these Fabien Lefebvre - Thèses · Mutagenèse dirigée ... formation d’un individu composé de nombreux types cellulaires ... de monomères d’actine-G polymérisés en longs

Université Victor Segalen Bordeaux 2

Année 2009 Thèse n°1648

THESE

Pour le

DOCTORAT DE L’UNIVERSITE BORDEAUX 2

Mention : Sciences Biologiques et Médicales

Option : Biologie-Santé

Présentée et soutenue publiquement le :

15 Décembre 2009

Par

Fabien LEFEBVRE

Né le 4 Juillet 1983

La polarité cellulaire chez la levure

Saccharomyces cerevisiae :

Etude de la régulation de la protéine

RhoGAP Rgd1 à domaine F-BAR.

Membres du Jury :

M M. Aigle, Professeur Université Lyon 1 Président

Mme B. Winsor, Directrice de recherche CNRS, Strasbourg Rapporteur

Mme M.H. Cuif, Maître de conférences, Université Paris-Sud 11 Rapporteur

Mme V. Moreau, Chargée de recherche, Université Bordeaux 2 Examinateur

M M. Crouzet, Professeur, Université Bordeaux 2 Examinateur

M F. Doignon, Professeur, Université Bordeaux 2 Directeur de thèse

ABREVATIONS

ADN acide désoxyribonucléique

APS persulfate d’ammonium

ATP adénosine 5' triphosphate

EDTA acide éthylène diamine tétraacétique

FITC fluorescéine isothiocyanate

GDP guanosine 5' diphosphate

GFP green fluorescent protein

GMP guanosine 5' monophosphate

GTP guanosine 5' triphosphate

LiAC acétate de lithium

PCR polymerase chain reaction

PEG polyéthylène glycol

PMFS phenyl methyl sulfoxyde fluoride

rpm rotation par minute

SDS sodium dodécyl sulfate

SPB sindle pole body

Tris tris hydroxymethylaminomethane

UV ultra violet

TABLE DES MATIERES INTRODUCTION............................................................................................... 1

A. Généralités sur la polarité cellulaire...................................................... 1 1. Le cytosquelette d’actine .................................................................. 2 2. Le cytosquelette de microtubules ..................................................... 3 3. Le trafic intracellulaire ..................................................................... 3 4. Les septines....................................................................................... 3

B. Les GTPases de la super-famille Ras.................................................... 4 1. Les régulateurs des petites protéines G ............................................ 5 2. Les protéines Rho chez l’Homme .................................................... 5 3. Les protéines Rho chez la levure...................................................... 6 4. La croissance polarisée chez Saccharomyces cerevisiae et l’implication des protéines Rho ................................................................ 7 5. Les régulateurs des protéines Rho3p et Rho4p ................................ 9

C. Objectifs .............................................................................................. 10 MATERIELS ET METHODES.......................................................................... 12

A. Matériel biologique ............................................................................. 12 1. Souches de levure ........................................................................... 12 2. Souches bactériennes ...................................................................... 12 3. Vecteurs de clonage et d'expression ............................................... 12

B. Méthodes microbiologiques ................................................................ 14 1. Milieu pour bactéries ...................................................................... 14 2. Milieux pour levures....................................................................... 14 3. Conditions de culture et de conservation........................................ 15 4. Suivi de la croissance cellulaire...................................................... 16 5. Mesure de la viabilité cellulaire...................................................... 16 6. Tests en gouttes............................................................................... 16 7. Obtention des zygotes..................................................................... 17 8. Obtention des haploïdes.................................................................. 17 9. Condition de culture de levures permettant la mise en place d’un stress acide............................................................................................... 17 10. Synchronisation cellulaire au facteur alpha.................................... 18

C. Manipulation des acides nucléiques.................................................... 18 1. Extraction d'ADN ........................................................................... 18 2. Hydrolyse et ligation de l'ADN ...................................................... 18 3. Amplification d'ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction) ...... 19 4. Mutagenèse dirigée......................................................................... 19 5. Séquençage d'ADN......................................................................... 19 6. Séparation des acides nucléiques par électrophorèse sur gel d'agarose et purification d'ADN.............................................................. 20

7. Transformation des bactéries E. coli .............................................. 21 8. Transformation des levures S. cerevisiae ....................................... 21

D. Préparation et analyse des protéines ................................................... 22 1. Extraction des protéines totales de levure ...................................... 22 2. Quantification des extraits protéiques ............................................ 22 3. Electrophorèse des protéines en gel d'acrylamide.......................... 23 4. Immunodétection des protéines sur membrane .............................. 23

E. Recherche d'interactions physiques entre protéines par le système double hybride............................................................................................. 24

1. Principe du double hybride............................................................. 24 2. Réalisation des tests double hybride............................................... 24

F. Méthode de biologie cellulaire............................................................ 25 1. Observation des cellules en microscopie à fluorescence................ 25 2. Marquage de l'actine-F par la phalloïdine-Alexa568 ....................... 26 3. Marquage nucléaire au DAPI ......................................................... 26 4. Immunocytochimie ......................................................................... 27

G. Fractionnement subcellulaire .............................................................. 28 1. Extraction des protéines totales à partir de sphéroplastes .............. 28 2. Centrifugations différentielles ........................................................ 28 3. Centrifugation sur gradient de saccharose...................................... 29 4. Tests d’activités enzymatiques ....................................................... 30

a) Mesure de l’activité ATPasique .................................................. 30 b) Mesure de l’activité GDPasique du cis-Golgi............................. 30 c) Mesure de l’activité cytochrome c réductase du réticulum endoplasmique..................................................................................... 31 d) Calcul des activités spécifiques................................................... 31

H. Mesure de activité RhoGAP................................................................ 32 1. Activité GAP en condition standard............................................... 32 2. Préparation des phospholipides pour les activités RhoGAP .......... 33

I. Test d’interaction protéine-lipide par« fat-Western-blot » ................. 34 J. Mesure de l’abondance, de la synthèse et de la dégradation .............. 34

1. Mesure de l’abondance de Rgd1p. ................................................. 34 2. Mesure de la vitesse de synthèse de Rgd1p.................................... 35

a) Lyse des cellules.......................................................................... 35 b) Immunoprécipitation ................................................................... 36

3. Mesure de la stabilité de la protéine Rgd1p ................................... 36 RESULTATS ...................................................................................................... 37

Chapitre I. Relation entre Rgd1p et les cytosquelettes .............................. 37 A. Relation entre le domaine RhoGAP de Rgd1p et le cytosquelette d’actine ........................................................................................................ 38

1. Contexte .......................................................................................... 38 2. Résultats.......................................................................................... 39

a) Le cytosquelette d’actine est-il affecté dans un mutant rgd1! en conditions standards de culture ? ........................................................ 39 b) Le pH acide affecte-t-il la polarité du cytosquelette d’actine dans un mutant rgd1! ?............................................................................... 39 c) Visualisation du cytosquelette d’actine avec ABP1-3xGFP....... 40 d) Marquage du cytosquelette d’actine à la phalloïdine.................. 41

3. Conclusion ...................................................................................... 42 B. Existe-t-il une interaction entre Rgd1p et les microtubules ? ............. 43

1. Existe-t-il une interaction entre Rgd1p et les microtubules in vitro ? 44 2. Existe-t-il une interaction entre Rgd1p et les microtubules in vivo ? 44

a) Recherche de létalités synthétiques avec le gène RGD1 ............ 45 b) Effet du benomyl sur la croissance du mutant rgd1! ................. 46 c) Etude du phénotype de binucléation chez le mutant rgd1! ....... 46 d) Localisation cellulaire de la protéine Rgd1................................. 47

3. Conclusion ...................................................................................... 48 C. La phosphorylation de Rgd1p pourrait-elle conditionner une interaction avec les microtubules ? ............................................................. 49

1. Généralités ...................................................................................... 49 2. Quelle est la localisation de Rgd1 dans un mutant ipl1 ?............... 50 3. La serine S143 a-t-elle un rôle dans la localisation de Rgd1 ? ...... 51 4. Caractérisation de la localisation particulière de Rgd1-3GFP observée dans un mutant ipl1-321........................................................... 52 5. Quelle est la localisation de Rgd1-3GFP dans un mutant fyv8! ? . 53 6. Conclusion ...................................................................................... 53

D. Conclusions générales et perspectives ................................................ 54 Chapitre II. Etude de la régulation de Rgd1p, protéine RhoGAP à domaine F-BAR .................................................................................................. 56

A. Généralités........................................................................................... 56 1. Mise en évidence du domaine F-BAR............................................ 56 2. Protéines RhoGAP à domaine F-BAR et pathologies humaines. .. 57 3. Les protéines à domaine F-BAR chez la levure. ............................ 58

B. Régulation de Rgd1p par les phospholipides. ..................................... 58 1. Effets des phospholipides sur les protéines à activité GAP. .......... 58 2. Problématique ................................................................................. 59 3. Les phospholipides ont-ils un rôle dans la régulation de l’activité RhoGAP et dans la localisation de Rgd1p ? ........................................... 60 4. Les phosphoinositides autres que le PtdIns(4)P et le PtdIns(4,5)P2

ont-ils un rôle dans la régulation de la localisation de Rgd1p ? ............. 69 C. Le trafic intracellulaire intervient-il dans la localisation apicale de Rgd1p ?........................................................................................................ 70

1. La localisation de Rgd1p est-elle perturbée dans des mutants affectés pour le trafic intracellulaire ?..................................................... 71 2. Dans quel compartiment biologique Rgd1p est-elle localisée ? .... 73

a) Fractionnement cellulaire par centrifugations différentielles ..... 74 b) Fractionnement cellulaire par centrifugation sur gradient de saccharose............................................................................................ 75

3. Conclusion ...................................................................................... 77 D. Localisation de Rgd1p au niveau du cou du bourgeon ....................... 80

1. Généralités sur la cytocinèse chez S. cerevisiae............................. 80 2. Rgd1p interagit avec de nombreux acteurs de la cytocinèse.......... 81 3. La localisation de Rgd1p au cou du bourgeon dépend-t-elle du cycle cellulaire ?...................................................................................... 82

a) A quelle phase du cycle cellulaire Rgd1p est-elle localisée au cou du bourgeon ? ...................................................................................... 82 b) A quelle étape de la phase mitotique Rgd1p est-elle localisée au cou ? .................................................................................................... 83

4. Comment Rgd1p est-elle recrutée au niveau du cou ? ................... 84 a) Interaction avec les septines........................................................ 85 b) Comment Rgd1p et Hof1p interagissent-elles ? ......................... 85

5. Conclusion ...................................................................................... 86 E. Etude de l’abondance de la protéine Rgd1p au cours du cycle cellulaire. ..................................................................................................... 87

1. Abondance de la protéine Rgd1...................................................... 88 2. Synthèse de Rgd1p au cours du cycle ............................................ 88 3. Stabilité de la protéine Rgd1 .......................................................... 89 4. Conclusion et perspectives ............................................................. 89

CONCLUSION ................................................................................................... 91 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................ 97

INTRODUCTION

NeuronesPaul De Koninck

Greenspine.ca.

Cellules immunitairesAtlas, Ronald M.

Principles of Microbiology

Cellules endothélialesSouthern Illinois University

School of medecine web site

Levure Saccharomyces cerevisiaeWheal EA.

Max Plank Institut

Figure 1 : Exemples de cellules polarisées.

INTRODUCTION

A. Généralités sur la polarité cellulaire

Au cours de l’évolution, des organismes présentant une immense diversité sont

apparus et ont colonisé les milieux les plus variés et les plus hostiles. Au delà de cette

biodiversité, il existe une unité du vivant. De nombreux mécanismes homologues sont

retrouvés dans des organismes phylogénétiquement et morphologiquement éloignés (Drubin

& Nelson, 1996). Chez les eucaryotes, c’est par exemple le cas du contrôle du cycle cellulaire

par la famille des protéines CDK (Cyclin Dependent Kinase) (Kaldis, 1999) et de la

ségrégation des chromosomes lors de la division cellulaire, contrôlée entre autres par les

protéines du kinétochore (Kitagawa & Hieter, 2001).

Un autre phénomène conservé au cours de l’évolution est la capacité des cellules à se

polariser (Figure 1). La polarité cellulaire comprend un ensemble de mécanismes permettant

l’acquisition d’une morphologie particulière, la migration cellulaire ou encore un trafic

intracellulaire polarisé (Ridley, 2001). Ainsi, chez les métazoaires, tous les mécanismes de la

polarité cellulaire seront mis en œuvre, notamment lors du développement de l’organisme au

cours duquel des cellules totipotentes embryonnaires non différenciées conduiront à la

formation d’un individu composé de nombreux types cellulaires distincts, avec des

caractéristiques morphologiques et fonctionnelles très différentes. Nous pouvons notamment

citer l’exemple des cellules endothéliales qui possèdent des morphologies et fonctions

différentes entre leurs faces apicale et basale (Barnhart & Baechler, 1978). La différenciation

et la migration neuronale mettent également en jeu les mécanismes de polarité cellulaire qui

conduiront à l’acquisition de la morphologie des neurones ainsi qu’à la sécrétion polarisée des

neurotransmetteurs le long de l’axone jusqu’à la synapse (Cameron et al., 1993).

La polarité cellulaire est issue de la combinaison de différents mécanismes

globalement conservés au cours de l’évolution, comprenant les acteurs de la dynamique des

cytosquelettes d’actine et de microtubules, du transport de vésicules et de leur ciblage vers des

zones particulières de la cellule (Watanabe & Higashida, 2004).

1

1. Le cytosquelette d’actine

L’actine est une petite protéine ubiquitaire présente chez tous les organismes

eucaryotes. Cette protéine cytoplasmique très abondante peut représenter plus de 5% des

protéines totales de la cellule (Ng & Abelson, 1980). Dans la cellule, l’actine existe sous une

forme monomérique globulaire de 42 kDa (actine-G) et sous une forme filamenteuse (actine-

F) constituée d’une suite de monomères d’actine-G polymérisés en longs filaments. Les

filaments d’actine possèdent une extrémité positive (barbue) où la polymérisation est rapide et

une extrémité négative (pointue) où la polymérisation est plus lente, leur conférant ainsi une

structure polarisée (Schmidt & Hall, 1998). L’actine-F peut être nucléée soit par les formines,

qui produiront de longs filaments linéaires (Schott et al., 2002) ou par le complexe Arp2/3,

qui produira des filaments branchés (Machesky & Gould, 1999). De nombreuses protéines

participent à la dynamique du cytosquelette d’actine, comme la profiline (Witke, 2004) et la

cofiline (Lappalainen & Drubin, 1997), qui agissent sur l’équilibre de

polymérisation/dépolymérisation des filaments, la fimbrine (Ayscough, 1998) qui permet

d’assembler les filaments d’actine entre eux, afin de former des structures plus importantes ou

encore les protéines de coiffage (Kim et al., 2004) qui protègent les extrémités des filaments.

L’actine-F forme plusieurs structures aux fonctions distinctes dans la cellule.

- Les câbles d’actine sont des assemblages de filaments linéaires, nucléés par les formines. Ils

sont utilisés chez la levure comme support pour le transport de vésicules et d’organelles ainsi

que pour la ségrégation nucléaire.

- Les fibres de stress sont des structures spécifiques des métazoaires. Ce sont des ensembles

de filaments d’actine associés à des fibres de myosines permettant une contraction. Ces fibres

de stress sont impliquées dans la motilité cellulaire. Chez les métazoaires, les filaments

d’actine participent également à la formation des podosomes, filopodes et lamellipodes

(Yilmaz & Christofori, 2009).

- L’anneau contractile de la cytocinèse est également composé de filaments d’actine et de

myosine. Sa principale fonction est de permettre la séparation des deux cellules, à l’issue de la

division.

- Les patches d’actine sont des structures branchées d’actine, nucléées par le complexe

Arp2/3. Ils interviennent dans l’endocytose en participant à la formation de vésicules et à leur

transport.

Ces différentes structures composent le cytosquelette et participent aux phénomènes de la

polarité cellulaire.

2

2. Le cytosquelette de microtubules

Les microtubules sont nucléés à partir des centrosomes (ou SPB (Spindle Pole Body)

chez la levure). Ils possèdent deux extrémités aux propriétés distinctes : alors que la

polymérisation/dépolymérisation est lente à l’extrémité (-) localisée au centrosome,

l’extrémité (+) est capable de se polymériser/dépolymériser très rapidement. Les microtubules

mitotiques interviennent dans la ségrégation des chromosomes. Les microtubules

cytoplasmiques ou astraux interviennent dans le trafic intracellulaire chez les métazoaires,

mais pas chez la levure S. cerevisiae où ce rôle est assuré exclusivement par les câbles

d’actine. A l’aide d’adaptateurs et des moteurs myosines et en utilisant le réseau de câbles

d’actine, les microtubules sont également capables d’orienter le fuseau mitotique chez la

levure (Lim et al., 2009).

3. Le trafic intracellulaire

La sécrétion permet d’apporter tout le matériel nécessaire à la croissance au niveau du

site de croissance en utilisant les cytosquelettes comme rails. Le trafic des vésicules est

contrôlé par le complexe de l’exocyste. Ce complexe, dont l’assemblage est contrôlé par les

GTPases de la famille Rab, est composé de deux parties : la première partie est accrochée à la

vésicule et interagit avec les moteurs myosines capables de tracter les vésicules le long des

câbles d’actine ou des microtubules. La seconde partie est située au niveau du site d’accostage

de la vésicule et cible sa destination. L’exocyste permet la fusion des vésicules avec la

membrane plasmique (Wu et al., 2008).

4. Les septines

Les septines sont une classe de protéines capables de s’associer en complexe annulaire

au niveau de la zone de séparation des deux cellules, lors de la cytocinèse. L’anneau de

septines est utilisé comme support pour de nombreux acteurs de la polarité cellulaire et de la

cytocinèse. Chez la levure, il existe 5 septines principales (Cdc3p, Cdc10p, Cdc11p, Cdc12p

et Shs1p) impliquées dans la cytocinèse, alors qu’elles sont au nombre de 14 chez l’Homme

où elles ont également des rôles dans le développement et l’acquisition de certaines

morphologies cellulaires (Weirich et al., 2008).

3

Figure 2 : Dendrogramme des membres de la super-famille Ras de l’Homme et de la levure

Saccharomyces cerevisiae calculé avec ClustalW. Les séquences de levure portent le suffixe

« _Y ». Ce dendrogramme indique la famille des protéines Ras (en vert clair), des protéines Arf

(en vert foncé), des protéines Rab (en orange), des protéines Ran (RAN, GSP1_Y et GSP_2)

ainsi que la famille des protéines Rho (en bleu). D’après Takai et al (2001), Physiol Rev, 81(1),

p153.

Parmi les acteurs jouant un rôle dans le contrôle de la polarité, la classe des petites

protéines G de type Rho conservée chez tous les eucaryotes, est particulièrement impliquée

dans le contrôle des cytosquelettes et du trafic intracellulaire (Ridley, 2001).

B. Les GTPases de la super-famille Ras

Les protéines Rho (Ras Homology) sont des petites protéines G monomériques

(environ 25 kDa) appartenant à la super-famille Ras. La super-famille Ras compte plus de 140

membres chez l’Homme et comprend 5 grandes familles : les GTPases Ras, Ran, Arf, Rab et

Rho (Takai et al., 2001) (Figure 2).

Les membres de cette super-famille comportent 5 domaines appelés G1-5 impliqués

dans la fixation des nucléotides guanyliques et l’hydrolyse du GTP (G1, G3-5) et dans la

reconnaissance de leurs effecteurs (G2) (Colicelli, 2004). Elles fonctionnent comme des

interrupteurs moléculaires capables d’alterner entre une forme dite active liée au GTP et une

forme dite inactive liée au GDP. Le changement conformationnel induit par le passage d’une

forme à l’autre permet de réguler des processus cellulaires complexes et diversifiés tels que la

prolifération, l’adhérence ou encore la migration en agissant sur différents effecteurs et voies

de signalisation (Ridley, 2001). De nombreuses petites protéines G de la super-famille Ras

sont prénylées. Dans la famille Rho, cette modification post-traductionnelle a lieu sur un site

CAAX (C : cystéine, A : acide aminé aliphatique, X : acide aminé quelconque) situé en

position C-terminale et conduit à l’ajout d’un groupement farnésyl (15 atomes de carbone) ou

géranyl-géranyl (20 atomes de carbone). Ces groupements lipidiques permettent l’ancrage des

GTPases aux membranes (Wennerberg & Der, 2004).

Les fonctions des petites protéines G de la super-famille Ras sont généralement

déterminantes pour le fonctionnement cellulaire et donc, l’alternance entre les formes actives

et inactives doit être régulée de façon très précise. En effet, la production de protéines Ras

dont la capacité à cycler est altérée est souvent délétère. C’est le cas de la protéine humaine

H-Ras dont des mutations conduisant à la production d’une forme constitutivement active

sont détectées dans 30 à 60 % des cancers (Nancy et al., 2002). Les membres de la famille

Rho sont également impliqués dans de nombreux cancers. La dérégulation du cycle des

GTPases Rho conduisant à l’augmentation de la proportion de formes actives est le plus

souvent provoquée par des altérations du niveau d’expression des protéines Rho ou des

altérations de leurs régulateurs (Symons & Segall, 2009).

4

Membrane

GAP

Pi

GEF

GTP

GDP

GTP

Rho

Rho

RhoGDI

GDP

FORME

ACTIVE

FORME

INACTIVE

Figure 3 : Cycle d’activation-inactivation des petites protéines G de type Rho sous l’influence

de leurs protéines régulatrices (GAP : GTPase Activating Protein ; GEF : Guanine Exchange

Factor ; GDI : GDP Dissociation Inhibitor).

1. Les régulateurs des petites protéines G

Trois types de régulateurs agissent sur les petites protéines G en favorisant le passage

d’une forme à l’autre (Figure 3).

- Les facteurs d’échange ou « Guanine nucleotide Exchange Factor » (GEF) favorisent

l’échange du GDP contre une nouvelle molécule de GTP. Ils favorisent l’apparition de formes

actives des GTPases.

- Les activateurs de l’activité GTPasique ou « GTPase Activating Protein » (GAP) catalysent

la réaction d’hydrolyse du GTP en GDP en stimulant l’activité GTPasique intrinsèque des

petites protéines G. Ils favorisent l’apparition de la forme inactive des GTPases et sont donc

considérés comme leurs régulateurs négatifs.

- Les facteurs d’inhibition de la dissociation du GDP ou « GDP Dissociation Inhibitor » (GDI)

inhibent l’échange du GDP contre du GTP catalysé par les GEF. Ils stabilisent les GTPases

associées au GDP et les séquestrent dans le cytosol en masquant leur groupement prényl

hydrophobe. Seules les protéines Rab et Rho et quelques rares protéines Ran (Yamada et al.,

1998) semblent être régulées par des GDI (DerMardirossian & Bokoch, 2005).

2. Les protéines Rho chez l’Homme

Chez l’Homme, 25 membres appartenant à la famille Rho ont été identifiés. Les

analyses de séquences, de structures et de fonctions ont permis d’identifier six sous-familles

de protéines Rho (Burridge & Wennerberg, 2004). Les sous-familles principales sont celle de

RhoAHs (comprenant également RhoBHs et RhoCHs), celle de Rac1Hs (Rac1-3Hs, RhoGHs) et

celle de Cdc42Hs (Cdc42Hs et son variant G25KHs spécifiquement produit dans le cerveau,

TC10Hs, TCLHs, Wrh1Hs et ChpHs/Wrh-2Hs). Les trois autres sous-familles sont celle des Rnd

(Rnd1-3Hs) constitutivement associées au GTP et incapables de l’hydrolyser, celle des

RhoBTB (RhoBTB1-3Hs) possédant un domaine BTB (Broad complex, Tramtrack and Bric-à-

brac) et impliquée dans la croissance cellulaire mais dont les fonctions exactes sont encore

mal connues, et la sous-famille des Miro, protéines Rho mitochondriales (Aspenstrom et al.,

2007) (Figure 4).

Les trois membres de la famille RhoA présentent une identité très forte, de l’ordre de

85% et sont exprimés de façon ubiquitaire. Ils sont capables de stimuler la contraction des

5

Figure 4 : Arbre phylogénétique de la famille des protéines Rho chez l’Homme, représentant les

relations entre 20 membres de cette famille. Le dendrogramme a été construit avec l’application

Bonsai (http://calliope.gs.washington.edu/software/_) à partir d’un alignement des domaines

Rho de ces protéines. Cinq sous-familles (Rho-like, Rnd, Cdc42-like, Rac-like, et RhoBTB) sont

indiquées par des cercles. La sous famille des Rho mitochodriales Miro ne figure pas sur ce

dendrogramme (Burridge et Wennerberg (2004), Cell, 116(2), p167).

fibres de stress, ce sont des structures d’actine impliquées dans la motilité cellulaire. Ces trois

protéines Rho interagissent avec les mêmes facteurs d’échange et les mêmes effecteurs,

toutefois, leurs fonctions différeraient selon leur localisation cellulaire (Wennerberg & Der,

2004).

Les protéines de la sous-famille Rac1 sont impliquées dans de nombreux processus

cellulaires tels que la stabilité des microtubules, la dynamique du cytosquelette d’actine et

notamment la formation de lamellipodes, participant à la motilité cellulaire. Cette famille a

également des effecteurs impliqués dans la production de molécules super-oxyde, la synthèse

d’ADN ou la transcription d’acteurs du cycle cellulaire (Bosco et al., 2009)

La sous-famille Cdc42 agit sur le cytosquelette d’actine et stimule la formation de

filopodes. Ces extensions membranaires permettent à la cellule de sentir son environnement.

Les filopodes sont ainsi impliqués dans la guidance axonale des neurones, l’établissement de

jonctions entre cellules des tissus épithéliaux ou encore le chimiotactisme des macrophages.

La localisation intracellulaire de Cdc42 est également impliquée dans la différenciation et la

maturation de certains types cellulaires neuronaux et épithéliaux (Heasman & Ridley, 2008).

Ces trois sous-familles de protéines interviennent ensemble dans la régulation de la polarité et

du cycle cellulaire (Figure 5A), au travers d’un réseau de régulations et d’interactions

fonctionnelles complexes (Figure 5B).

3. Les protéines Rho chez la levure

Les protéines Rho sont conservées au niveau mécanistique et fonctionnel de la levure

Saccharomyces cerevisiae jusqu’à l’Homme. La génétique de la levure permet d’étudier plus

aisément l’effet de modifications de la régulation des protéines Rho ou de leurs régulateurs

sur la polarité cellulaire que chez l’Homme. C’est un excellent modèle qui permet de mieux

comprendre les mécanismes qui contrôlent la polarité cellulaire. Chez la levure

Saccharomyces cerevisiae, il existe 6 protéines Rho : Cdc42p, Rho1p, Rho2p, Rho3p, Rho4p

et Rho5p. Les analyses par comparaison de séquences montrent que Cdc42p présente 80%

d’identité avec la protéine Cdc42Hs humaine. La GTPase Cdc42Hs a été montrée comme

supprimant la mutation thermosensible cdc42-1 chez la levure (Munemitsu et al., 1990;

Shinjo et al., 1990). La GTPase Rho1p a comme homologue humain la protéine RhoAHs. Ces

6

A

B

Figure 5 : Les protéines Rho interviennent et régulent conjointement de nombreux mécanismes.

A) Rôle de RhoA, Rac1 et Cdc42 sur le cytosquelette d’actine. RhoA intervient dans la

formation des fibres de stress, Rac1 intervient dans la formation de lamellipodes et Cdc42

intervient dans la formation de filopodes (D’après de Ory et Jurdic (2001), M/S, 17, p878).

B) Rôle de RhoA, Rac1 et Cdc42 sur le cycle cellulaire. RhoA, Rac1 et Cdc42 agissent sur

certains effecteurs communs et interviennent dans des voies de signalisation entrecroisées (Sahai

et Marshall (2002), Nat Rev, 2, p133).

deux protéines sont identiques à 72% et RhoAHs est capable de remplacer partiellement

Rho1p dans la levure (Qadota et al., 1994). Les GTPases Rho2p, Rho3p et Rho4p présentent

près de 50% d’identité avec les protéines RhoAHs, RhoBHs et RhoCHs de mammifères. Enfin la

GTPase Rho5p montre 46% d’identité avec Cdc42Hs et 44% avec Rac1Hs, Rac2Hs et Rac3Hs

(Roumanie et al., 2001).

4. La croissance polarisée chez Saccharomyces cerevisiae et

l’implication des protéines Rho

La polarité cellulaire est observable lors de la croissance végétative et sexuée de la

levure S. cerevisiae (Figure 6). Lors de la croissance végétative, la cellule mère se polarise en

direction du bourgeon jusqu’à la fin de la phase S. La croissance du bourgeon s’arrête pendant

la phase G2 et les cellules se séparent lors de la phase mitotique. A l’état haploïde, chaque

nouveau bourgeonnement a lieu à proximité du précédent, alors qu’à l’état diploïde, chaque

nouveau bourgeonnement a lieu à un site diamétralement opposé au précédent. Lors de la

croissance sexuée, la cellule haploïde se déforme en réponse à la phéromone sexuelle de signe

opposé et émet un prolongement, aboutissant à une forme particulière de la cellule, appelée

shmoo, afin de fusionner avec la cellule de signe sexuel opposé (Narayanaswamy et al.,

2009).

Les mécanismes mis en jeu lors de la croissance polarisée sont observables tout au

long du cycle cellulaire, en particulier pour le cytosquelette d’actine (Figure 7).

Lors de la phase G1, des marqueurs de bourgeonnement sont positionnés au futur site

de bourgeonnement. Grâce à ces marqueurs, Cdc42p peut initier l’émergence du bourgeon.

Une fois activée, Cdc42p se localise au site de bourgeonnement pour établir la polarité du

cytosquelette d'actine (Shulman & St Johnston, 1999). Elle permet l'émergence du bourgeon

en déclenchant la polymérisation de l'actine et en régulant la distribution des patches d'actine

corticale dans la cellule (Johnson, 1999; Kozminski et al., 2000). La formation de ces

structures d’actine corticale va être concentrée dans la zone d’émergence du bourgeon et

participer à la croissance du bourgeon.

La croissance apicale est régulée par les protéines Rho1p et Rho2p, partiellement

redondantes. Rho1p est essentielle, mais la surabondance de Rho2p due à une surexpression

du gène non-essentiel RHO2 est capable de compenser l’absence de Rho1p (Ozaki et al.,

7

Figure 6 : Cycle haplodiplophasique de la levure Saccharomyces cerevisiae : 1) Croissance

végétative à l’état haploïde ou diploïde par bourgeonnement, 2) Fusion de deux cellules

haploïdes de signe sexuel opposé a et ! et formation d’un zygote diploïde. On peut aisément

distinguer au microscope les formes ‘shmoo’ des zygotes ou des formes bourgeonnantes, 3)

Sporulation des cellules diploïdes et formation d’asques contenant 4 spores issues d’une cellule

diploïde ayant subi la méiose.

1996). La protéine Rho1 possède cinq effecteurs connus qui agissent ensemble pour

coordonner les réarrangements du cytosquelette d’actine, la sécrétion polarisée et le

remodelage de la paroi lors de la croissance polarisée ou en réponse aux stress pariétaux.

Dans la croissance polarisée, Rho1p active la formine Bni1p, responsable de

l’assemblage des câbles d’actine (Pruyne et al., 2004; Umikawa et al., 1998). Ces câbles,

polarisés dans l’axe du bourgeon sont utilisés par la machinerie du trafic pour acheminer les

vésicules vers le site de croissance. Rho1p interagit également avec la sous-unité Sec3p de

l’exocyste. Sec3p servirait de point de repère pour guider les vésicules vers la zone de

croissance du bourgeon (Guo et al., 2001). Rho1p stimule également la synthèse de la paroi

via la voie PKC et également en activant Fks1p, une sous-unité régulatrice de la "-1,3-glucane

synthase (Drgonova et al., 1996; Qadota et al., 1996).

Rho3p intervient ultérieurement lors de la croissance isotropique du bourgeon. Elle

possède deux rôles distincts :

- Rho3p intervient dans la polarité du cytosquelette d’actine en activant directement la

formine Bni1p au niveau du bourgeon pour permettre la mise en place d’un réseau de câbles

d’actine polarisés (Robinson et al., 1999), en coopération avec les protéines associées au

cytosquelette d’actine qui contrôlent la dynamique des filaments et l’assemblage des câbles.

Les câbles d’actine nucléés par les formines au niveau du bourgeon sont émis vers le cortex

de la cellule mère. Ils sont utilisés comme rails par le transport vésiculaire et participent avec

le cytosquelette de microtubules, à l’orientation du fuseau mitotique et la ségrégation du

noyau.

- Rho3p intervient dans la sécrétion polarisée interagissant au niveau de l’apex du

bourgeon avec la sous-unité Exo70p de l’exocyste. Cette interaction permet de polariser le

flux de vésicules en ciblant leur accostage et en favorisant leur fusion à la membrane

plasmique (Adamo et al., 1999).

Lorsque le bourgeon a atteint une taille critique, la croissance polarisée vers l’apex du

bourgeon s’arrête et est réorientée vers le cou du bourgeon. Le cytosquelette d’actine se

dépolarise avant de se repolariser au niveau du cou. Les patches d’actine corticale sont

concentrés dans la cellule mère et la cellule fille de part et d’autre du cou du bourgeon et les

câbles d’actine, initiés au niveau du cou, rayonnent à la fois dans la cellule mère et la cellule

fille (Pruyne et al., 2004).

La protéine Rho4 active la formine Bnr1p au niveau du cou, responsable de la

formation de câbles d’actine qui composent l’anneau contractile d’actomyosine (Imamura et

8

Figure 7 : La polarité cellulaire et le cytosquelette d’actine au cours du cycle cellulaire chez la

levure Saccharomyces cerevisiae. La polarité des câbles d’actine (en orange) et des patches

d’actine (en rouge) est établie grâce à la présence de marqueurs cellulaires (en bleu) dans les

zones de croissance. Les câbles d’actine vont guider les vésicules jusqu’au site de croissance, où

elles vont s’accumuler et fusionner avec la membrane plasmique. Lors de la cytocinèse, l’anneau

d’actomyosine (en rose) se met en place au niveau du cou du bourgeon pour permettre la

séparation des deux cellules (Pruyne et Bretsher (2000), J Cell Sci, 113, p571).

al., 1997). Rho4p participe également à la régulation de la cytocinèse en agissant sur Hof1p,

un acteur majeur du contrôle de la contraction de l’anneau d’actomyosine (Kamei et al.,

1998).

Enfin, Rho5 n’a pas de rôle clairement établi dans la croissance polarisée. Elle est

impliquée dans des mécanismes de réponse au stress et d’induction de la mort cellulaire due

aux ROS (Reative Oxygen Species) (Schmitz et al., 2002; Singh et al., 2008).

5. Les régulateurs des protéines Rho3p et Rho4p

Les protéines Rho sont principalement régulées par leur partenaires RhoGEF et

RhoGAP. A ce jour, des facteurs d’échange ont été identifiés comme candidats pouvant

assurer la régulation de Rho3p et Rho4p, mais leur fonction RhoGEF n’a pas encore été

validée par des tests biochimiques (Ozaki et al., 1996).

La protéine Rgd1 a été identifiée au laboratoire comme étant la seule protéine

RhoGAP de Rho3p et de Rho4p (Doignon et al., 1999).

De nombreux partenaires physiques et géniques de Rgd1p ont été identifiés ces

dernières années, soit lors de cribles globaux, soit lors d’analyses d’interactions entre gènes

ou protéines candidats. Ces interactions peuvent permettre d’identifier les processus

cellulaires dans lesquels Rgd1p est impliquée. Ainsi, Rgd1p interagit avec de nombreux

acteurs de la polarité cellulaire tels que les protéines Vrp1 et Las17, de la machinerie de

l’actine corticale (Roumanie et al., 2002; Roumanie et al., 2000), la sous unité Cdc12p (Ho et

al., 2002) de l’anneau de septines ou encore Hof1p (Yu et al., 2008).

Rgd1p interagit avec d’autres partenaires impliqués dans des mécanismes de réponse

aux stress, c’est le cas des senseurs de la paroi Mid2p (Claret et al., 2005) et Slg1p/Wsc1p (de

Bettignies et al., 1999; Fernandes et al., 2006) ainsi qu’avec des membres de la voie des MAP

kinases Pkc1p, impliqués dans le maintien de l’intégrité cellulaire (de Bettignies et al., 2001).

De plus, il a été montré au laboratoire que la protéine Rgd1p est impliquée dans la survie en

stress acide (Claret et al., 2005; Gatti et al., 2005).

Rgd1p est impliquée dans deux processus cellulaires :

- la croissance polarisée, en participant à la régulation des protéines Rho3 et Rho4,

- la réponse au stress, en particulier au stress acide.

9

C. Objectifs

Lors de la croissance polarisée de la levure Saccharomyces cerevisiae, les

cytosquelettes d’actine et de microtubules jouent un rôle déterminant dans la mise en place de

la polarité. Ils sont les supports du trafic intracellulaire et de la ségrégation des chromosomes,

mécanismes indispensables à la croissance. Les protéines de la famille Rho sont fortement

impliquées dans la mise en place et la régulation des cytosquelettes et des mécanismes les

utilisant. Afin d’agir correctement sur leurs effecteurs, les protéines Rho doivent être finement

régulées par leur partenaires RhoGAP, RhoGEF et RhoGDI.

Dans ce travail de thèse, je me suis intéressé tout particulièrement au rôle de la

protéine RhoGAP Rgd1p et à son action sur les protéines Rho3 et Rho4.

La protéine Rho3 est décrite comme un acteur de la croissance du bourgeon (Adamo et al.,

1999) et la protéine Rho4 est considérée comme intervenant au niveau du cou du bourgeon

(Fernandes et al., 2006). Toutefois leurs localisations n’ont pas été définies très précisément

(Tiedje et al., 2008). Quant aux cibles de Rho3p et Rho4p, elles ont des localisations

cellulaires distinctes et doivent être activées ou réprimées à différents moments du cycle

cellulaire. Cela signifie que ces deux protéines Rho doivent subir une régulation très fine afin

d’agir sur le bon effecteur, au bon site et au bon moment du cycle cellulaire. A l’heure

actuelle, Rgd1p est la seule RhoGAP de Rho3p et Rho4p connue. Ainsi, Rgd1p doit être

également finement régulée de façon à pouvoir agir sur Rho3p et Rho4p au moment opportun

et à l’endroit adéquat. Nous avons étudié la régulation de la RhoGAP Rgd1p, avec pour

objectif de mieux comprendre la régulation des protéines Rho. De plus, Rgd1p a une

organisation moléculaire similaire aux protéines RhoGAP humaine de la famille de SrGAP ou

encore ArhGAP4Hs. En effet, ces protéines GAP présentent une même topologie moléculaire

avec un domaine F-BAR à l’extrémité N-terminale et le domaine RhoGAP du coté C-

terminal. Le domaine F-BAR est proposé comme un senseur des courbures membranaires et

un acteur de la dynamique membranaire (Itoh et al., 2005). L’association du domaine F-BAR

et du domaine RhoGAP nous permet de penser que cette organisation moléculaire conservée

répond à des nécessités biologiques dans la croissance polarisée en agissant à la fois

directement sur la dynamique membranaire et sur les voies de signalisation contrôlées par les

protéines Rho. Très étudiés à l’heure actuelle en raison de leurs implications en pathologie

humaine, les trois membres de la famille de SrGAP (SrGAP1-3) sont produits dans le cerveau

et leur inactivation conduit à des pathologies mentales dues à des défauts de maturation, de

10

différentiation, de migration ou de sécrétion des cellules neuronales (Endris et al., 2002). Des

modifications de l’expression du gène ARHGAP4 ont également été identifiées dans un

certain nombre de cancers, principalement colorectaux (Heikinheimo et al., 2002).

La protéine Rgd1 est donc un modèle de protéine RhoGAP à domaine F-BAR, dans

une situation biologique particulière où une même RhoGAP va agir sur deux protéines Rho à

des endroits différents au cours du cycle cellulaire. La protéine RhoGAP Rgd1 permet donc

d’étudier un aspect de la régulation des protéines Rho dans un modèle unicellulaire plus

simple que le modèle mammifère.

Mon travail de doctorat a été centré sur l’étude du rôle de la protéine RhoGAP Rgd1

au cours de la croissance polarisée.

Dans une première partie, nous nous sommes intéressés aux relations pouvant exister

entre la protéine RhoGAP Rgd1 et les cytosquelettes d’actine et de microtubules. Dans une

seconde partie, plusieurs aspects de la régulation spatio-temporelle de Rgd1p ont été étudiés à

travers le domaine F-BAR. Les résultats que nous apportons à partir du modèle levure

pourront fournir de nouveaux éléments dans la compréhension de mécanismes de

fonctionnement des protéines RhoGAP à domaine F-BAR chez les mammifères.

Au delà de cette introduction, des rappels bibliographiques seront effectués au cours

de la présentation des résultats.

11

MATERIELS ET

METHODES

souches Génotype Origine

BY4741 MATa ; his3!1; leu2!0; met15!0; ura3!0 Euroscarf

BY4742 MAT" ; his3!1; leu2!0; lys2!0; ura3!0 Euroscarf

BY4743

MATa/MAT!; his3"1/his3"1; leu2"0/leu2"0; met15"0/MET15; LYS2/lys2"0; ura3"0/ura3"0 Euroscarf

BY4742 rgd1! RGD1::KanMX4; MAT" ; his3!1; leu2!0; lys2!0; ura3!0 Euroscarf

BY4741 rgd1! RGD1::KanMX4; MATa ; his3!1; leu2!0; met15!0; ura3!0 Euroscarf

BY4741 kar9! KAR9::KanMX4; MATa ; his3!1; leu2!0; met15!0; ura3!0 Euroscarf

BY4741 dyn1! DYN1::KanMX4; MATa ; his3!1; leu2!0; met15!0; ura3!0 Euroscarf

BY4743 fyv8!

FYV8::KanMX4/FYV8::KanMX4; MATa/MAT"; his3!1/his3!1; leu2!0/leu2!0; met15!0/MET15; LYS2/lys2!0; ura3!0/ura3!0 Euroscarf

BY4742 sec22! SEC22::KanMX4; MAT" ; his3!1; leu2!0; lys2!0; ura3!0 Euroscarf

BY4742 erd1! ERD1::KanMX4; MAT" ; his3!1; leu2!0; lys2!0; ura3!0 Euroscarf

BY4742 end3! END3::KanMX4; MAT" ; his3!1; leu2!0; lys2!0; ura3!0 Euroscarf

BY4742 fab1! FAB1::KanMX4; MAT" ; his3!1; leu2!0; lys2!0; ura3!0 Euroscarf

BY4742 vps34! VPS34::KanMX4; MAT" ; his3!1; leu2!0; lys2!0; ura3!0 Euroscarf

BY4742 ypt7! YPT7::KanMX4; MAT" ; his3!1; leu2!0; lys2!0; ura3!0 Euroscarf

SEY6210

MATa, leu2-3,112, ura3-52, his3-!200, trp1-!901, lys2-801, suc2-!9 Audhya et al., 2000

SEY6210 pik1-83 SEY6210, pik1::HIS3 with pRS314-pik1-83ts (LEU2) Audhya et al., 2000

SEY6210 stt4-4 SEY6210, stt4::HIS3 with pYC-stt4-4ts (LEU2) Routt et al., 2005

SEY6210 mss4-102 SEY6210, mss4::HIS3 with pYCplac111-mss4-102ts (LEU2) Stefan et al., 2002

SEY6210 sec14-1 CTY1-1A, MATa; sec14-1ts; ura3-52; his3!-200; lys2-801 Benkaitis et al., 1989

WT sec NY13 MAT a; ura3-52

sec61-3 mat", sec61-3; leu2-3,113; ura3-52, trp1-1 Schekman lab

sec4-2 MAT a; sec4-2 Novick et al., 1980

sec6-4 MAT a; sec6-4; ura3-52 Novick et al., 1980

WT cdc mat a, ura3-52 leu2 lys2-801 his3-d200 ade2-101 Snyder's lab

cdc12-1 mat a, cdc12-1, ura3-52 leu2 his3 trp1-d63 Snyder's lab

Tableau 1 : Souches de levures utilisées lors de ce travail.

MATERIELS ET METHODES

A. Matériel biologique

1. Souches de levure

Toutes les souches de levure utilisées sont de l'espèce Saccharomyces cerevisiae. La levure S.

cerevisiae est un organisme eucaryote unicellulaire qui appartient à la classe des ascomycètes

hétérothalliques. Son cycle de développement est haplo-diplophasique. Dans certaines

conditions défavorables de croissance, les cellules diploïdes forment des asques qui

contiennent quatre spores haploïdes, deux de signe sexuel (a) et deux de signe (#) (Figure 6).

Lorsque les spores germent, elles donnent des cellules haploïdes qui peuvent de nouveau

conjuguer pour donner un zygote diploïde. Les souches qui ont été utilisées au cours de ce

travail sont répertoriées dans le Tableau 1.

Le fond génétique de la levure BY4742 (EUROSCARF) a été principalement utilisé lors de ce

travail.

2. Souches bactériennes

Les souches utilisées sont des bactéries appartenant à l'espèce Escherichia coli :

! XL1-Blue (Stratagene) : recA1, supE44, hsdR17, endA1, gyrA96, thi-1, relA1,

lac [F’ proAB , lacIqZ!M15, Tn10(tet

r)] . Cette souche a été utilisée pour le clonage et

l’amplification d’ADN plasmidique.

3. Vecteurs de clonage et d'expression

Les principaux vecteurs décrits ci-dessous ont été utilisés pour réaliser ce travail de thèse.

Série pRS300 : Les plasmides de la série pRS300 sont des vecteurs navette bactérie/levure de

type intégratif (Sikorski & Hieter, 1989). Ils contiennent l'origine de réplication du plasmide

ColE1 d'E.coli, un gène de résistance à l'ampicilline. Ils possèdent le marqueur de levure HIS3

12

(pRS303), TRP1 (pRS304), LEU2 (pRS305) ou URA3 (pRS306) mais ne portent pas d'origine

de réplication levure.

Une séquence d’ADN codant 3 eGFP en tandem a été clonée du coté 3’ du multi-site de

clonage. Les gènes clonés en phase avec les 3GFP doivent porter un site de restriction unique

qui permet de cibler leur intégration au locus de leur gène lors de la transformation. Ainsi, ces

vecteurs permettent d’étiqueter avec 3GFP un gène à son propre locus, sous le contrôle de son

propre promoteur.

Ces vecteurs ont également été utilisés avec une étiquette tdimer2(12). Il s’agit d’un dimère

de mRFP1 espacé par 12 acides aminés.

pACT2: Le plasmide pACT2 (Durfee et al., 1993) est un vecteur navette bactérie/levure

utilisé dans le système double hybride. Il contient l'origine de réplication du plasmide ColE1

d'E.coli, un gène de résistance à l'ampicilline, l'origine de réplication du plasmide 2µ de la

levure, ainsi que le marqueur LEU2 de levure. L'insertion d'ADN au niveau du multi-site de

clonage permet l'expression de séquences peptidiques en fusion avec le domaine trans-

activateur de la protéine Gal4 de levure (AD, acides aminés 769 à 881), l'épitope de

l'hémagglutinine A du virus humain influenza (épitope HA) et avec une séquence de

localisation nucléaire (NLS de l'antigène T du virus SV40). L'expression de la séquence

d'ADN codant pour cette protéine de fusion, est sous la dépendance du promoteur constitutif

ADH1 de levure à forte activité transcriptionnelle.

pODB80: Le plasmide pODB80 (Louvet et al., 1997) est un vecteur navette bactérie/levure

utilisé dans le système double hybride. Au-delà des éléments nécessaires à la sélection et à la

propagation dans E. coli, il contient l'origine de réplication 2µ et le marqueur TRP1 de levure.

L'insertion d'ADN au niveau du multi-site de clonage permet l'expression de séquences

peptidiques en fusion avec le domaine de liaison à l'ADN de la protéine Gal4 (DB, acides

aminés 1 à 147). L'expression de la séquence d'ADN correspondant à cette protéine de fusion,

est sous la dépendance du promoteur ADH1 de levure.

13

B. Méthodes microbiologiques

1. Milieu pour bactéries

- DYT: Tryptone (Difco) 16 g/l

Chlorure de sodium 5 g/l

Yeast extract (Difco) 10 g/l

Des antibiotiques peuvent être ajoutés au milieu après autoclavage. Dans ce cas les

solutions mères sont stérilisées par filtration sur membrane de nylon 0,45 µm. L’ampicilline

est ajoutée à la concentration finale de 100 mg/L.

2. Milieux pour levures

- Milieu riche YPD:

Yeast extract (Difco) 10 g/l

Bacto-peptone (Difco) 20 g/l

Glucose 20 g/l

Le milieu YPD contenant de la généticine (G418) est préparé en ajoutant, après

autoclavage du milieu, de la généticine stérilisée par filtration, à la concentration finale de 200

mg/l.

- Milieu minimum SD supplémenté :

Yeast Nitrogen Base w/o amino acid (Difco) 6,7 g/l

Glucose 20 g/l

Solution 'dropout' 10 X 100 ml/l

Concentration des métabolites de la solution 'dropout' 10 X:

Isoleucine 300 mg/l Méthionine 200 mg/l

Valine 1500 mg/l Phénylalanine 500 mg/l

Adénine 400 mg/l Thréonine 2000 mg/l

14

Arginine 200 mg/l Tryptophane 200 mg/l

Histidine 200 mg/l Tyrosine 300 mg/l

Leucine 1000 mg/l Uracile 200 mg/l

Lysine 300 mg/l

- Milieu Minimum YNB

Yeast Nitrogen Base w/o a.a. (Difco) 6,7 g/l

D-Glucose 20 g/l

Certains métabolites peuvent être ajoutés au milieu minimum aux concentrations suivantes, de

manière à permettre la croissance des souches auxotrophes :

Adénine 20 mg/l

Uracile 20 mg/l

Histidine 20 mg/l

Tryptophane 20 mg/l

Leucine 30 mg/l

Lysine 30 mg/l

- Milieu de sporulation AcK:

Acétate de potassium 10 g/l

Tous les milieux de culture sont autoclavés à 110°C pendant 30 minutes. Les milieux

solides sont obtenus en ajoutant 20 g d'agar par litre de milieu avant autoclavage.

3. Conditions de culture et de conservation

Les bactéries sont cultivées à 37°C ; les levures sont cultivées à 30°C, exception faite

de certaines expériences pour lesquelles les températures de culture sont précisées dans le

texte.

Les cultures en milieu liquide sont agitées à 250 rpm, dans un Erlenmeyer de capacité

5 fois supérieure au volume du milieu pour permettre une bonne oxygénation.

Les souches bactériennes et les souches de levures sont conservées à -20°C et -80°C.

Pour cela, on ajoute à des cultures liquides en phase exponentielle de croissance, du glycérol à

raison de 20% final pour les bactéries et 25% final pour les levures.

15

4. Suivi de la croissance cellulaire

Pour les bactéries et les levures, la concentration cellulaire est estimée en mesurant la

turbidité à l'aide d'un spectrophotomètre d'absorption. Les équivalences suivantes ont été

déterminées au laboratoire pour les souches de référence :

Culture de levures : 1 unité à DO600 nm correspond à 2,4.107 cellules haploïdes par ml

Culture de bactéries : 1 unité à DO580 nm correspond à 2,5.108 cellules par ml.

Pour les cellules de levure dont la morphologie est anormale (par exemple de très

grosses cellules), la concentration cellulaire est estimée en utilisant la cellule de Thoma.

5. Mesure de la viabilité cellulaire

Le principe de cette méthode est basé sur l'accumulation d'un colorant vital, le bleu de

méthylène, dans les cellules mortes.

Une solution de bleu de méthylène est préparée à raison de 0,01 g de bleu de

méthylène dans 10 ml d'eau distillée. Après solubilisation et filtration, 2 g d'acide citrique

trisodique bihydraté sont ajoutés au mélange. La solution est complétée à 100 ml avec de l'eau

distillée et conservée à l'abri de la lumière. La suspension cellulaire et le réactif au bleu de

méthylène sont mis en contact volume à volume pendant 10 min à température ambiante. Le

comptage au microscope optique du nombre de cellules bleues par rapport au nombre total de

cellules permet d'évaluer le pourcentage de mortalité de la culture.

6. Tests en gouttes

Des tests en gouttes sur milieux solides ont été effectués pour examiner la croissance

des souches de levure dans différentes conditions. Des gouttes de suspension de levures à

différentes concentrations sont déposées sur le milieu gélosé. La croissance est examinée

après 2 à 6 jours d'incubation, par comparaison avec celle des souches de référence.

16

7. Obtention des zygotes

La levure S. cerevisiae est un organisme haplo-diplophasique (Figure 6). Elle peut se

diviser de façon végétative sous forme diploïde ou haploïde. Pour passer de l'état haploïde à

l'état diploïde, des cellules de type sexuel opposé (a et #$) en phase exponentielle de croissance

sont mélangées. Suite à l’action de la phéromone sexuelle produite par la levure de signe

opposé, les cellules haploïdes s’arrêtent dans la phase G1 du cycle cellulaire et émettent une

projection conique qui leur donne une forme de poire appelée « Shmoo ». Les projections

ainsi émises par deux levures de signe opposé peuvent fusionner, pour former un zygote

diploïde a/#%% qui a une forme transitoire caractéristique en haltère. Cette forme transitoire peut

être isolée du reste de la population à l’aide d’un micromanipulateur (Singer MSM-system).

8. Obtention des haploïdes

Le passage de l'état diploïde à l'état haploïde est induit par une carence en source

d'azote en présence d'une source de carbone non-fermentescible. La méiose aboutit à la

formation d'un asque contenant quatre spores haploïdes avec deux spores de chaque signe.

Pour induire la méiose, les cellules diploïdes en phase exponentielle sont repiquées sur le

milieu de sporulation AcK. La formation des asques est observée au microscope après 3 jours

de culture. Pour isoler les spores, la paroi de l'asque est digérée à l'aide de glucanex, (un

mélange enzymatique contenant plusieurs activités glucanases), utilisé à la concentration

finale de 10 mg/ml pendant 15 minutes à 30°C. Les asques sont ensuite déposés sur le milieu

solide YPD et les spores sont isolées et alignées par tétrade à l'aide d'un micromanipulateur.

Le milieu de culture est ensuite incubé afin de permettre la germination des spores.

9. Condition de culture de levures permettant la mise en place

d’un stress acide

Les cellules de levure sont mises en culture sur la nuit en milieu liquide YPD à 30°C

jusqu’à l’obtention d’une concentration approximative de 0,5 à DO600. La culture est alors

divisée en deux sous-cultures, la première est conservée comme contrôle tandis que le pH de

la deuxième est amené à pH = 2,8 par ajout d’HCl. Le pH du milieu de culture est suivi avec

un pH mètre (Hanna instruments).

17

10. Synchronisation cellulaire au facteur alpha

Le facteur alpha est ajouté à une culture en phase exponentielle de croissance à une

concentration finale de 10 mM. La culture est incubée pendant 2h à 30°C pour permettre à

toutes les cellules de terminer leur division et d’entrer en phase G1. Les cellules sont ensuite

centrifugées 5 minutes à 4 000g à température ambiante puis resuspendues dans du milieu

frais sans facteur alpha.

C. Manipulation des acides nucléiques

1. Extraction d'ADN

Pour extraire l'ADN plasmidique des bactéries, les kits "Wizard Plus Minipreps DNA

Purification System" (Promega) et "EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Kit" (Bio Basic Inc.)

ont été utilisés. Les protocoles suivis sont ceux décrits par les fournisseurs.

La méthode d'extraction d'ADN plasmidique de levure utilisée lors de ce travail est

celle décrite par Robzyk et Kassir (1992).

L'extraction et la purification d'ADN génomique de levure ont été réalisées à l’aide du

kit « Wizard Genomic DNA Purification Kit » (Promega).

2. Hydrolyse et ligation de l'ADN

Pour le clonage et l'analyse de fragments d'ADN, plusieurs endonucléases de

restriction ont été utilisées. Le mélange réactionnel est réalisé de la manière suivante :

0,1 à 0,5 µg d'ADN (& 2 µl)

1 µl de tampon de restriction 10 x

5 unités d'enzyme de restriction

H2O qsp 10 µl

Le mélange est incubé 1 à 2 heures à la température optimale pour l'enzyme.

18

Les ligations de fragments d’ADN sont réalisées en utilisant la T4 DNA ligase (New

England Biolabs Inc.), suivant les recommandations du fournisseur.

Pour une ligation entre un vecteur et un insert à extrémités cohésives, un rapport d’une

molécule de vecteur pour cinq à dix molécules d’insert est utilisé.

3. Amplification d'ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction)

La PCR permet d'amplifier in vitro un fragment d'ADN en un très grand nombre de

copies. Elle nécessite deux amorces oligonucléotidiques complémentaires des extrémités du

fragment à amplifier. Après hybridation des amorces à la matrice, les brins complémentaires

de l'ADN sont synthétisés par une ADN polymérase thermorésistante à partir des extrémités

3'-OH. Les fragments ainsi obtenus sont dénaturés par la chaleur et peuvent servir de matrice

pour une nouvelle hybridation d'amorces suivie d'une nouvelle synthèse.

Le kit "Expand High Fidelity PCR System" (Roche) a principalement été utilisé au

cours de ce travail pour réaliser les amplifications d'ADN de plus de 5 kb. Ce kit a été utilisé

selon les spécifications des fournisseurs. La matrice utilisée lors de la PCR peut être soit de

l'ADN purifié (issu par exemple de mini-préparation d'ADN plasmidique ou d'extraction

d'ADN génomique), soit des cellules entières. Dans ce dernier cas, les cellules sont

préalablement chauffées quelques minutes au four à micro-onde à pleine puissance pour les

faire éclater. Cet extrait est ensuite utilisé de la même manière qu'une matrice d'ADN purifié.

4. Mutagenèse dirigée

Les mutagenèses dirigées ont été réalisées à l’aide du kit QuikChange XL Site-Directed

Mutagenesis Kit (Stratagene).

5. Séquençage d'ADN

Le séquençage d'ADN a été effectué en utilisant la technique de terminaison de chaîne

(Sanger et al., 1977) à l'aide du séquenceur automatique ABI 3130 XL (Perkin Elmer) localisé

sur la plateforme de génotypage et de séquençage de Bordeaux. Les réactions de séquençage

19

ont été réalisées en utilisant le kit PRISM AmpliTaq® FS Big dye Terminator 1.1, selon le

protocole suivant :

Pour une réaction : 4 µl de mix BDT

2 µl de tampon 5X (400 mM Tris HCl pH 9,0; 10 mM MgCl2 )

4 µl H2O

1 µl amorce à 10 pmol/ %µl

12 µl ADN matrice (1 µg pour de l'ADN double brin et 100-250 ng pour un produit de

PCR). Les mélanges de réaction sont dénaturés 5 min à 95°C, puis subissent 35 cycles de 30

secondes à 95°C, 15 secondes à 50°C, 1 minute par kb d'ADN à 60°C. A la fin des réactions,

l'ADN des échantillons est précipité, lavé à l'éthanol 70% et repris dans 20 µl de tampon TSR.

Les échantillons sont dénaturés à 95°C avant d'être chargés sur le capillaire du séquenceur

ABI 310.

Les séquences sont traitées en sortie de capillaire grâce au logiciel ABI PRISM Sequencing

Analysis 3.3 (PE Applied Biosystems).

6. Séparation des acides nucléiques par électrophorèse sur

gel d'agarose et purification d'ADN

Les gels d'agarose sont préparés en mélangeant, selon des critères poids/volume, une

quantité d'agarose et un volume de tampon TBE (Tris-HCl 44,5 mM pH 8,0; acide borique

44,5 mM; EDTA 1 mM). La concentration en agarose du gel sera choisie en fonction de la

taille des fragments d'ADN à séparer. L'agarose est dissout dans le TBE en chauffant jusqu'à

ébullition le mélange. Du bromure d'éthidium à 1 µg/ml est ajouté avant polymérisation du

gel. Les échantillons d'ADN sont repris dans une solution de charge (bleu de bromophénol

0,12 %, EDTA 0,125 mM, saccharose 25 %) et déposés dans le gel d'agarose. Les fragments

d'ADN sont séparés par électrophorèse dans du tampon TBE. La visualisation des acides

nucléiques est réalisée en observant la fluorescence après excitation sous UV (302 nm).

Pour purifier l'ADN après électrophorèse sur gel d'agarose, le kit Wizard SV Gel and

PCR Clean-Up System (Promega) a été utilisé. Le bloc d'agarose contenant l'ADN à purifier

est découpé sur le gel puis pesé. L'échantillon est ensuite placé à 50°C pour faire fondre

l'agarose. L'ADN est ensuite traité comme indiqué dans le manuel technique fourni avec le

kit.

20

7. Transformation des bactéries E. coli

Le protocole dérive de la technique décrite par Mandel et Higa (1970). Les cellules

sont cultivées dans du milieu DYT jusqu'à DO580: 0,6. La culture est alors centrifugée pendant

5 min à 2500 g, puis les cellules sont reprises avec 20 ml de CaCl2 50 mM froid. Après 20

min d'incubation dans la glace, les cellules sont de nouveau centrifugées; reprises dans 2 ml

de CaCl2 froid et sont incubées pendant au moins 2 h à 4°C. A ce stade, il est possible de

conserver les bactéries compétentes en présence de glycérol (17% final) à –80°C, par

fractions aliquotes de 300 µl. Vingt à cent nanogrammes d'ADN plasmidique sont ajoutés à

300 µl de bactéries compétentes et l'ensemble est incubé pendant 10 min à 4°C. Après

incubation, les cellules subissent un choc thermique à 42°C pendant 2 min. Ensuite, 800 µl de

milieu DYT sont ajoutés et le mélange est incubé à 37°C pendant 1 h pour permettre

l'expression du gène de résistance à l'antibiotique. Cent microlitres de la suspension sont

étalés sur le milieu sélectif.

8. Transformation des levures S. cerevisiae

Les protocoles utilisés pour la transformation des levures par des plasmides ou des

fragments d'ADN dérivent du protocole décrit par Ito et al. (1983) et optimisé par Gietz en

1995.

Les cellules sont mises en culture en milieu complet YPD liquide, à 30°C, sous

agitation (250 rpm). En phase exponentielle de croissance, une fraction aliquote de la culture

est centrifugée 5 min, à 1000 g, 30°C. Puis le culot cellulaire est lavé avec du LiAc 100 mM.

Les cellules sont à nouveau centrifugées 5 min, à 1000 g, 30°C. Le culot cellulaire est ensuite

traité avec :

240 µl PEG (3350) 50% (poids/volume)

36 µl LiAc 1 M

25 µl ADN simple brin de sperme de saumon (2 mg/ml)

100 ng à 1 µg de plasmide + H2O qsp 50 µl.

Le culot est resuspendu dans le mélange par agitation, puis incubé 10 min à 30°C.

Après l'incubation, les cellules subissent un choc thermique 20 min à 42°C. Le mélange est

centrifugé 5 min, à 2400 g, 30°C. Le surnageant est éliminé et le culot est repris dans 100 µl

21

d'eau MilliQ stérile, puis les cellules sont étalées sur le milieu sélectif. Les cellules sont

incubées de 2 à 3 jours à 30°C.

D. Préparation et analyse des protéines

1. Extraction des protéines totales de levure

Le protocole d'extraction des protéines totales de levure dérive de la technique décrite

par Riezman et al. en 1983 :

Un volume de culture correspondant à 3 unités à DO600nm est centrifugé à 2500 g pendant 5

min. Le culot est resuspendu dans 500 µl d'eau stérile et 50 µl d'une solution de NaOH 1,85 M

sont ajoutés. Le mélange est agité vigoureusement puis il est incubé pendant 10 min à 4°C.

Un volume de 50 µl d'une solution d'acide trichloroacétique 50 % est rajouté, le mélange est

agité vigoureusement et incubé au moins 10 min à 4°C. Après 5 min de centrifugation à

12000 g à 4°C, le surnageant est éliminé. Le culot est resuspendu dans 70 µl d'un mélange

composé de 2 volumes de tampon de charge 2X (100 mM Tris HCl pH 6,8, 4 mM EDTA, 4%

SDS, 20% glycérol, 0,002% de bleu de bromophénol), 1 volume de Tris 1 M et de 2 % de 2-

mercaptoethanol.

L'échantillon est ensuite chauffé à 95°C pendant 10 min et 2 à 15 µl du volume de

l'échantillon sont utilisés pour l'analyse des protéines en SDS-PAGE.

2. Quantification des extraits protéiques

La concentration en protéines des extraits peut être déterminée par différentes

méthodes de dosage. Le dosage au réactif de Bradford (1976) a été utilisé lors de ce travail

pour quantifier les extraits protéiques ne contenant pas de détergents.

Quelques microlitres des extraits protéiques sont ajoutés à 1 ml de solution de

Bradford. Après 5 min d'incubation à température ambiante, l'absorbance du mélange est

mesurée à 595 nm. La quantité de protéines est déduite à partir d'une gamme étalon de BSA.

22

3. Electrophorèse des protéines en gel d'acrylamide

Les protéines extraites sont séparées en fonction de leur masse moléculaire par

électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes suivant la technique

décrite par Laemmli (1970). Le gel est composé d'un gel de séparation à 10 % d'acrylamide au

sommet duquel est coulé un gel de concentration contenant 5 % d'acrylamide. La composition

des gels est la suivante :

gel de concentration gel de séparation

Acrylamide/Bisacrylamide 40% (37,5:1) 5 % (w/v) 10 % (w/v)

Tris-HCl 125 mM pH 6,8 375 mM pH 8,8

SDS 0,1 % (w/v) 0,1 % (w/v)

APS 0,05 % (w/v) 0,05 % (w/v)

Temed 0,1 % (v/v) 0,05 % (v/v)

Les échantillons sont chauffés 5 min à 95°C avant d'être déposés sur le gel.

L'électrophorèse est menée à voltage constant pendant 30 à 60 min à 200V dans un tampon

Tris-glycine pH 8,3 (Tris 25 mM; glycine 192 mM; SDS 0,1%). Les protéines peuvent être

visualisées sur gel après migration par coloration en incubant le gel dans une solution de bleu

de Coomassie (Coomassie Brillant Blue R-250 0,25% w/v; méthanol 45%; acide acétique

10% v/v). La décoloration du gel est effectuée dans une solution contenant 45% de méthanol

et 10% acide acétique.

4. Immunodétection des protéines sur membrane

Afin de visualiser les protéines, les Western blots ont été effectués dans les conditions

suivantes :

Les protéines séparées en gel de polyacrylamide sont transférées sur une membrane de

nitrocellulose (Schleicher & Schuell, PROTRAN BA 83 0,2 µm) par électrotransfert en phase

liquide dans un tampon 25 mM Tris ; 192 mM Glycine ; 20% méthanol ; 0,005% SDS. La

membrane est saturée pendant deux heures à température ambiante dans un tampon PBS (137

mM NaCl ; 2,7 mM KCl ; 10 mM Na2HPO4 ; 10 mM KH2PO4 pH 7,4) ; 0,1% Tween 20 ; 5%

lait en poudre demi-écrémé. Puis elle est lavée 2 fois 5 minutes dans du tampon PBS, 0,1%

23

Tween 20, 3% lait. La membrane est ensuite incubée une heure dans du PBS, 0,1% Tween 20,

3% lait contenant l’anticorps primaire. Après 6 lavages de 5 minutes dans du tampon PBS,

0,1% Tween 20, la membrane est mise en contact pendant 30 minutes avec la protéine G

recombinante couplée à la peroxydase (UnAb-HRP, Eurogentec) dans du PBS, 0,1% Tween

20, 10% lait. Puis elle est lavée 6 fois 5 minutes dans du tampon PBS, 0,1% Tween 20. La

révélation par chimioluminescence est effectuée grâce au système Lumi-LightPLUS (Roche).

Par la suite, la membrane est traitée au rouge Ponceau (Sigma) afin de colorer les protéines et

vérifier la qualité du transfert.

E. Recherche d'interactions physiques entre protéines par le

système double hybride

1. Principe du double hybride

L'approche par double hybride consiste à construire deux protéines hybrides, l'une

fusionnée avec le domaine DB ("DNA-Binding"), l'autre avec le domaine AD ("Activation

Domain"), et à les co-produire dans une souche de levure S. cerevisiae contenant des gènes

"rapporteur" placés sous la dépendance de séquences d'ADN reconnues par le domaine DB.

Si les deux protéines de fusion sont capables d'interagir physiquement dans le noyau de la

cellule, les domaines DB et AD sont de nouveau associés et un activateur de transcription

fonctionnel peut être reconstitué. L'interaction est alors visualisée par l'activation des gènes

"rapporteur", tels que HIS3 et ADE2 de levure et LacZ d'E. coli. Dans ce cas, la cellule

devient prototrophe pour l'histidine et l'adénine et possède une activité "-galactosidase

détectable.

2. Réalisation des tests double hybride

La souche HY (Louvet et al., 1997) a été utilisée lors de ce travail pour rechercher des

interactions protéiques à l'aide du système double hybride. Cette souche de levure diploïde

HY porte les gènes rapporteur HIS3 de levure et lacZ d'E. coli, placés sous la dépendance de

promoteurs possédant les séquences UAS gal.

24

Pour réaliser les tests double hybride, la souche HY est transformée par les deux

plasmides pODB80 et pACT2 portant les constructions moléculaires d'intérêt et permettant

de co-exprimer dans la levure deux protéines de fusion, l'une associée au domaine DB, l'autre

au AD.

Les double-transformants sont sélectionnés sur un milieu SD dépourvu de tryptophane

et de leucine, et ensuite la croissance de levures de differentes colonies est suivie en réalisant

des tests en gouttes sur un milieu SD dépourvu de tryptophane, de leucine et d'histidine. Ce

milieu permet la sélection des levures prototrophes pour l'histidine et donc présentant une

activation de la transcription du gène rapporteur HIS3.

Pour valider les résultats des tests double-hybrides, nous nous sommes assurés dans

chaque expérience que l'activation du gène rapporteur HIS3 était bien le reflet de l'interaction

spécifique entre les deux hybrides protéiques testés. Pour cela, nous avons vérifié que les

protéines étudiées fusionnées avec l'un des deux domaines de Gal4p ne pouvaient pas, à elles

seules, activer la transcription des gènes rapporteurs. De même, nous nous sommes assuré

qu'elles n'étaient pas en interaction directe avec l'autre domaine de la protéine Gal4.

F. Méthode de biologie cellulaire

1. Observation des cellules en microscopie à fluorescence

Les cellules ont été cultivées pendant la nuit dans du milieu synthétique supplémenté

avec les acides aminés appropriés. Des fractions aliquotes contenant des cellules en phase

exponentielle de croissance (0,2-0,4 Unité DO A600) ont été centrifugées et le culot est

resuspendu dans une solution de DABCO (218 nM diazabicyclo [2.2.2] octane (Sigma), 25%

(v / v) de PBS, 75% (v / v) de glycérol). La suspension contenant les cellules est montée entre

lame et lamelle et la distribution du marquage fluorescent est examinée en microscopie. Le

microscope à épifluorescence utilisé est un Zeiss Axioskop 2 plus, équipé d'un objectif à

immersion de grossissement 100 X. La fluorescence verte propre à la GFP est observée grâce

à un filtre standard FITC (Filtre Zeiss 424920) ou un Filtre GFP Long Pass. La fluorescence

rouge de l’Alexa568 et du tdimer2(12) est observée grâce à un filtre Zeiss 424931 et la

fluorescence bleue du DAPI est observée grâce à un filtre Omega Blue QMAX-Blue ZS-55.

Les images ont été capturées avec la camera numérique Zeiss AxioCam MRm. Les images

25

ont été traitées avec le logiciel AxioVision 4.6 (Zeiss) et assemblées avec Photoshop CS2

Adobe). Chaque quantification a été réalisée au moins deux fois, de façon indépendantes, et

100 à 200 cellules ont été analysées à chaque fois.

2. Marquage de l'actine-F par la phalloïdine-Alexa568

Les cellules sont cultivées de préférence en milieu complet YPD liquide jusqu'en

phase exponentielle de croissance ; 5 à 10 U DO A600nm de cellules ont fixées en ajoutant du

formaldéhyde (Sigma) à la concentration finale de 3,7 % (1 mL de formaldéhyde 37% pour 9

mL de culture). Après 30 minutes à 2 heures de fixation dans les mêmes conditions de

température et d’agitation que la culture, les cellules fixées sont récupérées par centrifugation

et lavées 2 fois dans 2 mL de tampon PBS pH 7,4 (NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM;

Na2HPO4 8,1 mM; KH2PO4 1,7 mM). Elles sont à nouveau mises en suspension dans 45 µl de

PBS contenant et 5 µL phalloïdine-Alexa568 (Invitrogen) sont ajoutés. La phalloïdine couplée

à un marqueur fluorescent permet la visualisation des différentes formes d’actine polymérisée.

Après 16 heures d’incubation à 4°C, les cellules sont lavées 3 fois avec du PBS et

resuspendues dans 20 µl d'une solution de montage contenant 1 mg/ml para-phénylène

diamine (Sigma), 25% PBS, 75% glycérol qui permet de réduire le photo-blanchiment du

fluorophore. Le cytosquelette d'actine est ensuite observé par microscopie à fluorescence.

3. Marquage nucléaire au DAPI

Le DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole) est un agent intercalant de l’ADN qui une

fois lié à l’ADN, émet une fluorescence bleue, suite à une excitation UV. Il permet de

visualiser le noyau mais marque également le réseau mitochondrial.

L’échantillon de cellules à marquer est fixé au formaldéhyde à 3,7% final pendant 30

minutes à 2 heures dans les mêmes conditions de température et d’agitation que la culture.

Les cellules fixées sont récupérées par centrifugation et lavées 2 fois dans du tampon PBS

pH 7,4. Elles sont reprises dans une solution de PBS contenant 1 µg.mL-1 de DAPI. Après 10

minutes d’incubation à l’abri de la lumière, les cellules sont resuspendues dans une solution

de montage contenant 1 mg/ml para-phénylène diamine (Sigma), 25% PBS, 75%.

26

4. Immunocytochimie

Cette technique permet de localiser dans la cellule plusieurs éléments simultanément

sur des cellules fixées, à l’aide de plusieurs anticorps couplés à différents fluorochromes.

Les cellules sont cultivées de préférence en milieu complet YPD liquide jusqu'en

phase exponentielle de croissance, environ 3 U DO A600 nm de cellules sont fixées en ajoutant

du formaldéhyde (Sigma) à la concentration finale de 3,7 % (1 mL de formaldéhyde 37%

pour 9 mL de culture). Après 30 minutes à 2 heures de fixation dans les mêmes conditions de

température et d’agitation que la culture, les cellules fixées sont récupérées par centrifugation

et lavées 2 fois dans 1 mL de tampon sorbitol 1,2 M, K2HPO4/ KH2PO4 100 mM. Les cellules

sont ensuite resuspendues dans 500 µL d’une solution de zymolyase (sorbitol 1,2 M, K2HPO4/

KH2PO4 100 mM, Zymolyase 20T 0,2 mg.mL-1, "-mercaptoethanol 0,2%v/v) et incubées 45

minutes à 37°C afin de digérer la paroi cellulaire et de rendre les épitopes accessibles aux

anticorps.

Après le traitement à la zymolyase, les cellules sont rincées une fois dans 1 mL de

PBS puis resuspendues délicatement dans 200 µL de PBS à l’aide d’un cône bleu.

Un volume de 50 µL de cette suspension cellulaire est déposée sur une lame

préalablement traitée à la polylysine. Apres 30 secondes environ, la goutte est éliminée afin

de ne laisser sur la lame qu’une fine couche de cellules. Afin de déshydrater les cellules et de

les fixer sur la lame, celle-ci est immergée exactement 5 minutes dans du méthanol puis 30

secondes dans de l’acétone, tous deux conservés à -20°C.

Les cellules sont réhydratées par 30 µL d’une solution PBS-BSA-triton (PBS pH=7,4,

BSA 1%, triton X100 0,2%) pendant 30 minutes à 2 heures dans une chambre humide (2

épaisseurs de papier Whatman imbibé d’eau recouvert par un couvercle imperméable à la

lumière). La solution de réhydratation est éliminée puis 30 µL d’une solution de PBS-BSA-

triton contenant les anticorps primaires à la dilution adéquate est ajoutée pendant 1 heure dans

la chambre humide (Anticorps de rat anti-HA (1/100), anticorps de lapin anti-Cdc11 (1/100)).

Après avoir éliminé la solution d’anticorps primaires, la lame est rincée par immersion dans

du PBS pendant 25 minutes en agitant au moins 2 fois. La lame est ensuite délicatement

séchée à l’aide d’une allumette recouverte de papier absorbant. 30 µL d’une solution de PBS-

BSA-triton X100 contenant les anticorps secondaires et le DAPI à la dilution adéquate sont

ensuite ajoutés pendant 1 heure dans la chambre humide (Anticorps anti-rat couplés à la

cyanine 3(Cy3)(rouge) (1/100), anticorps anti-lapin couplés au FITC (Fluoresceine Iso Thio

Cyanate) (vert) (1/40), DAPI 1mg.mL-1 (bleu) (1/500)).

27

Apres avoir éliminé la solution d’anticorps secondaires, la lame est à nouveau rincée

par immersion dans du PBS pendant 25 minutes en agitant de temps en temps.

Apres avoir bien égoutté la lame sans trop la laisser sécher, les échantillons sont

recouverts avec 20 µL de DABCO, puis une lamelle est montée et sertie avec du vernis. La

lame peut se conserver plusieurs mois à 4°C. Les images ont été acquises et traitées avec le

logiciel MetaMorph (Molecular Device) et assemblées avec ImageJ (Wayne Rasband

(NIH)/domaine public).

G. Fractionnement subcellulaire

Afin de caractériser les compartiments cellulaires auxquels Rgd1p peut s’associer,

nous avons séparé les différents compartiments selon leur densité, par des approches

biochimiques (Bowser & Novick, 1991).

1. Extraction des protéines totales à partir de sphéroplastes

Les cellules en phase exponentielle de croissance (200 à 250U DO A600nm) sont

récoltées par centrifugation 5 minutes à 4000g. Le culot cellulaire est rincé avec 200 mL

d’eau stérile puis repris dans 12 mL de milieu de sphéroplastisation (50 mM Tris pH7,5 ;

10 mM NaN3 ; 1,4 M sorbitol ; 40 mM "-mercaptoethanol ; 0,4 mg/mL zymolyase 20T) et les

cellules sont incubées 20 minutes à 30°C.

Les sphéroplastes sont récoltés par centrifugation 3 minutes à 1500g, resuspendus

délicatement dans du tampon de lyse (0,8M sorbitol, 20mM triethanolamine, 1mM EDTA pH

7,2 ; PMSF et inhibiteur de protéases), puis cassés au potter par 20 aller-retours.

2. Centrifugations différentielles

Le lysat est clarifié 5 minutes à 500 g afin d’éliminer les gros débris cellulaires et les

cellules non cassées.

Le surnageant de clarification aliquoté par 1mL dans des microtubes de 1,5mL est

centrifugé à 13 000g pendant 10 minutes. Les surnageants de tous les tubes sont regroupés, il

s’agit de la fraction S13.

28

Chaque culot est resuspendu dans 100µL de tampon de lyse. La fraction P13 est donc 10 fois

plus concentrée par rapport à la fraction S13.

Dans des tubes à ultracentrifugation de 5 mL, 3 mL de S13 sont centrifugés à 248 000g

pendant 15 minutes (équivalent à 100 000g pendant 1h). Le surnageant de cette

ultracentrifugation est la fraction S100. Le culot est resuspendu dans 375 µL de tampon de

lyse, il est concentré 8 fois par rapport au S100.

Un volume adéquat de bleu de charge Lemmli 5X est ajouté dans toutes les fractions, puis une

fraction aliquote est analysée par électrophorèse SDS-PAGE en tenant compte des facteurs de

dilution.

3. Centrifugation sur gradient de saccharose

Un lysat cellulaire est préparé et clarifié comme décrit précédemment. Du tampon

MES pH 6,5 est ajouté à une concentration finale de 100mM MES dans le lysat clarifié. Ce

lysat est ensuite centrifugé à 13 000g comme décrit précédemment.

Le surnageant S13 est éliminé et les culots P13 sont repris dans un volume total de 2 mL

d’une solution de saccharose 55% ; MES 10mM pH 6,5.

Le culot P13 est déposé au fond du tube à ultracentrifugation de 11 mL utilisé pour la

centrifugation, puis des solutions de concentration différente de saccharose + 10mM MES pH

6,5 sont ajouté sur le P13 de la façon suivante :

- 1mL 50%

- 1mL 47,5%

- 1,5mL 45%

- 1,5mL 42%

- 1,5mL 40%

- 1mL 37,5%

- 1mL 35%

- 1mL 30%

Le gradient est ensuite centrifugé à 170 000g pendant 16h à 4°C. Après centrifugation,

le gradient est réparti en 20 fractions de 550 µL. La fraction 20 correspond à la première

fraction prélevée en haut du tube (la moins dense), la fraction 1 correspond au culot au fond

du tube (la plus dense).

29

4. Tests d’activités enzymatiques

Pour suivre la présence des différents compartiments cellulaires dans les fractions du

gradient de saccharose, nous avons testé l’activité ATPasique de Pma1p qui est spécifique de

la membrane plasmique, l’activité GDPasique qui est spécifique du cis-Golgi et l’activité

cytochrome-c réductase du réticulum endoplasmique.

a) Mesure de l’activité ATPasique

Cette activité enzymatique est inhibée par le vanadate (Bowman & Slayman, 1979).

Afin de mesurer l’activité ATPasique, l’hydrolyse de l’ATP est suivie en dosant le phosphate

inorganique issu de la réaction.

Dans des microtubes, 200 µL de mix ATPase (5 mM ATP ; 5 mM MgCl2 ; 10 mM

PIPES ; 5 mM NaN3 ; 5 mM phophosphoenolpyruvate) +5 µL/mL de Pyruvate kinase de

type II ajoutés extemporanément (Sigma P1506-1kU) sont incubés avec 50 µL de chaque

fraction, en présence et en absence de 12,5 µL/mL d’orthovanadate pendant 10 minutes à

37°C. Un blanc est réalisé en utilisant une solution de saccharose 40% ; 10 mM MES pH 6,5.

La réaction est stoppée en ajoutant 40µL de TCA 50% froid et en plaçant immédiatement les

tubes dans la glace.

Les tubes sont centrifugés 3 minutes à 12 000g à 4°C afin de d’éliminer les protéines

précipitées par le TCA. 200µL de surnageant est prélevé et conservé à 4°C ou congelé. Le

dosage du Pi libéré sera réalisé ultérieurement.

Le dosage du Pi libéré est réalisé à l’aide du kit Phosphate Assay (Interchim, IS2790).

Le principe de ce dosage est de former du phosphomolybdate à partir de molybdate et de

phosphate inorganique. Lorsqu’il est complexé avec de la malachite, ce composé prend une

coloration verte en condition acide, absorbant à 620 nm.

b) Mesure de l’activité GDPasique du cis-Golgi

L’activité GDPasique est mesurée en suivant le Pi libéré par l’hydrolyse du GDP en

GMP + Pi (Yanagisawa et al., 1990). 40 µL de chaque fraction sont mis en présence de 20 µL

30

de tampon GDPase (100mM imidazole HCl pH 7,4 ; 10mM CaCl2 ; 0,5% triton X-100),

20 µL d’eau.

Un blanc est réalisé en utilisant une solution de saccharose 40% ; 10 mM MES pH 6,5.

20 µL de GDP 35 mM sont ajoutés et les échantillons sont incubés pendant 30 minutes à

30°C.

La réaction est arrêtée par ajout de 10 µL de SDS 10% et les échantillons sont conservés à

4°C ou congelés dans l’attente du dosage du Pi libéré, comme décrit précédemment.

c) Mesure de l’activité cytochrome c réductase du réticulum endoplasmique

Le cytochrome c présente des différences d’absorption à 550nm selon son état redox.

C’est cette propriété qui est utilisée pour le dosage de l’activité spécifique du réticulum

endoplasmique (Kolling & Hollenberg, 1994).

Un volume de 50µL de fraction est mis en présence de 100 µL de tampon KPi 100

mM pH 7 + KCN 1 mM. L’échantillon est placé dans un spectrophotomètre double faisceaux

ou un lecteur de plaque capable de lire l’absorbance à 550 nm. Le blanc est la solution de

saccharose 40% ; 10 mM MES pH 6,5. 150 µL de solution de réaction (KPi 100 mM pH 7 ;

KCN 1 mM ; NADPH 10 mM ; Cytochrome c 2,5 mM) sont ajoutés.

L’augmentation de l’absorbance à 550nm est enregistrée pendant 5 minutes, puis la

mesure de la vitesse initiale est réalisée à l’aide du logiciel MARS (BMG Labtech).

d) Calcul des activités spécifiques

Les activités ATPasique (µmol/10 minutes /mg de protéines) et GDPasique

(µmol/30 minutes/mg de protéines) sont calculées de la façon suivante :

As=

[Pi ]x Vtdosage

Vdosé

x Vtreaction

Vfraction

x [Prot ]

Où [Pi] est la concentration en phosphate libéré en µM obtenue par le kit Phosphate Assay.

Vtdosage est le volume total de la réaction de dosage du phosphate, avec le kit Phosphate Assay

(150 µL)

Vdosé est le volume de d’échantillon dosé avec le kit Phosphate Assay

Vtréaction est le volume total de la réaction (290 µL pour l’activité ATPasique, 110 µL pour

l’activité GDPasique)

31

Vfraction est le volume de fraction utilisé dans les réactions enzymatiques (50 µL pour l’activité

ATPasique, 40 µL pour l’activité GDPasique).

[Prot] est la concentration protéique de la fraction, déterminée par un dosage de Bradford.

(Voir Matériel et Méthodes partie D-2).

Le calcul de l’activité spécifique de la cytochrome c réductase (pmol/min/mg) est effectué de

la façon suivante :

As=Vix V

reaction

e x lx Vfraction

x [ prot ]

Vi est la vitesse initiale de la réaction en !OD/min

e (!) est le coefficient d’absorption molaire du cytochrome c à 550 nm (! = 29500 L/mol/cm)

l est la longueur du chemin optique (l=1 cm).

H. Mesure de activité RhoGAP

1. Activité GAP en condition standard

La mesure de l’activité RhoGAP de Rgd1p est en fait la mesure de l'hydrolyse du GTP

par les protéines Rho3p et Rho4p. La réaction d’hydrolyse du GTP est réalisée avec du

GTP['32P]. Après la fin de la réaction, un traitement au charbon actif permet d’éliminer tous

les éléments organiques (protéines, GTP/GDP). La quantité de phosphate [32P] libéré,

correspondant à la quantité de GTP hydrolysé pendant la durée de la réaction, est mesuré à

l’aide d’un compteur à scintillation. Le test est réalisé en trois étapes successives (31).

1- Chargement du GTP

Le GTP est chargé sur la protéine Rho par incubation de la protéine avec du GTP['32P]

pendant 10 minutes à température ambiante dans le tampon suivant : 20 mM Tris-HCl,

pH 7.6, 25 mM NaCl, 0.1 mM DTT, et 10 mM EDTA. Une quantité appropriée de protéines

Rho pour l’ensemble des tests a été incubée à raison de 0,4-0,5 µCi de GTP['32P] (6000 Ci /

mmol) pour 15 pmol de GTPase. La réaction est arrêtée par addition de 36 mM MgCl2 froid,

et la solution est conservée dans la glace.

2-Activité GTPasique

L’activité GTPasique est initiée par l'ajout de 15 pmol de protéines Rho chargées au

GTP['32P] à un mélange de 0,67 mg / ml d’albumine de sérum bovin (BSA), la quantité de la

protéine RhoGAP Rgd1 dont on souhaite mesurer l’activité, et un volume approprié de

32

tampon d'incubation (tampon 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 0,1 mM DTT) dans un volume

réactionnel final de 30 µL. Ce mélange est incubé pendant 10 minutes à température ambiante

(22 ° C), et la réaction est ensuite arrêtée par addition de 800 µL d’une suspension froide de

charbon actif 0,1 M NaH2PO4.

3- Mesure du phosphate [32P] libéré

Le taux de phosphate [32P] libéré par l’hydrolyse du GTP est déterminé à l’aide d’un

compteur à scintillation après séparation par centrifugation des composés organiques

(GTP/GDP, protéines) piégés par le charbon actif.

Un échantillon contrôle est utilisé pour déterminer la quantité de phosphate [32P]

inorganique présent dans le surnageant sans incubation. Le niveau de radioactivité déterminé

pour ce blanc est soustrait de ceux obtenus dans les tests d'hydrolyse du GTP. Une fraction

aliquote du mélange de chargement est également mélangée à du liquide de scintillation et

comptée pour déterminer précisément la radioactivité totale présente dans chaque essai. Cette

valeur, une fois soustraite de la valeur obtenue pour le blanc, est considérée comme

correspondant à 100% de GTP ['32P] disponible pour l’hydrolyse. Le rapport entre cette

valeur et la quantité de radioactivité présente dans le surnageant après incubation définit le

pourcentage de GTP hydrolysé. Nous avons vérifié que la réaction d'hydrolyse n'atteint pas le

plateau à la fin de l'incubation, en réalisant comme contrôle une mesure d’hydrolyse du GTP

pour un temps d'incubation de 15 minutes au lieu de 10 minutes. Pour chaque essai, la

réaction est réalisée en double exemplaire, et la valeur moyenne des deux essais est retenue

pour l'analyse.

2. Préparation des phospholipides pour les activités RhoGAP

La phosphatidylcholine extraite à partir d'œufs de poule (Sigma) a été dissoute dans de

l’éther et diluée à 1 mg / ml dans du tampon d'incubation. Le phosphatidylinositol (PtdIns)

extrait à partir du soja (Sigma) a été dissous dans du chloroforme et séché sous un flux

d'azote. La phosphatidylsérine (Sigma), le phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns(4)P), et le

phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PtdIns(4,5)P2) (Avanti), extraits de cerveaux bovins ou

porcins, et le PtdIns ont été réhydratés pendant 2 h, et leurs concentrations ont été ajustées à 1

mg / ml dans du tampon d'incubation. Les vésicules ont été obtenues par sonication de la

suspension lipidique grâce à une sonde VCX130 (Sonics) jusqu'à ce que la suspension soit

devenue uniformément claire (Ahmed et al., 1995). Les suspensions de phospholipides ont été

33

stockées en fractions aliquotes à -80 ° C et ont été ajoutées aux tests d'hydrolyse du GTP pour

obtenir une concentration finale de 100 µM.

I. Test d’interaction protéine-lipide par« fat-Western-blot »

Les « Fat-Western-blot» ont été effectués comme décrit précédemment (Dowler et al.,

2002). Les membranes de Nitrocellulose sur lesquelles sont déposés les différents

phospholipides (PIP StipsTM; Echelon Biosciences) sont bloquées par incubation dans une

solution de PBST (137 mM NaCl, 2,37 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 7H2O, mm 1,4 KH2PO4,

1% Tween 20) contenant 1% de lait écrémé en poudre pendant 1 h à température ambiante.

Les membranes PIP StripsTM sont incubées pendant 1 h avec 10 ml de PBST contenant 1% de

lait écrémé en poudre et 10µg de protéine Rgd1p sous forme entière ou tronquée, toutes

étiquetées par la GST,. Les membranes PIP StripsTM sont lavées quatre fois dans du PBST et

incubées pendant 1 h avec une dilution au 1:10 000 d’anticorps anti-GST (Sigma) dans du

PBST contenant 1% de lait écrémé en poudre. La membrane est lavée à nouveau quatre fois et

incubée avec une dilution au 1:10 000 d’anticorps secondaires anti-souris couplés à la

peroxydase HRP (Pierce). La détection des anticorps fixés sur la membrane est réalisée par

chimioluminescence à l’aide du kit Lumi-substrat light PLUS (Roche Applied Science) et du

système d’acquisition Fluorchem 8800 Imaging System (Alpha Innotech).

J. Mesure de l’abondance, de la synthèse et de la dégradation

1. Mesure de l’abondance de Rgd1p.

Une culture de la souche exprimant Rgd1p étiquetée avec 6HA a été synchronisée au

facteur alpha (Matériels et Méthodes partie B-10). A intervalles réguliers après l’élimination

du facteur alpha, une fraction aliquote de 3 U DO A600nm est prélevée et les cellules sont

lysées par le protocole au NaOH-TCA (Matériels et Méthodes partie D-1). Les protéines sont

séparées par électrophorèse SDS-PAGE puis Rgd1-6HA est détectée à l’aide d’un anticorps

anti-HA et l’actine est détectée à l’aide d’un anticorps anti-Act1p.

34

2. Mesure de la vitesse de synthèse de Rgd1p

Les cultures de souches BY4742 (WT) et BY MATa Rgd1-6HA Met+ (HA) en phase

exponentielle de croissance sont synchronisées avec le facteur alpha comme décrit

précédemment en milieu SD-M. Apres les deux heures de synchronisation, une quantité de 15

U DO de cellules est récoltée par centrifugation et resuspendue dans 3 mL de SD-M

préchauffé à 30°C. C’est le temps de reference t=0.

La culture est distribuée en fractions aliquotes à raison de 0,5 ml/tube. Des marquages ont lieu

pendant 10 minutes aux temps suivants : 0 ; 20 minutes (G1) ; 45 minutes (S) ; 1h15 (G2) ;

1h30 (M) et 1h45(G1 du second cycle.

Un volume de méthionine [35S] correspondant à 125 µCi/U.DO, soit 312,5 µCi [35S] est ajouté

à chaque fraction (0,5mL) aux temps indiqués, puis après les 10 minutes d’incubation, 400µL

de la culture sont prélevés et ajoutés à 100µL de TCA 50% froid et le tube est placé 15

minutes à 4°C.

Les cellules sont centrifugées pendant 10 minutes à 5 000g et rincées deux fois avec 1mL

d’acétone. Le culot de cellules est séché 5 minutes à 37°C sous une sorbonne.

a) Lyse des cellules

Le culot est mis en présence de 100µL de tampon SDS/urée (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM

EDTA ; 1% (w/v) SDS ; 6 M urée) pendant 15 minutes à température ambiante.

Les cellules sont lysées en ajoutant des billes de verre (80-90% du volume) et en vortexant

pendant 1 minute. Les échantillons sont ensuite chauffés 4 minutes à 95°C, puis à nouveau

vortexés pendant 30 secondes.

Un volume de 900 µL de la solution d’immunoprécipitation (50 mM Tris-HCl pH 7,5 ; 0,1

mM EDTA ; 150 mM NaCl ; 0,5% (w/v) Tween 20) est ajouté, l’échantillon est ensuite

vortexé et laissé 10 minutes dans la glace.

Après 10 minutes de centrifugation à 14 000g, 850µL de surnageant sont transférés dans un

nouveau tube en éliminant les billes de verre.

Un volume de 5 µl de surnageant est prélevé pour effectuer un comptage avec le liquide de

scintillation.

35

b) Immunoprécipitation

Un volume de 100 µl de protéine A-sepharose est ajouté et incubé avec le surnageant de

l’étape précédente pendant 1 heure à 4°C. Après centrifugation, le surnageant est récupéré

dans un nouveau tube.

Un volume de 100µL du surnageant est mis en contact avec 1µL d'antisérum 12CA5 et incubé

sous agitation sur la nuit à 4°C.

Les échantillons sont centrifugés 30 secondes à 3000g, le culot est rincé 3 fois avec 1mL de

solution de rinçage (50 mM Tris-HCl, pH7,5 ; 100 mM NaCl ; 0,5% (w/v) Tween 20 ;

2 M urée)

Le culot est repris dans 50 µl de bleu de charge Laemmli 1X et chauffé 4' à 95°C.

Apres séparation des protéines par électrophorèse SDS-PAGE, le gel est séché sur un filtre

Whatman, puis la radioactivité est révélée à l’aide du Scanner FujiMajer.

3. Mesure de la stabilité de la protéine Rgd1p

Les cultures de souches BY4742 (WT) et BY Rgd1-6HA Met+ (HA) sont effectuées en

milieu SD-M et 20 U DO de cellules sont récoltés par centrifugation en phase exponentielle

de croissance.

Les cellules sont reprises dans 4 mL de milieu SD-M frais et incubées sous agitation pendant

10 minutes en présence de Méthionine[35S] à raison de 125 µCi/U DO. A l’issue des 10

minutes de marquage, les cellules sont centrifugées et le surnageant est éliminé. Le culot

cellulaire est resuspendu dans du milieu SD-M + 20 µL/mL de la solution de chasse 50X (50

mM Méthionine ; 5 mM Cystéine).

L’ajout de la solution de chasse correspond au temps 0 de l’expérience. Aux temps 0, 15

minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 heure, 1h15, 1h30 et 1h45, 400 µL de culture sont

prélevés, mélangés avec 100 µL de TCA froid et incubés 15 minutes à 4°C.

La lyse des cellules et l’immunoprécipitation sont réalisées comme précédemment.

36

RESULTATS

Figure I-1 : Organisation en domaines de la protéine RhoGAP Rgd1 de la levure

Saccharomyces cerevisiae et de la protéine humaine CIP4. Identification réalisée avec le

programme SMART (Simple Modular Architecture Reseach Tool) (http://smart.embl-

heidelberg.de).

RESULTATS

Chapitre I. Relation entre Rgd1p et les cytosquelettes

La protéine Rgd1 est l’unique régulateur négatif connu des protéines Rho3 et Rho4

(Doignon et al., 1999). Elle possède à son extrémité C-terminale un domaine RhoGAP

capable d'activer l'hydrolyse du GTP en GDP par les GTPases de la famille Rho. Il existe de

nombreux liens fonctionnels entre les GTPases Rho3p, Rho4p, leur protéine RhoGAP Rgd1 et

le cytosquelette d'actine. Ainsi, le gène RGD1 présente une co-létalité avec les gènes LAS17 et

VRP1 (Roumanie et al., 2002; Roumanie et al., 2000), les homologues chez la levure de

WASP (Wiskott-Aldrich Syndrom Protein) dont l’altération provoque une maladie

immunitaire héréditaire (Bosticardo et al., 2009) et WIP (WASP Interacting Protein). Les

protéines Las17 et Vrp1 sont des activateurs du complexe nucléateur de filaments d'actine

Arp2/3p, conduisant à la formation des patches d'actine ou actine corticale. Il a été montré au

laboratoire que ce lien fonctionnel transite par le domaine RhoGAP de Rgd1p et par les

protéines Rho3 et Rho4 (Roumanie et al., 2002; Roumanie et al., 2000). Les protéines Rho3

et Rho4 ont également une fonction activatrice sur les formines Bni1p et Bnr1p (Dong et al.,

2003), responsables de la nucléation des câbles d'actine, nécessaires au trafic intracellulaire, à

l'orientation du SPB (Spindle Pole Body) et à la formation de l’anneau d’actomyosine (Schott

et al., 2002).

A l'extrémité N-terminale de Rgd1p, un domaine FCH (Fer/Fes CIP4 Homology) a été

identifié in silico (Figure I-1 et I-2). Ce domaine est présent en particulier chez la protéine

humaine CIP4 de la famille toca (Cdc42 Interacting Protein)(Schultz et al., 1998). Ce

domaine est décrit comme étant capable d'interagir avec les microtubules. La protéine CIP4

est impliquée dans le trafic polarisé chez les cellules neuronales et immunitaires (Banerjee et

al., 2007), ainsi que dans l’adhésion cellulaire, en participant à la formation de podosomes

(Linder et al., 2000). Par son domaine FCH, CIP4 interagit avec les microtubules, et elle

interagit également avec Cdc42 et WASP via un domaine SH3 (Src homology 3) situé à son

extrémité C-terminale (Tian et al., 2000). CIP4 est donc capable d’interagir avec des

activateurs du cytosquelette d’actine (Cdc42 active la formation des câbles d’actine, WASP

active la formation des patches d’actine) et de les associer au réseau de microtubules astraux

pour ainsi jouer un rôle de coordination entre les cytosquelettes d’actine et de microtubules.

37

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I-2

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Dans cette partie, nous aborderons tout d’abord les liens physiques et fonctionnels

existant entre le domaine RhoGAP de Rgd1p et le cytosquelette d’actine, puis les relations

entre le domaine FCH de Rgd1p et le cytosquelette de microtubules, afin de déterminer si

Rgd1p ne pourrait pas jouer un rôle similaire à celui de CIP4 chez la levure S. cerevisiae, à

savoir permettre un dialogue moléculaire entre les deux cytosquelettes.

A. Relation entre le domaine RhoGAP de Rgd1p et le

cytosquelette d’actine

1. Contexte

Chez la levure S. cerevisiae, le cytosquelette d’actine est composé de câbles et de

patches d’actine ainsi que d’un anneau d’actomyosine.

Les câbles sont des faisceaux de filaments d’actine principalement visibles dans le

cortex de la cellule mère. Ils sont nucléés par les formines, notamment Bni1p, sous le contrôle

des GTPases de la famille Rho Cdc42p, Rho1p et Rho3p (Dong et al., 2003). Ces câbles sont

nécessaires au trafic intracellulaire où des « moteurs myosine » de type V, tel Myo2p, les

utilisent comme rails pour transporter vésicules et organelles de la cellule mère vers la cellule

fille. D’autre part, ils seront utilisés par la machinerie du cytosquelette de microtubules pour

orienter le fuseau de division nucléaire. Lors de la cytocinèse, des câbles d’actine, nucléés par

la formine Bnr1p, sous le contrôle de Rho4p, vont former un anneau au niveau du cou du

bourgeon, conduisant à l’assemblage d’un anneau contractile d’actomyosine (Dong et al.,

2003).

Les patches d’actine sont des ensembles de filaments branchés d’actine, nucléés par le

complexe Arp2/3p, sous le contrôle de Las17p et Vrp1p. Ces patches jouent un rôle dans

l’endocytose lors de l’internalisation des vésicules et de leur transport (Moseley & Goode,

2006).

Lors de la croissance polarisée, au début du cycle cellulaire, le cytosquelette d’actine

est polarisé vers le site de bourgeonnement pendant les phases de croissance apicale et

isotropique du bourgeon. Les câbles, nucléés dans le bourgeon, se prolongent dans le cortex

de la cellule mère, alors que les patches sont présents en grande quantité dans le bourgeon.

Lorsque la cellule fille a atteint une taille équivalente à celle de la cellule mère, la polarité

38

Figure I-3 : Etude de la mortalité de la souche de référence et du mutant rgd1! induite par un

stress acide en milieu riche YPD. Le choc acide a été réalisé au temps 0 par ajout d'acide

chlorhydrique 37% jusqu’à obtention d’un pH de 2,8. La mortalité du mutant rgd1! et de la

souche de référence a été suivie par coloration au bleu de méthylène et examen au microscope

de 200 cellules par points. La croissance a été suivie par mesure de la turbidimétrie de la culture

à 600 nm.

s’inverse pour s’orienter vers le cou du bourgeon. Les câbles sont alors nucléés au niveau du

cou et se prolongent de part et d’autres, dans les deux cellules, alors que les patches sont

concentrés dans la zone du cou (Figure 7 de l’introduction)

Afin d’examiner la nature des relations entre Rgd1p et le cytosquelette d’actine, nous

avons cherché à mettre en évidence des défauts du cytosquelette d’actine dans un mutant

rgd1!.

2. Résultats

a) Le cytosquelette d’actine est-il affecté dans un mutant rgd1! en conditions

standards de culture ?

Lors de précédentes études (Barthe et al., 1998), il a été montré au laboratoire que le

cytosquelette d’actine marqué à la Rhodamine-phalloïdine ne semblait pas présenter de

défauts particuliers dans des souches de fonds génétiques FY ou S288c, inactivées pour le

gène RGD1. Nous avons tout d’abord voulu reproduire et préciser ce résultat dans le fond

génétique BY, en utilisant l’Alexa568 comme fluorophore. Couplé à la phalloïdine,

l’Alexa568 est un fluorophore permettant de visualiser le cytosquelette d’actine avec

beaucoup plus de finesse que la rhodamine couplée à la phalloïdine.

La souche de référence BY4742 et la souche mutante rgd1! ont été cultivées en

condition standard (milieu riche YPD, 30°C) puis une fraction aliquote de chaque culture en

phase exponentielle de croissance a été prélevée afin de réaliser un marquage du cytosquelette

d’actine à l’aide de phalloïdine couplée au fluorophore Alexa568.

La proportion de cellules présentant un cytosquelette dépolarisé a été déterminée à

partir du comptage de 200 cellules pour chacune des souches. Nous n’observons pas de

différence significative entre la souche sauvage (8,8% de cellules présentant un cytosquelette

d’actine dépolarisé) et la souche rgd1! (7,7%).

b) Le pH acide affecte-t-il la polarité du cytosquelette d’actine dans un mutant

rgd1! ?

Lors d’un stress (thermique, pH, oxydatif,…), le cytosquelette d’actine se dépolarise

totalement en quelques minutes, puis revient à l’état initial au bout de quelques heures

(Chowdhury et al., 1992; Delley & Hall, 1999; Motizuki et al., 2008). En condition de stress

39

A

B

Figure I-4 : Cinétique de dépolarisation / repolarisation du cytosquelette d’actine par marquage

avec Abp1-3GFP. La polarité du cytosquelette d’actine, visualisée grâce à Abp1-3GFP a été

analysée sur 100 cellules pour chaque point en condition de choc acide à pH=2,8 réalisé au

temps 0 (trait plein) ou par ajout d’un volume d’eau identique au volume d’acide (trait pointillé).

En parallèle, la viabilité des différentes souches après le choc acide a été suivie par coloration au

bleu de méthylène (histogrammes à droite).

A) Suivi de la polarité du cytosquelette d’actine par Abp1-3GFP et de la mortalité sur la souche

de référence et le mutant rgd1!.

B) Suivi de la polarité du cytosquelette d’actine par Abp1-3GFP et de la mortalité sur les

souches produisant les formes tronquées Rgd1!FCH et Rgd1!GAP ainsi que dans la souche de

référence.

acide, une mortalité d’environ 40% de la population est observable dans la souche rgd1!

alors que dans la souche de référence cette mortalité concerne moins de 5% des cellules (Gatti

et al., 2005). Cette mortalité est observable environ 4 heures après le choc acide, en milieu

riche. Ce résultat montre que Rgd1p devient une protéine essentielle en condition de stress

acide (Figure I-3). C’est pourquoi nous avons également examiné le cytosquelette d’actine

dans cette condition chez le mutant rgd1!.

Le marquage du cytosquelette d’actine a donc été réalisé dans la souche de référence

et une souche rgd1! en milieu YPD. En phase exponentielle de croissance, un choc acide (pH

= 2,8) par ajout d’HCl à été réalisé, des échantillons ont été marqués à la phalloïdine-

Alexa568 avant le choc, puis à intervalles réguliers après le choc.

Dans ces conditions expérimentales, aucun signal de fluorescence correspondant à

l’actine n’est détectable après le choc acide pour les souches sauvage et rgd1!. Ce résultat

tend à montrer que l’acidification du milieu de culture interfère avec le marquage de l’actine.

De nombreuses conditions de fixation et de marquage ont été testées (rinçage des cellules au

PBS avant ou après la fixation, neutralisation du pH avant la fixation, essais de phalloïdine

couplée avec d’autres fluorochromes (FITC, alexa488, Rhodamine)) mais n’ont pas permis de

visualiser un signal de fluorescence.

c) Visualisation du cytosquelette d’actine avec ABP1-3xGFP

Ne parvenant pas à observer le cytosquelette d’actine par un marquage à la

phalloïdine, nous avons cherché à visualiser la protéine Abp1p (Actin Binding Protein),

fusionnée à 3 GFP. Abp1p s’associe avec les câbles et les patches d’actine et intervient

notamment dans l’endocytose (Kim et al., 2006). Cette construction, intégrée au locus ABP1

permet d’observer indirectement les câbles et les patches d’actine, même à pH acide. Nous

avons ainsi pu suivre, via ABP1-3GFP, la cinétique de dépolarisation / repolarisation du

cytosquelette d’actine suite à un choc acide (Figure I-4A). Dans la souche de référence, le

cytosquelette d’actine apparaît dépolarisé au maximum dans environ 35 % des cellules 20

minutes après le choc. Le pourcentage de cellules dépolarisées est de 17% une heure après le

choc et la valeur de ce pourcentage est similaire au niveau initial moins de 100 minutes après

le choc. Dans un mutant rgd1!, la dépolarisation est beaucoup plus importante 20 minutes

après le choc et affecte 70% de la population, le niveau basal n’est rétabli que 2 h après le

choc. Ces résultats montrent une différence du simple au double dans l’amplitude de la

dépolarisation entre la souche de référence et le mutant rgd1!, cependant les vitesses de

40

Figure I-5 : Cinétique de dépolarisation / repolarisation du cytosquelette d’actine par marquage

à la phalloïdine. La polarité du cytosquelette d’actine a été analysée sur 200 cellules pour chaque

point en condition de choc acide à pH=2,8 réalisé au temps 0.

En parallèle, la viabilité des différentes souches après le choc acide a été suivie par coloration au

bleu de méthylène (histogrammes à droite).

repolarisation entre ces deux souches semblent équivalentes. Comme décrit précédemment,

une mortalité d’environ 45% de la population est observable dans le mutant rgd1! 4 heures

après le choc, alors que la souche de référence présente moins de 10 % de mortalité.

Cette cinétique a également été réalisée avec des souches produisant les formes

tronquées de Rgd1p : Rgd1!FCH (!1-144) et Rgd1!GAP (!480-660). Ces constructions ont

été insérées au locus de RGD1, en remplaçant la copie endogene. (Figure I-4B). De façon

inattendue, la délétion rgd1!FCH(!1-144) entraîne une dépolarisation du cytosquelette

d’actine similaire à celle observée dans la souche sauvage (maximum de dépolarisation

inferieur à 40% des cellules 20 minutes après le choc et retour à un niveau presque basal en

une heure) mais conduit par contre à un taux de mortalité similaire au mutant rgd1! (de

l’ordre de 50%). La délétion rgd1!GAP(!480-660) entraine une amplitude de dépolarisation

légèrement inferieure à celle observée dans la souche sauvage mais cette dépolarisation est

beaucoup plus lente. En effet, dans la souche délétée pour le domaine RhoGAP de Rgd1p, le

cytosquelette est dépolarisé en une heure, et aucune repolarisation n’est observée à la fin de la

cinétique. Il est à noter que 4 heures après le choc, la souche rgd1!GAP présente une

mortalité légèrement réduite par rapport aux souches rgd1! et rgd1!FCH.

d) Marquage du cytosquelette d’actine à la phalloïdine

Les problèmes de marquage de l’actine à la phalloïdine en milieu acide ont été résolus

en utilisant du formaldéhyde dilué à 4,2% dans du PBS pour la fixation de cellules (9 mL de

formaldéhyde 4,2 % pour 1 mL de culture) tout en gardant la concentration finale de 3,7 % de

la fixation conventionnelle (Motizuki et al., 2008).

A la différence de la cinétique observée avec ABP1-3xGFP, le marquage à la

phalloïdine sur la souche de référence permet d’observer une dépolarisation de 80 % (environ

35% avec ABP1-3GFP) de la population 30 minutes après le choc et un retour au niveau

initial en 1 heure, comme décrit par Motizuki et al (Motizuki et al., 2008). Les cinétiques de

dépolarisation / repolarisation du mutant rgd1! et des souches exprimant les formes

tronquées Rgd1!FCH et Rgd1!GAP présentent un maximum de cellules dépolarisées

similaire à celui de la souche sauvage. Par contre, la proportion de cellules dépolarisées dans

le mutant rgd1! est plus élevée que pour la souche sauvage au temps 1h et n’est toujours pas

revenue au niveau initial 2 heures après le choc. Ce résultat semble indiquer un défaut de

repolarisation du cytosquelette d’actine dans un mutant rgd1!. De façon surprenante, les

41

Rgd1-!FCH

surnageant culot surnageant culot

Sans microtubule

Avec microtubules

Rgd1

FCH

Figure I-6 : Expérience in vitro de co-sédimentation de Rgd1p marquée par incorporation de

méthionine35S avec les microtubules. Apres 10 minutes d’ultracentrifugation à 120 000g des

différentes formes de Rgd1p en présence ou en absence de microtubules, les différentes fractions

ont été séparées par électrophorèse SDS-PAGE et révélées par autoradiographie. (Benoit

Pourcet, RDPR)

souches rgd1!FCH et rgd1!GAP repolarisent leur cytosquelette d’actine à la même vitesse

que la souche de référence (Figure I-5).

3. Conclusion

La protéine Rgd1p a de nombreux liens physiques et fonctionnels avec la machinerie

du cytosquelette d’actine. Afin d’examiner la nature de ces relations, nous avons cherché à

mettre en évidence des défauts du cytosquelette d’actine dans un mutant rgd1!. Les

différentes approches utilisées nous ont permis d’observer des différences dans la dynamique

du cytosquelette d’actine dans un mutant rgd1! dans des conditions de stress acide, où Rgd1p

devient une protéine essentielle.

Bien que les deux approches permettent de mettre en évidence des défauts de la

dynamique du cytosquelette d’actine dans un mutant rgd1! en condition acide, les cinétiques

de repolarisation suivies avec ABP1-3xGFP ou en marquage à la phalloïdine sont très

différentes. Selon la méthode utilisée, une différence d’amplitude de dépolarisation (ABP1-

3xGFP) ou de vitesse de repolarisation (phalloïdine) est notable entre la souche sauvage et la

souche rgd1!. Cette différence peut être expliquée par le fait que ABP1-3GFP permet une

visualisation indirecte du cytosquelette d’actine, potentiellement perturbée par les stress

cellulaires comme le pH alors que la phalloïdine, qui s’insère dans les filaments d’actine

polymérisés après une étape de fixation des cellules et plusieurs rinçages dans du PBS

pH=7,4, permet une visualisation directe du cytosquelette. De plus, la cinétique observée

grâce au marquage à la phalloïdine est similaire à ce qui est décrit dans la littérature (Motizuki

et al., 2008).

Un choc acide en milieu YPD à pH = 2,8 entraîne une mortalité d’environ 40% de la

population dans un mutant rgd1! et de l’ordre de 5% dans la souche de référence, 4 heures

après le choc. Lors d’expériences de marquage à la phalloïdine, la repolarisation du

cytosquelette d’actine est plus lente dans le mutant rgd1! que dans la souche de référence.

Contrairement à la souche sauvage dont le cytosquelette est entièrement repolarisé 1 heure

après le choc, la polarité du cytosquelette d’actine du mutant n’est pas entièrement restaurée

2 h après le choc.

42

A

B

Figure I-7: Orientation du fuseau de microtubules chez la levure Saccharomyces cerevisiae.

A). Le complexe Bim1-Kar9p-Myo2p est attaché à l’extrémité (+) des microtubules

cytoplasmiques issus des Spindle Pole Bodies (SPB). Myo2p est un moteur d’actine qui exerce

une tension sur les microtubules en se déplaçant le long des câbles d’actine en direction du

bourgeon (Hwang et al (2003), J Cell Biol, 161(3) p483).

B) Le complexe Dynéine-Dynactine est attaché à l’extrémité (+) des microtubules à l’aide du

complexe Pac1p-Bik1p et fixé au niveau du cortex cellulaire par Num1p. Le complexe Dynéine-

Dynactine est un moteur de microtubules capable de se déplacer vers l’extrémité (-) situé au

SPB créant ainsi une tension capable d’allonger le fuseau de microtubules (Sheeman et al

(2003), Curr Biol, 13(5) p364).

Le pH acide a deux effets sur le mutant rgd1! : au niveau de la dynamique de

repolarisation du cytosquelette d’actine et au niveau de la viabilité. Or le retard de

repolarisation est comblé environ 2 heures après le choc alors que la mortalité du mutant

n’apparaît que 4 heures après le choc. Cela suggère que le retard de repolarisation du

cytosquelette d’actine n’est pas la cause de la mortalité.

Réciproquement, avant deux heures, la mortalité du mutant est très faible et ne peut

pas expliquer le retard de repolarisation du cytosquelette.

Lors d’un choc acide, il a été montré au laboratoire que le pH intracellulaire du mutant

rgd1! était plus bas que celui de la souche de référence, montrant ainsi un rôle de Rgd1p dans

la régulation de l’homéostasie (Gatti et al., 2005). Il a été proposé que cette acidification

intracellulaire puisse être la cause de la mortalité associée à la délétion de RGD1 en condition

acide. Les souches mutantes rgd1!FCH et rgd1!GAP présentent une mortalité à 2h et à 4h

similaire à celle du mutant rgd1!, probablement causée par une acidification cellulaire

similaire à celle constatée dans le mutant rgd1!. Cependant, les souches produisant ces

formes tronquées ne présentent aucun retard de repolarisation après le choc acide, par rapport

à la souche de référence. On peut donc penser que l’acidification du contenu intracellulaire du

mutant rgd1! n’est pas responsable du retard de repolarisation du cytosquelette d’actine.

B. Existe-t-il une interaction entre Rgd1p et les microtubules ?

L’analyse bioinformatique de la séquence de Rgd1p a montré la présence d’un

domaine FCH en position N-terminale. Nous pouvons imaginer que Rgd1p pourrait interagir

avec les microtubules via son domaine FCH et permettre un dialogue entre les cytosquelettes

d’actine et de microtubules chez la levure Saccharomyces cerevisiae, à la manière de CIP4

chez l’Homme.

43

Figure I-8 : Effet du benomyl sur la croissance des mutants rgd1!, kar9!, dyn1! et des double

mutants rgd1!kar9! et rgd1!dyn1! sur milieu YPD + 4 µg/µL benomyl à 16°C.

Figure I-9 : Etude du phénotype de binucléation. Les mutants rgd1!, kar9!, dyn1! et les

double-mutants rgd1!kar9! et rgd1!dyn1! ainsi que la souche de référence BY ont été cultivés

en milieu YPD à 16°C pendant 48h. Après coloration au DAPI, les pourcentages de cellules

présentant des défauts de ségrégation nucléaire ont été déterminés (200 cellules observées par

souche). La photographie montre une cellule binucléée après coloration au DAPI.

1. Existe-t-il une interaction entre Rgd1p et les microtubules in

vitro ?

Afin de vérifier cette hypothèse, Benoit Pourcet, lors de son stage de Master 2

(2003/2004), a réalisé des expériences de co-sédimentation similaires à celles utilisées pour

démontrer l’interaction entre CIP4 et les microtubules (Tian et al., 2000).

La forme entière de Rgd1p ainsi que les formes tronquées Rgd1!1-144 (forme délétée

pour le domaine FCH) et Rgd1!144-666 (domaine FCH seul) ont été produites et radio-

marquées in vitro par le système RTS (Rapid Translation System) en présence de Méthionine 35S (Roche).

Les différentes formes de Rgd1p produites ont été incubées en présence ou en absence

de microtubules de bœuf, polymérisés in vitro (Société Cytoskeleton). Après centrifugation

des différents échantillons à 120 000g sur un coussin de glycérol à 60%, les protéines des

différentes fractions sont séparées par électrophorèse et la radioactivité associée à la protéine

Rgd1p est détectée par autoradiographie (Figure I-6).

La forme entière de la protéine est présente dans le culot de centrifugation en présence

de microtubules, alors qu’elle est détectée uniquement dans le surnageant en absence de

microtubules. L’analyse des profils de co-sédimentation des microtubules et des formes

tronquées de Rgd1p montre que le domaine FCH seul (Rgd1!144-666) est présent dans le

culot alors que la forme délétée pour le domaine FCH (Rgd1!1-144) n’y est pas détectée. En

absence de microtubules, le domaine FCH de Rgd1p et Rgd1!FCH sont très majoritairement

présents dans le surnageant.

Ces résultats tendent à montrer le rôle du domaine FCH dans l’association in vitro de

la protéine RhoGAP Rgd1p avec les microtubules.

2. Existe-t-il une interaction entre Rgd1p et les microtubules in

vivo ?

Afin de tester la réalité de cette interaction in vivo, nous avons tout d’abord cherché à

mettre en évidence des phénotypes caractéristiques, liés à des défauts du cytosquelette de

microtubules.

Kar9p et la dynéine (Dyn1p) sont deux protéines associées aux microtubules

impliquées dans la ségrégation nucléaire. Kar9p interagit avec les microtubules issus du

44

Figure I-10 : Localisation de la protéine de fusion Rgd1-3GFP. La construction est intégrée au

locus RGD1, son expression est sous le contrôle du promoteur de RGD1.

Figure I-11: Localisation du cytosquelette de microtubules marqué à l’aide de la construction

Tub1p-CFP (en haut) et la protéine +TIP Kar9-3GFP (en bas) (Moore et al (2006), Mol Biol Cell,

17 p178).

Spindle Pole Body (SPB) situé du coté du bourgeon et contrôle l’orientation du fuseau

mitotique. Kar9p interagit avec la protéine associée aux microtubules Bim1p et joue un rôle

d’adaptateur qui permet l’accrochage des microtubules sur le moteur myosine de type V,

Myo2p (Schuyler & Pellman, 2001). Myo2p est capable de se déplacer le long des câbles

d’actine, en direction de l’extrémité barbue située dans le bourgeon. Le complexe moteur

Bim1p-Kar9p-Myo2p permet l’accrochage et le déplacement des microtubules sur les câbles

d’actine et ainsi permet d’exercer une traction sur le Spindle Pole Body du coté de la cellule

fille et de conduire à la bonne orientation du fuseau mitotique (Schott et al., 2002) (Figure I-

7A).

La dynéine est un moteur de microtubules capable de se déplacer vers l’extrémité (-)

des microtubules, située au niveau des SPB. La dynéine et son activateur, la dynactine, sont

localisés à l’extrémité (+) des microtubules astraux par le complexe moteur Pac1p et Bik1p

(homologues de la kinésine et de CLIP-170). Le complexe dynéine-dynactine est ancré dans

les cortex de la cellule mère et de la cellule fille à l’aide de la protéine Num1. En se déplaçant

vers l’extrémité (-) des microtubules, Dyn1p permet d’exercer une traction sur les

microtubules de part et d’autre du noyau et conduit à la bonne ségrégation des noyaux (Moore

et al., 2009) (Figure I-7B).

La délétion des gènes KAR9 et DYN1 n’est pas létale en condition standard de culture.

Cependant, la double mutation dyn1"kar9" entraîne une co-létalité, montrant un lien

fonctionnel entre ces deux gènes. De plus, en conditions défavorisant la polymérisation des

microtubules, en présence de drogues (Benomyl, Nocodazol) ou bien à faible température

(16°C), la délétion de ces gènes entraîne des phénotypes allant de défauts de ségrégation

nucléaire à la mort de la cellule.

a) Recherche de létalités synthétiques avec le gène RGD1

L’inactivation simultanée de deux gènes non essentiels qui conduit à un phénotype de

létalité est généralement interprétée comme une implication de ces deux gènes dans des

processus cellulaires proches ou complémentaires. L’existence d’un phénomène de létalité

synthétique entre RGD1 et des éléments de la machinerie du cytosquelette de microtubules

tels que KAR9 et DYN1 révélerait un lien fonctionnel entre les produits de ces gènes.

Pour mettre ceci en évidence, la souche BY4742 rgd1" (Euroscarf) a été croisée avec

les souches BY4741 kar9" et BY4741 dyn1". Les double-mutants rgd1"kar9" et

45

A B

Figure I-12: Représentation schématique de l’attachement des microtubules aux kinétochores.

A) Modèle du processus d’attachement bipolaire du kinétochore aux microtubules nucléaires des

Spindle Pole Bodies.

B) Exemple de défauts d’attachement des microtubules aux kinétochores.

(Pinsky et Biggins (2005), Trends in Cell Biology, 15(9) p486)

rgd1"dyn1" ont été recherchés dans les asques di-type recombinés (DR) issus des

croisements rgd1! x kar9! et rgd1! x dyn1!. Pour chaque croisement, l’analyse de 3

tétrades de type DR a montré que tous les double-mutants sont viables et ne présentent pas de

défaut de croissance en condition standard.

Bien qu’aucune létalité synthétique ne soit observable, nous avons étudié le phénotype

des double-mutants dans des conditions défavorables à la polymérisation des microtubules.

b) Effet du benomyl sur la croissance du mutant rgd1!

Le benomyl est une drogue capable de déplacer l’équilibre thermodynamique de la

polymérisation des microtubules dans le sens de la dépolymérisation. Utilisé à différentes

concentrations dans le milieu de culture, le benomyl peut permettre de révéler des défauts de

la machinerie du cytosquelette de microtubules dans certains mutants de levure. La

température joue également un rôle important dans la stabilité des microtubules en

ralentissant leur assemblage.

Ainsi, la croissance des simple-mutants rgd1!, kar9! et dyn1! ainsi que la

croissance#des double-mutants rgd1"kar9" et rgd1"dyn1" a été testée sur milieu YPD

additionné en benomyl à différentes concentrations (2 à 8 µg.mL-1) à 16°C.

Après 5 jours de croissance, aucune différence de croissance n’a été observée pour les

double-mutants par rapport aux simple-mutants kar9! et dyn1! ou pour le mutant rgd1" par

rapport à la souche sauvage (Figure I-8).

c) Etude du phénotype de binucléation chez le mutant rgd1!

Les mutants kar9! et dyn1! entraînent respectivement des défauts d'orientation du

fuseau mitotique et de ségrégation du noyau. Ces défauts sont aisément visibles après

coloration au DAPI. Il est alors possible d'observer en microscopie à fluorescence la présence

d'un noyau allongé mal orienté ou bien la présence de deux noyaux dans la cellule mère. Ce

type d’analyse a été réalisé chez le mutant rgd1! ainsi que chez les double-mutants

rgd1!kar9! et rgd1!dyn1! et leurs contrôles respectifs. Pour chaque souche, 3 clones

indépendants ont été observés et 200 cellules de chaque clone ont été analysées.

Aucune différence significative n'a été mise en évidence entre le mutant rgd1! et la

souche sauvage ou entre les double-mutants et leurs contrôles respectifs (Figure I-9).

46

Figure I-13 : Ségrégation du noyau lors de la mitose, chez la levure Saccharomyces cerevisiae.

(Laboratoire de Marisa Segal, http://www.gen.cam.ac.uk/Research/segal.htm)

L’ensemble des résultats ci-dessus ne permet pas de mettre en évidence des défauts de

la machinerie du cytosquelette de microtubules dans une souche inactivée pour le gène RGD1.

Les résultats de ces tests nous montrent qu'il n'y a pas de létalité synthétique entre RGD1 et

DYN1 ou KAR9, que le mutant rgd1! est capable de croître normalement en condition

défavorable pour la polymérisation des microtubules et qu'il ne présente à aucun moment le

phénotype de binucléation caractéristique des mutants de la machinerie de microtubules.

d) Localisation cellulaire de la protéine Rgd1

Il est clair que Rgd1p ne joue pas de rôle majeur sur l’organisation ou le

fonctionnement du cytosquelette de microtubules, mais nous pouvons penser que le réseau de

microtubules pourrait avoir un effet sur l’activité ou la localisation de la protéine Rgd1p. Pour

répondre à cette question, la localisation de Rgd1p a été étudiée à l'aide d'une construction de

RGD1 étiquetée avec 3xGFP, intégrée au locus RGD1, sous le contrôle de son propre

promoteur.

Apres vérification par Western blot que la protéine de fusion était correctement

produite et qu'elle était capable de restaurer la fonction normale de Rgd1p en choc acide dans

le mutant rgd1!, sa localisation a été examinée par microscopie à fluorescence (Figure I-10).

La protéine Rgd1p peut être observée au moins à deux localisations distinctes (Voir

chapitre II) :

- Au niveau du site de croissance du bourgeon, sous forme d’un croissant sous-cortical lors

des premières étapes du cycle cellulaire (petits et moyens bourgeons).

- Au niveau du cou du bourgeon, sous forme d’un anneau dans la phase finale du cycle

cellulaire (gros bourgeon).

La localisation de Rgd1p semble suivre la zone de croissance de la cellule, d’abord

vers le fond du bourgeon, puis lors du changement de polarité du cytosquelette d’actine, vers

le cou du bourgeon. Il est donc envisageable que cette localisation puisse être contrôlée par le

cytosquelette d’actine ou le trafic intracellulaire. Cependant, cette localisation ne correspond

pas à la localisation caractéristique des protéines de type MAP (Protéine Associée aux

Microtubules), colocalisant avec l’ensemble des microtubules nucléaires ou astraux et

montrant une localisation cytoplasmique sous forme de un ou plusieurs traits reliés au SPB.

La localisation de Rgd1 ne correspond pas non plus à la localisation des protéines de type

+TIP (plus end Interacting Protein) telle Kar9p, montrant une localisation sous forme de

47

Figure I-14 : Modèle de régulation de la voie « NoCut » . La kinase Ipl1p et ses effecteurs

Boi1p et Boi2p régulent cette voie en ne déclenchant la cytocinèse qu’après la fin de l’anaphase

(Norden et al (2006) Cell 125 p85).

points discrets correspondant à l’extrémité (+) des microtubules astraux (Moore et al., 2006)

(Figure I-11).

3. Conclusion

Les études in vitro tendent à montrer que la protéine Rgd1 interagit avec les

microtubules via le domaine FCH, toutefois ce résultat n'a pu être confirmé in vivo. Cette

situation n'est pas propre à Rgd1p. En effet, le domaine FCH a été identifié par rapport aux

protéines CIP4 et Fes (c-fes tyrosine kinase). La protéine Fes est impliquée dans la

différenciation cellulaire et joue un rôle dans la polymérisation des microtubules. Cependant,

il a été montré in vitro que le domaine FCH était impliqué dans l'interaction de Fes avec la

tubuline libre, mais pas dans l'interaction avec le réseau de microtubules (Laurent et al.,

2004).

Pour Rgd1p, il est envisageable que la RhoGAP interagisse avec les microtubules dans

certaines conditions que les expériences mises en place n’ont pas pu révéler. Rgd1p est une

protéine multiphosphorylée et il a été montré in vitro au laboratoire que la kinase Ipl1p de la

famille des Aurora kinases phosphorylait Rgd1p au moins sur la Serine 143, positionnée à

l’extrémité du domaine FCH. De plus, la protéine humaine MgcRacGAP, orthologue de

Rgd1p est phosphorylée par la kinase Aurora B, l’orthologue d’Ipl1p (Minoshima et al.,

2003). Lors de la cytocinèse, MgcRacGAP interagit indirectement avec les microtubules

nucléaires (Pavicic-Kaltenbrunner et al., 2007), tout comme Aurora B (Toure et al., 2008). Il

est suggéré dans la littérature que la phosphorylation de MgcRacGAP par Aurora B

préviendrait l’interaction indirecte de MgcRacGAP avec les microtubules (Toure et al., 2008).

Nous pouvons donc émettre l’hypothèse que Rgd1p interagirait avec les microtubules via le

domaine FCH selon son état de phosphorylation.

.

48

A

B

Figure I-15: A) Colocalisation de Ipl1p étiquetée avec la GFP et de Tub1p étiquetée avec la

CFP au niveau du fuseau de microtubules.

B) Localisation de Boi1p (a gauche) et de Boi2p (à droite) dans une souche sauvage (colonne de

gauche) et dans un mutant ipl1-321 (colonne de droite) à température non permissive. Boi1p et

Boi2p sont le plus souvent localisées au niveau du fond ou du cou du bourgeon dans une souche

sauvage. Dans un mutant ipl1-321, Boi2p est systématiquement localisée dans le noyau.

Les flèches et pointes de flèches indiquent les localisations normales de Boi1p et Boi2p, les

étoiles indiquent la localisation nucléaire de Boi2p.

(Norden et al (2006) Cell 125 p85).

C. La phosphorylation de Rgd1p pourrait-elle conditionner une

interaction avec les microtubules ?

1. Généralités

Chez la levure S. cerevisiae, la kinase Ipl1p est la seule représentante de la famille des

kinases Aurora (Glotzer, 2005). Les kinases Aurora sont impliquées dans le contrôle du cycle

cellulaire (Norden et al., 2006), la condensation chromatinienne (Vas et al., 2007) et

l’attachement de microtubules aux kinétochores (Biggins et al., 1999). Chez les mammifères

il existe 3 kinases de la famille Aurora : Aurora A, Aurora B et Aurora C. Ipl1p et Aurora B

sont des orthologues (Vader et al., 2006).

Ipl1p intervient lors du point de contrôle du fuseau mitotique en vérifiant

l’attachement correct des microtubules aux kinétochores. Les microtubules issus de chacun

des Spindle Pole Body (SPB) doivent être attachés aux kinétochores de chaque paire de

chromatides sœurs pour assurer la ségrégation correcte des chromosomes (Figure I-12A).

Ipl1p serait capable de percevoir la tension qui existe au niveau des kinétochores lorsque

l’attachement est correct et ainsi autoriserait le passage vers l’anaphase. A l’anaphase, le

fuseau de microtubules s’allonge, ce qui entraînera la séparation des chromosomes vers l’un

et l’autre des SPB du noyau (Figure I-13). En cas d’attachement incorrect, le défaut de

tension est détecté par Ipl1p qui phosphoryle des éléments du kinétochore conduisant au

détachement des microtubules (Pinsky & Biggins, 2005) (Figure I-12B).

Ipl1p joue également un rôle dans la coordination de l’anaphase et de la cytocinèse. Il

faut que l’anaphase soit complètement terminée et que les chromosomes soient correctement

séparés avant le déclenchement de la contraction de l’anneau d’actomyosine et de

l’abscission.

Ipl1p est impliquée dans la coordination de ces étapes, appelée voie « NoCut », en

agissant sur Boi1p et Boi2p, des inhibiteurs de l’abscission (Norden et al., 2006). La voie

NoCut permet de prévenir les cassures chromosomiques que provoquerait une abscission

prématurée. Le modèle proposé par Norden et co-auteurs est le suivant : durant l’anaphase,

Ipl1p est séquestrée dans la région centrale du fuseau de microtubules. Ipl1p est alors

inactivée lorsque les chromosomes ont totalement ségrégé et qu’elle n’est plus en contact avec

la chromatine, ce qui conduit à l’arrêt de l’activation de Boi1p et Boi2p par Ipl1p. Cette

inactivation de Boi1p et Boi2p permet alors le déclenchement de la cytocinèse (Figure I-14).

49

Figure I-16 : Distribution de la localisation de Rgd1-3GFP à température permissive (26°C) et

après 3 heures à température non permissive (38°C) dans le mutant ipl1-321.

2. Quelle est la localisation de Rgd1 dans un mutant ipl1 ?

Ipl1p phosphoryle in vitro Rgd1p sur son domaine FCH (A. Vieillemard, RDPR,

résultats non publiés) et nous avons cherché à comprendre l’effet d’Ipl1p sur la localisation de

Rgd1p. Ipl1p a une localisation nucléaire, plus précisément associée au fuseau de

microtubules nucléaires (Figure I-15A). Or, Rgd1p est principalement localisée à l’apex du

bourgeon ou au cou du bourgeon mais nous observons également la présence de Rgd1 sous

forme de petits grains dans le cytoplasme (Figure I-10 et chapitre II).

Les cibles d’Ipl1p, Boi1p et Boi2p, ont une localisation similaire à celle de Rgd1p et

sont probablement phosphorylées par Ipl1p. Très récemment, il a été montré que Boi1p et

Boi2p pouvaient occasionnellement être visualisées dans le noyau, en phase G1 dans une

souche sauvage. Dans la souche mutante ipl1-321, Boi1p et Boi2p sont toujours retrouvées

dans le noyau (Norden et al., 2006) (Figure I-15B).

La mutation thermosensible ipl1-321 (D283N dans le domaine Serine/Thréonine

kinase) a été introduite dans le gène IPL1 par recombinaison homologue par transformation

de la souche BY RGD1-3xGFP. La localisation de Rgd1-3GFP a été observée dans cette

souche cultivée à 26°C ou après 3 heures à température non permissive (38°C).

La localisation de Rgd1-3GFP ne présente pas de localisation nucléaire dans ce mutant

contrairement à Boi1p et Boi2p (Figure I-15B). Cependant pour environ 5 % des cellules,

une localisation très particulière a pu être observée. L’apparition de cette nouvelle localisation

semble coïncider avec une diminution de la proportion de cellules ayant Rgd1p localisée au

niveau du cou (Figure I-16).

La localisation particulière de Rgd1-3GFP observée dans le mutant ipl1-321 se caractérise par

la présence de un ou de deux points intenses répartis de la façon suivante :

- Un seul spot localisé dans la cellule mère.

- Deux spots dans la cellule mère

- Deux spots : un dans la cellule mère, l’autre dans le bourgeon.

Cette répartition rappelle très fortement la localisation des SPB lors de la ségrégation

du noyau : un seul SPB est présent dans la cellule mère au tout début du cycle cellulaire, puis

après sa duplication, le fuseau mitotique s’oriente dans l’axe mère-fille, puis les deux SPB

sont séparés lors de l’anaphase, l’un reste dans la cellule mère alors que l’autre passe dans la

cellule fille.

La mutation ipl1-321 permet de révéler une localisation particulière. Ce résultat

suggère que cette localisation particulière de Rgd1p non observée dans un contexte sauvage

50

Rgd1S143A Rgd1S143D

Figure I-17 : Distribution de la localisation des formes de Rgd1-3GFP modifiées pour la sérine

143 en alanine (S143A) ou en aspartate (S143D).

doit correspondre à une localisation fugace et transitoire de la RhoGAP dans la souche

sauvage.

3. La serine S143 a-t-elle un rôle dans la localisation de Rgd1 ?

Pour savoir si l’effet de l’inactivation d’IPL1 sur la localisation anormale de Rgd1-

3GFP dans 5% des cellules est lié à l’acide aminé S143, situé dans le domaine FCH et

phosphorylé in vitro par la kinase Ipl1p, l’acide aminé S143 de la construction RGD1-3GFP a

été modifié par mutagenèse dirigée en alanine ou en aspartate. Ces mutations permettent de

rendre ce site non phosphorylable ou bien d’y mimer la présence d’un site constitutivement

phosphorylé.

L’analyse par microscopie à fluorescence des souches portant les mutations de la

serine 143 dans un contexte IPL1 sauvage permet de révéler à nouveau l’existence d’un ou de

deux spots, comme pour le mutant ipl1-321 (Figure I-17).

Le faible pourcentage de cellules montrant cette localisation particulière ne permet pas

de comparer quantitativement les proportions obtenues pour les formes mutées S143A et

S143D et la forme normale Rgd1-3GFP dans un mutant ipl1-321. Toutefois, cette observation

est spécifique de la kinase Ipl1p et de la serine 143 de Rgd1p. En effet, cette localisation

ponctuée est seulement observée pour les formes Rgd1S143A et Rgd1S143D ainsi que dans le

mutant ipl1-321 alors qu’elle n’a jamais été observée pour la forme originale de Rgd1 dans un

contexte sauvage.

La faible proportion de cellules présentant Rgd1p localisée sous forme ponctuée

pourrait s’expliquer par la phosphorylation de Rgd1p par Ipl1p à une étape précise du cycle

cellulaire ou bien dans un compartiment cellulaire spécifique. Quelle que soit l’hypothèse

envisagée, cela suppose qu’une partie des protéines Rgd1p doit aller dans le noyau ou

réciproquement que Ipl1p soit exportée du noyau vers le cytoplasme.

Le fait que la modification de l’acide aminé S143, mimant soit une forme non

phosphorylée ou une forme constitutivement phosphorylée, conduit au même phénotype de

délocalisation de Rgd1p ne permet pas de définir clairement l’effet d’une éventuelle

phosphorylation de Rgd1p par Ipl1p in vivo. Ce résultat peut néanmoins suggérer que le cycle

de phosphorylation de Rgd1p est important pour sa localisation physiologique.

51

A B

Figure I-18 : Localisation de Spc42-GFP dans le mutant ipl1-321.

A) à température permissive (26°), Spc42p est localisée au niveaux des SPB.

B) à température non permissive (38°C) Scp42p est délocalisée.

4. Caractérisation de la localisation particulière de Rgd1-3GFP

observée dans un mutant ipl1-321

Pour déterminer si les spots observés dans un mutant ipl1-321 sont localisés au SPB,

nous avons étudié la co-localisation de Spc42p (un membre du complexe du SPB) étiquetée

avec la GFP et de Rgd1p étiquetée avec la protéine fluorescente rouge tdimer2(12) dans un

mutant ipl1-321. Le tdimer2(12) correspond à une protéine possédant deux mRFP1 en

tandem, séparées par une boucle de 12 acides aminés permettant une dimérisation

intramoléculaire et une intensification du signal de fluorescence (Isabelle Sagot,

communication personnelle). Comme attendu, Spc42p est localisée au SPB à température

permissive (26°C) ; malheureusement, après 3 heures à température non permissive (38°C),

Spc42-GFP présente une délocalisation complète dans le mutant ipl1-321, rendant cette

approche inopérationnelle (Figure I-18). Nous avons alors cherché à co-localiser dans la

souche sauvage les formes mutées Rgd1S143A-tdimer2(12) ou Rgd1S143D-tdimer2(12) qui

présentent des localisations ponctuées, avec Spc42-GFP. Cependant, par cette nouvelle

approche, nous n’avons pas été en mesure d’observer une co-localisation de Rgd1p avec

Spc42p en raison du peu de cellules présentant ce phénotype particulier et de la faiblesse de

l’intensité du signal de l’étiquette tdimer2(12). En effet, cette étiquette est bien moins

énergétique que l’étiquette 3GFP (Fernandez-Suarez & Ting, 2008).

A défaut de réussir à co-localiser Rgd1p et Spc42p, les SPB étant insérés dans la

membrane nucléaire, nous avons décidé de visualiser le noyau à l’aide d’une construction

GAL4DB-mRFP1 sous le contrôle du promoteur ADH1 présentant une forte activité

transcriptionnelle. Cette construction permet d’amener le fluorochrome dans le noyau et de

visualiser ce compartiment cellulaire sans difficulté. Dans ces conditions, nous avons observé

que les spots formés dans les souches produisant Rgd1S143A-3GFP et Rgd1S143D-3GFP

présentent le plus souvent une localisation à proximité du noyau (Figure I-19). Cette

localisation est en accord avec l’hypothèse d’une association de Rgd1p avec les SPB, mais il

faudra chercher à le vérifier par d’autres approches afin de pouvoir en apporter la preuve

définitive.

52

Figure I-19 : Colocalisation des formes modifiées de Rgd1-3GFP S143A et S143D avec le du

noyau (marqué par l’expression de GAL4DB-mRFP1).

5. Quelle est la localisation de Rgd1-3GFP dans un mutant

fyv8! ?

Dans de nombreux cribles globaux réalisés sur la levure S. cerevisiae, la protéine

Fyv8p a été trouvée comme étant un partenaire physique de Rgd1p (Gavin et al., 2002; Ito et

al., 2001) ce qui suggère une interaction forte entre ces deux protéines. Ceci nous a amené à

examiner la localisation de Rgd1-3GFP dans le mutant fyv8!. Dans ce mutant la localisation

de Rgd1-3GFP est perturbée dans la grande majorité de la population cellulaire et la

localisation ponctuée caractéristique de Rgd1-3GFP dans un mutant ipl1-321 est fréquemment

observable. Dans une souche haploïde, cette localisation ponctuée coexiste avec la présence

d’un fond granuleux correspondant à une localisation non polarisée de Rgd1p. Dans une

souche diploïde homozygote pour fyv8!, cette localisation ponctuée est clairement

observable. (Figure I-20). Ce défaut de localisation concerne la quasi-totalité des cellules

haploïdes et diploïdes. Toutefois, quel que soit le niveau de ploïdie de la souche mutante, peu

de cellules présentent de façon concomitante les localisations ponctuées de Rgd1-3GFP avec

les localisations au niveau du fond ou du cou du bourgeon. La raison pour laquelle

l’observation de la localisation ponctuée est plus aisée dans une souche diploïde pourrait etre

que le SPB doit avoir une taille plus importante à l’état diploïde qu’à l’état haploïde (Ganem

et al., 2007).

Cette observation dans le mutant fyv8! est en accord avec l’existence d’un lien fonctionnel

étroit entre les protéines Rgd1 et Fyv8, comme l’indiquent les résultats d’interaction physique

observés lors d’approches globales. Malheureusement, la fonction de Fyv8p est, à ce jour,

inconnue. Il a été proposé par Baetz et al (Baetz et al., 2004) que Fyv8p pourrait avoir un rôle

dans la ségrégation chromosomique.

6. Conclusion

Bien que le rôle de la phosphorylation de Rgd1p par Ipl1p ne soit pas encore

déterminé, nous avons mis en évidence une nouvelle localisation en relation avec la sérine en

position 143 et probablement son niveau de phosphorylation. Malgré le faible nombre de

cellules présentant une localisation de Rgd1-3GFP sous forme de 1 ou 2 spots, nous pouvons

considérer que ce phénotype est significatif sur le plan biologique. En effet, nous retrouvons

ce même phénotype de façon massive dans un mutant fyv8!. Ce phénomène commun nous

53

BY4743 (2n) Rgd1-3GFP BY fyv8!/ fyv8! (2n) Rgd1-3GFP

Figure I-20 : Localisation de Rgd1-3GFP dans une souche de référence diploïde et dans un

mutant homozygote fyv8!/ fyv8!. La souche de référence BY4743 et la souche diploïde fyv8!/

fyv8! ont été transformées par la construction RGD1-3GFP et observées au microscope à

fluorescence.

amène à penser que Fyv8p et Ipl1p pourraient agir de concert sur Rgd1p. Vu la localisation

sous forme de 1 ou 2 spots de Rgd1p et malgré les contraintes techniques que nous avons

rencontrées, nous pouvons imaginer que la protéine RhoGAP est localisée transitoirement au

niveau du SPB et que les protéines Fyv8 et Ipl1 puissent agir à ce niveau.

D. Conclusions générales et perspectives

L’organisation en domaines de Rgd1p laissait imaginer des liens avec le cytosquelette

d’actine via la régulation des protéines Rho3p et Rho4p par son domaine RhoGAP et

suggérait, vu la littérature, une interaction avec les microtubules via le domaine FCH. Nous

avons cherché à savoir s’il existait des liens fonctionnels entre Rgd1p et les cytosquelettes

d’actine et de microtubules.

Nous avons pu montrer que la protéine RhoGAP Rgd1p est impliquée dans la

repolarisation du cytosquelette d’actine suite à un stress acide. Ce rôle n’est pas assuré

exclusivement par le domaine RhoGAP ou le domaine FCH. Cela suggère que la région

centrale de Rgd1p (144-480) pourrait participer au rétablissement de la polarité du

cytosquelette d’actine en condition de stress et que ce processus pourrait être indépendant de

Rho3p et Rho4p.

Contrairement au cytosquelette d’actine, le réseau de microtubules ne semble pas

présenter de défaut chez un mutant rgd1!, dans les conditions testées malgré la mise en

évidence d’une interaction in vitro entre Rgd1p et les microtubules. De plus, la localisation de

Rgd1p n’est pas caractéristique d’une protéine associée aux microtubules. Cependant, la

localisation mono ou biponctuée de Rgd1p dans les mutants ipl1-321 et fyv8! suggère que

Rgd1p pourrait interagir au niveau des SPB avec les microtubules. Dans le cadre de cette

hypothèse, il est envisageable que Rgd1p puisse interagir avec la '-tubuline au niveau du

SPB. Cette localisation doit être transitoire car elle n’est jamais observée avec la forme

sauvage de Rgd1p. Elle n’aurait lieu qu’à un moment particulier du cycle ou ne concernerait

qu’une fraction de la population totale de Rgd1p.

Des travaux complémentaires d’imagerie cellulaire seront nécessaires pour confirmer

si Rgd1p est capable de se localiser au SPB dans les mutants ipl1-321 et fyv8!. Nous pouvons

imaginer que, contrairement aux résultats obtenus dans le mutant ipl1-321, le marqueur

54

Spc42-GFP est correctement localisé dans le mutant fyv8!. Dans ce cas, nous serions en

mesure de rechercher une localisation de Rgd1p au SPB.

Le rôle de la phosphorylation dans cette localisation devra être étudié plus en détails

par des approches de biochimie et de biologie cellulaire. Les expériences de co-sédimentation

in vitro pourront être réalisées à partir des formes de Rgd1p mutées pour le site S143 afin de

déterminer l’affinité de la RhoGAP pour les microtubules, et tout particulièrement avec la

forme mimant un état constitutivement phosphorylé.

La recherche de nouveaux partenaires physiques de Rgd1p a été réalisée au laboratoire

à l’aide de puces protéiques (Invitrogen). Sur ces puces, 70% des protéines de levure sont

déposées. La puce a été incubée en présence de protéine Rgd1p étiquetée avec un épitope V5,

puis les interactions sont révélées à l’aide d’un anticorps anti-V5 couplé au fluorophore

Alexa647 et le signal de fluorescence a été mesuré à l’aide d’un scanner à puces

transcriptomiques. Par cette approche, la protéine Bud14p a été identifiée comme partenaire

candidat de Rgd1p. Bud14p est une sous-unité régulatrice du complexe phosphatase Glc7p

(Pinsky et al., 2006). La phosphatase Glc7p est une protéine essentielle, impliquée dans le

contrôle de la polarité et du cycle cellulaire ayant un rôle antagoniste à la kinase Ipl1p. Ce

résultat conforte l’existence d’un lien fonctionnel entre Rgd1p et la kinase Ipl1p. Il montre

aussi l’importance du cycle de phosphorylation / déphosphorylation de Rgd1p comme

élément de régulation de cette RhoGAP.

55

Figure II-1 : Les membres des différentes familles BAR, N-BAR et F-BAR homodimérisent en

formant des angles différents (Frost et al (2007), Cell Structure preview, 15, p751).

Chapitre II. Etude de la régulation de Rgd1p, protéine

RhoGAP à domaine F-BAR

A. Généralités

1. Mise en évidence du domaine F-BAR

Au cours de ces dernières années, un grand nombre de liens fonctionnels a été établi

entre des protéines à domaine FCH et la régulation de la dynamique du cytosquelette d’actine.

Ces protéines interagissent avec les protéines WIP et WASP via un domaine SH3, comme

c’est le cas chez l’Homme avec Toca-1, FBP17 (toca-2), CIP4 (Toca-3) ou encore avec la

synaptin/PACSIN ; elles agissent également sur les GTPases de la famille Rho et notamment

Cdc42 ou encore sur les formines (Aspenström, 1997; Ho et al., 2004; Modregger et al.,

2000).

De nombreuses protéines à domaine FCH sont également impliquées dans la

dynamique membranaire et l’endocytose, soit en interagissant avec d’autres acteurs protéiques

spécifiques de l’endocytose, tel la dynamine, soit en percevant et/ou en induisant directement

des courbures et tubulures de membrane (Kamioka et al., 2004; Modregger et al., 2000).

Ces caractéristiques fonctionnelles, à savoir leur rôle dans la plasticité du cytosquelette

d’actine, l’endocytose et la dynamique membranaire, sont plus traditionnellement retrouvées

dans la famille des protéines à domaine BAR (Bin-Amphiphine-Rvs)(Farsad et al., 2001;

Takei et al., 1999). Les domaines BAR sont constitués de 3 hélices alpha et s’organisent en

dimères formant une courbure « en forme de banane » dont l’angle varie selon les membres

de cette famille. La conformation du dimère de domaines BAR permet la reconnaissance de

courbure membranaire en interagissant avec les phospholipides chargés négativement comme

la phosphatidylsérine et le phosphatidylinositol 4,5 bis phosphate (PdtIns(4,5)P2). Le domaine

BAR peut dans certains cas posséder une hélice amphiphile supplémentaire du coté N-

terminal capable de s’insérer dans un des feuillets lipidiques des membranes et d’induire une

courbure ; ce domaine est alors appelé N-BAR (Dawson et al., 2006; Weissenhorn, 2005)

(Figure II-1).

56

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Itoh et al (2005) (Itoh et al., 2005) ont montré que les protéines à domaine FCH

présentent des acides aminés conservés dans le domaine FCH, mais également dans la région

adjacente correspondant à un domaine Coil-coiled. Les analyses de structure de cette grande

région FCH+CC d’environ 300 acides aminés permettent de prédire une organisation

similaire à celle des domaines BAR mais pouvant comprendre jusqu'à 5 hélices alpha au lieu

des 3 hélices proposées dans le modèle canonique (Figure II-2). Ce domaine FCH+CC est

appelé soit F-BAR pour FCH-BAR, soit EFC pour extended FCH domain, ou PCH pour

pombe Cdc15 Homology. Ils ont également montré que ce domaine est capable d’interagir

physiquement avec les phosphoinositides et d’induire des invaginations et tubulures de

membrane.

La quasi-totalité des protéines à domaine F-BAR identifiées dans le règne animal et

les champignons sont fréquemment associées à un ou plusieurs domaines SH3 ou un domaine

RhoGAP et dans le cas de Fer / Fes, à un domaine Tyrosine kinase. Ces protéines ont toutes

des rôles dans la polarité cellulaire, en intervenant dans l’organisation du cytosquelette

d’actine, du trafic intracellulaire ou de la dynamique membranaire (Figure II-3).

2. Protéines RhoGAP à domaine F-BAR et pathologies

humaines.

Chez l’Homme, des altérations de protéines RhoGAP à domaine F-BAR ont été

décrites dans de nombreuses pathologies. De nombreux cas de cancers, principalement

colorectaux, présentent des altérations de l’expression du gène codant pour la protéine

ArhGAP4 (Heikinheimo et al., 2002). De plus, une délétion de la région N-terminale

d’ArhGAP4 (contenant le domaine F-BAR) est retrouvée dans des cas de diabètes

néphrogéniques insipides et d’immunodéficience (Fujimoto et al., 2008). L’interruption du

gène MEGAP (Mental disorder-associated GAP protein)/srGAP3 provoque des retards

moteurs et mentaux suite à une translocation entre les chromosomes 3 et X. La protéine

MEGAP est produite dans le cerveau et agit sur les protéines Cdc42 et Rac1 (Endris et al.,

2002). Une mutation dominante de la protéine srGAP1, une protéine RhoGAP de Cdc42 et

intervenant dans le contrôle de la voie Slit-Robo, provoque des défauts de migration

neuronale et leucocytaire (Wong et al., 2001).

Chez l’Homme, l’altération de ces différentes protéines RhoGAP à domaine F-BAR

qui conduit à des dérégulations des protéines Rho entraine de sévères pathologies.

57

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3. Les protéines à domaine F-BAR chez la levure.

Chez la levure S. cerevisiae, les 4 protéines à domaine FCH (Bzz1p, Hof1p, Rgd1p et

Rgd2p) possèdent en fait un domaine F-BAR. Au delà du domaine F-BAR, Hof1p possède un

domaine SH3 et est impliquée dans la cytocinèse et plus précisément dans le contrôle de la

contraction de l’anneau d’actomyosine (Vallen et al., 2000). Bzz1p possède deux domaines

SH3 et est impliquée dans l’organisation de l’actine corticale et l’endocytose (Soulard et al.,

2005). Rgd1p et Rgd2p possèdent un domaine RhoGAP ; Rgd1p régule Rho3p et Rho4p alors

que Rgd2p agit in vitro sur Cdc42p et Rho5p (Roumanie et al., 2001).

Les connaissances accumulées sur la protéine RhoGAP Rgd1p et les protéines Rho3 et

Rho4 (régulées par cette protéine RhoGAP), associées aux nombreux avantages du modèle

levure (sur les plans génétique, biochimique et de la biologie cellulaire) nous permettent

d’appréhender Rgd1p comme un modèle de protéines RhoGAP à domaine F-BAR. Nous

chercherons à mettre en évidence des éléments de régulation de Rgd1p et à déterminer le rôle

du domaine F-BAR afin d’établir un modèle, transposable notamment aux protéines RhoGAP

humaines à domaine F-BAR.

Dans une première partie, nous étudierons les effets des phospholipides sur la

régulation de l’activité RhoGAP de Rgd1p et ainsi que sur sa localisation, notamment sur sa

localisation apicale. Dans une seconde partie, c’est la localisation au niveau du cou du

bourgeon qui sera étudiée.

B. Régulation de Rgd1p par les phospholipides.

1. Effets des phospholipides sur les protéines à activité GAP.

Les protéines présentant conjointement un domaine F-BAR et un domaine RhoGAP

ne comptent que quelques membres mais ont des représentants dans toute l’échelle évolutive.

Ces protéines ont des fonctions déterminantes dans l’établissement de la polarité cellulaire. Si

le domaine F-BAR permet une interaction physique avec certains phospholipides, de

nombreuses autres protéines à domaine RhoGAP sont également capables d’interagir avec des

58

lipides. Des exemples d’activité GAP régulée par les phospholipides et notamment les

phosphoinositides sont décrits dans la littérature (Bernards & Settleman, 2004).

L’exemple le mieux décrit est sans doute le cas de l’ArfGAP ARAP1, impliquée dans

le trafic membranaire des endosomes. Cette protéine GAP possède à la fois un domaine

ArfGAP et un domaine RhoGAP. La protéine ARAP1 possède aussi cinq domaines PH,

domaine souvent impliqué dans des interactions avec certains phosphoinositides. Il a été

montré que le phosphatidylinositol 3,4,5 triphosphaphate (PdtIns(3,4,5)P3) stimule l’activité

ArfGAP, mais pas l’activité RhoGAP (Campa et al., 2009). En activant un seul des deux

domaines GAP présents sur la protéine, le PdtIns(3,4,5)P3 va permettre une spécificité de

substrat pour la GTPase Arf, plutôt que pour la GTPase Rho.

De façon similaire, la protéine p190 RhoGAP chez l’Homme est capable d’interagir

avec des phosphoinositides (Ligeti & Settleman, 2006). Cette protéine possède un domaine

RhoGAP capable d’agir sur les petites protéines G : RhoA, Cdc42 et Rac1. Il a été montré que

la présence de phosphoinositides ou de phosphatidylserine confère une spécificité de substrat

à p190 RhoGAP en stimulant l’activité RacGAP et inhibant l’activité RhoGAP.

2. Problématique

Chez la levure S. cerevisiae, la croissance polarisée est en grande partie contrôlée par

les petites protéines G de la famille Rho. Rho3p est impliquée dans la croissance isotropique

du bourgeon en activant la mise en place des câbles d’actine (Dong et al., 2003) dans le

bourgeon (ainsi que Rho1p et Cdc42p) et en régulant l’exocytose (Adamo et al., 1999).

Rho4p intervient dans les étapes terminales du cycle cellulaire, en participant à la formation

de l’anneau contractile d’actomyosine (Dong et al., 2003) et en participant au contrôle de sa

contraction, au niveau du cou du bourgeon (Kamei et al., 1998). Nos études et celles de la

littérature indiquent que les protéines Rho3 et Rho4 ont des sites d’action bien déterminés et

interviennent à des moments très différents. Ces acteurs importants de la polarité doivent être

finement régulés de façon à effectuer leurs actions au bon endroit et au bon moment. Parmi

les régulateurs de ces GTPases, Rgd1p est la seule RhoGAP de Rho3p et Rho4p mise en

évidence (Doignon et al., 1999). Afin d’agir sur ses cibles au bon site et au bon moment du

cycle cellulaire, le régulateur négatif Rgd1p doit lui-même subir une régulation très pointue

soit au niveau de son activité RhoGAP, soit au niveau de sa localisation. Nous avons montré

précédemment que Rgd1p est localisée sous forme d’un croissant cortical au fond du

59

60

bourgeon lors de la phase de croissance isotropique, puis sous forme d’un anneau au cou du

bourgeon lors de cytocinèse (Figure I-10).

Rgd1p étant une protéine RhoGAP à domaine F-BAR, nous nous sommes intéressés

aux modes de régulation que pourraient exercer les phospholipides sur Rgd1p. Dans un

premier temps, nous avons étudié in vitro les effets de différents phospholipides sur l’activité

RhoGAP de Rgd1p par rapport à ses deux cibles Rho3p et Rho4p et nous avons cherché à

identifier le domaine responsable de cette régulation de l’activité RhoGAP. Dans un second

temps, nous avons étudié le rôle du domaine F-BAR et des phospholipides in vivo, dans la

régulation spatiotemporelle de la protéine RhoGAP Rgd1p.

3. Les phospholipides ont-ils un rôle dans la régulation de

l’activité RhoGAP et dans la localisation de Rgd1p ?

Dans cette partie les résultats obtenus sur le rôle du domaine F-BAR sur la régulation

spatiotemporelle et sur l’activité RhoGAP de Rgd1 sont présentés sous forme d’article, publié

dans le Journal of Biological Chemistry en Novembre 2008.

Nous avons montré que la protéine Rgd1 était capable d’interagir physiquement avec

les phosphoinositides. Cette interaction requière la présence du domaine F-BAR et est

nécessaire à la localisation de Rgd1p in vivo. Nous avons également montré que ces

phosphoinositides sont capables de stimuler l’activité RhoGAP de Rgd1p sur Rho4p mais pas

sur Rho3p. Cette modulation de l’activité ne semble pas nécessiter la présence du domaine F-

BAR.

Phosphoinositides Affect both the Cellular Distribution andActivity of the F-BAR-containing RhoGAP Rgd1p in Yeast*

Received for publication, July 8, 2008, and in revised form, September 22, 2008 Published, JBC Papers in Press, October 9, 2008, DOI 10.1074/jbc.M805161200

Valerie Prouzet-Mauleon1, Fabien Lefebvre1, Didier Thoraval, Marc Crouzet, and Francois Doignon2

From the Universite de Bordeaux, Institut de Biochimie et de Genetique Cellulaires, Bordeaux, F-33076 France, CNRS, UMR 5095,Bordeaux F-33076, France

Cell polarity is a key element of development in most

eukaryotes. The Rho GTPase-activating protein Rgd1p posi-

tively regulates the GTPase activity of Rho3p and Rho4p, which

are involved in bud growth and cytokinesis, respectively, in the

budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Rgd1p contains an

F-BAR domain at its N-terminal end in addition to its RhoGAP

domain at its C-terminal end. We demonstrate here that phos-

pholipids discriminate between the GTPase activities of Rho3p

and Rho4p through Rgd1p and specifically stimulate the

RhoGAP activity on Rho4p. The central region of the protein

contiguous to the F-BAR domain is required for this stimula-

tion. The F-BAR region binds to phosphoinositides in vitro and

also plays a key role in the localization of Rgd1p to the bud tip

and neck during the cell cycle. Studies of heat-sensitivemutants

lacking phosphatidylinositol 4-phosphate andphosphatidylino-

sitol 4,5-biphosphate suggested that Rgd1p initially binds to

Golgi membranes via phosphatidylinositol 4-phosphate and is

then transported to the plasmamembrane, where it binds phos-

phatidylinositol 4,5-biphosphate. We demonstrate here the

dual effects of phosphoinositides on a RhoGTPase-activating

protein. Phosphoinositides both regulate the recruitment and

trafficking of Rgd1p to membranes via the F-BAR domain and

specifically stimulate GTPase-activating protein activity, con-

sistent with functional interplay between lipids, RhoGAP, and

its related GTPases in yeast growth.

Small GTPases of the Rho family play various roles in theorganization of diverse cell functions, such as polarity, motility,shape change, membrane trafficking, and gene expression(1–4). Rho proteins act through their endogenousGTP hydrol-ysis activity, which is controlled by several regulatory proteins(guanine nucleotide exchange factors, GTPase-activating pro-teins, guanine nucleotide dissociation inhibitors), and inducecell signaling through several effectors. Like most smallGTPases, they cycle between inactive (GDP-bound) and active(GTP-bound) forms. GTPase-activating protein (GAP)3 accel-

erates the endogenous GTP hydrolysis rate of small GTPases(5). In Saccharomyces cerevisiae, six Rho GTPases (Cdc42p andRho1p–Rho5p) have been described, and, as in mosteukaryotes, these proteins exert their effects on various cellularprocesses through effects on the actin cytoskeleton, septinorganization, exocytosis, cytokinesis, and the cell wall stressresponse (6–11). We previously assessed the RhoGAP activityof various proteins with Rho GTPases in S. cerevisiae (12, 13)and, more specifically, explored the role of Rgd1p in regulatingthe activity of Rho3p and Rho4p, together with other cellularfunctions of these GTPases. Rgd1p is the only RhoGAP shownto act on both Rho3p and Rho4p. These GTPases are bothinvolved in actin cytoskeleton organization (7, 14). Rho3p isalso involved in exocytosis (8–10), whereas it has been sug-gested that Rho4p is involved in cytokinesis (15). RGD1 inacti-vation does not result in a strongmutant phenotype, other thanlethality during the stationary phase, in standard growth con-ditions (16). However, Rgd1p RhoGAP becomes essential inconditions of stress (17). Functional links between Rgd1p andthe actin cytoskeleton and between Rgd1p and the cell wallintegrity pathway have been demonstrated by studying syn-thetic lethal strains inactivated for RGD1 (16, 18–20). The roleof Rgd1p GAP activity in these functional links was revealedthrough the implication of activated Rho3p and Rho4p in theunderlying genetic interactions (15, 20).Rgd1p has an FCH domain at its N terminus (amino acids

(aa) 33–144), a coiled-coil domain (aa 139–172), and aRhoGAP domain at its C terminus (aa 486–666) (19). Theregion extending between amino acids 1 and 300 is similar tothe F-BAR domain, which is known to be involved in mem-brane binding and tubulation (21–23). The members of theF-BAR family have a similar domain organization, with severalhaving SH3 or RhoGAP domains (24–26).We investigated the ability of phospholipids to bind Rgd1p

and their effects on the cellular distribution andGAP activity ofRgd1p with the aim of improving our understanding of the roleof the Rgd1p RhoGAP in S. cerevisiae growth and in relation toits GTPases. Indeed, phospholipids not only bind proteins tocell membranes; they can also regulate GAP catalytic functionin vitro (27, 28). We therefore investigated the effects of lipidson Rgd1p activity with the Rho3p and Rho4p GTPases. Weobserved a specific stimulation of RhoGAP activity with oneparticular GTPase following the addition of phospholipids andidentified a regionwithinRgd1p responsible for themodulation

* This work was supported by CNRS and UB2. The costs of publication of thisarticle were defrayed in part by the payment of page charges. This articlemust therefore be hereby marked “advertisement” in accordance with 18U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

1 Both of these authors contributed equally to this work.2 To whom correspondence should be addressed: Box 64, Universite Bor-

deaux 2, 146 Rue Leo Saignat, 33076 Bordeaux Cedex, France. Tel.: 33-5-57-57-47-18; E-mail: [email protected].

3 The abbreviations used are: GAP, GTPase-activating protein; aa, aminoacids; GFP, green fluorescent protein; FCH, Fes/CIP4 homology; GST, glu-tathione S-transferase; DTT, dithiothreitol; PtdIns, phosphatidylinositol;

PtdIns(4)P, phosphatidylinositol 4-phosphate; PtdIns(4,5)P2, phosphatidy-linositol 4,5-bisphosphate.

THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 48, pp. 33249 –33257, November 28, 2008© 2008 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. Printed in the U.S.A.

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of RhoGAP activity by phosphoinositides. We also demon-strated a requirement for the F-BAR domain for phospholipidbinding in vitro. Using Rgd1p tagged at its C-terminal end withthree green fluorescent proteins (GFPs) in yeast mutants withimpaired phosphoinositide biosynthesis, we showed that inter-action with phosphoinositides was essential for the correct dis-tribution of Rgd1p during bud growth in vivo.We propose hereamodel taking into account the dual effects of phospholipids onGAP activity and the distribution of the Rgd1p RhoGAP inS. cerevisiae.

EXPERIMENTAL PROCEDURES

Yeast Strains and Media—The S. cerevisiae strains used inthis study are listed in Table 1. Standard techniques were used,and the composition of rich and minimal media for yeastgrowth have been reported elsewhere (29). Yeast strains weregenerally grown at 30 °C with the exception of heat-sensitivemutants. The heat-sensitive AAY104 (pik1-83ts), AAY202(mss4-102ts), and CTY1568 (stt4-4ts) strains and the SEY6210reference strain were cultured overnight at permissive temper-ature (26 °C) to an A600 of 0.2. Early in the exponential growthphase, the strains were shifted to the nonpermissive tempera-ture (38 °C) for 3 h and then observed by fluorescence micros-copy. In parallel, the viability of the cells shifted to the nonpermis-sive temperaturewas assessed by themethylene bluemethod (18).After 3 h at the nonpermissive temperature, 2% of control straincells, 3%of pik1-83ts cells and 12%of both stt4-4ts andmss4-102tscells had died. These very lowmortality rates ruled out the possi-bility of a defect in cell viability accounting for the different distri-bution of Rgd1p in heat-sensitive mutants.Plasmid Constructs—Plasmids for the purification from bac-

teria of unmodified GST-tagged Rho3p and Rho4p have beendescribed byDoignon et al. (12). GST-taggedRho3p andRho4pwere also produced in yeast to obtainmodified GTPases and, inparticular, prenylated Rho proteins. For this purpose, the cod-ing sequences of the RHO3 and RHO4 genes were inserted intopMG1 (30). The recombinant p783 plasmid for the productionof GST-tagged Rgd1p in bacteria (12) was used as template forinverse PCR for the construction of bacterial plasmids encod-ing various truncated forms of Rgd1p: Rgd1D1–300, Rgd1D1–350, Rgd1D1–450, Rgd1D301–350, and Rgd1D1–156. For thelocalization of Rgd1p in vivo, we generated various constructstagged at the C terminus with green fluorescent protein, usingthe integrative yeast vector pRS305-33GFP (generously pro-vided by Isabelle Sagot and David Pellman), which containsthree tandem copies of the GFP gene. For localization of thewild-type formof Rgd1p in thewild-type strain and in phospha-tidylinositol kinase mutants, we inserted the last 800 bp beforethe stop codon into the plasmid and targeted integration to the

RGD1 locus. For the localization of mutant forms of Rgd1p, we

generated constructs, including the RGD1 promoter and cod-

ing sequences carrying deletions (D1–156, D486–660, and

D301–350). These constructs were integrated into the RGD1

locus by targeting the residual promoter region of the rgd1D

mutant strain. The resulting RGD1 sequences of all recombi-

nant plasmids were verified by sequencing, and integration into

the RGD1 locus was checked by PCR. Using the sensitivity of

rgd1Dmutant cells to low pH (17), we also checked the effect of

GFP tagging. Adding 33GFP to the carboxyl-terminal extrem-

ity of wild type and truncated Rgd1p forms did not change their

functional behavior compared with untagged proteins. Full-

length tagged Rgd1p entirely rescued the rgd1D phenotype as

the untagged one.

Purification of GST Fusion Proteins—The production of

GST-tagged proteins in Escherichia coli and their purification

have been described elsewhere (12). The modified GST-tagged

Rho3 or Rho4 proteins, hereafter described as prenylated, were

produced in S. cerevisiae cells and were obtained from mem-

brane fractions by affinity purification. TheMGY70 strain con-

taining the pMG1 plasmid encoding the GST-tagged Rho3p or

Rho4p was cultured overnight in YPsaccharose (2%) medium

and then used to seed YPgalactose (2%)medium, to induce Rho

expression for 8 h. Cells were harvested, washedwith water and

frozen at 280 °C. The pelleted cells were disrupted with glass

beads in lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 1

mM EGTA, 5 mM MgCl2,1 mM DTT, and 1 mM phenylmethyl-

sulfonyl fluoride) supplemented with a protease inhibitor mix-

ture (Sigma) at 4 °C, using a Mini-beadbeater (Biospec Prod-

ucts). Cell lysates were centrifuged at 5503 g for 20min at 4 °C.

The supernatantwas collected and centrifuged at 22,0003 g for

45 min at 4 °C to pellet the membranes. The 22,000 3 g super-

natant was discarded, and the membrane pellet was resus-

pended in 3 volumes of solubilization buffer (50 mM Tris-HCl,

pH 7.6, 50 mM NaCl, 0.6% Triton X-100, 1 mM EGTA, 5 mM

MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and

protease inhibitor mixture) and incubated at 4 °C for 90 min,

with gentle shaking. GST-Rho proteins were allowed to bind to

glutathione-Sepharose beads (GE Healthcare) equilibrated in

wash buffer (50mMTris-HCl, pH 7.6, 50mMNaCl, 0.1% Triton

X-100, 5mMMgCl2, 1mMDTT) for 1 h. The beadswerewashed

four times, and GST fusion proteins were collected in elution

buffer containing 20 mM reduced glutathione, 50 mM Tris-

HCl, pH 8, 0.1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2,

and 1 mM DTT. The purified proteins were stored in small

aliquots, at 280 °C. Purity was checked by SDS-PAGE, and

protein concentrations were determined in Bradford protein

assays (Pierce).

TABLE 1

Yeast strains

Strain Genotype Source

BY4742 MATa, his3D, leu2D0, lys2D0, ura3D0 Euroscarfrgd1D BY4742, rgd1::KanMX4 EuroscarfSEY6210 MATa, leu2-3,112, ura3-52, his3-D200, trp1-D901, lys2-801, suc2-D9 Ref. 39AAY104 SEY6210, pik1::HIS3 with pRS314-pik1-83ts (LEU2) Ref. 39AAY202 SEY6210,mss4::HIS3 with pYCplac111-mss4-102ts (LEU2) Ref. 42CTY1568 SEY6210, stt4::HIS3 with pYC-stt4-4ts (LEU2) Ref. 41MGY70 MATa ura3-1, trp1-28, leu2D0, lys2D0, his7, mob1::kanMX4, pep4::LEU2 with pRS316-MOB1 Ref. 30

Regulation of Rgd1p by Phosphoinositides

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Measurement of GTP Hydrolysis by Rho3p and Rho4pGTPases—Each measurement was performed in three succes-sive steps (31).GTP loadingwas achieved by incubating theRhoproteins with [g-32P]GTP in a buffer containing 20 mM Tris-HCl, pH7.6, 25mMNaCl, 0.1mMDTT, and 10mMEDTA for 10min at room temperature. An amount of Rho protein suitablefor all assays was added to a tube, together with 0.4–0.5 mCi of[g-32P]GTP (6000 Ci/mmol) per 15 pmol of GTPase. The reac-tion was stopped by adding 36 mM ice-cold MgCl2, and thesolution was kept on ice. GTPase activity was initiated by add-ing 15 pmol of the [g-32P]GTP-loaded Rho protein to amixtureof 0.67 mg/ml bovine serum albumin, the investigated quantityof Rgd1p RhoGAP, and an appropriate volume of incubationbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 0.1 mM DTT), giving a finalreaction volume of 30 ml. This mixture was incubated for 10min at room temperature (22 °C), and the reaction was thenstopped by adding 800 ml of an ice-cold suspension of 5% acti-vated charcoal in 0.1 M NaH2PO4, and the amount of free[32P]phosphate following GTP hydrolysis was determined in ascintillation counter after separation from [g-32P]GTP by cen-trifugation. A control sample was used to determine theamount of inorganic [32P]phosphate present in the supernatantwithout incubation. The radioactivity level determined for thissample, the blank, was subtracted from those obtained in GTPhydrolysis assays. An aliquot of the loading mixture was alsomixed with scintillation liquid and counted to determine pre-cisely the total radioactivity present in each assay. Once thevalue obtained for the blank had been subtracted, this value wasconsidered to correspond to 100% [g-32P]GTP availability, andthe ratio of this value to the amount of radioactivity in thesupernatant after incubation defined the percentage of GTPhydrolysis. We checked that the hydrolysis reaction had notreach the plateau at the end of incubation, using a control forwhich the incubation time was 15 min rather than 10 min. Foreach assay, the reaction was carried out in duplicate, and themean value of the two assays was retained for analysis.Lipid Preparation—Phosphatidylcholine from hens’ eggs

(Sigma) was dissolved in ether and diluted to 1 mg/ml withincubation buffer. Phosphatidylinositol (PtdIns) from soybean(Sigma) was dissolved in chloroform and dried under a streamof nitrogen. Phosphatidylserine (Sigma), phosphatidylinositol4-phosphate (PtdIns(4)P), and phosphatidylinositol 4,5-bi-phosphate (PtdIns(4,5)P2) (Avanti), all from bovine or porcinebrain, and PtdInswere rehydrated over a period of 2 h, and theirconcentration in incubation buffer was adjusted to 1 mg/ml.Vesicleswere obtained by sonicating the lipid suspensionwith aVCX130 (Sonics) probe for a few s until the suspension becameuniformly clear (32). The phospholipid suspensions werestored in small aliquots at 280 °C and were added to GTPhydrolysis assays to give a final concentration of 100 mM.Protein LipidOverlayAssay—Overlay assayswere performed

as previously described (33). Nitrocellulose-immobilized phos-pholipids (PIP strips; Echelon Biosciences) were blocked byincubation for 1 h with 1% nonfat milk powder in PBST (137mM NaCl, 2.37 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4z7H2O, 1.4 mM

KH2PO4, 1% Tween 20). All incubations were carried out atroom temperature.We incubated 10ml of PBST supplementedwith 1% nonfat milk powder and 10 mg of either wild-type

Rgd1p or one of its truncated forms, all of which were GST-tagged, for 1 h with the PIP strips. The PIP strips were washedfour times with PBST and incubated for 1 h with a 1:10,000dilution of anti-GST antibodies (Sigma) in PBST supplementedwith 1% nonfat milk powder. Themembrane was again washedfour times and incubated with a 1:10,000 dilution of horserad-ish peroxidase-conjugated anti-mouse antibodies (Pierce).Bound antibodies were detected by chemiluminescence withthe Lumi-lightPLUS substrate (Roche Applied Science) and theFluorChem 8800 Imaging System (Alpha Innotech).Fluorescence Microscopy—Cells were grown overnight in

synthetic medium supplemented with the appropriate aminoacids. Aliquots of exponentially growing yeast cells (0.2–0.4A600 units) were centrifuged, and the pellet was resuspended inDABCO solution (218 nM diazabicyclo[2.2.2]octane (Sigma),25% (v/v) phosphate-buffered saline buffer, 75% (v/v) glycerol).Cells were observed with an epifluorescence microscope (ZeissAxioSkop 2 plus, with a 1003 oil objective and aGFP Long Pass424931 filter), and images were captured with a digital camera(Zeiss AxioCam MRm). Images were assembled with Photo-shop (Adobe).

RESULTS

Phospholipids Strongly Activate GTP Hydrolysis by Rho4, but

Not by Rho3, in the Presence of Rgd1p—Phospholipids can affectGTPase-activating protein activity, and may favor the activityof some GTPases over others (28, 31, 32). We evaluated theeffects of phospholipids on GTP hydrolysis by the Rho3p andRho4p GTPases.We first measured the intrinsic GTPase activ-ity of Rho3p and Rho4p purified from yeast independently inthe presence of individual phospholipids: phosphatidylserine,phosphatidylcholine, PtdIns, PtdIns(4)P, and PtdIns(4,5)P2.We decided to study phosphoinositides, because these mole-cules are involved in signal transduction and have different sub-cellular distributions (34). Phosphatidylserine was studied,because it has been reported to bind the F-BAR domain (22),and phosphatidylcholine was studied as the main phospholipidcomponent of cellular membranes (35). The addition of phos-pholipids to assays had no effect on the intrinsic GTPase activ-ity of prenylated Rho3p or Rho4p (data not shown). We thencarried out the same experiment in the presence of Rgd1p (Fig.1). To allow the detection of stimulation by phospholipids,we chose a GAP concentration that gave activation of GTPhydrolysis further from maximal activity of Rho proteins.For Rho3p, all of the phospholipids tested slightly increasedGTPase activity, by a factor of 1.1–1.5, the greatest stimula-tion being observed with PtdIns(4)P and the weakest stimu-lation with PtdIns(4,5)P2. The effects of phospholipids onthe GTP hydrolysis obtained with prenylated Rho4p in thepresence of Rgd1p were clearly different from those onRho3p. The addition of phosphatidylcholine had no effect,whereas GTPase activity was strongly increased byPtdIns(4)P and phosphatidylserine (by factors of 5 and 4,respectively) and by PtdIns and PtdIns(4,5)P2 (by a factor of3; Fig. 1). These results indicated a role for Rgd1p in theresponse to phospholipids and an effect of these moleculeson RhoGAP activity. The prenylation of both Rho3 and Rho4also appeared to be important for activation by phospholip-



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ids. Indeed, phospholipids had a less marked effect if the Rhoproteins used had been purified from bacteria. Indeed, nophospholipid stimulation of nonprenylated Rho3p wasobserved, and for the nonprenylated Rho4p with Rgd1p,hydrolysis was increased by a factor of 1.8–2.5 byPtdIns(4,5)P2, PtdIns, PtdIns(4)P, and PS (data not shown).These results are consistent with previous data demonstrat-ing the importance of prenylation in promoting interactionsbetween Rho-family small GTPases and their GTPase-acti-vating proteins (28, 36). Two other experiments done withthe prenylated Rho4p in different conditions were carriedout to assess the strength of phosphoinositide stimulation.In the first experiment, a PtdIns(4)P concentration 1 order ofmagnitude lower than that originally used was tested (10 mM

instead of 100 mM). In these conditions, stimulation wasobserved, with a doubling of activity despite the much lowerconcentration of phosphoinositide (data not shown). In thesecond experiment, the concentration of Rgd1p was

decreased to one-tenth that of Rho4p. This resulted in alower level of GAP activity, as expected, but the addition ofPtdIns(4)P clearly stimulated (and indeed almost doubled)GTP hydrolysis by Rho4p (data not shown). These data indi-cate that phospholipids have a strong, specific effect onRgd1p/Rho4p, potentially modulating GAP activation in dif-ferent conditions in vivo.Definition of the Region of Rgd1pMediating PtdIns(4)P-stim-

ulated GAP Activity—We tried to identify the region of Rgd1pinvolved in the phospholipid-mediated regulation of GAPactivity by constructing various N-terminally truncated formsof Rgd1p that nonetheless still contained the RhoGAP domain(Fig. 2A). We investigated the GAP activity of these truncatedforms with nonprenylated and prenylated Rho4p in the pres-ence and absence of PtdIns(4)P (Fig. 2B). As expected, all of theprotein constructs displayed GAP activity. However, in theabsence of phospholipid, the GAP activity observed with pre-nylated or unprenylated Rho4pwas strongerwith the truncatedRgd1p proteins thanwith the full-length protein. The Rgd1D1–450 form, consisting essentially of the RhoGAP domain, acti-vated Rho4pGTPase activity themost strongly, suggesting thattheN-terminal part of Rgd1pmay in someway limit the activityof the RhoGAP domain.GTP hydrolysis by unprenylated Rho4p was monitored in

the presence of PtdIns(4)P. In these conditions, the increasein GAP activity observed with Rgd1D1–300 was slightlysmaller than that observed with the full-length Rgd1p (Fig.2B and Table 2). The removal of the additional residuesbetween positions 300 and 450 abolished the activation ofGAP activity by PtdIns(4)P. Thus, amino acids 300–350 ofRgd1p seem to play a major role in the PtdIns(4)P-mediatedstimulation of GAP activity. A same analysis was carried outwith prenylated Rho4p, and the overall response was similarto that obtained with the unprenylated Rho protein. TheRgd1D1–300 protein displayed stimulation, as observed withthe wild-type form (Table 2). However, with Rgd1D1–350and Rgd1D1–450, which did not lead to PtdIns(4)P stimula-tion with the unprenylated Rho4p, lower levels of activationwere observed with the prenylated Rho4p, with similardecreases in activation observed for both truncated forms(Fig. 2B and Table 2). These observations with prenylatedRho4p also showed that amino acids 301–350 of Rgd1p wereimportant for PtdIns(4)P stimulation. The existence ofresidual activation not seen with unprenylated Rho4p sug-gested that over and above the action of the Rgd1p-specificregion, prenylation of the GTPase played an important rolein the stimulation mediated by PtdIns(4)P.We explored the region of Rgd1p involved in the response to

phospholipids in more detail, by constructing a RhoGAP pro-tein lacking amino acids 301–350.We assayed the GAP activityof this mutant protein in independent experiments withPtdIns(4)P and prenylated or unprenylated Rho4p. This dele-tion halved the effect of PtdIns(4)P on unprenylated Rho4p, thePtdIns(4)P stimulation factor being 1.69 6 0.37 rather than2.97 6 0.19, as for the wild-type Rgd1p. However, the effects ofphospholipid were not entirely abolished, by contrast to whatwas observed with the truncated form Rgd1D1–350. Theresults obtained with prenylated Rho4p were similar to those

FIGURE 1. Effect of phospholipids on the RhoGAP activity of Rgd1p withRho3p and Rho4p. GTP hydrolysis was performed with 300 nM of prenylatedRho3p (top) or 400 nM of prenylated Rho4p (bottom) and with an Rgd1p con-centration equimolar to that of the GTPase. Phosphatidylserine (PS), phos-phatidylcholine (PC), PtdIns (PI), PtdIns(4)P (PI(4)P), and PtdIns(4,5)P2

(PI(4,5)P2) were added to the assay at a final concentration of 100 mM. Errorbars, S.D. of duplicate assays in a given experiment. This profile is represent-ative of several experiments.



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obtained with the unmodified GTPase. The PtdIns(4)P stimu-lation factor was 2.38 6 0.13, versus 4.23 6 0.56 for the wild-type Rgd1p. In both cases, deleting amino acids 301–350 ofRgd1p halved the effect of PtdIns(4)P. Thus, this internalsequence of Rgd1p is clearly involved in regulating the stimu-latory effects of PtdIns(4)P on RhoGAP but probably actstogether with other parts of the Rgd1p protein closer to the Nterminus.The N-terminal Region of Rgd1p Is Required for Interaction

with Phosphoinositides—We investigated the physical interac-tion of Rgd1p with phospholipids through a protein lipid over-

lay assay. The GST-tagged Rgd1pand various GST-truncated formsof Rgd1p were used to probe nitro-cellulose-immobilized phospho-lipid membrane (PIP strips), andbound proteins were visualized byWestern blotting with anti-GSTantibodies (Fig. 3). For the full-length Rgd1p, solid binding of theprotein to all monophosphorylatedforms of phosphatidylinositides(phosphatidylinositol 3-phosphate,PtdIns(4)P, phosphatidylinositol5-phosphate) was observed. A stronginteraction with PtdIns(3,5)P2 wasalso observed. In addition, a weaksignal was obtained for the bindingof Rgd1p to phosphatidylinositol3,4-bisphosphate, PtdIns(4,5)P2,and phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate. A similar bindingpattern was observed with thedeleted Rgd1D301–350 form. Bycontrast, no binding was observedwith either Rgd1D1–300 orRgd1D1–350.

Thus, amino acids 1–300 areclearly essential for the physicalbinding of Rgd1p to phospholipidsand, more specifically, to phosphoi-nositides. Amino acids 300–350 ofRgd1p play a key role in PtdIns(4)P-stimulated GAP activity but do notseem to be involved in phospholipidbinding. These data are consistentwith the identification of an F-BAR

domain (aa 1–300) at theN-terminal extremity of Rgd1p,whichis known to interact with some phospholipids (21, 22). TheF-BAR domain includes the FCH domain and coiled-coilregions. To carry on exploring phospholipids binding,we testedthe GST-tagged Rgd1p only deleted for the FCH domain (aa1–156). No binding was detected indicating the determiningrole of FCH in interaction with phospholipids (Fig. 3).The N-terminal Region of Rgd1p Containing the F-BAR

Domain Is Necessary for Correct Localization in Vivo—Phos-phoinositides are concentrated at the cytosolic surfaces ofmembranes, and each has a unique subcellular distribution,being localized principally in certain subsets of membranes(37). Phosphoinositides are involved in direct signaling,through the binding of their head groups to cytosolic proteinsor the cytosolic domains of membrane proteins (38). The pres-ence of an F-BAR domain, a domain known to interact withphospholipids, at the N terminus of Rgd1p suggested that thisregion might be crucial for localization of the RhoGAP proteinin yeast cells.We therefore investigated the effect of this regionon the subcellular distribution of Rgd1p.We localized Rgd1p in the wild-type BY4742 background by

tagging the protein with three GFP molecules at its carboxyl

FIGURE 2. Effect of PtdIns(4)P on the GAP activity of full-length and truncated Rgd1p forms with Rho4p.The effects on GTPase activity of PtdIns(4)P depended on Rho4p prenylation state and Rgd1p form. A, sche-matic diagram of GST-tagged Rgd1p and of its truncated forms. B, GTP hydrolysis by 500 nM prenylated orunprenylated Rho4p was carried out with an equimolar concentration of Rgd1p or one of its truncated forms.Measurements were done in the absence (clear bars) or presence (dark bars) of 100 mM PtdIns(4)P. Error barsindicate the S.D. of duplicate assays in a single experiment. The same response was obtained in independentexperiments.

TABLE 2

Effect of full-length and truncated Rgd1p forms on GTP hydrolysis byunprenylated and prenylated Rho4p in the presence of PtdIns(4)PThe stimulation factor for GTP hydrolysis was determined by calculating the rate ofGTP hydrolysis (cpm) in the presence and absence of PtdIns(4)P. The data showncorrespond to the results displayed in Fig. 2.

RhoGAPRho4

Unprenylated Prenylated

Rgd1 2.69 6 0.17 5.1 6 0.52Rgd1D1–300 2.14 6 0.29 3.41 6 0.09Rgd1D1–350 1 6 0.24 1.88 6 0.17Rgd1D1–450 1.04 6 0.03 1.81 6 0.54



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terminus. Rgd1p was foundmostly in areas of polarized growthduring cell cycle progression (Fig. 4A). It was found in the budemergence area in the G1 phase and in the bud tip during the Sand G2 phases. During isotropic bud growth, Rgd1p wasdetected in dense patches resembling intensely fluorescentcrescents under the cortex at the bud tip. During M phase andcytokinesis, Rgd1p was undetectable at the bud tip and wasinstead found only at the bud neck. At this location, Rgd1pformed a single, intensely stained ring. After cytokinesis, Rgd1pwas distributed asymmetrically between mother and daughtercells. Many patches of staining were observed around the scarin themother cell, whereas the fluorescent signal tended to takethe formof a continuous line facing the scar in the daughter cell.Deletion of the N terminus of the protein (Rgd1D1–300 and

Rgd1D1–156) abolished binding to phosphoinositides on PIPstrips. We analyzed the subcellular distribution of Rgd1p fromwhich the entire FCH domain and part of the coiled-coil region(aa 1–156) belonging to the F-BAR domain had been deleted.This deletion led to mislocalization of all of the Rgd1p-33GFP

protein present, throughout the cell cycle, demonstrating theimportance of this sequence in controlling the distribution ofRgd1p in S. cerevisiae. No specific fluorescence was observed atthe bud tip and neck. Instead, a diffuse, heterogeneous signalwas observed over the entire cell surface, withmany apparentlyrandomly distributed dots of staining (Fig. 4B). By contrast,microscopic analysis of the RGD1D486–660 mutant showedthat the RhoGAP domain was not required for the correct dis-tribution of Rgd1p; indeed, this deleted form had a distributionidentical to that of the wild type in yeast cells (Fig. 4B).

We also showed that the removal of residues 301–350 ofRgd1p decreased the enhancement by PtdIns(4)P of the stimu-lation by Rgd1p of the GTPase activity of both unprenylatedand prenylated Rho4p. This internal region was not involved inphospholipid binding, but we nonetheless investigatedwhetherthe Rgd1D301–350 deleted protein with three GFP tags wascorrectly distributed, to determine whether this stimulatoryregion was involved in controlling the distribution of Rgd1p.The percentage of cells in which the Rgd1pmutant protein waslocated at the bud tip and neck was lower than for the wild-typeprotein (for the mutant protein, 38 6 8% was at the bud tip and8 6 2% was at the bud neck, whereas for the wild-type protein,58 6 6% was at the bud tip and 12 6 1.6% was at the bud neck).Consistent with these observations, the fluorescence signalseemed to be more diffuse and slightly stronger in the cyto-plasm of other Rgd1D301–350 cells (54%), in which the taggedprotein was located outside the bud tip and bud neck. A smallerproportion of the truncated Rgd1p than of the wild-type pro-tein was correctly distributed, but our findings nonethelessindicate that the deletion of amino acids 301–350 did not pre-vent the truncated form from reaching sites of polarizedgrowth, as in the reference strain. Thus, despite a lack of phys-ical interaction with phospholipids, loss of the region stimulat-ing GAP activity appears to play some role in controlling thelocation of Rgd1p, perhaps by maintaining RhoGAP at sites ofpolarized yeast growth.PtdIns(4)P and PtdIns(4,5)P2 Pools Are Required for Normal

Rgd1p Localization—We explored the role of phosphoinositi-des further by examining the distri-bution of Rgd1p in mutants withimpaired phosphoinositide synthe-sis. We specifically focused on theimpact of PtdIns(4)P levels, becausethis molecule had the strongesteffect on GAP activity and a strongphysical interaction with Rgd1p. InS. cerevisiae, most of the PtdIns(4)Pis generated by two PtdIns 4-ki-nases, Pik1p and Stt4p, and cellscarrying the heat-sensitive pik1-83ts or stt4-4ts mutation have verylow PtdIns(4)P levels, about halfthose of the wild type (39). Eachenzyme generates a discrete poolof PtdIns(4)P regulating differentessential biological processes. Pik1pis thought to supply the pool ofphosphoinositides required for the

FIGURE 3. Interaction of Rgd1p with phospholipids, as revealed byprotein-lipid overlay assays. PIP strips were spotted with 100 pmol oflysophosphatidic acid (LPA), lysophosphocholine (LPC), PtdIns (PI), phos-phatidylinositol 3-phosphate (PI(3)P), PtdIns(4)P (PI(4)P), phosphatidyli-nositol 5-phosphate (PI(5)P), phosphatidylethanolamine (PE), phospha-tidylcholine (PC), sphingosine 1-phosphate (S1P), phosphatidylinositol3,4-bisphosphate (PI(3,4)P2), phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate (PI-(3,5)P2), PtdIns(4,5)P2 (PI(4,5)P2), phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate(PI(3,4,5)P3), phosphatidic acid (PA), and phosphatidylserine (PS). GST-taggedRgd1p or truncated forms were incubated with the membrane and boundproteins were detected by Western blotting with anti-GST antibodies, asdescribed under “Experimental Procedures.”

FIGURE 4. Localization of wild-type and mutant Rgd1-33GFP proteins. A, the wild-type Rgd1-33GFP wasobserved by fluorescence microscopy in an asynchronous cell population. The various phases of the cell cyclewere reconstructed based on cell morphology and bud size. B, microscopy of Rgd1p forms with DFCH (D1–156)and DGAP (D486 – 660) deletions. We observed three independent clones for each mutant, and the imagesobtained are representative of the entire cell population.



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Golgi-to-plasmamembrane steps of the secretory pathway (39,40), whereas Stt4p is present in the plasmamembrane, where itsynthesizes the pool of PtdIns(4)P used to maintain cell wallintegrity and for actin cytoskeleton organization (39, 41).In the pik1-83ts mutant at permissive temperature (26 °C),

the distribution of Rgd1p was very similar to that observed inthewild-type strain. By contrast, at nonpermissive temperature(3 h at 38 °C), many highly fluorescent, mislocalized patches ofRgd1p were detected (Fig. 5). Rdg1p was found outside the budtip and neck in 87%ofmutant cells, versus only 35%ofwild-typecells. Rgd1p was located in the bud tip in far fewer mutant cellsthan cells of the reference strain (8 and 55%, respectively). Bycontrast, the percentage of cells in which Rgd1p was located atthe bud neck was similar in the mutant and wild-type strains atnonpermissive temperature (8 and 10%, respectively). Theseresults demonstrate the importance of the amount ofPtdIns(4)P generated by PIK1 for the correct distribution ofRgd1p, particularly at the bud tip. The proportion of cells withRgd1p at the bud tip was slightly lower in the stt4-4tsmutant atpermissive temperature than in the wild-type strain. Neverthe-less, shifting the stt4-4ts cells to 38 °C for 3 h did not reallyamplify this difference with respect to the control strain, imply-ing the absence of a clear role for STT4 in Rgd1p location. Thus,although PtdIns(4)P levels in the pik1-83ts and stt4-4tsmutantsat 38 °C were about half those of the reference strain (39), ourresults highlight the specific effects of the PIK1 gene in control-ling Rgd1p location.

PtdIns(4,5)P2, which is concentrated in the plasma mem-brane and participates in a large number of events at the cellsurface, is generated from PtdIns(4)P. We therefore also inves-tigated the effect of the amount of PtdIns(4,5)P2 on the distri-bution of Rgd1p and studied Rgd1p-33GFP in the mss4-102tsmutant defective for PtdIns(4,5)P2 synthesis (Fig. 5). In thismutant, which has much lower levels of PtdIns(4,5)P2 than thewild-type strain (42), a large percentage of cells containedRgd1p outside of polarized growth sites (73%) at nonpermissivetemperature. The number of cells in which Rgd1p was locatedat the tip of the bud was much lower (18%) in the mss4-102tsmutant than in the wild type (55%). By contrast, the proportionof cells in which Rgd1p was located at the bud neck was verysimilar to that in the reference strain. These results for themss4-102ts strain, resembling those obtained for the pik1-83tsmutant, again indicate the important role played by phospho-inositides in determining the distribution of the RhoGAP pro-tein in yeast cells.

DISCUSSION

The RhoGAP encoded by RGD1 in S. cerevisiae positivelyregulates theGTPase activity of both Rho3p and Rho4p (12). Itscellular distribution depends on cell cycle progression and isconsistent with its RhoGAP function on Rho3p and Rho4p.Given the diverse biological processes in which Rho3p andRho4p are involved (8, 14, 15, 43, 44), the activity of theseGTPases is likely to be strongly and differently controlled bytheir regulatory proteins. Consistentwith this hypothesis, somephospholipids were found to have specific effects, enhancingthe stimulation by Rgd1p of Rho4p GTPase activity. However,the level of stimulation differed between the phospholipidstested. Phosphatidylserine and PtdIns(4)P gave the largestincrease in activity, whereas phosphatidylcholine had no effecton GAP activity. By contrast, none of the phospholipids testedenhanced the stimulatory effects of Rgd1p on Rho3p to anygreat extent. Phospholipids have already been reported to reg-ulateGAP activity in vitro. The RacGAP activity of n-chimaerinis inhibited by some phospholipids and stimulated by others(32). Similarly, phospholipids strongly influence theGAP activ-ity of the p190A and p190BRhoGAPswith bothRhoA andRac1GTPases (28). In our study, lipids regulated the catalytic activityof the Rgd1p RhoGAP in a Rho-dependent manner, by chang-ing both specificity and the extent of the stimulatory effect. Thisspecific response must be linked to the structural properties ofthe Rho3p and Rho4p GTPases. Although both GTPases pos-sess the typical regions for guanine nucleotide binding, Rho3pand Rho4p present some differences. Rho4p has a polybasicregion (aa 281–287) preceding theCAAXbox at theC-terminalend. The polybasic region present in Ras and Rho GTPases hasbeen reported to control diverse functions, including binding tomembranes, interactions with specific proteins, and localiza-tion in particular subcellular compartments (45, 46). Reciprocalreplacement of the polybasic region of Rho4p by the equivalentregion of Rho3p had no effect on the response of Rgd1p/Rho4pand Rgd1p/Rho3p to phospholipids. Other regions of Rho4pmust therefore be involved in the stimulation effect.The physiological significance of phospholipid-mediated

GAP activation in overall yeast growth has not yet been studied.

FIGURE 5. Localization of Rgd1-33GFP in mutants with impairedPtdIns(4)P and PdtIns(4,5)P2 synthesis. Wild-type (WT) (SEY6210) andmutant (AAY104, AAY202, and CTY1568) cells producing Rgd1-33GFP werecultured at permissive temperature (26 °C) and shifted to nonpermissive tem-perature (38 °C) for 3 h. The pik1-83 and stt4-4 mutants had smaller pools ofPtdIns(4)P, whereas the amount of PtdIns(4,5)P2 was much lower in the mss4-102 mutant than in wild-type strain. Cells could be assigned to three catego-ries according to Rgd1p distribution: “bud tip,” “bud neck,” or “other localiza-tion” (not present in either the bud or tip or the bud neck). For each strain,three independent clones were observed, and 100 or more cells werecounted for each clone. Bars indicate the S.D. of three measurements for eachstrain.



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However, the principal consequence of the stimulation effectcould be a decrease in the abundance of active Rho4p and, thus,in Rho4-dependent signal transduction. Rho4p has beenreported to regulate the interaction between Hof1p and Bnr1p,two proteins involved in cytokinesis and localized at the budneck, in a GTP-Rho4p-dependent manner (47). Decreasing theamount of active Rho4p might, therefore, rapidly restrict theinteraction between Hof1p and Bnr1p proteins, leaving Hof1pfree and allowing cytokinesis to progress. Indeed, Hof1p degra-dation at the end of mitosis is important for efficient contrac-tion of the actomyosin ring and cell separation (48).We showed, with various truncated forms of Rgd1p and

assays of RhoGAP activity and PIP strips, that the N-terminalpart of this protein plays a determinant role in interactionswithphospholipids. The N-terminal end of the protein (aa 1–156) isessential for physical interactions with the various phospholip-ids in PIP strip assays. This protein-lipid interaction was alsodetected by the identification of Rgd1p as a phosphoinositide-binding protein in another approach based on yeast proteomechips (49). In addition, the need for the N-terminal region (aa1–156) for phosphoinositide binding is consistent with theidentification of this sequence belonging to an F-BAR domain.Removal of the internal region (aa 301–350) also halved thestimulatory effect on GAP activity. Finally, phosphoinositidesact at two different levels: binding to Rgd1p through the F-BARdomain and stimulating GAP activity, mostly via the internalregion (aa 301–350). Elimination of the F-BAR domain (aa1–300) was not sufficient to abolish the stimulation effect (seeTable 2).We therefore suggest that the internal regionmay alsointeract with phospholipids but that this interaction is tooweakfor detection in PIP strip assays. The enrichment of the internalsequence in basic residues is consistent with this hypothesis.This suggests that, after lipid binding, the internal region trans-mits a structural modification to the C-terminal part of theprotein. This structural change favors the activation of GTPhydrolysis specifically for Rho4p, either stabilizing the interac-tion between Rgd1p and Rho4p or increasing the rate of catal-ysis. The results obtained with the unprenylated GTPase areconsistent with this interpretation. However, analyses with theprenylatedRho4GTPase showed that theC-terminal region (aa350–666) nonetheless responded in part to the lipid environ-ment. The known role of prenylation in strengthening theGAP-GTPase interaction and so accelerating GTP hydrolysiscould explain this specific response of prenylated Rho4p com-pared with the unprenylated form (28, 36, 50). The highest lev-els of GAP activity were obtained with Rgd1D1–450 in theabsence of phospholipids, suggesting that amino acid se-quences outside the RhoGAP domain limit the accessibilityand/or the reactivity of the catalytic domain.Members of the F-BAR family are recruited from the cyto-

plasm to trigger the formation of plasma membrane extension,invaginations, tubular organelles, and transport intermediates,including endocytic vesicles (21–23, 51). In silico Rgd1p analy-sis showed that the N-terminal region adopted the conforma-tion typical of F-BAR domains, with five helices. The mislocal-ization of the mutant RhoGAP with a deletion of the FCHdomain and of part of the coiled-coil domain is consistent withthe known role of F-BAR in interactions with cellular mem-

branes.Our data show that this domain is essential for the local-ization of Rgd1p to cellular membranes at the bud tip and neck.This domainmay be the key element for the correct targeting ofthe RhoGAP domain close to GTPase sites, where GAP activa-tion takes place. However, deletion of the internal region (aa301–350) led to a decrease in the proportion of correctly dis-tributed proteins. However, this sequence does not seem to benecessary for directing the protein to the correct location, sincesome of the mutant protein nonetheless reached the bud tipand neck.We hypothesize that, in the absence of this sequence,the interaction between the RhoGAP and GTPases may beweakened, resulting in the more rapid release of the RhoGAPinto the cytoplasm.The considerable mislocalization of Rgd1p observed in the

temperature-sensitive mss4-102 mutant, which had very lowlevels of PtdIns(4,5)P2 in the plasma membrane (42), indicatesthat PtdIns(4,5)P2 is essential for the correct location of Rgd1pat the bud tip. Our data indicate that Rgd1p is localized at theplasma membrane through binding to PtdIns(4,5)P2 mediatedby the F-BARdomain.However, thismay be the case only in thebud tip, since the localization defect in the mss4-102 mutantappears limited to this area. We demonstrated that the F-BARdomain is also essential for the localization of RhoGAP at thebud neck. This domainmay interactwith other phosphoinositi-des or act in other ways to localize the protein at the bud neck.PtdIns(4)P depletion also disrupted the polarized localizationof Rgd1p in the bud tip. This defect, which was observed onlyfor the pik1mutant and not in stt4mutant, cannot be an indi-rect effect due to the disturbance of the cellular lipid homeo-stasis. Thus, given the clear role of Pik1p and Stt4p PtdIns 4-ki-nases, our observations in the pik1mutant suggest that Rgd1pmust initially bind to the cytoplasmic face of Golgi membranesvia the binding of F-BAR to PtdIns(4)P, being then transportedto the plasma membrane via the secretory pathway. At theplasma membrane, the protein can bind to the biphosphoryla-ted phosphatidylinositol. Several proteins specifically requirefunctional Pik1p and PtdIns(4)P and thus are selectivelyrecruited to the Golgi apparatus in vivo (42, 52, 53), as is theKes1p protein, which is mislocalized to the cytoplasm in thepik1 mutant but not in stt4 cells (54). In agreement with ourinterpretation, Rgd1p was correctly localized in a mutantblocked in endoplasmic reticulum to Golgi transport.4

Phosphoinositides have a structural and a signaling role viatheir recruitment of proteins. Recently, it was reported that theamount of phosphoinositides increases at low pH, and it wasproposed that PtdIns(4,5)P2 facilitates actin repolarization andup-regulates fluid phase endocytosis after low pH shock (55).Given these data and the sensitivity of rgd1D cells to acidic envi-ronment, we can imagine that a PtdIns(4,5)P2 increase facilitatesrecruitment of Rgd1p to plasma membrane through F-BARdomain.This recruitmentwould result indecreaseof cell signalingand growthmainly throughRho3p, located at the bud tip, to allowphysiological adaptation of yeast cells at low pH.This work provides the first demonstration of a dual mode of

action of phosphoinositides on a RhoGTPase-activating pro-

4 V. Prouzet-Mauleon, F. Lefebvre, D. Thoraval, M. Crouzet, and F. Doignon,unpublished results.



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tein containing an F-BAR domain. Phosphoinositides regulatethe trafficking of Rgd1p and its recruitment to membranes andstimulate GAP activity, suggesting a functional interplaybetween lipids, the RhoGAP, and the GTPases with which itinteracts. Heath and Insall (56) recently described abnormalvacuoles in the rgd1D mutant. It would therefore seem possiblethat Rgd1p controls other biological processes. Further analy-ses are required to investigate the multifunctional aspects ofthis RhoGAP in more detail and to discover the fine structuraldeterminants of Rgd1p interacting with phosphoinositides.

Acknowledgments—We thank Marco Geymonat and Steve Sedgwick

(National Institute for Medical Research, London) for providing the

plasmid and the yeast strain for optimized protein production in

yeast. We thank Isabelle Sagot for providing the pRS305-33GFP and

for assistance with microscopy. The heat-sensitive strains AAY104,

SEY6210, and AAY202 were generously provided by Chris Stefan

(University of California, San Diego), and strain CTY1568 was

obtained fromVytas Bankaitis (University of North Carolina, Chapel

Hill).We thank Erzsebet Ligeti (SemmelweisUniversity, Budapest) for

receiving VPM in her laboratory and Magdolna Levay for kind help.

DNA sequencing was performed at the Genotyping and Sequencing

Facility of the University of Bordeaux (supported by Conseil Regional

d’Aquitaine Grants 20030304002FA and 20040305003FA and Euro-

pean Union Grant FEDER 2003227).

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56. Heath, R. J., and Insall, R. H. (2008) J. Cell Sci. 121, 1054–1064



at C

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1, 2

008

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Figure II-4 : Rôle de différents phosphoinositides dans le trafic intracellulaire chez les

mammifères (KrauB et Haucke (2007), EMBO reports, 8(3), p241).

Figure II-5 : Distribution de la localisation de Rgd1-3GFP dans un mutant fab1!. La souche de

référence BY4742 et le mutant fab1! ont été transformés avec la construction RGD1-3GFP et

observés au microscope à fluorescence.

4. Les phosphoinositides autres que le PtdIns(4)P et le

PtdIns(4,5)P2 ont-ils un rôle dans la régulation de la localisation

de Rgd1p ?

Nous avons précédemment montré le rôle du PtdIns(4)P et du PtdIns(4,5)P2 dans la

localisation apicale de Rgd1p. Ces données nous ont permis de formuler le modèle proposé

dans l’article présenté ci-dessus. Cependant il est à noter qu’in vitro, Rgd1p interagit

également avec d’autres phosphoinositides (PtdIns(3)P, PtdIns(5)P, PtdIns(3,5)P2,

PtdIns(3,4)P2 et au PtdIns(3,4,5)P3) par son domaine F-BAR (Figure 3 de l’article). Chez la

levure, le PtdIns(5)P, le PtdIns(3,4)P2 et le PtdIns(3,4,5)P3 n’ont pas été trouvés (Strahl &

Thorner, 2007). Avant de chercher à conforter notre modèle, nous avons cherché à examiner

in vivo le rôle du PtdIns(3)P et du PtdIns(3,5)P2 sur la localisation de Rgd1p.

Alors que les phospholipides PtdIns(4)P et PtdIns(4,5)P2 sont impliqués dans le transport

antérograde, de l’appareil de Golgi vers la membrane plasmique, le PtdIns(3)P et le

PtdIns(3,5)P2 sont impliqués dans l’endocytose, l’adressage aux endosomes pour permettre

soit un recyclage des vésicules, soit une dégradation dans la vacuole (Figure II-4) (Krauss &

Haucke, 2007).

La localisation de Rgd1-3GFP a été observée dans la souche mutée pour le gène

codant pour la seule PtdIns-3-kinase de levure vps34! et dans la souche mutée pour le gène

codant pour la seule PtdIns(3)P-5-kinase de levure fab1!.

Dans le mutant fab1!, la localisation de Rgd1p n’est aucunement perturbée, par

rapport à la souche sauvage (Figure II-5). Il en est de même dans le mutant vps34!.

Pour conclure, le PtdIns(3)P et le PtdIns(3,5)P2 ne semblent pas jouer de rôle dans la

régulation de la localisation de Rgd1p. Cela suggère que le trafic antérograde, du Golgi vers la

membrane plasmique, joue un rôle prépondérant dans la bonne localisation de Rgd1p alors

que les voies d’endocytose et d’adressage vers les endosomes et la vacuole ne semblent pas

impliquées. L’ensemble de ces données tend à montrer que seul le PtdIns(4)P synthétisé par

Pik1p au niveau du Golgi, et le PtdIns(4,5)P2 synthétisé par Mss4p au niveau de la membrane

plasmique, ont un rôle dans la localisation de Rgd1p, suggérant ainsi un rôle du trafic

intracellulaire et plus particulièrement de la voie de sécrétion dans cette localisation.

69

C. Le trafic intracellulaire intervient-il dans la localisation apicale

de Rgd1p ?

Nous avons montré précédemment le rôle du PtdIns(4)P et du PtdIns(4,5)P2 dans la

localisation apicale de Rgd1p. La diminution du taux de PtdIns(4)P due à l’inactivation de

PIK1 se traduit par une altération de la morphologie de l’appareil de Golgi et d’importants

défauts de sécrétion (Audhya et al., 2000). La localisation de Rgd1-GFP est anormale dans un

mutant pik1-83 alors qu’elle n’est pas perturbée par l’inactivation du gène codant pour la

PtdIns-4-kinase Stt4p. Ce sont ces données qui nous ont suggéré que Rgd1p pourrait être

amenée à l’apex via le trafic intracellulaire en interagissant avec le PtdIns(4)P présent sur la

face cytosolique des vésicules de sécrétion (Lefebvre et al., 2009). De plus, lorsque nous

avons initié ce travail, Hwang et al (2008) ont publié des données similaires à notre hypothèse

à propos de la protéine RhoGAP REN1 d’Arabidopsis thaliana. REN1 est une protéine

RhoGAP d’une sous famille de Rho, Rop1p (Rho Of Plant) et possède un domaine PH et

deux domaines Coiled-coil en plus du domaine RhoGAP. ROP1 est localisée au niveau du site

de croissance des tubes polliniques et induit leur élongation (Hwang et al., 2008). REN1

présente également une localisation apicale afin d’inhiber l’activité de ROP1. Hwang et al

(2008) ont montré que REN1 était associée aux vésicules d’exocytose et était acheminée par

le trafic intracellulaire pour atteindre et inactiver ROP1 au niveau de la membrane plasmique.

Nous nous proposons d’étudier l’implication du trafic intracellulaire dans la

localisation de Rgd1p par des approches combinées de génétique, de biologie cellulaire et de

biochimie.

La distribution de Rgd1-3GFP a été analysée dans des mutants affectés pour des gènes

contrôlant le trafic. Le blocage du trafic intracellulaire à certains points clés permettra

d’identifier les étapes empruntées par Rgd1p.

La présence de Rgd1p dans les différents compartiments cellulaires a également été

examinée par centrifugations différentielles afin de séparer les petites vésicules des grosses

structures membranaires et organelles ainsi que des protéines solubles dans une souche

sauvage et dans des mutants altérés pour des gènes contrôlant le trafic intracellulaire. La

répartition de Rgd1p a ensuite été plus finement analysée par centrifugation d’un culot de

membranes (issu d’une centrifugation à 13 000g) sur un gradient de saccharose. La

70

A

sec4-2

sec6-4

B

38°C

C

26°C

38°C

Figure II-6 : Localisation de Rgd1-3GFP dans des mutants altérés pour le trafic.

A) Distribution de la localisation de Rgd1 dans des mutants du trafic.

B) Localisation de Rgd1-3GFP dans un mutant sec4-2 à température non permissive (3h à

38°C).

C) : localisation de Rgd1-3GFP dans un mutant sec6-4 à température permissive (26°C) (ligne

du haut) et non permissive (3h à 38°C) (ligne du bas).

caractérisation des différents compartiments cellulaires a été réalisée à l’aide de marqueurs

enzymatiques et Rgd1p sera détectée par Western blot.

1. La localisation de Rgd1p est-elle perturbée dans des

mutants affectés pour le trafic intracellulaire ?

La construction Rgd1-3GFP a été intégrée au locus RGD1 par transformation de

mutants altérés pour des gènes impliqués dans le contrôle du trafic intracellulaire, puis la

distribution de Rgd1-3GFP a été analysée par microscopie à fluorescence.

Nous avons sélectionné les mutants bloquant le trafic intracellulaire suivants :

- au niveau de la translocation des protéines dans le réticulum endoplasmique (sec61-3)

(Robson & Collinson, 2006),

- au niveau du transport antérograde (l’entrée dans le cis-Golgi) (sec22!) (Parlati et al.,

2000) et rétrograde (erd1!) (Hardwick et al., 1990),

- au niveau de l’émission des vésicules de sécrétion dans le trans-Golgi (sec14-1) (Mousley

et al., 2007),

- au niveau de l’arrimage et de la fusion des vésicules avec la membrane plasmique (sec4-2

et sec6-4) (He & Guo, 2009; Lipschutz & Mostov, 2002)

- au niveau de l’endocytose précoce (end3!) (Kaksonen et al., 2005).

Les mutants thermosensibles (sec61-3, sec14-1, sec4-2 et sec6-4) ont été analysés

après culture à température permissive (26°C) et après 3 heures à température non permissive

(38°) ; dans cette dernière condition, il a été vérifié que la mortalité cellulaire était faible. Les

délétants (sec22!, erd1! et end3!) ont été analysés après culture à 30°C en milieu minimum.

La protéine Sec61 fait partie du complexe du translocon responsable de la

translocation co-traductionnelle de protéines dans le réticulum endoplasmique (RE) et du

transfert post-traductionnel de certaines protéines (Robson & Collinson, 2006). Sec22p est

une v-SNARE participant à la fusion des vésicules provenant du RE au cis-Golgi (Parlati et

al., 2000) et Erd1p intervient dans le tri des protéines dans le cis-Golgi et leur rétro-transport

vers le RE (Okamoto et al., 2008). Les mutants sec61-3, sec22! et erd1! ne présentent pas de

défaut dans la répartition de localisation de Rgd1-3GFP par rapport aux souches contrôles

(Figure II-6A). Ces observations montrent que la localisation de Rgd1p ne fait pas intervenir

71

les étapes du trafic dans lesquelles les produits de ces gènes interviennent et suggèrent que

Rgd1p ne transite pas par le RE et n’est pas internalisée dans les vésicules provenant du RE.

La protéine Sec14 est une PITP (PhosphatidylInositol/phosphatidylcholine Transfert

Protein) requise pour le transport des vésicules du trans-Golgi à la membrane plasmique et est

un acteur important de la régulation du métabolisme de la phosphaditylcholine et du

phosphoinositol au niveau du trans-Golgi (Mousley et al., 2007). Lors de l’inactivation de

l’allèle thermosensible sec14-1 suite au transfert à température non permissive, la proportion

de cellules ayant Rgd1-3GFP localisée au niveau de l’apex du bourgeon diminue à 25% ± 3

alors que cette proportion est de 52% ± 6 dans la souche de référence. (Figure II-6A). Par

contre le pourcentage de cellules où Rgd1-3GFP est localisée au niveau du cou reste similaire

pour la souche sauvage (19% ± 2) et le mutant sec14-1 (23% ± 5). Cela suggère un rôle des

vésicules du trans-Golgi dans la localisation apicale de Rgd1p, mais pas dans sa localisation

au niveau du cou du bourgeon.

Deux mutants de l’exocytose sec4-2 et sec6-4 ont également été étudiés. La protéine

Sec4 est une GTPase de la famille Rab, impliquée dans l’assemblage du complexe de

l’exocyste puis dans le ciblage et la fusion des vésicules à la membrane plasmique (Lipschutz

& Mostov, 2002), alors que la protéine Sec6, un composant du complexe de l’exocyste, est

impliquée dans les étapes finales du trafic intracellulaire, en permettant la fusion des vésicules

d’exocytose avec la membrane plasmique (He & Guo, 2009). Les mutations sec4-2 et sec6-4

entrainent l’accumulation de vésicules dans le bourgeon à température non permissive

(Robinson et al., 1999; Walworth et al., 1989). Dans le mutant sec4-2, la localisation de

Rgd1-3GFP au niveau du fond du bourgeon est totalement perturbée, et la localisation au

niveau du cou du bourgeon reste quasiment normale, soit 11% ± 5 des cellules dans la souche

sec4-2 contre 19% ± 2 dans la souche de référence. Nous observons dans la plupart des

cellules pour lesquelles Rgd1p n’est pas localisée au niveau du cou du bourgeon (Figure II-

6A et B):

- Soit de nombreux points intenses, repartis dans l’ensemble de la cellule (72,3 % ±.3).

- Soit un important signal fluorescent concentré dans une région de la cellule

(15,5 % ±.2)

Dans le mutant sec6-4, la localisation de Rgd1-3GFP est presque totalement perturbée à la

fois au fond et au cou du bourgeon. On observe alors de nombreux spots intenses, répartis

dans l’ensemble de la cellule. (Figure II-6A et C). Ces observations montrent a priori une

implication de l’exocytose dans la localisation de Rgd1p au niveau du fond et du cou du

bourgeon.

72

Enfin, nous avons examiné la localisation de Rgd1-3GFP dans le mutant d’endocytose

end3!. La protéine End3 interagit notamment avec Las17p, un activateur du complexe Arp2/3

nucléateur des patches d’actine ; End3p favorise l’endocytose associée aux patches d’actine

(Kaksonen et al., 2005). Dans le mutant end3!, la localisation de Rgd1-3GFP n’est pas

altérée, ce qui tend à montrer que l’endocytose n’est pas impliquée dans la régulation de la

localisation de Rgd1p (figure II-6A).

Ces résultats montrent tout d’abord que ce n’est qu’à partir de l’étape contrôlée par

SEC14, au niveau du trans-Golgi que la localisation de Rgd1-3GFP est perturbée. On peut

donc penser que ni le transport vésiculaire du RE vers le Golgi, ni le transport rétrograde et ni

l’endocytose ne sont impliqués dans la localisation apicale de Rgd1p. Ensuite, dans les

mutants sec14 et sec4-2, seule la localisation apicale est altérée alors que dans le mutant sec6-

4, les différentes localisations recensées de Rgd1p sont perturbées. Sec14p et Sec4p seraient

donc impliquées uniquement dans la localisation apicale de Rgd1p alors que Sec6p jouerait un

rôle à la fois dans la localisation de Rgd1p au niveau du fond du bourgeon et au niveau du cou

du bourgeon.

D’autre part, les localisations observées chez les mutants sec4-2 et sec6-4 montrent

des organisations ponctuées non polarisées alors que dans ces mutants, bien que l’accostage et

la fusion des vésicules soient perturbés, leur trafic intracellulaire reste polarisé vers le site de

croissance, ce qui conduit à une forte accumulation de vésicules concentrées dans le bourgeon

(Guo et al., 1999; Walworth et al., 1989). Une association de Rgd1p aux vésicules de

sécrétion permettrait d’observer de nombreux points fluorescents dans le bourgeon. La

localisation dispersée de Rgd1-3GFP dans les mutants sec4-2 et sec6-4 ne permet donc pas de

valider l’hypothèse d’un transport vésiculaire de Rgd1p.

2. Dans quel compartiment biologique Rgd1p est-elle

localisée ?

En observant la localisation de Rgd1-3GFP dans des mutants de kinase du

phosphatidylinositol, nous avons mis en évidence un rôle du PtdIns(4)P synthétisé au niveau

du Golgi et du PtdIns(4,5)P2 synthétisé au niveau de la membrane plasmique dans la

localisation apicale de Rgd1p, suggérant un rôle du trafic intracellulaire. En examinant la

localisation de Rgd1-3GFP dans des mutants du trafic, nous avons montré que la voie de

73

sécrétion a un rôle déterminant dans la localisation de Rgd1. Cependant, la localisation

dispersée de Rgd1-3GFP observée dans les mutants de l’exocytose sec4-2 et sec6-4 n’est a

priori pas en accord avec l’hypothèse d’un transport vésiculaire de Rgd1p du trans-Golgi

jusqu’à la membrane plasmique.

Pour tenter de résoudre cette contradiction entre le modèle que nous avons proposé

(Lefebvre et al., 2009; Prouzet-Mauleon et al., 2008) et les observations de Rgd1-3GFP dans

les mutants sec4-2 et sec6-4, nous avons cherché à déterminer par des approches

biochimiques si Rgd1p pouvait être associée aux vésicules de sécrétion.

a) Fractionnement cellulaire par centrifugations différentielles

Nous avons isolé les différents compartiments cellulaires de la souche de référence

ainsi que des souches mutantes sec4-2 et sec6-4, accumulant des vésicules de sécrétion, par

centrifugations différentielles. Dans les différentes souches utilisées RGD1 a été étiqueté à

son locus avec la séquence codant pour l’épitope 6xHA (Janke et al., 2004). Les cellules

récoltées après 3 heures d’incubation à température non permissive ont été

« sphéroplastisées » et lysées mécaniquement à l’aide d’un potter. Après clarification du lysat

à 500g pendant 5 minutes, le surnageant est centrifugé à 13 000g pendant 10 minutes. Le

surnageant de cette centrifugation est récupéré et centrifugé à 100 000g pendant une heure.

Quatre fractions sont ainsi obtenues (Bowser & Novick, 1991) :

- Le culot 13 000g (P13) contient toutes les grosses structures membranaires : la

membrane plasmique, les mitochondries, la vacuole, le réticulum endoplasmique et le cis-

Golgi.

- Le surnageant 13 000g (S13) contient les petites vésicules assurant le transport entre

le RE et le Golgi, le trans-Golgi, les petites vésicules d’exocytose et d’endocytose ainsi que

les protéines solubles.

- Le surnageant et le culot 100 000g (S100 et P100) sont issus du S13. Le P100

contient toutes les petites vésicules du S13 et le S100 contient les protéines solubles.

Les différentes fractions issues des centrifugations sont analysées en Western blot

avec une révélation par un anticorps anti-HA (Figure II-7). Afin de contrôler la présence de

la membrane plasmique et du trans-Golgi respectivement dans les fractions P13 et P100, deux

marqueurs ont été utilisés :

- Pma1p est la principale ATPase de la membrane plasmique et est acheminée par la

voie de sécrétion (Harsay & Schekman, 2002).

74

- Kex2p est une protéase du trans-Golgi impliquée dans la maturation de nombreuses

protéines transitant par la voie de sécrétion, notamment le facteur alpha (Heiman et al., 2007).

Dans le cadre de notre hypothèse de travail, une augmentation de la proportion de

Rgd1p dans la fraction P100 (Rgd1p associée à de petites vésicules) et une diminution de la

proportion de Rgd1p dans la fraction P13 (Rgd1p associée à la membrane plasmique) sont

attendues dans les mutants sec4-2 et sec6-4, par rapport à la souche de référence. Or, la

proportion de Rgd1p présente dans la fraction P13 augmente dans le mutant sec4-2 et est

encore plus importante dans le mutant sec6-4. Dans la souche de référence, le marqueur de la

membrane plasmique Pma1p est correctement réparti, uniquement présent dans la fraction

P13. Dans le mutant sec6-4 et dans une moindre mesure, dans le mutant sec4-2, Pma1p est

détectée majoritairement dans les fractions P13, mais est également visible dans les fractions

S13 et P100. Pma1p est localisée à la membrane plasmique via la voie de sécrétion. La

population de Pma1p détectée dans les fractions S13 et P100 des mutants sec4-2 et sec6-4 doit

correspondre aux protéines présentes dans les vésicules de sécrétion bloquées dans le

bourgeon (Guo et al., 1999; Walworth et al., 1989).

Une diminution de la proportion de Rgd1p est également visible dans les fractions

S100 et P100, issues des deux mutants sec4-2 et sec6-4. Cependant, dans ces mutants, la

somme des signaux obtenus à partir des fractions P100 et S100 ne correspond pas au signal

observé pour la fraction S13, comme c’est le cas pour la souche de référence. Les conclusions

basées sur la proportion de protéine Rgd1 provenant des fractions P100 et S100 doivent être

considérées avec précaution, d’autant plus que le marqueur du trans-Golgi Kex2p n’a pu être

détecté dans aucune des fractions de centrifugation, certainement à cause de la faible affinité

des anticorps utilisés.

b) Fractionnement cellulaire par centrifugation sur gradient de saccharose

Afin de caractériser le(s) compartiment(s) cellulaire(s) au(x)quel(s) Rgd1p est associée

dans le culot 13 000g d’un mutant sec6-4 et en plus faible quantité dans le P13 de la souche

de référence, nous avons centrifugé les extraits cellulaires correspondants sur un gradient de

saccharose. En effet, l’accumulation de la protéine Rgd1p dans la fraction P13 des mutants

sec4-2 et sec6-4 pourrait avoir lieu au niveau du compartiment Golgien, lorsque le trafic est

bloqué.

75

Figure II-8 : Fractionnement cellulaire de la souche de référence par centrifugation sur gradient

de saccharose et suivi de la protéine Rgd1p. L’activité spécifique de l’ATPase de la membrane

plasmique est exprimée en µmol/10minutes/mg de protéines. L’activité spécifique de la GDPase

du cis-Golgi est exprimée en µmol/30minutes/mg de protéines. L’activité spécifique de la

cytochrome c reductase du RE est exprimée en pmol/min/mg de protéines. L’intensité relative

correspondant à la protéine Rgd1p dans chaque fraction a été calculée à partir de la

quantification des signaux obtenus après western blot.

Les culots P13 obtenus à partir d’une souche sauvage et du mutant sec6-4 sont

centrifugés sur un gradient de saccharose (30%-55%) à 100 000g pendant 16 heures (Bowser

& Novick, 1991; Chang et al., 2008; Goud et al., 1988). Le gradient est ensuite réparti en

vingt fractions de volume égal. A partir de chacune de ces fractions, des activités spécifiques

des différents compartiments cellulaires ont été testées, puis une partie aliquote de chaque

fraction a été analysée par Western blot avec une révélation par l’intermédiaire d’un anticorps

dirigé contre l’étiquette HA.

La membrane plasmique est détectée par la mesure de l’activité ATPasique de Pma1p,

le cis-Golgi par la mesure d’une activité GDPasique et le RE par la mesure de la cytochrome c

réductase. L’activité de la cytochrome c oxydase mitochondriale et l’activité de la DPAP-A

(DiPeptidyl AminoPeptidase A) vacuolaire ont également été mesurées mais sans succès.

Pour la souche de référence, l’activité GDPasique caractéristique du cis-Golgi et

l’activité cytochrome c reductase spécifique du RE sont présentes dans les fractions

supérieures du gradient, correspondant aux éléments les moins denses. Sur la Figure II-8, les

pics d’activité des enzymes correspondant à ces compartiments sont superposés mais au cours

des différents essais, il nous a parfois été possible de voir un pic d’activité de la cytochrome c

reductase correspondant au RE dans des fractions moins denses que celles correspondant au

cis-Golgi. La courbe d’activité ATPasique correspondant à la membrane plasmique présente

un large pic s’étalant selon les essais entre les fractions 6 et 13. Rgd1p est détectée par

Western blot anti-HA dans les fractions 5 à 10 avec un épaulement important correspondant à

des éléments denses, dans les fractions immédiatement inférieures à celles où la membrane

plasmique est détectée. Rgd1p n’est absolument pas détectée dans les fractions correspondant

au RE et au cis-Golgi.

Dans le mutant sec6-4, les différents compartiments sont détectés dans des fractions de

densité légèrement supérieure à la souche de référence. Cela peut être dû soit à une légère

différence de l’homogénéité du gradient ou à l’accumulation d’éléments membranaires dans

le mutant sec6-4, due au blocage du trafic, ce qui pourrait provoquer un effet entraineur plus

important. Toutefois, Rgd1p est à nouveau détectée dans les fractions où nous retrouvons

l’activité ATPasique spécifique de la membrane plasmique. Comme pour la souche sauvage,

il n’y a aucun signal détectable dans les fractions correspondant soit au RE, soit au cis-Golgi

(Figure II-9).

De manière étonnante et contrairement au modèle proposé, lorsque les étapes

terminales de l’exocytose sont bloquées, Rgd1p est associée en plus grande proportion avec

76

Figure II-9 : Fractionnement cellulaire de la souche sec6-4 à température non permissive par

centrifugation sur gradient de saccharose et suivi de la protéine Rgd1p. L’activité spécifique de

l’ATPase de la membrane plasmique est exprimée en µmol/10minutes/mg de protéines.

L’activité spécifique de la GDPase du cis-Golgi est exprimée en µmol/30minutes/mg de

protéines. L’activité spécifique de la cytochrome c reductase du RE est exprimée en

pmol/min/mg de protéines. L’intensité relative correspondant à la protéine Rgd1p dans chaque

fraction a été calculés à partir de la quantification des signaux obtenus après western blot.

La zone rose du graphique inferieur correspond à des activités spécifiques calculée à partir

d’extrapolations de la concentration protéique des différentes fractions. L’extrapolation a été

réalisée à partir de tous les autres fractionnements cellulaire obtenus par centrifugation sur

gradient de saccharose réalisé au cours de ce travail.

les fractions contenant la membrane plasmique plutôt qu’avec celles contenant les vésicules

de sécrétion.

3. Conclusion

Les résultats de la localisation de Rgd1-3GFP dans des mutants affectés pour des

gènes contrôlant des étapes du trafic nous ont permis de montrer l’importance du transport

vésiculaire du Golgi vers la membrane plasmique dans la localisation, notamment apicale, de

Rgd1p. Cependant, lors de ces différentes études menées en particulier avec le mutant sec6-4,

nous avons mis en évidence des résultats qui ne sont pas a priori totalement en accord avec le

modèle envisagé (Prouzet-Mauleon et al., 2008). Les trois expériences menées sur le mutant

sec6-4, donnent des résultats convergents : i) Rgd1-3GFP ne semble pas être localisée au

niveau des vésicules d’exocytose dans ce mutant, ii) après centrifugation différentielle, une

accumulation de Rgd1p est observée dans le P13, et iii) après centrifugation sur gradient de

saccharose, le compartiment concerné par cette accumulation sédimente avec les fractions

contenant la membrane plasmique. Bien que ces résultats tendent vers la même conclusion, un

contrôle est encore manquant afin de pouvoir la stabiliser. La détection du marqueur du trans-

Golgi Kex2p a posé de nombreux problèmes d’ordre technique et doit être testée à nouveau.

De plus, lors du fractionnement cellulaire sur gradient de saccharose de l’extrait issu du

mutant sec6-4, la quantité de protéines présente dans certaines fractions était inférieure au

seuil de détection des protéines par la méthode de dosage de Bradford, ce qui a empêché le

calcul des activités spécifiques. Ce fractionnement devra donc être répété, avec une quantité

initiale de cellules plus importante.

Les résultats obtenus à partir des centrifugations différentielles et des centrifugations

sur gradient de saccharose montrent une augmentation de la quantité de Rgd1p dans la

fraction P13 et la présence de Rgd1p dans les fractions contenant la membrane plasmique

dans un mutant sec6 4 comme dans la souche sauvage.

Dans un mutant sec6-4 à température non permissive, l’accostage de l’exocyste avec la

membrane plasmique est altéré et la fusion des vésicules est bloquée. Le blocage du transport

vésiculaire dans ce mutant a permis d’identifier deux types de vésicules d’exocytose (Harsay

& Bretscher, 1995). Leur observation n’est pas possible dans une souche sauvage en raison de

la rapidité du trafic intracellulaire et du peu de vésicules présentes. Les deux types de

77

A

B

Figure II-10 : Hypothèses concernant la localisation de Rgd1 dans un mutant sec6-4.

A) Pik1p est délocalisée dans un mutant sec6-4. Les vésicules sont dépourvues de PtdIns(4)P,

Rgd1p est incapable de s’y fixer et interagit avec les phosphoinositides présents dans d’autres

membranes ou s’agrège.

B) Les vésicules contenant les exoenzymes comme l’invertase ou la phosphatase acide

fusionnent avec la membrane de manière aléatoire lorsque la sécrétion polarisée est bloquée. Les

protéines Rgd1p associées à ces vésicules peuvent alors être localisées à la membrane

plasmique, de façon non polarisée..

vésicules ont une taille de 100 nm, mesurée en microscopie électronique, mais sont de densité

et de contenu différents :

- Les vésicules les moins denses contiennent entre autres l’ATPase Pma1p et l’exo-" 1-3

glucanase Bgl2p. Ces vésicules contiennent le matériel nécessaire à l’expansion de la

membrane plasmique et la synthèse de la paroi.

- Les vésicules les plus denses contiennent principalement des enzymes périplasmiques et des

protéines destinées à être sécrétées dans le milieu comme l’invertase ou la phosphatase acide

Exg1p. Ces vésicules n'ont pas besoin d'être ciblées précisément au niveau du site de

croissance.

L’interruption du trafic intracellulaire dans le mutant sec6-4 entraîne un défaut de

localisation de la phosphatidylinositol-4-kinase Pik1p, qui n’est alors plus associée à la

membrane golgienne (Demmel et al., 2008).

Les caractéristiques de ce mutant nous amènent à proposer deux hypothèses non

exclusives, permettant d’expliquer les résultats des centrifugations différentielles et sur

gradient de saccharose.

i) Rgd1p est incapable de s’associer aux vésicules d’exocytose dans un mutant

sec6 4 (Figure II-10A)

Dans le cadre de notre hypothèse de travail où Rgd1p serait associée avec le PtdIns(4)P au

niveau du Golgi puis des vésicules de sécrétion pour être acheminée à la membrane

plasmique, il a été montré que la localisation de la kinase Pik1p est perturbée dans le mutant

du trafic sec6-4. Ainsi, nous pouvons penser que l’utilisation du mutant sec6-4 conduit à la

formation de vésicules de sécrétion dépourvues de PtdIns(4)P, c'est-à-dire incapables de

prendre en charge Rgd1p. Rgd1p serait alors incapable de s’accrocher aux membranes

golgiennes et aux vésicules de sécrétion, la protéine RhoGAP pourrait alors interagir avec des

phosphoinositides présents sur d’autres membranes. L’accumulation de structures

membranaires anormales, appelées corps de Berkeley, a été observée dans les mutants sec14

(Novick et al., 1981) et pik1 (Audhya et al., 2000) altérant la localisation de Rgd1p. Dans le

mutant sec6-4, ces structures ne sont pas observées après 90 minutes à température non

permissive ; seule l’accumulation de vésicules sécrétrices a été décrites (Novick et al., 1981).

Néanmoins, dans nos conditions expérimentales à savoir 3 heures à température non

permissive, il est possible que des structures anormales soient formées suite à la mutation du

gène SEC6 ou indirectement suite à la mauvaise localisation de Pik1p. De plus, la

78

Rgd1-3GFP

pik1-83

sec6-4

Figure II-11 : Localisation de Rgd1-3GFP dans un mutant pik1-83 (en haut) et un mutant sec6-4

(en bas) à température non permissive (3h à 38°C).

délocalisation de Pik1p pourrait conduire à la synthèse de PdtIns(4)P dans d’autres

membranes, alors capables de fixer Rgd1p. Ces membranes co-sédimenteraient avec la

membrane plasmique.

Cette hypothèse est supportée par le fait que les images de la localisation de Rgd1p

dans les mutants pik1-83 et sec6-4 sont très similaires et présentent de nombreux spots dans la

cellule (Figure II-11). Dans le cadre de cette hypothèse, il faudra vérifier l’absence de

PtdIns(4)P dans les vésicules de sécrétion d’un mutant sec6-4. Pour cela, les fractions issues

de centrifugation différentielles ou sur gradient de saccharose contenant des vésicules de

sécrétion obtenues à partir du mutant sec6-4 et de la souche de référence seront identifiées en

suivant un marqueur de l’exocytose tel que l’invertase ou l’exoglucanase Bgl2p ; la présence

ou l’absence de PtdIns(4)P sera examinée à l’aide d’anticorps anti-PtdIns(4)P (Société

Echelon). Par ailleurs il faudra analyser finement les fractions contenant Rgd1p et préciser

leur composition pour comprendre l’effet de la mutation de sec6-4 sur la distribution

cellulaire de la RhoGAP.

Enfin, en considérant les propriétés de dimérisation des domaines F-BAR, l’incapacité

de Rgd1p à s’associer avec les vésicules dépourvues de PtdIns(4)P pourrait également

conduire à une agrégation de la protéine. Ces agrégats seraient visibles sous forme de spots en

microscopie à fluorescence et sédimenteraient soit dans le P13 ou avec la fraction

correspondant à la membrane plasmique.

ii) Les vésicules portant Rgd1p sont re-routées dans un mutant sec6-4 (Figure II-

10B).

Dans un mutant sec6-4, deux types de vésicules de densité et de contenu différents ont été

mises en évidence. Il a été montré que la phosphatase acide, contenue dans les vésicules les

plus denses peut être transportée au bourgeon par l’exocytose polarisée, mais également que

ces vésicules sont capables de fusionner à n'importe quel endroit avec la membrane plasmique

(Harsay & Bretscher, 1995). Il a été proposé que d’autres protéines sécrétées accumulées dans

les mutants de sécrétion non impliquées dans l'expansion de surface tels que l’#-galactosidase

et plusieurs perméases (sulfate, galactose et arginine perméases), doivent être présentes dans

ces vésicules denses contenant l'invertase, mais pas dans celles contenant Bgl2p et Pma1p

(Govindan et al., 1995; Liu & Bretscher, 1992). Ainsi, Rgd1p est peut être en partie associée

aux vésicules les plus denses capables. Ces vésicules produites en masse dans le mutant sec6-

4 seraient présentes dans le cytoplasme et certaines pourraient fusionner avec la membrane

plasmique à l’apex du bourgeon ou à n’importe quel endroit lorsque la croissance polarisée

79

Figure II-12 : Modélisation de l’organisation de l’anneau de septines en forme de « sablier » au

cou du bourgeon (Vrabioiu et Mitchison (2007), J Mol Biol, 372, p37)

est défectueuse. Cette hypothèse expliquerait aussi l’augmentation de la proportion de

protéine Rgd1p associée à la membrane plasmique dans les mutants sec4-2 et sec6-4.

D. Localisation de Rgd1p au niveau du cou du bourgeon

1. Généralités sur la cytocinèse chez S. cerevisiae

La cytocinèse est un processus cellulaire qui permet la séparation de la cellule mère et

de la cellule fille en fin de division cellulaire (Longtine & Bi, 2003). Ce processus implique

de nombreux mécanismes dont les actions doivent être correctement coordonnées. Les

septines sont les acteurs principaux de la coordination des mécanismes conduisant à la

cytocinèse ; ce sont des protéines associées au GTP, produites tout au long du cycle cellulaire

(Longtine et al., 1996).

Dès le début du cycle cellulaire, les 5 septines de la levure S. cerevisiae (Cdc3p,

Cdc10p, Cdc11p, Cdc12p et Shs1p/Sep7p) sont produites et localisées au futur site

d’émergence du bourgeon. Lors de l’émergence du bourgeon, les septines vont former un

collier en forme de sablier (« Hourglass ») (Figure II-12) au niveau du futur cou du bourgeon

(Vrabioiu & Mitchison, 2007). Au cours de la croissance du bourgeon, les septines vont

intervenir dans plusieurs points de contrôle du cycle cellulaire (Castillon et al., 2003) ou

encore dans l’orientation du fuseau de microtubules (Kusch et al., 2002) et participer au

recrutement de nombreux facteurs impliqués dans le trafic intracellulaire et la cytocinèse.

Ainsi, le moteur myosine de type II, Myo1p, qui permettra la contraction de l’anneau

d’actomyosine est recruté pendant la phase G1 (Bi et al., 1998). La protéine à domaine F-

BAR Hof1 et la protéine Cyk3, possédant toutes deux un domaine SH3 sont recrutées au

niveau du cou du bourgeon grâce aux septines et semblent intervenir dans la coordination de

la contraction de l’anneau d’actomyosine et la formation du septum (Bi, 2001). Les chitine

synthases sont associées à l’anneau de septines et vont synthétiser la chitine qui formera le

septum et la cicatrice de bourgeonnement (DeMarini et al., 1997). L’anneau de septines est

également responsable du recrutement de marqueurs de l’exocytose et de SNAREs, pour

permettre l’apport et l’extension des membranes au niveau du cou du bourgeon, afin de

séparer les cellules mère et fille (Lipschutz & Mostov, 2002).

Au moment de l’anaphase, un anneau d’actomyosine, composé de F-actine nucléée par

la formine Bnr1p et du moteur myosine de type II, Myo1p est assemblé au niveau de l’anneau

80

a)

b)

c)

d)

Figure II-13 : Déroulement de la cytocinèse chez la levure Saccharomyces cerevisiae.

a) L’anneau de septines est localisé au cou du bourgeon, l’anneau d’actomyosine est assemblé,

les chitine-synthases sont attachées à l’anneau de septines et l’anaphase est terminée.

b) L’anneau d’actomyosine se contracte et les chitine-synthases forment le septum primaire.

c) L’anneau d’actomyosine se contracte entièrement, l’anneau de septines se scinde en deux, les

membranes fusionnent et les chitine synthases forment le septum secondaire.

d) Les chitinases de la cellule fille dégradent l’excès de chitine.

(Bi (2001), Cell Struct&Func, 26, p529)

de septines (Bi et al., 1998). Le collier de septines se sépare en deux anneaux distincts situés

de part et d’autre du cou dans la cellule mère et dans la cellule fille, La cytocinèse débute lors

de l’action concertée de l’anneau d’actomyosine qui entame sa contraction, grâce à Myo1p et

des chitines synthases qui forment le septum primaire en formant une couche de chitine dans

l’espace périplasmique au niveau du cou (Schmidt et al., 2002). Cela conduit à un

rétrécissement du cou du bourgeon, qui favorise également l’exocytose permettant de ce fait

l’apport de membranes au niveau du cou. Lorsque les membranes du cou sont suffisamment

proches, les complexes proteiques de types SNAREs permettent la fusion des membranes et la

fermeture du cou (Joo et al., 2005). Les chitine synthases remplissent de chitine la zone

intermembranaire comprise entre la cellule mère et la cellule fille, formant ainsi le septum

secondaire. Les deux cellules sont alors totalement isolées (Schmidt et al., 2002). La

séparation des deux cellules a lieu grâce à l’action de chitinases, spécifiquement produites par

la cellule fille qui dégraderont l’excès de chitine déposé pendant la formation du septum

primaire (Bidlingmaier et al., 2001) (Figure II-13).

2. Rgd1p interagit avec de nombreux acteurs de la cytocinèse

Pour permettre la contraction de l’anneau d’actomyosine et initier le démarrage de la

cytocinèse, Hof1p localisée au niveau de l’anneau d’actomyosine est phosphorylée,

ubiquitinylée et rapidement dégradée par le proteasome (Blondel et al., 2005). Hof1p interagit

avec la formine Bnr1p, uniquement en présence de Rho4p liée au GTP (Kamei et al., 1998). Il

a été décrit que Rgd1p interagit physiquement avec Hof1p en double hybride (Yu et al.,

2008). Rgd1p a également été identifiée au sein du complexe de la septine Cdc12p, mais cette

interaction n’est pas retrouvée avec les autres septines (Ho et al., 2002). De plus,

l’inactivation des gènes non essentiels RGD1 ou HOF1 présente un phénotype de létalité

synthétique avec MYO1, ce qui montre un lien génétique entre RGD1 et MYO1 (Roumanie et

al., 2000) ainsi qu’entre HOF1 et MYO1 (Vallen et al., 2000). On peut donc proposer que

sous l’action de Rgd1p, Rho4p hydrolyse le GTP et libère Bnr1p de son interaction avec

Hof1p, ce qui a pour conséquence la contraction de l’anneau d’actomyosine (Lefebvre et al.,

2009). D’autre part, RGD1 interagit génétiquement avec BNI4 (Lesage et al., 2005), dont le

produit est nécessaire à l’attachement des chitine synthases à l’anneau de septines,

responsables de la synthèse de la couche de chitine formant la cicatrice de bourgeonnement.

81

Temps (min) après

élimination du

facteur alpha.

A

B

Figure II-14 : A) Distribution de Rgd1-3GFP dans un souche synchronisée avec le facteur alpha.

Les phases du cycle cellulaire ont été déterminées à l’aide de la morphologie des cellules et de la

position du noyau marqué au DAPI.

B) En haut : Projection moyenne d’un ensemble de 10 plans en z d’une cellule montrant un

anneau de Rgd1 au niveau du cou du bourgeon

En bas : Rgd1p forme un seul anneau de diamètre variable.

Bni4p interagit avec la phosphatase Glc7p (Kozubowski et al., 2003), alors que Rgd1p

interagit avec l’une de ses sous-unités régulatrices Bud14p (voir chapitre I-D).

Rgd1p interagit physiquement et génétiquement avec un grand nombre d’acteurs de la

cytocinèse, ce qui suggère un rôle de Rgd1p dans cette étape du cycle cellulaire.

Dans cette partie, nous étudierons la localisation de Rgd1p au niveau du cou au cours

du cycle cellulaire, puis nous étudierons le rôle d’acteurs de la cytocinèse dans le recrutement

de Rgd1p au niveau du cou du bourgeon.

3. La localisation de Rgd1p au cou du bourgeon dépend-t-elle

du cycle cellulaire ?

a) A quelle phase du cycle cellulaire Rgd1p est-elle localisée au cou du

bourgeon ?

Sur des cultures asynchrones, Rgd1p est localisée au niveau du cou du bourgeon dans

les cellules en fin de division, d’après la morphologie et la taille du bourgeon. Afin de

préciser l’étape du cycle concernée par la localisation de Rgd1p au niveau du septum, la

culture d’une souche de signe sexuel MATa exprimant Rgd1-3GFP a été synchronisée avec le

facteur alpha pendant 2 heures. Les cellules sont ensuite rincées et placées dans un milieu

frais, sans facteur alpha. Toutes les 15 minutes, un échantillon est observé au microscope à

fluorescence. En parallèle, un échantillon est fixé au formaldéhyde puis marqué au DAPI afin

de déterminer précisément la phase du cycle en fonction de la morphologie et la position du

noyau. Il nous a été impossible de réaliser un co-marquage DAPI/GFP car la GFP ne

fluoresce plus une fois les cellules fixées.

En réponse aux phéromones sexuelles, les cellules de levures haploïdes acquièrent une

morphologie particulière appelée shmoo en stoppant le cycle cellulaire en phase G1, en vue de

se préparer à la conjugaison (Figure II-14A). Dans les cellules en forme de shmoo, Rgd1p est

localisée à l’extrémité du pôle (Narayanaswamy et al., 2009). Lors de notre expérience, nous

avons retrouvé cette localisation pendant les 30 minutes qui ont suivi le transfert dans le

nouveau milieu ne contenant plus de facteur alpha, ce qui correspond au temps de latence

nécessaire pour le redémarrage du cycle, puis Rgd1p est relocalisée au niveau du site de

bourgeonnement et forme un croissant apical pendant les phases G1 et S. En phase G2, une

localisation non polarisée est observable, le croissant au fond du bourgeon a presque disparu

et aucun signal n’est détecté au niveau du cou du bourgeon. Ce n’est que lors de la phase

82

mitotique que Rgd1p est observable sous forme d’un seul anneau au niveau du cou du

bourgeon (Figure II-14B). Selon les cellules, la taille de l’anneau varie, ce qui suggère que

l’anneau de Rgd1p est capable de se contracter, contrairement aux anneaux de septines. Cela

suggère que cet anneau de Rgd1p n’est probablement pas associé aux septines, présentes sous

la forme de deux anneaux en fin de division, mais plus probablement à l’anneau contractile

d’actomyosine.

Lors des phases G1 et S, la grande majorité de la population présente une localisation

apicale de Rgd1p. La localisation au cou du bourgeon est observable dans seulement 25% à

30% de la population et pendant uniquement 15 à 30 minutes (t1h15 à 1h45 correspondant à

la phase M) alors que le reste de la population présente une localisation non polarisée de

Rgd1-3GFP. Cela indique que la localisation de Rgd1p au niveau de l’anneau est de courte

durée. De plus, nous observons une certaine hétérogénéité de morphologie des cellules qui

indique que la synchronisation n’est pas parfaite.

b) A quelle étape de la phase mitotique Rgd1p est-elle localisée au cou ?

Les septines, assemblées sous forme d’anneau au niveau du cou, jouent un rôle

prépondérant dans la croissance polarisée, de la sélection du site de bourgeonnement jusqu’à

la cytocinèse (Longtine & Bi, 2003). De plus, il est probable que Rgd1p soit localisée au

niveau de l’anneau d’actomyosine, mais recrutée au niveau du cou par l’influence des

septines. Nous avons voulu positionner plus finement l’anneau formé par Rgd1p par rapport

aux anneaux de septines. Lors des observations réalisées toutes les 15 minutes sur une culture

synchronisée de la souche produisant Rgd1-3GFP, il était difficile d’observer une forte

proportion de cellules montrant Rgd1p localisée sous forme d’anneau au niveau du cou,

probablement en raison de la rapidité du phénomène. Pour cela, nous avons co-

immunolocalisé Rgd1-6HA, la sous-unité Cdc11p de l’anneau de septines et marqué le noyau

au DAPI dans une culture synchronisée en fixant des échantillons toutes les 15 minutes

pendant les phases G1 et S, puis toutes les 5 minutes aux temps correspondant aux phases

G2/M (entre 1h15 et 1h30 après l’élimination du facteur alpha). Rgd1-6HA a été localisée à

l’aide d’un anticorps primaire de rat anti-HA et d’un anticorps secondaire anti-anticorps de rat

couplé au fluorophore rouge : cyanine 3 (Cy3), la septine Cdc11p a été localisée à l’aide d’un

anticorps primaire de lapin anti-Cdc11 et d’un anticorps secondaire anti-anticorps de lapin

couplé au fluorophore vert : FITC.

83

Figure II-15 : Rgd1p est localisée entre les deux anneaux de septines à l’anaphase. Par

immunolocalisation, Rgd1p (en rouge) apparait localisée entre les anneaux de septines (en vert).

Le noyau (en bleu) est totalement séparé et est présent aux extrémités opposées chez la cellule

fille et la cellule mère. La position du noyau est caractéristique de l’anaphase.

Lors de l’observation des cellules au microscope à fluorescence, nous avons recherché

les cellules où Rgd1p était localisée au niveau de l’anneau puis pris une succession de 21

images dans l’axe vertical z (z stack). Cette acquisition a été répétée avec 3 filtres différents,

permettant de visualiser successivement le marquage avec la cyanine 3, le FITC et le DAPI.

Ce travail a été réalisé à l’institut de génétique et microbiologie de l’Université Paris Sud 11,

aves l’aide de Marie Hélène Cuif et Magali Prigent.

Les images ont ensuite subies trois itérations de déconvolution afin d’optimiser le

rapport signal/bruit, puis ont été assemblées afin de pouvoir visualiser les 3 marquages sur la

même image.

La faiblesse du signal de fluorescence obtenu pour le marquage anti-HA (Rgd1p) ne

permet pas d’établir des données statistiques solides quant à la répartition de Rgd1p au cours

des phases G2/M. Sur le plan qualitatif, une trentaine de cellules où Rgd1p était localisée au

cou du bourgeon a été analysée (Figure II-15). L’anneau de Rgd1p est toujours localisé entre

les deux anneaux de septines et ne peut s’observer que lorsque les noyaux sont déjà séparés

dans chacune des cellules, soit à un stade avancé de l’anaphase. La localisation tardive de

Rgd1p au niveau de l’anneau nous amène à penser que Rgd1p interviendrait dans les étapes

tardives de la cytocinèse. Rgd1p pourrait activer l’hydrolyse du GTP par Rho4p au niveau de

l’anneau d’actomyosine et ainsi libérer la liaison Hof1p / Bnr1p et ainsi permettre la

contraction de l’anneau d’actomyosine et la mise en place du septum.

4. Comment Rgd1p est-elle recrutée au niveau du cou ?

De nombreux acteurs de la cytocinèse, comme Hof1p, sont recrutés par l’anneau de

septines (Bi, 2001). Bien que la localisation de Rgd1p en un anneau unique ne semble pas être

associée aux septines, la purification de complexes utilisant les différentes septines comme

proies a permis d’identifier Rgd1p dans le complexe associée à Cdc12p, mais pas dans les

complexes associées aux autres septines (Ho et al., 2002). De plus, la protéine Hof1p,

interagissant en double hybride avec Rgd1p dans des cribles globaux (Yu et al., 2008), est

recrutée par l’anneau de septine, mais localisée au niveau de l’anneau d’actomyosine lors des

premiers stades de la mitose (Lippincott & Li, 1998). Afin de déterminer si les septines et

Hof1p sont nécessaires au recrutement et à la formation de l’anneau de Rgd1p, nous avons

observé la localisation de Rgd1-3GFP dans le mutant de septine cdc12-1 et le mutant hof1!.

Nous avons également réalisé des tests d’interactions double-hybride entre Rgd1p et les

protéines Cdc12 et Hof1.

84

A

B

Figure II-16 : Interactions entre Rgd1p et la septine Cdc12p

A) Localisation de Rgd1-3GFP dans le mutant cdc12-1.

B) Test d’interaction entre Rgd1p et Hof1p en double hybride. Le gène rapporteur HIS3 est

placé sous le contrôle du promoteur GAL10. Si les deux partenaires interagissent, une croissance

est observée milieu SD-TLH. Chaque numéro correspond à des transformants indépendants.

Pour chaque clone, trois gouttes correspondant à des dilutions sériées de 10 ont été déposées. Le

symbole (+) indique la souche transformée par pODB80 Rgd1 +pACT2 Rgd1.

a) Interaction avec les septines.

Dans un mutant cdc12-1, les cellules ont une morphologie particulière à température

permissive (Sheu et al., 2000). En effet, la croissance apicale du bourgeon est correctement

initiée, mais la croissance isotropique n’a pas lieu, ce qui conduit à la formation de bourgeons

très allongés. Dans le mutant de septine cdc12-1, Rgd1-3GFP est localisée au fond du

bourgeon mais n’est jamais observée au niveau du cou du bourgeon à température non

permissive (3h à 38°C) (Figure II-16A). Ce résultat suggère que Rgd1p, tout comme Hof1p,

est recruté au niveau du cou par l’anneau de septine.

Nous avons alors cherché à savoir si Rgd1p pouvait interagir directement avec la

septine Cdc12p. En utilisant le système double hybride, nous n’avons pas mis en évidence

d’interaction entre Rgd1p et Cdc12p (Figure II-16B). Il est donc probable qu’un autre

membre du complexe serve d’adaptateur entre l’anneau de septines et Rgd1p afin de

permettre le recrutement de Rgd1p au niveau du cou. Cependant, d’après la littérature, aucun

membre de ce complexe « Cdc12 » n’a été identifié comme pouvant interagir directement

avec Rgd1p.

b) Comment Rgd1p et Hof1p interagissent-elles ?

Afin de déterminer si l’interaction de Rgd1p avec Hof1p était nécessaire au

recrutement et à la formation de l’anneau de Rgd1p au niveau du cou, la localisation de Rgd1-

3GFP a été examinée dans un mutant hof1!. Dans ce mutant, la localisation de Rgd1p est

fortement perturbée au niveau du cou (2% ± 2) et au niveau du fond du bourgeon (11% ± 4)

par rapport à la souche de référence (14% ± 5 et 52% ± 1 respectivement) (Figure II-17A).

La proportion de cellules présentant Rgd1-3GFP localisée soit au cou, soit au fond du

bourgeon est diminuée de 80% dans le mutant hof1! par rapport à la souche de référence. De

plus, la morphologie cellulaire du mutant hof1! est très fortement perturbée (Figure II-17B).

Cela ne permet de pas de conclure ici à un effet direct de l’interaction de Hof1p sur le défaut

de localisation de Rgd1p.

Cependant, nous avons vérifié l’interaction entre ces deux protéines en utilisant le

système double hybride. Comme décrit dans la littérature, les formes entières de Rgd1p et de

Hof1p fusionnées au domaine activateur (GAL4AD) ou au domaine de liaison à l’ADN

(GAL4DB) de GAL4 interagissent de façon réciproque (Ito et al., 2001).

85

A B

Visible Fluorescence

Rgd1-3GFP

pACT2

Hof1p Rgd1p F-BAR de Hof1p Hof1-!F-BAR

Hof1p + + + N/D

Rgd1p ++ ++ ++ -

F-BAR de Hof1p N/D ++ N/D -

F-BAR de Rgd1p + + + -

pODB80

C

Figure II-17: Interactions entre Rgd1p et Hof1p.

A) La localisation de Rgd1-3GFP est fortement perturbée au fond et au cou du bourgeon dans un

mutant hof1!.

B) La morphologie du mutant hof1! est fortement altérée.

C)L’interaction physique entre Rgd1p et Hof1p semble se faire par une hétérodimérisation de

leur domaine F-BAR. Par l’approche double-hybride, les domaines F-BAR des deux partenaires

interagissent ; de plus, la forme délété pour le domaine F-BAR de Hof1p n’interagit pas ni avec

les domaines F-BAR de Hof1p et Rgd1p, ni avec la formes entière de Rgd1p. ((+) et (++) :

pousse plus ou moins forte des souches sur milieu SD-TLH ; (-) : pas de pousse des souches sur

milieu SD-TLH ; N/D : non déterminé)

Hof1p est une protéine à domaine F-BAR. S’il est connu que la reconnaissance de

courbure membranaire ou les capacités de former des tubules de membranes, des protéines à

domaine F-BAR passent souvent par une homodimérisation, les exemples d’hétérodimères de

protéines à domaine F-BAR sont beaucoup plus rares. Le seul exemple proposé à l’heure

actuelle concerne les protéines humaines FCHO1 et FCHO2 (pour FCH Only). Ces protéines

très proches, de fonction inconnue, seraient capables de former des hétérodimères (Henne et

al., 2007), (www.endositosis.org/F-BAR_proteins/FCHo1.html). Chez les protéines à

domaine BAR, les exemples d’hétérodimerisation sont également très rares. Les seuls cas

décrits dans la littérature sont la formation d’hétérodimères Rvs161/Rvs167p (Friesen et al.,

2006), impliqués dans l’endocytose et la formation d’hétérodimères amphiphysine 1/

amphiphysine 2 (Wigge et al., 1997), intervenant dans le trafic des vésicules synaptiques.

Nous avons cherché à préciser les domaines d’interactions de Rgd1p et Hof1p par

analyse en double-hybride.

Des formes tronquées de Rgd1p et Hof1p ont été utilisées afin de déterminer le

domaine responsable de cette interaction (Figure II-17C). La construction GAL4DB-F-BAR

de Rgd1p interagit avec GAL4AD-F-BAR de Hof1p alors que la construction GAL4AD

Hof1!F-BAR n’interagit ni avec le domaine F-BAR de Rgd1p ni avec la protéine Rgd1p

entière. Cela montre que l’interaction entre Rgd1p et Hof1p aurait lieu par leur domaine F-

BAR respectifs. Cette interaction pourrait permettre le recrutement de Rgd1p au niveau du

cou.

5. Conclusion

Lors des observations en imagerie sur cellule vivante ou en immunofluorescence de la

localisation de Rgd1p au cours du cycle cellulaire, la proportion maximale de cellules ayant

un anneau de Rgd1p ne dépasse pas 50% sur un intervalle de 15 minutes. Pour tenter

d’augmenter cette proportion, d’autres approches de synchronisation sont envisageables.

Toutes les méthodes de synchronisation ont des impacts sur la croissance et la polarité des

cellules, nous avions choisi d’utiliser le facteur alpha car ses effets nous semblaient les moins

préjudiciables, sur la polarité cellulaire. A part la forme de shmoo, présente pendant les 30

premières minutes après le rinçage, la polarité ne semble pas altérée. Or, très récemment, BA

Young et coauteurs (Young et al., 2009) ont réussi à obtenir plus de 70% de cellules en

cytocinèse sur un intervalle de 15 minutes en inhibant la kinase de sortie de mitose Cdc15p.

Un allèle thermosensible cdc15-1 peut être utilisé pour synchroniser une culture cellulaire en

86

Figure II-18: Abondance de Rgd1 au cours du cycle cellulaire. Sur une culture de cellules

produisant Rgd1-6HA synchronisée au facteur alpha, des échantillons sont prélevés à intervalles

réguliers après l’élimination du facteur alpha et analysés en western blot.

phase G2/M. Nous avions écarté cette solution en raison des effets du choc thermique sur le

cytosquelette d’actine et la polarité cellulaire. Young et co-auteurs utilisent l’allèle particulier

Cdc15L99G ; qui est inhibé par l’analogue de l’ATP 1NaPP1. Cette méthode de

synchronisation a l’avantage d’éviter un stress thermique aux cellules et permet de bloquer le

cycle à une étape très proche de la mitose, contrairement au facteur alpha qui bloque le cycle

cellulaire en fin de phase G1. Ainsi, la qualité de la synchronisation lors de la mitose doit être

plus importante qu’avec le facteur alpha.

En observant la position du noyau, nous avons pu déterminer que la localisation de

Rgd1p sous forme d’anneau au cou du bourgeon avait lieu lors de l’anaphase. Cette

localisation correspond au moment du cycle où la contraction de l’anneau d’actomyosine doit

débuter. Lors de l’anaphase, Rgd1p serait recrutée au niveau de l’anneau d’actomyosine du

cou du bourgeon en interagissant avec Hof1p via l’hétérodimérisation de leur domaine F-

BAR. Afin de mettre en évidence cette interaction in vivo, il serait intéressant d’examiner la

localisation de Rgd1-3GFP dans une souche dont domaine F-BAR de Hof1p aurait été délété.

Lorsque l’anaphase est achevée, Rgd1p doit agir sur Rho4p qui à son tour mettrait fin à

l’interaction entre Hof1p et Bnr1p. Le contrôle du déclenchement de la contraction en fin

d’anaphase se fait en partie par la kinase Aurora Ipl1p, via la voie « NoCut » (Norden et al.,

2006). On peut également penser que la localisation de Rgd1p au cou du bourgeon est

dépendante de son niveau de phosphorylation. En effet, nous avons montré dans le chapitre I

(Figure I-16) que la localisation ponctuée de Rgd1-3GFP observée dans le mutant de kinase

ipl1-321 semblait apparaître au détriment de la localisation de Rgd1p au niveau du cou du

bourgeon. De plus, Ipl1p étant inactivée lors de l’anaphase (Norden et al., 2006) et Glc7p, la

phosphatase antagoniste d’Ipl1p, interagissant avec Bni4p, un élément du septum

(Kozubowski et al., 2003), nous pouvons proposer que ce soit la déphosphorylation de Rgd1p

qui joue un rôle dans la localisation au niveau du cou.

E. Etude de l’abondance de la protéine Rgd1p au cours du cycle

cellulaire.

La protéine Rgd1p est localisée à des sites distincts de la cellule dans l’espace et le

temps au cours du cycle cellulaire. Cette protéine doit subir une régulation très fine à

différents niveaux pour assurer correctement sa fonction sur les protéines Rho3 et Rho4. Nous

87

Pro

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n d

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Figure II-19: Vitesse de synthèse de Rgd1 au cours du cycle cellulaire. Une culture de cellules

produisant Rgd1-6HA est synchronisée au facteur alpha. Apres élimination du facteur alpha, des

échantillons sont prélevés à intervalles réguliers et incubés 10 minutes en présence de

méthionine 35S. A la fin des 10 minutes, les cellules sont lysées, Rgd1-6HA est

immunoprécipitée, les protéines sont séparées par électrophorèse SDS-PAGE et la radioactivité

et révélée par autoradiographie.

Le contrôle présent sur la piste de gauche est une souche BY4742 de référence non étiquetée

pour Rgd1p.

avons déjà montré que certains éléments tels les phospholipides étaient capables d’influer sur

l’activité RhoGAP de Rgd1p ainsi que sur sa régulation spatio-temporelle. La

phosphorylation est très probablement un autre signal permettant la régulation de Rgd1p.

De nombreuses protéines sont régulées par rapport à leur abondance. C’est par

exemple le cas de Hof1p qui est rapidement dégradée lors de la télophase (Vallen et al.,

2000). Lorsque l’on synchronise une culture de la souche Rgd1-3GFP avec du facteur alpha,

les localisations de Rgd1p au bourgeon et au cou disparaissent presque complètement durant

la phase G2. Afin de comprendre comment Rgd1p est régulée dans la cellule au cours du

cycle cellulaire, nous avons cherché dans un premier temps à étudier l’abondance de la

protéine Rgd1 au cours du cycle cellulaire. En effet, il est possible de proposer deux

hypothèses permettant d’expliquer l’origine de la population de protéines Rgd1 formant le

croissant apical et l’anneau du cou du bourgeon. On peut penser que la protéine est soit

dégradée lorsque son action au bourgeon est terminée, puis néo-synthétisée pour former

l’anneau lors de l’anaphase, soit elle subit une relocalisation entre les deux sites.

Pour répondre à cette question, nous avons étudié l’abondance de Rgd1p ainsi que le taux

de synthèse et la stabilité de la protéine au cours du cycle cellulaire.

1. Abondance de la protéine Rgd1

L’abondance a été mesurée par Western blot à partir de cellules synchronisées

provenant d’une souche produisant Rgd1-6HA. Toutes les 15 minutes après l’élimination du

facteur alpha, 3 U DO ont été prélevées et analysées. La quantité totale de Rgd1p est

normalisée par rapport à l’actine, présente en quantité constante au cours du cycle. Au cours

du cycle cellulaire, l’abondance semble relativement stable (Figure II-18). Nous avons

quantifié les signaux de Western blot obtenus et constaté que l’abondance de Rgd1p au cours

du cycle cellulaire ne présentait que quelques variations non significatives.

2. Synthèse de Rgd1p au cours du cycle

Pour étudier la synthèse, la souche MATa produisant Rgd1-6HA a été synchronisée au

facteur alpha pendant 2 h avec du milieu SD-met. Le facteur alpha est ensuite éliminé et les

cellules sont reprises dans du milieu SD-met à 30°C. A différents temps (t=0, 20' (fin G1) ,45'

(milieu S), 1h15 (G2), 1h30 (M), 1h45(G1 du second cycle)), une partie de la suspension

88

Souche RGD1-6HA

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Figure II-20: Stabilité de Rgd1p au cours du temps.

Une culture asynchrone d’une souche produisant Rgd1-6HA a été incubée 10 minutes en

présence de Méthionine et de Cystéine 35S. Apres une chasse avec de la méthionine non

radioactive, des échantillons sont prélevés à intervalles réguliers, les cellules sont lysées, Rgd1-

6HA est immunoprécipitée, les protéines sont séparées par électrophorèse SDS-PAGE et la

radioactivité est révélée par autoradiographie.

Le contrôle présent sur la piste de gauche est une souche BY4742 de référence non étiquetée

pour Rgd1p.

cellulaire est incubée en présence d'un mélange de Méthionine + Cystéine [35S] pendant 10

min, puis du TCA 10 % est ajouté afin de bloquer le métabolisme. Les cellules sont lysées,

Rgd1-6HA est immunoprécipitée à l’aide d’anticorps anti HA. Après une séparation des

protéines par électrophorèse SDS-PAGE, la radioactivité est révélée par autoradiographie puis

quantifiée par la suite (Figure II-19).

Entre les points t0 et 20 minutes, le taux de synthèse de Rgd1p est similaire. A partir

du point 45 minutes, le taux de synthèse semble augmenter de façon constante jusqu’à la fin

du cycle cellulaire, au point 1h30. Au temps 1h45 correspondant à la fin du premier cycle et

au début du second, le taux de synthèse diminue légèrement.

Cette expérience est réalisée en prélevant un volume constant et non une quantité

égale de cellules. L’augmentation de la vitesse de synthèse au cours du cycle peut s’expliquer

par l’augmentation, dans la culture, de la biomasse au cours du temps.

3. Stabilité de la protéine Rgd1

Pour estimer la stabilité de la protéine, une culture asynchrone en phase exponentielle

de croissance d’une souche exprimant Rgd1-6HA au locus est cultivée en milieu contenant de

la méthionine [35S] pendant 10 minutes. Après une chasse de la radioactivité par ajout de

méthionine froide, des fractions aliquotes sont prélevées à intervalles réguliers, Rgd1-6HA est

immunoprécipitée et la radioactivité incorporée est mesurée par autoradiographie. Dans toutes

les pistes, un signal radioactif correspondant à Rgd1p est clairement visible (Figure II-20).

Même 1h45 après la chasse, le signal radioactif correspondant à Rgd1-6HA reste élevé, ce qui

montre une stabilité importante de la protéine.

Cela signifie que l’hypothèse d’une relocalisation de Rgd1p entre les phases G1/S

(bourgeon) et G2/M (anneau) est envisageable.

4. Conclusion et perspectives

Les études menées sur l’abondance, la stabilité et la vitesse de synthèse de Rgd1p

montrent que ces caractéristiques de Rgd1p ne sont pas des éléments déterminants pour la

régulation spatiotemporelle de la RhoGAP.

L’augmentation du taux de synthèse observée au cours du cycle pourrait être en

relation avec l’augmentation du nombre de cellules. Le taux de synthèse serait donc constant

89

au cours du cycle cellulaire, ce qui permettrait de maintenir une quantité de protéine constante

dans la cellule au cours de la croissance.

La stabilité importante de la protéine Rgd1p et sa synthèse constante au cours du cycle

suggèrent en fait que l’anneau de Rgd1p est composé d’une population de protéines déjà

présente dans la cellule, c'est-à-dire suite à une relocalisation de Rgd1p, mais également

issues d’une population de protéines récemment synthétisées.

Pour répondre à cette question, il est envisageable d’utiliser les propriétés particulières

de la protéine fluorescente Kaede. Cette protéine issue du corail a la particularité d’émettre sa

fluorescence dans le vert, comme la GFP, mais une excitation UV entre 300 et 350 nm

entraine un clivage de la protéine, qui provoque un changement de son spectre d’émission et

elle émet alors dans le rouge (Field & Matz, 2009; Tomura et al., 2008). Ainsi, après avoir

étiqueté Rgd1p avec la protéine Kaede, des cellules en phase G1 ou S seront excitées afin de

faire émettre la Kaede dans le rouge. Si en phase G2/M, l’anneau de Rgd1p fluoresce en

rouge, cela signifie qu’il est issu de la relocalisation de Rgd1p, s’il est vert, cela signifie qu’il

est composé de protéines néo-synthétisées. Dans notre hypothèse, nous devrions obtenir un

anneau jaune, combinant les deux longueurs d’onde d’émission de la protéine Kaede.

90

CONCLUSION

CONCLUSION

Les cellules polarisées subissent de larges changements et réarrangements

moléculaires de façon concertée dans l’espace et dans le temps, conduisant à la réorganisation

des composants cellulaires selon l’axe de la croissance polarisée. Les mécanismes de la

polarité cellulaire sont importants à la fois pour la croissance et la division cellulaire et pour

des processus spécialisés de croissance polarisée, comme la morphogenèse neuronale, la

motilité cellulaire ou la différentiation asymétrique de cellules souches.

La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae est un excellent modèle d’étude

de la croissance polarisée, capable de se réorganiser différemment lors de la croissance

végétative, lors de la reproduction sexuée ou lors de la filamentation. Chacun de ces types de

croissance est caractérisé par une morphologie particulière, impliquant des voies de

signalisation différentes, en réponse à des stimuli spécifiques.

Après avoir surtout travaillé sur les protéines Rho et leurs cibles, certaines équipes,

dont la nôtre, travaillent actuellement sur les mécanismes de régulation de ces interrupteurs

moléculaires. Les protéines Rho étant régulées par des protéines GEF et des protéines

RhoGAP, nous cherchons à connaître quels sont les mécanismes qui régulent ces régulateurs.

Chez la levure, les GTPases Rho3p et Rho4p interviennent dans la croissance végétative ;

elles doivent agir respectivement dans la croissance isotropique du bourgeon et la cytocinèse.

Ces deux protéines de la famille Rho sont régulées par le même régulateur négatif : la

protéine RhoGAP à domaine F-BAR, Rgd1p. Elle doit être également finement régulée de

façon à pouvoir agir sur Rho3p et Rho4p au moment opportun et au lieu adéquat au cours du

cycle cellulaire. Nous avons étudié la régulation de cette protéine RhoGAP à domaine F-BAR

chez la levure S. cerevisiae, avec pour objectif de mieux comprendre le rôle du domaine F-

BAR sur la régulation des protéines Rho dans la croissance polarisée.

Au cours de ce travail de doctorat, nous avons étudié tout d’abord les effets que

pouvaient avoir Rgd1p sur les cytosquelettes d’actine et de microtubules. Dans une seconde

partie, nous nous sommes intéressés aux différents signaux capables de réguler Rgd1p, soit au

niveau de son activité RhoGAP, soit au niveau de sa localisation.

Dans tous les types de croissance, nous avons pu mettre en évidence la présence de

Rgd1p au niveau du site de croissance. Lors de la croissance végétative, Rgd1p est localisée

au fond du bourgeon pendant les phases de croissances apicale et isotropique, puis au niveau

91

du cou du bourgeon lors de la cytocinèse. Lors du croisement, Rgd1p est localisée à la pointe

du shmoo (Narayanaswamy et al., 2009), enfin, lors de la croissance filamenteuse, nous avons

montré au laboratoire que CaRgd1p, l’orthologue de ScRgd1p, était localisée à l’extrémité des

hyphes chez la levure pathogène opportuniste de l’Homme Candida albicans (publication en

préparation). Nous avons également montré que cette localisation est dépendante du domaine

F-BAR dans la cellule de levure en croissance. Chez l’Homme les protéines RhoGAP à

domaine F-BAR srGAP2 et ArhGAP4 sont également localisées au niveau des sites de

croissances des cellules neuronales. srGAP2 est localisée grâce à son domaine F-BAR au

niveau de filopodes (Guerrier et al., 2009) et ArhGAP 4 est localisée au niveau du leading

edge, la frange membranaire qui guide la migration cellulaire (Vogt et al., 2007). Cela

confirme la forte implication de Rgd1p et de ses orthologues dans la croissance polarisée.

Le cytosquelette d’actine est un élément capital de la polarité cellulaire. Nous avons

pu mettre en évidence des défauts de dynamique du cytosquelette dans un mutant rgd1!, en

condition de stress acide où Rgd1p est une protéine essentielle. Lors d’un choc acide, le

cytosquelette d’actine se dépolarise rapidement et présente un retard à la repolarisation dans

un mutant rgd1!. Cela montre que Rgd1p doit jouer un rôle dans l’organisation du

cytosquelette d’actine, notamment en condition de stress. Chez l’Homme, les protéines à

domaine F-BAR srGAP2 et srGAP3/MEGAP ont des effets importants sur la dynamique du

cytosquelette d’actine. La surexpression de la protéine srGAP3 entraîne une diminution de la

formation de lamellipodes et de filopodes ; ce phénotype peut être compensée par l’expression

de formes actives des GTPases Rac1 et Cdc42 (Yang et al., 2006). A l’inverse, la

surexpression de la protéine srGAP2 induit la formation de filopodes, alors que la forme de

srGAP2 délétée pour le domaine F-BAR (srGAP2!F-BAR) en est incapable (Guerrier et al.,

2009). Cela montre que les protéines RhoGAP à domaine F-BAR sont capables d’agir sur la

dynamique du cytosquelette, soit en régulant négativement les GTPases via leur domaine

RhoGAP, soit via leur domaine F-BAR. Le domaine F-BAR peut probablement permettre la

formation de courbures membranaires et le recrutement de facteurs impliqués dans la

formation de structures d’actine lors de l’apparition des filopodes. Il est remarquable que

srGAP2 semble avoir un effet activateur sur le cytosquelette d’actine alors que srGAP3

semble plutôt avoir un effet inhibiteur. Ces effets opposés sont certainement le reflet des

actions multiples de différentes protéines Rho sur la croissance polarisée. Chez la levure, nous

avons montré que la délétion de RGD1 a un effet négatif sur la capacité du cytosquelette

d’actine à se repolariser suite à un stress acide. De plus, la présence du domaine F-BAR

92

(Rgd1!GAP(!480-660)), même partielle (délétion du domaine FCH (!1-144)) semble suffire

pour restaurer une repolarisation normale du cytosquelette d’actine, suite à un stress acide.

Cela suggère que Rgd1p aurait un impact activateur sur l’organisation du cytosquelette

d’actine. Il sera intéressant d’observer les cinétiques de dépolarisation / repolarisation du

cytosquelette d’actine en condition de choc acide en délétant entièrement le domaine F-BAR

(Rgd1!F-BAR (!1-300)) ou en surexprimant la forme entière de Rgd1p ou en surexprimant

uniquement le domaine F-BAR entier ou tronqué.

Afin d’étudier la régulation spatiotemporelle de Rgd1p au cours de la croissance

végétative, nous avons étudié les éléments capables d’agir sur la localisation au fond ou au

cou du bourgeon lors de la croissance végétative. Nous avons montré que les phospholipides

jouent un rôle très important sur la régulation de Rgd1p, à la fois sur sa localisation et sur la

régulation de son activité RhoGAP. Les phospholipides, et notamment le PdtIns(4)P et le

PdtIns(4,5)P2 agissent sur la localisation apicale de Rgd1p en interagissant physiquement avec

le domaine F-BAR de la protéine RhoGAP. Ils lui confèrent également une spécificité de

substrat en stimulant son activité RhoGAP vis-à-vis de Rho4p, par l’intermédiaire de la région

adjacente au domaine F-BAR (300-350). Les effets des phospholipides sur la modulation de

l’activité RhoGAP à partir d’un domaine d’interaction présent à proximité du domaine

RhoGAP ont été également retrouvés pour une protéine RhoGAP humaine sans domaine F-

BAR, la protéine DLC1 en relation avec le cancer du foie (Erlmann et al., 2009). Nous avons

montré que le PdtIns(4)P était toujours capable de stimuler l’activité GAP d’une forme de

Rgd1p délétée pour une importante partie de la région N-terminale, comprenant la totalité du

domaine F-BAR, à condition que la protéine Rho4 soit prénylée. Chez l’Homme, il a été

montré très récemment que l’activité GAP de la forme délétée pour une longue région N-

terminale de la protéine DLC1 sur la protéine RhoA était stimulée par le PdtIns(4,5)P2

(Erlmann et al., 2009). Nous voyons donc que les mécanismes intimes de régulation de

l’activité RhoGAP par les phospholipides peuvent être conservés entre la levure et l’Homme.

Nous avons également montré par différentes approches que le trafic intracellulaire, et

plus particulièrement l’exocytose était requise pour permettre la localisation correcte de

Rgd1p. En l’état actuel, nos résultats n’ont pas pu montrer que Rgd1p était associée aux

vésicules d’exocytose pour être localisée au niveau de l’apex du bourgeon. Lorsque

l’exocytose est interrompue, Rgd1p est localisée sous forme de nombreux spots dans la

cellule et nous avons montré par des approches biochimiques que Rgd1p sédimente dans les

mêmes fractions que la membrane plasmique. Sur le plan conceptuel, il est difficile de

93

comprendre comment Rgd1p pourrait s’associer de façon plus importante à la membrane

plasmique dans un mutant affecté pour l’exocytose que dans une souche de référence non

mutée. L’étude au cours du temps de la localisation de Rgd1p dans les mutants sec4-2 et sec6-

4 en condition non permissive, ainsi que l’analyse du fractionnement cellulaire pourront

permettre d’associer Rgd1p aux vésicules sécrétrices pendant une période donnée, avant que

les effets des mutations ne soient trop délétères pour le trafic intracellulaire.

Parmi les priorités de recherche, il va falloir également préciser rapidement les

compartiments membranaires auxquels Rgd1p est associée par des approches fines de

fractionnements. A plus long terme, il faudra définir les types et compositions de membranes

avec lesquels le domaine F-BAR de Rgd1p est capable d’interagir, et quel impact ces

interactions peuvent avoir sur les membranes ou sur l’activité GAP associée. Le domaine F-

BAR est capable de moduler la topologie membranaire et de générer des courbures de

membrane (Frost et al., 2008), il faudra déterminer si le domaine F-BAR de Rgd1p est en

mesure d’établir des courbures de membrane. Nous chercherons à savoir si on peut distinguer

le processus de fixation et d’induction de courbures membranaires, en particulier en

s’appuyant sur la détermination des compositions lipidiques des membranes naturelles

associées à Rgd1p au cours du cycle cellulaire. La protéine Rgd1p possède un domaine

RhoGAP impliqué dans la régulation des GTPases de la famille Rho et un domaine F-BAR,

notamment capable d’interagir avec les membranes. Il sera important d’étudier le dialogue

entre les deux domaines et de déterminer si l’interaction du domaine F-BAR avec les

membranes et si les changements dans la composition lipidique ou la topologie des

membranes peuvent conduire à des variations de l'activité RhoGAP.

Lors de la cytocinèse, Rgd1p est localisée au niveau du cou du bourgeon sous forme

d’un anneau unique et contractile. Il semble que la formation de cet anneau dépende de

l’interaction entre les domaines F-BAR des protéines Rgd1p et Hof1p ainsi que de la présence

de l’anneau de septines. Hof1p est maintenue au niveau de l’anneau d’actomyosine en

interaction avec la formine Bnr1p, sous l’action de Rho4-GTP (Kamei et al., 1998). Au

laboratoire, il a été montré que Rgd1p était phosphorylée in vitro sur son domaine FCH par la

kinase de la famille Aurora Ipl1p (Données non publiées). Nous avons montré que dans le

mutant ipl1-321, la localisation de Rgd1p au niveau du cou du bourgeon était altérée, au profit

d’une nouvelle localisation sous forme de un ou deux points, rappelant fortement la

localisation du Spindle Pole Body (SPB). Les résultats du laboratoire tendent à montrer que

Rgd1p est capable d’interagir in vitro avec les microtubules, via le domaine FCH. Chez

94

l’Homme, la protéine MgcRacGAP, dont le domaine RhoGAP est très proche de celui de

Rgd1p, joue un rôle important lors de mitose en stabilisant le fuseau de microtubules au

niveau du mid-body. L’interaction de MgcRacGAP avec les microtubules semble être

conditionnée par sa phosphorylation via la kinase Aurora B, l’orthologue d’Ipl1p (Pavicic-

Kaltenbrunner et al., 2007). Chez la levure, nous pouvons donc raisonnablement envisager

que la localisation de Rgd1p au niveau du cou soit conditionnée par une interaction fugace

avec les microtubules et la phosphorylation par Ipl1p. Nous pouvons proposer un modèle

d’action de Rgd1p au niveau du cou. Rgd1p serait majoritairement phosphorylée par Ipl1p

tout au long du cycle cellulaire, probablement au niveau des SBP, avec la participation de la

protéine Fyv8. Lors de l’anaphase, Ipl1p est inactivée (Norden et al., 2006) et l’arrêt de la

phosphorylation de Rgd1p pourrait participer à son recrutement par Hof1p, déjà localisée au

niveau de l’anneau d’actomyosine. Le complexe phosphatase Bud14p-Glc7p est recruté au

niveau du cou lors de la cytocinèse et pourrait y déphosphoryler la totalité des protéines

Rgd1p présentes. Le recrutement de Rgd1p par Hof1p au niveau du complexe Hof1p-Bnr1p-

Rho4p-GTP de l’anneau d’actomyosine permettrait de stimuler l’activité GTPasique de

Rho4p afin de rompre l’interaction Hof1p-Bnr1p. Hof1p serait alors ubiquitinylée et dégradée

par le protéasome (Blondel et al., 2005), permettant ainsi le déclenchement de la contraction

de l’anneau d’actomyosine. Afin de déterminer avec précision le rôle de Rgd1p au niveau du

cou du bourgeon, il faudra localiser très précisément la RhoGAP dans l’espace et dans le

temps par rapport à Hof1p et à l’anneau d’actomyosine par des approches d’imagerie.

Ipl1p est une kinase majeure du contrôle des dernières étapes du cycle cellulaire. Bien

que son rôle dans la régulation de la protéine Rgd1 reste encore imprécis, la phosphorylation

de Rgd1p par des acteurs du contrôle du cycle cellulaire permettrait de coordonner les

mécanismes de la polarité cellulaire contrôlés par les protéines Rho avec l’avancée du cycle

cellulaire. Nous avons montré in vitro, que Rgd1p est phosphorylée sur son domaine F-BAR

par Ipl1p. Toutefois, Rgd1p est une protéine multiphosphorylée. En position centrale de

Rgd1p, un site de phosphorylation correspondant à la séquence consensus de phosphorylation

de la kinase cycline dépendante Cdc28p/Cdk1p à été identifié par spectrométrie de masse.

Cdc28p/Cdk1p est entre autres responsable du passage du point de contrôle de la phase G1,

permettant le démarrage de la phase S. La phase S est la phase du cycle où la croissance

isotropique a lieu. Il a été montré que la kinase Cdc28p/Cdk1p phosphoryle la protéine

Rga2p, une des protéines RhoGAP de la GTPase Cdc42p (McCusker et al., 2007). La

phosphorylation de Rga2p et d’autres régulateurs de Cdc42p par Cdc28p/Cdk1p pourrait

95

permettre de coordonner le passage de la phase G1 à la phase S avec le déclenchement de la

croissance isotropique.

Un des challenges important sera de déterminer les mécanismes qui relient la

régulation du cycle cellulaire à la localisation cellulaire spécifique de Rgd1p, donc à son

action spécifique sur les protéines Rho3p et Rho4p, et de ce fait sont action sur la polarité

cellulaire chez la levure en relation avec le cycle cellulaire.

96

REFERENCES

BIBLIOGRAPHIQUES

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PUBLICATIONS

Liste des publications

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Phosphoinositides affect both the cellular distribution and activity of the F-BAR-containing RhoGAP Rgd1p in yeast. J Biol Chem. 2008 Nov 28;283(48):33249-57.

F. Lefebvre*, V. Prouzet-Mauléon*, A. Vieillemard, D. Thoraval, M. Crouzet and

F. Doignon. Through its F-BAR and RhoGAP domains, Rgd1p acts in different polarized growth processes in budding yeast. Commun Integr Biol. 2009 Mar;2(2):120-2.

* These authors contributed equally to this work.

S. Claret, O. Roumanie, V. Prouzet-Mauleon, F. Lefebvre, F. Doignon, M. Crouzet and

D. Thoraval. Tos2p, a component involved in filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae, interacts with the Rgd1p RhoGAP (En préparation)

F. Ness, V. Prouzet-Mauléon, F. Lefebvre, T. Noël, M. Crouzet, F. Doignon and

D. Thoraval. Involvment of the RhoGAP Rgd1 in the polarised growth and cellular invasion in Candida albicans.( En préparation)

Through its F-BAR and RhoGAP domains, Rgd1p acts in different polarized growth processes in budding yeast

120 Communicative & Integrative Biology 2009; Vol. 2 Issue 2

[Communicative & Integrative Biology 2:2, 120-122; March/April 2009]; ©2009 Landes Bioscience

Protein domain architecture can be used to construct supramo-lecular structures, to carry out specific functions and to mediate signaling in prokaryotic and eukaryotic cells. The Rgd1p protein of budding yeast contains two domains with different functions in the cell: the F-BAR and RhoGAP domains. The F-BAR domain has been shown to interact with membrane phospholipids and is thought to induce or sense membrane curvature. The RhoGAP domain activates the GTP hydrolysis of two Rho GTPases, thereby regulating different cellular pathways. Specific molecular interac-tions with the F-BAR and RhoGAP domains, cell signaling and interplay between these domains may allow the Rgd1p protein to act in several different biological processes, all of which are required for polarized growth in yeast.

The establishment of cell polarity in eukaryotes involves asym-metric organization of the cytoskeleton and secretory pathway. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, polarization results in the budding of daughter cells and the asymmetric segregation of cell components.1 Polarized growth occurs at discrete regions of the cell surface, the presumptive bud site (late G1), the tip of small buds (S phase to G2 phase), the entire bud surface (G2/M phase to anaphase) and the bud neck of cells with large buds (late anaphase to telophase). Overall mother-bud polarity is maintained until late anaphase, when the growth machinery is redirected to the bud neck to promote cytoki-nesis and cell separation. Local polarity results from the fine-tuning of overall polarity by several factors, including GTPases and their regulators.

In S. cerevisiae, Rgd1p, a GTPase-activating protein (GAP), activates hydrolysis by the Rho3p and Rho4p GTPases, thereby negatively regulating the action of these enzymes in polarized growth. Consistent with the distribution of Rho3p and Rho4p,

Rgd1p is found mostly in areas of polarized growth during cell cycle progression. Rgd1p localizes to the bud tip and bud cortex during polarized growth and to a ring at the site of cytokinesis. The C-terminal Rho GTPase-activating protein (RhoGAP) domain of Rgd1p is dispensable for localization to these sites. All the essential information for targeting Rgd1p is located in the F-BAR-containing region at the N-terminus (see Fig. 1 for domain organization).2 The F-BAR (extended Fer-CIP4 homology/FCH-BAR) domain has been shown to generate and bind to tubular membrane structures.3 The distribution of Rgd1p suggests that F-BAR may interact with plasma membranes, specifically through binding to PtdIns(4,5)P2.2 Fluorescence microscopy analysis with the PtdIns(4,5)P2-binding domain of the Boi1 protein4 has shown that Rgd1p and PtdIns(4,5)P2 colocalize at the plasma membrane in the bud tip and bud neck. However, Rgd1p may act at membranes other than the plasma membrane. The distribution of Rgd1p is altered in a strain with impaired PtdIns(4)P biosynthesis at Golgi membranes.2 This suggests that Rgd1p may also be recruited to the Golgi apparatus via the F-BAR domain, leading to Rgd1p delivery to the plasma membrane via the secretory pathway. Alternatively, it may promote vesicle budding at the Golgi membrane, through the F-BAR domain.

The F-BAR domain is thought to be largely α-helical and to engage in coiled-coil interactions to form a banana-shaped dimer.5 Using a two-hybrid approach, we showed that the Rgd1p protein did indeed form dimers via the F-BAR region. We also identified a phosphorylation site for a kinase of the Aurora B family within the F-BAR domain. The kinases of this family regulate kinetochore-microtubule attachment and help to maintain chromosomes in a condensed state during anaphase and early telophase in S. cerevisiae.6 Another site, close to the F-BAR region, was identified by mass spec-trometry within a consensus sequence for CDK phosphorylation. These features are consistent with Rgd1p function being controlled through the cell cycle. In budding yeast, cell cycle-dependent cell morphogenesis is regulated by the essential CDK Cdc28p. It has recently been reported that Rga2p, one of four GTPase-activating proteins for Cdc42p in S. cerevisiae, is phosphorylated by the cyclin/CDK complex.7 We suggest that, as for Rga2p, Rgd1p phosphory-lation is required for appropriate temporal and spatial function in yeast cells.

One of the key features of the RhoGAP domain of Rgd1p is its ability to activate two different RhoGTPases in S. cerevisiae,8 Rho3p and Rho4p. Both these enzymes are involved in polarized growth

Article Addendum


Fabien Lefebvre, Valérie Prouzet-Mauléon, Aurélie Vieillemard, Didier Thoraval, Marc Crouzet and François Doignon*

Université de Bordeaux; Institut de Biochimie et de Génétique Cellulaires and CNRS; UMR 5095; Bordeaux, France

Key words: RhoGAP, F-BAR, Rho GTPase, polarized growth, yeast

*Correspondence to: François Doignon; Regulation of Rho Proteins (RDPR) University

of Bordeaux 2; Box 64 146 Rue Léo Saignat; Bordeaux Cedex 33076 France; Tel.:

33.5.57.57.47.18; Email: [email protected]

Submitted: 12/23/08; Accepted: 12/25/08

Previously published online as a Communicative & Integrative Biology E-publication:

http://www.landesbioscience.com/journals/cib/article/7737

Addendum to: Prouzet-Mauleon V, Lefebvre F, Thoraval D, Crouzet M, Doignon F.

Phosphoinositides affect both the cellular distribution and activity of the F-BAR-

containing RhoGAP Rgd1p in yeast. J Biol Chem 2008; 283:33249–57; PMID:

18845541; DOI:10.1074/jbc.M805161200.


www.landesbioscience.com Communicative & Integrative Biology 121

events, but at different locations and different times in the cell cycle. Rho3p is mostly localized to the plasma membrane of daughter cells, whereas Rho4p is found around the contractile ring during cytoki-nesis. The specificity of molecular interactions may make it possible for the modular organization of Rgd1p (F-BAR and RhoGAP) to be used in different pathways and subcellular regions (Fig. 1). For example, we demonstrated the stimulation of GAP activity by phos-phoinositides specifically for Rho4p/Rgd1p.2 Similarly, the protein and lipid composition of membranes may influence the distribution of Rgd1p at the bud tip or bud neck, thereby also affecting the effects of this protein on the Rho3p and Rho4p GTPases.

Rho3p was initially shown to affect the organization of cortical actin patches and actin cables.9 Rho4p must also be involved in these processes as the deletion of RHO4 exacerbates the actin cytoskeleton defect observed in rho3Δ mutants. A polarized array of actin cables in the cell cortex is the primary structural determinant of polarity. Motors, such as class V myosins, use this array to transport secretory vesicles and organelles to sites of growth. In budding yeast, Rho3p and Rho4p activate the Bni1p and Bnr1p formins, which nucleate actin filaments, thus directing the assembly of actin cables.10 Cortical actin patches enhance and maintain this polarity, probably through endocytic recycling, allowing the reuse of materials and preventing continuous growth at specific locations. The dynamic organization of targeting and recycling provides flexibility for the precise control of morphogenesis. The F-BAR domain, like N-BAR domains, is involved in the invagination of the plasma membrane during processes such as endocytosis.11 The F-BAR domain of Rgd1p may act as a membrane-targeting module during endocytosis in S. cerevi-siae. Consistent with a role for endocytosis, additional copies of the LAS17 and VRP1 genes encoding the homologs of the human WASP and WIP proteins involved in endocytosis, restore correct actin orga-nization in a strain lacking RHO3.12 Las17p binds strongly to Vrp1p and activates the Arp2/3 protein complex, which nucleates branched actin filaments. The synthetic lethality of RGD1 inactivation with

the las17Δ and vrp1Δ mutations suggests that the RhoGAP protein plays a role in endocytosis together with Las17p and Vrp1p.13 Rho3p also interacts with the exocyst subunit Exo70.14 The exocyst defines a hub integrating signals from many small GTPases (Cdc42, Rho1, Sec4 and Rho3) during polarized growth in yeast. A specific muta-tion in the Rho3 effector domain (rho3E51V) abolishing interaction with Exo70p causes the accumulation of post-Golgi vesicles in yeast cells. These data suggest that Rho3 plays a role in vesicle transport and tethering to the plasma membrane and positively regulates exocytosis. Rho3p may maintain polarized growth and cell wall integrity during subsequent bud growth, through exocytosis, endo-cytosis and actin organization.

Rho4p interacts with the formin Bnr1p and regulates the interac-tion between Bnr1p and Hof1p, two proteins involved in cytokinesis and localized at the bud neck, in a GTP-Rho4p-dependent manner.15 Genetic analysis revealed that both the rgd1Δ and hof1Δ deletions are synthetic lethal with vrp1 and myo1 inactivation.12 We also confirmed, in two-hybrid assays, that Rgd1p interacts with Hof1p. Thus, Rgd1p plays a role in cytokinesis, in the cellular mechanism

Figure 1. Organization and assigned properties of the domains of the Rgd1p protein.

Figure 2. Model of the role of Rgd1p in polarized growth in Saccharomyces cerevisiae; during bud growth (A) and during cytokinesis (B). See the text for more detail. SL: synthetic lethal interaction.


122 Communicative & Integrative Biology 2009; Vol. 2 Issue 2

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involving Hof1p. Cytokinesis in S. cerevisiae involves coordination between actomyosin ring contraction and septum formation and/or targeted membrane deposition. The actomyosin ring is a contrac-tile structure composed of actin filaments and Myo1p, the only known class II myosin. It forms beneath the plasma membrane at the mother-bud neck. Rgd1p and Hof1p form rings positioned at or close to the bud neck. Hof1p is required early in mitosis for the assembly of a functional actomyosin ring, but is specifically degraded late in mitosis, remaining absent throughout the entire G1 phase of the cell cycle. Hof1p downregulation is required at the end of mitosis for efficient contraction of the actomyosin ring and cell separation during cytokinesis.16 Concomitant with ring contraction, membrane vesicles are added at the cleavage site to facilitate the necessary expan-sion of the cell membrane and cell wall. Rgd1p, through its GAP activity on the Rho4p GTPase, should coordinate the regulation of cell contraction between mother and daughter cells. Rapid signaling to release Hof1p for degradation might involve the stimulation of GAP activity by PtdIns(4,5)P2. The role of Rgd1p in cytokinesis may also involve septum formation, as RGD1 inactivation is synthetic lethal with BNI4 deletion. Bni4p is required for the assembly of the chitin ring, and is also involved in septum formation and the main-tenance of bud neck integrity.17

The function of the Rho3p and Rho4p GTPases and the regula-tion of the processes in which they are involved must be coordinated in space and time to facilitate yeast cell growth. Rgd1p, through its F-BAR and RhoGAP domains, interacts with specific lipids and proteins at different sites of polarized growth (see Fig. 2 for models of Rgd1p action). In this way, a protein with a single organization of its internal domains can integrate different cell signals and take part in different polarized growth and morphogenesis processes during the cell cycle in S. cerevisiae.

Acknowledgements

This research was supported by Bordeaux 2 University and the CNRS.

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La polarité cellulaire chez la levure Saccharomyces cerevisiae : Etude de la

régulation de la protéine RhoGAP Rgd1 à domaine F-BAR.

RESUME :

Chez l’ensemble des organismes, la capacité des cellules à se polariser est une propriété

nécessaire à la croissance, à la division, à la mobilité, à la différenciation ou encore au trafic

intracellulaire. Les GTPases de la famille Rho jouent des rôles prépondérants dans la régulation

de ces mécanismes. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, nous étudions la manière dont le

régulateur RhoGAP Rgd1p des protéines Rho3 et Rho4 est lui-même régulé au cours de la

croissance polarisée. Nous avons montré que la protéine Rgd1 est localisée au fond du bourgeon

lors de la croissance isotropique du bourgeon puis sous forme d’un anneau au cou du bourgeon

lors de la cytocinèse. Nous avons également montré que le trafic intracellulaire, notamment

l’exocytose et les phosphoinosotides tels que le PdtIns(4)P et le PdtIns(4,5)P2 ont un rôle majeur

dans la régulation spatio-temporelle de la protéine Rgd1. Ces mécanismes permettraient

d’acheminer la protéine RhoGAP au niveau des sites de croissances afin d’agir sur les protéines

Rho3 et Rho4.

Cell polarity in the yeast Saccharomyces cerevisiae : Study of the regulatory

protein RhoGAP Rgd1 with a F-BAR domain.

ABSTRACT :

In all organisms, the ability of cells to polarize is a property necessary for growth, cell

division, mobility, cell differentiation or intracellular trafficking. GTPases of the Rho family play

central roles in the regulation of these mechanisms. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, we

study how the regulator RhoGAP Rgd1p of Rho3 and Rho4 proteins may be itself regulated

during polarized growth. We showed that the protein Rgd1 is located at the bud tip during

isotropic growth of the bud and form a ring at the bud neck during cytokinesis. We also showed

that the intracellular traffic, especially the exocytosis and phosphoinosotides as the PdtIns(4)P

and PdtIns(4,5)P2 have a major role in the spatio-temporal regulation of the Rgd1 protein. These

mechanisms would deliver the RhoGAP protein at growth sites to act on Rho3 and Rho4

proteins.

Discipline : Génétique.

Mots-Clés : RhoGAP, domaine F-BAR, Rgd1p, GTPases de la famille Rho, polarité cellulaire,

Saccharomyces cerevisiae.

Laboratoire de Régulation Des Protéines Rho (RDPR)

Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires (IBGC) CNRS 5095,

Université Victor Segalen Bordeaux 2, 146 rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux Cedex

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these Fabien Lefebvre - Thèses · Mutagenèse dirigée ... formation d’un individu composé de nombreux types cellulaires ... de monomères d’actine-G polymérisés en longs