Journée ARL - Yverdon

Thérapie cellulaire en Neuroscience Essai clinique… Dr. Jean-François Brunet 21 mars 2013

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Principe de la thérapie cellulaire: Isoler les cellules souches/progénitrices. Produire les cellules in vitro. Remplacer les cellules déficientes dans un organe ou remplacer un tissu.

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Cellules souches: Outil thérapeutique Deux possibilités:

- Protection - Régénération

Deux stratégies:

- Stimuler la génèse endogène - Apporter de nouvelles cellules

- De nombreuses voies à explorer

Origine des cellules souches Dès les premiers stades embryonnaires

Morula

Les cellules sont totipotentes

Les cellules souches embryonnaires

Blastula

Les cellules foetales

Cellules souches

dans les tissus adultes

Cellules souches stromales de la moelle osseuse

Cellules souches de la peau

Les cellules pluripotentes induites . iPS Cells

Mise en culture de cellules du donneur (Fibroblaste)

Transfection de gènes par rétrovirus

Gènes de pluripotence : - Oct-3/4, SOX2, c-Myc, and Klf4 - OCT4, SOX2, NANOG and LIN28

Sélection des cellules transfectées

Sélection des ES-like Cells (embryonic stem-like cells)

Système Nerveux Central (SNC) Le cerveau, la moelle épinière

En Neuroscience:

Capacité de régénérescence limitée

neurodégénérescence

régénérescence

Deierborg et al, Prog Neurobiol, 2008

D.E. Redmond The Neuroscientist 2002 J Bloch Neurosurgery Quarterly 2001

Greffe de tissus foetaux

•  Via mini-pumps •  Via ex vivo or in vivo gene therapy

! Capsules ! Virus

Libération de facteurs.

Où prendre les cellules?

- Cellules de Schwann - Cellules des glandes

surrénales -  Fibroblastes

- Cellules épithéliales

Greffes autologues pour les lésions du système nerveux central

Transplantation autologue.

In vitro brain cells

Re-implantation 3. Cell labelling

4. Re-implantation

2. culture

1. Cortical biopsy

Lésion du cortex moteur!

In vitro brain cells

3. Cell labelling

4. Re-implantation

2. culture

1. Cortical biopsy

Brunet et al, Laboratory investigation, 2002 Cryobiology, 2003 Experimental Neurology, 2005 Cell transplantation, 2009

Modèle MPTP, Parkinson!

Culture de cellules cérébrales adultes

Dissection Cortex

Substance blanche Substance grise

Arsenijevic et al, Exp Neurol , 2001 Brunet et al, Lab invest. 2002 Brunet et al, Cryobiology, 2003

Dissociation mécanique

Fragmentation (≈ 1 mm3)

Primoculture Cryopréservation

A partir de biopsies corticales:

1 cm

Cellules cérébrales adultes in vitro (même résultats à partir d’une biopsie corticale chez l’homme ou le singe)

GFAP Vim

GFAP Vim

Des astrocytes entourant des cellules progénitrices neurales

1 cm

DCX GFAP

Modèle de lésion corticale: Macaca fascicularis

!

!

Etape 1 : Jour 0

Biopsie corticale (lobe préfrontal)

PKH67

Etape 3 : jour 35 ou 70

Marquage avec l’intercalant membranaire fluorescent

PKH67 ou PKH26

culture Etape 2 : jour 15 ou 30

Injection d’acide iboténique

(cortex moteur gauche)

PKH26

Etape 4 : 4-6 mois post-réimplantation

Ré-implantation Entre 250 000 et 300 000 cellules

90 jours post ré-implantation Pas de détection des cellules PKH67 (injectées en controlatérale) Les cellules PKH26 migrent jusqu ’à occuper toute la zone lésée…

8 m

m

Acide iboténique Implantation

1

1

2

2

3 3

A B

C

A : PHK26 MAP2 B : PKH 26 C : MAP 2

Brunet et al, Exp Neurol, 2005

Les cellules PKH26 expriment le marqueur neuronal MAP2…

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Après lésion

Récupération naturelle

Test de dexterité

Après ré-implantation

Kaeser M et al, Neurosurgery, 2010 http://www.unifr.ch/neuro/rouiller/ACCI/videos.htm

Double-plateau of recovery only observed in

re-implanted monkeys.

Motor cortex lesion!

Singe non traité

Singe ré-implanté

Présence des cellules ré-implantées dans les structures corticales lésées et leur différenciation en neurones

Low$dose(MPTP((asymptoma2c(parkinsonian(model)(

High$dose(MPTP((symptoma2c(parkinsonian(model)(

4((individuals(

1.(Cor2cal(biopsy((prefrontal(right(lobe)(

Cell(culture(

MPTP treatment in Chlorocebus aethiops

Day(0(1.2mg/kg/12h(i.m(

Total(dose(3.6mg/kg!

Day(15(0.4mg/kg/12h(i.m(

Total(dose(1.2mg/kg(2.(MPTP(treatment(

!JF!Brunet,!DE!Redmond,!J!Bloch,!2009!in!press,!Cell!transplanta<on!

7((individuals(

Day(0( Day(40(

3.(Reimplanta2on(

Cell$labeling$with$viable$

fluorescent$dye$

PKH67(

Control(medium(

!JF!Brunet,!DE!Redmond,!J!Bloch,!2009!in!press,!Cell!transplanta<on!

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3(with(killed(cells((control)(

Day(35( Day(80(

Cell replacement in Chlorocebus aethiops

Low(dose(MPTP((asymptoma2c(parkinsonian(model)(

High(dose(MPTP((symptoma2c(parkinsonian(model)(

4.(Behavioral(assessment((

(5.(Necropsy((

Day(120$220(

4.(Necropsy((

3(months(aRer(reimplanta2on(

Map3D reconstruction Explora Nova 60 to 70% of cell survival

Ct N Ct MPTP Reimplanted

Ros

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tion

Cau

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n

!JF!Brunet,!DE!Redmond,!J!Bloch2009!in!press,!Cell!transplanta<on!

0!

1000!

2000!

3000!

4000!

5000!

6000!

7000!

Ct(N((n=2)(

Ct(MPTP((n=2)(

Reimplanted((n=4)!

Right SN!

Left SN!

p<!0.05! p<!0.01!

p<!0.05!

TH$posi2ve

neu

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MPTP LD results

Normal

MPTP

MPTP reimplanted

Ct(N((n=2)(

Ct(MPTP((n=2)(

Reimplanted((n=4)(

TH In

tensity

in H

Cd!

0.00!0.50!1.00!1.50!2.00!2.50!3.00!3.50!

***!***!

*!**! Right HCd!

Left HCd!

�����%*/"*.%/4�

Step 1 : Day 0 High-Dose MPTP treatment

1.2mg/kg/12h i.m. Total dose 3.6mg/kg (symptomatic parkinsonian model)

Step 3 : Day 80 Reimplantation

Cell labeling with viable fluorescent

dye

HIGH DOSE MPTP Model!in 7 Chlorocebus aethiops (St Kitts green monkey)!

Cell culture

Step 4 : Behavioral assessment Step 5: Day 120-220 Necropsy

4 viable cells 3 controls, killed cells

Step 2 : Day 40 Cortical biopsy

(prefrontal right lobe)

Three others present no change or increase of their Parkinsonian score

Four monkeys present a significant decrease of their Parkinsonian score

MPTP: MPTP treatment

Re.: re-implantation

Necropsy

B: biopsy of prefrontal cortical cortex

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

MPTP Re. Necropsy -20 -60 -100 -80 -120 -40

0

25

50

75

100

125

-25

Y135

P<0.0001

P<0.0001

B

PK sc

ore

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 -20 -60 -100 -80 -120 -40

0

25

50

75

100

125

-25 P<0.0001

NS

Y140

MPTP Re. Necropsy B

PK sc

ore

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 -20 -60 -100 -80 -120 -40

0

25

50

75

100

125

-25

Y172 P<0.02 P<0.0001

MPTP Re. Necropsy B

PK sc

ore

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 -20 -60 -100 -80 -120 -40

0

25

50

75

100

125

-25

Y181 P<0.0001

P<0.001

MPTP Re. Necropsy B

PK sc

ore

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 -20 -60 -100 -80 -120 -40

0

25

50

75

100

125

-25 P<0.0001

NS (+) worse P<0.0509

Y222

MPTP Re. Necropsy B

PK sc

ore

PK sc

ore

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 -20 -60 -100 -80 -120 -40

0

25

50

75

100

125

-25

Y234

P<0.0015 P<0.0001

MPTP Re. Necropsy B

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 -20 -60 -100 -80 -120 -40

0

25

50

75

100

125

-25

Y249

P<0.0001

Worse P<0.008

MPTP Re. Necropsy B

PK sc

ore

Perspectives : Limiter le nombre de cellules transplantées Contrôler le phénotype des cellules transplantées Utiliser les cellules souches en complément à d’autres approches (neuroprotection ou thérapie génique). L’important demeurant encore d’évaluer le réel impact thérapeutique de ces transplantations ou ces thérapies cellulaires.

Supported by !FNRS (3100AO-103924 to JB, JFB & ER),!

Fondation LEENAARDS,!ZWAHLEN Funds!

Groupe de Recherche Neurochirurgicale Département des Neurosciences cliniques

J. Bloch, M.D J-F. Brunet, Ph.D

YALE UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE!

Department of Psychiatry and Neurosurgery

New Haven CT - USA

D.E. Redmond, M.D-Ph.D

UNIVERSITE!DE!FRIBOURG!

Institut de Physiologie Faculté de Médecine

Eric Rouiller, Ph.D Thierry wannier, Ph.D

Mélanie Kaeser, Ph.D Arnaud Baylon

Laurence Grollimund Catherine Pythoud

UNIVERSITE!DE!LAUSANNE!

33

Chaque promoteur d’essai clinique conserve son leadership académique dans sa spécialité.

Production cellulaire GMP

BUT(Du(laboratoire(au(pa2ent(

(Applica2ons(en(thérapie(cellulaire

34

Pertinence préclinique

Comité éthique institutionnel

Groupe d’essai clinique Cliniciens, Investigateurs Économistes Juristes

Swissmedic

Production GMP

Essai clinique Phase I

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"  Trois centres de Grands Brûles en Suisse

- Suisse Romande:

- Suisse Alémanique: "  Un seul laboratoire de culture d’épidermes

- le laboratoire des greffes cutanées CPR8, CHUV

36

Déjà en clinique Soins aux Grands Brûlés:

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38

Le CPC doit répondre aux exigences des BPF Bonnes pratiques de fabrication.

« Écrire ce qui doit être fait, Faire ce qui est écrit, Écrire ce qui est fait ».

Implémentation d’un système qualité s’appuie sur la certification ISO 9001 de la direction du DL

Poursuite du projet pour l’installation à EPCR

Mise en place d’un système qualité:

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Satis

fact

ion

clie

nts

Dem

ande

urs

GOUVERNANCE

Gestion des risques

Relations Interfaces Réglementation Gestion de

projets Revue de direction

Prestations

Transposition Production Contrôle

RESSOURCES ET SOUTIEN Gestion

documentaire

Infrastructures, équipements,

consommables Système d’information

Ressources humaines

Finances

Gestion des

déviations et

des non-conformités

Audits

Enquêtes

Structure GMP exigées par Swissmedic

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Production

Service clinique

Chef de Production

Personnel production

Conseil scientifique

Unité des affaires juridiques

Swissmedic

Commission d’éthique

Responsable thérapie cellulaire

DL (PHA, …)

LOH (SPH, TCA, …)

Contrôle qualité

Responsable QC

Personnel QC

DCILM (STER, MPH,…)

CIT (CVS, GMAO,…)

Directeur CPC

DSI

CPC

Réseau de compétence CHUV en relation avec les activités CPC

Locaux CPC dans le futur… proche Locaux EPCR22 (Epalinges

Croisette 22):

41

42

Equipement principal: Le premier isolateur : betamodule .

Service ou Département Clinique

Comité d’Ethique

En(résumé(Applica2ons(en(thérapie(cellulaire

Responsable Thérapie cellulaire

Centre de Recherche

Clinique

Centre de Production Cellulaire

43

Merci Laurent WASELLE Fahd AZZABI

Isabelle SENECHAUD Juliette REDA Florence DUBUGNON

EPCR22