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UNIVERSITE LOUIS PASTEURSTRASBOURG I
1995
THESEprésentée à
L'UFR DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
pour obtenir le titre de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR
domaine : BIOLOGIE MOLECULAIRE
par
Alain HEHN
LES GENES 3' PROXIMAUX DU RNA 2 DU VIRUS DES NERVURES JAUNESET NECROTIQUES DE LA BETTERAVE (OU BNYVV) :
LEUR ROLE DANS LA REPLICATION ET LA TRADUCTION DU GENOMEVIRAL AINSI QUE DANS LE MOUVEMENT DU VIRUS DE CELLULE A
CELLULE.
Soutenue le 27 juin 1995 devant la Commission d'Examen
Dr. M. LEGRAND Rapporteur internePr. A. VAN KAMMEN Rapporteur externeDr. T. CANDRESSE Rapporteur externeDr. K. RICHARDS ExaminateurPr. G. JONARD Directeur de Thèse
Institut de Biologie Moléculaire des Plantes (IBMP-CNRS) Strasbourg
à mes parents,à Valérie, à Michel
Je voudrais remercier ici, le professeur Jonard qui m'a accordé sa confiance un matind'avril 1991 en m'accueillant au sein de son groupe, me donnant ainsi l'opportunité deréaliser cette thèse.
La recherche est un labyrinthe dans lequel on peut aisément s'égarer. Merci àmessieurs Guilley et Richards, les 2 autres membres du TCB, d'avoir été disponiblepour m'écouter, me conseiller et me diriger efficacement quand il le fallait.
J'aimerai exprimer ma gratitude aux membres du jury : messieurs Candresse, Legrandet Van Kammen pour avoir accepté de juger ce travail.
Mes remerciements vont tout particulièrement à Salah Bouzoubaa qui, armé debeaucoup de patience (si, si, beaucoup de patience ! ), a su m'initier à la paillasse et àla recherche en général.
Merci également à Mme Marbach pour avoir préparé chaque semaine, inlassablement,ces fameux protoplastes, source de joie et souvent de dépit.
Je tiens a exprimer ma reconnaissance à Mme Fritsch qui, au cours de nos discussions,m'a permis de mieux comprendre la maturation mais aussi le frame-shift...!
Enfin, je voudrais remercier toutes les personnes qui, de près ou de loin, ont contribué àfaire de cette thèse ce qu'elle est et avec qui j'ai partagé tant de gâteaux, de chocolats etautre thé à la menthe.
SOMMAIRE
SOMMAIRE.........................................................................................................................1
INTRODUCTION ...............................................................................................................7
RESULTATS
CHAPITRE 1 : LES PROTEINES EXPRIMEES A PARTIR DU "TRIPLE GENE
BLOCK" (TGB) SONT DIRECTEMENT IMPLIQUEES DANS LE
MOUVEMENT DU VIRUS DE CELLULE A CELLULE. ............................................17
I-Etat des connaissances sur les mécanismes de transport des virus. ....................................19
1-Stratégie utilisée par les tobamovirus. ....................................................................20
2-Stratégie utilisée par les comovirus, les népovirus et les caulimovirus..................20
3-Stratégie utilisée par les hordeivirus, les potexvirus et les furovirus......................21
II-Rôle du Triple Gene Block dans le mouvement de cellule à cellule du BNYVV. ............23
1-Le Triple Gene Block du BNYVV est impliqué dans le mouvement du virus de
cellule à cellule...........................................................................................................23
2-Les protéines P42 et P13 du Triple Gene Block sont exprimées à partir de
RNA subgénomiques. ................................................................................................27
III-Conclusions et perspectives. .............................................................................................28
Publication n°1 : EFFICIENT CELL TO CELL MOVEMENT OF BEET NECROTIC
YELLOW VEIN VIRUS REQUIRES 3' PROXIMAL GENES LOCATED ON RNA 2.....31
Sommaire______________________________________________________________________
2
CHAPITRE 2 : ETUDE DE LA PROTEINE P14 CODEE PAR
L'ORF 3' PROXIMALE DU RNA 2 DU BNYVV............................................................41
I-Mise en évidence du rôle de la protéine P14 dans le cycle de multiplication du
BNYVV. ................................................................................................................................41
1-Des mutations introduites dans le gène VI du RNA 2 engendrent une
diminution du taux de réplication des RNA viraux. (publication n°1).....................41
2-La protéine P14 joue un rôle en cis dans la réplication du RNA 2 et active en
trans la synthèse de la protéine de coque. (publication n°2) .....................................48
3-Mode d'action de la protéine P14. ..........................................................................54
II-Mise en évidence de l'importance des résidus cystéines 69, 72, 106 et 109 dans
l'activité de la protéine P14....................................................................................................60
1-Construction de mutants alanine (Giesman-Cookmeyer & Lommel, 1993). .........62
2-Propriétés biologiques des mutants alanine............................................................62
III-Mise en évidence d'interactions protéine P14-acides nucléiques. ....................................65
1-Clonage du gène VI dans le vecteur pET. ..............................................................65
2-Purification partielle de la protéine P14 par chromatographie d'affinité sur une
colonne "Zinc Chelate Affinity Adsorbent" (ZCAA). ...............................................67
3-Mise en évidence d'interactions protéine P14-acides nucléiques par la
technique de "Northwestern" (Gramstat et al, 1990). ................................................69
IV-Conclusion .......................................................................................................................69
Publication n°2 : THE SMALL CYSTEIN-RICH PROTEIN P14 OF BEET NECROTIC
YELLOW VEIN VIRUS REGULATES ACCUMULATION OF RNA 2 IN CIS AND
COAT PROTEIN IN TRANS.................................................................................................73
CHAPITRE 3 : DES RNA 2 DEFECTIFS SONT CAPABLES D'INHIBER LA
REPLICATION DU BNYVV .............................................................................................103
I-Rappel sur les stratégies de lutte antivirale par transgénose : expression de
séquences dérivées du pathogène...............................................................................103
II-Obtention de RNA défectifs artificiels du BNYVV : leur effet sur la
réplication du virus. ...................................................................................................109
Sommaire______________________________________________________________________
3
1-Obtention de RNA défectifs.................................................................... 109
2-Seules les délétions introduites dans le RNA 2 produisent des RNA ayant
un effet Défectif Interférant........................................................................ 109
3-Analyse de l'effet DI en fonction de la quantité de RNA DI utilisée et du
temps. ......................................................................................................... 110
4-Analyse dans les plantes de l'effet DI des différents mutants du RNA 2.112
III-Conclusions et perspectives. .................................................................................113
Publication n°3 : ARTIFICIAL DEFECTIVE INTERFERING RNAs DERIVED FROM
RNA 2 OF BEET NECROTIC YELLOW VEIN VIRUS.....................................................115
CHAPITRE 4 : MISE EN EVIDENCE D'UNE ACTIVITE PROTEOLYTIQUE
ASSOCIEE A LA PROTEINE P237 CODEE PAR LE RNA 1 DU BNYVV. ...............125
I-Les protéases d'origine virale et leurs caractéristiques ............................................127
1-Généralités sur les protéases. .................................................................. 127
2-Exemples de protéines virales présentant une activité protéasique ........ 130
II-Cas du BNYVV......................................................................................................131
1-Comparaison de séquences avec des domaines protéases d'autres
phytovirus................................................................................................... 131
2-Mise en évidence d'une activité protéase associée à la protéine P237.... 134
III-Conclusions :.........................................................................................................135
CONCLUSION ....................................................................................................................137
MATERIEL ET METHODES
A-AMPLIFICATION, EXTRACTION ET MODIFICATIONS DE DNA
PLASMIDIQUE. ..................................................................................................................141
I-Souches bactériennes, vecteurs de clonage ou d'expression et milieux de culture. ............141
1-Souches bactériennes .............................................................................................141
2-Vecteurs .................................................................................................................143
Sommaire______________________________________________________________________
4
3-Milieux. ..................................................................................................................146
II-Transformation des souches bactériennes et mise en culture. ...........................................146
1-Utilisation de Chlorure de Calcium........................................................................146
2-Transformation par électroporation ........................................................................147
3-Caractérisation des clones par hybridation in situ. .................................................148
III-Extraction et analyse de DNA plasmidique......................................................................148
1-Minipréparation et maxipréparation .......................................................................148
2-Analyse. ..................................................................................................................150
IV-Préparation de DNA plasmidique simple brin uridylé et mutagénèse dirigée selon la
méthode de Kunkel . ..............................................................................................................152
1-Culture. ...................................................................................................................152
2-Purification du DNA simple brin. ..........................................................................152
3-Mutagénèse dirigée en utilisant des oligonucléotides modifiés (Zoller & Smith,
1982). .........................................................................................................................152
V-Techniques de sous clonage par l'utilisation d'enzymes. ...................................................153
1-Digestion enzymatique. ..........................................................................................153
2-Obtention d'extrémités franches. ............................................................................154
3-Déphosphorylation..................................................................................................155
4-Phosphorylation. .....................................................................................................156
5-Ligation...................................................................................................................156
VI-Amplification d'un fragment de DNA par la technique de la PCR. .................................157
1-Principe de la méthode et conditions générales......................................................157
2-Cas particulier du RNA 2 du BNYVV. ..................................................................158
VII-Purification sur gel d'agarose d'un fragment de DNA obtenu par digestion
enzymatique ou par PCR. ......................................................................................................158
1-Par électroélution....................................................................................................158
2-Par extraction d'un gel LMP. ..................................................................................159
VIII-Séquençage selon la méthode de Sanger, modifiée pour la T7 DNA polymérase.........159
1-Séquençage d'un DNA plasmidique. ......................................................................159
Sommaire______________________________________________________________________
5
2-Séquençage d'un produit PCR.................................................................................160
IX-Transcription in vitro. .......................................................................................................161
1-Obtention de transcrits infectieux du BNYVV.......................................................161
2-Synthèse de sondes ribonucléiques.........................................................................163
X-Analyse des transcrits par hybridation in situ ....................................................................163
1-Séparation des RNA par migration sur gel d'agarose en conditions
dénaturantes................................................................................................................163
2-Hybridation avec des sondes spécifiques radioactives. ..........................................165
XI-Analyse de la descendance par réverse transcription........................................................166
B-EXPRESSION IN VIVO OU TRADUCTION IN VITRO DES PROTEINES DE
BNYVV .................................................................................................................................167
I-Expression de protéines dans un système bactérien (Studier et al, 1990)...........................167
II-Purification par chromatographie d'affinité sur une colonne ZCAA (Zinc Chelate
Affinity Adsorbent)................................................................................................................167
III-Traduction in vitro dans un système acellulaire de réticulocytes de lapins. .....................168
1-Préparation du lysat de réticulocytes de lapins. ......................................................168
2-Traduction des produits de transcriptions. ..............................................................169
IV-Analyse. ............................................................................................................................169
1-Par électrophorèse en conditions dénaturantes sur gel de polyacrylamide. ............169
2-Par immunorévélation après transfert. ....................................................................170
V-Etude de l'activité fixatrice d'une protéine par northwestern. (Gramstat et al, 1990)........173
C-MULTIPLICATION DU VIRUS DANS UNE PLANTE HOTE :
CHENOPODIUM QUINOA. ...............................................................................................173
I-Plante hôte. ..........................................................................................................................173
II-Préparation du virus. ..........................................................................................................174
III-Extraction de RNA viraux à partir de feuilles de C. quinoa. ............................................174
1-En présence de tampon "polysome" (Jackson & Larkins, 1976) ...........................174
Sommaire______________________________________________________________________
6
2- En présence de tampon Tris-Magnésium. .............................................................175
IV-Préparation, inoculation et mise en culture de protoplastes. ............................................176
1-Préparation des protoplastes (Veidt et al, 1992).....................................................176
2-Infection des protoplastes par des acides nucléiques (RNA de BNYVV ou
DNA plasmidique) et mise en culture........................................................................176
V-Extraction des RNA viraux de protoplastes. .....................................................................177
VI-Expression transitoire dans les feuilles de C. quinoa et Nicotiana tabacum. ..................178
ANNEXES
Publication n°4 : IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF RESISTANCE
TO RHIZOMANIA IN AN ECOTYPE OF BETA VULGARIS SUBSP. MARITIMA. .........179
ABREVIATIONS..................................................................................................................195
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...............................................................................199
INTRODUCTION
C'est en 1959, dans la vallée du Pô (Italie), que Canova décrit pour la première
fois des betteraves malades présentant comme symptômes (1) des feuilles gaufrées avec
des tâches jaunes diffuses le long des nervures (voir figure 1-B) ; (2) un pivot de taille
réduite par rapport à celui d'une plante saine ; (3) une nécrose des anneaux vasculaires
facilement observable lorsque le pivot est coupé transversalement ; et (4) une abondante
barbe "poivre et sel" due à une prolifération anormale et anarchique des radicelles (voir
figure 1-A). Cette dernière observation, la plus caractéristique, donne son nom à la
maladie : la rhizomanie, ce qui signifie étymologiquement "démence des racines" (rhizo
= racines ; mania = folie) (voir figure 1-A). Cette maladie a ensuite été décrite au Japon
en 1965 et fait son apparition en France, plus précisément en Alsace, dans les années 70
(Putz et Vuittenez, 1974). La rhizomanie engendre une perte considérable dans le
rendement en sucre qui passe de 18 à 8%, rendant l'exploitation impropre.
Dès 1966, Canova suggère que la maladie est due à un champignon du sol :
Polymyxa betae. C'est un champignon inférieur, à zoospores biflagellées, parasite
intracellulaire des racines de betteraves. Il appartient à la classe des Myxomycètes et à
l'ordre des Plasmodiophorales (Chadefaud & Emberger, 1942). Les spores de résistance
se trouvant dans un sol contaminé vont germer et libérer des zoospores qui se déplacent
vers les radicelles d'une betterave, la propulsion se faisant grâce au mouvement
coordonné des 2 flagelles de la zoospore. Lorsque le contact avec une radicelle a lieu,
les flagelles disparaissent et la zoospore déverse son contenu cellulaire dans la cellule
hôte. Après 16 heures, on peut déjà observer un jeune plasmode qui va se différencier en
Introduction______________________________________________________________________
8
A
B
Figure 1 : Symptômes de la rhizomanie : (A) photo représentant des betteraves saines (àgauche) et rhizomaniées (à droite).(Photo fournie par l'INRA de Colmar). (B) Photomontrant les symptômes foliaires qui ont donné leur nom au virus.
Introduction______________________________________________________________________
9
Figure 3 : Cycle de Polymyxa betae (d'après Keskin, 1967)
Introduction______________________________________________________________________
10
zoosporange ou en cystosore (Keskin, 1964 et 1967) (voir figure 3).
Ce n'est qu'en 1973 que Tamada et Baba démontrent que l'agent responsable de la
rhizomanie est un virus : le beet necrotic yellow vein virus ou virus des nervures jaunes
et nécrotiques de la betterave (encore appelé BNYVV) ; ceci fut confirmé par Fujisawa
et Sugimoto en 1977. Le champignon Polymyxa betae, quant à lui, est seulement
impliqué dans la transmission du BNYVV (Fujisawa & Sugimoto, 1976). Enfin, les
premières études au plan moléculaire furent initiées en 1983 (Putz et al, 1983) et
démarrèrent vraiment en 1985 (Richards et al, 1985).
Le virus des nervures jaunes et nécrotiques de la betterave est un phytovirus (Putz,
1977) appartenant à la famille des furovirus (fungus rod-shaped virus) (Brunt &
Richards, 1989 ; Brunt, 1991). Son génome est composé de 4 RNA (voir figure 4) de
polarité positive coiffés à leur extrémité 5' et polyadénylés à leur extrémité 3'. Ces 4
RNA sont encapsidés dans des particules virales de taille variable (390 nm, 265 nm, 100
nm et 89 nm) et de symétrie hélicoïdale avec un diamètre constant de 20 nm. Dans
certains isolats japonais, un 5ème RNA, de fonction inconnue, a été décrit (Tamada et al,
1989). Les RNA 1 et 2 sont nécessaires à la réplication, l'encapsidation et le mouvement
de cellule à cellule du virus. Ils sont donc suffisants pour provoquer un processus
infectieux quand ils sont inoculés mécaniquement à des feuilles de Chenopodium
quinoa, une plante hôte (voir figure 2-B). Les RNA 3 et 4 restent cependant essentiels
lors de l'infection naturelle des racines de betterave par l'intermédiaire du champignon
vecteur.
Le RNA 1 (6746 nt) code pour une protéine de poids moléculaire 237 kDa
renfermant les séquences consensus des méthyltransférase, hélicase (GKS) et
polymérase (GDD) (Bouzoubaa et al, 1987). D'autre part, comme nous le verrons dans
le chapitre IV, la protéine P237 contient une séquence caractéristique des protéases de
type papaïne (Koonin & Dolja, 1993 ; Rozanov et al, 1995) localisée entre le domaine
hélicase et le domaine polymérase. Le RNA 1 est capable de s'autorépliquer lorsqu'il est
inoculé seul à
Introduction______________________________________________________________________
11
Figure 4 : Organisation génétique du virus des nervures jaunes et nécrotiques de la betterave ou BNYVV et fonctions associées aux protéines codées par les différents RNA génomiques.
Réplication
Encapsidation
Transmission
Symptomatologie et amplification du
virus dans les racines
Mouvement de cellule à cellule
Régulation de la réplication et de la
traductionInconnue
Fonctions dans le cycle de multiplication.
RNA 1GKS
P 237
AAAGDD
MTR HEL PRO POL? ? ?
RNA 3 RNA 4 AAAAAA4.6 KP25 P31
RNA 215 K
CP
AAA
P75
UAG
P42
P13 P14
TGB
RNA Subgénomique
GKS
N
Introduction______________________________________________________________________
12
des protoplastes de cellules de mésophylle de C. quinoa (voir figure 5) (Bouzoubaa &
Scheidecker, 1990 ; Gilmer et al, 1992).
Le RNA 2 (4612 nt) présente une organisation génétique plus complexe avec 6
phases de lecture ouverte (ORF). La première ORF dirige la synthèse de la protéine de
capside (CP) d'un poids moléculaire de 21 kDa. La protéine de translecture de 75 kDa
obtenue par suppression du codon stop UAG de la première ORF (Ziegler et al, 1985 ;
Bouzoubaa et al, 1986), joue un rôle dans l'initiation de l'encapsidation (Schmitt et al,
1992), dans la transmission du virus par le vecteur (Tamada & Kusume, 1991) et a été
visualisée par microscopie électronique à l'une des extrémités des particules virales
(Haeberlé et al, 1994). Les 3 ORF chevauchantes III, IV et V sont regroupées sous le
terme de "triple gene block" (ou TGB). Une organisation génétique analogue a été
décrite pour d'autres furovirus (Herzog et al, 1994 ; Scott et al, 1994) mais également
chez des virus comme les carlavirus, les hordeivirus et les potexvirus (Morozov et al,
1989). Ces 3 ORF du BNYVV codent respectivement pour des protéines potentielles de
poids moléculaire 42, 13 et 15 kDa. La protéine P42 dispose d'une séquence consensus
GKS caractéristique d'une activité NTP-binding souvent associée aux hélicases et a été
mise en évidence, ainsi que la protéine P13, dans les fractions membranaires préparées à
partir de feuilles de C. quinoa infectées par le virus (Niesbach-Klösgen et al, 1990). En
revanche, la protéine P15 n'a pas encore été détectée in planta. Enfin, l'ORF 3'
proximale du RNA 2 code pour une protéine de 14 kDa riche en cystéine et qui a été
localisée dans la fraction cytosolique de feuilles infectées (Niesbach-Klösgen et al,
1990). Cette protéine, comme nous le verrons ultérieurement (voir chapitre 2), joue un
rôle dans la régulation de l'infection virale.
Le RNA 3 (1773 nt) code pour une protéine de 25 kDa impliquée dans la
multiplication virale au niveau des racines de betteraves infectées (Koenig et al, 1986 ;
Lemaire et al, 1988 ; Tamada & Abe, 1989) ainsi que dans la symptomatologie au
niveau des feuilles (Jupin et al, 1992). Une étude immunocytochimique récente montre
que la protéine P25 est synthétisée très tôt dans le cycle viral ; de plus elle est détectée à
Introduction______________________________________________________________________
13
la fois dans le cytoplasme et dans le noyau des cellules infectées (Haeberlé & Stussi-
Garraud,
Introduction______________________________________________________________________
14
Figure 4 : Protoplastes préparés à partir de cellules de mésophylle deChenopodium quinoa dans les conditions décrites dans Matériel etméthodes.
Introduction______________________________________________________________________
15
1995). Une seconde ORF, l'ORF N, est exprimée lorsque des délétions dans le gène
codant pour la protéine P25 rapprochent l'AUG initiateur de cette petite ORF de la
séquence 5' non codante (Jupin et al, 1990). L'expression de la protéine très hydrophobe
codée par ce gène N entraîne l'apparition de lésions nécrotiques sur les feuilles des
plantes hôtes infectées. Enfin, une troisième ORF a été mise en évidence et code pour
une protéine potentielle de 4,6 kDa qui serait exprimée à partir d'un RNA subgénomique
détecté dans les feuilles infectées et qui est redondant avec les 545 derniers nucléotides
du RNA 3 (Bouzoubaa et al, 1991). Le rôle de ce peptide est actuellement en cours de
caractérisation au laboratoire. Des résultats préliminaires montrent que des délétions
réalisées dans cette ORF inhibent le mouvement à longue distance du virus dans Beta
macrocarpa (Tamada, communication personnelle) alors que des mutations ponctuelles
introduisant des codons de terminaison restent sans effet (Guntz-Lauber, communication
personnelle). Cette observation semble indiquer que c'est la séquence nucléotidique de
ce RNA subgénomique qui est directement impliquée dans ce phénomène de transport à
longue distance et non pas son produit d'expression.
Le RNA 4 (1467 nt) code pour une protéine de 31 kDa (Bouzoubaa et al, 1985)
qui joue un rôle prépondérant dans la transmission du virus par le vecteur fongique
(Koenig & Burgermeister, 1989 ; Tamada & Abe, 1989).
Mon travail de thèse a consisté plus particulièrement à caractériser le rôle des
produits des gènes 3' proximaux du RNA 2. Pour cela nous disposions au laboratoire
des clones cDNA complets des 4 RNA viraux (Quillet et al, 1989) permettant d'obtenir
des transcrits infectieux. A partir de ces clones, nous avons construit des mutants
ponctuels ou des mutants de délétion dans l'une ou l'autre des séquences codantes, puis
nous avons étudié in vivo l'effet de ces modifications. Ainsi, dans le premier chapitre,
j'aborderai les problèmes du mouvement du virus de cellule à cellule et je démontrerai
que les protéines codées par les trois cistrons du triple gene block sont impliquées dans
ce processus. Dans le chapitre 2, je présenterai les résultats concernant le rôle de la
protéine P14, codée par l'ORF VI du RNA 2, dans la réplication et dans la traduction du
Introduction______________________________________________________________________
16
RNA 2. Le 3ème chapitre traitera des stratégies antivirales qui peuvent être envisagées
pour bloquer la réplication du BNYVV. J'y montrerai comment nous avons obtenu des
RNA défectifs interférants (ou RNA DI) à partir du RNA 2, RNA DI que l'on peut
envisager d'utiliser comme outil de lutte contre ce virus. Enfin dans le chapitre IV, je
décrirai des résultats préliminaires qui permettent d'affirmer que la protéine P237, codée
par le RNA 1, est une polyprotéine susceptible d'être maturée au cours du cycle de
multiplication virale par une activité protéasique associée à cette polyprotéine.
CHAPITRE 1 :
LES PROTEINES EXPRIMEES A PARTIR DU "TRIPLE GENE
BLOCK" (TGB) SONT DIRECTEMENT IMPLIQUEES DANS LE
MOUVEMENT DU VIRUS DE CELLULE A CELLULE.
L'infection d'une plante par un virus à RNA passe, en général, par quatre étapes
majeures. Dans un premier temps le virus doit pénétrer dans les cellules de l'hôte. Cette
infection peut se faire par inoculation mécanique en provoquant une lésion au niveau
des tissus de la plante ; elle peut également s'établir par l'intermédiaire d'un vecteur
(aphide, nématode, champignon). Quand il est en place, le virus doit pouvoir se
multiplier, multiplication qui sous entend la décapsidation du ou des RNA génomiques
provenant de l'inoculum, leur traduction, leur réplication et finalement l'encapsidation
des RNA néosynthétisés. Dans un troisième temps, le virus est amené à quitter le site
d'infection pour migrer dans les cellules voisines. Finalement quand il atteint les
vaisseaux conducteurs, il va pouvoir infecter le reste de la plante provoquant ainsi une
infection systémique. La spécificité d'infection d'un virus pour un hôte particulier
consiste donc à pouvoir réaliser toutes ces étapes.
Résultats______________________________________________________________________
18
Figure I-1 : Représentation schématique des 2 types de stratégies qui semblentse dégager des études effectuées sur le mouvement de cellule à cellule des virusde plantes. Le premier mécanisme fait appel à une protéine de mouvement quiaugmente la limite d'exclusion des plasmodesmes et qui permet unelinéarisation des RNA viraux qui pourront ainsi diffuser sous forme decomplexe ribonucléoprotéique. Cette stratégie est adoptée par le TMV. Lesecond mécanisme engendre une modification irréversible des plasmodesmesavec la présence de particules virales à l'intérieur de microtubules (c'est le casdu CPMV).
Réplication du virus
Protéines de mouvement
Protéines de coque
Type CPMV
Paroi cellulaire
Protéines de mouvement
protéines cellulaires
RNA viral néosynthétisé
?
?
?
diffusion de l'infection
virale
Type TMV
Chapitre 1______________________________________________________________________
19
Avant de présenter les résultats obtenus dans l'étude des gènes responsables de la
diffusion du BNYVV, je voudrais rappeler brièvement ce que l'on sait sur les différents
mécanismes de diffusion de cellule à cellule de l'infection virale.
I-Etat des connaissances sur les mécanismes de transport des virus.
En raison de la présence de la paroi pectocellulosique qui entoure chaque cellule
végétale, les possibilités de mouvement du virus de cellule à cellule sont très restreintes.
Le seul passage possible est représenté par les plasmodesmes qui sont des
communications intercellulaires assurant une continuité cytoplasmique entre 2 cellules
et permettant ainsi des échanges de métabolites. Des études par micro injection de
molécules fluorescentes de taille variable dans les cellules végétales ont permis de
mettre en évidence la limite d'exclusion moléculaire (SEL ou Size Exclusion Limit) des
plasmodesmes. Elle se situe entre 0,7 et 1 kDa ce qui correspond à peu près à un
diamètre de 1,5 à 2 nm. (Goodwin, 1983 ; Tucker, 1982).
Bien que la SEL soit relativement petite, Esau a montré, dès 1967, la présence de
virus de la jaunisse de la betterave (BYV) au niveau des plasmodesmes de plantes
infectées. Or le diamètre de ces virus à symétrie hélicoïdale est voisin de 10 nm, soit
cinq fois supérieure à la SEL. D'autres virus à symétrie hélicoïdale tels que le potato
virus X (ou PVX) (Allison & Shalla, 1974) et le barley stripe mosaic virus (ou BSMV)
(Mc Mullen et al, 1977), ainsi que des virus à symétrie icosaédrique comme les
lutéovirus (Gill & Chong, 1975 ; D'Arcy & De Zoeten, 1979) et les népovirus (De
Zoeten & Gaard, 1969) ont pu être observés au niveau de ces structures. Compte tenu de
leur SEL, il est évident que les plasmodesmes doivent donc subir des modifications
structurales pour permettre le passage de ces virus (Robards & Lucas, 1990).
A l'heure actuelle, 2 mécanismes majeurs (figure I-1) semblent être mis en jeu
dans la diffusion de l'infection virale à savoir le mécanisme utilisé par le virus de la
mosaïque du tabac (ou TMV) et d'autres tobamovirus et la stratégie employée par les
comovirus, les népovirus et les caulimovirus.
Résultats______________________________________________________________________
20
1-Stratégie utilisée par les tobamovirus.
Les résultats majeurs ont été obtenus avec le TMV qui fut pendant longtemps le
phytovirus le plus étudié sur le plan physico-chimique et biologique. Il code notamment
pour une protéine de 30 kDa essentielle au mouvement du virus de cellule à cellule
(Leonard & Zaitlin, 1982 ; Meshi et al, 1987). Des études par microscopie électronique
ont permis de montrer que des plantes infectées par ce virus ont des plasmodesmes
ayant une SEL supérieure à celle d'une plante saine. Elle passe de 1,5 nm à 5-6 nm. Des
plantes transgéniques exprimant la protéine P30 de manière constitutive présentent
même une SEL de 6 à 9 nm (Deom et al, 1990 ; Wolf et al, 1989). La protéine P30 a pu
être localisée au niveau de ces plasmodesmes (Ding et al, 1992 ; Atkins et al, 1991 ;
Moser et al, 1988, Tomenius et al, 1987) sans pour autant en modifier la structure
(Shalla et al, 1982). Cette augmentation de la SEL n'est pourtant pas suffisante pour
permettre le passage du TMV d'une cellule à une autre, les particules virales en bâtonnet
ayant un diamètre moyen de 18 nm et l'encombrement moyen d'une molécule de RNA
étant de 10 nm (Gibbs, 1976). La protéine P30 a également la propriété de fixer les
acides nucléiques (Citovsky et al, 1990). Ces propriétés ont donc amené Citovsky et
collaborateurs (1992) à proposer un modèle dans lequel la protéine P30 joue un rôle
double dans le mécanisme de mouvement : (1) elle augmente la SEL des plasmodesmes
d'un facteur 3 à 4 et (2), en se fixant au RNA, elle lui confère une structure déroulée qui
lui permet de passer au travers des plasmodesmes. Ceci sous-entend que le mouvement
de cellule à cellule se fait sous forme de complexe ribonucléoprotéique sans intervention
de la protéine de capside. L'intervention de facteurs cellulaires n'a pas encore été
démontrée pour le moment.
2-Stratégie utilisée par les comovirus, les népovirus et les caulimovirus.
Ce second mécanisme a été plus particulièrement étudié pour un comovirus : le
cowpea mosaic virus (ou CPMV), un virus à génome bipartite qui exprime son
information sous forme de polyprotéines qui sont ensuite maturées. L'information
génétique de ce virus est portée par 2 RNA génomiques. Le B-RNA dispose de
Chapitre 1______________________________________________________________________
21
l'information nécessaire et suffisante à la réplication car il est capable de s'auto répliquer
dans les protoplastes (Goldbach et al, 1980). Par contre, en l'absence du M-RNA, le
virus n'est pas capable d'induire une infection dans la plante. Une analyse détaillée a
montré que non seulement les protéines 48K/58K, dont l'information est portée par la
région 5' terminale du M-RNA, sont nécessaires au mouvement de cellule à cellule
(Rezelman et al, 1982), mais également les protéines de capsides VP37 et VP23. Les
protéines non structurales 48/58 K ont été localisées au niveau de structures tubulaires
dans les plasmodesmes de plantes infectées (Van Lent et al, 1990) : ces structures
modifient les plasmodesmes de façon irréversible et renferment des particules virales.
Ces tubules peuvent également être observées au niveau de la membrane de protoplastes
infectés (Van Lent, 1991). Enfin, plus récemment, grâce à des expériences d'expression
transitoire, il a été possible de démontrer que la protéine de 48 K était, d'une part, la
protéine de mouvement et, d'autre part, la seule protéine virale responsable de la
formation in vivo de ces tubules (Kasteel et al, 1993 ; Wellink et al, 1993). Cependant,
comme dans le cas de la stratégie utilisée par les tobamovirus, la participation de
protéines cellulaires ne peut être exclue à l'heure actuelle.
La formation de tubules et la présence de particules virales à l'intérieur de ces
structures ont également été observées pour d'autres types de virus comme l'euphorbia
mosaic virus (EMV), un géminivirus (Kim & Lee, 1992), le cauliflower mosaic virus
(CaMV), un caulimovirus (Stussi-Garraud et al, 1994), le tomato spotted wilt virus
(TSWV), un tospovirus (Kormelink, 1994) et le grapevine fanleaf virus (GFLV), un
népovirus (Ritzenthaler et al, 1995).
3-Stratégie utilisée par les hordeivirus, les potexvirus et les furovirus.
Enfin d'autres virus utilisent une stratégie de mouvement qui nécessite la synthèse
de 3 protéines à partir de 3 gènes regroupés en triple gene block, mais, à l'heure actuelle,
le mécanisme mis en oeuvre n'est pas encore élucidé. Cette stratégie est utilisée par le
Résultats______________________________________________________________________
22
Figure I-2 : Organisation génétique du BNYVV, du WClMV et du BSMV.
Domaine hydrophobe Séquence GDD caractéristique des polymérases virales Séquence GKS, site de fixation de nucléotides triphosphates Protéine de capside Triple Gene block impliqué dans le mouvement du virus de cellule à cellule Protéine jouant un rôle dans la réplication du virus
CPTGB
BNYVV
WClMV
BSMVAA
AA
AA
RNA 1
RNA 2
RNA 3 RNA 4
A
A
AA
A
TGB
TGB
TGB
CP
CP
CP
RNA α
RNA ß
RNA γ
Chapitre 1______________________________________________________________________
23
BSMV) (Petty et al, 1990), un hordeivirus et le white clover mosaic virus (WClMV)
(Beck et al, 1991), un potexvirus. Le BNYVV fait appel également à un ensemble de 3
gènes pour assurer la fonction de transport. Les ressemblances entres ces 3 virus ne
s'arrêtent pas là ; il faut également noter des homologies de séquences importantes entre
ces protéines, plus particulièrement au niveau des protéines codées par les 2 premiers
gènes du TGB (Figure I-2).
II-Rôle du Triple Gene Block dans le mouvement de cellule à cellule du BNYVV.
L'inoculation mécanique de feuilles de Chenopodium quinoa par des transcrits du
RNA 1 et du RNA 2 provoque des lésions chlorotiques localisées. Les RNA 1 et 2 du
BNYVV sont donc nécessaires et suffisants aux fonctions de base du virus, à savoir la
réplication, l'encapsidation et le mouvement de cellule à cellule de l'infection virale.
Les ORF III, IV et V du RNA 2 du BNYVV sont organisées en triple gene block.
La protéine P42 exprimée à partir de l'ORF III renferme une séquence GKS souvent
associée aux hélicases. Les protéines P13 et P15 codées respectivement par les ORF IV
et V contiennent des domaines hydrophobes. Les protéines P42 et P13 ont été localisées
au niveau de fractions membranaires dans des plantes infectées (Niesbach-Klösgen et al,
1990).
1-Le Triple Gene Block du BNYVV est impliqué dans le mouvement du virus de
cellule à cellule.
a-Construction de mutants du TGB.
Pour tous les RNA génomiques, nous disposons de clones cDNA complets à partir
desquels il est possible de synthétiser in vitro des transcrits qui se sont révélés être
infectieux lors d'une inoculation mécanique de feuilles de C. quinoa. Partant de ces
constructions, nous avons pu réaliser des modifications au sein des RNA génomiques
Résultats______________________________________________________________________
24
RNA 2 A
TGB
CP
mutant H A
ACA CTA GTA GAG ACA CTA GCT AGT
sauvage mutant
mutant I A
AT AGA G AT A AC TCG
sauvage mutant
mutant J A
AGG AAT TCG AGG AAT T AA TTC G
sauvage mutant
Figure I-3 : Localisation des mutations introduites dans le triple gene block (TGB) du RNA 2 du BNYVV. Les sites de restriction utilisés pour introduire les modifications (Spe I pour le mutant H et Eco RI pour le mutant J) sont représentés en rouge. Les nucléotides insérés sont soulignés.
Chapitre 1______________________________________________________________________
25
afin de pouvoir étudier le rôle des différents gènes. Par mutagénèse dirigée, nous avons
construit les mutants décrits figure I-3. Pour obtenir le mutant H, nous avons linéarisé le
plasmide pB218 en un site Spe I, puis, par l'utilisation du fragment de Klenow de la
DNA polymérase, ce site a été rempli, générant ainsi, après religation, un plasmide
pB218 ayant une insertion de 4 nucléotides au niveau de l'ORF III. L'utilisation d'un
oligonucléotide mutagène nous a permis d'insérer 4 nucléotides (ACTC) dans le gène IV
et d'obtenir ainsi le mutant I. Enfin, pour construire le mutant J, il nous a fallu faire une
digestion partielle Eco RI du plasmide pBF14 suivie d'un remplissage du site de
restriction par le fragment de Klenow de la DNA polymérase. Après ligation, le clone
obtenu dispose d'une insertion de 4 nucléotides. Pour tous les mutants décrits ci dessus,
l'insertion de 4 nucléotides génère un changement du cadre de lecture, l'apparition d'un
codon stop et donc la synthèse de protéines tronquées non fonctionnelles.
b-Etude de l'effet des mutations introduites dans le TGB.
Afin de vérifier si les protéines codées par le TGB jouent un rôle dans la
réplication, les transcrits correspondants à ces différents mutants ont été coinoculés avec
du RNA 1 (nécessaire à la réplication) à des protoplastes de C. quinoa. Après 48 heures
de culture, les RNA totaux ont été extraits puis analysés par hybridation moléculaire en
utilisant des sondes spécifiques des RNA 1 (pB12 : nt 4740 à 6560) et 2 (pB21 : nt 2335
à 3793). Nous avons ainsi pu constater qu'en l'absence des protéines P42 (mutant H),
P13 (mutant I) et P15 (mutant J) fonctionnelles le virus était encore capable de se
répliquer (voir publication 1, figure 4, pistes 2, 3 et 4). Les mutations introduites dans
ces 3 gènes n'altèrent donc pas une structure impliquée en cis dans la reconnaissance par
le complexe de réplication.
Pour tester l'impact des modifications introduites dans le TGB sur la diffusion de
l'infection virale, les différents mutants ont ensuite été transcrits et coinoculés avec du
RNA 1 à des feuilles de C. quinoa. Une semaine après l'infection, alors qu'il apparaît
Résultats______________________________________________________________________
26
des symptômes chlorotiques classiques sur les feuilles inoculées par du RNA 1 et 2
sauvage,
Figure I-4 : Localisation (A) des sondes riboprobes utilisées pour la mise en évidence des RNA subgénomiques (B). (* le produit d'expression du gène V n'a jamais pu être détecté in vivo).
RNA 2 A
TGB
CP 54 kDa
P42
P13
P15*
P14
P75
nt 638 à 2081 ² BB nt 2078 à
2715 218Bg
nt 3949 à 4481 ² AS
4,6 kb
A2 sub a 2,6 kb
A2 sub b 1,4 kb
A2 sub c 0,7 kb
nt 2324-3789 pB21A
B
Chapitre 1______________________________________________________________________
27
les feuilles inoculées en présence des mutants du TGB ne présentent pas de lésions.
L'analyse par hybridation moléculaire des RNA extraits de ces feuilles ne permet pas de
mettre en évidence de RNA viral (Voir publication 1, figure 2, pistes 3, 4 et 5). On peut
donc conclure que les protéines du TGB sont toutes les 3 essentielles au mouvement de
cellule à cellule de l'infection virale. En absence de mouvement, il est impossible de
détecter une infection qui reste limitée aux seules cellules initialement infectées.
2-Les protéines P42 et P13 du Triple Gene Block sont exprimées à partir de RNA
subgénomiques.
Pour exprimer des protéines codées par des cistrons internes d'un RNA
génomique, les virus de plantes ont élaboré de nombreuses stratégies comme : (1) le
mécanisme de "terminaison-réinitiation" où les ribosomes, après avoir traduit une ORF
glissent sur le messager jusqu'à ce qu'ils rencontrent un nouvel AUG initiateur (Kozak,
1989) ; (2) le "leaky scanning" où les ribosomes initient la traduction au niveau du
premier AUG, mais également au niveau d'un autre AUG plus en aval si le premier
AUG n'est pas dans un contexte favorable (Kozak, 1989) ; (3) le mécanisme "d'entrée
interne" quand les ribosomes reconnaissent une séquence au sein d'un RNA génomique
(Pelletier & Sonnenberg, 1988) ; (4) la translecture obtenue par suppression d'un codon
stop (Ziegler et al, 1985) ; (5) le changement de cadre de lecture ou frame shift (Brault
& Miller, 1992), enfin (6) l'utilisation de RNA subgénomiques où le gène à exprimer se
trouve localisé à l'extrémité 5' du RNA messager.
Pour mettre en évidence la présence de RNA subgénomiques correspondant aux
cistrons 3' proximaux du RNA 2, nous avons inoculé des feuilles de C. quinoa ou une
autre plante hôte Tetragonia expansa avec du BNYVV isolat Stras 12 contenant les
RNA 1 et 2. Lorsque les lésions apparaissent, les RNA totaux sont extraits puis analysés
par hybridation moléculaire en utilisant des sondes ribonucléiques correspondant à des
séquences internes du RNA 2 (figure I-4). L'utilisation d'une sonde ∆AS correspondant à
l'extrémité 3' terminale du RNA 2 (nt 3949 à 4481) nous a permis de mettre en évidence
4 bandes ayant une taille de 0,7 kb pour le RNA 2sub c, 1,4 kb pour le RNA 2sub b,
Résultats______________________________________________________________________
28
2,6 kb pour le RNA 2sub a et enfin 4,6 kb pour le RNA 2 complet (voir publication 1,
figure 5, piste 4). Lorsque l'on utilise d'autres sondes, seule l'une ou l'autre de ces bandes
apparait après autoradiographie. Ainsi la sonde 218Bg (nt 2078 à 2715) ne révèle que le
RNA 2sub a et le RNA 2. Enfin la sonde ∆BB (nt 638 à 2081) ne s'hybride qu'au RNA
génomique. La taille de ces différents RNA subgénomiques correspond aux tailles
attendues pour des RNA permettant l'expression de la protéine P42 (RNA 2sub a), de la
protéine P13 (RNA 2sub b) et de la protéine P14 (RNA 2sub c).
Pour la protéine P15, aucun RNA subgénomique n'a pu être mis en évidence. Pour
expliquer cela, 2 hypothèses peuvent être émises : soit la synthèse du RNA
subgénomique est très faible, soit la protéine P15 est exprimée sous forme d'une
protéine de fusion P13-P15. Ceci impliquerait alors un changement de cadre de lecture
de l'ORF IV. Dans ce cas, la synthèse de la protéine P13-P15 se ferait à un taux très
faible, ce qui expliquerait pourquoi elle n'a pas encore pu être détectée in vivo en
utilisant un sérum anti P13.
III-Conclusions et perspectives.
Nous avons montré dans ce chapitre que les protéines exprimées à partir du TGB
étaient toutes les 3 essentielles au mouvement du virus de cellule à cellule. En leur
absence, l'infection d'une plante ne peut avoir lieu. Nous avons également montré que
l'expression de 2 des 3 protéines au moins se faisait à partir de RNA subgénomiques.
Ces résultats vont dans le sens d'observations faites pour d'autres virus comme le
WClMV, un potexvirus (Beck et al, 1991) et pour le BSMV, un hordeivirus (Petty et al,
1990).
Des études ont été entreprises au laboratoire, afin de mieux comprendre le rôle de
ces 3 protéines dans le mouvement de cellule à cellule. Les résultats préliminaires
indiquent que la protéine P42 est dotée d'une activité ATP binding à l'image de la
protéine de 58 K codée par le RNA ß du BSMV (Jackson et al, 1991). Enfin, comme
dans le cas de la protéine de coque d'AMV (Baer et al, 1994), il semblerait que
Chapitre 1______________________________________________________________________
29
l'extrémité N-terminale de la protéine P42 soit indispensable à l'activité de fixation des
acides nucléiques (C. Bleykasten, communication personnelle). Des études d'interaction
entre les 3 protéines du TGB ont également été initiées en utilisant la technique "double
hybride" (Hope & Struhl, 1986 ; Keegan et al, 1986 ; Ma & Pasthne, 1987). En effet, les
protéines P13 et P42 ont été retrouvées au niveau de fractions membranaires (Niesbach-
Klösgen et al, 1990). Or, seule la protéine P13 est dotée de régions hydrophobes
pouvant faciliter l'ancrage au niveau des membranes. Pour expliquer la colocalisation
membranaire de la protéine P42, on peut donc imaginer des interactions entre cette
protéine et la protéine P13.
Résultats______________________________________________________________________
30
Publication n°1
EFFICIENT CELL TO CELL MOVEMENT OF BEET NECROTIC YELLOW
VEIN VIRUS REQUIRES 3' PROXIMAL GENES LOCATED ON RNA 2
D. Gilmer, S. Bouzoubaa, A. Hehn, H. Guilley, K. Richards and G. Jonard.
Virology
(189, 40-47)
(1992)
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40
CHAPITRE 2 :
ETUDE DE LA PROTEINE P14 CODEE PAR
L'ORF 3' PROXIMALE DU RNA 2 DU BNYVV.
I-Mise en évidence du rôle de la protéine P14 dans le cycle de multiplication du
BNYVV.
1-Des mutations introduites dans le gène VI du RNA 2 engendrent une diminution du
taux de réplication des RNA viraux. (publication n°1)
Dans le chapitre précédent, nous avons montré que les trois protéines codées par
le TGB sont nécessaires au mouvement à courte distance du virus. Dans ce deuxième
chapitre, nous allons nous intéresser plus particulièrement au rôle de l'ORF 3' proximale
du RNA 2 (encore appelée ORF VI) dans le cycle de multiplication du BNYVV. Cette
ORF code pour une protéine de 14 kDa qui a été localisée par immunochimie au niveau
de la fraction cytosolique (Niesbach-Klösgen et al, 1990) et qui est exprimée à partir
d'un RNA subgénomique, le RNA 2sub c. Pour essayer de mieux comprendre la
fonction de cette protéine dans le cycle de multiplication viral, nous avons utilisé la
même approche
Résultats______________________________________________________________________
42
CPA
P14RNA 2
P75 TGB
TGG T AA TTG
nt 4043 nt 4148
GGT T GA TGC
nt 4043 nt 4078
mutant 4003
mutant 3992
ATG GAG ATC TGG TAG
nt 4043
mutant 3722
P42P13
15 kDa
Figure II-1 : Caractéristiques des mutants du RNA 2 n'exprimant pas laprotéine P14. Les nucléotides introduits dans le génome viral sont écrits en rouge. Les codons stop qui apparaissent sont soulignés.
Chapitre 2_____________________________________________________________________
43
que précédemment dans l'étude du TGB, à savoir l'introduction de mutations dans l'ORF
VI et l'analyse des conséquences au niveau biologique.
a-Construction de mutants n'exprimant pas la protéine P14.
L'introduction de mutations dans la région 3' proximale du RNA 2 pouvait
toucher des séquences impliquées en cis dans la réplication du RNA 2. C'est pourquoi,
pour minimiser ce risque, nous avons multiplié les constructions et réparti les mutations
tout au long de la séquence de l'ORF VI. Deux approches différentes ont été utilisées : la
première a consisté à insérer un linker Bgl II de 10 nucléotides au niveau du site Sma I
situé en position 4331, entraînant ainsi un changement du cadre de lecture (+1) (voir
publication 1, figure 1) et donnant le mutant RNA 2-L. La seconde approche repose sur
l'introduction de mutations ponctuelles (figure II-1) dans un fragment correspondant aux
824 derniers nucléotides du RNA 2 cloné dans le vecteur Bluescribe. Trois mutants ont
ainsi été obtenus : (1) le mutant RNA 2-3722 (voir publication 1, figure 1) où 2
nucléotides ont été insérés en position 4050 ce qui a pour conséquence d'éliminer le
2ème ATG initiateur et d'introduire un changement du cadre de lecture qui entraîne
l'apparition d'un codon stop. (2) Le mutant RNA 2-3992 où la substitution d'un
nucléotide génère un codon stop en position 4148. (3) Le mutant RNA 2-4003 où
l'introduction d'un T en position 4078 fait apparaître un codon de terminaison TAA.
Toutes ces mutations entraînent soit l'absence de synthèse de protéine P14
(mutant 3722), soit conduisent à la synthèse d'une protéine P14 plus ou moins tronquée
(mutants 3994 et 4003). Le fragment de 824 nt a finalement été réinséré dans le clone
cDNA complet du RNA 2.
b-Effet in planta des mutations introduites dans le gène VI.
Pour analyser les effets des mutations introduites dans le gène VI, les différents
mutants ont été transcrits puis coinoculés avec des transcrits du RNA 1 à des feuilles de
C. quinoa. Huit à dix jours après l'infection, on voit apparaître des lésions ayant un
Résultats______________________________________________________________________
44
phénotype différent de celui des lésions provoquées par l'isolat sauvage : ces lésions
sont
Chapitre 2_____________________________________________________________________
45
Stras 123 Mutant 2-3722
Figure II-2 : Effets des mutations introduites dans le gène VI. (A) Symptômes observés surdes feuilles de C. quinoa inoculées avec l'isolat sauvage et le mutant RNA 2-3722(B) Analyses par hybridation moléculaire des RNA totaux extraits des feuilles deC. quinoa : sur la piste 1 ont été déposés 1/20 des RNA totaux extraits des feuillesinoculées avec l'isolat sauvage Stras 123. Les pistes 2, 3 et 4 correspondentrespectivement à la totalité des RNA extraits de feuilles inoculées par les mutantsRNA 2-3722, RNA 2-3992 et RNA 2-4003.
A
B
RNA 2
RNA2-3722
RNA2-3992
RNA2-4003
RNA 1
RNA 2
1 2 3 4
Résultats______________________________________________________________________
46
petites et nécrotiques en leur centre (figure II-2-A). Afin d'analyser la quantité de RNA
viral présent dans les feuilles inoculées, nous avons prélevé ces lésions ainsi que les
lésions provoquées par les RNA viraux sauvages, en prenant garde de récupérer la
même surface foliaire dans les 2 cas. Les RNA sont extraits en présence de tampon
polysome, comme cela a été décrit dans le chapitre matériel et méthodes. La lecture de
la DO260nm permet d'estimer la quantité de RNA total présent dans l'extrait et 300 ng
sont déposés sur gel d'agarose en conditions dénaturantes. Après transfert sur membrane
de nitrocellulose, les RNA sont analysés par hybridation moléculaire en utilisant des
sondes ribonucléiques spécifiques complémentaires du RNA 1 (pB12 : nt 4740 à 6560)
et du RNA 2 (pB21 : nt 2335 à 3793). Quel que soit le mutant analysé, on peut constater
une forte diminution de la quantité de RNA 2 mutant par rapport au RNA 2 sauvage. La
réplication du RNA 1 est également affectée mais dans des proportions plus faibles
(publication 1, figure 2, pistes 6, 7, 9 et 10, et voir figure II-2, pistes 2, 3 et 4).
Ces résultats suggèrent donc que la protéine P14 n'est pas essentielle à l'infection
virale mais la favorise, soit en améliorant l'efficacité du mouvement de cellule à cellule,
soit en stimulant la multiplication du virus. Pour discriminer entre ces 2 possibilités,
nous avons inoculé ces mêmes mutants à des protoplastes de C. quinoa.
c-Mise en évidence du rôle de la protéine P14 dans la réplication du BNYVV et la
quantité de protéine de capside synthétisée.
Les transcrits des différents mutants n'exprimant pas la protéine P14 ainsi que les
transcrits du RNA 1 (nécessaire à la réplication) ont été coinoculés à des protoplastes de
C. quinoa. Après 48 heures de culture, nous avons extrait et analysé les RNA totaux par
hybridation moléculaire. Les résultats que nous avons obtenus révèlent une chute
importante de la quantité de RNA 2 et une diminution beaucoup plus faible voire parfois
nulle du signal correspondant au RNA 1 (voir publication 1, figure 4, pistes 5 et 6). Ces
résultats qui sont tout à fait comparables à ceux obtenus sur plantes sont regroupés dans
le tableau II-1 : le pourcentage d'inhibition de la réplication du RNA 2 en absence de
synthèse de protéine P14 peut atteindre 85 à 98 % ; par contre ce pourcentage n'est plus
Chapitre 2_____________________________________________________________________
47
Expérience n° Mutant
Accumulation par rapport au témoin sauvage
RNA 1 RNA 2
1
2
4
3
2-40032-39922-37222-4003
2-3992
2-4003
2-4003
120 % 13 %150 % 14 %42 % 2 %58 % 2 %38 % 7 %
64 % 5 %
37 % 2 %
Tableau II-1: Effets des mutations introduites dans le gène VI sur la réplication des RNA 1 et RNA 2 de BNYVV.
Réplication du RNA 2
Synthèse de protéine de
coque
RNA 1 + RNA 2
RNA 1 + RNA 2-4003
RNA 1 + RNA 2-4003 + RNA 2-F
RNA 1 + RNA 2-4003 + rep 14
++++
+++
+
++++
+
+ ++++
+
Tableau II-2 : Bilan des expériences de complémentation démontrant que la protéine P14 a une action en cis sur la réplication du RNA 2 et en trans sur la synthèse de protéine de capside.
Résultats______________________________________________________________________
48
Figure II-3 : Cinétique de réplication des RNA viraux et de synthèse des protéines P14, CP et P42 dans des protoplastes de C. quinoa infectés par l'isolat Stras 12 de BNYVV. Les prélèvements ont été effectués au bout de 9, 16, 24 et 48 heures d'infection et les analyses réalisées par hybridation moléculaire et par immunoempreinte pour détecter les RNA viraux (A) et les protéines P14 (B), CP (C) et P42 (D)
Chapitre 2_____________________________________________________________________
49
que de 63 % dans le pire des cas pour le RNA 1. D'autres expériences ont également
montré que la réplication du RNA 3 est peu ou pas affectée par l'absence de protéine
P14.
L'autre effet significatif des mutations introduites dans l'ORF VI est une
diminution importante de la quantité de protéine de capside synthétisée (tableau II-2 et
publication 2, figure 4-B, pistes 3 et 4) alors que la synthèse de protéine P25 codée par
le RNA 3 n'est pas affectée (publication 2, figure 4-A, pistes 3 et 4). Enfin, pour
expliquer la petite taille des lésions et leur phénotype nécrogène, on peut émettre
l'hypothèse suivante. En absence de protéine P14, les taux de réplication des RNA
viraux et de synthèse de protéine de coque sont considérablement abaissés ce qui peut se
répercuter de manière directe ou indirecte sur la synthèse des protéines de mouvement
du virus, ralentissant ainsi sensiblement le processus infectieux. Cet effet pourrait alors
permettre à la plante de mettre en place un système de défense qui s'apparenterait, dans
ce cas là, à une réaction d'hypersensibilité sévère caractérisée par l'apparition de lésions
nécrotiques.
2-La protéine P14 joue un rôle en cis dans la réplication du RNA 2 et active en trans
la synthèse de la protéine de coque. (publication n°2)
Avant de décrire les expériences de complémentation qui nous ont permis de
mieux comprendre le mécanisme d'action de la protéine P14 dans la réplication et dans
la traduction du RNA 2, il était intéressant d'étudier la cinétique d'apparition de cette
protéine ainsi que son rôle dans la synthèse de RNA de polarité négative.
a-Cinétique d'apparition de la protéine P14 lors de l'infection de protoplastes de
C. quinoa.
Les cinétiques réalisées avec l'isolat Stras 12 montrent que la protéine P14 peut
être détectée en western blot à partir de 16 heures (figure II-3-B, piste 3). Des études
effectuées en parallèle sur la synthèse de protéine capsidaire et de la protéine P42
révèlent que toutes ces protéines apparaissent en même temps (figure II-3-C et D, piste
Résultats______________________________________________________________________
50
3). Cependant au bout de 48 heures de culture, la synthèse de protéine P42 atteint un
maximum alors que les protéines P14 et CP continuent à s'accumuler ; nous avons pu
montrer dans d'autres expériences que l'accumulation de protéine de coque et de
protéine P14 continuait jusqu'au temps 72 heures. Au delà de ce temps, le taux de
mortalité des protoplastes devient trop important pour que les résultats obtenus puissent
être pris en considération. Ces observations suggèrent que la synthèse de protéine P42
est donc régulée différemment des 2 autres protéines étudiées. Des observations
analogues ont été faites par Davies et collaborateurs (1993) en ce qui concerne la
protéine P25 synthétisée à partir de la première ORF du TGB du potato virus X (ou
PVX).
b-L'absence de protéine P14 a un effet inhibiteur sur la synthèse de RNA (-).
Après avoir mis en évidence un effet négatif sur la synthèse des brins (+), nous
avons cherché à savoir si l'absence de protéine P14 affectait également la synthèse des
brins (-). Pour cela, les RNA totaux ont été extraits de protoplastes infectés après 36
heures de culture dans les conditions décrites dans le chapitre matériel et méthodes. La
seule modification introduite dans le protocole expérimental consiste à précipiter
l'ensemble des acides nucléiques en présence d'éthanol et d'acétate d'ammonium 2 M.
Nous avons ainsi pu montrer qu'en l'absence de protéine P14, l'effet observé pour les
RNA brin (+) se retrouve au niveau de la synthèse des RNA brins (-) (publication 2,
figure 5-A et B) en provoquant une réduction importante de l'intensité des signaux plus
particulièrement au niveau des brins (-) correspondant au RNA 2.
c-La protéine P14 agit en cis sur la réplication du RNA 2.
Dans les expériences décrites ci-dessous, nous avons entrepris de complémenter
l'effet des mutations introduites dans l'ORF VI par l'apport de protéine P14 sauvage. Ces
expériences de complémentation ont été réalisées de 2 façons différentes :
Chapitre 2_____________________________________________________________________
51
- Dans une première série d'expériences, nous avons utilisé le mutant RNA 2-F
(figure II-4) caractérisé par une délétion de 935 nt au niveau de l'ORF II. Ce mutant est
capable de se répliquer dans les protoplastes (voir publication 1, figure 4, piste 1 ;
AnRNA 2-F
1143 2077
tRep 14 An
1688382
Protéine P14
RNA 2 sub c An
Figure II-4 : Caractéristiques des transcrits RNA 2 F et tRep 14 exprimant la protéine P14 dans les expériences de complémentation. : Séquences 5' et 3' non codantes du RNA 3. : ORF VI dirigeant la synthèse de la protéine P14. : Protéine P14. .
Résultats______________________________________________________________________
52
Chapitre 2_____________________________________________________________________
53
Figure II-5 : Représentation schématique de la construction du clone Rep 14. Après amplification par PCR, l'ORF VI du RNA 2 de BNYVV est introduit dans le clone cDNA du RNA 3 délété de toute l'information codante (pB6 (²ES).
PCR ORF VI (+ sites Bam HI)
1470380 linker BamHI
promoteur T7
Bam HIBam HI
P14
pB6 (²ES)
+
P14Rep 14
tRep 14 P14 An
Résultats______________________________________________________________________
54
publication 2, figure 1, piste 2) et permet la synthèse d'une protéine P14 native. Les
expériences de complémentation ont consisté à coinoculer le mutant RNA 2-F avec le
RNA 1 et le RNA 2-4003 n'exprimant pas la protéine P14. Ces expériences qui ont été
répétées un grand nombre de fois n'ont jamais permis de déceler une stimulation de la
réplication du RNA 2-4003 (publication 2, figure 1, piste 4) suggérant ainsi que la
protéine P14 ne peut être efficace lorsqu'elle est apportée en trans. Cependant on peut
imaginer une autre explication : la synthèse de protéine P14 à partir du RNA 2-F se
ferait à un taux trop faible pour être efficace dans une action en trans.
- C'est pourquoi, dans une deuxième série d'expériences, nous avons utilisé un
transcrit exprimant la protéine P14 en grande quantité, le transcrit rep 14 (figure II-4)
correspondant obtenu de la manière suivante (voir figure II-5) : le gène VI a d'abord été
amplifié par PCR en utilisant des amorces contenant les sites de restriction Bam HI.
Après digestion Bam HI, le produit PCR a été introduit dans le clone pB6 (∆ES) entre
les séquences 5' (1 à 380) et 3' (1470 à 1773) non traduites du RNA 3 du BNYVV. Dans
ce clone construit par Isabelle Jupin (Jupin et al, 1990), la séquence virale est placée
sous le contrôle du promoteur T7 . Le produit de transcription rep 14 est capable de se
répliquer dans les protoplastes lorsqu'il est inoculé en présence de transcrits du RNA 1.
De plus ce transcrit est capable d'exprimer efficacement la protéine P14 (publication 2,
figure 3-B, piste 4 et 5). Le transcrit rep 14 a donc été coinoculé avec les RNA 1 et 2-
4003 et, là encore, les résultats de ces expériences de complémentation ne révèlent
aucune stimulation de la réplication du RNA 2-4003 (publication 2, figure 1, piste 6).
On peut donc en conclure que la protéine P14 joue très certainement un rôle en cis sur la
réplication du RNA 2 (voir tableau II-2).
d-La protéine P14 stimule en trans la synthèse de la protéine de capside.
Parallèlement à ces analyses par hybridation moléculaire, nous avons recherché
par immunoempreinte la présence de protéine de coque. Nous avons ainsi pu mettre en
évidence une seconde fonction liée à la protéine P14 : indépendamment de l'effet en cis
sur la réplication, la protéine P14 peut stimuler fortement en trans, la synthèse de la
Chapitre 2_____________________________________________________________________
55
protéine de coque. En effet, le signal correspondant à la protéine de coque est beaucoup
plus intense en présence de protéine P14 apportée en trans par le transcrit rep 14
(publication 2, figure 3-A, piste 5) qu'en son absence (publication 2, figure 3-A, piste 3)
bien que le taux de réplication du RNA 2-4003 ne soit pas stimulé (publication 2,
figure 2, piste 3 et 6 et tableau II-2).
Pour expliquer ce résultat, nous avons émis l'hypothèse que la protéine P14 a une
affinité pour une séquence spécifique du RNA 2 et favorise ainsi la traduction de la
protéine capsidaire. C'est pourquoi nous avons entrepris des expériences d'expression
transitoire en bombardant des feuilles de C. quinoa et de Nicotiana tabacum avec 2
types de vecteurs : l'un permet la synthèse de protéine P14 et l'autre renferme la
séquence cible potentielle reconnue par la protéine P14, en l'occurrence la région 5'
terminale de l'un ou l'autre RNA du BNYVV. Cette séquence cible est placée en amont
d'un gène rapporteur permettant de visualiser la stimulation si celle-ci a lieu. Les
caractéristiques de ces vecteurs sont les suivantes :
- Les vecteurs permettant l'expression de la protéine P14 native ou tronquée ont
été obtenus par insertion de la séquence nucléotidique correspondante dans le plasmide
pMJD 82 (Dowson Day et al, 1994). Pour cela, nous avons amplifié, par PCR, le cistron
de la protéine P14 sauvage ou mutée en utilisant une amorce 5' renfermant le site Nco I
et un oligonucléotide correspondant à l'extrémité 3' du RNA 2. Ce produit PCR a
ensuite été digéré par les enzymes Nco I et Stu I (site naturel localisé en position 4479
du RNA 2) puis inséré dans le vecteur pMJD 82 linéarisé par Nco I et Sma I. Nous
avons ainsi obtenu les vecteurs pMJD-P14 exprimant la protéine P14 sauvage et pMJD-
P14∆1 exprimant une protéine P14 délétée de 30 acides aminés. Ce mutant de délétion
a été obtenu par une digestion à l'exonucléase III générant une délétion de 98 nt (nt
4286-4284) suivie d'une insertion d'un linker de 8 nucléotides permettant de récupérer la
phase de lecture. Lorsque ce mutant du gène VI est introduit dans le RNA 2 et que le
transcrit correspondant est inoculé à des protoplastes, on obtient des résultats analogues
aux résultats obtenus avec les mutants ponctuels RNA 2-3722, -3992 et -4003. Le clone
Résultats______________________________________________________________________
56
pMJD-P14∆1 nous a servi de témoin négatif dans les expériences d'expression
transitoire décrites ci-dessous.
- Les vecteurs renfermant les séquences cibles ont été obtenus par insertion de
produits PCR correspondant aux extrémités 5' non codantes des RNA 2, 3 et 4 du
BNYVV (respectivement les 142, 442 et 377 premiers nucléotides) dans le vecteur
pRT2-syn-LUC : les amplifications PCR ont été effectuées en utilisant des
oligonucléotides renfermant un site Xho I pour l'amorce 5' et un site Nco I pour l'amorce
3'. Après digestion par ces 2 enzymes, les fragments ont été introduits dans le vecteur
rapporteur pRT2-syn-LUC coupé par Xho I et Nco I. Les plasmides recombinants ainsi
obtenus ont été appelés pRT-BN2-LUC, pRT-BN3-LUC et pRT-BN4-LUC. Les
différents plasmides recombinants ont ensuite été cobombardés (un vecteur de type
pMJD avec un vecteur de type pRT) sur des feuilles de C. quinoa et de N. Tabacum
(voir matériel et méthodes). Vingt quatre heures après l'inoculation, la stimulation de
l'activité luciférase a été analysée. Les résultats (publication 2, tableau 2) démontrent
que la protéine P14 est en mesure de stimuler l'activité luciférase dans les 2 types de
feuilles bombardées ; ce facteur de stimulation peut varier de 2,4 à 4,5 . Cependant,
cette stimulation n'est pas spécifique d'une séquence présente dans la région 5' leader du
RNA 2 car elle a lieu quelle que soit la séquence cible utilisée ; même le vecteur
rapporteur renfermant uniquement la cassette de clonage montre une stimulation de
l'activité luciférase en présence de la protéine P14. Cependant, le facteur de stimulation
est plus faible que celui observé lors de la synthèse de protéine CP dans les expériences
de complémentation dans les protoplastes où la protéine P14 est apportée en trans. Il est
clair que ces expériences devront donc être reprises avec des séquences du RNA 2 du
BNYVV allongées au delà de la séquence 5' leader si l'on veut observer une stimulation
beaucoup plus significative.
3-Mode d'action de la protéine P14.
Pour expliquer les résultats décrits ci dessus, nous avons proposé le modèle
suivant (voir figure II-6) : dans les premiers instants de l'infection, les RNA décapsidés
Chapitre 2_____________________________________________________________________
57
Figure II-6 : Modèle permettant d'expliquer le rôle de la protéine P14 dans le cycle de multiplication du BNYVV.
Brin moins
Brin plus
Brin plus
Rôle au niveau de la réplication
(en cis)Rôle au niveau de la traduction
(en trans)P14
RNA 2 sub c
5' 3'
5'3'
5' 3'
5' 3'
P75
CP
P75
CP
Résultats______________________________________________________________________
58
Synthèse de RNA brin + et de RNA subgénomiques
Complexe de réplication
3'
3'
5'
5'
-
-+
La protéine P14 naissante se fixe au complexe de réplication et reconnait une séquence sur le brin + néosynthétisé. Puis elle stimule la synthèse de RNA brin -.
3'-
+
-+
Figure II-7 : Modèle proposé pour expliquer le rôle en cis de la protéine P14 dans la réplication du RNA 2.
Chapitre 2_____________________________________________________________________
59
de polarité positive provenant de l'inoculum, sont traduits permettant, entre autre, la
synthèse de RNA polymérase RNA dépendante. Cette enzyme va permettre la formation
d'un complexe de réplication induisant, à un taux que nous allons qualifier de basal, la
synthèse de RNA de polarité négative. Ces RNA (-) servent ensuite de matrice pour la
formation des RNA complémentaires génomiques et subgénomiques. Puis la protéine
P14 néosynthétisée à partir du RNA 2sub c pourra stimuler en cis la synthèse de
nouveau brin moins à partir desquels se fera une synthèse massive de RNA génomiques.
Cet effet en cis est assez peu courant et mérite que l'on s'y attarde un peu plus : comme
on peut le voir sur la figure II-7, le RNA de polarité négative sert de matrice à la
synthèse de RNA génomique, mais également à la synthèse de RNA subgénomique.
Celui ci pourra être pris en charge, durant sa synthèse par les ribosomes pour initier la
production de protéine P14. Dans ces conditions, on aura un couplage
réplication/traduction. La protéine P14 ainsi synthétisée pourra ensuite reconnaître une
séquence spécifique dans la région 3' terminale du RNA brin plus génomique et stimuler
ainsi la synthèse de nouveaux brins de RNA de polarité négative. On peut imaginer que,
durant sa synthèse, un site cryptique de la protéine P14 reconnaît une séquence
spécifique du RNA 2. Le masquage de ce site sur la protéine mature pourrait expliquer
pourquoi la protéine P14 apportée en trans reste sans effet sur la réplication du RNA 2.
Après avoir stimulé en cis la synthèse de RNA brin moins, la protéine P14 qui
commence à s'accumuler dans la cellule pourra alors induire en trans la synthèse de la
protéine de coque.
Pour mieux comprendre l'intérêt d'un tel système, il faut se rappeler que la
plupart des virus de plante expriment leur protéine de coque à partir d'un RNA
subgénomique (TMV, AMV, etc...) ou alors par l'intermédiaire d'une polyprotéine
maturée (CPMV, GFLV, etc ...). Ces 2 systèmes permettent une régulation relativement
facile de la production de la CP. Par contre dans le cas du BNYVV, du BSMV, un
hordeivirus ou du TRV, un tobravirus, le cistron codant pour la protéine de coque est
localisé en 5' d'un RNA génomique et sera donc traduit en premier. Si tel est le cas, la
présence de protéine CP dès le début du cycle de réplication devrait favoriser la
Résultats______________________________________________________________________
60
réencapsidation des
Chapitre 2_____________________________________________________________________
61
Figure II-8 : Caractéristiques de la protéine P14 codée par l'ORF VI du RNA 2. A : Profil d'hydrophilicité selon Kyte & Doolittle (1982) et probabilité de surface des acides aminés : ces profils ont été obtenus en utilisant le logiciel de prédiction de structure "plotstructure" de UWGCG. B : Séquence nucléotidique de l'ORF VI du RNA 2 et structure primaire de la protéine P14 correspondante.
ATGGGGATGGTAGATAGTTTGTGCGTGTTTGTTGGTCGAGTCATAACTGAGGGATCTGAAM G M V D S L C V F V G R V I T E G S EAGTGTTGAGGGTGTGGAAAGGTTTTCCATTAAGTTTAGTGAGTGGAAATTGTTCACCATCS V E G V E R F S I K F S E W K L F T IGCGGTGTTTGTTGAATATCGTGAGTTAGGTGAGAAAGAGTGCAGTTTGAAGGATGCTGGTA V F V E Y R E L G E K E C S L K D A GAGATTACACTTTAATGTGTCATGTGTGAAATGCTGTCAAAAACTTAAATGCAAGAAACAAR L H F N V S C V K C C Q K L K C K K QAATAAAAATCATAGTAAACACGTCCAAAATGGATATTTACGCAAGGTACGTAATTTTTCCN K N H S K H V Q N G Y L R K V R N F SATTTTAGGTGTTTGCGGTGATTGTTGTGAGTCTTTTACACTCGCGGACGAAAAACCTCATI L G V C G D C C E S F T L A D E K P HGTTATTGTCGATCCTGAGGTGTAAV I V D P E V *
A
B
Hydrophilicité (KD)
Probabilité de surface
50 10060 70 80 90 110 12040302010
Résultats______________________________________________________________________
62
A
C69
C72 C106
C109
E118 K119
K79K80
Zn
B
Figure II-9 : (A) Comparaison de séquence entre l'ORF 6 du RNA 2 du BNYVV et un certain nombre de papillomavirus (Koonin et al, 1991). HPV 1a, human papilloma virus type 1a ; BPV2, bovine papillomavirus type 2 ; DPV, deer papilloma virus ; CRPV, cottontail rabbit papilloma virus. + correspond à des acides aminés hydrophobes et * désigne des acides aminés du BNYVV faisant partie de la séquence consensus. (B) Structure en doigt de zinc hypothétique de la protéine P14 du BNYVV. Les acides aminés représentés correspondent aux mutants alanines décrits dans le chapitre II, paragraphe III.
Chapitre 2_____________________________________________________________________
63
RNA génomiques provenant de l'inoculum et empêcher ainsi la multiplication du virus.
Or, à la lumière des résultats obtenus, le rôle bifonctionnel de la protéine P14
permettrait une régulation temporelle du processus d'infection virale : au début de
l'infection virale, la protéine P14 serait intégralement utilisée pour stimuler la
réplication des RNA viraux ; dans un deuxième temps son accumulation stimulerait la
synthèse de protéine capsidaire et donc l'encapsidation des RNA viraux néosynthétisés.
II-Mise en évidence de l'importance des résidus cystéines 69, 72, 106 et 109 dans
l'activité de la protéine P14.
La protéine P14 est un polypeptide de 126 acides aminés très riche en cystéines
(8 %) et en lysines (10 %) et dont la séquence est présentée figure II-8-B.
Bien que codée par une ORF localisée à l'extrémité 3' du RNA 2, la protéine P14
présente très peu d'homologies avec d'autres protéines riches en cystéines également
exprimées à partir d'ORF localisées en 3' de RNA génomiques d'autres phytovirus
comme le BSMV ou encore le TRV. Par contre, des comparaisons de séquences
(Koonin et al, 1991) (figure II-9) montrent une homologie non négligeable entre cette
protéine P14 et la protéine E6 des papillomavirus, une protéine impliquée dans la
transactivation de la transcription du génome viral grâce à la présence d'une structure en
doigt de zinc (Lamberti et al, 1990).
Avant d'initier une étude fine des acides aminés essentiels à l'activité biologique
de la protéine P14, nous avons effectué des prédictions de structure à l'aide d'un
programme informatique "plotstructure" de UWGCG et les résultats sont décrits figure
II-8-A. L'examen du profil de probabilité des acides aminés d'être en surface de la
protéine P14 (figure II-8-A) révèle l'existence de 2 domaines : ces 2 domaines sont
situés au voisinage des acides aminés 80 et 120, le premier domaine très hydrophile est
encadré de résidus cystéines conservés chez les papillomavirus. Ces observations ainsi
que les résultats déjà obtenus par U. Niesbach-Klösgen (1990) et montrant que la
protéine P14
Résultats______________________________________________________________________
64
A B C
Figure II-10 : Symptômes induits par le mutant RNA 2 (E118-K119) (A), lemutant RNA 2 (K79-80) (B) et les mutants RNA 2 (C106-109) ou RNA2 (C69-72) (C) inoculés à des feuilles de C. quinoa.
Chapitre 2_____________________________________________________________________
65
était capable de fixer le zinc, permettent de proposer, pour cette région très hydrophile
comprise entre les acides aminés 69 et 109, l'existence d'une structure en doigt de zinc
qui est représentée figure II-9-B.
1-Construction de mutants alanine (Giesman-Cookmeyer & Lommel, 1993).
Pour vérifier l'importance de certains résidus aminés, nous avons entrepris de
construire des mutants ponctuels dans lesquels ces acides aminés sont remplacés par des
alanines. Ces mutations concernent plus précisément des acides aminés supposés en
surface tels que les lysines 79, 80 et 119 et l'acide glutamique 118 (figure II-8) ou alors
des cystéines (69, 72, 106 et 109) potentiellement impliquées dans une structure en
doigt de zinc. Nous avons ainsi obtenus les mutants pB2(C69-72), pB2(C106-109),
pB2(K79-80) et pB2(E118-K119).
2-Propriétés biologiques des mutants alanine.
Afin de tester l'effet de ces modifications sur la réplication du virus in planta,
nous avons transcrit les différents clones obtenus et nous les avons coinoculés à des
plantes en présence de transcrits correspondant aux RNA 1 et RNA 3. Après une dizaine
de jours d'infection, nous avons observé 3 types de lésions (figure II-10).
(1) Des lésions de type sauvage, chlorotiques et de grande taille pouvant diffuser
le long des nervures avec le mutant pB2(E118-K119). Ces lésions sont tout à fait
semblables à celles observées avec un isolat sauvage.
(2) Des lésions chlorotiques de taille beaucoup plus petite avec le mutant
pB2(K79-80).
(3) Des lésions nécrotiques avec les mutants pB2(C69-72) et pB2(C106-109) ;
ces lésions sont analogues aux lésions obtenues avec les mutants n'exprimant pas la
protéine P14 (figure II-2).
L'analyse des RNA extraits des lésions révèle une diminution de tous les RNA
viraux dans les lésions de type nécrotique (figure II-11-A, piste 4 et 5) et une diminution
Résultats______________________________________________________________________
66
Figure II-11 : Analyse par hybridation moléculaire des RNA extraits deslésions locales provoquées par les mutants alanine (A). les quantités deprotéine de capside (B) et de protéine P14 (C) présentes dans ces mêmeslésions ont été mises en évidence par immunoempreinte.
RNA 1
RNA 3
RNA 2
RNA 2
RNA 2 (E118-K119)RNA 2 (K79-80)RNA 2 (C106-109)RNA 2 (C69-72)
CP
P14
A
B
C
1 2 3 4 5
Chapitre 2_____________________________________________________________________
67
E. coli BL21(DE3)plysS
pET 3d
Nco I
RNA 2 AAAA
P14Terminateur T7Promoteur T7
T7 RNA Polymérase
pro Lac UV 5
IPTG
Figure II-12 : Schéma du système pET adapté à la protéine P14. En présence d'IPTG, la synthèse de T7 RNA polymérase va permettre l'expression de la protéine P14 à partir du plasmide recombinant pET-P14.
Résultats______________________________________________________________________
68
moins spectaculaire de tous les RNA pour les lésions obtenus avec le mutant pB2 (K79-
80) (figure II-11-A, piste 3). Pour les RNA correspondant au mutant pB2 (E118-K119)
(figure II-11-A, piste 2), il n'y a pas de différence par rapport aux RNA isolés à partir de
plantes inoculées avec l'isolat sauvage (figure II-11-A, piste 1). Les mutations E118-
K119 introduites en aval de la structure en doigt de zinc potentielle n'ont donc pas
d'effet. Parallèlement, l'analyse par western blot montre une diminution très nette de la
quantité de protéine de coque pour les mutants pB2(C69-72) et pB2(C106-109) (figure
II-11-B, pistes 4 et 5) et une diminution moins importante pour le mutant pB2(K79-80)
(figure II-11-B, piste 3). Il en va de même pour la protéine P14 qui passe sous le seuil de
détection dans le cas des mutants où les cystéines ont été remplacées par des alanines
(figure II-11-C, pistes 4 et 5). Pour tous les mutants étudiés, et plus particulièrement
pour le mutant qui se comporte comme le RNA 2 sauvage, nous avons séquencé la
descendance et montré qu'il n'y avait pas réversion au niveau des mutations "alanines"
introduites.
Ces résultats préliminaires indiquent donc que les cystéines 69, 72, 106 et 109
jouent un rôle important par l'intermédiaire d'une structure qui pourrait être une structure
en doigt de zinc telle qu'elle est représentée sur la figure II-9. Les mêmes expériences
vont maintenant être réalisées dans les protoplastes.
III-Mise en évidence d'interactions protéine P14-acides nucléiques.
1-Clonage du gène VI dans le vecteur pET.
Pour mettre en évidence une possible activité fixatrice d'acides nucléiques par la
protéine P14, nous avons entrepris de l'exprimer et de la purifier à partir d'un système
d'expression procaryotique. Nous avons opté pour le système pET décrit par Studier et
collaborateurs (1990) (figure II-12). Ce système implique l'utilisation d'un vecteur
d'expression bactérien, le pET (plasmid for expression by T7 RNA polymerase) et d'une
souche bactérienne particulière, la bactérie BL21 (DE3) pLys S. Le plasmide pET
dispose d'un promoteur reconnu par la RNA polymérase du bactériophage T7. Le gène
VI a été
Chapitre 2_____________________________________________________________________
69
A
B
C
Figure II-13 : Purification de la protéine P14 par chromatographie d'affinitésur colonne ZCAA.
Les différentes fractions éluées à pH 8, 7, 6 et 5 ont été analysées parélectrophorèse en gel de polyacrylamide 15% et les protéines ont étévisualisées soit par coloration au bleu de coomassie (A), soit parimmunoempreinte en utilisant un sérum anti P14 (B). C- Analysecomparative par immunoempreinte de la protéine P14 obtenue soit parexpression dans un système procaryotique (piste 1), soit à partir de feuillesinfectées par le BNYVV (piste 2). Piste 3 : marqueurs de PM.
marqueur
pH6
pH7
pH8
pH5
2 3 4 5 7 8
extraittotaldebactéries 6
marqueur9 2 3
P14
106,580,049,5
32,527,5
18,5
marqueur
pH6pH
7pH8
pH5
2 3 4 5 7 86
marqueur
9 2 3
P14
9467
43
30
20,1
14,4
P14
106,580,049,5
32,527,5
18,5
1 2 3
Résultats______________________________________________________________________
70
amplifié par la technique PCR en utilisant des oligonucléotides contenant un site Nco I
pour l'amorce 5' et un site Bam HI pour l'amorce 3'. Après digestion par ces 2 enzymes,
le fragment a été introduit dans le vecteur pET, linéarisé en aval du promoteur T7 par les
enzymes Nco I et Bam HI. Puis le plasmide recombinant pET-P14 a été introduit par
électroporation dans des bactéries BL 21 (DE3) pLys S qui renferment dans leur génome
le gène permettant la synthèse de T7 RNA polymérase sous le contrôle du promoteur lac
UV 5 inductible par l'IPTG (voir figure II-12). Les bactéries BL21 (DE3) pLys S
transformées par pET-P14 sont ensuite mises en culture dans 200 ml de milieu LB
additionné d'ampicilline (50 µg/ml) et de chloramphénicol (34 µg/ml). Quand la culture
atteint une DO550nm comprise entre 0,6 et 1, l'expression de protéine P14 est induite par
l'addition d'IPTG (0,2 g/l). Après 2 heures d'induction, les protéines sont extraites et
reprises dans du tampon SB (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl) à pH 8.
2-Purification partielle de la protéine P14 par chromatographie d'affinité sur une
colonne "Zinc Chelate Affinity Adsorbent" (ZCAA).
Après lyse des bactéries induites, les protéines totales sont reprises dans 2 ml de
tampon SB pH 8 et déposées sur une colonne ZCAA dont le principe est décrit dans le
chapitre matériel et méthodes. L'élution est réalisée à température ambiante avec 13,5
ml de tampon SB pH 8, puis 13,5 ml de tampon SB pH 7, puis 13,5 ml de tampon SB
pH 6 et enfin 13,5 ml de tampon SB pH 5. Les fractions récoltées, et plus
particulièrement les fractions obtenues par élution à pH 6, ont été analysées sur gel de
polyacrylamide soit par coloration au bleu de coomassie (figure II-13-A) soit par
immunoempreinte grâce à un sérum anti-P14 (figure II-13-B). Comme on peut le
constater sur les figures II-13-A et II-13-B, la protéine P14 est éluée à pH 6 mais elle
n'est pas purifiée à homogénéité ; elle reste soluble et se conserve aisément à -20 °C.
Enfin, nous avons montré que cette protéine exprimée dans un système procaryote
comigre avec la protéine P14 présente dans les plantes infectées (figure II-13-C). Il faut
cependant noter que son poids moléculaire apparent est de l'ordre de 18 kDa, c'est à dire
supérieur à son poids moléculaire
Chapitre 2_____________________________________________________________________
71
Figure II-14 : Mise en évidence de la capacité de la protéine P14 à se lierde manière non spécifique aux acides nucléiques.Les extraits bactériens ont été préparés à partir de bactériestransformées avec le plasmide pET 3d (Témoin) et le plasmiderecombinant pET-P14 (P14).Immunoempreinte effectuée avec un sérum dirigé contre la protéineP14 (1). Incubation en présence de sonde ribonucléique pB21 (2),d'un oligonucléotide radiomarqué par phosphorylation au γ32P (3) etd'un DNA plasmidique phosphorylé au γ32P (4).
Marque
ur
Témoin
P14
P14
Témoin
P14
Témoin
P14
Témoi
n
P14
1 2 3 4
106,580,049,5
32,527,5
18,5
Résultats______________________________________________________________________
72
théorique. Cette technique de purification originale, basée sur la présence potentielle
d'une structure en doigt de zinc, nous a donc permis d'obtenir une protéine soluble
suffisamment pure pour étudier les interactions protéines-acides nucléiques en utilisant
la technique décrite par Gramstat et al (1990).
3-Mise en évidence d'interactions protéine P14-acides nucléiques par la technique de
"Northwestern" (Gramstat et al, 1990).
Ces expériences ont été réalisées de la façon suivante : des échantillons de
protéine P14 sont déposés sur gel de polyacrylamide, soumis à une électrophorèse,
transférés sur membrane de nitrocellulose et renaturés en présence d'urée. Finalement,
les membranes sont incubées en présence de différents types d'acides nucléiques
radiomarqués : du DNA simple brin correspondant à un oligonucléotide de 39 nt
phosphorylé au 32P (figure II-14, 3), du DNA plasmidique double brin linéarisé puis
phosphorylé au 32P (figure II-14, 2) et une sonde ribonucléique pB21 (figure II-14, 1).
Dans les trois cas, la protéine P14 fixe, de façon non spécifique, les acides nucléiques
radiomarqués. Cette fixation n'est pas liée à la présence de protéines d'origine
bactérienne car, dans les mêmes conditions de purification, un témoin préparé à partir de
bactéries BL 21 (DE3) pLys S transformées par le vecteur pET 3d sans l'insert
correspondant au gène de la protéine P14 ne montre aucune fixation. Ces résultats
préliminaires demandent à être confirmés dans d'autres conditions et notamment en
milieu liquide, ce qui va nécessiter l'utilisation de protéine P14 purifiée à homogénéité.
Pour cela, on peut envisager d'améliorer la purification de la protéine P14 en utilisant
d'autres techniques de chromatographies, et notamment des colonnes d'exclusion
moléculaire.
IV-Conclusion .
Chapitre 2_____________________________________________________________________
73
La protéine P14 exprimée à partir de l'ORF 3' terminale du RNA 2 de BNYVV
est une protéine riche en cystéines et en lysines qui est capable de se lier de façon
aspécifique à du DNA simple brin, double brin ou du RNA simple brin. Elle partage un
certain nombre d'homologies de séquences avec les protéines E6 de papillomavirus
(Koonin et al, 1991 ; Lamberti et al, 1990) et, d'après nos expériences préliminaires,
présente une structure potentielle en doigt de zinc qui semble être essentielle au bon
fonctionnement de la protéine P14. Nous avons montré que cette protéine a un rôle
double car elle intervient à la fois dans la réplication du RNA 2 et dans sa traduction.
En ce qui concerne son activité en cis dans la réplication, il faut rappeler qu'une
telle activité en cis a été mise en évidence pour la protéine de 58 kDa située à l'extrémité
N-terminale de la polyprotéine codée par le M-RNA du CPMV. Dans ce cas,
l'introduction de mutations au sein de la protéine, empêche la réplication du M-RNA,
sans pour autant inhiber celle du B-RNA qui porte toute l'information nécessaire à la
réplication. Là aussi, les expériences de complémentation se sont révélées négatives
(Van Bokhoven et al, 1993 ; Wellink et al, 1994). Cette stimulation en cis de la
réplication est un phénomène assez rare pour les virus de plantes. En effet pour d'autres
virus, la réplication est assurée avec l'aide d'un facteur cellulaire qui agit en trans avec le
complexe de réplication viral. Ainsi, pour le BMV, il a été montré qu'un sérum dirigé
contre la protéine 1a permettait de coprécipiter un complexe composé des protéines 1a,
2a et de 5 protéines cellulaires ayant un poids moléculaire de 43 à 67 kDa (Quadt &
Jaspars, 1990). Toujours pour le BMV, un modèle a été établi par Pogue et Hall (1992)
qui stipule qu'un facteur cellulaire reconnaît une structure secondaire en 5' du brin (+) de
la forme réplicative RNA double brin. Il permet, en s'y fixant, de libérer l'extrémité 3' du
RNA brin moins, et ainsi de faciliter l'accès au complexe de réplication. La synthèse de
RNA (+) est donc facilitée. Enfin, signalons que l'intervention de facteurs cellulaires
n'est pas propre aux virus de plantes. En effet, dans le cas du poliovirus, une protéine
cellulaire de 36 kDa est essentielle à la formation du complexe de réplication (Andino et
al, 1993 ; Harris et al, 1994). Ce facteur cellulaire p36 et la protéine 3CD interagissent
avec la structure en forme de trèfle composée des 90 nucléotides 5' terminaux du
Résultats______________________________________________________________________
74
poliovirus et le complexe ainsi formé permet l'initiation de la synthèse de nouveaux
RNA génomiques de polarité positive.
La seconde fonction de la protéine P14 se situe au niveau de la stimulation de la
traduction de la protéine de coque. Un tel phénomène a également été mis en évidence
chez le BSMV où une protéine riche en cystéine est codée par un gène localisé en 3' du
RNA γb . Dans ce cas là, des mutations abolissant l'expression de la protéine γb
entraînent une diminution considérable de la quantité de protéine de coque (Petty et al,
1990) mais une action en cis comme pour le BNYVV, n'a pas été démontré. Des études
plus récentes ont montré que cette protéine renfermait deux domaines riches en
cystéines dont l'un est impliqué dans la synthèse de la protéine de coque et de la
première protéine du TGB (Donald & Jackson, 1994).
Les résultats que nous venons de décrire soulèvent un certain nombre de
questions. Ces questions concernent tout d'abord les cystéines qui jouent un rôle
important dans la réplication. Interviennent-elles également dans la régulation de la
synthèse de la protéine de capside ? Jouent-elles un rôle dans la propriété de la protéine
P14 à fixer les acides nucléiques ? Autrement dit, la protéine P14 possède-t-elle un ou
plusieurs domaines fonctionnels ?
Autre question importante : existe-t-il des interactions spécifiques entre la
réplicase virale codée par le RNA 1 et la protéine P14 ? Si de telles interactions peuvent
être mises en évidence, il sera bien sûr intéressant de définir quels sont les domaines
peptidiques qui interagissent entre eux pour initier la réplication du RNA 2.
Chapitre 2_____________________________________________________________________
75
Publication n°2
THE SMALL CYSTEIN-RICH PROTEIN P14 OF BEET NECROTIC YELLOW
VEIN VIRUS REGULATES ACCUMULATION OF RNA 2 IN CIS AND COAT
PROTEIN IN TRANS.
A. Hehn, S. Bouzoubaa, N. Bate, D. Twell, J. Marbach, K. Richards, H. Guilley and G.
Jonard.
Virology
(210, 73-81)
(1995)
Publication n°2______________________________________________________________________
77
Abstract
The effect of null mutations of the small cysteine-rich protein P14 encoded by RNA 2 of
beet necrotic yellow vein virus has been investigated using in vitro transcripts of viral
RNA to infect Chenopodium quinoa protoplasts. The P14 mutations down-regulated
RNA 2 accumulation by approximately 10-50 fold. Accumulation of minus-strand
RNA 2 was also diminished but RNA 1 accumulation was much less affected. The
inhibition of RNA 2 accumulation could not be complemented in trans by providing
P14 from another source (either a second molecule of RNA 2 or an RNA 3 based
replicon) containing and expressing the P14 gene. The P14 null mutations dramatically
inhibited accumulation of viral coat protein, which is encoded by the 5'-proximal gene
on RNA 2, but this effect could be complemented in trans, indicating that it occurs by a
mechanism distinct from that affecting RNA 2 accumulation. Transient expression
experiments were also carried out in which a plasmid expressing P14 and plasmids
expressing a reporter gene placed downstream of potential translational control
sequences (the 5'-noncoding sequences of RNAs 2, 3 or 4) were introduced into C.
quinoa or Nicotiana tabacum leaves by microprojectile bombardment. Co-expression of
P14 produced a 3-4 fold stimulation of reporter gene expression levels for all the
constructs. The lack of sequence specificity suggests that this phenomenon is not
directly related to the RNA 2 specific stimulation of coat protein accumulation observed
in a viral infection.
Résultats______________________________________________________________________
78
INTRODUCTION
The genome of beet necrotic yellow vein virus consists of four plus-sense RNAs, of
which the two largest (RNA 1 and RNA 2) are required for host-nonspecific
'housekeeping' functions such as replication and encapsidation of the viral RNA and
virus movement while the two smaller RNA species control proliferation of the
infection within sugar beet roots and production of rhizomania symptoms (RNA 3) and
transmission of the virus by its fungal vector, Polymyxa betae (RNA 4) (for reviews, see
Jupin et al., 1991, and Richards and Tamada, 1992). Some Japanese isolates also
contain a third accessory RNA (RNA 5) whose function has not yet been determined
(Tamada et al., 1989). The single long open reading frame (ORF) on RNA 1 possesses
the alphavirus superfamily 'core polymerase' and RNA helicase motifs (Bouzoubaa et
al., 1987), marking it as the RNA-dependent RNA replicase; RNA 1 is the only
BNYVV RNA that can replicate autonomously in protoplasts and is required for the
replication of the other viral RNAs (Bouzoubaa and Scheidecker, 1990). RNA 2 has six
long ORFs (Figure 1). The 5'-proximal AUG is the site of translation initiation for two
proteins, the 21 kilodalton (kDa) major coat protein (P21) and the translational
readthrough protein P75 (Ziegler et al., 1985; Bouzoubaa et al., 1986), which is a minor
component of the viral capsid (Tamada and Kusume, 1991; Schmitt et al., 1992;
Haeberlé et al., 1994). The three following partially overlapping ORFs, encoding the
proteins P42, P13 and P15, form a cassette of cell-to-cell movement proteins known as
the Triple Gene Block (TGB; Figure 1). Counterparts of the TGB are present in some
other furoviruses (Herzog et al., 1994; Scott et al., 1994) and in potex-, carla- and
hordeiviruses (Morozov et al., 1989). Mutations in full-length BNYVV RNA 2
transcripts knocking out any one of the three TGB genes completely abolished local
lesion formation on C. quinoa leaves (when coinoculated with a transcript of the wild-
type BNYVV RNA 1) but had relatively little effect on C. quinoa protoplast infection
(Gilmer et al., 1992).
Publication n°2______________________________________________________________________
79
The 3'-proximal ORF of RNA 2 encodes a cysteine-rich 14 kDa protein (P14) which
is expressed from a subgenomic RNA (Gilmer et al., 1992) and is readily detected by
serological techniques in the cytoplasmic fraction of infected cells (Niesbach-Klösgen et
al., 1990). Unlike mutations in the TGB, null mutations of P14 did not abolish local
lesion formation on C. quinoa leaves, although lesion size was diminished and the
accumulation of progeny viral RNA was greatly reduced (Gilmer et al., 1992). The
effect of the P14 mutations on lesion size suggested that P14 intervenes in cell-to-cell
movement of the virus, perhaps by regulating the expression of the TGB proteins.
Preliminary experiments with C. quinoa protoplasts revealed that mutation of P14 also
diminished accumulation of RNA 1 and 2, particularly the latter, in single cells (Gilmer
et al., 1992). In this paper we have further investigated the role of P14 in the viral
replication cycle in C. quinoa protoplasts. Our results are consistent with a model in
which P14 acts in cis to stimulate the accumulation of RNA 2, but also acts
independently and in trans as an enhancer of viral coat protein synthesis.
MATERIALS AND METHODS
cDNA constructs
The vectors for production of in vitro run-off transcripts of wild-type BNYVV
RNA 1 (pB15), RNA 2 (pB218 and pBF14), RNA 3 (pB35) and the plasmid containing
the P75 deletion (pB218-F) have been described elsewhere (Ziegler-Graff et al., 1988;
Quillet et al., 1989; Gilmer et al., 1992). For site-directed mutagenesis of the P14 gene,
an EcoRI fragment extending from residue 3789 to the 3'-end of the insert was excised
from pBF14 and subcloned into pBluescript (-). Oligonucleotide-directed mutagenesis
was carried out on single-stranded phagemid DNA (Zoller and Smith, 1982; Kunkel et
al., 1987) and the EcoRI fragment bearing the mutation was substituted back into pBF14
to produce pBF14-4003 and pBF14-3992 (Figure 1). The P14-expressing RNA 3
construct (pB3rep14) was obtained by inserting a polymerase chain reaction (PCR)
product containing the P14 ORF (with BamHI sites built into the PCR primers) into the
BamHI site of the RNA 3 deletion mutant pB6(∆E-S) (Jupin et al., 1990).
Résultats______________________________________________________________________
80
In vitro transcription
Bacteriophage T7 RNA polymerase run-off transcripts of pB15 and pB3rep14 were
obtained from HindIII-linearized template DNA (Ziegler-Graff et al., 1988; Quillet et
al., 1989). After the transcription reaction, template DNA was eliminated by treatment
with DNase followed by extraction with phenol-chloroform (1:1) (Veidt et al., 1992).
The transcripts were ethanol precipitated in the presence of 2 M ammonium acetate, and
the pellet, after centrifugation, was disolved in sterile water. The yield and integrity of
the transcripts were monitored by agarose gel electrophoresis.
Templates for run-off transcription of full-length wild-type or mutant RNA 2 were
the appropriate ligation products of the large BamHI-BstXI fragment of pB218 (or
pB218-F) and the small BstXI-SalI fragment of pBF14, pBF14-4003 or pBF14-3992
(Quillet et al., 1989). The full-length cDNA (plus an upsteam bacteriophage T7 RNA
polymerase consensus promoter) in an aliquot corresponding to 200 nl of the ligation
mix was then amplified by PCR. The PCR primers were 5'-
CGAATTCTAATACGACTCACTATAGGAAATTCTAACTAT (the sequence in italics
corresponds to the bacteriophage T7 promoter and the underlined sequence to the 5'-
terminus of RNA 2) and 5'-GCCAAGCT20CAATATACTGAAAAC (the underlined
sequence is complementary to the 3'-terminus of RNA 2 upstream of the 3'-poly(A) tail).
PCR was carried out with 5 units Thermus thermophilus DNA Polymerase (Eurogentec)
as described by the supplier except that the reaction mix was supplemented with 6%
dimethylsulfoxide and 100 µg/ml bovine serum albumin. One µg of each primer was
added and the reaction was carried through 25 cycles at 94° for 30 sec, 50° for 30 sec
and 72° for 6 min with the last (elongation) step incremented 5 sec per cycle. The PCR-
amplified DNA was extracted with phenol-chloroform, precipitated with ethanol, taken
up in water at a concentration of 1 µg/µl and transcribed as detailed above for plasmid
templates. The full-length RNA 2 transcripts containing mutations will be referred to as
t2-4003, etc (Fig. 1).
Publication n°2______________________________________________________________________
81
Protoplast inoculation and extraction
Protoplasts were prepared from C. quinoa leaves and inoculated by electroporation
as described (Veidt et al., 1992). The inoculum contained 10 µg RNA 1 transcript and 5
µg of the appropriate RNA 2 transcript per 200,000 protoplasts. In some experiments, 2
µg of pB3rep14 transcript or wild-type RNA 3 transcript was also included in the
inoculum. RNA was extracted from 133,000 protoplasts 48 hr post-inoculation as
described (Veidt et al., 1992). Viral plus-strand RNAs were detected by Northern
hybridization using 32P-labelled riboprobes complementary to RNAs 1, 2 and 3
(Lemaire et al., 1988) followed by autoradiography. Radioactivity in the bands was
quantified in some experiments using a Fujix MAS1000 Bio-Analyzer. For analysis of
viral minus-strands, RNA was extracted from the protoplasts as described (Veidt et al.,
1992) except that the RNA was ethanol-precipitated in the presence of 2M ammonium
acetate and the LiCl precipitation step was omitted. Riboprobes for detection of RNA 1
and 2 minus-strands were obtained by transcribing HindIII-linearized pB12 and EcoRI-
linearized pB21 (Lemaire et al., 1988) with bacteriophage T7 and bacteriophage T3
RNA polymerase, respectively.
For detection of viral proteins, protoplasts were collected by centrifugation and the
pellet was resuspended in 20 µl of two-times concentrated gel loading buffer, the sample
was heated to 95° for 5 min and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis
(Laemmli, 1970). After electrotransfer to nitrocellulose, the viral coat protein, P14 and
the RNA 3 translation product P25 were detected using specific antisera as described
(Niesbach-Klösgen et al., 1988).
Transient expression
The P14 ORF was amplified by PCR with primers containing a built-in NcoI site for
the primer flanking the 5'-end of the ORF and a StuI site for the primer flanking the 3'-
end. The PCR product was cut with NcoI and StuI and inserted between the NcoI and
Résultats______________________________________________________________________
82
SmaI sites of pMJD82 (Dowson Day et al., 1994), a plasmid containing a partially
duplicated 35S promoter, the tobacco mosaic virus omega translational enhancer, a
polylinker (SYN) and the nopaline synthase terminator, to produce pMJD-P14. The
construct pMJD-P14∆1, which contains a 98 residue deletion (plus an 8 residue linker
insertion) in the P14 ORF, was produced similarly except that the template for PCR was
a plasmid containing a P14 deletion mutant generated by exonuclease III digestion
followed by linker insertion (Gilmer et al., 1992). The 5'-noncoding regions of BNYVV
RNA 2 (residues 1-142), RNA 3 (residues 1-442) and RNA 4 (residues 1-377) were
amplified by PCR using primers flanking the noncoding regions and containing a built-
in XhoI site in the primer flanking the 5'-end of the noncoding region and a built-in NcoI
site in the 3'-flanking primer. The PCR products were cleaved with XhoI and NcoI and
inserted between the XhoI and NcoI sites of pRT-SYN-LUC (Turner et al., 1994) to
produce pRT-BN2-LUC, pRT-BN3-LUC and pRT-BN4-LUC (see below).
The lower surfaces of C. quinoa leaves (3-4 cm length, from 4 week-old plants) or
3-4 cm long half leaves of Nicotiana tabacum were used as targets. Bombardment of
the leaves with tungsten microprojectiles coated with DNA and measurements of
luciferase activity were essentially as described (Twell et al., 1989).
RESULTS
Point mutations in P14 inhibit accumulation of RNA 2 and coat protein
We have shown previously that infection of C. quinoa with wild-type RNA 1 plus
RNA 2 carrying a mutation, either a ten base insertion (mutant 2-L) or a +2 frameshift
mutation (mutant 2-3722), in the P14 ORF produced smaller local lesions containing
diminished amounts of progeny viral RNA (Gilmer et al., 1992). The mutations also
down-regulated production of RNA 2 and (to a lesser extent) RNA 1 in protoplasts. It
may be argued that the reduction in RNA 2 accumulation in the aforesaid mutants is a
consequence of alteration of cis-acting replication signals on the viral RNA sequence.
This explanation appears unlikely, however, because the +2 frameshift is at the
beginning of the ORF and the ten-base insertion is 335 residues downstream. Additional
Publication n°2______________________________________________________________________
83
evidence that the decreased accumulation of RNA 2 is not due to cis affects on RNA 2
synthesis has come from a study of two additional P14 null mutants, t2-4003 and t2-
3992, in which the P14 ORF has been prematurely terminated by mutation of a single
base to produce an in-frame stop codon, either 13 amino acids (2-4003) or 35 amino
acids (2-3992) downstream of the P14 N-terminus (Fig. 1). Both mutants displayed the
same phenotype on C. quinoa as mutants 2-L and 2-3722 (data not shown). In twelve
experiments in which t2-4003 or t2-3992 was coinoculated with wild-type RNA 1
transcripts to C. quinoa protoplasts, a pronounced reduction in the accumulation of
progeny RNA 2, generally ranging from ten-fold to one hundred-fold compared to the
level obtained with wild-type RNA 2, was consistently observed (Table 1 and additional
observations; also see Figure 2 lane 3). In most experiments, the accumulation of RNA
1 was also diminished by the mutations, but the effect (three-fold or less; Table 1) was
much less pronounced than that observed for RNA 2. Since the different P14 null
mutants behaved similarly in whole plant and protoplast infections, only one of them, 2-
4003, was used for further experiments.
Western blot analysis of protein extracted from virus-infected protoplasts revealed
that inhibition of RNA 2 accumulation provoked by 2-4003 was accompanied by a
reduction in the amount of the major viral capsid protein P21. The reduction ranged
from about one tenth the wild-type level in some experiments (e.g., Fig. 3A, lane 3) to
below the limits of detection in others (e.g., Fig. 4B, lane 4). Accumulation of the minor
readthrough capsid protein P75, which is normally synthesized at about one tenth the
level of P21, underwent a comparable reduction. Diminished accumulation of P21 and
P75 is consistent with the observed lower levels of RNA 2 in the P14 mutant, but it is
difficult to separate cause from effect in these circumstances. Thus, it could be argued
that the primary action of the P14 mutations is to down-regulate synthesis of the viral
capsid proteins and that the concomitant decrease in progeny RNA levels is not due to
defective RNA synthesis, but is instead an indirect effect in which the progeny RNA
that is not packaged by the smaller pool of capsid protein is unstable in the cytosol.
Instability of nonpackaged viral RNAs in protoplasts has been reported for cowpea
Résultats______________________________________________________________________
84
mosaic virus (De Varennes and Maule, 1985; Van Bokhoven et al., 1993). We do not
rule out the possibility that RNA instability contributes in a secondary manner to the
diminished accumulation of progeny RNA levels in the P14 null mutants, but the
evidence presented below indicates that the principal cause, at least in the case of RNA
2, is down-regulation of viral RNA synthesis.
Coat protein synthesis but not replication of a P14-defective RNA 2 mutant can be
complemented in trans
To determine if the defect in RNA 2 synthesis of mutant 2-4003 can be
complemented in trans, t2-4003 was coinoculated to protoplasts along with wild-type
RNA 1 transcripts and transcripts of the previously described RNA 2 mutant 2-F
(Gilmer et al., 1992), in which the sequence encoding the C-terminal half of P75 has
been deleted (Fig. 1). This mutant was used as a source of wild-type P14 in the three-
component infections because its 934 residue deletion makes it easily distinguishable in
Northern hybridization experiments from 2-4003. Mutant 2-F replicated efficiently
when coinoculated with RNA 1 transcripts to protoplasts both in the absence (Fig. 2,
lane 2) and the presence (Fig. 2, lane 4) of mutant 2-4003. Western blot analysis using
P14-specific antiserum revealed that addition of mutant 2-F to the inoculum resulted in
the appearance of amounts of P14 comparable to those produced from the wild-type
RNA 2 transcript (data not shown). This extraneous source of P14 did not, however,
significantly stimulate accumulation of progeny 2-4003 when both 2F and 2-4003 were
included in the inoculum (Fig. 2, lane 4).
In a second attempt to complement mutant 2-4003 replication, we constructed a
BNYVV RNA 3-based 'replicon', B3rep14, in which the P14 ORF was substituted for
the central 1307 residues of RNA 3. It has been shown previously that an RNA 3
construct with the ß-glucuronidase (GUS) gene substituted in this region is efficiently
replicated when inoculated to C. quinoa leaves with RNA 1 and 2 and expresses GUS
activity (Jupin et al., 1990). B3rep14 transcript was likewise replicated efficiently in
protoplasts when inoculated with RNA 1 and the 2-4003 transcript (Fig. 2, lane 5).
Publication n°2______________________________________________________________________
85
Western blot analysis revealed that the B3rep14 directed synthesis of P14 in the infected
protoplasts in amounts higher than wild-type RNA 2 in a parallel experiment. (Fig 3B,
lanes 2 and 4). The production of abundant amounts of P14 by B3rep14 was not,
however, accompanied by increased accumulation of progeny 2-4003 RNA (Fig. 2,
lane 6), confirming that the defect in RNA 2 accumulation caused by mutation of P14
cannot be complemented in trans.
While an external source of P14 in three-component infections reproducibly failed
to elevate 2-4003 accumulation, P14 from tB3rep14, on the other hand, had a
pronounced and reproducible stimulatory effect on translation of 2-4003. Western blot
analysis using P21-specific antiserum revealed that inclusion of tB3rep14 in the
inoculum resulted in the accumulation of P21 (Fig. 3A, lane 5) in amounts similar to
those obtained with the wild-type RNA 2 transcript. Stimulation of P75 accumulation is
not readily detectable in Fig. 3A, lane 5, but was observed in other experiments, (data
not shown). In additional experiments, three-component infections were carried out with
RNA 1 transcript, t-4003 and 2-4 times less tB3rep14 than in the experiment shown in
Figure 3. This resulted in significantly lower levels of P14, but the same strong
stimulatory effect on P21 accumulation was observed (data not shown).
We assume that the increased levels of P21 and P75 provoked by addition of
tB3rep14 are due to stimulation of RNA 2 translation rather than to decreased rates of
degradation of P21 and P75. Although the latter possibility cannot formally be ruled out,
it appears unlikely because capsid proteins such as P21 and P75 are expected to be
intrinsically stable. However, regardless of the mechanism by which capsid protein
levels are regulated by P14, the failure of wild-type levels of P21 and P75 produced
during the three-component infection with RNA 1, t2-4003 and tB3rep14 to enhance
accumulation of progeny 2-4003, represents strong evidence that the principal effect of
P14 on RNA 2 accumulation is at the level of RNA 2 synthesis rather than through an
indirect encapsidation-mediated effect on stability. At present, we reserve judgement as
to whether a similar conclusion applies to the much less dramatic effect of the P14
mutations on RNA 1 levels.
Résultats______________________________________________________________________
86
It was of interest to determine if the stimulatory effect of P14 on protein synthesis
was limited to the proteins encoded by full-length RNA 2 or also applied to viral
proteins translated from subgenomic RNAs. The available antisera do not permit
detection of RNA 1-encoded products or the RNA 2 TGB proteins (encoded by
subgenomic RNAs (Gilmer et al., 1992)) in infected protoplasts. Therefore, no
conclusion can be drawn concerning the effect of P14 on production of these proteins.
Preliminary experiments revealed, however, that the RNA 3 translation product P25 can
be detected weakly by Western blot analysis of protein from infected protoplasts when
RNA 3 is included in the inoculum. Consequently, an experiment was carried out in
which wild-type RNA 3 transcript was included in the inoculum along with RNA 1
transcript and either wild-type RNA 2 transcript or t2-4003. Substitution of t2-4003 for
wild-type RNA 2 transcript did not significantly reduce levels of RNA 3 (not shown) or
P25 (Fig. 4A, lanes 3 and 4). Thus the inhibitory effect of P14 mutations on RNA 2
replication and translation does not extend to RNA 3. To summarize, the foregoing
experiments show that P14 is required for both efficient replication and translation of
RNA 2. Furthermore, the two phenomena are distinct in that the effect of P14 on
replication is tightly coupled and cannot be complemented in a P14-defective RNA 2
mutant by P14 supplied in trans whereas the effect of P14 on RNA 2 translation can be
complemented in trans.
Mutation of P14 attenuates RNA 2 minus-strand synthesis
In some experiments, the effect of mutation of P14 on levels of plus-strand RNAs
(Fig. 5B) were accompanied by measurements of minus-strand viral RNA levels
(Fig. 5A). Figure 5A, lane 4 shows that protoplasts inoculated with RNA 1 and the 2-
4003 transcript accumulated significantly lower amounts of RNA 2 minus-strand than
the control (Fig. 5A, lane 3). RNA 1 minus-strand synthesis, on the other hand, was
much less inhibited. This experiment shows that, in the absence of P14, minus-strand
RNA 2 synthesis occured, but only at a low, basal level. Apparently, P14 produced in
the course of the infection cycle with wild-type RNA 2 stimulates synthesis of the
Publication n°2______________________________________________________________________
87
minus-strand RNA. The alternate possibility, that P14 enhances minus-strand
accumulation by diminishing its rate of degradation, seems unlikely in view of the 'cis'
nature of the relationship between P14 and RNA 2 in replication. We do not yet know if
P14 also stimulates synthesis of plus-strand RNA 2 directly or whether the up-regulation
of plus-strand levels is an indirect consequence of enhanced accumulation of minus-
strand. The effect of P14 on accumulation of the various RNA2-related subgenomic
RNAs produced from the minus-strand RNA 2 template, including the subgenomic
RNA encoding P14 itself, also remains to be investigated.
P14 can stimulate expression of a reporter gene in a transient expression system
The foregoing experiments have shown that, independent of its effects on RNA 2
replication, P14 enhances translation of the 5'-proximal genes of RNA 2. To determine
if P14 can alter translational activity outside of the context of a viral infection, the P14
ORF was inserted between the 35S promoter and nopaline synthase transcription
terminator of pMJD82 to produce pMJD-P14 (Fig. 6). As a null control, a similar
construct was prepared containing the P14 ORF from which 98 residues had been
deleted (pMJD-P14∆1). A series of 'reporter' plasmids (Fig. 6) was also constructed in
which different potential translation control sequences (the 5'-noncoding regions of
BNYVV RNA 2, 3 or 4) were placed between a 35S promoter and the luciferase (LUC)
gene. A previously described (Turner et al., 1994) reporter plasmid (pRT2-SYN-LUC)
containing the 35S promoter plus a synthetic polylinker upstream of the LUC gene (Fig.
6) was also tested. Equimolar amounts of the P14 expression plasmid and a reporter
plasmid were introduced into leaf tissue of C. quinoa or N. tabacum by microprojectile
bombardment (Twell et al., 1989) and LUC activity was measured 24 hr later.
Bombardment of either plant with the P14 expression vector pMJD-P14 and any of the
aforesaid reporter plasmids produced a 2.4-4.5 fold stimulation of reporter gene activity
(Table 2) compared to values obtained for bombardment with the same reporter plasmid
plus the empty expression vector, pMJD82. Substitution of the wild-type P14 gene in
the expression vector by the P14 deletion mutant construct pMJD-P14∆1 did not elicit
Résultats______________________________________________________________________
88
elevated LUC activity (Table 2), indicating that the stimulatory effect is related to the
presence of full-length P14.
It is not yet known if P14 enhances reporter gene expression at the level of
transcription or acts post-transcriptionally. It is evident, however, that there are
important differences in the behavior of P14 in the transient expression system and in a
viral infection. In particular, the stimulation of reporter gene expression provoked by
P14 is sequence nonspecific and is significantly lower than P14 stimulation of capsid
protein synthesis during viral infection, which we estimate to be at least ten-fold and
probably more. These differences may indicate that the RNA 2 5'-noncoding sequence
included in pRT2-BN2-LUC does not contain the putative signal recognized by P14 to
specifically enhance RNA 2 translation in viral infections and that the observed
sequence-nonspecific stimulation shown in Table 2 is a secondary effect. Alternatively,
other features of a viral infection (e.g, the presence of additional viral-coded proteins or
compartmentalization of the viral RNAs and proteins) may be required to obtain a large,
RNA 2-specific enhancement. Nevertheless, the stimulation observed in the transient
expression experiments provides independent evidence that P14 can interact with and
modify the behavior of nucleic acids in vivo.
Publication n°2______________________________________________________________________
89
DISCUSSION
P14 belongs to a group of small cysteine-rich proteins that are encoded by 3'-
proximal genes of furo- (Shirako and Wilson, 1993; Herzog et al., 1994) hordei-, tobra-
and carlaviruses (Morozov et al., 1989). Although there is no significant sequence
similarity among these proteins, they display weak but statistically significant similarity
to various other nucleic acid binding proteins: the E6 protein of the papillomaviruses, in
the case of P14 of BNYVV (Koonin et al., 1991).
Of the various small cysteine-rich proteins, the 17 kDa γb protein of barley stripe
mosaic hordeivirus (BSMV), which is the 3'-proximal gene on BSMV γ RNA, has been
most extensively studied (Petty et al., 1990a, 1990b; Petty et al., 1994; Donald and
Jackson, 1994). Null mutations in the γb gene are not lethal but have effects on
pathogenicity, cell-to-cell movement and viral gene expression. In particular, null
mutations in γb significantly attenuate synthesis of the two other BSMV genome
components, RNAs α and ß (Petty et al., 1990a) and provoke an even more dramatic
attenuation of expression of the two most 5'-proximal genes on RNA ß, the viral coat
protein gene, and the neighboring gene for ßb, the first protein of the TGB (Petty et al.,
1990a). The regulatory action of γb on coat protein translation resembles the trans-
acting stimulatory effect of P14 on BNYVV coat protein levels. Although we have no
direct evidence that P14 also regulates expression of the BNYVV TGB proteins, the
decrease in local lesion size upon infection of leaves with the P14 mutants (Gilmer et
al., 1992) is consistent with such an effect. There are other features, however, where the
similarity between the BSMV γb protein and P14 breaks down. In particular, the BSMV
γb protein does not regulate accumulation levels of γ RNA itself and γb null mutations
can be complemented in trans (Petty et al., 1990a).
The requirement for P14 for efficient synthesis of BNYVV RNA 2 also has a
parallel in the situation with the cowpea mosaic virus (CPMV) 58K protein, encoded by
CPMV M-RNA. Mutations in the 58K protein inhibited synthesis of M-RNA but not B-
RNA, which encodes the 'core' viral RNA replicase (Van Bokhoven et al., 1993;
Résultats______________________________________________________________________
90
Wellink et al., 1994). Furthermore, the 58K mutants could not be complemented by
supplying wild-type P58 in trans from wild-type M-RNA included in the inoculum.
Figure 7 illustrates schematically our current model for the regulation of BNYVV
RNA 2 replication and translation by P14. It should be remarked that in the very early
stages of the viral infection cycle, prior to the onset of RNA 2 minus-strand synthesis,
no P14 will be produced in the infected cell because the subgenomic RNA responsible
for P14 synthesis is not encapsidated (authors' unpublished observations). Consequently,
the capacity of the RNA 2 delivered in the inoculum to direct synthesis of coat protein
will be attenuated. This may be a mechanism to ensure that the infection cycle is not
aborted by premature encapsidation of the 'parental' viral RNAs before replication can
occur. It is noteworthy that, except for the carlaviruses, the other viruses which encode
small cysteine-rich proteins also have their coat protein genes situated at the 5'-extremity
of a genomic RNA and may require a similar mechanism for turning off coat protein
synthesis early in the infection cycle.
Because of the absence of P14, RNA 2 minus-strand synthesis will initially occur
only at very low levels. Once synthesized, however, the RNA 2 minus-strand can serve
as template for production of the P14 subgenomic RNA which will in turn lead to P14
production, further stimulation of RNA 2 minus-strand synthesis, etc. This positive
feedback cycle should lead by a simple mass-action effect to increased accumulation of
the other RNA 2 subgenomic RNAs and RNA 2 plus-strand although we do not rule out
the possibility that P14 may intervene directly to activate their synthesis.
We suggest that the P14 synthesized in the early stages of the aforesaid cycle is
primarily 'channeled' to the viral replication machinery devoted to RNA 2 minus-strand
synthesis. The mechanism by which this channeling occurs is not known but it
presumably involves coupling between replication and translation, perhaps based on
physical proximity of the various components in a large complex. Our inability to
complement in trans the effect of P14 mutations on RNA 2 replication would be a
consequence of this coupling. As P14 accumulates in the cell in the course of the
infection, it will also trigger coat protein synthesis from RNA 2. A time course study of
Publication n°2______________________________________________________________________
91
the accumulation of P14 and coat protein in infected protoplasts reveals that coat protein
begins to appear slightly later than P14 (unpublished observations). Possibly, the
precociously synthesized P14 is (mostly) sequestered by replication complexes and only
once these sites have been saturated does free P14 become available to potentiate coat
protein synthesis.
In conclusion, while the foregoing model accounts for our principal observations
concerning the effects of P14 on RNA 2 replication and translation, it should be
considered as a starting point which probably will require modification as additional
evidence becomes available. Characterization of the viral protein composition of
BNYVV RNA replication complexes would be a useful means of testing some of the
predictions of the model. It would also be of interest to locate the putative target
sequence on RNA 2 which is recognized by P14 during activitation of coat protein
translation.
Acknowledgements. A. H. was the recipient of a FEBS Summer Fellowship. The
plasmid pMJD82 was a gift of M. J. Dowson Day.
Résultats______________________________________________________________________
92
P21P14
RNA 2
P75TGB
4043
RNA 2-F1143 2077
GGU UGA UGC
4078
t4003
4148
UGG UAA UUG
t3992
wild-type
4423
Figure 1. Genome organization of BNYVV RNA 2 and structure of the RNA 2 mutants.
The black rectangle in the map of wild-type P14 indicates the position of a putative Zn-
finger motif (Niesbach-Klösgen et al., 1990). The sequence in the vicinity of the
premature stop codons (underlined) in the P14 mutants 2-4003 and 2-3992 is given. The
deletion in RNA 2-F is symbolized by slanted lines. Numbering refers to nucleotide
position in full-length RNA 2. TGB = Triple Gene Block.
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93
Figure 2. BNYVV-related RNAs in transcript-infected protoplasts detected by Northern
hybridization. C. quinoa protoplasts were inoculated with RNA 1 (t1) plus wild-type
RNA 2 transcripts (t2) (lane 1), RNA 1 plus RNA 2-F transcripts (lane 2), RNA 1 plus
2-4003 transcipts (lane 3), RNA 1 plus RNA 2-F transcripts plus 2-4003 transcripts
(lane 4), RNA 1 plus wild-type RNA 2 transcripts plus B3rep14 transcripts (lane 5) and
RNA 1 plus 2-4003 transcripts plus 3Brep14 transcripts (lane 6). RNA was extracted
from 133,000 protoplasts 48 hr post-inoculation and transferred to nitrocellulose
following agarose gel electrophoresis under denaturing conditions. BNYVV-related
RNA species were detected by hybridzation with RNA 1-, 2- and 3-specific 32P-labeled
antisense RNA probes.
Résultats______________________________________________________________________
94
Figure 3. Accumulation of P21, P75 and P14 in transcript-infected C. quinoa
protoplasts. Protoplasts were mock-inoculated (lane 1) or inoculated with RNA 1 (t1)
plus RNA 2 transcripts (t2) (lane 2), RNA 1 plus 2-4003 transcripts (lane 3), RNA 1
plus RNA 2 plus B3rep14 transcripts (lane 4) and RNA 1 plus 2-4003 plus B3rep14
transcripts (lane 5). Total protein was extracted from 35,000 protoplasts 48 hr post-
inoculation, separated by PAGE and transferred to nitrocellulose. Capsid proteins were
immunodetected using an anti-virus serum (Panel A). P14 was detected (Panel B) using
serum raised against a P14-fusion protein expressed in bacteria (Niesbach-Klösgen et
al., 1990). Bars to the left indicate the positions of 94, 67, 43, 30, 20 and 14 kDa
molecular weight markers. The more slowly migrating bands in Panel B are probably
multimers of P14.
Publication n°2______________________________________________________________________
95
Figure 4. Immunodetection of the RNA 3 product P25 in C. quinoa protoplasts. Total
protein was extracted from 100,000 protoplasts which had been inoculated with RNA
from isolate Stras12, containing only RNA 1 and 2 (Quillet et al., 1989) (lane 1), mock-
inoculated (lane 2), or inoculated with RNA 1, RNA 2 and RNA 3 transcripts (lane 3) or
with RNA 1, 2-4003 and RNA 3 transcripts (lane 4). P25-specific antiserum (Niesbach-
Klösgen et al. 1990) was used to detect P25 expression in Panel A. The position and
size (in kDa) of molecular weight markers are given to the left. Panel B shows
immunodetection of capsid proteins in a duplicate gel loaded with protein from 35,000
protoplasts as described in the Figure 3 legend.
Résultats______________________________________________________________________
96
Figure 5. Effect of mutation in P14 on the accumulation of BNYVV RNA 1 and 2
minus-strands. RNA was extracted from 130,000 protoplasts 36 hr following
inoculation with Stras12 viral RNA (lane 1), mock-inoculation (lane 2), inoculation with
RNA 1 plus wild-type RNA 2 transcripts (lane 3) or inoculation with RNA 1 plus 2-
4003 transcripts (lane 4). Duplicate Northern blots were hybridzed with probes specific
for either minus-strand (Panel A) or plus-strand (Panel B) RNAs 1 and 2. The bands
marked with asterisks in Panel A are the size of the RNA 2 subgenomic species RNA
2suba and RNA 2subb (Gilmer et al., 1992).
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97
pRTS2-LUC
Xho I Nco I
35 S 5' Luciferase 35 S 3'SYN
pMJD 82
Nco I Sma I
ž NOS 3'
pMJD-P14 P14ž NOS 3'
pRTBN2-LUC
1451
LuciferaseRNA 2
35 S 5' 35 S 3'
35 S 5'
35 S 5'
Figure 6. Structure of vectors employed in transient expression experiments (not to
scale). For each construct, only the inserted genes (LUC or P14 and flanking control
elements (cauliflower mosaic virus 35S promoter and terminator and the nopaline
synthase terminator) are shown. The thick line labeled SYN represents a polylinker and
the thin line labelled RNA 2 represents the BNYVV RNA 2 5'-noncoding sequence
(residues 1-145). Constructs pRTBN3-LUC and pRTBN4-LUC (not shown) were
identical to pRTBN2-LUC except that they contained the 5'-noncoding region of RNA 3
(residues 1-442) and RNA 4 (residues 1-377), respectively, in place of the RNA 2
sequence. Constructs pMJD2 and pMJD-P14 also contain the tobacco mosaic virus 5'-
noncoding sequence omega (Gallie et al., 1987).
Résultats______________________________________________________________________
98
RNA 2 (-)
RNA 2 (+)
Replication level
(in cis)
Translation level
(in trans)
P14
2 subc
P14
P21
P21P75
P14
Figure 7. Model illustrating the effects of P14 on replication and translation of BNYVV
RNA 2. The rectangles represent ORFs on RNA 2 and the ovals symbolize the RNA 2
translation products P21 and P75. P14 is represented by shaded circles. 2subc is the
subgenomic RNA which is thought to direct P14 synthesis (Gilmer et al., 1992). Other
RNA 2-derived subgenomic RNAs are not shown.
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99
Experiment MutantAccumulation (relative to wild type)
RNA 1 RNA 21
2
4
3
2-40032-39922-3722a2-40032-3992
2-4003
2-4003
1,20 0,131,50 0,140,42 0,020,58 0,020,38 0,07
0,64 0,05
0,37 0,02
a The P14 frameshift mutant 2-3722 has been described previously (Gilmer et al., 1992)
Table 1: Effect of null mutations in P14 on accumulation of RNA 1 and RNA 2.
Résultats______________________________________________________________________
100
a Luciferase activity (measured in light units emitted in 10 sec) in tissue bombarded with a reporter plasmid plus pMJD-P14 or pMJD-P14²1 divided by the luciferase activity in the same weight of tissue bombarded with the same reporter plasmid plus pMJD 82. Standard deviations are given for the experiments where n=4. Luceriferase activity for tissue displaying stimulation ranged between 105 to 106 in different experiments. Background levels for extracts from nonbombarded leaves were between 1000-3000.
P14 constructReporter Construct Plant
Number of experiments
pMJD-P14 SYN-LUC C. quinoa 4 3.14 ± 0.84N. tabacum 2 2.4SYN-LUC
pMJD-P14²1 SYN-LUC C. quinoa 1 1.19
BN3-LUC
pMJD-P14 BN2-LUC 4 2.8 ± 0.45C. quinoa
pMJD-P14²1 1 0.65BN2-LUC C. quinoa
C. quinoapMJD-P14
2 2.8BN2-LUC N. tabacum
2 4.5BN3-LUC N. tabacum 1 3.0
pMJD-P14 2 3.27BN4-LUC C. quinoaN. tabacum 2 3.8BN4-LUC
pMJD-P14²1 0.721C. quinoaBN4-LUC
Stimulation a
Table 2: Luciferase transient expression in leaves of C. quinoa or N. tabacum after bombardment with microprojectiles coated with different P14 expressing plasmids and lucerferase-expressing reporter gene constructs.
Publication n°2______________________________________________________________________
101
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105
CHAPITRE 3 :
DES RNA 2 DEFECTIFS SONT
CAPABLES D'INHIBER
LA REPLICATION DU BNYVV
Avant de décrire l'utilisation de RNA défectifs interférant avec la réplication du
BNYVV, je voudrais rappeler brièvement quelques stratégies couramment utilisées dans
la lutte antivirale par transgénose.
I-Rappel sur les stratégies de lutte antivirale par transgénose : expression de
séquences dérivées du pathogène.
De nombreux résultats concernant l'obtention de plantes transgéniques exprimant
des séquences virales ont déjà été décrits dans la littérature et les différentes stratégies
utilisées ont une efficacité qui varie en fonction du virus étudié (pour revue, voir
Wilson, 1993).
Chapitre 3______________________________________________________________________
107
a-Expression constitutive de protéines structurales.
Powell-Abel et collaborateurs ont obtenu dès 1986 des tabacs exprimant la
protéine de coque du TMV et résistant à une infection par ce virus. Le processus
impliqué dans cette résistance n'est pas bien établi. Il semblerait cependant que la
protéine de coque exprimée dans ces plantes transgéniques inhibe la décapsidation du
virus. Ces travaux ont été les premiers d'une longue série faisant appel à la stratégie
capside et, à l'heure actuelle, de nombreux cas de plantes transgéniques exprimant la CP
de différents phytovirus sont décrits dans la littérature (pour revue voir Beachy et al,
1990 ; Hull & Davies, 1992). Cette stratégie ne confère en général qu'une résistance
partielle contre l'infection du virus, résistance caractérisée par un retard dans l'apparition
des symptômes qui sont moins sévères ainsi qu'une concentration moindre du virus.
b-Résistance liée à l'expression d'un RNA d'origine virale non traduit.
Dans certains cas, l'expression de la protéine CP n'est pas nécessaire à l'induction
de la résistance. Ainsi, Smith et collaborateurs (1994) ont introduit, dans des tabacs, le
gène muté de la protéine de capside du potato virus Y (ou PVY) et ont obtenu
l'accumulation du transcrit correspondant. Dans ce cas, les plantes infectées par du PVY
présentent une résistance beaucoup plus importante que celle développée par des plantes
transgéniques exprimant constitutivement la protéine de coque du virus. Des résultats
analogues ont été obtenus avec le tobacco etch virus (ou TEV) (Silva-Rosales et al,
1994). Dans ce cas, les plantes présentent une résistance homologue à une infection par
le TEV alors que les plantes exprimant la protéine de coque développent une résistance
partielle hétérologue contre le TEV, mais aussi contre le PVY, un autre potyvirus. Pour
expliquer cette résistance spécifique liée à la présence de RNA seul, les auteurs
suggèrent qu'il existe un système de régulation de la transcription du transgène dans la
cellule végétale. Lorsqu'un certain seuil de concentration du transcrit est atteint dans la
cellule, un système de régulation négatif à la fois cytoplasmique et nucléaire se met en
place, réprimant ainsi la synthèse de transcrits et pouvant éventuellement engendrer leur
dégradation. Ce système spécifique activé pourrait agir dès les premiers instants d'une
Résultats______________________________________________________________________
108
infection par un virus donné (Smith et al, 1994) mais présente un inconvénient. En effet,
il a été démontré que des plantes transgéniques génétiquement identiques exprimant de
telles séquences pouvaient réagir de manière différente face à une infection virale. Ainsi,
une plante peut être totalement résistante alors qu'une autre sera sensible, cette
différence étant liée à des modifications épigénétiques comme la méthylation par
exemple (Dougherty et al, 1994 ; Wasseneger et al, 1994).
c-La séquence virale exprimée interfère avec la réplication virale.
Ce type de résistance a été obtenue en utilisant soit des RNA satellites soit des
RNA défectifs interférants.
-Les RNA satellites.
Les RNA satellites sont de petites molécules de RNA incapables de se répliquer
seules dans une cellule végétale ; ils nécessitent la présence d'un virus assistant à la fois
pour la réplication et l'encapsidation. Ils ne présentent pas d'homologie significative
avec les RNA viraux à l'exception de quelques nucléotides 5' et 3' terminaux (Franki,
1986) et peuvent aggraver ou atténuer les symptômes (Jacquemond & Lot, 1981).
L'association d'un RNA satellite avec un isolat viral plutôt qu'un autre, ou la
modification de quelques nucléotides au niveau du satellite suffit pour modifier dans un
sens ou dans l'autre les effets dus au virus lors de l'infection d'un hôte (Baulcombe,
1990). Le RNA satellite le plus étudié à l'heure actuelle est le satellite du cucumber
mosaic virus ou CMV (pour revue voir Yie & Tien, 1993).
L'utilisation des RNA satellites dans le cadre d'une lutte antivirale par
transgénose permet d'induire une résistance à l'infection par le CMV (Baulcombe et al,
1986 ; Tien et al, 1987 ; Montasser et al, 1991). Cette résistance peut être augmentée
lorsque les plantes transgéniques expriment à la fois la séquence satellite et la protéine
capsidaire (Yie et al, 1992). Cependant, cette stratégie présente un risque majeur, à
savoir des mutations ponctuelles transformant les RNA satellites non nécrogènes en
RNA satellites nécrogènes avec toutes les conséquences néfastes connues (Baulcombe,
Chapitre 3______________________________________________________________________
109
1990).
Résultats______________________________________________________________________
110
Figure III-1 : Représentation schématique du "copy-choice" pour la synthèse de RNA Défectifs Interférants (d'après Lazzarini et al, 1981). Deux possibilités :
(A) intermoléculaire (B) intramoléculaire
( indique un saut de la réplicase)
Complexe de réplication
A B
RNA
Chapitre 3______________________________________________________________________
111
-Les RNA défectifs interférants.
Ce sont de petits RNA obtenus par délétions internes au sein de RNA viraux
(Roux et al, 1991). Ils conservent donc les séquences 5' et 3' terminales essentielles à la
reconnaissance par le complexe de réplication, mais nécessitent la présence d'un RNA
assistant pour se répliquer. Ces RNA DI peuvent apparaître de façon naturelle lors de
passages successifs du virus sur l'hôte et leur effet DI est probablement lié à une
compétition pour la réplicase virale. Cette compétition entraîne une chute du taux de
réplication virale et atténue les symptômes. Des RNA DI naturels ont été décrits dans de
nombreux cas de virus de plantes comme le tomato bushy stunt virus ou TBSV
(Hillman et al, 1987), le cymbidium ringspot virus ou CyRSV (Burgyan et al, 1989), le
turnip crinkle virus ou TCV (Li et al, 1989), le clover yellow mosaic virus ou CYMV
(White et al, 1991) et le tomato spotted wilt virus ou TSWV (De Oliveira Resende et al,
1991).
Le mécanisme moléculaire lié à l'apparition de ces molécules de RNA DI n'est
pas encore élucidé à l'heure actuelle : ils pourraient être issus d'un épissage incontrôlé
des RNA génomiques ; ils pourraient également être obtenus à la suite d'une erreur lors
de la réplication des RNA génomiques selon le modèle "copy-choice" décrit par
Lazzarini et collaborateurs (1981) (figure III-1). Dans ce modèle, le complexe de
réplication initierait normalement la synthèse du RNA génomique, puis, par un
mécanisme encore inconnu, continuerait sur une autre région du RNA génomique, voire
sur une autre molécule de RNA, ce qui aurait pour conséquence une délétion plus ou
moins importante du génome.
Des molécules défectives interférantes ont été utilisées avec succès dans la lutte
contre l'african cassava mosaic virus (ACMV), un géminivirus. En effet des tabacs
transgéniques exprimant un DNA viral délété dérivé du composant B génère une
résistance vis à vis de l'ACMV. Ces plantes restent cependant sensibles à une infection
par un autre géminivirus appartenant au même sous groupe : le tomato golden mosaic
virus ou TGMV (Stanley et al, 1990). Une telle résistance induite par des RNA DI a
également été décrite pour le CyRSV, un tombusvirus (Kolar et al, 1993). Enfin, en
Résultats______________________________________________________________________
112
1991, Marsh et ses collaborateurs ont été en mesure de construire par mutagénèse
dirigée des RNA DI à partir du RNA 2 du brome mosaic virus (ou BMV).
Chapitre 3______________________________________________________________________
113
P237 ARNA 1
ARNA 1 a 6562221
ARNA 1 b 6562435
AP31RNA 4
ARNA 45-R4404 1334
CP AP42
P13 P14RNA 2
RNA 2 b499
A4482
RNA 2 d1142
A4482
RNA 2 a270
A4482
RNA 2 c637
A4482
ARNA 2 e3789
269
P75
RNA 3 P25
RNA 3A ² ES A1470381
A
Figure III-2 : Organisation génétique du BNYVV et localisation des délétions réalisées dans les différents RNA génomiques.
Résultats______________________________________________________________________
114
Dans le cas du BNYVV, il n'existe pas de RNA DI naturel. C'est pourquoi, dans
l'optique de la mise au point d'une stratégie de lutte antivirale dirigée contre le BNYVV,
nous avons entrepris la construction de telles molécules à partir des clones cDNA
correspondant aux différents RNA du BNYVV.
II-Obtention de RNA défectifs artificiels du BNYVV : leur effet sur la réplication du
virus.
1-Obtention de RNA défectifs.
Pour construire des RNA DI potentiels, nous avons délété une grande partie des
régions codantes présentes sur les différents RNA et ceci en utilisant des sites de
restriction présents sur les copies cDNA double brin correspondant à ces RNA. Les
délétions ont été effectuées en conservant les extrémités 5' et 3' terminales impliquées en
cis dans la réplication (c'est à dire les 310 premiers et 70 derniers nucléotides pour le
RNA 3 par exemple) (Jupin et al, 1990). Les différents mutants obtenus sont décrits sur
la figure III-2. Les délétions introduites éliminent de 64 % (dans le cas du RNA 2d)
jusqu'à 93 % (dans le cas du RNA 1a) de l'information génétique du RNA viral.
2-Seules les délétions introduites dans le RNA 2 produisent des RNA ayant un
effet Défectif Interférant.
Afin de tester leurs propriétés biologiques, nous avons transcrit ces différentes
constructions puis nous les avons inoculés à des protoplastes en présence de RNA
assistant représenté par les RNA 1 et 2 de l'isolat Stras 12. Les expériences ont été
réalisées dans les conditions où les RNA délétés sont en excès d'un facteur 30 (en poids)
par rapport aux RNA viraux génomiques. Après 48 heures de culture, nous avons extrait
classiquement les RNA totaux et nous les avons analysés par hybridation moléculaire en
utilisant les sondes ribonucléiques spécifiques des RNA 1 et 2. Les résultats que nous
avons obtenus (publication 3, figures A et B) montrent que seuls les mutants de délétion
du RNA 2 (RNA 2a à RNA 2e) sont en mesure d'inhiber la réplication des RNA 1 et 2
Chapitre 3______________________________________________________________________
115
génomiques. Pour les mutants de délétion préparés à partir des RNA 1, 3 et 4, aucun
effet sur le taux de réplication des RNA 1 et 2 n'a pu être détecté.
3-Analyse de l'effet DI en fonction de la quantité de RNA DI utilisée et du temps.
a-En fonction de la quantité
Pour essayer de mieux comprendre les raisons de cet effet inhibiteur nous avons
réalisé d'autres expériences en utilisant essentiellement le RNA 2a qui provoque les
effets inhibiteurs les plus sévères. Afin de voir si la quantité de RNA DI utilisée avait
une influence sur le degré d'inhibition de la réplication, nous avons coinoculé l'isolat
Stras 12 avec des quantités croissantes de RNA mutant (d'un facteur 1 à 30 en poids, ce
qui correspond à 30 jusqu'à 300 fois plus de molécules de RNA DI que de RNA 1 et 2 ).
Lorsque l'on analyse les RNA génomiques extraits de protoplastes inoculés dans ces
conditions, on constate que leur synthèse est totalement inhibée pour des quantités de
RNA 2a en excès de 10 fois (publication 3, figure 3, piste 6). Cette inhibition est
spécifique : en effet, lorsqu'on coinocule du RNA Stras 12 avec un excès d'un facteur 30
de RNA totaux extrait de C. quinoa sain, on n'observe pas de diminution du taux de
réplication des RNA viraux génomiques (publication 3, figure 3, piste 4). Bien au
contraire, les signaux correspondant aux RNA 1 et 2 sont souvent légèrement plus forts
ceci étant probablement dû à un effet protecteur vis à vis de nucléases cellulaires.
Enfin, on ne peut mettre en évidence de signal correspondant au RNA DI et
indiquant une réplication efficace de cette molécule (voir publication 3, figure 3, pistes
5 à 8). Pour expliquer cela, plusieurs hypothèses sont envisageables : (1) on peut
imaginer que le RNA DI ne se réplique que très faiblement et n'est donc pas détectable.
Ceci apparaît d'autant plus plausible que l'ORF VI est totalement éliminée ou bien que la
synthèse de RNA subgénomique correspondant est probablement inhibée (cas du
RNA 2e) ; or on sait maintenant que la protéine P14 agit en cis dans la réplication. (2)
On peut également imaginer que la délétion introduite a éliminé une séquence
nécessaire à l'encapsidation de ces RNA qui seraient alors la cible de nucléases
cellulaires.
Résultats______________________________________________________________________
116
A B C
Figure III-3 : Effet des RNA DI 2a et 2e coinoculés avec l'isolat Stras 123.A- Isolat Stras 123B- Isolat Stras 123 + RNA 2aC- Isolat Stras 123 + RNA 2e
Chapitre 3______________________________________________________________________
117
b-Cinétique de la réplication du virus en présence et en l'absence du RNA 2a.
Pour déterminer à quel moment du cycle de réplication viral se faisait "l'effet
DI", nous avons réalisé une cinétique d'infection de protoplastes en coinoculant l'isolat
Stras 12 avec un large excès de RNA DI 2a. Lorsque l'on extrait les RNA totaux 1 heure
après l'électroporation, les RNA génomiques ne peuvent être observés quel que soit le
cas (publication 3, figure 4, pistes 1 et 2). La réplication n'a pas encore atteint un taux
suffisamment important pour que les RNA viraux puissent être détectés par la technique
utilisée. Par contre, on peut observer une bande résiduelle correspondant au RNA DI
provenant de l'inoculum. Si on peut déjà détecter un signal très faible correspondant aux
RNA 1 et 2 7 heures après l'infection (publication 3, figure 4, piste 4), en revanche, ces
RNA 1 et 2 ne peuvent être mis en évidence quand ces protoplastes sont coinoculés avec
l'isolat Stras 12 et le RNA DI et ceci même 48 heures après l'infection (publication 3,
figure 4, piste 11). Cette cinétique nous permet donc de conclure que l'effet DI est un
événement précoce dans le cycle de réplication du virus.
4-Analyse dans les plantes de l'effet DI des différents mutants du RNA 2.
Il nous restait à confirmer l'effet inhibiteur des RNA 2 DI au niveau de la plante.
Pour cela, nous avons infecté des feuilles de C. quinoa avec l'isolat Stras 123 (constitué
des RNA 1, 2 et 3 sauvages) en présence et en l'absence de RNA 2a ou 2e. Comme on
peut le constater sur la figure III-3, l'isolat Stras 123 provoque des lésions chlorotiques
sévères tandis que les plantes inoculées avec l'isolat Stras 123 et les RNA 2 DI ne
développent pas de symptômes. Cela est confirmé par l'analyse des RNA totaux extraits
des feuilles qui révèle une diminution importante de la quantité de RNA viraux. On note
d'autre part un très léger signal correspondant aux RNA 2a et 2e qui pourrait en fait
n'être qu'un résidu d'inoculum (publication 3, figure 5, piste 2 et 3).
Résultats______________________________________________________________________
118
III-Conclusions et perspectives.
Ces expériences préliminaires nous ont donc permis de générer des mutants de
délétion du RNA 2 capables d'inhiber la réplication des RNA génomiques viraux. Ces
résultats rejoignent les observations faites par Marsh et collaborateurs (1991) qui ont
également pu construire des RNA défectifs interférants à partir du RNA 2 du BMV.
On peut penser que cet effet DI est associé à une affinité plus grande des RNA
DI pour le complexe de réplication qui, ainsi piégé, ne sera plus disponible pour la
réplication des RNA viraux.
Pour expliquer l'efficacité des RNA défectifs dérivés du RNA 2 par rapport aux
autres RNA, on peut imaginer que ces RNA DI ont perdu leur site d'encapsidation. De
ce fait, n'étant pas encapsidés, ils pourront rester accessibles au complexe de réplication
et donc interférer avec la réplication des RNA génomiques.
Ces résultats vont maintenant être exploités pour construire des plantes
transgéniques exprimant constitutivement l'un des RNA 2 DI. Cependant, comme on a
pu le constater, le problème majeur qui se posera dans cette approche est la nécessité
d'obtenir une forte synthèse de RNA DI pour inhiber la réplication virale.
Chapitre 3______________________________________________________________________
119
Publication n°3
ARTIFICIAL DEFECTIVE INTERFERING RNAs DERIVED FROM RNA 2 OF
BEET NECROTIC YELLOW VEIN VIRUS
A. Hehn, S. Bouzoubaa, G. Jonard, H. Guilley and K. Richards.
Archives of Virology
(135, 143-151)
(1994)
Publication n°3______________________________________________________________________
121
Résultats______________________________________________________________________
122
Publication n°3______________________________________________________________________
123
Résultats______________________________________________________________________
124
Publication n°3______________________________________________________________________
125
Résultats______________________________________________________________________
126
Publication n°3______________________________________________________________________
127
Résultats______________________________________________________________________
128
Publication n°3______________________________________________________________________
129
CHAPITRE 4 :
MISE EN EVIDENCE
D'UNE ACTIVITE PROTEOLYTIQUE
ASSOCIEE A LA PROTEINE P237 CODEE
PAR LE RNA 1 DU BNYVV.
Ces travaux préliminaires concernant la maturation de la protéine P237 codée
par le RNA 1 du BNYVV font suite à une étude informatique de comparaison de
séquences réalisée par Koonin et Dolja en 1993. Outre les domaines consensus déjà
décrits, à savoir les domaines méthyltransférase (MTR), hélicase (HEL) et polymérase
(POL) (Poch et al, 1989), Koonin & Dolja ont également montré que la protéine P237
renfermait un domaine protéase de type papaïne (PRO). Cette observation suggère que
la protéine P237 est donc probablement maturée lors du cycle d'infection virale. Comme
on peut le voir dans le tableau IV-1, cette stratégie est utilisée par de nombreux virus
végétaux ou animaux pour exprimer leur information génétique.
Chapitre 4______________________________________________________________________
131
______________________________________________________Famille de virus Protéase virale Protéase cellulaire______________________________________________________
Virus animaux
PicornaviridaeEnterovirus Ser*, Ser*Rhinovirus Ser*, Ser*
TogaviridaeAlphavirus Cys, Ser OuiRubivirus Cys Oui
Coronaviridae Cys, Ser
FlaviviridaeFlavivirus Ser Oui
Retroviridae Asp Oui
Virus végétaux
PotyviridaePotyvirus Ser, Cys, Ser*Baymovirus Cys, Ser*
Comoviridae Ser*
Nepoviridae Ser*
Furoviridae Cys ?
Tymoviridae Cys
Caulimoviridae Asp______________________________________________________
Tableau IV-1 : Exemples de virus nécessitant la maturation d'une polyprotéine viraleau cours de la réplication. Ser : protéase à sérine, Ser * : protéase sérinelike, Cys : protéase à cystéine, Asp : protéase à acide aspartique. le "?"signifie qu'il n'y a pas encore de preuve biochimique de l'appartenance de laprotéase à telle ou telle classe (Dougherty & Semler, 1993).
Résultats______________________________________________________________________
132
I-Les protéases d'origine virale et leurs caractéristiques
1-Généralités sur les protéases.
Il existe 2 types de protéases : les exoprotéases et les endoprotéases. Les
exoprotéases catalysent l'élimination, de manière récurrente, des acides aminés
terminaux. Les endopeptidases, par contre, permettent le clivage d'une liaison
peptidique entre 2 acides aminés spécifiques au sein d'une protéine donnée (Barrett,
1986). Quatre classes d'endoprotéases ont été décrites :
-Les métalloprotéases, les protéases à sérine, les protéases à cystéine et les
protéases acides. Les métalloprotéases nécessitent pour être actives la présence d'un ion
divalent, en général un ion Zn2+ et à l'heure actuelle, ces protéases n'ont pas encore été
décrites dans le cas de maturation de protéine virale.
-Les protéases à sérine sont caractérisées par la présence d'une "triade
catalytique" composée par une sérine, une histidine et un acide glutamique ou aspartique
au niveau du site actif. Lors de la réaction enzymatique, il se forme un intermédiaire
enzyme-substrat covalemment lié entre le groupement hydroxyl de la sérine du site
catalytique et le groupement carbonyle de la liaison peptidique (Sprang et al, 1987).
-Il existe 2 types de protéases à cystéine : (1) celles qui disposent d'une diade
catalytique composée d'une cystéine et d'une histidine, ce sont des protéases à cystéine
papaïn-like. (2) Les protéases caractérisées par une triade catalytique analogue à celle
des protéases à sérine où le résidu sérine est remplacé par une cystéine : c'est le cas des
enzymes de type chymotrypsine. Le processus catalytique des protéases à cystéine passe
par la formation d'un intermédiaire enzyme-substrat s'établissant grâce à une liaison
covalente entre le groupement thiol de la cystéine du site actif et le groupement
carbonyle de la liaison peptidique.
-Enfin, les protéases à acide aspartique, ou protéases acides, contiennent 2 acides
aspartiques au niveau de leur site catalytique. Le mécanisme réactionnel des protéases
Chapitre 4______________________________________________________________________
133
Figure IV-1 : Schéma général de l'organisation génétique du CPMV. La taille des protéines obtenues après maturation des polyprotéines P105, P95 et P200 est également représentée.
M-RNA
B-RNA
58 k/ 48 k VP 37 VP 23
105 k
95 k
58 k 60 k
48 k 60 k
VP 37 VP 23
Vpg AAA
Vpg AAA32 k 58 k
Vpg
24 k 87 k
200 k
32 k 170 k
84 k 87 k
60 k 110 k
58 k Vpg 24 k 87 k
polyméraseprotéase
protéines de structure
transport et réplication
régulation de la maturation
Résultats______________________________________________________________________
134
Figure IV-2 : Représentation schématique de l'organisation génétique du RNA du Tobacco Etch Virus (ou TEV) et des différentes étapes de la maturation de la polyprotéine de 346 kDa.
AA
P1 HC-PRO Protéine de Mouvement ?
Hélicase, NTPase Vpg NIa
protéase Réplicase ? capside?
Traduction
Maturation cotraductionnelle
Maturation post-traductionnelle
87 kDa 121 kDa 6 kDa 49 kDa 88 kDa
35 kDa 51 kDa 50 kDa 71 kDa 21 kDa 27 kDa 58 kDa 30 kDa
54 kDa
ou
Chapitre 4______________________________________________________________________
135
acides et des métalloprotéases n'est pas clairement établi mais il semblerait qu'il n'y ait
pas formation d'un intermédiaire enzyme-substrat lié de façon covalente.
2-Exemples de protéines virales présentant une activité protéasique
De nombreux virus expriment leur information génétique sous forme de
polyprotéines qui sont maturées en cis ou en trans par une ou plusieurs protéases
virales. Le tableau IV-1 rassemble quelques exemples répertoriés chez les virus animaux
et végétaux. Nous allons, dans la suite de ce chapitre, nous limiter à une description
sommaire de l'un ou l'autre de ces cas.
a-Une seule activité protéase est responsable de la maturation des polyprotéines du
Cowpea Mosaic Virus (CPMV):
La protéinase unique permettant la maturation des 2 polyprotéines synthétisées
par le cowpea mosaic virus (CPMV), un virus picorna-like, a un poids moléculaire de 24
kDa et fait partie intégrante de la polyprotéine de 200 kDa codée par le B-RNA
(Wellink et al, 1986, 1987 ; Peters et al, 1992) (voir figure IV-1). Il existe un cofacteur
de 32 kDa, localisé à l'extrémité N-terminale de la protéine B, qui permet une régulation
positive ou négative de la maturation des polyprotéines B et M (Vos et al, 1988 ; Peters
et al, 1992). Des études par mutagénèse dirigée ont permis de mettre en évidence
l'importance des résidus histidine (His40), cystéine (Cys166) et acide glutamique (Glu76)
au niveau du site actif (Dessens & Lomonossof, 1991) : la protéine de 24 kDa est donc
une protéase à cystéine de type chymotrypsine (Gorbalenya et al, 1989).
b-Trois activités protéases sont nécessaires pour maturer la polyprotéine codée par
le Tobacco Etch Virus (TEV), un potyvirus :
Pour le TEV, 3 protéases sont nécessaires pour mener à terme la maturation de la
polyprotéine synthétisée à partir du RNA génomique unique (voir figure IV-2). Ainsi, la
protéase P1 de 35 kDa catalyse son automaturation. C'est une protéase à sérine
caractérisée par sa triade catalytique composée d'une histidine (His214), d'un résidu
acide aspartique (Asp223) et d'une sérine (Ser256) (Verchot et al, 1992). La protéine HC-
Résultats______________________________________________________________________
136
Pro présente des homologies de séquence avec des protéases de type papaïne et a donc,
de ce fait, été classée dans la catégorie des protéinases à cystéine (Gorbalenya et al,
1991). Son site catalytique est composé par une cystéine (Cys649) et une histidine
(His722). Comme la protéase P1, HC-PRO catalyse sa propre maturation. Enfin, la
protéase NIa de 49 kDa est responsable des 5 autres clivages de la polyprotéine codée
par le TEV (Carrington & Dougherty, 1987 ; Riechmann et al, 1992). Elle a été classée
dans la catégorie des protéases à cystéine chymotrypsine-like car son site catalytique est
composé d'une triade histidine (His 234), acide aspartique (Asp 269) et cystéine (Cys 339)
(Dougherty et al, 1989).
c-Exemple de l'activité protéase associée à la polyprotéine P206 codée par le
Turnip Yellow Mosaic Virus (TYMV), un virus sindbis-like.
La maturation de la protéine P206 du TYMV nécessite la présence d'un domaine
protéase papaïn-like caractérisé par une cystéine et une histidine au niveau du site
catalytique. La maturation permet de générer une protéine N-terminale de 150 kDa et
une protéine C-terminale de 70 kDa (Bransom & Dreher, 1994). Il a été démontré que
l'activité catalytique se faisait en cis car aucune complémentation n'est possible in vitro.
D'autre part, des mutations ponctuelles substituant les résidus acides aminés du site
catalytique (la cystéine 783 ou l'histidine 869) engendrent une inhibition de la
réplication du virus dans les protoplastes de Brassica rapa.
II-Cas du BNYVV.
1-Comparaison de séquences avec des domaines protéases d'autres phytovirus.
Une étude informatique réalisée par Koonin et Dolja, en 1993, a permis de
mettre en évidence des homologies de séquences entre un certain nombre de virus et le
BNYVV. Ces homologies concernent notamment une séquence consensus de protéase
de type
Chapitre 4______________________________________________________________________
137
BNYVV RubV HEV
TEV PVY
CADFYNLVSRPNNCLVVAISECLGVT...77... SDGHFIAAPLSSRASTRGGELDPNTCWLRAAANVAQAA..105 ...PTGHFVCAVGGGFCCFMKWLGQECTCFLQPAEGAVGDQ...91....PERHNLSFDASQ
LNEEKMYIANEGYCYMNIFFALLVNV...57....KTMHVLDSYGSRGDSEMLYIAKQGYCYINVFLAMLINI...57....QTCHVVDSFGSQ
C@U H&
Figure IV-3 : Séquences consensus de protéases papaïn-like virales. Ces protéases sont caractérisées par la présence de résidus cystéine et histidine au sein du site catalytique. @ désigne un résidu aromatique (F, Y, W, L), & un résidu hydrophobe (aliphatique ou aromatique) et U un résidu aliphatique (I, L, V, M). RubV = Rubi virus, HEV = hepatitis E virus, TEV = tobacco etch virus, PVY = potato virus Y(Koonin and Dolja, 1993)
Résultats______________________________________________________________________
138
ΑΑΑΑ ΒΒΒΒ C
237 kDa160 kDa
60 kDa
237 kDa160 kDa
237 kDa160 kDa
20min
40min
1heure
2heures
4heures
4heure
s
4heure
s
40min
40min
20min
20min
Figure IV-4 : Analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide 8% des produits detraduction de l'isolat Stras 12 dans le système de réticulocytes de lapins.
A. Cinétique d'apparition du produit de maturation P160.B. Mise en évidence du produit de maturation N-terminal par une expériencede chasse en présence d'édéine et de méthionine froide.C. Caractérisation du produit de maturation C-terminal. La méthionineradioactive et l'édéine ont été rajoutées au milieu après 20 minutes detraduction.
Chapitre 4______________________________________________________________________
139
papaïne (figure IV-3) et plus précisément une cystéine et une histidine appartenant au
site catalytique potentiel. Les résidus acides aminés concernés chez le BNYVV seraient
la cystéine 1280 et l'histidine 1370 de la protéine P237 codée par le RNA 1, ce qui
permet de localiser le domaine protéase entre les domaines hélicase et polymérase de la
polyprotéine.
2-Mise en évidence d'une activité protéase associée à la protéine P237.
a-Cinétique de la traduction.
Pour confirmer les prédictions informatiques concernant la maturation de la
protéine P237 du BNYVV, nous avons entrepris de traduire l'isolat Stras 12 du BNYVV
dans le système de réticulocytes de lapins. Les traductions ont été effectuées à 30 °C en
présence de méthionine radiomarquée au 35S et stoppées par l'addition d'un volume de
tampon de charge décrit dans le chapitre matériel et méthodes. Les résultats que nous
avons obtenus (voir figure IV-4) révèlent l'apparition d'une protéine ayant un poids
moléculaire approximatif de 160 kDa. Cette protéine apparaît après 2 heures de
traduction et n'engendre pas une diminution notable de la quantité de protéine P237.
Cette approche n'a cependant pas permis de mettre en évidence le peptide
complémentaire qui devrait avoir approximativement un poids moléculaire de 80 kDa.
b-Mise en évidence du peptide renfermant le domaine N-terminal de la protéine
P237.
Afin de déterminer si le produit de maturation de 160 kDa observé
précédemment correspond à l'extrémité N-terminale ou C-terminale de la protéine P237,
nous avons réalisé une expérience de "chasse". Le principe de la méthode consiste à
initier la traduction en présence de méthionine radiomarquée. Après 15 minutes de
traduction, on rajoute de l'édéine (pour inhiber l'initiation) au milieu réactionnel ainsi
qu'une grande quantité de méthionine non marquée. Seuls les produits de traduction
provenant de l'extrémité N-terminale seront donc radioactifs. Comme on peut le
Résultats______________________________________________________________________
140
constater sur la figure IV-4-B, la protéine P160 est très nettement visible ce qui prouve
que ce peptide correspond à l'extrémité N-terminale de la protéine P237.
c-Mise en évidence du produit de maturation renfermant l'extrémité C-terminale
de la protéine P237.
Cette méthode consiste à initier la traduction de la protéine P237 en présence de
méthionine non radioactive. Après 15 minutes de traduction, le milieu est additionné
d'édéine et d'un large excès de méthionine radiomarquée ce qui a pour conséquence de
marquer les protéines uniquement à leur extrémité C-terminale. Grâce à cette technique,
nous avons pu visualiser sur la figure IV-4-C le peptide complémentaire du produit de
maturation P160 décrit plus tôt. Cette protéine a un poids moléculaire approximatif de
60 kDa. Sur la même figure, nous pouvons observer la présence des protéines P237 et
P160.
III-Conclusions :
Les observations de Koonin et Dolja (1993) basées sur des études de
comparaison de séquence et prédisant la présence d'un domaine protéase dans la
protéine P237 sont donc confirmées. En effet, les études que nous avons initiées sur la
synthèse de la protéine P237 révèlent une maturation in vitro qui génère au moins 2
protéines, l'une de PM 160 kDa et l'autre de PM 60 kDa environ. L'appartenance à la
classe des protéases papaïn-like n'a pour l'instant pas encore été démontrée.
Il s'agit à présent de déterminer si cette activité protéasique est auto catalytique
ou si elle nécessite la présence d'autres protéines virales. Il faudra également caractériser
les sites actifs et les sites de clivage. Enfin, une étude plus détaillée des produits de
traduction du RNA 1 permettra de savoir si les protéines P160 et P60 représentent les
seuls produits de maturation de la protéine P237.
Pour répondre à ces questions, nous envisageons, dans un premier temps, la
construction d'un clone plus petit renfermant le domaine protéase et permettant une
Chapitre 4______________________________________________________________________
141
analyse plus facile de la maturation dans le système de traduction. Cela nous permettra
de caractériser plus facilement les sites catalytiques et les sites de clivages de cette
protéase.
Nous envisageons également de cloner le RNA 1 dans un vecteur d'expression
bactérien inductible par l'IPTG, puis d'analyser les produits de maturation obtenus in
vivo. Une telle approche a été utilisée par Kadaré et collaborateurs (1995) pour étudier la
maturation de la polyprotéine P206 codée par le RNA du TYMV.
CONCLUSION
Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse nous ont amenés à aborder sur le
plan moléculaire certains aspects de la virologie végétale tels que le mouvement de
cellule à cellule, la réplication, la maturation d'une polyprotéine et la lutte antivirale par
l'utilisation de RNA DI.
Ainsi dans le cadre d'une étude par mutagénèse dirigée des fonctions des gènes 3'
proximaux du RNA 2, nous avons démontré que les protéines codées par les ORF III, IV
et V étaient nécessaires à une diffusion efficace de l'infection virale. D'autres phytovirus
comme le white clover mosaic virus (WClMV) et le barley stripe mosaic virus (BSMV)
ayant une organisation génétique analogue requièrent également la présence des 3
protéines du triple gene block (TGB) pour assurer le mouvement de cellule à cellule. Si
de nombreuses études ont déjà été effectuées sur des virus nécessitant une seule protéine
virale pour le mouvement, par contre aucun mécanisme n'a encore été proposé pour
expliquer comment un complexe de 3 protéines pouvait intervenir dans ce phénomène.
Aussi, pour essayer de comprendre leur mode d'action, on peut envisager d'obtenir des
résultats précieux en utilisant le "two-hybrid system" qui permet de détecter in vivo des
interactions protéine-protéine (Hope & Struhl, 1986 ; Keegan et al, 1986 ; Ma &
Pasthne, 1987).
Conclusion______________________________________________________________________
143
L'étude de la protéine P14, un polypeptide riche en cystéine, nous a permis de
montrer qu'elle intervient d'une part dans la stimulation en cis de la réplication du RNA
2 et d'autre part dans la régulation en trans de la synthèse de la protéine de coque. Il faut
noter que d'autres virus disposent d'un gène analogue localisé en 3' d'un RNA
génomique et qui dirige la synthèse d'une protéine riche en cystéine : c'est le cas du
BSMV et du tobacco rattle virus (TRV) dont le gène de capside est aussi situé en 5' d'un
RNA génomique. Il est donc possible que ces différents virus aient adopté un système
de régulation analogue pour la synthèse de protéine de coque. Cette stratégie est
différente de celle des virus qui expriment la protéine de coque à partir d'un RNA
subgénomique ou encore à partir d'une polyprotéine.
Nous avons montré d'autre part que la protéine P14 avait des propriétés de
fixation des acides nucléiques et qu'elle renfermait probablement une structure en doigt
de zinc, structure qui semble être impliquée directement dans l'effet sur la réplication du
RNA 2 et (ou) sur la synthèse de la protéine de coque. Nous envisageons à présent de
déterminer si ces 2 phénomènes sont liés. Pour cela, dans un premier temps, nous avons
construit des mutants permettant de déstabiliser cette structure en "doigt de zinc" en
remplaçant les cystéines par des alanines. Les résultats montrent que ces mutations
entraînent une diminution du taux de réplication des RNA viraux dans les plantes
inoculées. Dans un second temps, les protéines correspondant aux différents mutants
alanine et possédant une cage histidine, seront exprimées dans un système
procaryotique, purifiées par chromatographie d'affinité sur une colonne Ni-NTA, puis
utilisées dans des expériences de Northwestern pour tester leur capacité à fixer ou non
les acides nucléiques.
Dans des expériences préliminaires visant à développer une stratégie de lutte
antivirale, nous avons pu montrer que la construction de RNA défectifs pouvait
déboucher sur une inhibition de la réplication virale. Cependant, dans l'optique d'une
lutte par transgénose efficace, il faut impérativement que ces RNA DI soient exprimés à
Conclusion______________________________________________________________________
144
un taux élevé car nous avons montré qu'un large excès de RNA DI était nécessaire pour
que l'inhibition soit effective.
Enfin, nous avons montré que la protéine P237 est en fait une polyprotéine
renfermant un domaine protéase qui entraîne l'apparition d'au moins 2 produits de
maturation de 160 et 60 kDa environ. Pour confirmer l'appartenance de la protéase à la
classe des protéases papaïn-like (Koonin & Dolja, 1993), l'analyse de la maturation in
vivo de la protéine P237 exprimée à partir d'un vecteur d'expression procaryotique ainsi
que l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques semblent être les 2 approches les plus
appropriées.
Conclusion______________________________________________________________________
145
MATERIEL ET METHODES
A-AMPLIFICATION, EXTRACTION ET MODIFICATIONS DE DNA
PLASMIDIQUE.
I-Souches bactériennes, vecteurs de clonage ou d'expression et milieux de culture.
1-Souches bactériennes
-BL21 (DE3) pLysS (Studier et al, 1990).
Ces bactéries ont été utilisées essentiellement pour la surexpression de protéines à
partir du vecteur pET décrit dans le paragraphe A-I-2. Leur déficience en protéases
permet la stabilisation de ces protéines.
Cette souche est lysogène pour le phage DE3, un dérivé du phage λ. Celui-ci
contient dans son génome le gène lac I codant pour le répresseur du promoteur de
l'opéron lactose ainsi que le gène de la T7 RNA Polymérase qui est placé sous la
dépendance du promoteur lac UV5 inductible par l'IPTG.
La souche dispose également du plasmide pLysS qui confère la résistance au
chloramphénicol. Ce plasmide code pour le lysozyme du phage T7 qui forme un
complexe avec la T7 RNA polymérase, inhibant ainsi une activité transcriptionnelle qui
serait due à une expression basale de la T7 RNA polymérase avant l'induction par
l'IPTG (Moffatt & Studier, 1987). Cependant, le faible taux de lyzozyme produit
n'interfère pas avec l'activité de la T7 RNA polymérase après induction.
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
147
-BW313 (dut- ung-) (Kunkel et al, 1987).
Cette souche est mutée dans le gène dut, ce qui entraîne l'apparition de
concentrations élevées de dUTP dans la cellule par manque de désoxyuridylase
fonctionnelle. Il en résulte une incorporation de façon statistique de dUTP à la place de
dTTP dans les chaînes de DNA néosynthétisées. Ces erreurs d'incorporation ne sont pas
réparées car l'enzyme N-glycosylase permettant la réparation n'est pas présente (ung -).
Ces souches ont été utilisées pour préparer les formes simple brin des plasmides
utilisés lors des expériences de mutagenèse dirigée.
-MC1022 (Casadaban & Cohen, 1980)
Ces bactéries sont couramment utilisées dans de nombreux laboratoires de
biologie moléculaire à cause de leur capacité à fournir beaucoup de DNA plasmidique.
Cette souche permet de faire une α-complémentation avec la partie N-terminale de la ß-
galactosidase exprimée par les vecteurs de type pUC.
-NM522 (Gough & Murray, 1983).
Cette souche est utilisée lors des amplifications de plasmides recombinants. Elle
possède l'épisome F' nécessaire à la conjugaison bactérienne et à l'infection par les
phages filamenteux (M13, f1). Ces bactéries sont mutées dans l'opéron lactose et
expriment une ß-galactosidase inactive qui peut être rendue fonctionnelle par α-
complémentation en utilisant un vecteur de clonage de type pUC ou pBS. En effet, ces
plasmides disposent de la partie complémentaire de la ß-galactosidase. Cette
complémentation intercistronique permet une sélection des clones recombinants par la
couleur en présence d'un substrat de la ß-galactosidase, le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-
ß-D-galactoside, ou X-gal.
-Sure cells (Greener, 1990) [Stratagene].
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
148
Cette souche n'a pas la capacité de réparer le DNA et de réaliser des
recombinaisons homologues. D'autre part, elle possède une faible activité
endonucléasique, ce qui permet d'obtenir un DNA de bonne qualité lors d'une extraction
par minipréparation. Elle dispose de l'épisome F' et est résistante à la tétracycline et à la
kanamycine.
Toutes ces souches bactériennes sont stockées à -80 °C en présence de 15%
glycérol.
2-Vecteurs
-Le Bluescribe [Stratagene]
Ce plasmide polyfonctionnel dérive du pUC 19 et possède, de part et d'autre de la
cassette de clonage, les séquences promotrices de la transcription des phages T7 et T3.
Ces promoteurs permettent de synthétiser in vitro, en présence de la RNA polymérase
du phage correspondant, des RNA ayant la polarité de l'un ou de l'autre des brins du
DNA cloné au niveau du polylinker. La linéarisation du vecteur en aval de l'insert
permet de limiter la transcription au seul DNA cloné.
pBS +/-3,2 kb
Amp r
col E1 ori
origine f1(+)
lac Z
MCS
T7
T3
Eco RI Sac I Kpn I Sma I Bam HI Xba I Sal I Pst I Sph I Hind III
Ce plasmide possède la région intergénique du bactériophage M13, responsable de
la formation du DNA simple brin et de son encapsidation. Une infection, par le phage
helper M13K07 modifié dans sa région intergénique, de bactéries contenant un plasmide
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
149
recombinant Bluescribe et un épisome nécessaire à la formation des F pilis, conduit à
une synthèse et une encapsidation préférentielle du DNA simple brin recombinant
(Vieira & Messing, 1987). Suivant l'orientation de la région intergénique sur le plasmide
(pBS+ ou pBS-), l'encapsidation de l'un ou l'autre des brins est possible. Par exemple, le
plasmide pBS+ permet l'encapsidation du brin possédant la phase codante du gène de la
ß-galactosidase.
Le phage helper M13K07 possède de plus le gène de résistance à la kanamycine et
confère une résistance à cet antibiotique aux bactéries qu'il infecte. En présence de
kanamycine, seules les bactéries infectées se multiplieront.
-Vecteurs pET (Studier et al, 1990).
pET 3d4,6 kb
Promoteur T7
Terminateur T7
Amp.
Nco IBam HI
r
Les plasmides pET (pour plasmid for expression by T7 RNA polymerase) sont
utilisés pour surexprimer des protéines dans E. coli. Ils confèrent la résistance à
l'ampicilline. Dans les plasmides pET 1 à 9, le gène d'intérêt est cloné en aval du
promoteur Φ10 (promoteur du gène 10 du phage T7) reconnu par la T7 RNA
polymérase.
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
150
-Le vecteur pMJD-82. (Dowson Day et al, 1994)
Ce vecteur a essentiellement été employé pour l'expression transitoire dans des
plantes et dans des protoplastes.
Afin d'optimiser l'efficacité d'expression du gène inséré au niveau de la cassette de
clonage, ce vecteur dispose des séquences "enhancer" du promoteur de la transcription
35S du CaMV suivi du promoteur 35S proprement dit. Ces 2 éléments assurent une
bonne transcription du gène d'intérêt. Vient ensuite la séquence Ω du TMV, une
séquence qui stimule la traduction des gènes clonés en aval. Enfin, ce vecteur dispose
également des séquences de terminaison de la transcription de la nopaline synthase.
pMJD 82
4,3 kb
enhancer 35 S promoteur 35 S
ž
terminateur nosr
Nco I Pst I Sal I Xba I Bam HI Sma I Kpn I Sac I
Amp
-Le vecteur pRT2-syn-LUC (Turner et al, 1994)
pRT2-syn-LUC5,4 kb
pUC 19
promoteur 35 S x2
cassette de clonage
luciférase
terminateur 35 S
Xho I Sal I Pst I Not I Spe I Eco RV Sac II Nco I
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
151
Comme le plasmide précédemment décrit, pRT2-syn-LUC dispose de la séquence
promotrice de la transcription du CaMV, le promoteur est placé en amont du gène
codant pour la luciférase. Enfin, en aval de ce gène, on trouve la séquence terminatrice
de la transcription du RNA 35S du CaMV.
3-Milieux.
Les bactéries sont cultivées à 37°C en milieu liquide ou solide LB (bactotryptone
1%, extraits de levure 0,5%, NaCl 0,5%). Il peut être rendu solide par addition d'agar
[Difco] 1 %. Ce milieu est autoclavé durant 30 min à 110°C puis légèrement refroidi et
additionné de 50 µg/ml d'ampicilline.
Lors des expériences de préparation de DNA plasmidique simple brin, les
bactéries sont cultivées dans le milieu 2xYT (bactotryptone 1,6%, extraits de levure 1%,
NaCl 0,5%).
II-Transformation des souches bactériennes et mise en culture.
1-Utilisation de Chlorure de Calcium.
a.Préparation des bactéries compétentes.
Un litre de milieu LB est ensemencé par une pré culture de 24 heures de bactéries
puis incubé à 37°C sous agitation jusqu'à ce que la culture atteigne une DO570nm de 0,6.
Elle est ensuite refroidie puis sédimentée par une centrifugation de 10 min à 3000 rpm.
Les culots sont mis en suspension dans 330 ml de tampon Tris-CaCl2 (Tris-HCl 0,1 mM
pH 7,5, CaCl2 50 mM), suspension qui est recentrifugée et dont le culot est repris par
200 ml de ce même tampon. Les bactéries sont gardées un jour à 4°C puis récoltées
comme précédemment et remises en suspension dans 40 ml de Tris-CaCl2, en présence
de glycérol 15%. Les bactéries ainsi rendues compétentes sont gardées à -20°C pendant
1h30 puis stockées à -80°C.
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
152
b.Transformation.
Après décongélation dans la glace, 50 µl de bactéries compétentes sont incubées à
0°C pendant 30 min en présence de 150 µl de CaCl2 50 mM, 7 µl de TEN x5 (Tris-HCl
50 mM pH 7,8, EDTA 5 mM, NaCl 500 mM) et 10 µl de mélange de ligation contenant
2 à 100 ng d'ADN plasmidique. Les bactéries sont ensuite soumises à un choc thermique
de 2 min à 42°C puis 1 ml de milieu LB est ajouté. Après 30 min d'incubation à 37°C,
les bactéries ainsi transformées sont étalées sur milieu LB gélosé additionné
d'ampicilline (50 µg/ml). Après une nuit à 37°C les colonies apparues sont analysées par
la technique décrite dans le paragraphe A-II-3.
2-Transformation par électroporation
a.Préparation des bactéries.
Un litre de milieu LB est ensemencé par une pré culture bactérienne. Les bactéries
sont multipliées sous agitation à 37°C jusqu'à ce que la culture atteigne une DO570nm de
0,2 à 0,4. La culture est refroidie puis sédimentée par centrifugation pendant 15 minutes
à 4000 rpm. Le culot est lavé par 500 ml d'eau bidistillée stérile froide, centrifugé 15
min à 4000 rpm, puis repris dans 20 ml de glycérol 10%. Finalement, les bactéries sont
récoltées comme précédemment, remises en suspension dans 2 à 3 ml de glycérol 10%
et congelées, par fractions aliquotes, à -20°C avant d'être stockées à -80°C .
b.Transformation.
La transformation est effectuée dans une cuve à électrodes espacées de 0,2 cm. Le
DNA plasmidique (2 à 100 ng) est mis en présence de 40 µl de suspension bactérienne
et incubé au froid environ 1 min. La cuve est placée dans l'électroporateur [BioRad] de
capacité 25 µF et de résistance 200 Ω et une impulsion électrique de 12,5 kV/cm est
appliquée avant d'ajouter 1 ml de milieu LB. Après 30 min d'incubation à 37°C les
bactéries sont étalées sur milieu LB gélosé, additionné d'ampicilline (50 µg/ml). Après
une nuit à 37°C les colonies obtenues sont analysées par les techniques décrites dans le
paragraphe A-II-3.
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
153
3-Caractérisation des clones par hybridation in situ.
Les clones obtenus sont analysés par hybridation in situ suivant le protocole décrit
par Maas en 1983. Les colonies sont repiquées sur milieu LB gélosé puis transférées sur
une membrane de nitrocellulose. Les bactéries sont lysées en plaçant la nitrocellulose
dans une solution SDS 10% pendant 3 min suivi d'un traitement dénaturant par une
seconde solution lysante 0,5 M NaOH et 1,5 M NaCl pendant 3 min. La nitrocellulose
est ensuite placée dans une solution neutralisante Tris-HCl M pH 7,5, NaCl 1,5 M et
fixée par une irradiation UV à 254 nm de 120 mJ. Le papier est pré hybridé durant 10
min dans 10 ml de tampon SSC x6 renfermant du Denhardts x1 (voir Tableau M-7) et
du DNA de sperme de hareng 0,1 mg/ml. L'hybridation est réalisée en rajoutant la sonde
radioactive constituée par un oligonucléotide phosphorylé en présence d'ATP(γ) 32P
(voir paragraphe A-V-4). Après 4 à 16 heures d'hybridation à la température de fusion
de l'oligonucléotide diminuée de 15°C, la nitrocellulose est lavée 3 fois dans du SSC x6
à cette même température afin d'éliminer l'excès de sonde radioactive. La membrane est
finalement séchée et placée sous autoradiographie.
III-Extraction et analyse de DNA plasmidique.
1-Minipréparation et maxipréparation
L'extraction plasmidique est réalisée selon la méthode de Maniatis et al (1982)
dont le protocole est résumé dans le Tableau M-1.
Le DNA plasmidique peut être purifié sur gradient de chlorure de césium en
présence de bromure d'éthidium (BET) (Radloff et al, 1967) dans les conditions
suivantes : le DNA plasmidique en suspension dans 4,3 ml de Tris-HCl 10 mM pH 7,5,
EDTA 1 mM est additionné de 4,7 g de chlorure de césium et de 50 µl de BET à
10 mg/ml. Le DNA est ensuite centrifugé 4h à 65000 rpm dans un rotor vertical
Beckman Vti 65 à 15°C (la centrifugation peut aussi se faire 16h à 55000 rpm). La
bande la plus dense, qui correspond au DNA plasmidique, est récoltée sous lumière UV,
diluée dans deux volumes d'eau et une partie du BET est éliminée en mélangeant cette
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
154
solution avec un volume d'isopropanol. Après agitation et une courte centrifugation, la
phase inférieure est récupérée et précipitée en présence d'alcool. Après sédimentation, le
DNA est redissous dans 400 µl de TNE puis est soumis à deux extractions phénoliques,
suivies d'un lavage à l'éther. Le DNA est ensuite précipité à l'éthanol et après lavage et
séchage, il est ajusté à une concentration voisine de 1 µg/µl après lecture de la
DO260nm.
Minipréparation Maxipréparation Composition des solutions
2ml 250 ml
1 min à 10 000 rpm 5 min à 5000 rpm
100 µl
culture bactérienne
centrifugation
solution I +
agitation5 ml
Tris HCl 25 mM pH 8 EDTA 10 mM
Glucose 50 mM
solution II 200 µl 10 ml NaOH 200 mM SDS 1 %
solution III + agitation 150 µl 7,5 ml Acétate de K 3 M
Acide acétique 5 M
Centrifugation 2 min à 10 000 rpm 10 min à 4800 rpm
filtration sur Miracloth
précipitation avec 0,6 vol d'isopropanol
culot repris dans 500 µl de tampon TE
Tris HCl 10 mM EDTA 1 mM
centrifugation 5min à 10 000 rpm
précipitation par 2 vol d'éthanol
centrifugation 10 min à 10 000 rpm
lavage à l'éthanol 70 %
reprise du culot dans du tampon TE
150 µl4 ml
éventuelle purification sur gradient de Chlorure de
césium
Agitation douce et incubation pendant 1 min à température ambiante
Extraction au phénol-chloroforme (v/v)
Tableau M-1 : Méthode d'extraction de DNA plasmidique
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
155
2-Analyse.
a-Sur gel d'agarose.
Ces gels sont utilisés de manière analytique pour fractionner les fragments de
DNA et pour déterminer leur taille. Le pourcentage d'agarose varie de 0,8 à 4% suivant
la taille des fragments à séparer. L'électrophorèse a lieu en présence de tampon Tris-
borate 100 mM pH 8,3 EDTA 2 mM (encore appelé TBE x1). Avant leur dépôt sur gel,
les échantillons sont additionnés de tampon de charge encore appelé Blue Juice (0,04%
LMP. agarose, Tris 50 mM pH 7,5 ; EDTA 100 mM pH 7,5 ; 10% glycérol ; 0,05%
Bleu de Bromophénol).
b-Sur gel de polyacrylamide après séquençage.
Ces gels sont utilisés pour séparer les produits obtenus lors des réactions de
séquençage de DNA ou de RNA. Le rapport acrylamide-bisacrylamide est de 19 pour 1
et ces gels sont polymérisés en présence d'urée 7 M. La concentration de ces gels est
généralement de 6% à 8% et leur composition est décrite dans le Tableau M-2.
pourcentage
acrylamide
bisacrylamide
urée (8,3 M final
eau distillée qsp
TBE x10
filtration millipore 0,22 µm
persulfate d'ammonium 10 %
TEMED
6 %
3,42 g
0,18 g
30 g
54 ml
6 ml
500 µl
50 µl
Tableau M-2 : Composition des gels de séquence
Les fragments de DNA sont chauffés 2 min à 90°C en présence de formamide
80%, TBE x1 et des deux indicateurs de migration (à savoir le bleu de xylène cyanol et
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
156
le bleu de bromophénol) avant d'être refroidis rapidement dans la glace et chargés sur
gel. La migration s'effectue à 55 W en présence de tampon TBE x1.
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
157
Figure M-1 : Principe de la mutagénèse dirigée selon Kunkel.
Bactéries BW313 dut , ung --
U
UU
U
U
Infection par des phages M13 KO7
U
U
U
U
U
U
Elongation
Transformation de Sure cells
U
U
U
Hybridation avec un oligonucléotide mutagène
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
158
IV-Préparation de DNA plasmidique simple brin uridylé et mutagénèse dirigée
selon la méthode de Kunkel (Figure M-1).
1-Culture.
200µl d'une culture bactérienne BW313 contenant le plasmide recombinant sont
utilisés pour inoculer 2 ml de milieu 2xYT additionné de 100µg/ml d'ampicilline et
d'uridine à 25 µg/ml. Quand la culture entre en phase exponentielle de croissance,
(DO550nm~0,5), 10 µl de phage helper M13K07 à 1011 phages/ml sont ajoutés à la
culture placée sous forte agitation pendant 1 heure à 37°C. De cette culture, on prélève
40µl pour ensemencer 10 ml de milieu 2xYT supplémenté d'ampicilline (100 µg/ml), de
kanamycine (70 µg/ml) et d'uridine (0,25 µg/ml). La culture est ensuite placée une nuit à
37°C sous forte agitation.
2-Purification du DNA simple brin.
Les bactéries sont éliminées par deux centrifugations successives à 15000 rpm. Le
DNA simple brin encapsidé est précipité durant 15 min à température ambiante en
présence d'une solution de PEG 6000 à 5%, NaCl 0,625 M final puis il est sédimenté par
une centrifugation de 15 min à 15000 rpm. Le DNA est remis en suspension dans 200 µl
de tampon TE (Tris-HCl 10 mM pH 7,5 ; EDTA 1 mM) puis soumis à deux extractions
phénoliques suivies d'un lavage à l'éther. Le DNA simple brin est alors précipité par
deux volumes d'éthanol en présence d'acétate de sodium 0,3 M. Après centrifugation, le
culot est lavé, séché et repris dans 20 µl de TE. La concentration en DNA simple brin
est déterminée par mesure de la densité optique à 260 nm puis ajustée à 1 µg/µl.
3-Mutagénèse dirigée en utilisant des oligonucléotides modifiés (Zoller & Smith,
1982).
Cette méthode permet d'introduire des modifications très précises sur une
molécule de DNA ; ces modifications peuvent être des délétions, des insertions ou des
remplacements de nucléotides. Cette technique nécessite du DNA simple brin circulaire
dont l'obtention a été décrite au paragraphe précédent.
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
159
La première étape de la mutagenèse passe par la synthèse d'un DNA hétéroduplex
circulaire. Pour cela, nous avons utilisé les conditions suivantes :
oligonucléotide (20 à 30 nt) 10 pmolesDNA simple brin uridylé 5 pmolestampon d'hybridation x10 1 µl
Tris HCl pH 7,5 200 mMMgCl2 200 mMNaCl 500 mMDTT 10 mM
H2O qsp 10 µl
5 min à 37 °C
Mix d'hybridation 10 µltampon d'élongation x10 1 µl
Tris HCl pH 7,5 200 mMMgCl2 100 mMDTT 100 mM
dNTP 10 mM 1 µlATP 10 mM 1 µlT4 DNA ligase 1 unitéT4 DNA polymérase 3 unitésH2O qsp 20 µl
2 heures à 37 °C
Le milieu de mutagénèse est utilisé tel quel pour transformer par électroporation
des bactéries Sure cells. Ces bactéries vont amplifier préférentiellement le brin non
uridylé de l'hétéroduplex contenant la mutation introduite par l'amorce. Les colonies
obtenues sont ensuite analysées par la méthode d'hybridation in situ décrite au
paragraphe A-II-3 en utilisant comme sonde l'oligonucléotide mutagénique
radiomarqué.
V-Techniques de sous clonage par l'utilisation d'enzymes.
1-Digestion enzymatique.
Les enzymes de restriction sont des enzymes bactériennes qui reconnaissent
spécifiquement des séquences particulières sur le DNA. Elles coupent au niveau ou à
proximité du site de reconnaissance en générant des extrémités franches ou cohésives 5'
ou 3' sortantes.
Pour digérer 1 µg de DNA nous avons utilisé les conditions suivantes :
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
160
DNA à 1 µg/µl 1 µlTampon x10 spécifique de l'enzyme 2 µlEnzyme à 1 unité/µl 1 µlH2O qsp 20 µl
La réaction s'effectue en général pendant 1h à 37°C. Les résultats de la digestion
sont visualisés sur gel d'agarose et il est possible d'extraire les fragments intéressants en
réalisant une électroélution (paragraphe A-VII-1) ou en utilisant de l'agarose à bas point
de fusion (LMP) (paragraphe A-VII-2). Lors de digestions de solutions de DNA
contenant des RNA totaux bactériens ou du RNA entraîneur, une addition de RNase A à
10 µg/ml est préférable pour, par la suite, pouvoir visualiser de manière correcte le
produit des digestions.
2-Obtention d'extrémités franches.
Il est possible que le vecteur et l'insert utilisé aient des extrémités incompatibles
pour la réaction de ligation. Il est alors nécessaire de les rendre franches soit en ajoutant
des nucléotides complémentaires à une extrémité 5' sortante, soit en délétant les
nucléotides excédentaires d'une extrémité 3' sortante.
a-Cas d'une extrémité 5' sortante.
L'enzyme utilisée est le fragment de Klenow, obtenu après clivage protéolytique
de la DNA polymérase I d'E. coli par la subtilisine (Jackobsen et al, 1974). Les activités
polymérasique 5'-3' et exonucléasique 3'-5' sont conservées mais l'activité
exonucléasique 5'-3' a été éliminée (Derbyshire et al, 1988). Cette enzyme est aussi
couramment utilisée dans les expériences de clonage pour synthétiser le brin
complémentaire du cDNA. Les conditions que nous avons utilisées sont décrites ci-
dessous :DNA 1 µgTampon x10 5 µl
Tris-HCl 200 mM pH 7,5MgCl2 100 mMDTT 10 mMNaCl 500 mM
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
161
dNTP 2 mM 1 µlEnzyme Klenow à 1 unité / µl 1 µlH2O qsp 50 µl
L'incubation se fait pendant 30 min à 37°C lorsque l'on veut remplir un site de
restriction.
L'enzyme fonctionne dans une large gamme de températures de 15 à 37°C et dans les
tampons habituels d'enzymes de restriction.
b-Cas d'une extrémité 3' sortante.
L'enzyme utilisée est la T4 DNA polymérase qui possède une activité 3'-5'
exonucléasique en absence de désoxyribonucléotides triphosphates et une activité 5'-3'
polymérase en présence de désoxyribonucléotides triphosphates (Lehman, 1974). Les
conditions d'utilisation de cette enzyme sont résumées ci-dessous :
DNA 1 µgTampon x10 1 µl
Tris-acétate 330 mM pH 7,9Mg-acétate 100 mMK-acétate 660 mMDTT 5 mM
H20 qsp 10 µlT4 DNA Pol 3 u/µl 1 µl
L'incubation est effectuée 5 min à 20°C puis 1 µl d'une solution 10 mM dNTP est ajouté
et la réaction poursuivie pendant 10 min à 37°C afin de déplacer l'équilibre dans le sens
de l'incorporation. Il en résulte une création d'extrémités franches.
3-Déphosphorylation.
Cette technique permet de favoriser l'insertion d'un fragment de DNA en
empêchant le vecteur de se refermer sur lui-même lors de l'étape de ligation. L'enzyme,
la phosphatase alcaline d'intestin de veau, élimine les phosphates 5' et 3' terminaux. Elle
est thermostable et ne présente pas de spécificité étroite de tampon d'utilisation, ce qui
rend son utilisation possible en même temps que l'enzyme de restriction. Dans les
conditions de déphosphorylation, l'enzyme est incubée 1 h à 37°C en présence de
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
162
l'enzyme de restriction puis 1h à 55°C à raison de 0,05 unités par µg de DNA. L'enzyme
est éliminée par extraction phénolique.
4-Phosphorylation.
Cette étape permet d'ajouter un phosphate (radioactif ou non) aux extrémités 5' de
l'insert. Elle est indispensable pour que la ligation ait lieu en présence d'un vecteur
déphosphorylé. L'enzyme, la T4 polynucléotide kinase, utilise l'ATP comme cosubstrat.
DNA 1 µgTampon x10 5 µl
Tris HCl 700 mM pH 7,5MgCl2 100 mMDTT 50 mM
ATP 5 mMT4 polynucléotide kinase 4 unitésH2O qsp 50 µl
La réaction se fait à 37°C pendant 30 min et est stoppée par extraction phénolique.
Lorsqu'on désire préparer des sondes radioactives en utilisant des
oligonucléotides, 10 ng sont marqués par 10 µCi d'ATP γ32P en présence de 10 unités
d'enzyme dans un volume réactionnel de 10 µl pendant 30 min à 37°C avant d'être
utilisés tels quels dans les expériences d'hybridation in situ.
5-Ligation.
L'enzyme, la T4 DNA ligase, catalyse la formation d'une liaison phosphodiester
entre les extrémités 3' OH et 5' P de molécules de DNA.
Les conditions d'utilisation sont les suivantes :
Insert 100 ngVecteur 100 ngBSA à 2 mg/ml 1 µlATP 30 mM 1 µlTampon x10 2 µl
Tris-HCl 200 mM pH 7,5MgCl2 200 mMDTT 100 mM
Ligase à 1 unité / µl 1 µl
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
163
H2O qsp 20 µl
Si l'insert et le vecteur possèdent des extrémités cohésives, la réaction est réalisée
pendant 4 h à 16°C ; si les extrémités sont franches, la réaction est faite pendant 16 h à
4°C.
VI-Amplification d'un fragment de DNA par la technique de la PCR.
1-Principe de la méthode et conditions générales.
Cette technique décrite depuis 1985 (Saiki et al, 1985 ; Mullis et al, 1986 ; Mullis
& Faloona, 1987) et améliorée en 1988 (Saiki et al, 1988) permet l'amplification in vitro
d'un fragment de DNA de manière exponentielle grâce à l'utilisation de la DNA
polymérase thermostable isolée de Thermus aquaticus (Chien et al, 1976). Elle nécessite
l'utilisation de deux amorces oligodésoxyribonucléotidiques flanquant la séquence à
amplifier. La réaction se déroule sous forme de plusieurs cycles incluant une étape de
dénaturation à 95°C, une étape d'hybridation des amorces sur l'un et l'autre des brins
matrice à une température proche de leur température de fusion suivie d'une élongation à
72°C dont la durée dépend de la taille du fragment à amplifier.
Les conditions générales d'amplification en utilisant la Taq DNA polymérase
commercialisée par Eurogentec sont les suivantes :
DNA (0,1 ng) 10 µlOligonucléotide #1 40 ngOligonucléotide #2 40 ngTampon X10 10 µl
Tris HCl pH 8,8 750 mM(NH4)2SO4 200 mMMgCl2 15mMTween 20 O,1 %
dNTP 10 mM 1 µlBSA 10 mg/ml 1 µlH2O qsp 100 µlTaq DNA Polymérase 1 unités/µl 1 µl
Les tubes sont recouverts d'huile de paraffine dans le but d'éviter toute évaporation
et placés dans le "thermocycler" (Perkin-Elmer Cetus) pour une série de 25 à 30 cycles.
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
164
Ces cycles sont constitués d'une suite d'incubations successives de 30 sec à 95°C
correspondant à l'étape de dénaturation, de 30 sec à Tm -1°C pour l'hybridation des
amorces et de N sec à 72°C pour l'élongation. La température d'hybridation d'une
amorce est donnée par la relation suivante: Tm = 69,3+0,41x(%GC)-(650/taille amorce).
Le temps d'élongation est déterminé en utilisant un temps moyen de 30 sec pour
amplifier un fragment de 500 pb.
2-Cas particulier du RNA 2 du BNYVV.
Dans le cas d'amplification de fragment de DNA de grande taille comme le produit
de ligation du RNA 2, l'utilisation de DMSO à une concentration de 6% permet de
minimiser les structures secondaires et ainsi d'optimiser la PCR. D'autre part, nous
avons utilisé une DNA polymérase plus stable, la Tth DNA polymérase [Eurogentec].
DMSO 6 µlH2O 72 µlDNA 0,2 ng 5 µloligonucléotide 1 2µgoligonucléotide 2 2µgtampon x10 10 µldNTP 10 mM 3 µlBSA 10 mg/ml 2 µlTth DNA polymérase 1 µl
94 °C pendant 30 sec50 °C pendant 30 sec72 °C pendant 6 min avec un incrément de 5 sec par cycle
Le produit PCR est ensuite soumis à 2 extractions phénol/chloroforme puis
précipité et lavé à l'éthanol. Le DNA peut ensuite servir de matrice pour l'obtention de
transcrits infectieux en utilisant le protocole décrit dans le Tableau M-5.
VII-Purification sur gel d'agarose d'un fragment de DNA obtenu par digestion
enzymatique ou par PCR.
1-Par électroélution.
La bande visualisée sous lumière UV est découpée du gel puis placée dans un
boudin à dialyse en présence du tampon de migration TBE x1. Le boudin à dialyse est
ensuite soumis à un champ électrique de 65 mA pendant 30 à 45 min puis à une
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
165
inversion de polarité de 30 secondes pour décrocher les éventuels fragments présents sur
la membrane à dialyser. Le tampon contenant le DNA électroélué est récupéré, soumis à
une extraction phénolique suivie d'une extraction au phénol-chloroforme et d'une
précipitation à l'éthanol en présence ou non d'un entraîneur (tRNA ou glycogène).
2-Par extraction d'un gel LMP.
Des fragments de DNA peuvent être facilement extraits de gels LMP présentant la
particularité de fondre dès 65°C. Les bandes de DNA sont découpées du gel après
visualisation sous UV puis chauffées 5 min à 65°C en présence de 200 µl de Tris-HCl
200 mM pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 200 mM. Le DNA est extrait comme
précédemment.
VIII-Séquençage selon la méthode de Sanger, modifiée pour la T7 DNA polymérase.
1-Séquençage d'un DNA plasmidique.
C'est une méthode enzymatique basée sur la synthèse interrompue de molécules
plus ou moins longues de DNA. La T7 DNA polymérase est capable d'allonger
l'extrémité 3' d'une amorce oligodésoxyribonucléotidique hybridée à un DNA simple
brin en présence des quatre désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP). Elle peut aussi
incorporer des didésoxyribonucléotides triphosphates (ddNTP) à la place des dNTP. Ces
ddNTP n'ayant pas de groupement hydroxyl en 3' du ribose ne permettent plus la
formation de la liaison phosphodiester et il s'en suit un blocage de l'élongation de
manière statistique. Le séquençage est réalisé en deux étapes. La première consiste en
un marquage des molécules néosynthétisées et la seconde permet l'élongation des
molécules marquées.
Le DNA double brin à séquencer provient soit de minipréparations de plasmides
soit de DNA plasmidique purifié par gradient de chlorure de césium. Le DNA est dans
un premier temps dénaturé et débarrassé des éventuels RNA par traitement à la soude
0,2 M finale pendant 5 min. Dans un second temps, il est passé sur une colonne de
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
166
sépharose 6C-LB [Pharmacia] (pré-équilibrée avec du tampon Tris 10 mM pH 7 ;
EDTA 1 mM) pour éliminer les molécules de petites tailles. La matrice de DNA simple
brin est ensuite hybridée à l'amorce oligodésoxyribonucléotidique avant de réaliser les
étapes de marquage et d'élongation comme décrit dans le tableau M-3.
Dénaturation
Hybridation
Marquage
Elongation
incubation 5 min. à température ambiante
DNA dénaturé 7 µl
Tampon d'hybridation x5 2 µl
Amorce 20 ng/µl 1 µl
DNA (5 µg)
NaOH 10 N
80 µl
2 µl
incubation 5 min à 37°C
incubation 5 min à 0°C
incubation 10 min à température ambiante
Tris-HCl 200 mM pH7,5 MgCl2 100 m NaCl 250 mM
Mélange d'hybridation
DTT 0,1 M
α S- dATP 10 µCi/µl 1 Ci/mole
dGTP, dTTP, dCTP (1,5 µM chaque)
T7 DNA polymérase 2 unités/µl
10 µl
1 µl
2 µl
0,5 µl
2 µl
Mélange de marquage 3,5 µl
Mélange de terminaison 2,5 µldATP dTTP dGTP dCTP
80 µM 80 µM 80 µM 80 µM
NaCl 50 mM8 µMun ddNTP
Arrêt de la réaction
purification et neutralisation par gel filtration sur colonne de Sepharose 6 C-LB (équilibrée en tampon Tris-HCl 10 mM pH 7,
EDTA 1mM)
par 4 µl de solution dénaturante (formamide 95%, EDTA 20 mM, xylène cyanol 0,05%, bleu de bromophénol 0,05%).
Les échantillons sont chauffés 2 min à 95°C avant d'être déposés sur gel de polyacrylamide dénaturant.
35
Tableau M-3: Protocole de séquençage
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
167
2-Séquençage d'un produit PCR.
Le produit PCR obtenu suivant le protocole décrit dans le paragraphe A-VI-1 est
dans un premier temps purifié sur un gel d'agarose LMP (voir paragraphe A-VII-2).
Après extraction, le culot est repris dans 7 µl d'eau. Le DNA est mélangé avec 5 ng de
l'oligonucléotide qui va permettre le séquençage, chauffé pendant 5 min à 95 °C,
chauffage qui est suivi d'une congélation instantanée dans de l'azote liquide. 2 µl de
tampon d'hybridation (Tableau M-3) sont ajoutés et le tout est laissé à décongeler
lentement à température ambiante. Après cette première étape d'hybridation, la réaction
de séquençage continue comme décrit dans le Tableau M-3 avec le marquage.
IX-Transcription in vitro.
1-Obtention de transcrits infectieux du BNYVV.
La transcription est réalisée en présence de m7GpppG [Pharmacia] encore appelé
cap et permet donc d'obtenir des transcrits néosynthétisés avec un groupement
m7GpppG à leur extrémité 5'. Au premier temps de la transcription, la concentration en
rGTP (0,625 mM) est faible afin de favoriser l'incorporation de cap (10 mM) en 5'.
Après 30 min de réaction, on rajoute une quantité de rGTP 10 mM analogue aux autres
rNTP permettant ainsi l'allongement des chaînes néosynthétisées. La transcription se fait
à 37°C.
Les conditions que nous avons utilisées pour la synthèse de RNA coiffés ou non à
leur extrémité 5' sont résumées dans le Tableau M-4.
En fin de réaction, l'efficacité de la transcription peut être vérifiée de différentes
manières. Les transcrits peuvent être visualisés directement en conditions natives, par
électrophorèse en gel d'agarose 1% puis coloration au BET. Ils peuvent également être
analysés en conditions dénaturantes par la technique d'hybridation moléculaire décrite
au paragraphe A-X. Enfin, l'analyse peut se faire par coloration au bleu d'orthotoluidine
0,05% dans de l'acétate de Na 1 mM, acétate de Mg 0,1 mM pH 5,5 et décoloration dans
l'acide acétique 1%.
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
168
Finalement, les propriétés biologiques des transcrits sont étudiées soit par
inoculation de protoplastes de C. quinoa dans les conditions décrites au paragraphe C-
IV-6 soit par inoculation mécanique de feuilles de C. quinoa avec 20 µl du milieu de
transcription dilué à 200 µl final avec de l'eau bidistillée stérile et en présence de
macaloïd 0,5%. Chaque feuille est inoculée avec 50 µl de ce mélange.
Tris-HCl pH 8MgCl2DTTNaClBSASpermidine
200 mM50 mM50 mM50 mM
250 µg/ml20 mM
Tampon x5 (BRL)
Sondes ribonucléiques
3 µl
15 mM
10 mM
10 mM
10 mM
10 mM
0,625 mM
0,5 mM
50 unités/µl
20 µCi/µl
RNasine
DNA linéarisé
RNA polymérase
H2O
ATP
GTP
CTP
UTP
UTP
GTP
m7G 5'PPP G5'
(α P) UTP32
40 unités/µl
1 mg/ml 1 µl
qsp 15 µl
1 µl
1 µl
1 µl
1 µl
2 µl
1 µl
Incubation à 37°C 1 heure
GTP 10 mM
Incubation à 37°C
DNase RNase free 10 unités/µl
- Cap
60 µl
100 µl
30 µl
30 µl
30 µl
30 µl
4 µl
qsp 300 µl
10 µl
2 heures
2 µl 1 µl
+ Cap
5 µl
1 µl
qsp 25 µl
1 µl
1 µl
1 µl
1 µl
1 µl
1 µl
1 µl
30 min
1 µl
2 heures
1 µl+/-
Incubation à 37°C 30 min
1 µl
Tableau M-4 : Conditions de transcriptions
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
169
2-Synthèse de sondes ribonucléiques
Les sondes ribonucléiques sont obtenues par transcription in vitro des fragments
de cDNA clonés dans le vecteur Bluescribe en présence d'UTP (α32P) suivant le
protocole décrit dans le Tableau M-4. Le traitement du milieu de transcription à la
DNase permet d'éliminer le DNA matrice afin qu'il n'interfère pas lors de l'hybridation.
X-Analyse des transcrits par hybridation in situ
1-Séparation des RNA par migration sur gel d'agarose en conditions
dénaturantes.
Cette méthode est, elle aussi, basée sur la détection de RNA par hybridation au
moyen de sondes spécifiques radioactives, après séparation des RNA par électrophorèse
et transfert sur nitrocellulose. Elle peut être appliquée à des RNA totaux de plantes
infectées et permet également d'analyser la qualité des produits de transcription utilisés
pour les inoculations lors des tests biologiques. Les RNA sont dénaturés et analysés par
électrophorèse en gel d'agarose dans les conditions décrites dans les tableaux M-5 et M-
6 (Rave et al, 1979).
Fondre l'agarose puis équilibrer la température à 50°C
Agarose
Hepes EDTA 10 mM
200 mMpH 7, 8
H2O
Formaldéhyde 36%
1, 7 g
17 ml
125 ml
28 ml
0, 3 g
3 ml
22 ml
4.86 ml
Tableau M-5: Composition des gels d'agarose dénaturants
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
170
Les échantillons sont dénaturés durant 5 min à 65°C avant d'être déposés sur gel
en présence de 5 µl de tampon de charge composé de glycérol 50% et de bleu de
bromophénol. La migration est effectuée dans du tampon Hepes 20 mM pH 8, EDTA
1 mM. Les analyses sont effectuées en général sur 20 ng de transcrits ou 300 ng de RNA
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
171
Figure M-2: Schématisation de la pyramide de transfert salin utilisée lors desexpériences d'hybridation moléculaire par la technique du Northern Blot.
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
172
totaux de plante. Le transfert des RNA sur feuille de nitrocellulose (Schleicher &
Schüell) est réalisé par la méthode du transfert salin dans du tampon SSC x20 durant 16
h (voir figure M-2). Les acides nucléiques sont ensuite fixés irréversiblement sur la
nitrocellulose par une irradiation de 120 mJ à 254 nm (UV).
RNA
Formamide
Formaldéhyde 36%
EDTA 10 mM200 mMHepes pH 7, 8
H2O qsp
Chauffage 5 min à 65°C
Glycérol 50%, bleu de bromophénol 0, 05%
0, 5 µg
2, 5 µl
12, 5 µl
4 µl
25 µl
5 µl
Tableau M-6: Conditions de dénaturation des RNA avant dépôt sur gel
2-Hybridation avec des sondes spécifiques radioactives.
a-Préparation des sondes. (voir Tableau M-4)
b-Préhybridation.
La feuille de nitrocellulose préhydratée est mise à préhybrider pendant 2 h à 60°C
dans le tampon dont la composition est donnée dans le tableau M-7.
c-Hybridation.
Au milieu de préhybridation sont ajoutées 5 µl de sonde ribonucléique hautement
radioactive et l'hybridation est effectuée pendant 16 h à 55°C sous agitation.
d-Lavages et autoradiographie.
Après 16 h d'incubation et afin d'éliminer toutes les hybridations aspécifiques avec
les RNA ribosomiques de plante, la feuille de nitrocellulose est lavée deux fois à 65°C
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
173
avec une solution de SSC x2, SDS 0,1% puis deux fois à 65°C avec du SSC x0,2, SDS
0,1%. Finalement, la feuille de nitrocellulose séchée est placée sous autoradiographie.
1 M
Formamide 5 ml 50%
SSC x20* 2,5 ml 5 x
NaH PO /Na HPO pH 6,5 0, 5 ml 50 mMSDS 20% 50 µl 0,1%
**Denhardts x100 0,8 ml 8 x
RNA total de levure 25 mg/ml 200 µl 500 µg/mlDNA de sperme de hareng 2,5 mg/ml 1 ml 250 µg/ml
Volume Concentration finaleComposition du tampon de préhybridation
Composition du tampon d'hybridation
Tampon de préhybridation 10 ml
Sonde ribonucléotidique 5 µl
* SSC x20 : Citrate de sodium 0,3 M pH 7; NaCl 3M. ** Denhardts x100 : BSA 2% ; Ficoll 2% ; Polyvinylpyrrolidone 2%.
2 42 4
Tableau M-7 : Composition des tampons de préhybridation et d'hybridation
XI-Analyse de la descendance par réverse transcription.
Afin d'analyser la descendance de RNA transcrits inoculés à des plantes, nous
avons, dans un premier temps, synthétisé le cDNA correspondant. Dans un second
temps, ce cDNA est amplifié par la réaction de PCR (paragraphe A-VI) et finalement
séquencé comme cela a été décrit dans le paragraphe A-VIII-2. Pour obtenir le cDNA,
nous avons utilisé la réverse transcriptase extraite du virus de la leucémie murine de
Moloney commercialisée par Promega dans les conditions suivantes :
H2O 16 µlOligonucléotide complémentaire 5 ngTampon RT x5 5 µl
Tris HCl pH 7,5 250 mMDTT 50 mMKCl 375 mMMgCl2 15 mM
RNA total (0,2 mg/ml) 1 µl
15 min à 37 °C
DTT 0,1 M 1 µldNTP 10 mM 1µlRT MoMuLV (200 u/µl) 1 µl
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
174
1 heure à 37 °C
B-EXPRESSION IN VIVO OU TRADUCTION IN VITRO DES PROTEINES DE
BNYVV
I-Expression de protéines dans un système bactérien (Studier et al, 1990).
Une pré culture de 2 ml de bactéries BL 21 pLys S est utilisée pour ensemencer
500 ml de LB additionné d'ampicilline à 50 µg/ml et de chloramphénicol à 34 µg/ml.
Les bactéries sont mises à croître à 28 °C jusqu'à ce que la culture atteigne une DO550nm
de 0,6 à 1. A ce stade, la synthèse de T7 RNA polymérase est induite par de l'IPTG à une
concentration de 0,2 g/l. Cette induction va se faire pendant 2 heures à 28 °C, période
durant laquelle il y aura une synthèse massive de la protéine désirée. Les bactéries sont
ensuite sédimentées par une centrifugation de 15 min à 6000 rpm. Le culot est repris
dans un tampon SB (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl), puis, à 2 reprises, congelé dans
de l'azote liquide et décongelé à 37 °C, cette dernière étape ayant pour but de lyser les
bactéries. Le DNA libéré est fragmenté par sonication puis éliminé par centrifugation à
4800 rpm pendant 15 min. Le surnageant récupéré est analysé sur gel de polyacrylamide
en conditions dénaturantes comme décrit dans le paragraphe B-IV.
II-Purification par chromatographie d'affinité sur une colonne ZCAA (Zinc Chelate
Affinity Adsorbent).
La colonne ZCAA [Boehringer] est composée d'une matrice d'agarose sur
laquelle sont fixés des ions Zinc (0,1 mg de Zn2+/ml) . Ces ions sont chélatés par un
ligand d'acide iminoacétique lui même lié par un bras de 4 carbones au gel d'agarose
(Porath et al, 1975)
Agarose-O-CH -CHOH-CH -O-(CH ) -O-CH -CH-CH -N
OH42
CH -COOH2
2222CH -COOH2
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
175
Les protéines déposées sur la matrice et qui ont une affinité pour le zinc restent
fixées sur la colonne, tandis que les autres passent dans le volume mort. Les protéines
ainsi fixées peuvent ensuite être éluées par des lavages avec des tampons ajustés à des
pH variables (de 8 à 5 par exemple) ou des concentrations en sels variables. Les
protéines récupérées sont finalement analysées comme décrit dans le paragraphe B-IV.
III-Traduction in vitro dans un système acellulaire de réticulocytes de lapins.
1-Préparation du lysat de réticulocytes de lapins.
Le bruit de fond traductionnel dû aux messagers endogènes peut être limité en
traitant le lysat à la nucléase micrococale (Pelham & Jackson, 1976). Cette enzyme dont
l'action est dépendante des ions calcium peut ensuite être spécifiquement inhibée par
l'addition d'EGTA en excès. Le lysat est ensuite supplémenté en tRNA et en
aminoacides suivant les conditions résumées dans le Tableau M-8.
Hémine
Créatine kinase
Créatine phosphate
Hepes-KOH pH 7, 5
DTT
CaCl
Nucléase micrococale
Incubation 15 min à 20°C
EGTA-KOH
tRNA foie de veau
Amino acides sauf Met
1 mM
10 mg/ml
20 mM
500 mM
200 mM
100 mM
1 mg/ml
500 mM
10 mg/ml
1 mM
35
30
90
55
20
14
14
12
15
190
20 µM
0,17 mg/ml
10 mM
15 mM
2,2 mM
0,8 mM
8 µg/ml
3,25 mM
83 µg/ml
105 µM
ComposéQuantité ajoutée
(µl) à 1 ml de lysatconcentration finale
dans le milieu de traduction
2
Tableau M-8 : Préparation de lysat de réticulocytes de lapins.
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
176
Le lysat est réparti en fractions de 100 µl immédiatement congelées dans un bain
de carboglace/éthanol et conservées dans de l'azote liquide.
2-Traduction des produits de transcriptions.
Il reste à ajouter au lysat traité des sels de magnésium et de potassium, la
méthionine radioactive et le RNA messager. Différentes concentrations d'acétate de
magnésium et de potassium ont été testées afin d'optimiser la traduction des RNA du
BNYVV. Les conditions retenues sont les suivantes :
Lysat 100 µlAcétate de Mg 1 mM finalAcétate de K 1,6 mM finalMéthionine S35 (10 mCi/ml) 0,5 mCi/ml final
(1500 Ci/mmol)
9,5 µl de ce mélange de traduction sont additionnés d'1 µl de RNA (0,5 à 1 mg/ml) et
incubés une heure ou plus (suivant la taille de la protéine à synthétiser) à 30°C. Les
produits de traduction sont ensuite analysés sur gel de polyacrylamide en conditions
dénaturantes (voir paragraphe B-IV).
IV-Analyse.
1-Par électrophorèse en conditions dénaturantes sur gel de polyacrylamide.
Les protéines obtenues par traduction in vitro ou par purification à partir de
cultures bactériennes sont analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en
présence de SDS. Pour cela on utilise un gel qui fait intervenir un système de tampons
discontinus décrit par Laemmli (1970) et qui permet de concentrer les échantillons en
une bande très fine dans un "gel de concentration" puis de séparer les protéines selon
leur poids moléculaire dans un "gel de séparation". Le tableau M-9 donne la
composition des gels.
Avant dépôt, les protéines sont dénaturées par addition d'un volume égal de
tampon de charge x2 (Tris HCl pH 6,8 125 mM, SDS 5 %, Glycérol 20 %, ß
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
177
mercaptoéthanol 5 % et bleu de bromophénol 0,05 %) et chauffés à 90 °C pendant cinq
minutes. Après une électrophorèse dans un tampon Tris HCl pH 8,3 25 mM ; Glycine
192 mM ; SDS 0,1 % à 100 volts (20 à 30 mA), le gel est fixé dans un bain d'éthanol à
25% et d'acide acétique à 10%. Les protéines sont ensuite révélées au bleu de
Coomassie (0,5 g/l dans le mélange de fixation), le gel est décoloré par de l'acide
acétique à 10% puis séché sous vide à 80 °C et enfin placé sous autoradiographie.
composantsgel de
concentration
gel de résolution
Tris HCl pH 6,8
Tris HCl pH 8,8
TEMED
persulfate 25 %
8 % 10 % 12,5 % 15 %11 %
8 µl 10 µl
40 µl 50 µl
Acrylamide
bisacrylamide
8 % 10 % 11 % 12,5 % 15 %4 %
0,1 % 0,20 % 0,25 % 0,27 % 0,31 % 0,37 %
0,125 M
0,375 M
SDS 0,1 %
0,375 M 0,375 M 0,375 M 0,375 M
0,1 % 0,1 % 0,1 % 0,1 % 0,1 %
10 µl 10 µl 10 µl 10 µl
50 µl 50 µl 50 µl 50 µl
Tableau M-9 : Composition des gels de polyacrylamide en conditions dénaturantes
2-Par immunorévélation après transfert.
a- Principe.
La technique consiste à séparer les protéines d'un extrait de plante virosée ou de
protoplastes sur gel de polyacrylamide dénaturant puis à les transférer sur une
membrane de nitrocellulose par électrotransfert. La révélation d'une protéine particulière
est ensuite réalisée à l'aide d'anticorps spécifiques de cette protéine.
b- Séparation des protéines par électrophorèse et transfert sur un support de
nitrocellulose.
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
178
Une dizaine de lésions locales découpées à partir d'une feuille virosée
sont finement broyées en présence de 50 µl de tampon de charge x2 et de 50 µl d'eau.
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
179
Composition du tampon d'électrotransfert de protéines
Tris-HCl
Glycine
pH 8,3 25 mM
192 mM
Ethanol 20 %
Figure M-3 : Schéma du système d'électrotransfert de protéines sur nitrocellulose. Composition du tampon utilisé.
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
180
L'ensemble est centrifugé 10 min à 6 000 rpm et 10 µl du surnageant sont
déposés sur un gel dénaturant 10% à 15% (voir Tableau M-9) et soumis à une
électrophorèse à 100 volts en présence du tampon d'électrophorèse. Après migration, les
protéines sont transférées sur nitrocellulose [BA 85 Schleicher-Schüell] selon le
dispositif schématisé dans la figure M-3. Le montage et le transfert (80 volts, 40 min)
sont réalisés dans du tampon de transfert puis la nitrocellulose est séchée à 37°C
pendant 10 minutes.
L'analyse de protéines extraites de protoplastes se fait de manière analogue. 70
000 protoplastes infectés sont sédimentés puis additionnés de 20 µl de tampon de charge
et déposés sur gel.
c- Réaction immunologique (voir Tableau M-10).
étape réactif tampon durée
Incubation du 1er anticorps
Dilution de l'antisérum de lapin
dirigé contre la protéine étudiée (au 20000ème).
2 heures à température ambiante ou une nuit à
4°C
Incubation du 2nd anticorps
PBS Tween 20 1%
Lait en poudre 5%
2 heures à température ambiante
IgG de chèvre anti IgG de lapin
couplées à la phosphatase alcaline (au 2000ème)
Lavages
PBS Tween 20 1%
Diéthanolamine-HCl 0,1 M pH 9,6
2 fois 10 min
2 fois 10 min
RévélationB.C.I.P. 50 µg/ml
N.B.T. 100 µg/ml
10 min à 1 heure à température ambiante
MgCl 1 mM
Diéthanolamine-HCl 0,1 M pH 9,6
Lavages 3 fois 10 min
PBS : 150 mM NaCl ; 1,5 mM KH PO ; 7,9 mM Na HPO ; 2,7 mM KCl ; pH 7,4
B.C.I.P. : 5-bromo 4-chloro 3-indolyl phosphate sel disodique
N.B.T. : Nitro blue tetrazolium chlorid monohydrat
PBS Lait en poudre 5%
PBS Tween 20 1%
Lait en poudre 5%
242 4
2
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
181
Tableau M-10 : Immunodétection de protéines après transfert sur membrane de nitrocellulose
La nitrocellulose est lavée dans du tampon PBS-Tween pH 7,4 (NaCl 150 mM,
KH2PO4 1,4 mM, Na2HPO4 10 mM, KCl 2,7 mM, Tween 20 1%). Elle est ensuite
traitée comme décrit dans le tableau M-10.
Les complexes antigènes-anticorps sont révélés par addition du substrat de la
phosphatase alcaline, le 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate sel dissodique (BCIP)
0,005%. L'élimination du phosphate permet la formation d'un complexe coloré en violet
avec le Nitro Blue Tetrazolium Chlorid Monohydrat (NBT) 0,01%. Cette action de la
phosphatase se fait dans du tampon diéthanolamine 100 mM pH 9,6, MgCl2 1 mM.
V-Etude de l'activité fixatrice d'une protéine par Northwestern. (Gramstat et al, 1990)
Un extrait de protéines bactériennes ou des protéines purifiées sont séparés par
électrophorèse en conditions dénaturantes sur gel de polyacrylamide 12,5 ou 15% puis
transférés sur nitrocellulose pendant 40 min à 80 V. Les protéines fixées sont renaturées
par deux lavages de la nitrocellulose pendant 15 min dans une solution d'urée 6 M,
NP40 0,1% puis par deux immersions de 30 min dans le tampon Tris-HCl 10 mM pH 8,
NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, Denhardts x1. La membrane de nitrocellulose est ensuite
incubée dans le même tampon pendant 1 heure à 20°C avec 10 µl de RNA
radiomarquée au 32P (5.105 cpm en général). Deux lavages de 30 min dans du tampon
Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 200 mM sont effectués puis la
nitrocellulose est séchée et autoradiographiée.
C-MULTIPLICATION DU VIRUS DANS UNE PLANTE HOTE :
CHENOPODIUM QUINOA.
I-Plante hôte.
La gamme d'hôtes naturels du BNYVV est relativement restreinte (Kuszala &
Putz, 1977) et est constituée principalement par des plantes appartenant à la famille des
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
182
Chénopodiacées telles que l'épinard, les betteraves ou les chénopodes. Au laboratoire,
nous utilisons essentiellement Chenopodium quinoa, une plante répondant à une
inoculation mécanique par des lésions chlorotiques locales pouvant diffuser le long des
nervures des feuilles.
II-Préparation du virus.
L'inoculation est réalisée en frottant les feuilles par un broyât de feuilles virosées,
broyât effectué dans du tampon KH2PO4 20 mM pH 7,5 et en présence d'un abrasif, la
célite. Après huit à dix jours de virose, les feuilles inoculées sont récoltées et broyées
dans du tampon borate de sodium 100 mM pH 9 additionné de tétrachlorure de carbone
dans des proportions respectives de 170 ml et 100 ml pour 100 g de feuilles. Le broyât
est ensuite clarifié par une centrifugation de 30 min à 8000 rpm et filtré sur Miracloth.
Le virus est précipité par addition de 0,8% NaCl et 2% PEG 6000 pendant 5h à 4°C
sous agitation douce, puis il est sédimenté par une centrifugation de 20 min à 12000 rpm
et remis en suspension dans 100 ml de tampon borate de sodium 10 mM pH 9. Une
seconde précipitation PEG/NaCl est effectuée et le culot est remis en suspension dans
30 ml de tampon borate de sodium 10 mM pH 9 puis ultra centrifugé à travers 7 ml d'un
coussin de saccharose 20% pendant 2 h à 35000 rpm. Le culot de virus est finalement
remis en suspension dans 3 ml de tampon borate de sodium 10 mM pH 9. Les
rendements moyens d'extraction dépassent rarement 20 µg de virus par gramme de
feuilles.
III-Extraction de RNA viraux à partir de feuilles de C. quinoa.
1-En présence de tampon "polysome" (Jackson & Larkins, 1976)
Afin de pouvoir analyser la descendance de transcrits initialement inoculés sur
plante hôte, des feuilles de plantes virosées ou saines sont broyées au froid dans du
tampon "polysomes" (5 ml de tampon par gramme de feuille). La forte force ionique, le
pH alcalin et la présence d'EGTA, un chélateur spécifique de cations divalents
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
183
permettent de garder les RNA intacts et en particulier les RNA viraux qu'ils soient
encapsidés ou non.
La composition du tampon "polysome" est la suivante :
Tris-HCl pH 9 200 mMKCl 400 mMMgCl2 35 mMEGTA 25 mMSaccharose 200 mM
Le broyât obtenu est soumis ensuite à deux extractions phénoliques et à un lavage
à l'éther. Les acides nucléiques totaux sont ensuite précipités par deux volumes
d'éthanol. Après centrifugation, le culot est repris dans l'acétate de sodium 3 M pH 6
afin de solubiliser le DNA et les petits RNA (tRNA et RNA 5S). Les RNA messagers,
ribosomiques et viraux insolubles sont récupérés par sédimentation, remis en suspension
dans de l'eau bidistillée stérile et précipités une seconde fois à l'éthanol. Après
centrifugation et lavage à l'éthanol 70%, ils sont dissous dans de l'eau bidistillée stérile
et quantifiés par spectrophotométrie. L'analyse des RNA viraux est ensuite réalisée par
hybridation moléculaire.
2- En présence de tampon Tris-Magnésium.
Le principe de cette extraction repose sur la protection spécifique des RNA viraux
encapsidés vis à vis de l'action des nucléases libérées lors du broyage du matériel
végétal. Le tampon Tris-MgCl2 utilisé (encore appelé tampon TM) favorise l'action des
RNases. Les feuilles sont broyées au froid, à raison de 5 ml de tampon par gramme de
feuille. Après élimination des débris cellulaires par une courte centrifugation, les
surnageants sont incubés à 37°C pendant 30 min pour favoriser la dégradation des RNA
viraux non encapsidés. Les acides nucléiques totaux sont ensuite purifiés comme
précédemment (paragraphe C-III-2).
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
184
IV-Préparation, inoculation et mise en culture de protoplastes.
1-Préparation des protoplastes (Veidt et al, 1992).
Les protoplastes sont isolés à partir de Chenopodium quinoa âgés de quatre
semaines. Seules les deuxièmes feuilles après les cotylédons sont utilisées. Afin de
faciliter le contact des feuilles avec l'agent désinfectant (eau de Javel), celles ci sont
trempées pendant cinq secondes dans de l'éthanol 70% puis stérilisées cinq minutes dans
de l'eau de Javel 1,25%. Finalement, elles subissent trois lavages successifs de cinq
minutes dans un grand volume d'eau stérile. Débarrassées de l'eau de Javel, les feuilles
sont alors dilacérées en fines bandelettes de 1 mm de large environ. Les lamelles
obtenues sont plasmolysées dans du mannitol 0,6 M pH 5,6, CaCl2 0,1 mM (milieu A).
Puis elles sont soumises à une digestion enzymatique dans le milieu A additionné de
cellulase 1,5 % et de macérozyme 0,3% (ce milieu est stérilisé par filtration sur filtre
millipore). Cette étape permet la digestion de la paroi pectocellulosique et après 2h30 à
3h d'incubation à 30°C, la libération des protoplastes est vérifiée par observation au
microscope optique. Si ce n'est pas le cas, l'incubation est poursuivie avec une légère
agitation.
S'il apparaît des protoplastes libres, toutes les lamelles de feuilles sont récupérées
à l'aide d'une pipette à bout large et déposées sur un filtre stérile ayant une réticulation
de 100 µm. Le filtrat est centrifugé pendant 5 min à 700 rpm et le culot de protoplastes
est repris par une agitation très douce dans le milieu A. Cette opération est répétée trois
fois afin d'éliminer le maximum de débris cellulaires, chloroplastiques ainsi que le reste
des enzymes de digestion. Une fraction aliquote du dernier lavage est prélevée et
permettra de dénombrer les protoplastes obtenus, le comptage se faisant grâce à une
cellule de Fuchs-Rosenthal ou une cellule de Mallassez. La concentration est amenée à
400 000 protoplastes/ml puis la suspension est placée à 4°C pendant quelques heures.
2-Infection des protoplastes par des acides nucléiques (RNA de BNYVV ou DNA
plasmidique) et mise en culture.
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
185
Les acides nucléiques sont introduits dans les protoplastes par la technique
d'électroporation. Deux cent mille protoplastes (0,5 ml de la suspension stock) sont mis
en présence de 1 µg des RNA viraux 1 et 2 (souche Stras 12), ou 10 µg de transcrits du
RNA 1 et 5 µg de transcrits RNA 2, ou encore de 5 µg de DNA plasmidique. Ils sont
soumis à une décharge électrique de 450 V/cm (100 W, 125 µF) pour les RNA et de 750
V/cm pour les DNA dans une cuve d'électroporation ayant des électrodes distantes de
0,4 cm. On récupère les protoplastes dans 1 ml de milieu A et la suspension est incubée
à 0°C pendant 20 min afin de stabiliser les membranes. Les protoplastes sont ensuite
centrifugés à 1000 rpm pendant 2 min. Le culot de protoplastes est doucement remis en
suspension dans un milieu de survie encore appelé milieu B (KH2PO4 0,2 mM, KNO3
1 mM, MgSO4 1 mM, CaCl2 5 mM, KI 1 µM, CuSO4 10 nM et mannitol 600 mM)
additionné d'un agent bactériostatique : la carbénicilline à 0,25 mg/ml. La mise en
culture se fait à 24°C dans une chambre à lumière diffuse (1000 lux) avec 16h de
lumière et 8h d'obscurité. Des cinétiques d'infection ont montré que la multiplication du
virus est maximum au bout de 48h de culture. Cependant, pour mettre en évidence les
brins moins, nous avons aussi extrait les RNA après 36 heures de culture ; pour les
expériences d'expression transitoire, 24 heures de culture sont suffisantes.
V-Extraction des RNA viraux de protoplastes.
Les protoplastes, délicatement transférés dans un tube Eppendorf, sont centrifugés
2 min à 1000 rpm, puis le surnageant est éliminé et le culot congelé à -20 °C puis remis
en suspension dans un tampon d'extraction contenant du Tris-HCl 50 mM pH 7,5, de
l'EDTA 1 mM, du SDS 1% et du macaloïd 0,03%. Suivent alors deux extractions au
phénol-chloroforme (v/v) et le surnageant est mélangé à un volume de LiCl 4M afin de
précipiter spécifiquement les RNA. Après agitation, le tube est placé à 0°C pendant 2h.
Les RNA sont sédimentés par centrifugation puis lavés à l'éthanol 70% et repris dans 10
µl d'eau bidistillée stérile avant d'être analysés par Northern Blot comme décrit dans le
paragraphe A-X
Matériel et méthodes______________________________________________________________________
186
VI-Expression transitoire dans les feuilles de C. quinoa et Nicotiana tabacum.
5 µg de plasmides sont mis en présence de 25 µl d'une solution de billes de
tungstène, 25 µl de CaCl2 1M et de 10 µl de spermidine 0,1 M. Le DNA est mis à
précipiter pendant 10 min à température ambiante, avant d'éliminer 25 µl du surnageant.
Après une brève sonication pour homogénéiser le mélange DNA-billes de tungstène, 2
µl sont bombardés à la surface de feuilles de C. quinoa agées de 3 semaines, placées
face antérieure sur le dessus dans des boites de Pétri contenant un milieu de culture
gélosé. Des bombardements analogues sont effectuées sur des feuilles de Nicotiana
tabacum comme décrit par Twell et al (1989). Après 24 heures de culture en logette, les
feuilles sont broyées dans du tampon d'extraction (10 mM KPO4 pH 7,5, 10 mM DTT).
Finalement l'activité luciférase est mesurée en présence de tampon Hepes KOH pH 7,5
50 mM, MgCl2 20 mM, ATP 10 mM et de luciférine 0,5 mM.
Publication n°4
IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF RESISTANCE TO
RHIZOMANIA IN AN ECOTYPE OF BETA VULGARIS SUBSP. MARITIMA.
Geyl L., Garcia Heriz M., Valentin P., Hehn A. & Merdinoglu D.
Sous presse dans Plant Pathology
(1995)
Annexe______________________________________________________________________
188
Publication n°4______________________________________________________________________
189
Annexe______________________________________________________________________
190
Publication n°4______________________________________________________________________
191
Annexe______________________________________________________________________
192
Publication n°4______________________________________________________________________
193
Annexe______________________________________________________________________
194
Publication n°4______________________________________________________________________
195
Annexe______________________________________________________________________
196
Publication n°4______________________________________________________________________
197
Annexe______________________________________________________________________
198
Publication n°4______________________________________________________________________
199
Annexe______________________________________________________________________
200
Publication n°4______________________________________________________________________
201
Annexe______________________________________________________________________
202
ABREVIATIONS
Abréviations des acides aminés
A : Ala : AlanineC : Cys : CystéineD : Asp : Acide aspartiqueE : Glu : Acide glutamiqueF : Phe : PhénylalanineG : Gly : GlycineH : His : HistidineI : Ile : IsoleucineK : Lys : LysineL : Leu : LeucineM : Met : MéthionineN : Asn : AsparagineP : Pro : ProlineQ : Gln : GlutamineR : Arg : ArginineS : Ser : SérineT : Thr : ThréonineV : Val : ValineW : Trp : TryptophaneY : Tyr : Tyrosine
Abréviations des virus
ACMV : African cassava mosaic virusAMV : Alfalfa mosaic virusBMV : Brome mosaic virusBNYVV : Beet necrotic yellow vein virusBSMV : Barley stripe mosaic virusBYV : Beet yellows virusBWYV : Beet western yellows virusCaMV : Cauliflower mosaic virusCMV : Cucumber mosaic virus
Annexe______________________________________________________________________
204
CPMV : Cowpea mosaic virusCYMV : Clover yellow mosaic virusCyRSV : Cymbidium ringspot virusEMV : Euphorbia mosaic virusGFLV : Grapevine fanleaf virusPCV : Peanut clump virusPVM : Potato virus MPVY : Potato virus YPVX : Potato virus XSBWMV : Soil borne wheat mosaic virusTBSV : Tomato bushy stunt virusTCV : Turnip crinkle virusTEV : Tobacco etch virusTGMV : Tomato golden mosaic virusTMV : Tobacco mosaic virusTRV : Tobacco rattle virusTSWV : Tomato spotted wilt virusTYMV : Turnip yellow mosaic virusWClMV : White clover mosaic virus
Abréviations générales
A : AmpèreAA : AminoacideAmp : AmpicillineATP : Adénosine 5' triphosphateBCIP : 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate sel dissodiqueBET : Bromure d'éthidiumBSA : Sérum albumine bovinecDNA : Acide désoxyribonucléique complémentaireChl : ChloramphénicolCi : CurieCP : protéine de coquecm : centimètreCTP : Cytosine 5' triphosphateDa : DaltonddNTP : Didésoxyribonucléoside triphosphate (ddATP, ddCTP, ddGTP,
ddTTP)DNA : Acide désoxyribonucléique
Abréviations______________________________________________________________________
205
DNase : DésoxyribonucléasedNTP : Désoxyribonucléoside triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)DO : Densité optiqueDTT : DithiothréitolEDTA : Ethylène diamine tétraacétate de sodiumEGTA : Ethylène glycol tétraacétate de sodiumF : FarradFDA : Fluoréscéine diacétateg : Grammeh : HeureHepes : Acide N-2 hydroxy éthyl pipérazine N'-2 éthane sulfoniqueIgG : Immunoglobuline de type GINRA : Institut national de la recherche agronomiqueIPTG : IsopropylthiogalactopyranosideJ : Joulek : Kilo-kb : KilobaseLB : Luria BertaniLMP : Bas point de fusionM : Mole par litremin : MinutemRNA : Acide ribonucléique messagermol : Molen : Nano-µ : Micro-NBT : Nitro blue tetrazolium chlorid monohydratnt : NucléotideORF : Phase ouverte de lecturepb : paire de basePBS : Tampon phosphate salinPCR : Réaction de polymérisation en chaînePEG : Polyéthylène glycolPVPP : Polyvinylpolypyrrolidoneqsp : Quantité suffisante pourRNA : Acide ribonucléiqueRNase : RibonucléaseRNasin : Inhibiteur de ribonucléaserpm : Révolution par minuteRT : Readthrough
Annexe______________________________________________________________________
206
SDS : Dodécyl sulfate de sodiumsec : SecondeSSC : Standard sodium citrateTBE : Tampon Tris-Borate-EDTATE : Tampon Tris-EDTATEMED : NNN'N' tétraméthyl éthylène diamineTm : Température de fusionTNE : Tampon Tris-NaCl-EDTATris : Tris (hydroxyméthyl) amino méthanetRNA : Acide ribonucléique de transfertT° : TempératureU : Unité enzymatiqueUV : Ultra violetV : VoltW : WattΩ : Ohm
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