THÈSE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITÉ PARIS 6 · significant consequences on their capacity to simulate biomass in a realistic way. It also ... Céline Heyndrickx et Stéphanie Sabini

THSE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSIT PARIS 6

Spcialit

Ocanologie Biologique et Environnements Marins

prsente par

Lionel PAWLOWSKI

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR de l'UNIVERSIT PARIS 6

Sujet de la thse:

MODLISATION DE L'INCORPORATION DU CARBONE PHOTOSYNTHTIQUE EN ENVIRONNEMENT MARIN

PILOT PAR ORDINATEUR

Soutenue le 22 septembre 2004

devant le jury compos de:

MM. Gilles BUF Prsident Jean-Christophe POGGIALE Rapporteurs Yvan LAGADEUC Antoine SCIANDRA Directeur de thse Marina LEVY Examinateurs Luigi LAZZARA

Laboratoire d'Ocanographie de Villefranche sur Mer

Modlisation de l'incorporation du carbone photosynthtique en environnement marin pilot par ordinateur

Dans le cadre du dveloppement d'un nouveau modle de croissance phytoplanctonique, une dmarche thorique et exprimentale est mene afin d'valuer la pertinence de certaines approches couramment employes en modlisation biogochimique. Dans un premier temps, ce travail value dans quelle mesure un modle de croissance phytoplanctonique valid partir d'expriences ralises en condition stable est capable de reproduire correctement les variations de la biomasse lorsqu'il est utilis avec des forages journaliers variables. Nous tudions aussi si des modles trs simples de colimitation azote/lumire sont capables de reprsenter l'volution du carbone particulaire dans le milieu marin et dans quelle mesure le recours un rapport chlorophylle sur carbone constant est applicable pour estimer la biomasse en carbone.

L'tude thorique est parallle la conduite d'expriences ralises en chmostat sur des

cultures de diatomes Thalassiosira weissflogii. Un dispositif automatis permet de raliser des mesures haute frquence et d'imposer diffrents rgimes lumineux (continu, cyclique, apriodique). Les mesures acquises lors de ces expriences ont permis l'identification des paramtres et la validation du modle de croissance l'quilibre et d'tudier la rponse des diffrents descripteurs de la population aux variations journalires du flux de photons. Ces expriences ont galement mis en vidence le contrle de la division cellulaire par une horloge interne et le couplage complexe de l'absorption du substrat avec le flux de photons.

La comparaison des sorties du modle aux mesures souligne que ces proprits, gnralement

pas reprsentes dans les modles ou alors de faon trs sommaire, ont des consquences significatives sur l'adquation entre simulations et observations. Il apparat galement que la validit d'un modle utilis en dehors de son domaine d'identification est a priori incertaine. Cette tude montre galement que des modles trs simples peuvent se rvler, l'quilibre, comptitifs en terme de capacit simuler une biomasse en carbone par rapport des modles plus labors. Cependant, ils deviennent beaucoup moins performants pour des forages lumineux journaliers variables. Enfin, les rsultats exprimentaux et thoriques montrent que l'estimation de la biomasse en carbone partir de mesures de chlorophylle, en utilisant un rapport chlorophylle sur carbone constant, conduit des incertitudes importantes. Leurs effets peuvent tre significatifs pour la capacit d'un modle reprsenter la biomasse au sein d'un cosystme.

Mots cls: chmostat, modlisation, Thalassiosira weissflogii, validation, identification, photoadaptation, absorption, division cellulaire.

Modelling the incorporation of carbon through photosynthesis in a computer controlled marine environment

In parallel to the development of a new phytoplankton growth model, a theoretical and experimental approach is used to evaluate some common trends in biogeochemical modelling. First, we evaluate how a model which parameters are identified at steady-state behaves when used with dynamic forcings such as light variation due to vertical mixing. Secondly, we study if simpler models may be competitive with complex ones in terms of reliability for steady-state and dynamic conditions of forcings. Finally, we evaluate if the use of constant chlorophyll to carbon ratios is suitable to estimate particulate carbon concentrations from chlorophyll measurements.

The theoretical approach is conducted in parallel to experiments in chemostat on the diatoms Thalassiosira weissflogii. An automated system is used to perform high frequency samplings and to program different light regimes (continuous, cyclic, aperiodic) into the culture devices and levels of nitrate limitations. Acquired data were used to calibrate and validate the model at steady-state and to study the responses of the different parameters of the population for daily variation of the light regime. These experiments have highlighted the control of cell division by a biological clock and the complex dependency of nitrate uptake with light intensity.

The comparison between model outputs and observations has shown that these

properties, generally poorly or not represented within primary production models have significant consequences on their capacity to simulate biomass in a realistic way. It also appears that it is almost impossible to predict the validity of a model is uncertain outside its domain of calibration. In some cases simulations are close to observation. In other situations, output are unreliable. This study has also shown that simpler models are able to simulate biomass at steady-state but are far less able to reproduce observations than complex models when used with dynamic forcings. We also demonstrated that the use of a constant chlorophyll to carbon ratio to estimate particulate carbon leads to significant uncertainties when these models are used in the context of ecosystem or biogeochemical modelling. Keywords: chemostat, modelling, Thalassiosira weissflogii, validation, identification, photoadaptation, uptake, cell division.

3

Remerciements

Cette thse a t ralise au sein du Laboratoire dOcanographie de Villefranche/Mer et dans le cadre du projet COMORE de lINRIA de Sophia-Antipolis. Je tiens remercier les membres de ces deux quipes pour leur accueil, leur soutien logistique et pour le plaisir que j'ai eu les rencontrer notamment en raison de leur formations scientifiques et culturelles trs varies.

Je remercie Antoine Sciandra et Olivier Bernard qui ont dirig et co-encadr cette

thse. Leurs approches complmentaires et interdisciplinaires sur la modlisation, lexprimentation et la biologie du phytoplancton mont permis dvoluer sans encombre au travers de ces diffrentes disciplines. Ils mont permis de me former diverses approches et techniques et ont contribu bien au-del des rsultats de cette thse enrichir mes connaissances dans des domaines trs varis. Antoine et Olivier mont fourni une aide inestimable toutes les tapes de ce long travail et particulirement pour la rdaction de ce document.

Je tiens remercier les membres du jury davoir accept de porter un il critique sur

ce manuscrit : Monsieur Gilles Boeuf pour avoir accept de prsider ce jury. Messieur Jean-Christophe Poggiale et Yvan Lagadeuc pour avoir accept dtre les

rapporteurs de cette thse. Madame Marina Levy et Monsieur Luigi Lazzara pour avoir accept dtre

examinateurs de ce travail. Je tiens galement remercier Gilbert Malara, Cdric Prvost et Bruno Sialve pour

leur aide, leur disponibilit et leur sympathie. Leurs contributions au dispositif de culture m'ont permis de raliser les exprimentations dans de trs bonnes conditions. Josphine Ras, Cline Heyndrickx et Stphanie Sabini mont fourni chacune une aide pour les dosages de pigments et les mesures aux CHN. Les coups de pouce de Stphanie mont permis de rsoudre rapidement de nombreux problmes. Je remercie galement Emilie Le Floc'h pour la disponibilit et l'aide qu'elle m'a apport dans les premiers stades du dveloppement de BioLOV.

Jadresse des remerciements particuliers Corinne et Delphine. Les moments partags

ensemble que ce soit devant une tasse de th refaire le monde, dans les profondeurs du littoral niois traquer la petite bte photographier, ont largement contribu l'panouissement "extrascientifique" de cet animal bizarre qu'est le thsard. Leur soutien m'a galement permis d'avoir un regard lucide lors des invitables moments de doute qui jalonnent une thse. Je remercie galement Frdrique, Christian, Aline, Didier, Lionel, Ricou, Jean-Marc, Eric, Cathy et Philippe pour leur amiti et toutes les bonnes choses que nous avons partag et partagerons, sans oublier non plus les tudiants du laboratoire d'ocanographie.

Jadresse galement mes remerciements Paul Nival et Alain Nierga. Ils ont toujours

t des oreilles attentives et promptes aider dans la rsolution de problmes lis au droulement d'une thse.

4

Je ne pourrais galement pas terminer ces remerciements sans un mot pour mes

parents qui me soutiennent dans mes entreprises hasardeuses depuis trop longtemps, et ceci en dpit du fait que je les vois trop peu souvent.

Alors que dans ces lignes se termine un chapitre important de ma vie, ces diffrentes

personnes ont toutes apport des rponses aux nombreuses questions scientifiques ou existentielles que pose ce long travail qu'est une thse et encore une fois, je les en remercie !

5

Table des matires Chapitre I - Introduction gnrale I. La production primaire, un enjeu de locanographie contemporaine..11 II. Une estimation difficile de la production primaire..12 III. Organisation du manuscrit..15 Chapitre II - Environnements contrls et chmostats I. Introduction...19 II. Des cosystmes en laboratoire...19 III. Mthodes et proprits des cultures planctoniques22 Chapitre III - Matriel et mthodes I. Introduction....32 II. Thalassiosira weissflogii..32 III. Contrle de lenvironnement physico-chimique et des caractristiques biologiques de la culture....33 IV. Mesures ralises....38 Chapitre IV - Modlisation de la croissance phytoplanctonique I. Introduction....45 II. Reprsentations classiques de la croissance du phytoplancton dans les modles de rseaux trophiques : loi du minimum et loi multiplicative.45 III. Des modles ddis ltude de la croissance du phytoplancton..48 IV. Hypothses et formulation du modle BIOLOV54 V. Choix dune approche exprimentale..63 Chapitre V - Caractrisations exprimentale et thorique des effets de la lumire et de la limitation en azote sur des cultures l'quilibre I. Introduction...69 II. Dmarche exprimentale..70 III. Evolution de principaux paramtres de la culture..71 IV. Identification des paramtres des modles.78 V. Comparaison des simulations aux observations..87 VI. Conclusion......89

6

Chapitre VI - Croissance du phytoplancton dans une couche de mlange profonde hivernale I. Introduction.93 II. De la ralit du milieu marin celle de lexprimentation en chmostat..94 III. Droulement de lexprience....97 IV. Apports pour la modlisation106 V. Synthse et discussion111 Chapitre VII - Croissance phytoplanctonique carence en nitrate sous clairement cyclique I. Introduction.123 II. Droulement de lexprience.123 III. Evolution gnrale de la population.124 IV. Simulations dynamiques vs. observations127 V. Identification des sources des carts aux donnes.128 VI. Synthse et discussion......133 Chapitre VIII Comparaison de BioLOV des modles plus simples. I. Introduction....139 II. Reprsentation des limitations simultanes substrat/lumire par le modle de monod140 III. Comparaison des modles dans le cas dun systme sous diffrents quilibres..143 VI. Comparaison des modles dans le cas de cultures sous clairements variables...145 V. Synthse et conclusions..148 Chapitre IX Discussion gnrale et perspectives. I. Rappel du contexte..154 II. Faits exprimentaux marquants et leurs consquences pour la modlisation de la production primaire...154 III. Perspectives...162 Conclusion..164 Rfrences bibliographiques166 Annexe.176

7

Table I : Listes des abrviations

ATP : Adnosine Tri-PhosphateATPases : Adnosine Tri-PhosphataseBioLOV : Modle de croissance du phytoplancton dvelopp dans cette thse.BioLOVabs : Modle BioLOV intgrant une absorption du nitrate dpendante de la lumire.C:Chl : Rapport Carbone sur Chlorophylle aChl a :C : Rapport Chlorophylle a sur CarboneCO2 : Dioxyde de CarboneCOP : Carbone Organique ParticulaireCID : Carbone Inorganique Dissousd : Taux de dilution (j-1)E : Dose de photons reue depuis le dbut de la journe (mol quanta.m-2.j-1)HL : Culture sous fort clairement lumineuxI : Intensit lumineuse instantane (mol quanta.m-2.s-1)LL : Culture sous faible clairement lumineuxMCO : Moindre Carr OrdinaireMonodMin : Modle Monod intgrant une double limitation lumire/azote formule selon une loi du minimumMonodmult : Modle Monod intgrant une double limitation lumire/azote formule selon une loi multiplicativeMonodQuot : Modle Monod utilisant une formulation multiplicative NOP : Azote Organique ParticulaireNPZ : Nutriment Phytoplancton Zooplancton NPZD : Nutriment Phytoplancton Zooplancton DetritusNt : Azote particulaire totalPhCyc : Jeu de paramtres du taux de photosynthse de BioLOV identifis en rgime cycliquePhEqHL : Jeu de paramtres du taux de photosynthse de BioLOV identifis sous fort clairementPhEqLL : Jeu de paramtres du taux de photosynthse de BioLOV identifis sous faible clairementPOMME : Programme Ocan Multidisciplinaire Mso EchellePSII : Photosystme IIRubisco : Ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxygenaseSEMPO : Simulateur d'Environnements Marins Pilot par OrdinateurSin : Concentration en Substrat limitant apport par le milieu de culture dans le chmostatSyncyc : Jeu de paramtres du terme de photoadaptation de BioLOV identifis en rgime cycliqueSynEq : Jeu de paramtres du terme de photoadaptation de BioLOV identifis l'quilibreTEP : Transparent Exopolymeric ParticlesZe : Epaisseur de la couche euphotique (m)Zm : Epaisseur de la couche de mlange (m)

8

Table II : Liste des variables et paramtres du modle BioLOV

Variables Symboles Units

Nitrate S mol N.L-1

Azote particulaire non chlorophyllien N mol N.L-1

Azote particulaire chlorophyllien L mol N.L-1

Carbone particulaire C mol C.L-1Quota en azote particulaire total Q mol N.mol C-1

Quota en azote particulaire chlorophyllien QL mol N.mol C-1

Quota en azote particulaire non chlorophyllien QN mol N.mol C-1

Paramtres Symboles Units

ForagesIntensit lumineuse I mol quanta.m-2.s-1

Taux de dilution Sin mol N.L-1

Absorption du nitrateTaux maximal d'absorption m mol N.mol C-1.j-1

Coefficient de demi saturation ks mol N.L-1

Synthse des pigments k(I) s.d.Taux de synthse maximal kl s.d.Coefficient d'ajustement kc mol quanta.m-2.s-1

Photosynthse a(I) mol C.j-1

Taux de photosynthse maximal mol C.mol N-1.j-1

coefficient de demi saturation ki mol quanta.m-2.s-1

Dgradation et respirationTaux de respiration j-1

Taux de dgradation des pigments j-1

facteur de conversionazote chlorophyllien:Chl a f mol N.g Chla-1

9

CHAPITRE I

Introduction gnrale

Chapitre I Introduction gnrale

10

Chapitre I

Introduction gnrale

I. LA PRODUCTION PRIMAIRE, UN ENJEU DE LOCEANOGRAPHIE

CONTEMPORAINE. ............................................................................................................ 11

II. UNE ESTIMATION DIFFICILE DE LA PRODUCTION PRIMAIRE..................... 12

III. ORGANISATION DU MANUSCRIT. .......................................................................... 15


11

I. La production primaire, un enjeu de locanographie

contemporaine.

Les zones de forte production phytoplanctonique suscitent depuis longtemps lintrt

des ocanographes car elles sont gnralement associes dabondantes ressources

halieutiques. De plus, outre le fait quil est le premier maillon des chanes trophiques marines,

le phytoplancton joue galement un rle majeur dans le cycle du carbone. En effet, le

phytoplancton contribue de faon significative la squestration du dioxyde de carbone (CO2)

atmosphrique dans la couche euphotique, et sa rpartition dans les rseaux trophiques

marins. Le CO2 est gnralement considr comme tant lun des facteurs principaux

responsable du rchauffement plantaire. Il contribue pour 60% au forage radiatif li au gaz

effet de serre, et na cess daugmenter depuis le dbut de lre industrielle (Hougthon et al.,

2001). Dans les annes 1980, la prise de conscience des risques que constitue laugmentation

de la concentration en CO2 dans latmosphre pour lvolution du climat a conduit la

communaut scientifique intensifier les recherches sur le rseau plagique, notamment sur le

phytoplancton, et ce, dans le contexte du cycle biogochimique global du carbone.

La part du phytoplancton dans le rgne vgtal est peu significative, de 1 2% de la

biomasse vgtale mondiale, mais paradoxalement le phytoplancton fixe annuellement 30

60% du carbone inorganique global (Sakshaug et al., 1997). L'incorporation du carbone

inorganique dans le rseau trophique ocanique constitue ce qui est couramment appel la

pompe biologique du CO2 (Gammon, 1986). La production primaire phytoplanctonique

(matire organique produite par les organismes autotrophes) joue donc un rle trs significatif

dans la rgulation du cycle du carbone. Par consquent, de nombreux efforts de recherche

portent sur les facteurs qui rgulent cette production en amont ou en aval. La disponibilit en

sels nutritifs, la lumire et la temprature constituent les principaux facteurs qui contrlent en

amont la fixation du carbone inorganique dissous par le phytoplancton. En aval, la prdation

permet le transfert du carbone vers dautres niveaux trophiques et contribue in fine

lexportation de matire organique en dehors de la couche euphotique et sa squestration sur

les fonds ocaniques.


12

Ltude du phytoplancton prsente donc un intrt vident pour comprendre le rle

qu'il joue non seulement dans la rgulation du climat, mais aussi dans le fonctionnement des

cosystmes marins, notamment ceux exploits par lhomme (pche, aquaculture et tourisme).

La comprhension des facteurs qui rgulent la production primaire est apparue comme

un enjeu majeur de la recherche ocanographique contemporaine (Falkowski et al.,

1998). La comprhension des effets rsultant des interactions entre processus physiques et

biologiques ncessite des approches de laboratoire et de terrain qui couvrent une large gamme

d'chelles spatio-temporelles, allant de ltude des proprits cellulaires des microalgues aux

observations globales issues de limagerie satellitaire.

La problmatique de cette thse sinscrit dans ltude cophysiologique de la

photoadaptation du phytoplancton autotrophe en rponse aux facteurs du milieu qui

rgulent la fixation du carbone. Par extension, elle s'inscrit galement dans la dmarche

de modlisation de la production primaire et connat donc des applications d'ordre

biogochimique lchelle rgionale ou globale.

II. Une estimation difficile de la production primaire.

Les observations satellitales constituent actuellement le seul moyen permettant

destimer globalement et relativement haute frquence les variations de la production

primaire (Antoine et al., 1996). Ces estimations reposent sur des mesures de la couleur de

locan qui permettent de dterminer les teneurs superficielles en chlorophylle. Ces teneurs

constituent la plupart du temps des entres de modles qui permettent destimer les flux de

carbone (Behrenfeld & Falkowski, 1997). Mais ces modles ne tiennent absolument pas

compte de la dynamique du phytoplancton, notamment aux petites chelles temporelles. En

effet, grce la photoadaptation, le phytoplancton rgule son contenu pigmentaire en rponse

aux variations du flux de photons reu. D'autre part, la photoadaptation est elle mme sous la

dpendance des ressources nutritives (Rhee & Gotham, 1981; Chalup & Laws, 1990; Sciandra

et al., 1997), l'azote inorganique entre autres qui constitue, dans la majeure partie des ocans,

le principal lment inorganique limitant. De ce fait, l'interaction des flux de photons et des


13

nutrilites joue un rle capital sur la synthse pigmentaire des cellules, et donc sur la

photosynthse. Dans ces conditions, on peut lgitimement se poser la question de savoir

dans quelle mesure l'utilisation d'un rapport carbone/chlorophylle phytoplanctonique

constant dans les modles mathmatiques n'est pas la cause d'un biais significatif dans

l'estimation d'une production primaire ralise au sein d'un environnement marin

caractris par une importante variabilit spatio-temporelle des facteurs biotiques.

Aux chelles spatio-temporelles caractristiques d'un site ocanique, la production

primaire peut galement tre estime partir de modles biogochimiques coupls des

modles hydrodynamiques, capables de prendre en compte plus finement les interactions

entre processus physiques et biologiques. Dans ce type de modle, la production

phytoplanctonique est calcule d'aprs les conditions dinsolation, de sels nutritifs et de

temprature avec des formulations de complexit variable qui ncessitent dans tous les cas des

moyens de calculs importants. Cependant, ces modles sont sujets caution parce que leur

formulation s'inspire gnralement de rsultats dexpriences ralises au laboratoire

avec des populations monospcifiques places dans des conditions constantes dintensit

lumineuse, de temprature et de sels nutritifs, c'est--dire trs diffrentes de celles de

lenvironnement marin. En effet, dans ce dernier, les cellules doivent s'adapter en permanence

une importante variabilit des facteurs de croissance qui, de surcrot, peuvent agir de faon

concomitante. La colimitation, rarement aborde exprimentalement, est donc modlise de

faon essentiellement empirique. En dfinitive, on ne connat actuellement pas le biais qui

rsulte de l'application de modles mono-facteur valids exprimentalement l'tat stable

des systmes dynamiques dans lesquels les processus peuvent tre rguls simultanment par

plusieurs facteurs prsentant, l'chelle des organismes, une grande variabilit. Un des

objectifs de cette thse est donc dvaluer le degr d'adquation de modles de

production phytoplanctonique labors et valids lquilibre des conditions de

croissance caractrises par des limitations variables et simultanes en lumire et en

nitrate.

Aborder cette question requiert une double approche exprimentale et thorique.

Lexprience au laboratoire est complmentaire des observations acquises en mer. En effet,

les campagnes permettent dobserver les processus in situ mais les mesures ralises,

coteuses, ponctuelles et frquence limite ne permettent pas d'apprhender toute la

complexit des phnomnes, soumis une multitude d'interactions de nature diverse que l'on

ne matrise pas. A l'oppos, le laboratoire offre un environnement permettant un


14

chantillonnage frquent et plus cibl qu'en mer. Nanmoins, la plupart des conditions de

culture testes que l'on trouve dans la littrature restent encore trs caricaturales. En effet, les

dispositifs capables de contrler en temps rel, en continu, et sur de longues priodes

plusieurs paramtres du milieu sont encore assez rares, ce qui prsente des inconvnients

vidents. De fait, la plupart des phnomnes d'adaptation ne s'expriment que dans des rgimes

dynamiques variables : lexistence de cycles circadiens endognes, le conditionnement de

certains processus par les forages rencontrs prcdemment par les cellules, la rponse des

changements rapides et imprvisibles des conditions de croissance

Cette thse utilise donc une approche exprimentale propre faire varier

plusieurs paramtres du milieu simultanment et raliser un chantillonnage temporel

diversifi et dense. La finalit de l'automate de culture que nous avons utilis n'est pas tant de

recrer la variabilit exacte des conditions de croissance rencontres en mer (ce qui est de

toute faon impossible), que de permettre l'tude de la rponse des algues, notamment leur

photoadaptation, des forages caractristiques de situations typiques (couche de mlange

profonde, cycles circadiens par exemple). Les donnes acquises lors de ces expriences

permettent de comprendre les mcanismes impliqus, et de dvelopper de nouveaux modles

de croissance. Ce travail se propose galement de concevoir et de valider

structurellement un nouveau modle de croissance autotrophe rgie par des flux de

photons et dazote.

La croissance phytoplanctonique peut tre modlise de faon plus o moins

complexe. D'un ct, les modles biogochimiques de type NPZD ont tendance intgrer

une formulation simplifie de la production primaire au profit d'un temps de calcul

rduit. Cette simplification est gnralement justifie par le fait que ces modles

fonctionnant une chelle de temps suprieure la journe. Cependant, la production

primaire moyenne journalire calcule dans ces conditions ignore les fluctuations de la

photosynthse l'chelle caractristique de la photoadaptation, c'est--dire l'heure. A

loppos, les physiologistes ont dvelopp des modles mcanistiques l'chelle de

fonctionnement de la cellule phytoplanctonique, mais qui sont gnralement trop

complexes pour pouvoir tre intgrs dans des modles biogochimiques de production.

La vocation des expriences conduites dans ce travail a donc galement t de

reconstituer des situations de rfrence permettant de tester la capacit de modles de

complexits variables reprsenter la rponse des descripteurs du phytoplancton


15

(carbone, chlorophylle, nombre de cellules) des conditions variables de colimitation.

Il sest agit d'valuer le gain potentiel d'une complexification des modles de production

primaire par rapport aux formulations empiriques traditionnellement utilises.

III. Organisation du manuscrit.

Notre travail, organis en 5 sections, aborde la photoacclimatation du phytoplancton

autotrophe en utilisant de faon complmentaire exprimentation et modlisation.

Dans la premire section, nous prsentons le dispositif utilis lors des expriences. Le

chapitre II introduit les concepts denvironnements contrls et de chmostats. Nous

prsentons dabord lintrt de ce type de systme pour ltude de processus au sein d'un

environnement artificiel reconstitu, dont les conditions sont nanmoins caractristiques d'un

milieu type. Nous soulignons notamment la difficult que constitue la conception dun

environnement marin artificiel. Le principe de fonctionnement des chmostats est prsent.

Dans le chapitre III, nous prsentons en dtail le systme de culture automatis grce auquel

lenvironnement physico-chimique des algues est contrl, et leur mesures automatises.

La seconde section (chapitre IV) est consacre la modlisation de la croissance du

phytoplancton. Aprs un tat de lart et un bilan des caractristiques, forces et faiblesses des

modles de croissance actuels, nous prsentons les hypothses biologiques du modle

BioLOV, puis dtaillons ses proprits mathmatiques. La seconde partie de ce chapitre

prsente les expriences destines fournir les jeux de donnes pour identifier les paramtres

de BioLOV, et tester ce dernier dans des conditions de croissance variables au cours du

temps.

La troisime section (chapitre V, VI, VII) est consacre l'interprtation

phnomnologique des observations acquises lors des exprimentations, ainsi qu' leur

implication pour le dveloppement de modles. Ces chapitres sont organiss selon le mme

schma: les diffrentes proprits biologiques sont en premier lieu dduites des rsultats

exprimentaux. Ensuite, les sorties du modle BioLOV sont compares ces mmes rsultats,

ce qui a pu nous conduire revoir sa formulation mathmatique.

Le chapitre V constitue le point de dpart exprimental de ce travail: au travers de l'approche


16

classique de cultures lquilibre, lexprience propose permet de connatre le

comportement qualitatif des cellules pour diffrents niveaux dintensit lumineuse et de

dilution. Les donnes recueillies constituent la matire premire pour lidentification et la

validation lquilibre du modle BioLOV. Dans le chapitre VI, nous abordons le cas typique

de la production primaire au sein d'une couche de mlange profonde o la profondeur de la

couche euphotique est infrieure celle de la couche de mlange et o les nitrates ne sont pas

limitants pour la croissance. Les rsultats obtenus permettent de discuter des effets de la

synchronisation de la population sur le couplage entre photosynthse et absorption de nitrate.

Le modle est ensuite test dans ces conditions, et une formulation diffrente de ce processus

est propose. Grce une exprience au cours de laquelle les algues sont soumises une

photopriode et le nitrate constitue un facteur limitant, le chapitre VII tente de prciser

lexistence ventuelle dun contrle circadien de la division et de l'activit photosynthtique

par une horloge endogne.

Dans la quatrime section de ce manuscrit (chapitre VIII), nous testons les proprits

de modles empiriques (loi du minimum, loi multiplicative) traditionnellement utiliss en

biogochimie, que nous comparons ensuite au modle BioLOV. L'objectif est de dterminer si

la relative complexit de BioLOV est justifie par rapport ces modles.

Enfin la cinquime section (chapitre IX et conclusion) fait la synthse des diffrents

faits marquants observs lors des exprimentations et de ce quils peuvent impliquer pour

lexprimentation et la modlisation. Un bilan des proprits du modle BioLOV est ensuite

prsent et des perspectives de dveloppement et dapplication de ce modle sont proposes.

17

CHAPITRE II

Environnements contrls et

chmostats

Chapitre II Environnements contrls et chmostats

18

Chapitre II

Environnements contrls et chmostats

I. INTRODUCTION. ............................................................................................................. 19

II. DES ECOSYSTEMES EN LABORATOIRE. ............................................................... 19

III. METHODES ET PROPRIETES DES CULTURES DU PLANCTON. .................... 22

III.1. CULTURES CONFINEES.............................................................................................................................. 22

III.2. CULTURES EN CONTINUE. ......................................................................................................................... 23

a) Principe du chmostat. ............................................................................................................................ 23

b) Notion de taux de dilution. ...................................................................................................................... 24

c) Le rle de la concentration en substrat limitant Sin................................................................................ 25

d) Cas des cultures faiblement renouveles................................................................................................. 25

e) La dilution comme outil de slection gntique....................................................................................... 25

III.3. VERS UN SIMULATEUR DENVIRONNEMENT MARIN PILOTE PAR ORDINATEUR. ......................................... 26

a) Lquilibre, une situation peu reprsentative.......................................................................................... 26

b) Vers un simulateur denvironnement marin pilot par ordinateur.......................................................... 28


19

I. Introduction.

Les cologistes essaient de comprendre la complexit de la nature l'aide

dexprimentations au laboratoire et de reprsentations thoriques, les modles. Lors de ces

exprimentations, les organismes sont placs dans des conditions artificielles permettant

d'analyser leur rponse la variation dun ou plusieurs paramtres de leur environnement.

Cette approche est longtemps reste caricaturale car elle ne tient pas compte de la variabilit

naturelle du facteur tudi mais uniquement de lintensit de celui-ci. Dans la nature, les

organismes doivent non seulement rpondre lintensit des facteurs mais galement leur

variabilit temporelle qui induit une adaptation constante. Cette approche simplificatrice a

longtemps t utilise en raison de labsence de moyens techniques adquats. L'apparition de

dappareillages capables de raliser des chantillonnages haute frquence ou de contrler

automatiquement les conditions exprimentales de faon programme permet maintenant

denvisager des expriences o lon peut imposer des variations aux paramtres du milieu de

faon mimer les conditions naturelles, et ce, ventuellement avec des communauts

biologiques de plus en plus complexes.

II. Des cosystmes en laboratoire.

Paralllement au dveloppement de ces nouveaux moyens exprimentaux, les

changements climatiques ont incit les scientifiques tudier comment les cosystmes

terrestres y rpondaient. Il est pour cela ncessaire de connatre au pralable les acteurs

biologiques et leurs interactions au sein de milieux naturellement complexes et caractriss

par une importante variabilit de leurs conditions physico-chimiques. Le travail de terrain

constitue un moyen dobservation et de description de la structure dun environnement.

Cependant, il ne permet pas dvaluer de faon prcise les flux entrant et sortant, ni la rponse

des organismes aux changements du milieu, ce qui ncessite un chantillonnage intensif,

frquent et prolong des paramtres biologiques, physiques et chimiques. Si lexprimentation

en laboratoire permet de raliser ce type de mesure, il est en revanche beaucoup plus difficile

Figure II-1 : Lcotron est compos dun ensemble de chambres o les entres et les sortiessont contrles. Chaque chambre contient une communaut et peut tre connecte dautreschambres. (daprs NERC Centre for Population Biology).


20

de raliser un environnement artificiel proche des conditions relles observes sur le terrain.

Dans le milieu marin, un problme supplmentaire rside dans le fait que les

concentrations en phytoplancton sont parfois trop faibles pour permettre une tude fine des

processus de la croissance. De ce fait, ce type dtude nest actuellement envisageable qu'avec

des expriences en laboratoire mais pour cela, il est ncessaire d'utiliser des cultures o les

algues sont concentres par l'utilisation de milieux enrichis en sels nutritifs ce qui loigne

encore un peu plus les conditions de lexprience de la ralit. Malgr ceci, ces cultures

constituent lapproche privilgie pour tudier la physiologie du phytoplancton. Elles

bnficient en effet du cadre exprimental du laboratoire qui offre la possibilit de tester des

hypothses, de mesurer prcisment les flux entrant et sortant, et dacqurir des donnes

haute frquence sur des systmes idaliss, gnralement des populations monospcifiques ou

des maillons trophiques trs simplifis.

Un exemple d'approche intermdiaire entre l'observation in situ et les expriences en

laboratoire a t propose au dbut des annes 1990 avec lapparition des cotrons

(Thompson et al., 1993), cosystmes artificiels terrestres en milieux semi-ferms o les

entres (cest--dire les facteurs physiques, chimiques voire biologiques qui forcent le

systme) sont imposes et contrles par lexprimentateur (figure II-1). Les sorties - les

mesures - sont galement analyses. Elles correspondent ce qui est produit au final par

lcosystme (gaz, matire organique). Le niveau de complexit biologique est fix par

lexprimentateur. Le milieu est prpar de faon strile afin que lenvironnement

exprimental ne soit pas contamin par des organismes ou des composs qui pourraient

interagir avec ou nuire aux organismes tudis. Les expriences sont ralises en continu

une chelle de temps proche de lanne. Ce dispositif prsente de nombreux

avantages (Lawton, 1996): 1) le cadre et les limites des hypothses cologiques peuvent tre

testes, 2) il est possible de rpondre des questions qui ncessiteraient un travail trop

difficile ou onreux raliser sur le terrain, 3) lvolution globale de lcosystme peut tre

acclre par rapport un environnement naturel, 4) les expriences peuvent tre rptes

sans tre influences par les conditions climatiques du terrain, 5) les entres, les sorties et les

organismes peuvent tre mesurs et contrls.

Les cotrons pourraient trouver avantageusement leur place dans ltude du milieu

marin : les campagnes ocanographiques en mer sont onreuses, ponctuelles, lourdes


21

logistiquement, dpendantes des conditions mtorologiques et sont davantage orientes sur

lobservation du milieu que sur lexprimentation in situ, elle-mme difficile matriser et

suivre au cours du temps. Cependant, dvelopper un dispositif quivalent pour le milieu marin

est un dfi technique complexe, car, contrairement l'environnement terrestre, il est fortement

structur verticalement sur de grandes chelles avec des contraintes physico-chimiques

(temprature, salinit, pression, courant, intensit lumineuse, spectre lumineux, advection et

diffusion) dont la nature et la variabilit sont pour ainsi dire impossibles recrer en

laboratoire. Ce problme nest pas insoluble si lon tient compte du fait que le but nest pas

tant de crer une colonne deau, que den simuler exprimentalement les proprits. Sur ce

principe, il est possible, grce une programmation adquate d'quipements capables de faire

varier automatiquement les paramtres du milieu, de recrer la variabilit du milieu marin.

A dfaut de disposer, pour linstant, de systmes similaires aux cotrons, des msocosmes

sont couramment utiliss pour rcrer moindre chelle des environnements marins. Ces

dispositifs peuvent avoir un volume atteignant 10000 m3, et sont classiquement utiliss pour

tudier certains aspects de lcologie du plancton comme les effets des variations de

paramtres chimiques (vitaux ou potentiellement toxiques) du milieu (e.g. Chen & Durbin,

1994; Escaravage et al., 1996 ; Jacobsen et al., 1995 ; Siron et al., 1996), de la qualit de la

lumire, notamment les ultra-violets (e.g. Fauchot et al., 2000 ; Forster & Schubert, 2001), de

la temprature (e.g. Agawin et al, 2000 ; Keller et al., 1999) ou la rgulation de relations

trophiques simples (e.g. Bertolo et al.,2000 ; Nejstgaard et al., 1994). Cependant, ces

dispositifs ne sont pas trs adapts ltude des effets des processus physiques sur la

production primaire. En effet, d'un ct lutilisation denceintes de tailles modestes propices

des tudes physiologiques ne permet pas de reprsenter lhydrodynamisme local dans la

colonne deau; de l'autre, les msocosmes de volumes importants o lhydrodynamisme peut

tre un facteur significatif pour le milieu, sont difficiles manipuler sans provoquer une

contamination de l'enceinte par des organismes extrieurs indsirables.

Il se dgage donc deux difficults majeures dans la cration dun environnement

marin artificiel. Dune part, la variabilit des conditions physico-chimiques et leur

reprsentation verticale sont difficiles recrer exprimentalement. Dautre part, la

concentration des organismes modifie les proprits du milieu et peut affecter les

conditions biologiques des cultures (attnuation excessive de la lumire, excrtion de

composs par les cellules, etc ). Ces problmes sont relatifs la disproportion entre les


22

chelles spatiales et temporelles des processus physiques qui peuvent tre trs grandes et

celles des processus biologiques que l'on tudie gnralement l'chelle de la cellule ou

de l'organisme.

Les cologistes marins, dfaut de pouvoir recrer ces cosystmes, travaillent

gnralement sur les effets dun paramtre du milieu sur des populations monospcifiques et

sur le fonctionnement des maillons trophiques en ralisant des expriences simples. Les

connaissances issues de ces expriences permettent ensuite, une fois regroupes, davancer

des hypothses sur le fonctionnement des cosystmes. La suite de ce travail se focalisera sur

les dispositifs qui permettent destimer la production primaire au sein des cosystmes

marins.

III. Mthodes et proprits des cultures de phytoplancton.

III.1. Cultures confines.

Une approche simple, classiquement utilise en cophysiologie, consiste faire crotre

des algues dans un milieu enrichi et maintenu isol de l'extrieur. Ces cultures, dites fermes,

prsentent lavantage dtre faciles raliser mais comportent de nombreux inconvnients :

- Les substrats du milieu spuisent au cours du temps ce qui modifie les conditions de

croissance. Les produits de lexcrtion algale s'accumulent et peuvent devenir toxiques

pour la population (Le Floch, 2002) .

- Les concentrations initiales en sels nutritifs et les densits algales en cours dexprience

sont souvent trs suprieures celles observes dans le milieu marin, mais cette condition

est ncessaire pour avoir des concentrations mesurables par les instruments employs.

- L'puisement du milieu tant proportionnel la taille de la population, l'tude du systme

Culture volumeconstant V

Apport de milieu neuf dbit Qin

Export du trop plein dbit Qout

Export hors chmostat:- substrat rsiduel- cellules

Milieu de culture:- sels nutritifs en excs- 1 facteur limitant

Pompe PompeChmostat etmatriel biologique

Figure II-2 : Schma de principe du chmostat. Le milieu neuf est apport grce une pompeen mme temps que le trop plein est vacu. Pour que le volume de la culture reste constant,les dbits entrant et sortant, respectivement Qin et Qout doivent tre gaux. Le rapport entrele dbit entrant et le volume de la culture est gal au taux de dilution d (d=Qin/V) .


23

se rduit trois phases :

1) celle o les sels nutritifs sont abondants et non limitants pour la croissance qui est alors

exponentielle,

2) celle o les sels nutritifs atteignent des concentrations similaires aux teneurs

ocaniques qui sont limitantes pour la croissance. Cette phase correspond

approximativement la fin de la phase exponentielle,

3) une phase de plateau o le facteur limitant a disparu et o la densit de la population est

maximale avant que la population de plus en plus carence ne dgnre.

- L'absence de renouvellement de la culture restreint les possibilits d'chantillonnage.

III.2. Cultures en continue.

a) Principe du chmostat.

Il est possible de rsoudre en partie les inconvnients des cultures fermes en

travaillant avec un dispositif o le milieu est renouvel en permanence, le chmostat. Il a t

imagin peu prs simultanment et indpendamment par Monod (1950) et Novick et Szilard

(1950) pour ltude de la croissance de bactries. Les premiers avoir utilis ce type de

dispositif pour tudier les effets de la lumire et du taux de dilution sur les algues furent

Fujimoto et al. en 1956.

Le chmostat est une enceinte (figure II-2) alimente continuellement en milieu de

culture enrichi, et dont le volume est maintenu constant grce une vacuation galement

continue. Il est donc possible de raliser au cours du temps des chantillonnages beaucoup

plus nombreux que dans le cas dune culture ferme sans que son volume n'en soit

significativement modifi. Le milieu qui alimente le chmostat contient en excs tous les

lments nutritifs ncessaires la croissance des organismes, except un, qui dos faible

concentration (Sin) constitue le facteur limitant.

0.E+00

1.E+10

2.E+10

3.E+10

4.E+10

40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51

Temps (jours)

Bio

volu

me

(m

3 .L-1

)

0

0.5

1

1.5

Taux

de

croi

ssan

ce (j

-1)

Dilution : 0,385 j-1

Intensit lumineuse:95 E/m/s 27 E/m/s 57 E/m/s

Equilibre Dcroissance Accroissement de la population puis quilibreA B C

0.E+00

1.E+10

2.E+10

3.E+10

4.E+10

40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51

Temps (jours)

Bio

volu

me

(m

3 .L-1

)

0

0.5

1

1.5

Taux

de

croi

ssan

ce (j

-1)




0.E+00

1.E+10

2.E+10

3.E+10

4.E+10

40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51

Temps (jours)

Bio

volu

me

(m

3 .L-1

)

0

0.5

1

1.5

Taux

de

croi

ssan

ce (j

-1)




Biovolume Taux de croissance

Figure II-3 : Passage dune culture par diffrents tats - quilibre, dcroissance, croissance -par modification du rgime lumineux (dilution constante).Partie A: la culture est lquilibre, le taux de croissance est gal au taux de dilution et labiomasse est stable.Partie B: la lumire a t rduite un niveau qui entrane une dcroissance de la culture.Partie C: le nouveau niveau d'intensit lumineuse instaur, conjugu une disponibilitaccrue en substrat rsultant de la rduction du nombre de cellule, induit un taux de croissancesuprieur au taux de dilution. Au cours du temps le taux de croissance tend vers la valeur dutaux de dilution et la biomasse se stabilise progressivement.


24

b) Notion de taux de dilution.

Le taux de dilution est un paramtre exprimental important car il dtermine la fois l'apport

en facteur limitant et lexport de cellules et de substrats nutritifs non consomms, dits

rsiduels. La densit de cellules rsulte de la diffrence entre la croissance nette de la

population et son vacuation partielle par le trop plein. Si lon considre une culture pour

laquelle les conditions de croissance sont susceptibles de varier, les diffrences entre taux de

dilution et taux de croissance vont affecter la taille de la population positivement ou

ngativement. Afin dillustrer les effets de la dilution, nous prsentons ici 3 situations qui ont

t rencontres lors de nos expriences :

Le taux de dilution est trs suprieur au taux de croissance effectif. La quantit de

biomasse vacue est suprieure la production et la population dcrot (figure II-3,

cas B). Cette situation nest pas viable sur le long terme car la population est

physiquement limine du chmostat. On parle de lessivage lorsque cette situation

entrane la disparition de la culture.

Le taux de dilution est infrieur au taux de croissance effectif. La population saccrot,

ce qui saccompagne dune rduction de la disponibilit en substrat par cellule et donc

par une rduction progressive du taux de croissance qui tend vers un nouvel tat

dquilibre (voir le point suivant). Une telle situation, o le taux de croissance peut

tre suprieur au taux de dilution, est ncessairement transitoire. Elle rsulte d'une

amlioration passagre des conditions de croissance comme, par exemple, une

injection de sels nutritifs limitant ou laugmentation de lclairement (figure II-3 cas

C). Par analogie, ce cas trouve son quivalent au cours des phases de croissance

exponentielle des cultures fermes.

Le taux de dilution est gal au taux de croissance maximal. On parle alors de culture

lquilibre. Cet quilibre est atteint lorsque l'apport de facteur limitant quilibre les

besoins requis par la population pour maintenir une croissance gale au taux de

renouvellement de la culture. Dans cette situation, vers laquelle le systme tend


25

naturellement, la biomasse renouvele en permanence, nvolue plus en terme de

quantit, car ses pertes dues la dilution sont exactement compenses par

laccroissement net de la population (figure II-3 cas A). Cette situation sera discute

dans la partie III.3.

c) Le rle de la concentration en substrat limitant Sin.

La biomasse l'quilibre dpend non seulement du taux de dilution, mais aussi de la

concentration en substrat limitant Sin. Lexprimentateur peut ainsi ajuster la biomasse dans

le chmostat, qui est proportionnelle Sin l'quilibre.

d) Cas des cultures faiblement renouveles.

Sciandra et Ramani (1994) ont montr que, pour de faibles taux de renouvellement de

milieu neuf par unit de biomasse, obtenus pour des valeurs de Sin leves et/ou de dilutions

faibles, les niveaux de culture mesurs l'quilibre sont infrieurs ceux que prdit le modle

de croissance de Droop (Burmaster, 1979). Les causes de ces diffrences sont attribuables au

fait que, dans ces conditions de culture faiblement renouveles, le systme ouvert qu'est le

chmostat se rapproche d'un systme ferm avec tous ses inconvnients: accumulation dans le

milieu de produits dexcrtion par les algues potentiellement nocifs, mais qui peuvent

galement favoriser la production de bactries comptitrices pour le facteur limitant, si la

culture nest pas parfaitement axnique.

e) La dilution comme outil de slection gntique.

Le taux de dilution exerce une slection au sein de la population de cellules. Au cours

dune exprience, la ligne la mieux adapte aux conditions environnementales devient


26

dominante dans le chmostat. Cette proprit, observe exprimentalement par Droop (1974)

et Veldkamp (1976), fait du chmostat un outil de slection de souches largement utilis en

biotechnologie (pour la production de certains composs organiques comme les acides

amins). Par consquent, sil sagit deffectuer des exprimentations sur une population

homogne dans le temps, il est ncessaire de limiter la selection de lignes et lapparition de

proprits phnotypiques particulires en cherchant raliser des expriences les plus courtes

possibles.

III.3. Vers un simulateur denvironnement marin pilot par

ordinateur.

a) Lquilibre, une situation peu reprsentative.

La possibilit d'atteindre une situation singulire d'quilibre dans un chmostat a

constitu le cadre de nombreuses tudes, car elle permet de maintenir de faon viable une

population de cellules ltat stable pendant une dure bien plus longue que celle autorise

par l'utilisation des cultures fermes. Cet tat stable permet lacquisition rpte et prolonge

dun grand nombre de mesures de nature trs varie au cours dune mme exprience.

Cependant, selon Jannasch (1974), lquilibre dune culture ncessite 3 conditions qui incitent

penser que cette situation idale, reste somme toute loigne des conditions relles de

lenvironnement:

La premire condition considre que lorganisme doit tre capable de croissance

exponentielle et ne doit tre limit que par un facteur unique connu. Cette condition

est rarement remplie dans le milieu marin o les facteurs de croissance sont le plus

souvent colimitants, et agissent des niveaux cellulaires diffrents, de faon

simultane et avec des intensits diffrentes. Pour remplir cette condition,

lexprimentateur place les cultures dans des conditions environnementales optimales

except le paramtre dont on veut tudier leffet sur les organismes.

La seconde exigence implique une stabilit des conditions de croissance: clairement,


27

temprature et disponibilit en substrat doivent rester constants. Dans le domaine

ocanique, c'est plutt la variabilit de ces paramtres qui prdomine. Aucun d'entre

eux ne reste constant suffisamment longtemps pour quun quilibre durable puisse tre

atteint.

Lhomognit de la culture est la troisime condition. Mme petite chelle, cette

condition est rarement satisfaite dans le milieu marin. En effet, diffrents phnomnes

physiques ou biologiques peuvent provoquer l'agrgation des cellules et favoriser

ainsi lexportation de matire organique en profondeur (Prieto et al., 2002). Un de ces

mcanismes est par exemple un phnomne de formation dexudats l'origine des

TEP (Transparent Exopolymeric Particles) (Alldredge et al., 1993). Ces TEPs,

formes partir de polysaccharides prcurseurs issus essentiellement du

phytoplancton, de matires collodales, constituent un vecteur liguant pour les

particules marines qui deviennent agrges, et ce de trs petite chelle. Nanmoins,

les cultures tant sous agitation permanente, on fera par la suite lhypothse que le

milieu est homogne.

En dpit du caractre peu raliste des cultures lquilibre, cette approche constitue un

cadre largement utilis pour ltude du phytoplancton. Cette situation a longtemps perdur

parce quil nexistait pas de dispositifs capables de faire varier de faon raliste les conditions

environnementales. La relative facilit avec laquelle il est possible dobtenir un tat stable

et les avantages qui en dcoulent ont fait paradoxalement dune situation singulire, une

situation de quasi-rfrence pour tudier les rponses de la croissance diffrentes

conditions. Par extension, on considre gnralement que ces rponses restent

inchanges dans des environnements marins o les conditions varient perptuellement.

De ce fait, les donnes exprimentales acquises lquilibre constituent couramment la

matire premire pour construire et valider des modles destins tre appliqus au

milieu marin.

On peut donc penser que l'application de modles dvelopps et identifis ltat

stable au contraire des systmes caractriss par une forte variabilit dynamique peut

induire des biais que seules des expriences ralises sous conditions variables peuvent

permettre d'estimer.


28

b) Vers un simulateur denvironnement marin pilot par ordinateur.

Un dispositif exprimental destin recrer la variabilit des conditions de

lenvironnement marin doit donc prendre en compte la dynamique des conditions

environnementales qui prvalent dans la colonne d'eau. Cependant, il est matriellement trs

difficile, voire impossible de rcrer une colonne deau de taille pertinente pour ltude des

mcanismes lis la croissance du phytoplancton. Nanmoins, ce problme se simplifie si

lon considre le mouvement des cellules selon des points de vue eulriens et lagrangiens.

D'un point de vue eulrien, le dispositif exprimental doit permettre le dplacement

des cellules dans des environnements o les conditions du milieu sont diffrentes. Comme le

chmostat est un milieu suppos homogne, ce type d'approche ncessiterait un dispositif

compos de plusieurs chmostats soumis des conditions diffrentes (figure II-4). Ce systme

exprimental prsente lavantage de matrialiser, par exemple, des niveaux individualiss au

sein dune colonne deau et les changes entre ces niveaux. Cependant, ce dispositif est

complexe raliser, car il ncessite beaucoup de chmostats, ainsi que de systmes de mesure

et de contrle associs. Il implique galement de considrer des lements discrets de la

colonne deau, ce qui peut constituer une situation caricaturale.

La conception lagrangienne considre lvolution de lenvironnement que la cellule

peroit au cours de son dplacement (figure II-5) dans la colonne deau. Selon cette approche,

le contenu du chmostat ne reprsente pas un volume particulier de la colonne deau, mais

une population de cellules soumises des phnomnes d'advection et de diffusion. En faisant

varier continuellement des paramtres comme lclairement ou lenrichissement du milieu, on

peut ainsi "simuler" le dplacement de la population dans la colonne deau. Cette approche

prsente linconvnient de faire intervenir la notion de trajectoires de cellules qui sont

extrmement difficiles dterminer, soit par des mesures directes en mer, soit l'aide de

modles hydrodynamiques. Malgr ceci, la conception lagrangienne prsente lavantage de ne

ncessiter quun seul dispositif exprimental: les forages appliqus aux cultures sont

programms pour reproduire les conditions de croissance rencontres par les cellules au cours

de leurs dplacement dans la colonne d'eau.

Cette seconde approche a t retenue pour dvelopper au Laboratoire dOcanographie

Figure II-4 : Schma de principe dun systme exprimental reprsentant une colonne deauhtrogne selon une approche Eulrienne avec des chmostats relis en srie. Chaquechmostat reprsente une couche de la colonne deau avec un niveau d'intensit lumineusediffrent. Dans cette configuration, les mesures de sels nutritifs (SN), carbone particulaire (C)et de chlorophylle (Chl) devraient tre ralises dans chaque chmostat.

Couche n-1

Couche n

Couche n+1

Couche n+1

Couche n-1

Couche n

Lumire n+1

Lumire n

Lumire n-1

SN, Chl, C

SN, Chl, C

SN, Chl, CSN, Chl, C

SN, Chl, C

SN, Chl, C

M

E

S

U

R

E

S

Couche n-1

Couche n

Couche n+1

Couche n+1

Couche n-1

Couche n

Lumire n+1

Lumire n

Lumire n-1

SN, Chl, C

SN, Chl, C

SN, Chl, CSN, Chl, C

SN, Chl, C

SN, Chl, C

M

E

S

U

R

E

S

Colonne Chmostats

Profondeur

Position Y

Position X

Temps

Lum

ire

Temps

Nitr

a te

Temps

Tem

p ra

ture

Trajectoire dune cellule dans une rgion ocanique

Environnement physico-chimique peru par la cellule au cours du temps

Figure II-5 : Description lagrangienne de la position dune cellule dans une colonne deau.La cellule se dplace dans un espace 3 dimensions o les conditions physico-chimiquesvarient spatio-temporellement. Lapproche lagrangienne consiste reprsenter lvolutiontemporelle des paramtres de lenvironnement perue par la cellule au cours de sondplacement.


28

b) Vers un simulateur denvironnement marin pilot par ordinateur.

Un dispositif exprimental destin recrer la variabilit des conditions de

lenvironnement marin doit donc prendre en compte la dynamique des conditions

environnementales qui prvalent dans la colonne d'eau. Cependant, il est matriellement trs

difficile, voire impossible de rcrer une colonne deau de taille pertinente pour ltude des

mcanismes lis la croissance du phytoplancton. Nanmoins, ce problme se simplifie si

lon considre le mouvement des cellules selon des points de vue eulriens et lagrangiens.

D'un point de vue eulrien, le dispositif exprimental doit permettre le dplacement

des cellules dans des environnements o les conditions du milieu sont diffrentes. Comme le

chmostat est un milieu suppos homogne, ce type d'approche ncessiterait un dispositif

compos de plusieurs chmostats soumis des conditions diffrentes (figure II-4). Ce systme

exprimental prsente lavantage de matrialiser, par exemple, des niveaux individualiss au

sein dune colonne deau et les changes entre ces niveaux. Cependant, ce dispositif est

complexe raliser, car il ncessite beaucoup de chmostats, ainsi que de systmes de mesure

et de contrle associs. Il implique galement de considrer des lements discrets de la

colonne deau, ce qui peut constituer une situation caricaturale.

La conception lagrangienne considre lvolution de lenvironnement que la cellule

peroit au cours de son dplacement (figure II-5) dans la colonne deau. Selon cette approche,

le contenu du chmostat ne reprsente pas un volume particulier de la colonne deau, mais

une population de cellules soumises des phnomnes d'advection et de diffusion. En faisant

varier continuellement des paramtres comme lclairement ou lenrichissement du milieu, on

peut ainsi "simuler" le dplacement de la population dans la colonne deau. Cette approche

prsente linconvnient de faire intervenir la notion de trajectoires de cellules qui sont

extrmement difficiles dterminer, soit par des mesures directes en mer, soit l'aide de

modles hydrodynamiques. Malgr ceci, la conception lagrangienne prsente lavantage de ne

ncessiter quun seul dispositif exprimental: les forages appliqus aux cultures sont

programms pour reproduire les conditions de croissance rencontres par les cellules au cours

de leurs dplacement dans la colonne d'eau.

Cette seconde approche a t retenue pour dvelopper au Laboratoire dOcanographie

BactriesEchantillonnage manuel

AnalyseurCHN

AnalyseurHPLC

Microscope

CompteurHIAC

Spectrophotomtre

C.O.P.N.O.P.

Pigments

Chlorophylle aIn vivo / In vitro

Abondance cellulaireDiamtre

Biovolume

Autres

FiltrationPrparation

AutoanalyseurTechnicon

NitrateNitrite

Serveur SEMPO

Bullage

Culture

Milieu sortant

Milieu entrant

LumireQuantamtre

Quantamtre

VARIABLES MESUREES

Figure II-6 : Schma de principe du simulateur dEnvironnement Marin Pilot parOrdinateur. Les flches noires symbolisent les mouvements des fluides (culture, milieu neuf,air) vers les diffrents appareillages. Certains appareils (HIAC, spectrophotomtre,Technicon) ncessite une prparation automatique pralable de lchantillon (filtration,dilution, rinage de lappareil). Les traits en pointills symbolisent les changesdinformations entre les diffrents automates.

Figure II-7 : Synergie dune dmarche parallle de modlisation et dexprimentation autourdu Simulateur dEnvironnement Marin Pilot par Ordinateur dans le cadre de ltude de lacroissance du phytoplancton en environnement variable.

Trajectoires de particules

Environnement de la cellule chaque instant t

( lumire, sels nutritifs,temprature, etc )

Modlisation / ThorieModle de croissance phytoplanctonique

Modle hydrodynamique

Donnes exprimentalesChmostat(s)

sous conditions fluctuantes

Automates de contrlelumire, sels nutritifs,(temprature, etc...)


29

de Villefranche sur Mer le SEMPO (Simulateur dEnvironnement Marin Pilot par

Ordinateur). Ce dispositif (figure II-6), dont les lments seront dtaills dans le chapitre

suivant, est compos dun rseau dordinateurs permettant de grer d'une part des dautomates

contrlant les conditions variables de lumire, de substrat et de dilution, et d'autre part des

appareils d'analyse ralisant de faon autonome la mesure de certaines variables forantes et

d'tat de la culture. Les donnes recueillies sont ensuite rassembles sur un serveur.

Ce dispositif permet lacquisition de donnes haute frquence au sein dun

environnement dont les caractristiques et lvolution sont programmes par

lexprimentateur. La flexibilit du systme permet de recrer des situations types, soit

partir de donnes issues de campagnes la mer, soit partir de cas thoriques destines

mettre en avant ou tester des hypothses sur certains processus biologiques. Ce systme

permet de tester en temps rel leffet des forages dun modle physique sur la croissance

phytoplanctonique, puis de comparer ces observations aux proprits thoriques issues de

modles biologiques contraints par ces mmes forages (figure II-7). Bien que ce dispositif

soit encore en dveloppement, ces diffrentes approches ont t mises en uvre pour la

prsente tude.

30

CHAPITRE III

Matriel et Mthodes

Chapitre III Matriel et mthodes

31

Chapitre III

Matriel et mthodes

I. INTRODUCTION. ............................................................................................................. 32

II. THALASSIOSIRA WEISSFLOGII. ................................................................................. 32

III. CONTROLE DE LENVIRONNEMENT PHYSICO-CHIMIQUE ET DES

CARACTERISTIQUES BIOLOGIQUES DE LA CULTURE. ........................................ 33

III.1. COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURES.................................................................... 33

III.2. RENOUVELLEMENT ET HOMOGENEISATION DES CULTURES........................................... 34

III.3. CONTROLE DE LINTENSITE LUMINEUSE. ...................................................................... 34

III.4. BULLAGE...................................................................................................................... 35

III.5. TEMPERATURE.............................................................................................................. 36

III.6. AXENICITE.................................................................................................................... 36

IV. MESURES REALISEES................................................................................................. 37

IV.1. NITRATE ET NITRITE. .................................................................................................... 37

IV.2. COMPTAGE OPTIQUE DE LA POPULATION PHYTOPLANCTONIQUE. ................................. 38

IV.3. CARBONE ET AZOTE PARTICULAIRES. ........................................................................... 40

IV.4. PIGMENTS..................................................................................................................... 40

a) Dosages in vitro de la chlorophylle a et des pigments. ............................................... 40

b) Dtermination in vivo de la chlorophylle a. ................................................................ 41


32

I. Introduction.

Ce chapitre prsente l'ensemble des dispositifs utiliss lors des expriences prsentes

dans ce document. Dans le chapitre prcdent consacr aux environnements contrls, nous

avons dj prsent une vue d'ensemble du dispositif destin recrer certaines proprits

physico-chimiques du milieu marin. Nous dtaillons ici les diffrents appareils et mthodes de

mesures employs lors de nos exprimentations.

II. Thalassiosira weissflogii.

Lespce utilise durant cette tude, Thalassiosira weissflogii (Grunow) (Fryxell &

Hasle, 1979), appartient la classe des coscinodiscophyceae (diatome). La souche

(CCMP1053), fournie par le Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine

Phytoplankton (CCMP - Bigelow Laboratory for Ocean Science, tats-unis) est entretenue

strilement au laboratoire dans des erlens contenant un milieu F/2 (Guillard, 1975 ; Guillard et

Ryther, 1962), 17C sous lumire continue. Une seconde souche a t fournie

ultrieurement par lAVCR - Laboratory of Photosynthesis (Institute of Microbiology,

Trebon, Rpublique Tchque) car il tait ncessaire pour raliser la premire exprience du

projet APPLE, dutiliser des marqueurs biomolculaires mis au point pour cette souche.

Les souches utilises prsentent une structure daspect cylindrique de 6 15 m de

longueur et 6 m de largeur. Les mesures ralises laide du compteur optique de particules

HIAC donnent un diamtre sphrique quivalent de 10 15 m, comparable aux indications

fournies.


33

III. Contrle de lenvironnement physico-chimique et des

caractristiques biologiques de la culture.

Ce chapitre dtaille la faon dont est contrl lenvironnement des cellules et par

consquent leur croissance. Le terme contrle sapplique la surveillance en temps rel

des caractristiques du milieu suivant une consigne programme l'avance pour les

expriences.

III.1. Composition des milieux de cultures

Les milieux de culture sont raliss partir deau de mer pompe 1m de profondeur

la sortie de la rade de Villefranche sur Mer (Point B) et une prparation F/2 (Guillard &

Ryther, 1962, Guillard, 1975) avec une concentration en nitrate ajuste selon les besoins de

lexprience. Dans un premier temps, leau est filtre sur une cartouche Millipore de 1 m

puis stocke plusieurs semaines dans des bidons de 60 L en polythylne. Lors de la

prparation dune nouvelle exprience, leau de mer est nouveau filtre sur 0,22 m, puis

autoclave (120C pendant 30 minutes) dans des bidons Nalgne en polycarbonate de 20 L,

lesquels refroidissent ensuite pendant plusieurs jours ce qui permet au milieu de squilibrer

avec la pression partielle de CO2 atmosphrique. Les bidons sont protgs dune

contamination bactrienne grce des filtres air Millipore Hepavent placs au niveau des

bouchons.

Le milieu F/2 et le nitrate sont rajouts strilement l'aide d'une seringue, une aiguille

et un filtre seringue strile (Corning SFCA de porosit 0,25 m). Les bonbonnes sont utilises

par sries de 5, pour le remplissage initial des chmostats puis comme rserve de milieu pour

le maintien des cultures durant les expriences.

Pour contrler que la concentration en nitrate dans le milieu denrichissement n'volue

pas au cours du temps, un dosage est effectu lors de la mise en place de nouveaux bidons,

lorsquils sont mi-volume et lorsquils sont presque vides.


34

III.2. Renouvellement et homognisation des cultures.

Les flux entrant et sortant des chmostats sont assurs par des pompes pristaltiques

de prcision (Gilson) dont le dbit, mesur par pese, est ajust en fonction du taux de

dilution souhait. Lusure des tubes de pompes pristaltiques peut entraner une drive du

dbit, ce qui ncessite un contrle rgulier de celui-ci, ralis manuellement. Le milieu arrive

dans le chmostat par une canule en verre situe quelques centimtres au-dessus de la

surface, et tombe dans la culture au goutte goutte. Les pompes pristaltiques assurent

galement lvacuation du trop plein de la culture via un tube affleurant sa surface.

Lhomognit de la culture est assure par un barreau aimant en tflon et un

agitateur magntique plac sous chaque chmostat. Un film compos de cellules et de matire

organique a nanmoins pu se dposer au cours des expriences sur les canules, le barreau

aimant, les parois du chmostat, et se dvelopper galement la surface de la culture, ce qui

a rgulirement requis une remise en suspension par agitation des enceintes. En effet, des tests

ont montr que ce dpt pouvait biaiser les mesures dabsorption, ainsi que le dnombrement

des cellules.

Nous considrons que les effets de lagitation sont ngligeables sur la physiologie des

cellules bien que certaines espces prsentent une sensibilit la turbulence (Thomas &

Gibson, 1990).

III.3. Contrle de lintensit lumineuse.

Le contrle de lintensit lumineuse est un des aspects les plus critiques et

dterminants pour le bon droulement des expriences, dans la mesure o la quantit de

lumire reue par les algues dpend la fois de lintensit des sources lumineuses, de la

configuration spatiale des chmostats, et galement de la concentration alguale. Pour le besoin

de ltude, il est ncessaire de connatre en permanence le flux de photons reu par les algues,

mais galement de pouvoir imposer une intensit lumineuse particulire un moment donn.

Lclairage est constitu de deux rampes places de part et d'autre de lespace de

travail, composes chacune de 6 nons Dulux (OSRAM) de 55W. Ltat allum ou teint, et


35

lintensit de chaque non est assure par un ballast Quicktronic (OSRAM). Il possde une

entre analogique en tension (0-10V) qui permet de moduler lallumage et lintensit du non,

via la tension envoye par un ordinateur quip dune carte plusieurs entres/sorties

analogiques. Un programme dvelopp au sein du laboratoire pilote la carte de faon

transparente pour lutilisateur, ce qui lui permet de travailler selon trois configurations : en

lumire constante, en cycle jour/nuit avec un signal en cloche, ou l'aide dun fichier qui

programme lintensit lumineuse au cours du temps. Cette troisime option offre la possibilit

de simuler des donnes issues du terrain, ou bien des sorties de modle dcrivant la trajectoire

des cellules dans une colonne deau.

Lordinateur est galement connect deux quantamtres sphriques 2 (QSL-100 et

QSL-2100, Biospherical Instruments Inc). Lun est fix de faon permanente au centre de

lespace exprimental, et sert contrler une ventuelle drive des lampes. Le second est

plong successivement au cours du temps dans chaque chmostat, ce qui permet ainsi de

connatre le flux lumineux reu dans chaque culture soit par mesure directe, soit par

interpolation partir de lenregistrement du quantamtre qui reste lair libre.

Le champ lumineux peut varier dune exprience lautre suivant le nombre de

chmostats utiliss et leur volume. Nous ralisons donc un talonnage en dbut dexprience :

sur un cycle, le programme tablit la correspondance entre la tension (0-10V) envoye dans

les ballasts et lintensit lumineuse reue au centre dun chmostat rempli de milieu. Le

systme permet datteindre une intensit de lordre de 1500 mol quanta.m-2.s-1 au centre

dun espace comportant quatre chmostats.

III.4. Bullage.

Le bullage dair permet de maintenir la pression partielle de CO2 (pCO2) et donc le pH

de la culture des valeurs qui n'excde pas trop les niveaux standards de leau de mer

naturelle (cest dire environ 8,20). Le Floch (2002) souligne que dans les milieux neufs

rcemment autoclavs, la pCO2 est gnralement trs leve ce qui impose de laisser les

milieux reposer plusieurs jours avant leur utilisation. Lair est dbarrass des composs

organiques et des particules par lutilisation dune cartouche de charbon actif (Carbon Cap) et


36

dune cartouche de filtration de 0,3 m (Gamma Whatman). Lvacuation des gaz hors des

chmostats est ralise travers un filtre Hepa-Vent.

III.5. Temprature

Les chmostats comportent une double paroi permettant la circulation de leau

dsionise et thermostate 17C +/- 0,1C au moyen deux cryostats indpendants.

III.6. Axnicit

Les souches algales sont repiques rgulirement en conditions axniques. Toutes les

parties hydrauliques des appareillages et des chmostats sont changes chaque exprience et

rinces lacide chlorhydrique 10%. Les chmostats sont compltement remplis dacide avant

le dbut de lexprience, puis rincs avec le milieu de culture prpar afin den liminer les

traces dacide avant le remplissage final du chmostat. Le pH doit tre comparable celui de

leau de mer (8,2) au dbut de lexprience.

Le phytoplancton et les bactries prsentent des relations complexes pouvant aller de

la symbiose au parasitisme (Le Floch, 2002). Les cultures faiblement renouveles peuvent

tre le sige d'une comptition entre phytoplancton et bactries (Sciandra & Ramani, 1994).

Des comptages bactriens (DAPI) et une observation au microscope permettent de sassurer

de ltat des algues et de la prsence ventuelle de bactries. Les diffrences entre les mesures

de nitrate dans les bidons de milieu neuf et les mesures dazote particulaires dans les cultures

peuvent galement servir d'indices quant une comptition entre microalgues et bactries.


37

IV. Mesures ralises.

Le dispositif de culture prsente la particularit dautomatiser certaines mesures. Le

dveloppement d'automates pilots par ordinateur a t initi depuis de nombreuses annes au

sein de lquipe (Malara & Sciandra, 1991 ; Bernard, 1995 ; Le Floch, 2002), et se poursuit

actuellement dans le cadre du projet de Simulateur dEnvironnement Marin Pilot par

Ordinateur (SEMPO). Ce projet ma permis de participer au dveloppement dun serveur

informatique (Prvost & Beuzet, 2003) ddi au pilotage centralis des automates et au

stockage des donnes. Mon rle a essentiellement t de rflchir aux problmes daccs et de

pilotage distance des automates, dinterprtation des fichiers de donnes, de lergonomie de

linterface du dispositif, et sur des questions de programmation.

Les automates permettent de raliser certaines mesures haute frquence dans la

limite de la maintenance raliser (changements de filtres, ractifs, etc.) et des volumes

prlevs par rapport au renouvellement de la culture. Il sagit des nitrate, nitrite, des spectres

dabsorption, ainsi que le comptage des particules. Dautres prlvements sont manuels et

concernent les mesures de carbone et dazote particulaires, et de flurorescence. Limportant

volume ncessaire aux mesures manuelles ainsi que les contraintes de prsence imposes

lexprimentateur restreignent les frquences des mesures automatiques. Les chantillons de

culture sont prlevs de faon viter les risques de contaminations bactriennes au moyen de

canules de verre plonges de faon permanente dans les chmostats et termines par des

clapets empchant un retour du fluide vers les cultures.

IV.1. Nitrate et nitrite.

Les nitrates et nitrites sont doss au moyen dune chane danalyse Technicon. Le

dosage du nitrite repose sur la mthode de Benshneider et Robinson (1952) : le nitrite est

transform par diazotation avec du sulfanilamide et addition de N-1-naphtylthylne-diamine

en un complexe diazoique donnant la solution une couleur rose dont lintensit est mesure


38

au moyen dun colorimtre. Le dosage du nitrate est ralis aprs sa rduction en nitrite par

une colonne de cadmium-cuivre selon le protocole de Wood et al. (1967).

La mesure est entirement automatise et pilote par un ordinateur. Le programme

gre la fois le pompage, la filtration des chantillons, les cycles de rinages de la chane

danalyse, ltalonnage du dispositif, le passage des chantillons et lenregistrement des

rsultats. Les chantillons sont dans un premier temps dbarrasss des cellules via deux

rampes de 8 filtres en fibres de verre Gelman A/E de 13 mm de diamtre sur support

Millipore Swinnex prcds chacun par une lectrovanne. Lordinateur gre lactivation des

lectrovannes selon le nombre de passage par filtre afin dviter leur colmatage. Lchantillon

est au besoin dilu 10 fois, la chane ne pouvant doser linairement que des concentrations

infrieures 5 atg.L-1. Une phase dtalonnage permet de dterminer le gain des

colorimtres et lefficacit de la colonne de rduction nitrate/nitrite. Connaissant ces

paramtres, les concentrations des chantillons sont automatiquement calcules lors de leurs

passages et stockes dans un fichier.

IV.2. Comptage optique de la population phytoplanctonique.

Le comptage des cellules et la mesure de leur diamtre sont assurs par un compteur

optique HIAC 9700 (Pacific Scientific Instruments) et un automate dilueur. Le principe de

cette mesure repose sur le passage des particules une une travers un faisceau laser.

Lombre projete des particules est mesure par un capteur, donnant ainsi des informations

sur le nombre et la section efficace des cellules. Les rsultats sont fournis sous forme de

spectres dabondance selon diffrentes classes de tailles, rparties entre 1,6 m et 30 m. En

dbut dexprience, des mesures complmentaires sont ralises manuellement avec une

cellule de Lemaur sous microscope. En effet, afin de ne pas saturer lappareil, lchantillon

doit contenir moins de 10000 12000 particules par millilitre. Avant chaque comptage, les

chantillons sont dilus par un automate (bas sur seringue monte sur un piston lectrique).

Lautomate assure le choix du chmostat, la dilution de l'chantillon, le remplissage et la

vidange du bcher de mesure du HIAC. Un cycle de mesure comporte deux blancs raliss

partir deau de mer filtre, quatre rplicats dilus par chmostat, un rinage lacide et un

rinage final leau distille.


39

Le nombre N de particules contenues dans un volume V pour un groupe de classes

numrotes de iinf et isup se dfinit par la formule suivante :

=

=sup

inf

1 i

iiinV

N (III.1)

o ni est le nombre de particules dans la classe i. Le diamtre moyen D sexprime selon la

relation suivante :

=

=sup

inf

1 i

iiii ndN

D (III.2) avec 2

1++= iiiddd (III.3)

id est le diamtre moyen de la classe de taille i qui contient les particules comprises entre di et

di+1.

Le calcul du biovolume (III.4) ncessite de calculer au pralable les volumes sphriques

quivalents moyens (III.5) pour chaque classe concerne (III.4) :

=

=sup

inf

1 i

iiii nvV

B

(III.4) avec 6

3

ii

dv = (III.5)

Le biovolume est le produit du nombre et du volume des cellules. Il peut tre

considr comme un indicateur de la biomasse. En comparant les donnes de biovolume avec

les mesures de carbone particulaire, il apparat une relation linaire entre ces grandeurs

(Sciandra et al., 1997). Par consquent, sous rserve davoir mis en vidence ce type de

relation, le biovolume peut servir destimateur de la quantit de carbone particulaire prsente

dans la culture.

Bien que simples, ces calculs se rvleraient vite fastidieux compte tenu de la quantit

des donnes. Les fichiers sont transforms dans un format exploitable au moyen dune

macrocommande crite en Visual Basic for Applications et fonctionnant sous Excel

(Microsoft). Les sries temporelles obtenues font galement lobjet de lissages (TableCurve


40

2D, AISN Software).

IV.3. Carbone et azote particulaires.

Le carbone (COP) et l'azote organiques particulaires (NOP) sont dtermines

manuellement. Des triplicats de 25 50 ml de culture sont filtrs sur filtres GF/C (Whatman)

pralablement placs au four 400C pendant 10 heures. Les chantillons sont ensuite placs

ltuve 60C jusqu leur analyse grce un analyseur Leco 900 CHN.

IV.4. Pigments.

Diffrentes mthodes automatiques ou manuelles ont t utilises pour le dosage des

pigments, et en particulier de la chlorophylle a. Ces dosages sont dlicats en raison de la

rapide dgradation des pigments lair libre. Au moins deux mthodes ont t mises en uvre

pour s'assurer de la validit des mesures.

a) Dosages in vitro de la chlorophylle a et des pigments.

Les mesures manuelles ncessite la filtration en triplicats de 25 50 ml de culture sur

filtres GF/C (Whatman). Les chantillons placs dans des tubes Nalgene sont immdiatement

plongs dans lazote liquide 180C puis stocks dans un conglateur 80C. Deux

mt

Documents

THÈSE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITÉ PARIS 6 · significant consequences on their capacity to simulate biomass in a realistic way. It also ... Céline Heyndrickx et Stéphanie Sabini