) (figure 16b). En absence de tout
stimulus apoptotique, les caspases initiatrices existent sous forme de monomère et les
caspases effectrices sous forme de dimères de pro-caspase [300].
Les caspases initiatrices (caspases 2, 8, 9, et 10) sont activées en réponse aux stimuli
pro-apoptotiques, puis elles clivent à leur tour les caspases effectrices (caspases 3, 6, et 7) qui
sont responsables de la destruction de la cellule. L‟action des caspases effectrices prend sa
place ce qui permet la destruction de plusieurs structures cellulaires clés, où ces dernières ont
des centaines de substrats qui vont contribuer à la destruction de la cellule apoptotique : la
perte de morphologie des cellules est la conséquence du clivage des protéines du
cytosquelette telles que les filaments d‟actines et les microtubules [301], le clivage des
lamines conduisant à la condensation nucléaire [302] ; et la fragmentation d‟ADN en
oligonucléomes qui est généralement réalisé par la nucléase DFF40 (DNA fragmentation
factor/CAD (caspase activated-DNase) qui coupe l‟ADN génomique en fragments de 180
paires de bases en fin d‟apoptose [303]. Cette nucléase existe dans la cellule sous forme de
complexe inactif, liée à une chaperonne inhibitrice, la DFF45/ICAD (inhibitor of CAD). Ce
complexe est dissocié par l‟action de la caspase 3 qui clive DFF45 en trois sites différents et
permet à DFF40 de former des dimères qui sont alors actifs.
B. Les différents types de mort non-apoptotique
B.1. La nécrose
La nécrose a été définie premièrement comme une mort anormale, incontrôlée et non
programmée d‟une cellule ou d‟un tissu, en opposition avec l‟apoptose. Cependant les
découvertes récentes de médiateurs clés de la mort nécrotique tels que RIP kinases et PARP,
révèlent l‟existence d‟une nécrose induite. Receptor Interacting Protein kinases (RIP), le poly
(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP1), NADPH oxydases et les calpaïnes ont été identifiés
comme composants de signalisation potentiels de nécrose programmée [304], [305].
La nécrose est généralement associée à une réponse immunitaire inflammatoire. Cette
forme de mort cellulaire perméabilise la membrane lysosomale et relargue les contenus
cellulaires des cellules mortes, les DAMPs (Damage/Danger-Associated Molecular Patterns),
résultant en des réactions immunitaires [306] (figure 17). Ces DAMPs vont se lier à des
récepteurs spécifiques à la surface des cellules phagocytaires (macrophages, cellules
dendritiques). Ces dernières vont alors secréter des cytokines pro-inflammatoires (TNF,
79
Interleukines IL-1, IL-6 et IL-8) responsables de la maturation des cellules dendritiques et de
l‟activation de l‟immunité adaptative [307]. Une réponse pro-inflammatoire est donc
provoquée par les cellules nécrotiques.
D‟autre part, plusieurs études mettent en évidence une programmation du processus
nécrotique où les études portant sur la signalisation de la nécrose ont été principalement
réalisées dans les modèles cellulaires L929 (lignée de fibrosarcome de souris) et Jurkat
(lignée leucémique lymphoblastique T humaine). Ces études ont permis de faire émerger le
concept de «nécroptose», c‟est-à-dire une mort cellulaire programmée avec les
caractéristiques morphologiques nécrotiques avec l‟intervention de constituants de la voie
apoptotique des récepteurs de mort [272], [308], tels que le TNF [309], TRAIL et FasL [310].
B.1.1. Caractéristiques de la cellule nécrotique
La cellule nécrotique a longtemps été caractérisée par l‟absence des modifications
cellulaires caractéristiques de l‟apoptose ou de l‟autophagie. La cellule nécrotique est
caractérisée par une augmentation du volume (oncosis), un gonflement des organelles et une
rupture précoce de la membrane plasmique avec perte du contenu intracellulaire [278] (figure
13). Outre les changements morphologiques, la cellule nécrotique se distingue de la cellule
apoptotique par une dégradation progressive de la chromatine nucléaire s‟accompagnant
d‟une fragmentation aléatoire de l‟ADN. Durant la nécrose, les cellules présentent une chute
du potentiel de la membrane mitochondriale ψm et leurs membranes mitochondriales se
perméabilisent comme pour les cellules en apoptose.
La détection d‟ADN fragmenté par la méthode TUNEL et l‟absence d‟activation de la
cascade des caspases, est un paramètre essentiel qui distinguent aussi la cellule nécrotique de
la cellule apoptotique [311].
80
Structures des caspases
Mode d’activation
Caspases initiatrices
Caspases effectrices
a)
b)
Figure 16 : Représentation schématique des caspases humaines, leur structure et de leur mode d’activation.
(a) Parmi les caspases, 7 sont impliquées dans l‟apoptose (caspases 2, 3, 6, 7, 8, 9, et 10) et 4 dans l‟inflammation (caspases 1,4, 5, 12). La caspase 14 semble impliquée dans le développement des kératinocytes [435].
(b) Les pro-caspases initiatrices monomériques se dimérisent avant leur activation par clivage au niveau des résidus aspartate (Asp) présents entre le pro-domaine et la grande sous-unité et entre les deux sous-unités. Les pro-caspases effectrices dimériques sont activées par les mêmes clivages que les pro-caspases initiatrices [436].
81
Figure 17: Déclenchement de l’inflammation durant la nécrose
Les cellules nécrotiques activent le complément et relarguent des protéases et des DAMPs (Damage/Danger-Associated Molecular Patterns). Les DAMPs sont repérés par les cellules immunitaires qui vont déclencher une réponse inflammatoire. Les cellules immunitaires circulantes et les anticorps solubles vont, par la circulation, atteindre les cellules nécrotiques, neutraliser les dommages tissulaires, phagocyter les cellules mortes et stimuler la réparation des tissus [312].
82
B.1.2. La voie d’induction de la nécrose
La mort par nécrose est induite généralement suite à un traumatisme comme un stress
mécanique, chimique ou des températures extrêmes [313]. La nécrose intervient lors de
phénomènes d‟ischémie/reperfusion et notamment au cours de greffes hépatiques [314]. Les
études décrivent la nécrose comme une mort cellulaire par défaut due à l‟inhibition
d‟événements essentiels au déroulement des processus apoptotiques et/ou autophagiques,
résultant alors dans l‟induction d‟une mort cellulaire nécrotique.
En effet, l‟inhibition simultanée des protéines intervenant dans la perméabilisation des
membranes mitochondriales (PMM) et des protéines essentielles au déroulement de
l‟autophagie [315] ou l‟inhibition de l‟activité des caspases (utilisation du z-VAD, inhibiteur
global des caspases) [316], dirige la cellule vers une mort par nécrose. Une déplétion en ATP
peut également favoriser un basculement vers une mort nécrotique car l‟ATP est nécessaire à
l‟activation de la cascade des caspases [317].
Cependant, quelques études ont mis en évidence une programmation du
déclenchement et du déroulement du processus nécrotique [305]. La nécrose peut être
déclenché par l'occupation de récepteurs par leurs ligands spécifiques, un des modèles les
mieux étudiés de la mort nécrotique induite est la lignée cellulaire de fibrosarcome L929
traitées avec TNFα. Dans ce modèle, les cellules déclenchent une voie complexe multi-signal
dans lesquels FADD est recruté à la récepteur de TNFR1 et induit la nécrose [318].
Les inducteurs de la mort par nécroptose les mieux caractérisés sont les ligands des
récepteurs de mort, en particulier, le facteur de nécrose tumorale (TNF), nommé ainsi en
raison de ses propriétés stimulantes de nécrose. Le facteur TNF a été connu depuis de
nombreuses années parce qu‟il induit également une forme non-apoptotique de la mort
cellulaire (la nécroptose), en addition à son rôle pro-inflammatoire et apoptotique. [309]. Il est
important de noter que d‟autres ligands induisent la nécroptose comme le TRAIL et FasL. La
fixation des ligands sur les récepteurs de mort activent la voie kinase RIP1 (Receptor-
interacting protein 1) [310] et RIP3 [319], [320]. Ces deux kinases sont activées par
phosphorylation en aval des récepteurs de mort et vont interagir au sein d‟un complexe multi-
protéique appelé nécrosome [321]. Ce complexe diffère du complexe DISC, activé dans la
voie apoptotique extrinsèque, car il fait intervenir un partenaire supplémentaire: RIP1 (Figure
18). Pour l‟instant, des molécules divers participent dans cette mécanisme de mort dont le rôle
n‟est pas connu comme le FADD et caspase 8 qui sont présents dans le nécrosome [322].
83
Nécrosome
ROS
Nécrose
Altération de la mitochondrie
Z-VAD- fmk
Figure 18 : La signalisation de la nécrose programmée
La signalisation actuellement connue pour l‟exécution de la nécrose programmée a de nombreuses caractéristiques communes avec la voie extrinsèque de l‟apoptose. En aval du TNFR il y a formation d‟un complexe multi-protéique impliquant FADD ou TRADD, RIP1, RIP3 et la caspase 8. RIP3 peut ensuite interagir avec des enzymes métaboliques et augmenter leur activité catalytique produisant ainsi plus de substrats pour la chaîne respiratoire. Cela mène à une surproduction d‟EAO (espèces activées de l‟oxygène) mitochondriaux qui vont induire la perméabilisation de la membrane mitochondriale et la mort de la cellule.
84
Les intervenants situés plus en aval dans la signalisation nécroptotique ne sont pas encore
clairement identifiés. La mitochondrie est altérée lors d‟une mort cellulaire nécrotique, suite à
une production excessive de radicaux libre oxygénés (ROS) [320],[323], mais l‟importance de
leur rôle semble varier selon les lignées testées [324].
B.2. L’autophagie
Le terme autophagie vient du grec et signifie se manger soi-même : “auto”: soi-même
et “phagie”: manger. L‟autophagie, est un processus de dégradation des protéines, des
organites cytoplasmiques tels que le réticulum endoplasmique (RE), les mitochondries,
l‟appareil de golgi. L‟autophagie joue un rôle important dans le maintien de l‟homéostasie
puisqu‟elle permet l‟élimination et le remplacement des organites non fonctionnels en
condition de stress. Ce mécanisme a été identifié en 1963 par Christian de Duve, prix Nobel
de physiologie en 1974 pour son travail sur les lysosomes [325]. Christian de Duve a observé
des vésicules à simple ou double membranes contenant des éléments du cytoplasme, incluant
des organelles telles que des mitochondries à différents stades de digestion, et a utilisé le mot
autophagie pour la première fois afin de décrire ce phénomène.
B.2.1. Caractéristiques de la cellule autophagique
Une cellule autophagique se caractérise notamment par une accumulation massive
dans le cytoplasme des vésicules à doubles membranes « les autophagosomes» et une absence
de condensation de la chromatine [326]. L‟autophagie, se décompose en trois étapes. L‟étape
d‟initiation, se caractérise par la formation d‟une vacuole isolée appelée phagophore qui se
forme dans le cytoplasme de la cellule. Lors de l‟élongation, chaque extrémité du phagophore
s‟allonge jusqu‟à la fusion des deux extrémités formant une vésicule à double membrane
appelée autophagosome dans laquelle des portions de cytoplasme sont séquestrées. La
dernière étape est la fusion de l‟autophagosome avec des lysosomes. La structure ainsi formée
est appelée autolysosome et permet la dégradation du contenu grâce aux enzymes
lysosomales. Dans certains cas, les autophagosomes peuvent fusionner avec des endosomes,
avant leur fusion avec les lysosomes, formant les amphisomes (figure 19a).
Les analyses en microscopie électronique à transmission (MET) (figure 19b) sur des
sections ultrafines permettent de détecter les différents stades de l‟autophagie, en se basant sur
la forme et le déplacement des vacuoles. L‟un des critères essentiels pour identifier une
cellule autophagique est la présence des autophagosomes qui doivent contenir du matériel
cytoplasmique ainsi que des organites, tels que RE, mitochondries, ribosomes [327].
85
a)
b)
Figure 19 : Les autophagosomes au cours du processus autophagique
a) Les différentes étapes du processus autophagique, les protéines et organites devant être dégradés sont
séquestrés dans des structures dans des structures vacuolaires, appelées autophagosomes, et délimitées par une double membrane [328].
b) Observation en MET de cellules autophagiques, les structures autophagiques « autophagosome » sont
marqués par les points des flèches et les noyaux sont étiquetés par la lettre N [329].
86
Les cellules autophagiques sont également caractérisées par un marquage spécifique de la
protéine MAP1-LC3 (microtubule-associated protein 1 light chaine 3) constitutive de la
membrane des autophagosomes et impliquée dans la formation du phagophore [330], [331].
B.2.2. La voie d’induction de l’autophagie
Il existe trois types d‟autophagie conduisant à la dégradation de portions du
cytoplasme: la macroautophagie, la microautophagie et l‟autophagie médiée par les
chaperonnes. Nous abordons dans cette partie une vue générale sur les principales voies de
signalisation ainsi que les principales molécules régulatrices intervenant dans ce type de mort.
La protéine mTOR (mammalian target of rapamycin) est une protéine qui appartient à
la famille des phosphatidylinositol-related Kinase (PIKK) et de taille importante (280KDa)
[332]. Cette protéine est formée de deux complexes protéiques structurellement et
fonctionnellement distincte: mTORC1 et mTORC2 (figure 20) [333]. La protéine mTOR est
un membre de la cascade de signalisation PI3K/AKT/mTOR, elle va réguler le processus
autophagique en fonction de la quantité des nutriments et des facteurs de croissance
disponibles dans la cellule. En conditions physiologiques normales, la voie PI3K/AKT/mTOR
est activée, l‟autophagie est inhibée, permettant une stimulation de la prolifération cellulaire
[334]. Par contre, la privation en nutriments inactive cette voie et les cellules entrent alors
dans un processus autophagique (figure 20) [334].
La formation de l‟autophagosome est régulée par de nombreuses protéines Atg codées
par des gènes ATG (autophagy related genes), découverts chez la levure Saccharomyces
cerevisiae dans les années 1990 [335] [336].
De plus, la protéine suppresseur de tumeur p53 intervient dans l‟induction de
l‟autophagie. Il peut induire ce type de mort cellulaire à travers deux mécanismes :
l‟inhibition de la voie de signalisation mTOR, mais également à travers l‟activation du gène
DRAM (damage-regulated autophagy modulator) [337]. DRAM est un gène cible de p53
codant pour une protéine lysosomale qui va permettre l‟induction d‟autophagie.
Des interrelations complexes entre l‟autophagie et l‟apoptose ont été mise en évidence.
En effet, les protéines de la famille Bcl-2 décrites comme étant des régulateurs du processus
apoptotique, maintenant elles sont également connues pour leur implication dans les
mécanismes d‟autophagie [338]. Les protéines anti-apoptotiques Bcl-2, Bcl-xl sont capables
d‟inhiber l‟autophagie par une interaction Beclin1/Bcl-2 ou Beclin-1/Bcl-xl, mais
l‟interruption de cette interaction conduit à l‟autophagie (figure 20) [339], [338].
87
Figure 20: Implication des protéines de la famille Bcl-2 et la voie PI3K/AKT/mTOR dans la
régulation de l’autophagie.
Une carence en nutriments désactive la voie PI3K/AKT/mTOR, et la cellule rentre dans l‟autophagie. De plus, les protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 interviennent en inhibant ce processus à travers une interaction directe avec la protéine Beclin-1.
88
B.3. La pyroptose
L‟expression « pyroptose » a été décrite en 1992 dans les macrophages et les cellules
dendritiques infectés par différentes bactéries telles que Shigella flexneri [340] et Salmonella
typhimurium [341], [342], [343], [344]. Les cellules en pyroptose présentent des
caractéristiques communes à l‟apoptose, mais également à la nécrose (Tableau 2) La
pyroptose, comme l‟apoptose, est une forme de mort cellulaire programmé qui nécessite une
activité spécifique des caspases, elle se distingue de l‟apoptose par l‟activation unique de la
caspase-1 et n‟implique pas les caspases apoptotiques [345], [346], [347].
B.3.1. Caractéristiques de la cellule en pyroptose
La pyroptose présente des modifications morphologiques et biochimiques communes à
celles trouvées dans la nécrose classique et l'apoptose. En effet, la cellule pyroptotique se
caractérise par un gonflement cytoplasmique et la formation de pores au niveau de la
membrane plasmique traduisant une perméabilisation de la membrane plasmique qui conduit
à une perte du contenu intracellulaire (pouvant être caractérisée par une libération de lactate
déshydrogénase (LDH) dans le milieu extracellulaire). En conséquence, la pyroptose est
également associée à une réponse inflammatoire comme la nécrose. Elle présente également
une fragmentation aléatoire de l'ADN sans condensation de la chromatine. Enfin, les
mécanismes de signalisation de la pyroptose engagent l‟activation de la caspase-1 et sont
indépendants de l‟activité des caspases apoptotiques. Il est à noter que le rôle de la caspase-1
dans la signalisation intracellulaire de la cellule pyroptotique intervient dans la réponse
inflammatoire, mais également dans les mécanismes aboutissant à la mort cellulaire [348],
[349].
Un tableau, présenté ci-dessous, permet la comparaison des caractéristiques
principales de l‟apoptose, la nécrose et la pyroptose. Notons que la pyroptose a été
principalement étudiée dans des cellules immunitaires. Quelques études récentes montrent
que ce processus de mort cellulaire peut également se produire pour des cellules épithéliales
(kératinocytes [350], cellules de la rétine [351], cellules tumorales du colon [352]).
89
Tableau 2: Un tableau comparatif des caractéristiques multiples de la nécrose/ apoptose et pyroptose.
90
B.3.2. La voie d’induction de la pyroptose
La voie de mort par pyroptose a été plus particulièrement étudiée dans les cellules du
système immunitaire. L'induction de la pyroptose par des bactéries pathogènes comme la S.
typhimurium [353], [354], L. pneumophila [355] et P. aeruginosa [356], [357] est suffisante
pour déclencher l‟activation de la caspase-1, la pyroptose, et la sécrétion d‟interleukine. Les
cellules déficientes en caspase-1 répondent à tous les signaux d‟apoptose ce qui signifie
qu‟elle n‟intervient pas dans la voie de mort apoptotique [358]. La caspase-1 joue aussi un
rôle clé dans le clivage des pro-formes IL-1β et IL-18 en cytokines inflammatoires matures
[359].
L‟activation de la caspase-1 est régulée par un complexe protéique, analogue à
l‟apoptosome, nommé l‟inflammasome. La formation de l‟inflammasome est coordonnée par
la famille de protéines NLRs (Nod-Like receptors) ou la famille de protéines PYHIN (Aim2).
Les protéines NLRC4 et NLRPb murin contenant un domaine CARD interagissent
directement avec celui de la Caspase-1 [360]. Par contre, la protéine NLRP3 dépourvue de
domaine CARD recrute, via son domaine pyrine, une protéine intermédiaire ou adaptatrice
ASC (appelée aussi PYCARD et dotée des domaines pyrine et CARD) qui est capable
d‟interagir avec la Caspase-1 par son domaine CARD [361]. La protéine AIM 2 (Interferon-
inductible protein), appartenant à la famille des protéine PYHIN, recrute la protéine
adaptatrice ASC pour former le complexe avec la Caspase-1 (figure 21b) [362]. La Caspase-1
s‟active par différents clivages: au niveau des sites D103 ou D122 pour permettre la libération
du domaine CARD, les clivages au niveau du D296, D308, D313 et D314 conduisant à la
formation des fragments p10 et p20 (figure 21a) [363]. La caspase-1 activée est nécessaire
pour la maturation des pro-interleukines (pro-IL-1β, pro-IL-18) et l‟induction de la pyroptose.
C. Compartiment lysosomale et mort cellulaire
C.1. Les lysosomes
Christian de Duve décrivait en 1955 l‟existence d‟une structure vacuolaire riche en
enzymes hydrolytiques, au sein de cellules hépatiques de rat qu‟il nomma « lysosome », se
référant à sa fonction lytique [364], [365]. Parallèlement, l‟existence de cette structure a été
mis en évidence par des études en microscopie électronique réalisées sur des cellules et des
tissus [366].
91
a)
b)
Figure 21: La voie d’induction de la pyroptose
(a) Une figure détaillé des sites de clivages différentes de la procaspase-1 la procaspase-1 [363]. (b) Les inflammasomes recrutent la protéine ASC ce qui permette leur liaison à la pro-caspase 1. Ce dernier se clive par l‟inflamasomme et à son tour clive les pro IL-1β et pro-IL18.
92
Le lysosome est une organelle cytosolique, il acquiert au cours de sa maturation un
ensemble d‟enzymes hydrolytiques (protéases dont les cathepsines, nucléase, glycosidase,
lipase...) dont le fonctionnement est optimal à pH acide. Il est entouré par une bicouche
phospholipidique qui protège le contenu cellulaire de l‟action enzymatique [367]. Il existe 25
protéines identifiées de la membrane lysosomale, dont les plus abondantes sont : LAMP 1 et -
2 (lysosomal-associated membrane protein), LIMP-2 (lysosomal integral membrane protein)
et CD63 [368].
Les lysosomes sont des organelles hautement dynamiques, qui reçoivent des protéines
endogènes et exogènes ainsi que des organelles cellulaires, de l‟endocytose, de la pinocytose,
de la phagocytose et de l‟autophagie [367].
Les pathologies liées au dysfonctionnement lysosomal ou à l‟expression des enzymes
lysosomales sont nombreuses : maladies congénitales, troubles associés au vieillissement dont
certaines maladies neuro-dégénératives, cardiovasculaires et cancer [369], [370].
C.2. La perméabilisation de la membrane lysosomale (LMP)
La perméabilisation de la membrane lysosomale est un évènement souvent retrouvé, à
un stade précoce ou tardif, dans les mécanismes de mort cellulaire apoptotique, nécrotique ou
pyroptotique. Le mécanisme par lequel les enzymes s‟échappent du compartiment lysosomale
est appelé LMP (Lysosomal membrane permebilization). De plus, les travaux de Anna Senik
et ses collaborateurs montrent que la fuite du contenu lysosomal dépend de la taille des pores
formés ; 10 et 40 kDa du dextrane-FITC sont libérés au cours d‟apoptose induite par
staurosporine dans des cellules T, tandis que les 70 et 250 kDa du dextrane-FITC sont retenus
[371]. Néanmoins, cette limite de sélection par taille de protéines ne s‟applique pas dans tous
les modèles de la mort.
Plusieurs mécanismes contribuant à la perméabilisation de la membrane lysosomale
ont été décrits et sont détaillés dans la section suivante (C.2.1. les inducteurs du LMP).
C.2.1. Les inducteurs du LMP
a) La déstabilisation lysosomale médiée par les radicaux libres oxygénés (ROS)
La formation de radicaux libres oxygénés peut conduire au déclenchement de la
perméabilisation de la membrane lysosomale (LMP). De nombreux stimulis peuvent induire
la génération des ROS, tels que les médicaments, des rayonnements ionisants ou par des
conditions différentes comme l‟inflammation et les troubles neurodégénératifs [372]. Durant
le stress oxydatif, l‟excès de peroxyde d‟hydrogène dans les lysosomes peut réagir avec le fer
93
en forme actif (Fe2+), provenant de la dégradation des macromolécules riches en fer. Cette
réaction, appelée réaction de fenton, conduit à la formation de ROS [373]. Les radicaux libres
oxygénés (ROS) ainsi générés déstabilisent la membrane lysosomale par peroxydation des
lipides membranaires et une dégradation des protéines membranaires (figure 22) [374].
Plusieurs études ont permis de démontrer le rôle primordial du peroxyde d‟hydrogène [375],
[376], et du Fe2+ [377], dans l'induction de la perméabilisation de la membrane lysosomale
(LMP). En effet, un excès de ces composés augmente la sensibilité lysosomale à la
peroxydation membranaire tandis qu‟un déficit inhibe ce processus. Par exemple, des
macrophages qui ont été cultivé dans du milieu riche en particules de silice enrobées par des
molécules de fer montrent un fort dommage au niveau membranaire, tandis que le dommage a
beaucoup diminué dans ceux qui ont ingéré des particules de silice prétraités avec le chélateur
de fer « desferrioxamine » [378].
b) Les détergents lysosomotropes
Les agents lyosomotropes sont des bases faibles qui s‟accumulent dans les lysosomes.
Ils s‟acidifient dans les lysosomes après protonation [379], [380]. On trouve parmi ces
détergents lysosomotropes: des amines avec des chaines hydrophobes (imidazol, morpholine)
[380], la ciprofloxamine [381], la sphingosine [382] et la siramesine [383]. En outre, l‟ester
méthylique L-leucyl-L-leucine (Leu-Leu-OMe) est un agent lysosomotrope en cours de
développement d‟essai clinique afin de l‟utiliser comme un immuno-suppresseur, en raison
de son effet cytotoxique sur les lymphocytes. La sensibilité accrue de ces cellules dépend de
leur niveau élevé en cathepsine C, qui est nécessaire pour convertir Leu-Leu-OMe en un
détergent (Leu-Leu)n-OMe (n ≥ 3), après adressage aux lysosomes par endocytose [384].
Le sphingolipide sphingosine est un agent lysosomotrope, lipophile, qui s‟accumule
dans les compartiments acides dans lesquels il agit comme un détergent. Des doses modérées
de sphingosine peuvent induire une cascade de mort cellulaire impliquant la LMP, l‟activation
de la voie mitochondriale et des caspases [385]. Par contre, des doses élevées de sphingosine
vont provoquer une rupture lysosomale massive aboutissant à une nécrose rapide de la cellule
[386]. Plusieurs études ont contribué à montrer que le rôle de sphingosine intracellulaire, en
régulant son niveau intervient dans la perméabilisation de la membrane lysosomale,
Wernerburg et ses collaborateurs ont montré sur des hépatocytes, qu‟un traitement TNF-α
(tumor necrosis factor alpha) augmente le taux intracellulaire de sphingosine et par suite LMP
[387]. De plus, la surexpression du dominant négatif, la sphingomyélinase FAN (neutral
94
sphingomyelinase activation) réduit LMP, la fuite des cathepsines B et diminue l‟apoptose
[388].
Enfin, il existe plusieurs inducteurs différents de LMP dont les cathepsines, les lipides,
les toxines, la protéine Bcl-2, les protéines lysosomales, les caspases. Nous les présenterons
dans le tableau répertoire ci-après (tableau 3).
C.2.2. Les cathepsines
Parmi les enzymes lysosomales, les protéases de la famille des cathepsines sont les
plus connues. Il existe trois types de cathepsines, classées selon leur spécificité catalytique :
sérine-cathepsines (cathepsines A et G), les aspartates cathepsines (cathepsines D et E) et
cystéine-cathepsines (cathepsines B, C, F, H, K, L, O, S, V, W, et X). Les cathepsines D, B,
C, H et L, sont les plus abondants dans le compartiment lysosomal [389]. Les rôles des
cathepsines ont longtemps été associés à leur fonction de dégradation à l‟intérieur des
lysosomes où l‟environnement acide (pH 4.5-5.0) facilite ce processus [390], [391].
Cependant, plusieurs études rapportent le rôle des cathepsines dans les mécanismes
aboutissant à la mort cellulaire [392], bien qu‟il existe des inhibiteurs endogènes dans le
cytosol, les stefines, aussi appelées cystatines, qui limitent l‟activité des cathepsines à motif
cystéine volontairement ou accidentellement relâchées [393], [383]. En effet, la plupart des
études suggèrent que la mort cellulaire médiée par les cathepsines procède par une
déstabilisation de la mitochondrie [392]. La première preuve de la capacité des cathepsines
cytosoliques pour déclencher la mort cellulaire provient de l'étude de Karin Roberg montrant
que l‟injection de cathepsine D dans le cytosol est suffisante pour déclencher la
perméabilisation de la membrane mitochondriale externe (MOMP = mitochondrial outer
membrane permeabilization), le relargage du cytochrome c et induire l'apoptose dans des
fibroblastes humains [394].
En effet, le mécanisme de régulation pH-dépendent est essentiellement lié au
déclenchement de l‟apoptose. Les cathepsines sont des enzymes dont l‟activité est optimale à
un pH acide (comme dans les lysosomes) : Bien que, leur activité est diminuée dans le cytosol
à pH neutre, les cathepsines peuvent toutefois agir dans ce compartiment [395]. Une
acidification du cytosol, suite à la libération du contenu lysosomal acide, pourrait participer à
la conservation de l‟activité protéolytique des cathepsines [396], [397], [398], [399]. Des
expériences soutiennent que le pH optimal pour l‟activation des caspases se situe près de pH
95
6,4. Le pH 7,4 du cytosol, diminue l‟activité des caspases pour atteindre 25% de la valeur
optimale [397].
C.3. L’implication des lysosomes dans la mort cellulaire
Le rôle des cathepsines dans les différents types de mort cellulaire a été mis en
évidence : nécrose, apoptose, autophagie, et pyroptose. La nécrose peut être induite par une
sortie soudaine et massive des hydrolases contenues dans les lysosomes [382] et la mort
cellulaire autophagique, lorsque les autophagosomes viendront fusionner avec les lysosomes
afin de former des autophagolysosomes, permettant à leur contenu d‟être dégradé par les
hydrolases lysosomales [400]. Nous détaillerons dans ce chapitre le rôle des cathepsines
comme inducteurs de l‟apoptose et de la pyroptose.
C.3.1. Rôle des lysosomes dans la cascade apoptotique
En fonction du type cellulaire et du stimulus utilisé, le compartiment lysosomal dans la
mort cellulaire par apoptose peut intervenir soit dans la phase d‟initiation, en initiant ou en
contribuant à l‟initiation de la cascade apoptotique, soit dans la phase d‟exécution, en
participant à la destruction finale de la cellule par les protéases lysosomales.
Plusieurs travaux démontrent l‟action pro-apoptotique des cathepsines, spécifiquement
les cystéines-cathepsines B et L et aspartate-cathepsines. Après libération dans le cytoplasme,
suite à la LMP, les cathepsines B, H, L, et S clivent les protéines pro-apoptotique de la famille
Bcl-2, Bid [401]. À noter que la protéolyse de Bid est attribuable aux cathepsines à motifs
cystéines, puisque le motif catalytique de la cathepsine à motif acide aspartique ne correspond
pas au site de clivage de Bid [402] et que le pepstatin A, un inhibiteur spécifique à ce type de
cathepsines, n‟inhibe pas le clivage de Bid [403]. Par contre, un mécanisme en deux étapes a
été rapporté, dans lequel la cathepsine D (aspartate protéase) active la cathepsine B (cystéine
protéase) qui ensuite clive la protéine Bid [404]. La forme tronquée tBid, ainsi générée
conserve tout de même son potentiel d‟activer la MOMP, contribuant à l‟activation de la voie
mitochondriale [283], [401]. L‟une des premières observations, suggérant une implication du
compartiment lysosomal dans les mécanismes conduisant à la mort cellulaire, fût
l‟acidification cytosolique [405], [406]. Des travaux montrent que dans les cellules U-937
apoptotiques, le pH cytosolique décroit de 7,2 ± 0,1 à 5,8 ± 0,1 tandis que le pH intra-
lysosomal passe de 4,3 ± 0,4 à 5,2 ± 0,3 quatre heures après le traitement au TNF-α [398].
D‟autre part, l‟acidification du cytosol pourrait, d‟une part, contribuer à l‟activation des
caspases [397]. et d‟autre part, faciliter la dimérisation des membres pro-apoptotiques de la
96
famille Bcl-2 et leur capacité à provoquer la perméabilisation de la membrane mitochondriale
[407].
C.3.2. Rôle des lysosomes dans la pyroptose
Des études montrent que la fuite des protéases lysosomales suite à une
perméabilisation membranaire, stimule la formation des inflammasomes suivie par un clivage
du pro-caspase 1 et l‟activation d‟un processus de mort cellulaire appelé « pyroptose ».
Une étude sur des cellules épithéliales de la rétine (EPR) montre que, la
perméabilisation des lysosomes induite par le Leu-Leu-OMe permet la formation de
l'inflammasome, l‟activation de la de caspase-1 qui intervient alors dans la maturation de
l‟interleukine (IL-1β) et dans le processus de mort cellulaire. Cet effet est inhibé en présence
de l‟inhibiteur DPP-I (Gly-Phe-NH2) bloquant la destruction des lysosomes par le LLOme,
d‟inhibiteurs de Cathepsines B/L ou de caspase-1 [408]. Kathleen M. Averette et al. ont
confirmé cette hypothèse sur les macrophages et les cellules dendritiques [409],[410].
97
Figure 22: La perméabilisation de la membrane lysosomale par le stress oxydatif
Le peroxyde d'hydrogène, est produit principalement par les mitochondries, diffuse dans les lysosomes avec des quantités anormales. De plus, les lysosomes sont riches en fer redox actif (Fe2+) en raison de la dégradation des macromolécules contenant du fer, des réactions du type Fenton ont eu lieu résultant en une rupture lysosomale avec une libération des enzymes lytiques puissantes [373].
98
Tableau 3: Un tableau répertoire des observations sur l’activation de la voie lysosomale conduisant à l’apoptose [411].
99
Résultats Et
Discussion
100
PARTIE I
Preuve de concept de nanothérapie ciblée par
hyperthermie magnétique
101
INTRODUCTION
Une des avancées thérapeutiques majeures en cancérologie au cours de ces deux
dernières décennies concerne les thérapies ciblées qui visent à accroitre l‟efficacité des
traitements tout en minimisant les effets secondaires et les dommages sur les tissus sains.
Toutefois, une forte proportion de patients échappe encore à la guérison. Parmi les causes
d‟échecs thérapeutiques, on trouve le diagnostic tardif de certains cancers, la grande
hétérogénéité des cancers (hétérogénéité entre tumeurs pour un même type de cancer et à
l‟intérieur d‟une même tumeur) et la capacité des cellules tumorales à mettre en œuvre des
mécanismes de résistance leur permettant d‟échapper aux traitements. Il est donc impératif de
continuer à accroitre l‟arsenal diagnostique thérapeutique disponible.
L‟élaboration des thérapies ciblées anti-tumorales a été rendu possible notamment par
la mise en évidence de la surexpression de certains marqueurs, protéines, récepteurs à la
surface des cellules tumorales comparativement aux tissus sains environnants, permettant
ainsi d‟améliorer les techniques de diagnostic et la délivrance ciblée d‟agents thérapeutiques
vers les cellules tumorales [108], [412]. Par exemple, la mise en évidence de la surexpression
des récepteurs de la somatostatine dans les tumeurs neuroendocrines ont conduit au
développement de l‟Octreoscan®, un analogue radioactif utilisé en clinique pour le
diagnostic, mais également en thérapie, des tumeurs neuroendocrines [9]. Les efforts de
recherche de notre équipe ont montré l‟implication tumorale du récepteur de la CCK et de la
gastrine (RCCK2) appartenant à la famille des récepteurs à sept domaines transmembranaires
(R7TM) et couplés aux protéines G. Nos travaux montrent que ce récepteur est surexprimé
dans certains cancers digestifs (estomac, pancréas) ainsi que dans les tumeurs endocrines [32],
[82].
D‟autre part, le développement des nanotechnologies dans le domaine de la médecine
est en plein essor, en particulier en cancérologie. Les nanoparticules magnétiques et plus
particulièrement les nanoparticules d‟oxyde de fer (IONPs) qui sont biocompatibles, sont
utilisées comme agents de contraste pour améliorer la sensibilité de la détection par IRM
[237]. De plus, leurs propriétés magnétiques permettent d‟utiliser les nanoparticules
magnétiques pour la thérapie par hyperthermie [413], [414]. Lorsqu‟elles sont injectées chez
les patients, elles sont opsonisées par les macrophages du système réticulo-endothélial,
s‟accumulent au niveau du foie, de la rate et de la moelle osseuse et sont donc utilisées pour le
102
diagnostic de pathologies affectant ces tissus [415]. Pour détecter les cancers touchant
d‟autres tissus, il est nécessaire de les vectoriser, en greffant à leur surface un anticorps, un
peptide ou un oligonucléotide dont la cible est présente sur les cellules tumorales [108].
Dans ce contexte, nous avons développé une nanoplateforme composée d‟IONP
vectorisée avec un analogue du ligand spécifique du récepteur CCK2, la mini-gastrine, afin de
cibler les cellules tumorales qui surexpriment ce récepteur. Cette nanoplateforme est appelée
MG-IONP-DY647.
Dans ce travail, nous démontrons la capacité du MG-IONP-DY647 à cibler
spécifiquement les cellules qui surexpriment le RCCK2. Nous avons caractérisé les
mécanismes d‟internalisation des nanoparticules et leur accumulation dans les lysosomes,
comparativement au ligand libre dans la lignée cellulaire HEK-FLpIn qui est le modèle
reconnu pour l‟étude de mécanismes d‟internalisation, ainsi que dans la lignée tumorale
endocrine INR1G9 et un clone stable exprimant le RCCK2 [416]. Nous avons ensuite
appliqué différentes conditions de champ magnétique alternatif à haute fréquence,
susceptibles d‟induire une hyperthermie magnétique et analysé l‟effet sur la survie et la mort
cellulaire. Enfin, nous avons abordé l‟étude des mécanismes cellulaires aboutissant à la mort
des cellules tumorales ayant internalisé des nanoparticules magnétiques et soumises au champ
magnétique.
103
ARTICLE I
Targeting G- Protein- Coupled Receptor
Overexpressed in Endocrine Tumors by Magnetic
Nanoparticles to Induce Cell Death
(Accepté dans ACS Nano, le 8 janvier 2014)
104
105
106
107
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116
117
118
DISCUSSION
Dans le contexte de succès croissant de la thérapie ciblée des cancers, l‟objectif de ces
travaux était de conjuguer un analogue de la gastrine synthétique, la mini-gastrine (MG) avec
des nanoparticules magnétiques afin de cibler les tumeurs qui surexpriment le récepteur
CCK2. Les nanoparticules d‟oxyde de fer, enrobées d‟un PEG ont été choisi pour nos études
pour leur biocompatibilité et leur demi-vie plasmatique assez long. De plus, l‟enrobage PEG
comportant des groupements amines a permis la liaison covalente de la gastrine, d‟une part, et
d‟ajouter une molécule fluorescente afin de faciliter leur détection en microscopie, d‟autre
part. Dans un premier temps, nous avons vérifié la toxicité des nanoparticules MG-IONP-
DY647 même à des concentrations élevées : l‟absence de l‟IL-1β dans le milieu des
macrophages cultivés en présence de nanoparticules, montrent la biocompatibilité des
nanoparticules d‟oxyde de fer vectorisées.
Caractérisation du trafic cellulaire suivi par les nanoparticules vectorisées
La première partie de ces travaux a consisté à déterminer les mécanismes
d‟internalisation des nanoparticules vectorisées dans le modèle cellulaire HEK293 transfecté
de manière stable avec le récepteur CCK2. Les résultats suggèrent que la liaison et
l‟internalisation des nanoparticules MG-IONP-DY647 sont totalement dépendantes de la
présence du récepteur CCK2. Cependant, nous avons constaté que la cinétique de liaison et
d‟internalisation du RCCK2 étaient beaucoup plus lente avec le MG-IONP-DY647
comparativement au ligand CCK (CCK-DY647) libre, bien que les nanoparticules
s‟internalisent avec le récepteur selon le même mécanisme moléculaire décrit pour
l‟internalisation induite par la CCK ou la gastrine [55]. En effet, les étapes clés dans le
processus d'internalisation comme le recrutement de la β-arrestine2, la participation des puits
de clatherine et la dynamine ont été observé dans les deux cas, les nanoparticules MG-IONP-
DY647 et le ligand libre (CCK-DY647) [55]. D‟autre part, dans les vésicules d‟endocytose, le
récepteur se sépare plus rapidement des nanoparticules vectorisées. Les expériences de co-
localisation avec la protéine Rab 11 ont montré que, lorsque le récepteur est stimulé par les
nanoparticules, il rejoint les vésicules de recyclage plus rapidement tandis que les
nanoparticules rejoignent les lysosomes. Nos résultats sont cohérents avec une étude
rapportant que la nanoconjugaison de quantum dots avec un anticorps dirigé contre le
récepteur de l‟EGF modifie l‟internalisation du récepteur [417].
119
Notre travail montre que les nanoparticules sont capable d’interférer avec la
cinétique du trafic intracellulaire du RCCK2, elles ne modifient pas les mécanismes impliqués
dans l’internalisation.
Effet du Traitement par hyperthermie sur les cellules tumorales
Après leur internalisation, les nanoparticules vectorisées avec la gastrine sont
adressées aux lysosomes dans les deux types de modèles cellulaires utilisées (HEK 293 et les
cellules tumorales INRG9) qui surexpriment le récepteur CCK2. Il est à noter que les
nanoparticules MG-IONP-DY647 sont beaucoup plus stables dans les lysosomes que le
ligand libre fluorescent que ne l‟on détecte plus 24h après son contact avec les cellules. Les
nanoparticules magnétiques offrent une opportunité thérapeutique prometteuse
d‟hyperthermie magnétique lors de leur exposition à un champ magnétique alternatif. Suite à
l‟accumulation des nanoparticules magnétiques dans les lysosomes et l‟application d‟un
champ magnétique, l‟hyperthermie magnétique induirait la mort cellulaire par apoptose. Nos
résultats montrent que l‟application du champ magnétique induit la mort de 17% des cellules
ayant internalisé des nanoparticules. Ce résultat est confirmé par un test MTT de survie
cellulaire à 24 heures, une diminution de 30% de la survie des cellules tumorales ayant
internalisé des nanoparticules a été observé, sans affecter des cellules dépourvues en
nanoparticules. Notons que ce phénomène se produit avec de faibles quantités de
nanoparticules internalisées (2.2 pg Fer/cellule) et sans élévation détectable de la température.
De plus, nous montrons l‟implication de la voie lysosomale et les cystéines protéases dans le
mécanisme de mort. En effet, la perte de la fluorescence rouge du LysoTracker accumulé dans
les lysosomes, reflète la perméabilité de la membrane lysosomale dans les cellules
accumulant les nanoparticules et exposées au champ magnétique.
Les données de la littérature suggèrent que, suite à l‟accumulation des nanoparticules
magnétiques dans les lysosomes et l‟application d‟un champ magnétique, l‟hyperthermie
magnétique induirait la libération du contenu lysosomal dans le cytoplasme, dont les enzymes
protéolytiques, les cathepsines B entraînant la mort de la cellule [160], [418]. Dans ce
contexte, l‟utilisation de l‟inhibiteur des cathepsines E64d est capable d‟inverser l‟effet du
champ magnétique. Donc, les nanoparticules MG-IONP-DY647 exposé à un champ
magnétique se comporte comme des agents lysosomotropes dans les cellules tumorales
endocrines. De plus, l‟étude avancée par Domenech et al. suggère que l‟internalisation des
nanoparticules magnétiques suivie par une application du champ magnétique stimule la
120
perméabilisation de la membrane lysosomale, accompagné par une production de ROS et une
mort cellulaire [160]. Ces effets sont produits sans aucune augmentation détectable de la
température du milieu d‟incubation cellulaire [160], [218], [220].
En conclusion, notre étude montre que la vectorisation de la mini-gastrine à la surface
des nanoparticules d’oxyde de fer permette un ciblage hautement spécifique des cellules HEK
293 et des cellules tumorales INR1G9 surexprimant le RCCK2. Par suite, l’activation du
RCCK2 par les nanoparticules vectorisées va provoquer leur internalisation par la voie
dépendante de la clathrine, impliquant les β-arrestines et la dynamine. Les nanoparticules
internalisées sont ensuite dirigés vers les lysosomes où elles sont accumulées d’une façon
durable et avec une quantité minime (2.2 pg/cellule). L’application du champ magnétique
alternatif (275 kHz, 40mT) sur des cellules contenant des nanoparticules MG-IONP-DY647
induit la mort cellulaire via la voie lysosomale, démontrant ainsi que la mort cellulaire est
déclenchée même avec une quantité minime de nanoparticules, possédant une faible
puissance thermique.
Nos résultats démontrent la faisabilité de la nanothérapie ciblant spécifiquement les
cellules cancéreuses. Mais, l'optimisation des nanoparticules sera nécessaire afin d'améliorer
leur efficacité de mort. La taille et la composition pourraient être modifiées pour augmenter
leur puissance en chaleur.
121
PARTIE II
Etude des mécanismes conduisant à la mort des
cellules par hyperthermie magnétique
122
INTRODUCTION
Suite à l‟étude précédente que l‟on avait publiée en 2014, on a montré que dans une
approche d‟hyperthermie magnétique, les nanoparticules d‟oxyde de fer sont utilisées pour
induire la mort des cellules cancéreuses dans lesquelles elles sont internalisées. De plus, les
études montrent que la combinaison de IONPs à un champ magnétique alternatif (AMF)
induit la mort cellulaire dans les expériences in vitro [218], [221] et une régression tumorale
chez les xénogreffes des souris [419], [420], [226]. Il est à noter que les cellules meurent en
absence d‟élévation de température perceptible au cours des expériences [160], [218], [421],
[221], [422]. Cette conclusion apporte beaucoup d'espoir de ce traitement pour l'avenir, car
elle rend possible d'induire la mort cellulaire avec une très faible quantité de NPM [421],
[423].
Malgré ces succès, les mécanismes de base conduisant à la mort cellulaire suite à
l‟application de l'AMF ne sont pas encore clairs. La clarification des mécanismes cellulaires
et moléculaires à l'origine de la mort cellulaire est une enquête majeure dans cette approche
thérapeutique.
La microscopie confocale est l‟instrument standard en biologie cellulaire. Combiné
avec de nombreuses sondes de fluorescence disponibles, il permet d'acquérir une
connaissance profonde sur la machinerie de la cellule et les mécanismes moléculaires au cours
des expériences in vitro. Jusqu'à présent, il n‟existe pas d‟étude ayant analysé en temps réel
les évènements qui se déroulent durant le traitement au champ magnétique pour deux raisons
principales (i) la plupart des inducteurs de l'AMF utilisé dans les laboratoires sont des bobines
volumineuses qui ne s‟adaptent pas à un microscope en raison du faible espace disponible et
(ii) la haute fréquence du champ magnétique pourrait chauffer les pièces ferromagnétiques du
microscope qui sont en voisinage de l'échantillon.
Dans cette étude, nous avons utilisé la microscopie confocale comme un outil
d‟observation directe et en temps réel du comportement des cellules afin de détecter in situ
plusieurs évènements : chimiques, biologiques et physiques qui participent à l‟hyperthermie
locale et par suite au processus de la mort cellulaire [424]. La variation de pH, la
perméabilisation de la membrane lysosomale, la production des radicaux libres oxygénés
(ROS), les mouvements des molécules [425], et l'activation des voies de signalisation
conduisant à la mort cellulaire pourraient donc être spatialement et temporellement détectée.
123
Nous décrivons dans cet article, une approche réussie pour réaliser l'imagerie des
cellules en temps réel pendant le traitement des cellules tumorales au champ magnétique.
Cette approche est basée sur l'application d'un champ magnétique à haute fréquence localisée,
à l'aide d'un électroaimant magnétique miniaturisé. Les potentialités de la nouvelle
configuration sont illustrées par des données montrant que le taux de dommages cellulaires, la
perméabilisation de la membrane lysosomale et la production de ROS.
Cette approche va permettre d'obtenir rapidement des informations clés sur les
mécanismes à l'origine de la mort des cellules contenant des quantités infimes de
nanoparticules. Plus généralement, il devrait donner un nouveau départ à tous les sujets en
nanomédecine, où une haute fréquence AMF est utilisée.
124
ARTICLE II
Real-Time Analysis of Magnetic Hyperthermia
Experiments on Living Cells under a Confocal
Microscope
(Accepté dans Small, le 8 janvier 2015)
125
126
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133
134
DISCUSSION
L‟objectif initial de ces travaux est d‟élucider la cascade d'événements conduisant à la
mort cellulaire dans les cellules tumorales ayant accumulé des nanoparticules d‟oxyde de fer
et soumises au champ magnétique. Une étude montrent que la génération des radicaux libres
est corrélé à la perméabilisation de la membrane lysosomale, démontrée par la diminution de
l'intensité lysosomale de l‟acridine orange et la libération de la cathepsine B dans le cytosol
[160]. Néanmoins, les mécanismes à l‟origine de la mort cellulaire par hyperthermie
magnétique sont actuellement loin d‟être compris, du fait de l‟absence des instruments
permettant une observation direct des évènements.
Dans le but de décortiquer la voie de mort cellulaire, nous présenterons dans cette
partie, l‟opportunité offerte par un électroaimant miniaturisé, d‟où les événements indiqués ci-
dessus peuvent être contrôlés de manière dynamique sous un microscope confocal pendant le
traitement au champ magnétique. Nos résultats montrent que les deux processus, la
production des ROS et la perméabilisation de la membrane lysosomale se produisent dans un
stade précoce du traitement AMF, bien avant la détection de la mort cellulaire. De plus, le fait
que la perméabilisation de la membrane lysosomale se produit en stade précoce, est en faveur
d‟une initiation de la mort cellulaire dans le compartiment lysosomal, où les nanoparticules
magnétiques sont accumulées.
Rôle des ROS dans la mort cellulaire
L‟étude de Domenech et al. avait prouvé précédemment que la perméabilisation de la
membrane lysosomale induite par le champ magnétique est corrélé à une génération de
radicaux libres oxygénés (ROS) [160]. Nous avons cherché à mesurer la production des
radicaux libres dans les différentes conditions utilisées à l‟aide du réactif fluorescent
CellROX (invitrogen). Après l‟application du champ magnétique avec une bobine
commerciale (40mT, 275 kHz), l‟analyse de la génération de ROS par cytométrie en flux
montre que le champ magnétique induit une augmentation de la production des ROS
spécifiquement dans des cellules ayant accumulé les nanoparticules MG-IONP-DY647 d‟un
facteur de 1.5 ± 0.04 comparativement à des cellules dépourvues de nanoparticules (figure 1).
En absence d'AMF, l‟exposition unique des cellules à des nanoparticules n'a pas abouti à un
changement significatif du taux de ROS. Cet effet est inhibé lorsque les cellules sont incubées
en présence d‟un piégeur de ROS, la N-acétyl-cystéine (NAC). De même, la génération de
135
ROS a été mesurée par microscopie confocale (figure 2A). Les images de la microscopie
confocale montrent encore une fois que la génération de ROS est dépendante de l‟AMF et des
nanoparticules MG-IONP-DY64 : le taux de production de ROS est augmenté d‟un facteur
4.29 ± 0.86 comparativement aux cellules contrôles. La NAC est capable d‟inhiber l‟effet du
champ magnétique sur les cellules ayant accumulé de MG-IONP-DY647. Ces observations
indiquent que la production de ROS dans les cellules est dépendante des nanoparticules et de
leur exposition à un champ magnétique. De plus, on a mentionné précédemment que
l‟électroaimant miniaturisé offre l‟avantage d‟observer sous un microscope confocal tous les
événements en direct et pendant le traitement au champ magnétique. Pour cela, nous avons
mesuré cette production de ROS durant l‟application du champ magnétique. Nos résultats
montrent une production significative dès 30 minutes d‟application du champ magnétique
(figure 2B).
Ensuite, nous avons montré l‟impact de la production des ROS sur la mort cellulaire.
Pour cela, des cellules ayant ou non accumulé des nanoparticules MG-IONP-DY647 et incubé
ou non en présence de N-acetyl-cystéine ont été soumises au champ magnétique (figure 4).
Après une révélation de la mortalité cellulaire par microscopie confocale, 4h après
l‟application du champ magnétique par un marquage annexin V/ iodure de propidium, les
résultats montrent que l‟AMF induit spécifiquement la mort des cellules ayant accumulé les
nanoparticules MG-IONP-DY647 (15%) comparativement à des cellules contrôles (7%). Cet
effet est inhibé en présence de N-acetyl-cystéine (4%), indiquant ainsi que le champ
magnétique catalyse la production de ROS dans les cellules ayant accumulé les
nanoparticules, et que cette production joue un rôle essentiel dans les mécanismes aboutissant
à la mort cellulaire induite.
136
Figure 1: L’application du champ magnétique alternatif sur des cellules ayant internalisé des nanoparticules MG-IONP-DY647 augmente la production de ROS.
La production de ROS a été quantifiée par la cytométrie de flux de l‟intensité verte de CellROX. La mesure est réalisée directement après l‟application du champ magnétique (40mT, 275 kHz) sur des cellules INR1G9-RCCK2 ayant internalisées ou non les nanoparticules MG-IONP-DY647, elles sont incubées en présence ou non du chélateur des ROS N-acetyl-cystéine, puis soumises ou non au champ magnétique.
AMF - + - + - + - +
MNP - - - - + + + +
NAC - - + + - - + +
** *** ***
137
Figure 2: L’application du champ magnétique alternatif sur des cellules ayant internalisé des nanoparticules MG-IONP-DY647 augmente la production de ROS.
La production de ROS a été quantifiée par analyse d‟images à la microscopie confocale de l‟intensité verte de CellROX. A) Analyse après l‟application du champ magnétique (40mT, 275 kHz) sur des cellules INR1G9-RCCK2 ayant internalisées ou non les nanoparticules MG-IONP-DY647, sont incubées en présence ou non du chélateur des ROS N-acetyl-cystéine, puis soumises ou non au champ magnétique. B) Analyse pendant l‟application du champ magnétique induit par l‟électroaimant miniaturisé (53mT, 300 kHz).
138
Perméabilisation de la membrane lysosomale et fuite des enzymes lysosomales
Nous avons analysé précédemment la fuite du contenu lysosomale, après l‟application
du champ magnétique (40mT, 275kHz). Les cellules chargées de nanoparticules MG-IONP-
DY647 et soumises à un champ magnétique alternatif (figure 10c de l‟article I) montrent une
libération du contenu lysosomal. Mais, il était nécessaire de mesurer la fuite du lysotraker
accumulé dans les lysosomes cellulaires durant l‟application du champ magnétique (figure 3
de l‟article II), à l‟aide de l‟électroaimant miniaturisé et par microscopie confocale afin de
déterminer si cette perméabilisation était un événement précoce dans la signalisation
aboutissant à la mort cellulaire. Nos résultats montrent une perméabilisation de la membrane
lysosomale précoce et significative dès 30 minutes d‟application du champ magnétique.
Ensuite, nous avons cherché à visualiser que cette perméabilisation permettait la fuite
des enzymes lysosomales vers le cytosol. Les cellules INR1G9-RCCK2 ont été transfectées
pour exprimer la protéine de la membrane lysosomale Lamp1 tandis que la localisation de
l‟enzyme Cathepsine B lysosomale (CathB) est révélée par un substrat flurorescent (CV-
(RR)2). Nous avons mesuré par analyse d‟images, la colocalisation de la Cathepsine B au
niveau des lysosomes marqués par la protéine Lamp1, une forte colocalisation entre les deux
protéines se traduit par un coefficient de Pearson élevé. Les cellules ayant internalisé les
nanoparticules et exposés à un champ magnétique montrent une diminution significative de la
co-localisation des protéines Lamp1 et CathB (0.5), par rapport à des cellules contrôles qui
présentent une forte co-localisation cathB/Lamp1 (0.7) (figure 3). La co-localisation a été
également mesurée en présence du piégeur des ROS, la NAC, les analyses montrent qu‟en
présence de la NAC le champ magnétique n‟induit pas la fuite de CathB (figure 3).
De plus, nous avons montré l‟impact de la perméabilisation de la membrane
lysosomale suivie par la fuite des enzymes lysosomales sur la mort cellulaire. L‟application
du champ magnétique induit spécifiquement la mort des cellules ayant accumulées de
nanoparticules (15%) comparativement à des cellules contrôles (7%). L‟effet est inhibé en
présence d‟E64d (5%) indiquant ainsi, que les enzymes lysosomales dont les cathepsines B
interviennent dans les mécanismes aboutissant à la mort cellulaire induite par le champ
magnétique (figure 4).
139
+ AMF
NAC contrôle
MNP MNP + NAC
Champ magnétique
Figure 3: L’application du champ magnétique alternatif sur des cellules ayant internalisé des nanoparticules MG-IONP-DY647 induit la fuite de l’enzyme lysosomale cathepsine B (CathB) vers le cytosol.
Le niveau de la colocalisation des protéines CathB/YFP-Lamp1 est déterminé par le coefficient de Pearson. Analyse après l‟application du champ magnétique (40mT, 275 kHz) sur des cellules INR1G9-RCCK2 ayant internalisées ou non les nanoparticules, sont incubées en présence ou non du chélateur des ROS N-acetyl-cystéine.
140
NAC contrôle E64d
MNP MNP + NAC
MNP + E64d
Figure 4: L’application du champ magnétique alternatif sur des cellules ayant internalisé des nanoparticules MG-IONP-DY647 induit la mort cellulaire, en affectant la perméabilité lysosomale.
La mortalité cellulaire est analysée 4 heures après l‟application du champ magnétique (40mT, 275kHz) sur des cellules tumorales ayant internalisées les MG-IONP-DY647 ou la gastrine, en présence ou en absence du chélateur des ROS (N-acetyl-cyctéine), aussi en présence ou en absence de l‟inhibiteur des cystéines protéases (E64d).
141
En conclusion, nous avons développé avec succès un électro-aimant miniaturisé qui
permet d’appliquer un champ magnétique alternatif à haute fréquence directement sous un
microscope confocal. Il est à noter que la fréquence et l'amplitude du champ sont de l'ordre
de ceux utilisées dans les expériences d'hyperthermie magnétiques classiques. L’observation
en temps réel des deux événements soupçonné de jouer un rôle clé dans le processus de mort
induite par le traitement magnétique ont été réalisées: la perméabilisation de la membrane
lysosomale et la génération de ROS. Ces deux phénomènes sont détectés 30 mn après le début
du traitement AMF, donc en amont de la cascade d'événements conduisant à la mort
cellulaire.
Donc, l'électro-aimant miniaturisé présenté dans ces travaux sera un outil précieux
pour élucider les mécanismes impliqués dans la mort cellulaire. Un avantage supplémentaire
offert par cet outil, la mesure de l’hyperthermie. Des mesures en temps réel de la température
à la surface des nanoparticules magnétiques chauffées pourront être réalisées en utilisant des
thermomètres moléculaires dont l'intensité de fluorescence émise dépend de la température.
La surveillance en temps réel pourrait conduire à plusieurs avancées dans ces domaines
prometteurs liés à l’hyperthermie magnétique.
142
PARTIE III
Améliorer l’efficacité thérapeutique en associant
l’hyperthermie magnétique à un traitement
chimiothérapeutique
143
INTRODUCTION
De nombreuses techniques ont été rapportées pour augmenter la température des
tissus cancéreuses, tels que l'hyperthermie du corps entier, l‟échauffement à distance
(ultrasons, micro-ondes, rayonnements infrarouge, etc.) ou par implantation in vivo de
dispositifs (fibres optiques, antennes, etc.). Mais, ces techniques d‟hyperthermie présentent
une difficulté car elles ne peuvent pas augmenter la température des tissus cancéreux d‟une
manière contrôlée sans endommager les tissus normaux environnants.
L‟hyperthermie sélective a été étudiée comme une approche possible afin d‟obtenir
une éradication spécifique de la tumeur. Plus récemment, les nanoparticules magnétiques ont
été étudiés à cet effet, parce qu‟elles sont capables de générer de la chaleur lorsqu'elles sont
exposées à un champ magnétique alternatif suite à une perte d‟énergie par hystérésis. Ces
dernières années, les nanoparticules d‟oxyde fer sont définies comme des particules ayant un
diamètre inférieur à 100 nm, elles ont été largement appliquées dans le domaine de la
médecine en raison de leurs propriétés physico-chimiques et leurs caractéristiques uniques.
Nous avons détaillé précédemment dans la partie (B. Les applications biomédicales des
nanoparticules magnétiques) de l‟introduction bibliographique tous les applications
biomédicales possibles des nanoparticules d‟oxyde de fer au niveau diagnostiques et
thérapeutiques. De plus, les travaux publiés de notre laboratoire dans ce domaine confirment
que la propriété magnétique des nanoparticules était efficace pour tuer 30% des cellules
endocrines cancéreuses en présence d‟un champ magnétique alternatif. Par contre, ce
pourcentage de mort cellulaire obtenue se considère non massif par rapport à la taille de la
tumeur.
D‟autre part, le traitement de 50% des cancers humain inclut l‟utilisation de la
chimiothérapie. La résistance des tumeurs endocrines à des agents chimiothérapeutiques
disponibles est un obstacle majeur à la réussite du traitement. Dans de nombreux des cas, la
sensibilité à la chimiothérapie est faible et l‟efficacité est limité, cela peut être dû au faible
index mitotique qui caractérise les tumeurs endocrines, l‟expression des gènes de résistance
aux médicaments (MDR) et des protéines d‟efflux qui sont capables d‟excréter un grand
nombre de molécules anti-cancéreuses. Parmi les agents chimothérapeutiques fréquemment
utilisés pour le traitement en clinique des tumeurs endocrines, la doxorubicine (DOX) qui est
un agent antineoplasique appartient à la famille des anthracyclines. Il exerce une activité anti-
tumorale en inhibant l‟activité de la topoisomérase II, ce qui empêche la réplication et la
144
réparation de l'ADN, cela conduit à la mort cellulaire par apoptose. Des études récentes ont
démontré que l'hyperthermie stimule l'absorption cellulaire des agents chimiothérapeutiques
comme la cisplatine et par conséquent améliore la cytotoxicité de l‟agent dans les cellules
cancéreuses, à la fois in vitro et in vivo [426], [427].
Dans cette étude, afin d‟augmenter l‟efficacité thérapeutique obtenu précédemment,
nous avons combiné le traitement d‟hyperthermie magnétique avec la doxorubicine, qui est un
agent utilisé en premier ligne en clinique pour traiter des tumeurs endocrines.
145
ARTICLE III
Combination of magnetic intra-lysosomal
hyperthermia and doxorubicin treatment increase
eradication efficiency of endocrine tumoral cells
146
Combination of magnetic intra-lysosomal hyperthermia and doxorubicin
treatment increase eradication efficiency of endocrine tumoral cells
Darine El Hajj Diab1, Pascal Clerc1, Michel Gougeon2, Julian Carrey3, Daniel Fourmy1,
Véronique Gigoux1*.
1. Université de Toulouse 3, EA 4552, Toulouse, France
2. Université de Toulouse 3/CNRS, CIRIMAT, Toulouse, France
3. INSA/CNRS, Laboratoire de Physique et Chimie des Nano-Objets, Toulouse
* Corresponding authors: Véronique Gigoux, EA 4552, CHU Toulouse, Avenue du
Professeur Jean Poulhès, F-31432 Toulouse, France. Email : [email protected]
Keywords: magnetic nanoparticles, magnetic hyperthermia, cell death, cancer, endocrine
tumors, Doxorubicin
147
INTRODUCTION
Neuroendocrine tumors (NETs) are uncommon and heterogeneous neoplasms of epithelial
origin, in which neoplastic cells retain many of the structural and functional characters of
normal endocrine cells, including the expression of typical endocrine and neuroendocrine
markers (such as chromogranin A and synaptophysin) and the capacity to synthesize, store
and secrete peptidic hormones and neuropeptides 1. Although NETs may develop in almost
any organ, they predominate within the pancreas and the gastrointestinal tract. The incidence
of gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors (GEP-NETs) is 3.65/100 000 indivuals per
year. This incidence has increased markedly over the last 3 decades, probably as a result of
trends in imaging and improvements in diagnosis. Although most endocrine tumors present a
slow and local development, some of them become malignant with metastatic disseminations
and are associated with a poor prognosis.
GEP-NETs therapy included systemic chemotherapy with streptozotocin, doxorubicin
and 5-fluorouracil. Doxorubicin belongs to the anthracylin drugs and is one of the commonly
used anticancer drugs. Doxorubicin exerts antitumor activity through its inhibition of
topoisomerase II, and thus prevents chain unfolding and separation in DNA replication as
well as DNA repair. This ultimately leads to cell death by apoptosis. Other mechanisms that
might be involved are intercalating into DNA, resulting in inhibition of DNA synthesis and
function, and formation of cytotoxic reactive oxygen species (ROS) that result in single- and
double-stranded DNA breaks with subsequent inhibition of DNA synthesis and function.
Resistance of GEP-NET, more particularly metastatic GEP-NET, to the available
chemotherapeutics is a major obstacle to successful treatment. Indeed, GEP-NETs strongly
148
express the multidrug resistance gene MDR-1 which encodes the protein efflux P
glycoprotein (Pgp).
Over the past two decades, the introduction of targeted cancer therapeutics in clinic
has been a major breakthrough in cancer therapy. Currently, targeted delivery of diagnosis
and/or therapeutic agents to tumoral cells uses biological markers selectively expressed or at
least overexpressed in tumors relative to healthy surrounding and distant tissues. The majority
of GEP-NETs were shown to express G protein-coupled receptors including somatostatin
receptor sst2, cholecystokinin-2 receptor (CCK2R), glucagon-like peptide 1 (GLP-1) receptor
and glucose-dependent insulinotropic (GIP) receptor 2. Consequently, the gastrointestinal
peptide hormone and their receptors have gained an important role in diagnosis and/or
radionuclide therapy of cancer over the last few decades 3 4. The peptide receptor first
identified for these purposes was the somatostatin receptors 5. GEP-NETs which express
somatostatin receptors in high amounts can be visualized scintigraphically with the
radiolabeled somatostatin analog OctreoScan® 5. Moreover, targeted radiotherapy of tumors
with radiolabeled somatostatin analogs demonstrated promising therapeutic efficiency 6, 7. The
CCK2R is another peptide receptor that is frequently expressed in cancers 8 , 9 , 10 , 11. Indeed,
CCK2R is expressed at high incidence and level in medullary thyroid carcinomas (MTC),
small cell lung cancers (SCLC), gastrointestinal stromal tumors (GIST), and insulinomas 10 ,
11, 12 . Nanotherapy using magnetic nanoparticles grafted with ligands of receptors
overexpressed in cancers is a promising diagnostic and therapeutic strategy. In this context,
much attention is focused toward the development of strategies combining molecular
targeting and nanoparticles delivery 13 , 14. Among the wide range of available nanoparticles,
magnetic nanoparticles (MNPs) have emerged as biocompatible systems for cancer detection
by magnetic resonance imaging (MRI) and for targeted cancer therapy 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
Magnetic nanoparticles offer the theoretical potential to be driven to the tumors by grafting
149
the nanoparticles with ligands or antibodies recognizing receptors or antigens overexpressed
in tumors 13. In vivo, targeted magnetic nanoparticles injected intravenously accumulate
within the tumor, where they can eradicate tumoral cells by hyperthermia upon application of
an alternating magnetic field. Interestingly, magnetic iron oxide nanoparticles targeting
epidermal growth factor (EGF) receptor were recently shown to be internalized by tumoral
cells and to kill the cells upon application of an alternating magnetic field 19 , 20. We
previously develop magnetic iron oxide nanoparticles targeting the CCK2R overexpressed in
neuroendocrine tumors 21. These gastrin-grafted nanoparticles recognized cells expressing
CCK2R with a high specificity, subsequently internalized using the CCK2R-dependent
signaling and finally accumulated in the lysosomes. Internalization of a minute amount of
EGF- or gastrin-grafted nanoparticles (2 pg Fe/cell) induced the death of 30% of tumoral cells
upon a high frequency alternating magnetic field with no perceptible temperature rise,
strongly suggesting that magnetic intra-lysosomal hyperthermia (MILH) might trigger cell
death through lysosomal death pathway. However, the efficiency of the magnetic
hyperthermia treatment is currently limited pending new generations of nanoparticles with
higher eating power and validated for clinical trials in humans.
Hyperthermia applications including magnetic fluid hyperthermia was previously
shown to sensitize tumoral cells to chemotherapeutic treatment 22. However, these approaches
present several limitations and adverse effect such as damage to adjacent tissues, occurrence
of tachycardia and malaise, detrimental impact on tissue metabolism, blood flow, organ
function, tissue repair 22 , 23. The aim of our study was to increase endocrine tumoral cell death
by associating magnetic intra-lysosomal hyperthermia application induced by gastrin-grafted
iron oxide nanoparticles with doxorubicin chemotherapeutic treatment.
150
MATERIALS AND METHODS
Chemical reagents
The synthesis method and characterization of the magnetic nanoplatform used in the present
article have been previously described 21. The nanoplatform (DY647-MNP-gastrin) is
composed of commercial iron oxide nanoparticles coated with PEG-Amine (Gecco Dots,
Sweden) and decorated with 100 molecules of a synthetic replicate of gastrin (Covalab) and
20 molecules of the fluorescent label NHS-DY647-PEG1 (Dyomics GmbH, Jena, Germany).
The size of the magnetic core determined by transmission electron microscopy was 8.7 ± 1.6
nm. The specific absorption rate of these MNPs is 13 W/g at 275 kHz and 40 mT.
Doxorubicin and MTT [(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] were
purchased from Sigma-Aldrich.
Cell line
The glucagon-producing hamster tumoral cell line INR1G9 stably expressing CCK2R
(INR1G9-RCCK2) obtained as previously described 24 was cultured in RPMI 1640 medium
containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 100 units/ml penicillin/streptomycin (Life
technologies). Cells were grown in a humidified atmosphere at 95% air and 5% CO2 at 37°C.
Cell treatment
The cytotoxic effect of doxorubicin was determined using MTT assays. Briefly, 1x104
INR1G9-RCCK2 cells were seeded in 96-wells plate, grown overnight and treated with
increased concentrations of doxorubicin in RPMI 1640 medium buffered with 10 mM HEPES
151
buffer pH 7.4 containing 0.5% FBS and 1% penicillin-streptomycin (Life technologies) for 24
and 48 hours.
Cell treatment by alternalting magnetic fied were performed as follows. Cells were
seeded 24 h before the experiments onto four-compartment Cellview dishes (Greiner Bio-
One) at a density of ∼ 60 x103 cells/compartment, grown overnight and incubated with
DY647-MNP-gastrin (16 µg Fe/ml) for 24 hours at 37°C in RPMI 1640 buffered with 10 mM
HEPES buffer pH 7.4 containing 0.5% FBS and 1% penicillin-streptomycin to allow
magnetic nanoparticles internalization and accumulation in lysosomes. Incubation medium
was withdrawn and cells were rinsed twice with incubation medium. At this stage, magnetic
measurements have shown that cells contain in average 2.2 pg of iron per cell which is
actively targeted and accumulated into lysosomes 21. Cells were then incubated or not with
doxorubicin in RPMI 1640 buffered with 10 mM HEPES buffer pH 7.4 containing 0.5% FBS
and 1% penicillin-streptomycin for 24 h. Attached cells were exposed to an alternating
magnetic field (275 kHz, 40 or 52 mT) delivered by a commercial magnetic inductor (Fives
Celes, Lautenback, France) for 2 h as previously described 21. The temperature of the
Cellview dish was maintained at 37.0°c +/- 0.4°c and controlled using a thermal probe
(Reflex, Neoptix, Canada) placed in the incubation medium of the cells. At the end of the
experiments, cells were placed in a humidified atmosphere at 5% CO2 at 37°c.
Determination of cell death and survival
The effects of magnetic field treatment were investigated as follows: first, apoptotic and
necrotic cells labeled with FITC-annexinV and/or propidum idodure (Cell Meter Annexin V
apoptosis assay kit, AAT Bioquest) were counted 4 h after the end of magnetic field exposure.
Counting of labeled cells was carried out by analyzing confocal microscopy images
152
representing populations of 2-3000 cells/experiment using ImageJ software. Then cell
survival was determined 24 h post-magnetic field treatment using a MTT viability assay.
Statistical analysis
Results are expressed as the mean ± SEM of at least three independent experiments. Statistical
analysis was performed using ANOVA test. Differences were considered significant when p <
0.05.
RESULTS
We previously elaborated a nanoplatform, termed DY647-MNP-gastrin, which is composed
of commercial iron oxide nanoparticles coated with PEG-Amine and decorated with i) a
synthetic replicate of gastrin, which binds specifically to the CCK2R, a receptor
overexpressed in endocrine tumors, and allows specific MNPs internalization in cells
overexpressing the CCK2R, ii) a fluorescent label DY647 21. These DY647-MNP-gastrin
nanoparticles recognized endocrine tumoral cells expressing CCK2R INR1G9-RCCK2 with a
high specificity, subsequently internalized using the CCK2R-dependent signaling and finally
accumulated in the lysosomes. We showed that the internalization of a minute amount of
DY647-MNP-gastrin (2 pg Fe/cell) induced the death of 26.9 ± 7.6 % of INR1G9-RCCK2
cells upon a 40mT/275kHz alternating magnetic field without affecting the survival of cells
devoid of magnetic nanoparticles. Moreover, we demonstrated that cell death occurred
through a lysosomal death pathway, without perceptible temperature rise during the
experiments. However, the efficiency of this intra-lysosomal magnetic hyperthermia (MILH)
treatment is currently limited. Indeed, the application of a 52mT/275kHz alternating magnetic
field increased the death rate of INR1G9-RCCK2 cells having internalized magnetic
153
nanoparticles (67.1 ± 9.9 %), but also affected the survival of cells devoid of magnetic
nanoparticles (24.8 ± 11.4% )21. In this context, we examined whether the MILH using
gastrin-grafted nanoaprticles could sensitize the endocrine tumoral cells INR1G9-RCCK2 to
doxorubicin-induced cytotoxicity.
First, to determine doxorubicin cytotoxicity, INR1G9-RCCK2 cells were treated with
increased concentrations of doxorubicin for 24 to 48 hours. The analysis of doxorubicin dose-
response using MTT assays shows that doxorubicin decrease the survival of INR1G9-RCCK2
cells with an effective dose (ED50) of 5.00 ± 0.10 and 4.59 ± 0.09 µM at 24 and 48 hours,
respectively (figure 1). Thus, INR1G9-RCCK2 cells were pre-incubated with 16 µg/ml of
DY647-MNP-gastrin for 24 hours before the addition of different concentrations of
doxorubicin for another 24 hours. As shown in figure 2, pre-incubation with DY647-MNP-
gastrin did not induce cytotoxic effect against INR1G9-RCCK2 cells and did not sensitize
INR1G9-RCCK2 cells to doxorubicin-induced cell survival inhibition. These results confirm
that iron oxyde nanoparticles did not present any intrinsic cytotoxicity.
In order to investigate whether endocrine tumoral cell death could be increased by
associating MILH and a chemotherapeutic treatment, we applied a high frequency alternating
magnetic field to INR1G9-RCCK2 cells having internalized DY647-MNP-gastrin and/or
treated by doxorubicin. INR1G9-RCCK2 cells were pre-incubated with 16 µg/ml DY647-
MNP-gastrin for 24 hours, allowing their internalization and lysosome accumulation, washed
to eliminate unbound and non-internalized nanoparticles, before the addition of different
concentrations of doxorubicin for another 24 hours and submitted or not to a high frequency
alternating magnetic field (40 mT, 275 kHz). The impact of the treatments was determined by
counting cells labeled with FITC-tagged annexin V and/or propidium iodide which identified
early apoptotic, late apoptotic and necrotic cells, respectively. As shown in figure 3 and table
1, application of alternating magnetic field during 2 hours caused the cells having internalized
154
magnetic nanoparticles to enter into apoptosis. The total number of dead cells reached 16.7 ±
1.0 % including 16.3 ± 1.0 % of apoptotic cells, 4 hours after magnetic field application.
Determination of cell survival 24 hours after magnetic field exposure using MTT assay
indicated that the magnetic field killed 26.1 ± 2.8 % of tumoral cells. As expected, application
of magnetic field did not affect control cells. Indeed, the death rates of control cells represent
7.8 ± 0.5 % and 4.1 ± 2.9 % of the total cell population, 4 and 24 hours after exposure to an
alternating magnetic field, respectively (Figures 3 and 4, Tables 1 and 2). Likewise, exposure
to a high frequency alternating magnetic field did not sensitize cancer cells when treated with
doxorubicin alone (figures 3 and 4, tables 1 and 2). The death rates of doxorubicin-treated
INR1G9-RCCK2 cells were not significantly different depending on whether the cells have
been exposed or not to the magnetic field, whatever the doxorubicin concentration used
(figure 3, table 1). The total number of dead cells treated with 5µM of doxorubicin reached
respectively 21.2 ± 1.6 % and 21.0 ± 1.0 % 4 hours, 58.0 ± 3.6 % and 56.7 ± 4.4 % 24 hours
after exposure or not to magnetic field. Same results were obtained with lower concentrations
of doxorubicin. Finally, we studied whether application of a high frequency alternating
magnetic field increased the death of cells having internalized gastrin-grafted nanoparticles
and pre-incubated with different concentrations of doxorubicin (figures 3 and 4, tables 1 and
2). INR1G9-RCCK2 cells having internalized DY647-MNP-gastrin and treated with
doxorubicin experienced a significant increase of death rates comparatively to INR1G9-
RCCK2 cells devoid of magnetic nanoparticles and submitted to magnetic field or INR1G9-
RCCK2 cells incubated with doxorubicin alone. Indeed, application of alternating magnetic
field caused the death of 32.4 ± 0.8 % INR1G9-RCCK2 cells having internalized DY647-
MNP-gastrin and incubated with 5µM of doxorubicin 4 hours after magnetic field exposure,
whether individual treatment were less efficient since exposure to magnetic field of cells
having internalized magnetic nanoparticles or doxorubicin treatment alone induced the death
155
of 16.7 ± 1.0 % and 21.0 ±1.0 %, respectively (figure 3 and table 1). Determination of cell
survival 24 hours after magnetic field exposure using MTT assay indicated that the magnetic
field killed 77.7 ± 2.1 % of tumoral cells having internalized magnetic field and incubated
with 5µM of doxorubicin, whether exposure to magnetic field of cells having internalized
magnetic nanoparticles or doxorubicin treatment alone caused the death of 27.4 ± 3.9 % and
56.7 ±4.4 %, respectively (figure 4 and table 1). Of note, identical results were obtained with
lower doses of doxorubicin (figures 3 and 4, tables 1 and 2). All together, these results
indicate that association of MILH application with doxorubicin-induced cytotoxicity
increased the eradication efficiency of tumoral cells comparatively to single treatment.
Moreover, the combination of both treatments decreased tumoral cell survival with an
efficiency near to the additivity of individual treatments.
DISCUSSION
Actually, the conventional cancer therapies include surgery, radiotherapy and/or
chemotherapy. Several studies have provided evidence that hyperthermia could enhance
efficiency of radiotherapy/chemotherapy or overcome drug resistance in many cancer cells 22,
25 , 26 . The rationale is based on a direct cell-killing effect at temperatures above 41–42°C 27.
Indeed, synergistic interaction between heat and radiation dose as well as various
cytostatic/cytotoxic treatments has been validated in preclinical studies 28 , 29. Hyperthermia
using a water bath sensitized breast cancer cells to bortezomid or TNF, resulting in enhanced
cell death 30 25. Although in vitro studies of hyperthermia with chemotherapeutic drugs have
shown promising results, translation to the clinic has been limited due to challenges regarding
application of hyperthermia as a treatment modality. These include avoidance of nonspecific
damage to adjacent tissues, occurrence of tachycardia and malaise, and a detrimental impact
156
on tissue metabolism, blood flow, organ function, tissue repair 22 , 23. For these reasons,
alternative hyperthermia application approaches are being actively pursued.
The use of magnetic nanoparticles for localized thermal oncotherapy is a novel and
attractive approach 31. The first approach which has been developped is commonly named
magnetic fluid hyperthermia ; this approach takes the advantage of the deposition of thermal
energy by magnetic nanoparticles under an applied alternating magnetic field, resulting in
local heating of cancerous tissue 32. Several studies have provided evidence that application of
magnetic fluid hyperthermia was more effective in reducing the viability of tumoral cells
comparatively to hot water hyperthermia at similar thermal doses 33 , 34. This approach present
also several limitations for the translation to clinic, although in vitro studies of magnetic fluid
hyperthermia have shown promising results. The first limitation is the concentration (~10
mg/ml) of magnetic nanoparticles necessary to induce tumoral tissue hyperthermia when
submitted to alternating magnetic field, indicating that only intra-tumoral injection of high
concentration nanoparticles could be effective to increase the temperature of tumoral tissues.
Moreover, the efficiency of the targeted magnetic hyperthermia treatment using intraveinous
injection of ligand-grafted nanoparticles is currently limited pending to overcome the
limitations due to the stealth of nanoparticles towards immune system, their capacity to cross
biological barriers such as endothelial vasculature, tumoral microenvironment... The others
limitations are the adverse effects due to temperature increase such as damage to adjacent
tissues, occurrence of tachycardia and malaise, impact on tissue metabolism, blood flow,
organ function, tissue repair...
We previously develop gastrin-grafted nanoparticles which recognized cells
expressing CCK2R with a high specificity, subsequently internalized using the CCK2R-
dependent signaling and finally accumulated in the lysosomes 21. In this study, we showed
that internalization of a minute amount of gastrin-grafted nanoparticles (2 pg Fe/cell) induced
157
the death of 30% of tumoral cells upon a high frequency alternating magnetic field with no
perceptible temperature rise, strongly suggesting that intra-lysosomal magnetic hyperthermia
(MILH) might trigger cell death through lysosomal death pathway. However, the efficiency of
the MILH is currently limited pending new generations of nanoparticles with higher eating
power and validated for clinical trials in humans. Here, we studied whether the MILH could
be combined to a chemotherapeutic drug to increase the eradication efficiency of tumoral
cells. Doxorubicin is one of the commonly used anticancer drugs to treat pancreatic endocrine
tumors. After determining the doxorubicin ED50, we combined this dose and lower dose of
doxorubicin with intra-lysosomal magnetic hyperthermia treatment and analyzed the effect on
cell death and cell survival. Our results indicate that association of MILH application with
5µM doxorubicin-induced cytotoxicity increased the eradication efficiency of tumoral cells up
to 77.7 ±1.6 % comparatively to single treatment. Moreover, the combination of both
treatments decreased tumoral cell survival with an efficiency near to the additivity of
individual treatments. These results strongly suggest that MILH and doxorubicin might
induced tumoral cell death by involving different intracellular signaling pathways as
combination of both treatment induced dead level near additive effect of individual treatment.
Indeed, previous studies demonstrated that MILH induced cell death through radical oxygen
species (ROS) generation and a lysosomal signaling pathway whereas doxorubicin inhibits
topoisomerase II and prevents DNA replication and DNA repair leading to cell death by
apoptosis 19 , 21.
In conclusion, our results indicate that intracellular accumulation of magnetic
nanoparticles followed by doxorubicin treatment and exposure to a high frequency magnetic
field might provide a promising approach in the treatment of patients with endocrine tumors
without inducing adverse effect of others hyperthermia approaches such as hot water,
magnetic fluid hyperthermia... Intra-lysosomal magnetic hyperthermia might increase the
158
eradication efficiency of tumoral cells for patients being refractory and presenting limited
response to doxorubicin.
LEGENDS TO FIGURE
Figure 1: Dose response curve for INR1G9-RCCK2 cells. Cells were incubated with
increased concentrations of doxorubicin for 24 and 48 hours. Cell viability was analyzed by
MTT assay. Error bars represent the sem of four independent experiments.
Figure 2: DY647-MNP-gastrin did not modify doxorubicin cytotoxicity on INR1G9-
RCCK2 cells. Cells were pre-incubated with 16 µg/ml of DY647-MNP-gastrin for 24 hours,
washed to eliminte unbound nanoparticles, then incubated with different concentrations of
doxorubicin for another 24 hours. Cell viability was analyzed by MTT assay. Each value
represents the mean ± sem of eight independent experiments.
Figure 3: Effect of magnetic intra-lysosomal hyperthermia on doxorubicin-induced
cell apoptosis. INR1G9-RCCK2 cells were pre-incubated with 16 µg/ml DY647-MNP-gastrin
for 24 hours, allowing their internalization and lysosome accumulation, washed to eliminate
unbound and non-internalized nanoparticles, before the addition of different concentrations of
doxorubicin for another 24 hours and submitted or not to a high frequency alternating
magnetic field (40 mT, 275 kHz). The impact of the treatments was determined 4 hours after
magnetic field application by counting cells labeled with FITC-tagged annexin V and/or
propidium iodide which identified early apoptotic, late apoptotic and necrotic cells,
respectively. Results represent the mean ± sem of eight independent experiments.
Figure 4: Effect of combination of magnetic intra-lysosomal hyperthermia and
doxorubicin treatement on cell viability. INR1G9-RCCK2 cells were pre-incubated with 16
159
µg/ml DY647-MNP-gastrin for 24 hours, allowing their internalization and lysosome
accumulation, washed to eliminate unbound and non-internalized nanoparticles, before the
addition of different concentrations of doxorubicin for another 24 hours and submitted or not
to a high frequency alternating magnetic field (40 mT, 275 kHz). The impact of the treatments
was determined 24 hours after magnetic field application by MTT assay. Results represent the
mean ± sem of eight independent experiments.
Table 1: Effect of magnetic intra-lysosomal hyperthermia on doxorubicin-induced cell
death. INR1G9-RCCK2 cells were pre-incubated with 16 µg/ml DY647-MNP-gastrin for 24
hours, allowing their internalization and lysosome accumulation, washed to eliminate
unbound and non-internalized nanoparticles, before the addition of different concentrations of
doxorubicin for another 24 hours and submitted or not to a high frequency alternating
magnetic field (40 mT, 275 kHz). The impact of the treatments was determined 4 hours after
magnetic field application by counting cells labeled with FITC-tagged annexin V and/or
propidium iodide representing total cell death level. Results represent the mean ± sem of eight
independent experiments.
Table 2: Effect of combination of magnetic intra-lysosomal hyperthermia with
doxorubicin treatment on cell viability. INR1G9-RCCK2 cells were pre-incubated with 16
µg/ml DY647-MNP-gastrin for 24 hours, allowing their internalization and lysosome
accumulation, washed to eliminate unbound and non-internalized nanoparticles, before the
addition of different concentrations of doxorubicin for another 24 hours and submitted or not
to a high frequency alternating magnetic field (40 mT, 275 kHz). The impact of the treatments
was determined 24 hours after magnetic field application by MTT assay. Results represent the
mean ± sem of eight independent experiments.
160
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162
Fig. 1
163
Fig.2
164
Fig.3
165
Fig.4
166
Table 1
167
Table 2
168
DISCUSSION
Dans les deux études précédentes, nous avons montré que l‟accumulation des
nanoparticules vectorisées avec la gastrine (MG-IONP-DY647) induit une augmentation de la
mort cellulaire (17%) suivie par une diminution de la survie cellulaire (30%) mesuré
respectivement, 4 et 24h après l‟application du champ magnétique sans élévation détectable
de la température. Mais, les conditions utilisées dans cette étude, ne permettent pas d‟avoir un
effet massif induit par les nanoparticules vectorisées par rapport à la taille d‟une tumeur.
Donc, des améliorations ont été nécessaires afin d‟augmenter l‟efficacité thérapeutique de
l‟hyperthermie et d‟affronter la résistance cellulaire, la combinaison d‟un agent
chimiothérapeutique à l‟hyperthermie a été proposé comme une approche prometteuse dans ce
but.
L’effet dose-réponse de la doxorubicine sur les cellules endocrines
Dans le but de déterminer la DE50 qui correspond à la dose efficace de l‟agent
cytotoxique permettant l‟éradication de 50% des cellules tumorales, nous avons incubé des
cellules INR1G9-RCCK2 avec des doses variables de l‟agent chimiothérapeutique, la
doxorubicine. La survie cellulaire est déterminée à 24 et 48h par un test MTT. Les courbes
dose-réponse de survie cellulaire, affirment que la DE50 de la doxorubicine à 24 et 48h, est de
4,99.10-6 M et de 4,59.10-6 M, respectivement.
La combinaison de l’hyperthermie magnétique avec un traitement chimio-
thérapeutique «la doxorubicine» renforce l’apoptose et inhibe la survie cellulaire.
Nous avons examiné si la combinaison de l‟effet induit par les nanoparticules sous un
champ magnétique avec un traitement à la doxorubicine peut augmenter le pourcentage de la
mort cellulaire dans les cellules endocrines. Pour cela, des cellules INR1G9-RCCK2 ont été
pré-incubées ou non avec des nanoparticules vectorisées MG-IONP-DY647 pendant 16h, puis
incubées avec des doses de doxorubicine correspondant à la DE50 ou inférieures (10-6, 3.10-6
et 5.10-6) pendant 24h. Ensuite, nous avons mesuré par analyse d‟images confocales, le taux
de la mortalité cellulaire, 4h après l‟application du champ magnétique alternatif, détectée par
marquage annexin V/iodure de propidium. Nos résultats montrent que la combinaison des
deux traitements permet d‟augmenter le taux de la mort cellulaire comparativement aux
traitements individuels quelque soit la dose de doxorubicine. En effet, en absence du champ
169
magnétique, les nanoparticules MG-IONP-DY647 n‟induisent pas un effet cytotoxique et ne
sensibilisent pas les cellules à la doxorubicine quelque soit la concentration utilisée (article
III, tableau..). Ce qui montre que les nanoparticules seules ne peuvent pas être dans notre cas
une source cytotoxique et que la mort cellulaire induite reste lié spécifiquement à la dose de
doxorubicine employée, où les pourcentages de mort 13.4 ± 1.1, 18.2 ± 1.7 et 21.0 ± 1.0%
correspondent, respectivement, aux trois doses de doxorubicine utilisées 10-6, 3.10-6 et 5.10-6.
Tandis que, l‟application du champ magnétique sur des cellules qui ont accumulé les
nanoparticules et la doxorubicine présentent un effet proche de l‟additivité, pour atteindre des
pourcentages de 25.4 ± 4.0, 28.6 ± 3.0 et 32.4 ± 0.8%.
Egalement, l‟effet cytotoxique de la combinaison de traitements a été mesuré sur la
survie cellulaire par un test MTT, 24h après le traitement au champ magnétique (figure 4 de
l‟article III). Nos résultats de survie cellulaire, montrent encore une fois que la combinaison
du traitement d‟hyperthermie magnétique avec un agent chimiothérapeutique, la
doxorubicine, permet de diminuer la survie cellulaire avec un effet proche de l‟additivité par
rapport aux traitements individuels. En présence ou non des nanoparticules, l‟inhibition de la
survie cellulaire reste dépendante uniquement de la concentration du traitement utilisée. Lors
de l‟application d‟AMF, nous avons observé un effet d‟inhibition plus important dans les
cellules qui ont accumulé les nanoparticules et la doxorubicine, les pourcentages atténués sont
de l‟ordre de 53.5 ± 3.9, 30.3 ± 3.1 et 22.3 ± 2.1% (Tableau 2 de l‟article III).
Nous avons affirmé dans nos études précédentes que la vectorisation de la mini-
gastrine à la surface des nanoparticules d‟oxyde de fer permette un ciblage hautement
spécifique des cellules tumorales INR1G9 surexprimant le RCCK2, et suite à l‟application
d‟un champ magnétique alternatif, la mortalité cellulaire augmente spécifiquement dans les
cellules qui ont accumulé ces nanoparticules vectorisées. Par contre, l‟efficacité du traitement
n‟était pas suffisante pour éradiquer toutes les cellules tumorales. Pour cela, nous avons
combiné ce type de traitement à un agent chimiothérapeutique. Nos résultats suggèrent que
l'accumulation intra-cellulaire de nanoparticules vectorisées suivie par un traitement à la
doxorubicine et l'exposition à un champ magnétique alternatif peut fournir une approche
prometteuse dans le traitement des tumeurs endocrines qui répondent peu à la chimiothérapie.
Nous avons réussis à augmenter l‟effet cytotoxique d‟hyperthermie magnétique pour atteindre
un effet maximale de 77.7 ± 2.1% d‟éradication des cellules tumorales, 24h après le
traitement à l‟AMF. Donc, l‟effet de la combinaison des nanoparticules vectorisées avec un
agent chimiothérapeutique est exclusivement lié au champ magnétique appliqué sur des
170
cellules tumorales qui ont accumulé spécifiquement les nanoparticules vectorisées sans
endommager les cellules saines, ce qui diminue les effets secondaires liés à la chimiothérapie.
Nous avons montré précédemment que suite à leur accumulation dans les lysosomes,
les nanoparticules d‟oxyde fer induisent la mort cellulaire par voie lysosomale en impliquant
les enzymes lysosomales, les cystéines protéases. De plus, la doxorubicine présente un effet
antiprolifératif lié à son interaction avec la topoisomérase-II, elle s‟intercale dans l‟ADN et
stabilise le complexe topoisomérase-II/ADN, produisant des cassures de la chaîne et une
défaillance de la réplication. Donc, l‟effet induit suite à une combinaison de deux traitements
différents est attribué à l‟additivité de deux voies de morts indépendants. Les prochaines
études seront axées sur l‟exploration des mécanismes possibles de cet effet amélioré telles que
les différences dans l'absorption des agents chimio-thérapeutiques, les changements
morphologiques induits par la combinaison de traitement et une décortication des membres
qui sont impliqués dans les voies de mort, comme l‟activation des caspases.
Il convient de noter qu‟il serait encore nécessaire d‟optimiser les nanoparticules
magnétiques utilisées afin d‟améliorer l‟effet induit par le traitement d‟hyperthermie
magnétique, en utilisant des nanoparticules de pouvoir hyperthermique supérieur. De même, il
serait souhaitable de vectoriser la doxorubicine à la surface des nanoparticules MG-IONP-
DY647 pour cibler l‟agent chimiothérapeutique dans les cellules tumorales sans endommager
les cellules saines. La quantité des nanoparticules accumulées dans les lysosomes et la nature
hybride des nanoparticules devrait provoquer sous l‟effet du champ magnétique, une
libération de l‟agent cytotoxique lié à la nanoparticule et induire la mort cellulaire, par l‟agent
chimiothérapeutique et par hyperthermie magnétique.
Nous vous présenterons dans la partie suivante une autre stratégie de traitement
combiné, en utilisant un agent anti-mitotique, le docetaxel ou taxotère qui agit en bloquant les
cellules dans la phase G2/M du cycle cellulaire.
Hyperthermie magnétique combinée à un traitement chimiothérapeutique, «le
Taxotère»
Le taxotère est un agent anti-tumoral largement utilisé, il a été utilisé pour traiter un
large éventail de tumeurs solides telles que le cancer de l'ovaire, du poumon, le cancer du sein
local ou métastatique, et le cancer de la prostate [428], [429]. Le taxotère est un agent anti-
mitotique, appartient à la famille des taxanes et il se lie aux microtubules et les stabilise
contre la dépolymérisation. Par conséquent, le taxotère inhibe la réplication des cellules en
171
perturbant la formation normale du fuseau mitotique et il induit l'apoptose en bloquant les
cellules dans la phase G2/M du cycle cellulaire. Bien que plusieurs études aient suggéré une
corrélation entre l‟arrêt du cycle cellulaire et la sensibilité des cellules à la mort [430].
De plus, une étude montre l'efficacité du taxotère encapsulé dans des liposomes
(DML) sous un champ magnétique alternatif sur le cancer gastrique. Des différences
significatives dans le taux de survie et le volume tumoral ont été observée entre le groupe de
souris qui a subi un traitement combiné du taxotère et de l‟hyperthermie et les autres groupes.
La tumeur a disparu et les souris ont survécu plus de 6 mois après le traitement [431]. Une
autre étude, examine le cycle et le taux de mort cellulaire dans la tumeur gastrique et montre
qu‟un pic en G2/M a été observé 24h après l‟injection du DML suivi par l‟exposition au
champ magnétique avec une augmentation progressive du taux de mortalité des cellules
tumorales [432].
Nous formulons l‟hypothèse que l‟augmentation du pourcentage des cellules
endocrines en G2/M pourrait permettre la sensibilisation et par suite l‟éradication massive des
cellules tumorales par hyperthermie magnétique.
Premièrement, les cellules INR1G9-RCCK2 ont été incubées 24h et 48h, avec
différentes dose de Taxotère afin de déterminer la dose correspondant à la DE50 (figure 5).
Nous avons ensuite cherché à déterminer une dose non toxique pour les cellules et capable de
les arrêter en phase G2/M du cycle cellulaire.
Cette analyse a été réalisée par cytométrie en flux. Après 24 et 48h d‟incubation, un
marquage de l‟ADN par un composé fluorescent 7-AAD (7-aminoactinomycine) a été réalisé,
permettant ainsi de déterminer l‟état des cellules dans le cycle cellulaire. Nous avons observé
que le pourcentage de cellules en G2/M était de 57,6% ± 8.4% lorsque les cellules ont été
traitées avec une dose de 3 µM non toxique pendant 24 heures par rapport à 10,43% ± 2%
dans les échantillons témoins non traitées (figure 6). Lorsque les cellules ont été traitées avec
3 µM pour 48 heures, le pourcentage de cellules en G2/M était de 45.25% ± 2,8% par rapport
à 14,85% ± 2,1% pour les cellules non-traitées (figure 6).
Ces résultats suggèrent que le taxotère à une dose non toxique provoque un arrêt du
cycle cellulaire avec un pourcentage élevé par rapport à des cellules non traitées. Nous
continuerons donc cette étude en combinant le taxotère à l‟hyperthermie magnétique intra-
lysosomale produite par les nanoparticules d‟oxyde de fer. Ce traitement combiné pourrait
conduire à une éradication plus massive des cellules tumorales, si la cellule mitotique est plus
172
sensible à la mort cellulaire par hyperthermie magnétique, suite à une production excessive de
radicaux libres oxygénés.
-10 -9 -8 -7 -6 -50
50
100
150 24h48h72h
Log10
% s
urvi
e ce
llula
ire
Figure 5 : Courbe représentant la variation de la prolifération cellulaire par rapport à des concentrations ascendantes de Taxotère.
173
0 5.6 10-8
10-7
1.8 10-7
3 10-7
5.6 10-7
10-6
0 5.6 10-8
10-7
1.8 10-7
3 10-7
5.6 10-7
10-6
24 h 48 h
TAX
Figure 6 : Histogramme représentant l’état des cellules dans le cycle cellulaire par rapport à des concentrations ascendantes de Taxotère.
174
Conclusions Générales
Et Perspectives
175
Dans le domaine des thérapies ciblées, le développement des nanoparticules
magnétiques montrent un intérêt grandissant pour leurs rôles diagnostiques et thérapeutiques.
Dans un premier volet de notre étude, nous nous sommes attachés à déterminer le trafic
cellulaire suivi par les nanoparticules vectorisées dans le modèle cellulaire HEK 293 et
INR1G9 (glucagonome de hamster) exprimant le RCCK2. Il ressort que la liaison et
l‟internalisation des nanoparticules MG-IONP-DY647 sont dépendantes de la présence du
récepteur et de la densité en ligand à leur surface. De plus, nous démontrons que les MG-
IONP-DY647 présentent des cinétiques de liaison et d‟internalisation du RCCK2 relenties,
mais en gardant le même mécanisme d‟internalisation induite via le ligand libre. Comme
beaucoup d‟autres RCPG, l‟internalisation du RCCK2 est un mécanisme dépendant de la β-
arrestine, la clathrine et la dynamine. Une fois internalisé, le RCCK2 n‟est pas recyclé de
manière rapide à la membrane mais est recyclé très lentement et est également dégradé dans
les lysosomes. Dans notre étude, nous mettons en évidence par les nanoparticules MG-IONP-
DY647 rejoint les vésicules de recyclage plus rapidement que l‟agoniste libre, et que les
nanoparticules vectorisées avec la gastrine sont adressées aux lysosomes.
Les trois axes différents de recherche que j‟ai développé au cours de mon doctorat
consistaient à : (i) Démontrer le concept d‟hyperthermie magnétique in vitro sur des cellules
tumorales endocrines. (ii) Etudier les mécanismes de mort cellulaire induite par hyperthermie
magnétique intra-lysosomale. (iii) Combiner le traitement d‟hyperthermie magnétique avec un
agent chimiothérapeutique.
(i) Preuve de concept de la nanothérapie ciblée par hyperthermie magnétique
Dans notre étude, nous avons réussi à faire la preuve de concept de la nanothérapie des
cancers par hyperthermie magnétique. Des cellules tumorales endocrines sur-exprimant le
RCCK2 internalisent massivement les nanoparticules vectorisées avec la gastrine MG-IONP-
DY647. L‟application d‟un champ magnétique alternatif à haute fréquence est susceptible
d‟induire une hyperthermie magnétique suivie par la mort cellulaire. Les nanoparticules
seules ne présentent pas de toxicité tandis que l‟application du champ magnétique réduit la
survie cellulaire de 30% des cellules tumorales ayant accumulées les nanoparticules MG-
IONP-DY647, sans affecter celle des cellules dépourvues de MG-IONP-DY647.
Suite à l‟accumulation des nanoparticules MG-IONP-DY647 dans les lysosomes, nous
avons examiné si ces compartiments participaient dans le processus de mort cellulaire. Les
cellules ayant accumulées ou non des nanoparticules MG-IONP-DY647 ont été soumises au
176
champ magnétique alternatif, mais en pré-incubant les cellules avec l‟inhibiteur des cystéines
protéases E64d. En présence d‟inhibiteur E64d, l‟induction de la mort par le champ
magnétique est réduite. Ces résultats montrent un rôle du compartiment lysosomal et des
cystéines protéases dans le mécanisme de mort cellulaire induit par hyperthermie magnétique.
Il est à noter que la mort cellulaire est induite en maintenant la température du milieu
extracellulaire à 37°C, pour cela l‟un des mécanismes avancés serait que l‟application du
champ magnétique induirait une hyperthermie locale, au niveau des lysosomes ayant
accumulées des nanoparticules provoquant ainsi une perméabilisation de la membrane
lysosomale suivie par la fuite de son contenu. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons
cherché à visualiser la fuite d‟un marqueur fluorescent, le lysotraker, préalablement accumulé
dans les lysosomes. L‟application du champ magnétique diminue la fluorescence du
lysotraker accumulé dans les lysosomes des cellules ayant internalisé les MG-IONP-DY647,
alors qu‟il n‟y a aucun effet sur les cellules dépourvues en nanoparticules.
Donc, une éradication spécifique des cellules tumorales ayant internalisées des
nanoparticules MG-IONP-DY647 par un champ magnétique alternatif s’effectue sans une
élévation de température perceptible et implique une voie de mort lysosomale.
(ii) Etude des mécanismes impliqués dans la mort cellulaire induite par hyperthermie
magnétique intra-lysosomale.
Notre étude s‟attache aussi à préciser la cascade d‟évènements conduisant à la mort
des cellules traitées au champ magnétique. On a déjà mentionné que les nanoparticules
s‟accumulent dans les lysosomes, un lieu bien connu pour la production de radicaux libres
oxygénés (ROS), et que les nanoparticules magnétiques d‟oxyde de fer soumises à un champ
magnétique n‟induiraient pas une élévation perceptible de température dans le milieu
d‟incubation. Nous avons donc formulé l‟hypothèse que cette élévation de température locale,
intra-lysosomale, catalyserait la génération des ROS qui, à leur tour, seraient responsables de
la perméabilisation de la membrane lysosomale, permettant ainsi la fuite des enzymes
lysosomales vers le cytosol, entrainant l‟activation des voies de mort cellulaire dépendantes
des lysosomes (figure 23).
Donc, nous sommes intéressés à décortiquer les étapes initiatrices de mort, au niveau
lysosomal. L‟étude des mécanismes de mort est rendue difficile car il était jusqu‟à présent
impossible d‟observer en direct les cellules durant le traitement au champ magnétique. Nous
présentons dans notre étude l‟opportunité offerte par un électroaimant miniaturisé qui traite
177
les cellules cancéreuses à un champ magnétique alternatif à haute fréquence, ce qui rend
possible l‟observation directe de tous les évènements déclencheurs conduisant à la mort
cellulaire, par microscopie confocale. De plus, cet électroaimant présente l‟avantage de
pouvoir étudier tous les conditions simultanément; des cellules ayant ou non internalisé des
nanoparticules magnétiques, soumises ou non au champ magnétique. Cet électroaimant est
capable de provoquer un taux de mortalité équivalent à des inducteurs commerciaux. Nos
résultats montrent que l‟application du champ magnétique induit une augmentation de la
production ROS et une perméabilisation de la membrane lysosomale spécifiquement dans les
cellules ayant internalisé des nanoparticules comparativement aux cellules contrôles. Ces
deux évènements sont impliqués dans les mécanismes aboutissant à la mort des cellules
induites par hyperthermie magnétique et ils se produisent à un stade précoce.
Les résultats de notre étude sur les mécanismes de mort cellulaire soutiennent
toujours l’hypothèse émise, selon laquelle l’initiation de la mort cellulaire par hyperthermie
magnétique intra-lysosomale selon laquelle l’échauffement des nanoparticules induit par le
champ magnétique catalyserait la production des radicaux libres oxygénés. Induisant une
perméabilisation de la membrane lysosomale et par suite la fuite des enzymes vers le cytosol.
Figure 23 : Description schématique du mécanisme d’hyperthermie magnétique intra-lysosomale.
178
(iii) Combinaison du traitement d’hyperthermie magnétique avec un agent chimio-
thérapeutique.
Le pourcentage de la mort cellulaire obtenue dans les deux études présentées ci-dessus
se considère non massif par rapport à la taille de la tumeur. Dans le but d‟augmenter la mort
cellulaire, nous faisons l‟hypothèse qu‟un traitement avec un agent chimique combiné au
champ magnétique devrait permettre, d‟augmenter l‟efficacité thérapeutique. Nous avons
choisi d‟associer au champ magnétique, la doxorubicine, un agent chimio-thérapeutique
utilisé en premier ligne pour le traitement en clinique des tumeurs endocrines. Quelque soit la
dose de la doxorubicine employée, la combinaison des deux traitements permet d‟augmenter
la mortalité et de diminuer la survie cellulaire comparativement aux traitements individuels.
Les résultats démontrent un effet proche de l‟additivité des deux traitements séparés,
l‟hyperthermie magnétique et la doxorubicine, avec une réduction de la survie jusqu‟à 77.7%.
Compte tenu des résultats encourageants du traitement par hyperthermie magnétique,
il apparaissait important d‟étendre l‟étude en s‟intéressant à disséquer toutes les molécules
clés intervenant dans les voies de signalisation en aval du lysosome (figure 24). Nous
chercherons notamment à déterminer le type de mort cellulaire, pouvant être induite à partir
des compartiments lysosomales tels que l‟apoptose, la nécrose ou la pyroptose. A l‟heure
actuelle, nous sommes intéressés à détecter le lieu de la production des ROS, la méthode
utilisée est basée sur l'accumulation dans la cellule d‟un réactif fluorescent, cette méthode ne
pourrait pas préciser que la production des ROS est exclusivement lysosomale. Deux
hypothèses peuvent être proposées: (i) la perméabilisation de la membrane des lysosomes
pourrait être initialement provoqué par la formation de ROS dans les lysosomes par réaction
Fenton, (ii) la production de ROS pourrait être une conséquence de la perméabilisation
lysosomale. Cette hypothèse est plus compatible avec les multiples sources de ROS, y
compris les mitochondries, les peroxysomes, ou le réticulum endoplasmique. Pour cela, le
développement d‟un biosenseur fixé à la surface des nanoparticules MG-IONP-DY647 sera
utile. Ce biosenseur fluorescent sera suivi durant l‟application du champ magnétique à l‟aide
de l‟électroaimant miniaturisé ce qui permettra de déterminer si la production de ROS, est
exclusivement induites par les nanoparticules en réponse à un champ magnétique alternatif.
De plus, nous avons vérifié que les nanoparticules MG-IONP-DY647 accumulées
dans les lysosomes et exposées à un champ magnétique se comportent comme des agents
lysosomotropes dans les cellules tumorales endocrines, où une perméabilisation de la
membrane lysosomale suivie par une perte de leur contenu dans le cytoplasme est induite.
179
Dans ce contexte, des expériences complémentaires seront nécessaires afin de
visualiser la fuite d‟enzymes lysosomales en temps réel. Les cellules seront cotransfectées
pour exprimer les protéines : Lamp1 résidente dans la membrane lysosomale et Cathépsine-B
lysosomale.
Egalement, nous chercherons à déterminer l‟hyperthermie au niveau lysosomale. La
quantification de l‟élévation de la température à la surface des nanoparticules MG-IONP-
DY647 porteuses d‟un thermomètre moléculaire, qui sont présentes dans les lysosomes des
cellules tumorales pendant l‟application du champ magnétique est rendue possible grâce à
l‟électro-aimant miniaturisé que nous avons développé.
D‟autre part, le projet continuera pour réaliser des études précliniques de nanothérapie
ciblée des tumeurs endocrines, qui consiste à valider le ciblage des cellules tumorales à l‟aide
des nanoparticules MG-IONP-DY647 dans des modèles murins de xénogreffe et, d‟autre part,
à éradiquer les tumeurs endocrines dans ces modèles par hyperthermie magnétique. Des
études similaires seront réalisées sur le modèle de souris transgéniques de tumeurs endocrines
pancréatiques KO-MEN1, imitant le syndrome MEN de type 1 humain, après avoir validé
l‟expression du récepteur CCK2 dans ces tumeurs.
Enfin, nos données constituent une avancée dans le domaine de la nanotechnologie.
La compréhension du trafic intracellulaire des nanoparticules, la validation de l’effet
hyperthermique sur des cellules en culture, l’élucidation des mécanismes et la détermination
des facteurs limitant le niveau de mort, nous permettront d’optimiser les futures générations
de nanoparticules magnétiques pour les rendre plus efficaces. L’utilisation de nanoparticules
présentant des propriétés magnétiques supérieures à celles des oxydes de fer, et donc un
pouvoir hyperthermique supérieurs, pourrait améliorer l’efficacité du traitement par
hyperthermie magnétique intra-lysosomale. Ce traitement pourra également être associer à
d’autres stratégies thérapeutiques permettant une éradication performante des cellules
tumorales.
180
Figure 24: Représentation schématique des mécanismes de morts cellulaires induites par l’hyperthermie magnétique intra-lysosomale.
181
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