TP de Techniques Biochimiques - University of M'silavirtuelcampus.univ-msila.dz/facscience/wp-content/...TP n 01 : Détermination de la composition générale de différents aliments

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Mohamed Boudiaf-M’sila

Faculté des Sciences

Département de Microbiologie & Biochimie

Polycopié de Travaux Pratiques

TP de Techniques Biochimiques

Polycopié destiné aux Etudiants en 3ième Année Licence en Biochimie

Chargé de TP : Dr. RÉGGAMI Yassine

Année universitaire : 2019-2020

SOMMAIRE

TP n° 0 :

TP n° 1 :

TP n° 2 :

TP n° 3 :

TP n° 4 :

Consignes de sécurité et matériel de laboratoire………………………………………..…..

Détermination de la composition générale de différents aliments ……………..…

Séparation de plastes cellulaires par la technique de centrifugation à

l’équilibre en gradient de densité discontinu.………………………………………………….

Détermination de la composition en sucres d’un jus de fruit par

Chromatographie sur couche mince (CCM) ….………...…………………………………..…

Identification, séparation et dosage des colorants alimentaires du sirop de

menthe. (Chromatographie sur papier / Chromatographie sur colonne /

Spectrophotométrie) ……………………………………………………………….……………………..

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Semestre : 6 Unité d’enseignement Fondamentale 2 (UEM 3.2): Techniques biochimiques et méthodes spectrales Matière 1: Techniques Biochimiques Crédits : 8 Coefficient : 3 Objectifs de l’enseignement Mettre l’accent sur les techniques de fractionnement et les différentes méthodes de séparation chromatographiques et électrophorétiques ainsi que leurs applications dans le domaine de l’analyse pour l’extraction, l’identification, et la quantification des molécules et plus particulièrement des substances biochimiques. Connaissances requises recommandées : Avoir des connaissances en biophysique et en biochimie acquises en L2. Mode d’évaluation : Contrôle continu, Exposés, Posters, Interrogations, Compte rendu de TP, examen de TD et de TP.

Matière: Techniques Biochimiques Responsable de la matière : Dr. REGGAMI.Y TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire

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TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire

1. Consignes de sécurité

Par mesure d'hygiène, il est interdit de manger dans le laboratoire.

Le port de la blouse 100% coton est obligatoire. La blouse doit être de longueur raisonnable

et à manches longues.

Les étudiants doivent toujours manipuler debout. Aucun objet ne doit encombrer les

paillasses.

Les tabourets ou les chaises doivent être rangés sous les paillasses afin de ne pas encombrer

les allées.

Pour chaque manipulation présentant un risque, le port des lunettes de protection et de

gants en latex est impératif. Les cheveux longs doivent être attachés derrière la tête.

Toute manipulation de produits chimiques présentant un risque doit être réalisée sous une

hotte ventilée, avec vitres protectrices.

Le pipetage à la bouche est interdit. Utiliser les propipettes.

IL est interdit de regarder de près les récipients contenant des liquides en ébullition.

Ne pas respirer le contenu d’un récipient pour l’identifier à son odeur.

Reboucher tout flacon immédiatement après usage.

Ne jamais prendre de produits solides avec les doigts, utiliser une spatule.

Utiliser des verreries résistantes aux hautes températures (verrerie Pyrex) lorsqu'il faut

chauffer.

Éviter de faire subir des chocs thermiques à la verrerie (ne pas refroidir brutalement un

récipient chaud).

Les paillasses doivent être nettoyées au cours de la séance et laissées parfaitement propres et

sèches en fin de séance.


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Il est impératif de se laver soigneusement les mains après manipulation.

Il est recommandé de ne jamais jeter dans les éviers de laboratoires, les produits à risque :

Verser les solutions dans les flacons de récupération prévus à cet effet.

Les pictogrammes de sécurité de produits chimiques doivent être connus.

Le SGH (ou en Europe « règlement CLP ») s’applique de façon obligatoire aux substances depuis fin

2010. Ce nouveau système comprend 9 pictogrammes. Baptisé « Système Général Harmonisé (SGH) »

ou « Globally Harmonized System (GHS) », il a pour but d’uniformiser l’étiquetage des produits

chimiques à l’échelle mondiale. Il est appliqué en Europe sous le nom de « Règlement CLP ». Le

système européen préexistant et le nouveau système SGH cohabitent ainsi depuis le 1er décembre

2010.

2. Connaissance des risques de produits utilisés

Il existe trois grandes catégories de dangers intrinsèques aux substances chimiques :

les dangers physiques (risque d’explosion, d’in ammation, etc.) ;

les dangers pour la santé (toxicité aiguë, lésion oculaire, toxicité pour la reproduction, etc.) ;

les dangers pour l’environnement (danger pour les milieux aquatiques).


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3. Etiquetage de produits chimiques

La première information sur les dangers d’une substance chimique est fournie par l’étiquette sur

laquelle doit apparaître au moins :

le nom du produit ;

des pictogrammes de danger ;

des mentions de dangers (phrases H) ;

des conseils de prudence (phrases P) ;

une mention d’avertissement.

Sur l’étiquette, peuvent aussi figurer des grandeurs physiques (densité, masse molaire,

composition, etc.).

L’image suivante donne l’exemple d’une étiquette d’acide chlorhydrique concentré.


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Pictogrammes de danger

Ces schémas représentent des types de dangers particuliers. Ils sont notés SGHXX et sont

présentés dans la figure suivante.

Mentions de danger (phrases H)

Les mentions de danger complètent les pictogrammes. Elles commencent toujours par la

lettre H (pour Hazard = danger) qui est suivie d’un nombre à 3 chiffres. Le 1er chiffre

correspond à la catégorie de danger.

H2XX : mentions de dangers relatives aux dangers physiques ;

H3XX : mentions de dangers relatives aux dangers pour la santé ;

H4XX : mentions de dangers relatives aux dangers pour l’environnement.

Conseils de prudence (phrases P)

Les conseils de prudence complètent également les pictogrammes. Ils commencent toujours

par la lettre P (pour Prudence) qui est suivie d’un nombre à 3 chiffres. Le 1er chiffre

correspond à la catégorie de conseil de prudence.

P1XX : conseils de prudence généraux ;

P2XX : conseils de prudence - Prévention ;

P3XX : conseils de prudence - Intervention ;

P4XX : conseils de prudence - Stockage ;

P5XX : conseils de prudence - Élimination.


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Mention d’avertissement

Sur l’étiquette figure une mention d’avertissement « Attention » ou « Danger » qui indique le

degré relatif de dangerosité. « Danger » est utilisé pour les dangers les plus graves.

Substances C.M.R. : Cancérogène, Mutagène, toxique pour la Reproduction

Il existe une classification européenne de produits chimiques C.M.R. qui s’appuie sur des

résultats d’études animales et/ou humaines. La liste des substances C.M.R. évolue car tous les

produits n’ont pas été testés.Les composés C.M.R. doivent être stockés sous clé et utilisés en

respectant scrupuleusement les consignes de sécurité.

Quelques exemples de substances C.M.R. : aniline, benzène, 1,3-butadiène, chlorure de

cobalt (II), dichromate de potassium, mercure, phénol...

4. Premiers soins aux victimes d’accident

4.1. En cas de projection cutanée

Rincer la peau longuement et abondamment à l'eau claire jusqu'à ce que le produit soit

éliminé.

Attention, ne pas chercher à neutraliser les produits acides ou basiques.

4.2. En cas de projection oculaire

Rincer immédiatement et abondamment à l'eau froide.

Consulter systématiquement un ophtalmologue.

4.3. En cas d’ingestion accidentelle

En cas d'ingestion, rincer la bouche. Boire un verre d'eau.

En cas d'inhalation de vapeurs (Eau de Javel, Brome…), amener la personne dans un endroit

aéré.


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5. Verreries et Petit Matériel de Laboratoire

Matière: Techniques Biochimiques Responsable de la matière : Dr. REGGAMI.Y TP n 1 : Détermination de la composition générale de différents aliments

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TP n° 01 : Détermination de la composition générale de différents aliments

Cette manipulation sera effectuée sur 4 aliments : pain, viande, produit laitier, fruit.

1. Détermination de la teneur en eau 1.1. Définitions • Teneur en eau : c'est la quantité d'eau exprimée en pourcentage contenue dans un composé solide ou liquide. • Matières sèches (ou extrait sec) : il s'agit du produit résultant de la déshydratation (élimination de l'eau) d'un composé solide ou liquide. On l'exprime en g /100 g pour un produit solide.

1.2. Mode opératoire -Peser un creuset en silice vide : masse m1 -Déposer le produit à analyser et peser le creuset plein : masse m2 -Placer le creuset à l’étuve à 100-110°C pendant 1 heure. -Laisser refroidir au dessiccateur (préserve le produit déshydraté de l'humidité). -Peser après déshydratation le creuset : masse m2’.

1.3. Résultats m2 – m1 = correspond à la masse ......................... m2’ – m1 = correspond à la masse .......................... m2 – m2’ = correspond à la masse .........................

Etablir les formules permettant de calculer la teneur en eau et le pourcentage de matières sèches du produit à analyser.

2. Détermination de la teneur en minéraux et en matières organiques 2.1. Principe

La matière sèche obtenue après déshydratation d'un produit est composée de substances minérales (calcium, magnésium, chlorures...), mais aussi de substances organiques (glucides, lipides, protides, acides nucléiques). Il s'agit de molécules complexes constituées majoritairement des éléments C, H, O et N.

Un chauffage puissant au four à moufle à 500°C permet la destruction et l'élimination totale des matières organiques qui se trouvent totalement dégradées en matières minérales qui s'échappent du creuset sous forme gazeuse, c'est la minéralisation :

Matières organiques CO2 + H2O + NH3

Il reste alors dans le creuset les sels minéraux sous forme de cendres blanches.

2.2. Mode opératoire -Placer le creuset contenant la matière sèche au four à moufle à 500-600°C pendant 2 heures. -Refroidir au dessiccateur. -Peser le creuset contenant les cendres : masse m3 2.3. Résultats

m3 – m1 = correspond à la masse .................................. m2’ – m3 = correspond à la masse ..................................

Matière: Techniques Biochimiques Responsable de la matière : Dr. REGGAMI.Y TP n 1 : Détermination de la composition générale de différents aliments

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Etablir les formules permettant de calculer : -le pourcentage de matières minérales dans la matière sèche (en g dans 100 g de matière sèche). -le pourcentage de matières organiques dans la matière sèche (en g dans 100 g de matière sèche). -le pourcentage de matières minérales dans le produit frais. -le pourcentage de matières organiques dans le produit frais.

Récapituler tous les résultats dans le tableau suivant :

Matière: Techniques Biochimiques Responsable de la matière : Dr. REGGAMI.Y TP n° 02 : Séparation de plastes cellulaires par la technique de centrifugation à l’équilibre en gradient de densité discontinu.

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TP n° 02 : Séparation de plastes cellulaires par la technique de centrifugation à l’équilibre en gradient de densité discontinu.

1. Introduction : La centrifugation est une méthode couramment utilisée en biochimie pour séparer ou

analyser des fractions ou des structures cellulaires, des cellules entières, des macromolécules, etc.

On peut accentuer ou raffiner la séparation entre les particules en faisant cette centrifugation dans un gradient de concentration.

En effet, un des facteurs qui influence la vitesse de sédimentation est la différence entre la densité de la particule et celle du solvant. On peut donc moduler cette vitesse en faisant varier de façon continue ou par étape (discontinue) cette différence de densité en créant un gradient de densité :

Si la densité de la particule est plus grande que celle du solvant, elle sédimentera. Plus la différence de densité est grande plus la sédimentation est rapide.

S'il n'y a aucune différence de densité, il n'y aura aucune sédimentation, quelle que soit l'accélération.

Si la particule est moins dense que le solvant, celle-ci s'élèvera dans le tube jusqu'à atteindre un niveau de densité égal à la sienne ou, le cas échéant, jusqu'à flotter à la surface.

2. Principes de la technique :

2.1. Fabrication des gradients :

Les variations de densités sont obtenues en faisant varier la concentration d'un produit chimique dans la solution. Divers produits peuvent être utilisés pour faire ces gradients. Ils doivent être très solubles en solution aqueuse, ce qui permet d'obtenir des densités suffisantes. On recherche aussi des produits qui sont relativement inertes, peu coûteux, faciles à manipuler, non toxiques, etc. Évidemment aucun produit ne réunit toutes ces qualités et on doit choisir en tenant compte des contraintes expérimentales.

Le saccharose ("sucrose") est très souvent employé. Il permet d'atteindre des densités assez élevées, de l'ordre de 1.3 g/mL avec du saccharose 2.5 M. Ce produit a l'avantage d'être peu coûteux, électriquement neutre et plutôt inerte pour la plupart des fractions cellulaires. Son principal défaut est sa viscosité à forte concentration, ce qui rend son utilisation plus difficile. Il est aussi à déconseiller si la pression osmotique est un facteur important, par exemple dans l'isolement de cellules entières.


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Un autre produit couramment utilisé, particulièrement dans la séparation des acides nucléiques, est le chlorure de césium (CsCl). Ce sel peut atteindre une densité très élevée, de l'ordre de 1.9 g/mL à 7.5 mol/L. Cette possibilité d'atteindre des densités si élevées en solution aqueuse est son principal avantage. Son coût et le fait qu'il s'agisse d'un sel, donc de molécules chargées, réduisent son champ d'application. D'autres sels de césium peuvent aussi être employés comme le CsSO4.

D'autres produits peuvent aussi être utilisés pour séparer des cellules ou des organites par gradient de densité. Cependant, ils sont souvent restreints à des applications particulières. Leur coût peut aussi être prohibitif.

2.2. Gradients continus et discontinus :

Figure 1A : Exemple de gradient discontinu.

On peut facilement fabriquer un gradient de densité discontinu en déposant une sur l'autre 2, 3 ou 4 couche (cas présenté) de solutions de saccharose de diverses concentrations. L'échantillon a été représenté au sommet ce qui suppose qu'il soit moins dense que la première couche de solution de saccharose. Il arrive qu'on place l'échantillon au fond, au besoin en ayant au préalable augmenté sa densité en ajoutant du saccharose (par exemple).

Figure 1B : Exemple de gradient continu.

On peut aussi obtenir un gradient continu où la variation de densité est graduelle le long du tube à centrifuger. On le coule en faisant varier en continu le débit de deux pompes qui mélangent deux solutions, l'une à 10% et l'autre à 60% de saccharose dans le cas présent. Le gradient peut être linéaire (cas présenté) mais aussi exponentiel ou logarithmique selon les besoins.

3. Objectifs :

Réalisation d’un gradient de densité discontinu en utilisant des solutions de saccharose de concentrations décroissantes : 60%, 40%, 25% et 10%.

Séparation de plastes cellulaires (lycopènes de tomate, carotènes de la carotte et chloroplastes des feuillets de laitue).


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4. Produits et Materiel :

4.1. Produits utilisés :

3 échantillons (feuillet de laitue, carotte et tomate). Saccharose : 140 g Eau distillée: 2 L

4.2. Matériel :

Centrifugeuse + Tubes à centrifuger. Balance de précision + Spatule + Capsule de

pesée. 1 Fiole de 100 ml 4 Bêcher de 100ml. Agitateur magnétique + barreau aimanté.

3 Mortier et pilon. 3 Compresse (gaze). Entonnoir + Pipettes 2 ml + pipeteur. 3 Bêcher de 50ml. Agitateur de tubes (vortex).

5. Mode opératoire :

5.1. Préparation des solutions de saccharose 60%, 40%, 25%, 10% et 3% : Pour préparer une solution de saccharose 60% ; on pèse, à l’aide d’une balance de

précision tarée, 60 g de saccharose (sucre alimentaire). Par la suite, on rempli la fiole de 100 ml contenant ce saccharose par l’eau distillé jusqu’au trait de jauge. Enfin, on fait dissoudre le saccharose dans un bécher de 100 ml, à l’aide d’un agitateur magnétique.

On procède de la même manière avec les autres concentrations (40g de saccharose pour la solution de 40 %, 25 g pour 25%, 10 g pour 10% et 3 g pour 3%).

5.2. Préparation des jus : On découpe les échantillons (feuillet de laitue, carotte et tomate) chacun dans un mortier

en broyant à sec puis on ajoute quelques millilitres de saccharose 3% (dilué) pour permettre l’éclatement des cellules et donc libération des organites dont les plastes. (Extraction par osmose).

On filtre à l’aide d’une compresse (gaze) et on récupère les jus chacun dans un bécher de 50 ml.

5.3. Centrifugation préparative : Cette première centrifugation permet de récupérer les plastes dans le culot. Pour ce

faire, on utilise une centrifugeuse oblique. Dans un premier temps, on équilibre la centrifugeuse de telle façon que chaque 2 tubes opposés auront le même poids. On ferme bien l’appareil sans oublier d’y programmer (le temps de rotation ainsi que la vitesse par Rotation Par Minute « rpm » propre pour chaque appareil ou par Force Centrifuge Relative RCF en « g » c’est une unité fondamentale). Enfin, on lance la centrifugeuse en appuyant sur START. (6000 rpm pendant 5 min).


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Après centrifugation, on obtient pour chaque tube : un culot et un surnageant. On élimine le surnageant et on récupère le culot contenant les organites cellulaires dont les plastes.

5.4. Réalisation d’un gradient discontinu décroissant de saccharose : Le gradient discontinu est décroissant 60%, 40%, 25%, et 10% ceci est obligatoire car

dans le cas inverse, les molécules possédant une densité faible (diamètre important) ne peuvent pas traverser la couche la plus concentré pour atteindre leur position.

Dans un premier temps, on verse 2 ml de saccharose 60% dans un tube de centrifugation, sur lequel on rajoute délicatement et progressivement (la position du tube est oblique dans ce cas) 2 ml de saccharose 40% pour que les 2 concentrations soient séparer. Il est important de signaler que l’ajout se fait goutte à goutte sur la paroi du tube. On procède de la même manière pour le saccharose 25% et 10%.

On obtient un gradient discontinu car présentant une différence suffisante de densité entre les couches superposées

5.5. Centrifugation analytique : On ajoute 2 ml de saccharose 3% pour chaque culot puis on homogénéise en utilisant

un vortex (on utilise dans ce cas le saccharose 3 % qui est de faible concentration inférieur à celle de la première couche du gradient permettant le dépôt).

On dépose chacun sur un gradient, 1 ml de chaque échantillon (progressivement et délicatement contre les parois).

Enfin, on centrifuge (2000 rpm pendant 10 min).

6. Résultats :

Interpréter les résultats obtenus.

Matière: Techniques Biochimiques Responsable de la matière : Dr. REGGAMI.Y TP n° 03: Détermination de la composition en sucres d’un jus de fruit par Chromatographie sur couche mince (CCM)

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TP n° 03: Détermination de la composition en sucres d’un jus de fruit par Chromatographie sur couche mince (CCM)

1. Introduction La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique d'analyse qualitative. Elle a

pour but de séparer les produits d’un mélange et permet d'identifier un composé, de vérifier sa pureté ou de suivre l'avancement d'une réaction en analysant des prélèvements successifs du milieu réactionnel afin de mettre en évidence l’apparition de produits et/ou la disparition de réactifs.

2. Objectif du TP Déterminer la composition en sucres d’un jus de fruit par Chromatographie sur couche mince

(CCM).

3. Principe de la technique Considérons un mélange de composés que l’on souhaite séparer. Lors d'une CCM, le mélange

est déposé sur un solide poreux adsorbant appelé phase stationnaire qui recouvre une plaque rigide inerte. La partie inférieure de cette plaque est mise en contact avec un solvant appelé phase mobile qui monte par capillarité : on parle d'élution et la phase mobile est appelée éluant.

Figure 1 : Dispositif simple d'une CCM.

À gauche : schéma d'une plaque CCM sur laquelle ont été déposés deux échantillons (taches A et B) ; la tache du centre (A+B) correspond au co-dépôt des échantillons A et B.

À droite : schéma d'une plaque CCM

placée dans une cuve à élution fermée.

Lors de l'élution, les différents composés du mélange migrent plus ou moins haut sur la plaque du fait de la compétition entre trois phénomènes : o l'adsorption des composés sur la phase stationnaire ; o la solubilisation des composés dans l'éluant ; o l'adsorption de l'éluant sur la phase stationnaire (qui remplace les composés adsorbés

sur la phase stationnaire et les « pousse» alors vers le haut).

Figure 2 : Interactions existant entre le composé et les phases mobile et stationnaire.


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Ces trois phénomènes sont gouvernés par des interactions faibles de type interactions de Van der Waals et liaisons hydrogène. Pour optimiser la séparation entre les trois acteurs (composé, adsorbant, éluant), il faut prendre en compte :

- leur polarité (fonction de différents paramètres tels que le moment di-polaire, la permittivité diélectrique...) ; - leur proticité (aptitude à établir des liaisons hydrogène).

Phase stationnaire (adsorbant) Elle est le plus souvent constituée de silice SiO2, déposée sur un support rigide en verre, en aluminium ou en plastique. Chaque grain de silice présente en surface des groupements silanols Si-OH : c'est donc un matériau polaire et protique.

Figure 3 : Vision schématique de la surface d'un grain de silice. L'interaction avec un alcool est plus forte qu'avec un aldéhyde (plus grand nombre de liaisons hydrogène établies) : à éluant égal, l'alcool est plus retenu par la phase stationnaire que l'aldéhyde.

N.B : La silice a un caractère acide gênant si les échantillons à analyser sont dégradables en milieu acide. On peut lui substituer d'autres phases stationnaires polaires et protiques telle que l'alumine Al2O3. Celle-ci peut être traitée de façon à avoir un caractère acide, neutre ou basique que l'on choisira en fonction des composés à analyser.

Phase mobile (éluant) Un éluant est caractérisé par sa polarité et sa proticité. Il n'est pas toujours aisé de comparer la polarité des éluants entre eux : on a généralement recours à une échelle empirique représentée ci-dessous.

Figure 4 : Échelle de polarité relative de divers solvants utilisés comme éluant en CCM.

N.B : L'éluant est souvent un mélange de solvants, afin de pouvoir aisément moduler sa polarité par simple changement de proportions.


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Migration des composés Tableau 1 : Conséquences de la polarité du composé et de l'éluant sur la migration.

Chaque numéro fait référence à un des phénomènes en compétition.

En chimie organique, les produits synthétisés sont généralement polaires. On retient donc que :

- pour un même composé, la migration est d'autant plus importante que l'éluant est polaire et protique. - pour un même éluant, un composé est d'autant plus retenu qu’il est polaire et protique puisque la silice est elle-même polaire et protique : Un alcool est plus retenu qu'un hydrocarbure.

N.B : Il existe évidemment des contre-exemples... La détermination des conditions de séparation nécessite souvent de procéder par essais et erreurs.

4. Réactifs et matériel

4.1. Réactifs utilisés Système solvant (V /V) : Butanol, Acétone, Eau (5/4 /1) : 20 mL. Réactif de Molisch (0.25g -naphtol + 50ml Ethanol + 50ml H2SO4 à 20%). Hcl 2N : 5mL Jus de fruit. Glucose : 1g Fructose : 1g Saccharose : 1g Eau distillée: 2 L

4.2. Matériel Plaque CCM. 4 Cuve CCM ou 4 Bêcher de 100ml. Lampe UV. Micropipette ou Capillaires pour faire les dépôts. Plaque chauffante + barreau aimanté. Balance Analytique + Spatule + Capsule de pesée.

3 Bêcher de 50ml. 5 Fiole jaugée de 50ml. Entonnoir. Sèche-cheveux. Etuve à 100°C.

5. Mode opératoire

5.1. Préparation de l'éluant et de la cuve chromatographique -On utilise un système solvant contenant (V /V) : Butanol, Acétone, Eau (5/4 /1). -Verser l'éluant dans la cuve CCM ou un bêcher sur une hauteur de 5 à 8 mm. -Recouvrir la cuve ou le bêcher avec une plaque ou verre de montre pour que l’air qu’elle contient soit saturée des vapeurs de l’éluant.

5.2. Préparation de la plaque CCM -On trace la ligne de départ et les points de dépôts à environ 1cm du bord inférieur de la plaque.


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5.3. Préparation de l'échantillon -On prend 10ml de jus de fruit dans une fiole jaugée de 50ml et on complète jusqu'au trait de jauge avec de l'eau distillée, pour obtenir un jus de fruit dilué. -Du jus de fruit dilué on prélève 10ml au quel on ajoute 5ml d'Hcl 2N, et on chauffe le tout a température légère pendant 20 minutes dans un bêcher de 50ml. Pour obtenir du jus de fruit hydrolysé.

5.4. Préparation des solutions des étalons - Les solutions des étalons (glucose, fructose et saccharose) sont préparées à raison de 2,5 g/1. -Préparer ces solutions par dissolution de ces sucres dans de l’eau distillée dans des fioles jaugées de 50ml.

5.5. Dépôts des étalons et échantillons -A l'aide d'une micropipette ou tubes capillaires, déposer une très petite goutte de chaque solution préparée des étalons (saccharose, glucose et fructose) ainsi que du liquide à analyser (jus de fruit dilué et jus de fruit hydrolysé) sur la plaque CCM en suivant le schéma ci-contre.

Figure 5 : Dépôt des étalons et échantillons.

ATTENTION : Les tâches obtenues doivent avoir un diamètre de l’ordre de 3mm. Il faut tenir la plaque par les bords pour ne pas endommager la silice déposée sur la plaque.

-Sécher puis recommencer l’opération pour les concentrer, (bien superposer les tâches) : faire ainsi 3 dépôts successifs en séchant entre chaque dépôt. 5.6. Développement du chromatogramme

-Placer la plaque de silice dans la cuve ou le bêcher en position verticale, fermer et laisser migrer l'éluant. - N.B : On ne déplacera pas la cuve pendant la migration de l’éluant. -Retirer la plaque quand l’éluant est à environ 1 cm du bord supérieur de la plaque.

5.7. Révélation - Les solutés étant incolores, il faut les faire apparaître par une réaction chimique. On utilise pour cela le réactif de Molisch, qui donne une coloration violette après réaction avec les glucides. -Sortir la plaque, matérialiser au crayon de papier la ligne de front du solvant. -Sécher la plaque, éventuellement à l'aide d'un sèche-cheveux. -Sous la hotte aspirante, immerger la plaque dans le réactif de Molisch, sécher, et placer la plaque à l'étuve à 100°C pendant quelques minutes. N.B : On peu aussi déterminer les taches sous lampe UV.

6. Résultats : Exploitation du chromatogramme - Calculer le rapport frontal RF de chaque sucre, c'est-à-dire le rapport de la distance parcourue par le sucre (repérée au centre de la tâche) sur la distance parcourue par le front du solvant. « Ce RF est une constante pour chaque sucre dans les conditions de cette chromatographie ».

Par comparaison, identifier et déterminer la composition en sucre du jus de fruit.

Rf = distance parcourue par la substance (au centre de la tache) / distance parcourue par le solvant.

Matière: Techniques Biochimiques Responsable de la matière : Dr. REGGAMI.Y TP n° 04 : Identification, séparation et dosage des colorants alimentaires du sirop de menthe.

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TP n° 04 : Identification, séparation et dosage des colorants alimentaires du sirop de menthe.

(Chromatographie sur papier/Chromatographie sur colonne/Spectrophotométrie)

1. Objectifs : Optimiser, par le choix de l’éluant (nature et concentration), la séparation des constituants

d'un mélange de deux colorants, en utilisant la technique de chromatographie de partage sur papier.

Exploiter des chromatogrammes. Réaliser une chromatographie sur colonne. Faire un dosage spectrophotométrique des colorants.

2. Principe de la chromatographie : Le mot chromatographie vient du grec Khrôma qui signifie couleur. En effet, à l’origine, cette

technique servait à séparer des espèces chimiques végétales colorées (pigments) contenues dans un mélange. La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différences d’affinité des espèces à analyser à l’égard de deux phases, l’une stationnaire ou fixe, l’autre mobile. Elle permet d’identifier ou de séparer tout type d’espèces chimiques contenues dans un mélange homogène (gazeux ou liquide).

Lorsqu’on réalise une chromatographie, que ce soit sur papier, sur couche mince (C.C.M.) ou sur colonne, il faut donc préciser :

Le support ou phase stationnaire ou

fixe ; l’éluant ou phase mobile ; et la technique de révélation si les

espèces chimiques étudiées sont incolores.

Dans la chromatographie sur papier proposée ici, la phase fixe est formée par l’eau adsorbée par les molécules de cellulose du papier Whatman et la phase mobile est un liquide, l’éluant. C’est une chromatographie de partage qui repose sur la différence de solubilité des espèces dans les deux solvants. Si une espèce est plus soluble dans la phase mobile, l’éluant, elle se déplace plus rapidement qu’une espèce qui l’est moins et inversement. La polarité des phases est un autre paramètre qui agit sur la progression de l’espèce. La chromatographie sur papier est particulièrement adaptée à l’analyse des composés très polaires : acides aminés, sucres, composés polyfonctionnels.


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Les chromatographies sur couche mince et sur colonne sont des chromatographies d’adsorption où la phase stationnaire est un solide, il s’agit par exemple de silice ou d’alumine traitée et la phase mobile un liquide. La séparation est basée sur l’adsorption sélective des espèces à la surface du solide. L’éluant migre à travers la phase stationnaire par capillarité.

Exploitation d’un chromatogramme. À une tache d’un chromatogramme correspond une seule espèce chimique. Pour caractérisée cette espèce sur le chromatogramme on utilise la notion de rapport frontal, noté RF. Par exemple pour l’espèce E2 du chromatogramme ci-contre, il est définit par la relation

: . C’est un nombre sans unité.

3. Réactifs et matériel : 3.1. Réactifs et produits utilisés :

Sirop de menthe : 50 ml. Na cl : 20 g. Ethanol 96° : 20 ml. Solution d’ammoniaque (0,1 mol.L-1) : 20 ml. Poudre de silice. Coton.

Colorant vert du sirop de menthe : 1g. Jaune de tartrazine: 1g. Bleu patenté: 1g. Eau distillée: 2 L.

3.2. Matériel : 6 Cuves à chromatographie ou 6 Bêcher de 250ml. 6 Feuilles de papier Whatman (ou de papier filtre) Micropipette ou Capillaires pour faire les dépôts. Balance Analytique + Spatule + Capsule de pesée. 3 tubes à essais + Portoir. Brin de 20 cm de laine écrue. Plaque chauffante. Spectrophotomètre + cuves.

Entonnoir. 2 Pipette pasteur. Pipettes. Compte-gouttes. Sèche-cheveux. Agrafeuse. Agitateur en verre

4. Mode opératoire : 4.1. La chromatographie sur papier : 4.1.1. Récupération du colorant du sirop de menthe :

Dans un bécher, placer un brin de 20 cm de laine écrue (c’est à dire non colorée) ; on peut aussi décolorer un brin de laine après une ébullition douce dans une solution d’ammoniaque (0,1 mol.L-1)

Verser environ 40 mL de sirop de menthe et 5 mL de solution d’acide éthanoïque environ molaire (ou de vinaigre blanc)

Porter à ébullition pendant une dizaine de minutes en remuant la laine avec un agitateur en verre


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Une fois le brin de laine bien imprégné, le sortir du bécher et le rincer à l’eau. Placer ensuite le brin de laine dans un bécher contenant 20 mL de solution d’ammoniaque

(0,1 mol.L-1)

Porter l’ensemble à ébullition douce pendant une dizaine de minutes Retirer le brin de laine et continuer l’ébullition pour concentrer la solution de colorant. Soit

S, la solution obtenue.

4.1.2. Réalisation de chromatographies avec différents éluants :

Découper dans une feuille de papier Whatman (ou de papier filtre) une bande de 10 cm de large et de 10-12 cm de haut.

Tracer au crayon de papier une ligne à 1 cm du bord inférieur et sur cette ligne 3 petites croix séparées de 2-3 cm entre elles et des bords

Sur chacune des croix, placer avec un capillaire un dépôt de la solution S de la partie 1, et respectivement des solutions de jaune de tartrazine et de bleu patenté et sécher avec un sèche-cheveux et faire une seconde application, puis sécher à nouveau..

Donner au papier une forme cylindrique de diamètre inférieur à celui du diamètre intérieur de la cuve en attachant les bords opposés avec des agrafes (éviter que les bords ne se chevauchent).

Dans un bécher de 250 mL large, verser sur environ un demi-centimètre de hauteur l’un des éluants du tableau suivant (chaque groupe traite un éluant) puis mettre le couvercle.

Placer le papier dans le bécher en évitant que celui-ci ne touche les parois. Réaléser l’élution. Récupérer puis sécher le chromatogramme.

Conclure sur le choix de l’éluant.

QUESTIONS : Le sirop de menthe contient du bleu patenté V, E 131, généralement fourni sous la forme de sel calcique et du jaune de tartrazine, E 102, généralement fourni sous forme de sel trisodique.


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a) En vous aidant des résultats obtenus en chromatographie sur papier de tous les groupes conclure sur les solubilités comparées des deux colorants selon la nature de l’éluant.

b) Quel est donc l’éluant adapté pour analyser les colorants présents dans le sirop de menthe ? c) Au vu des formules chimiques, expliquer pourquoi le jaune de tartrazine est moins soluble

dans l’éthanol que le bleu patenté. d) Le rapport frontal d'une espèce dépend-il de l'éluant ?

4.2. La chromatographie sur colonne du sirop de menthe. Dans la partie précédente nous avons identifié les

colorants présents dans un sirop de menthe et nous désirons maintenant les séparer.

Préparation de la colonne. Enfoncer délicatement un morceau de

coton dans la pipette pasteur sans le tasser.

Remplir la pipette avec un peu d'eau et boucher la partie effilée avec le doigt. La colonne ne doit pas contenir de bulles d'air.

Remplir au trois quart avec la poudre de silice en versant successivement un peu d'eau, un peu de silice, un peu d'eau, un peu de silice, etc.

Enfoncer un peu de coton sur la silice sans le tasser et fixer la colonne sur un support de façon à ce qu'elle reste verticale.

Le niveau d'eau s'ajuste quand on retire le doigt de la partie effilée.

Réalisation de la chromatographie. Placer un premier tube à essais (n°1) sous

la pipette et avec une pipette ou avec un compte gouttes, verser 3 à 4 gouttes de sirop de menthe.

Remplir immédiatement la colonne avec d’éluant (eau) jusqu’à ce qu’il coule.

Surveiller le niveau de l'éluant au-dessus de la colonne.

Procéder à l’élution, sans dessécher la colonne, en ajoutant régulièrement de l’éluant par le haut de la colonne.


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Observer la colonne pendant l'élution. Recueillir dans un deuxième tube à essais

(n°2) le colorant jaune. Remplacer l'eau par de l'alcool à 95° (ou

éthanol) lorsque le premier colorant est extrait.

Récupérer la phase transitoire dans le premier tube à essais.

Recueillir le deuxième colorant dans un troisième tube à essais (n°3).

Exploitation. Quelles sont les teintes des différentes

solutions recueillies ? Mélanger les tubes n°2 et n°3. Qu’obtient-

on ?

4.3. Etude de l’absorption optique des colorants : Etudier au spectrophotomètre le spectre d’absorption respectivement de la solution de

jaune de tartrazine (2mg /100ml d’eau), de bleu patenté (1mg /100ml d’eau) et du sirop de menthe (dilué 10 fois).

QUESTIONS :

Le spectre du sirop de menthe est-il cohérent avec les observations des manipulations de chromatographie ?

Quelles sont les valeurs de longueur d’onde du maximum d’absorption pour chaque colorant ?

A quelle couleur du spectre visible correspond respectivement ces valeurs de longueur d’onde ?

Ces couleurs sont-elles cohérentes avec les couleurs de chacun des colorants ? On se propose de doser les quantités respectives de bleu patenté et de jaune de

tartrazine dans le sirop de menthe par un dosage spectrophotométrique par étalonnage.

a) Rappeler le principe d’un dosage par étalonnage spectrophotométrique et le protocole à suivre.

b) Pour doser le bleu patenté, à quelle valeur de longueur d’onde faut-il se placer et pourquoi ?

c) Pour doser le jaune de tartrazine : - à quelle longueur d’onde faut-il, a priori, se placer ? - compte tenu du spectre du bleu patenté à cette longueur d’onde, quel est

l’inconvénient de choisir cette valeur de longueur d’onde ? - Proposer une solution pour pallier cet inconvénient en précisant ses limites.

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TP de Techniques Biochimiques - University of M'silavirtuelcampus.univ-msila.dz/facscience/wp-content/...TP n 01 : Détermination de la composition générale de différents aliments