Études des caractéristiques biochimiques et structurales

ISABELLE BANVILLE

ÉTUDE DES CARACTÉRISTIQUES BIOCHIMIQUES ET STRUCTURALES DE LA PROTÉINE DMC1 DE

SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise biologie cellulaire et moléculaire pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc)

FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

NOVEMBRE 2004 © Isabelle Banville, 2004

Résumé Peu de données sont connues à savoir comment des protéines méiotiques régulent la

recombinaison homologue de façon biochimique. Lors d'études effectuées chez l'humain, il

a été démontré que hRad51 se comporte sensiblement comme le fait son homologue

bactérien, RecA. Malgré que hDmc1 possède une séquence d’acides aminés possédant

52% d’identité à celle de hRad51, ses caractéristiques et ses capacités sont différentes.

Afin d’étudier si cette disparité est conservée chez l'organisme Schizosaccharomyces

pombe nous avons purifié et étudié biochimiquement la protéine Dmc1 de cet organisme.

Nous montrons que spDmc1 lie préférentiellement l'ADN simple brin et protubérant à

l'ADN double brin, une propriété similaire à son homologue bactérien RecA. SpDmc1

purifiée est capable de catalyser des réactions d’échange de brins, telles que rencontrées

durant la recombinaison homologue. Contrairement à la protéine humaine, spDmc1 a la

capacité de lier l'ADN et d'y former un filament hélicoïdal, la signature des recombinases

classiques.

Remerciements Remerciement sincère à Jean-Yves Masson.

Merci pour l’aide, la patience et surtout, merci de nous aider à s’amuser en travaillant.

Merci à mon équipe de travail, Marie-Christine Gauthier, Ugo Déry et Mickaël Ploquin.

Merci d’avoir partager mes hauts et mes bas, vous m’avez fait passer de très bons moments.

Merci à ma famille.

Merci d’être là, et de m’avoir encouragée dans mon cheminement.

Merci à toi, Oli, de m’avoir remis sur pied lorsque j’en ai eu besoin.

À cette bière qui, quelques fois, nous donne le courage de tout recommencer, encore une fois.

Table des matières

1 INTRODUCTION --------------------------------------------------------------------------------------------------- 1

1.1 LA MÉIOSE -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 1.1.1 Le cycle biologique de S.pombe ----------------------------------------------------------------------------- 3 1.1.2 La diversité génétique ---------------------------------------------------------------------------------------- 4

1.2 LA RECOMBINAISON INTERHOMOLOGUE ---------------------------------------------------------------------- 5 1.2.1 Les cassures double brin de l’ADN ------------------------------------------------------------------------- 5

1.3 RÉPARATION DES CASSURES DOUBLE BRIN ------------------------------------------------------------------- 6 1.3.1 Non crossing-over vs crossing-over ------------------------------------------------------------------------ 6 1.3.2 Le non crossing-over ----------------------------------------------------------------------------------------- 7 1.3.3 Le crossing-over----------------------------------------------------------------------------------------------- 7

1.4 LES RECOMBINASES --------------------------------------------------------------------------------------------- 8 1.4.1 RecA : recombinase bactérienne ---------------------------------------------------------------------------- 8

1.4.1.1 Sa structure----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9 1.4.1.2 Le filament ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9 1.4.1.3 La réaction d’échange de brin ------------------------------------------------------------------------------------10 1.4.1.4 La renaturation------------------------------------------------------------------------------------------------------10

1.4.2 Rad51 --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 10 1.4.2.1 Similitudes et différences avec RecA----------------------------------------------------------------------------12 1.4.2.2 Les mutants de rad51 chez S.cerevisiae -------------------------------------------------------------------------13

1.4.3 Dmc1 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 13 1.4.3.1 Sa structure----------------------------------------------------------------------------------------------------------14 1.4.3.2 La liaison a l’ADN et le filament --------------------------------------------------------------------------------14 1.4.3.3 La réaction d’échange de brin et la renaturation ---------------------------------------------------------------15 1.4.3.4 Les mutants----------------------------------------------------------------------------------------------------------15

1.5 BUTS DU PROJET DE MAÎTRISE -------------------------------------------------------------------------------- 16

2 MATÉRIELS ET MÉTHODES--------------------------------------------------------------------------------- 17

2.1 LE SYSTÈME D’EXPRESSION PET CHEZ ESCHERICHIA COLI ------------------------------------------------ 17 2.2 RÉACTION DE POLYMÉRISATION EN CHAÎNE (PCR)-------------------------------------------------------- 17 2.3 GEL D’AGAROSE ----------------------------------------------------------------------------------------------- 18 2.4 CLONAGE DES GÈNES RAD51(+) ET DMC1(+) DANS LES VECTEURS D’EXPRESSION -------------------- 19 2.5 PRÉPARATION DU VECTEUR PET16B------------------------------------------------------------------------- 20 2.6 EXTRACTION SUR GEL D’AGAROSE -------------------------------------------------------------------------- 20 2.7 CLONAGE ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 21 2.8 TRANSFORMATION DES CELLULES COMPÉTENTES : -------------------------------------------------------- 21 2.9 PRÉPARATION D’ADN PLASMIQUE -------------------------------------------------------------------------- 22 2.10 SÉQUENÇAGE --------------------------------------------------------------------------------------------------- 24 2.11 MUTAGENÈSE -------------------------------------------------------------------------------------------------- 24 2.12 GEL D’ACRYLAMIDE------------------------------------------------------------------------------------------- 26 2.13 PRODUCTION PROTÉIQUE-------------------------------------------------------------------------------------- 26 2.14 EXTRACTION DE PROTÉINES ---------------------------------------------------------------------------------- 27 2.15 PURIFICATION DE LA PROTÉINE DMC1 EXPRIMÉE CHEZ E.COLI------------------------------------------- 28 2.16 PURIFICATION DE LA PROTÉINE RAD51 EXPRIMÉE CHEZ E.COLI------------------------------------------ 29 2.17 FILTRATION SUR GEL ------------------------------------------------------------------------------------------ 29 2.18 RENATURATION D’ADN SIMPLE BRIN ----------------------------------------------------------------------- 31 2.19 RETARDEMENT SUR GEL -------------------------------------------------------------------------------------- 32 2.20 ÉCHANGE DE BRIN --------------------------------------------------------------------------------------------- 34 2.21 MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE-------------------------------------------------------------------------------- 35

3 RÉSULTATS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 36

3.1 CLONAGE ET MUTAGENÈSES---------------------------------------------------------------------------------- 36 3.2 EXPRESSION ET PURIFICATION DE LA PROTÉINE DMC1 DE S.POMBE ------------------------------------- 36

iv

3.3 FILTRATION SUR GEL ------------------------------------------------------------------------------------------ 37 3.4 INTERACTION PAR DOUBLE HYBRIDE ------------------------------------------------------------------------ 38 3.5 LIAISON À L’ADN PAR DMC1 DE S.POMBE------------------------------------------------------------------ 39 3.6 ACTIVITÉ ATPASE DE DMC1 DE S.POMBE------------------------------------------------------------------- 40 3.7 RENATURATION DE L’ADN----------------------------------------------------------------------------------- 41 3.8 RÉACTION D’ÉCHANGE DE BRIN ------------------------------------------------------------------------------ 42 3.9 FILAMENT PROTÉIQUE SUR L’ADN -------------------------------------------------------------------------- 42

4 CONCLUSIONS --------------------------------------------------------------------------------------------------- 44

BIBLIOGRAPHIE------------------------------------------------------------------------------------------------------- 48

Liste des tableaux

1 INTRODUCTION --------------------------------------------------------------------------------------------------- 1

TABLEAU 1.1 : COMPARAISON STRUCTURALE DES PROTÉINES RECA ET RAD51 -------------------------------- 11 TABLEAU 1.2 : COMPARAISON DE RECA D'E.COLI AVEC LES PROTÉINES SCRAD51 ET HRAD51 -------------- 12


TABLEAU 2.1 : AMORCES UTILISÉES LORS DE L'AMPLIFICATION PAR PCR -------------------------------------- 18 TABLEAU 2.2 : CELLULES COMPÉTENTES UTILISÉES LORS DES TRANSFORMATIONS PAR CHOC THERMIQUE - 21 TABLEAU 2.3 : TAMPONS NÉCESSAIRES À LA PRÉPARATION D'ADN PLAMIDIQUES ----------------------------- 23 TABLEAU 2.4 : AMORCES UTILISÉES LORS DU SÉQUENÇAGE------------------------------------------------------- 24 TABLEAU 2.5 : AMORCES UTILISÉES LORS DE LA DÉLÉTION DIRIGÉE DE L'INTRON GÉNOMIQUE --------------- 25 TABLEAU 2.6 : AMORCES UTILISÉES LORS DU RETARDEMENT SUR GEL ------------------------------------------ 33

3 RÉSULTATS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 36

4 CONCLUSIONS --------------------------------------------------------------------------------------------------- 44

Liste des figures

1 INTRODUCTION --------------------------------------------------------------------------------------------------- 1

FIGURE 1.1 : SÉGRÉGATION DES CHROMOSOMES LORS DE LA MÉIOSE.--------------------------------------------- 1 FIGURE 1.2 : ILLUSTRATION DU COMPLEXE SYNAPTONEMAL LORS DE LA PROPHASE MÉIOTIQUE I ------------- 2 FIGURE 1.3 : SCHÉMA DU CYCLE CELLULAIRE MÉIOTIQUE ---------------------------------------------------------- 3 FIGURE 1.4 : CELLULES DIPLOÏDES DE S.POMBE SUITE A LA MÉIOSE ----------------------------------------------- 3 FIGURE 1.5 : CYCLE BIOLOGIQUE DE S.POMBE ------------------------------------------------------------------------ 4 FIGURE 1.6 : LE NON-CROSSING-OVER --------------------------------------------------------------------------------- 7 FIGURE 1.7 : LE CROSSING-OVER --------------------------------------------------------------------------------------- 8 FIGURE 1.8 : RECA ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9 FIGURE 1.9 : STRUCTURE OCTAMÉRIQUE DE DMC1 OBTENUE PAR CRISTALLOGRAPHIE ----------------------- 14


3 RÉSULTATS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 36

FIGURE 3.1 : ILLUSTRATION DE LA MUTAGENÈSE EFFECTUÉE SUR L'ADN GÉNOMIQUE ------------------------ 36 FIGURE 3.2 : EXPRESSION ET PURIFICATION DE LA PROTÉINE DMC1 DE S.POMBE ------------------------------ 37 FIGURE 3.3 : NATURE MULTIMÉRIQUE DE LA PROTÉINE DMC1 DE S.POMBE ------------------------------------- 37 FIGURE 3.4 : INTERACTION PAR DOUBLE HYBRIDE ----------------------------------------------------------------- 38 FIGURE 3.5 : RETARDEMENT SUR GEL DE LA PRTÉINE DMC1 DE S.POMBE --------------------------------------- 39 FIGURE 3.6 : CONDITIONS FAVORABLES À LA LIAISON À L'ADN ------------------------------------------------- 40 FIGURE 3.7 : ACTIVITÉ ATPASE DE DMC1 DE S.POMBE------------------------------------------------------------ 40 FIGURE 3.8 : RENATURATION DE L'ADN PAR LA PROTÉINE DMC1 DE S.POMBE--------------------------------- 41 FIGURE 3.9 : RÉACTION D'ÉCHANGE DE BRIN PAR LA PROTÉINE DMC1 DE S.POMBE---------------------------- 41 FIGURE 3.10 : MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE------------------------------------------------------------------------- 42

4 CONCLUSIONS --------------------------------------------------------------------------------------------------- 44

Liste des abréviations AD : Domaine d’activation Gal4 (double hybride)

ADE : Adénine

Amp : Ampicilline

Cam : Chloramphénicol

CDB : Cassure double brin

db : Double brin

DBD : « Gal4 DNA binding domain » (double hybride)

Dr : Docteur

DTT : Dithiothreitol

G1 : Intervalle de temps de croissance précédant la synthèse d’ADN

G2 : Intervalle de temps précédant la division cellulaire

h : Heure

his-tag : Étiquette d’histidine

IPTG : Isopropyl-β-thiogalactopyranoside

kb : Kilobase

LB : Milieu de culture bactérienne « Luria Broth »

M : Phase de division cellulaire (mitose, méiose)

min : Minute

nm : Nanomètre

pb : Paire de bases

pH : Potentiel hydrogène

S : Phase de synthèse de l’ADN

sb : Simple brin

SC : Complexe synaptonemal

viii

SDSA : « Synthesis dependent strand annealing »

SSB : « Single strand DNA binding protein »

Sp : Schizosaccharomyces pombe

RPA : « Replication protein A »

rpm : Révolution par minute

YPD : Milieu de culture de levure « Yeast extract, Peptone, Dextrose »

1 Introduction

1.1 La méiose Il existe, chez les eucaryotes, un type de division nucléaire et cellulaire caractéristique à la

reproduction sexuée appelé méiose. Celle-ci se singularise par le fait qu’elle génère quatre

cellules haploïdes (gamètes ou spores) génétiquement non équivalentes à partir d’une seule

cellule diploïde originale. Pour ce faire, la méiose procède à deux cycles de divisions

cellulaires pour une seule réplication du matériel génétique.

La première ronde de division méiotique, la division réductionnelle, amène la disjonction

des chromosomes homologues. Cette étape, si on la compare à la division mitotique du

cycle végétatif, diffère par le fait qu’il n’y a séparation des centromères (lien entre deux

chromatides sœurs formant un

chromosomes) (voir figure

1.1). Les chromatides sœurs

restent alors appariées

ensembles et, s’en suit la

ségrégation des chromosomes

homologues. Il y a donc

formation de deux cellules

contenant chacune un seul

exemplaire de chaque type de

chromosome dédoublé en deux

chromatides ( Roeder, 1997).

Division réductionelle et équationelle

En prophase, il y a condensation des chromosomes (apparition sous forme de deux

chromatides sœurs attachées par le centromère), migration des centrioles vers les pôles

opposés de la cellule et dissolution de l’enveloppe nucléaire à l’exception de celle des

levures. Cette première étape de la division réductionnelle occupe 90% de la méiose et est

subdivisée en cinq stades (http://webiologie.free.fr/cellules/domaines/meiose.html). Le

Figure 1.1: Ségrégation des chromosomes lors de la méiose. Les chromosomes homologues parentaux sont indiqués en vert (père) et en bleu (mère).

http://webiologie.free.fr/cellules/domaines/meiose.html

2

premier, le leptotène est caractérisé par la condensation des chromatides sous forme de

minces filaments fixés à un axe protéique (voir figure 1.2). Ensuite, le zygotène amène

l’appariement des chromosomes homologues et la formation du complexe synaptonemal

(SC) entre les deux jeux de chromatides. Le pachytène, troisième étape de la prophase,

permet la recombinaison génétique entre les chromosomes homologues grâce au SC qui

assure un contact étroit entre ceux-ci. Vient ensuite la dissolution des SCs et le début de la

séparation des chromosomes homologues. Ces derniers s'éloignent l'un de l'autre, mais

restent joints au niveau des chiasmas; zone d'échange d'ADN entre deux chromatides par

crossing-over. Cette étape caractéristique se nomme diplotène. Ensuite, la diacénèse

marque le retour à la prophase normale. Dans chacune des tétrades, les chromatides sœurs

sont reliées par leur centromère et les chromatides non-sœurs par leurs chiasmas. La

prophase terminée, le cycle cellulaire continue avec la métaphase. L’ADN s’aligne alors

sur le plan équatorial de la cellule, attachée au niveau des centromères par les microtubules

reliés aux deux centrioles. L’anaphase amène ensuite le détachement des chromatides

sœurs et le déplacement de chacune d’elle vers un pôle opposé, par l’action des

microtubules. Lors de l’étape subséquente, la télophase, il y a relâchement des

chromosomes en chromatine et la cellule retrouve son état original. Il y a donc disparition

du fuseau mitotique, formation de la membrane nucléaire et du nucléole. L’apparition de

deux cellules filles se fait finalement, étape que l’on nomme cytocinèse.

Figure 1.2 : Illustration de la formation et du démembrement du complexe synaptonemal lors de la prophase méiotique I. Illustration provenant du livre Molecular Biology of the cell, 4eme édition.

3

Figure 1.3 : Schéma du cycle cellulaire méiotique. Obtention de 4 cellules filles haploïdes génétiquement différentes à partir d’une cellule diploïde parentale.

Figure 1.4 : Cellules diploïdes de S.pombe suite à la méiose. Coloration effectuée par DAPI. Image gracieusement fournie par Paul Nurse.

Suite à ces étapes, le cycle reprend et la deuxième division méiotique débute. Celle-ci se

rapporte à la division mitotique, puisqu’il y a séparation des chromatides sœurs

subséquente à la division des centromères. On la nomme mitose équationelle. Il en résulte

alors quatre cellules filles comprenant chacune une chromatide de chaque paire initiale de

chromosomes homologues (voir figure 1.3) (Roeder, 1997).

1.1.1 Le cycle biologique de S.pombe Schizosaccharomyces pombe est une levure cylindrique

possédant des extrémités arrondies. Sa taille varie selon

son état, de 3-4μM de largeur sur 6-15μM de longueur

lorsqu’elle est sous forme haploïde, et de 4-5μM de

largeur sur 10-25μM de longueur en phase diploïde

(voir figure 1.4). Sa taille est facilement observable au

microscope optique. Contrairement à Saccharomyces

4

cerevisiae, une levure à bourgeonnement, pombe se divise plutôt par fission transversale

(http://www.didier-pol.net/4pombe1.htm).

Lors du cycle végétatif, cette levure se retrouve généralement sous forme haploïde.

L’avènement du cycle

sexué, lors de conditions

nutritives défavorables,

conduit à la fusion de 2

cellules haploïdes

compatibles sexuellement.

Il y a alors formation d’un

zygote. Ce zygote peut

alors suivre le cycle

végétatif sous forme

diploïde, et former quatre

ascospores lors d’une

éventuelle méiose (voir figure 1.5).

Le cycle biologique de Schizosaccharomyces pombe diffère en quelques points des autres

eucaryotes. En effet, son interphase est caractérisée par un stade G1 très court et un G2 très

long. De plus, la séparation des cellules s’effectue en phase S comparativement à la fin de

la phase M chez les autres organismes (http://www.didier-pol.net/4pombe1.htm).

1.1.2 La diversité génétique Précédant les deux divisions cellulaires, la prophase du premier cycle méiotique (prophase

I) amène la nature à se diversifier en permettant la production de chromosomes

recombinants. Lors de cette prophase, l’alignement et la synapse des chromosomes

homologues permettent le transfert d’information génétique entre les chromosomes

parentaux au cours d’un phénomène appelé recombinaison interhomologue. Cet échange

favorise l’évolution des espèces en amenant la nature à se diversifier à une fréquence de

100 à 1000 fois supérieure que lors du cycle végétatif (Smith & Nicolas, 1998).

Figure 1.5 : Cycle biologique de S.pombe. Provient du site internet : http://www.didier-pol.net/4pombe1.htm

http://www.didier-pol.net/4pombe1.htm


5

1.2 La recombinaison interhomologue La recombinaison interhomologue est induite suite au mécanisme de cassure double brin de

l’ADN (CDB). Il semblerait maintenant que le même procédé de réparation des CDBs

serait à la base du réarrangement génétique interhomologue.

1.2.1 Les cassures double brin de l’ADN Les cassures double brin de l’ADN (CDBs) sont une cause connue d’instabilité génomique

pouvant mener à la formation de cancer ou à la mort cellulaire (Masson & West, 2001).

Ces cassures peuvent être induites par des agents exogènes (radiation γ, agents chimiques),

des agents endogènes (radicaux libres, réplication de cassure simple brin) mais aussi par

des mécanismes spécialisés. Parmi ceux-ci, la recombinaison V(D)J permettant la création

d’anticorps variés pouvant nous protéger, et la méiose, qui mène à la recombinaison

méiotique.

Chez l’organisme Schizosaccharomyces pombe, les protéines Rec6, Rec7, Rec12, Rec14 et

Rec15 seraient essentielles à la formation des CDBs nécessaires à la recombinaison

interhomologue (Cervantes & al, 2000). La protéine Rec12, orthologue de la protéine

Spo11, est présente chez la majorité des organismes eucaryotes. Cette protéine de type

topoisomérase est en quelques sorte un homologue de l’unité A de la topoisomérase

archéobactérienne IV. Cette topoisomérase de type II est un hétérotétramère composé

d’unités A et B. L’unité A a pour fonction de cliver l’ADN suite à une réaction de

transestérification tandis que l’unité B coordonne le bris et la jonction de l’ADN. Chez la

plupart des eucaryotes, seule l’unité A (Spo11) a été découverte, l’unité B semble

généralement absente (Roeder, 1997 ; Villeneuve & Hilers, 2001). Cette réaction, de

transestérification, amenant la cassure de l’ADN prend lieu au stage leptotène de la

prophase I dans des régions relâchées de la chromatine. Par contre, lors d’expérimentation

par double hybride, des sites artificiels de coupure ont toutefois pu être créés

artificiellement près du site de liaison de Gal4 lors de la fusion de Spo11 au facteur de

transcription Gal4. Ce résultat démontre que la coupure effectuée par Spo11 est suffisante

à l’avènement de la recombinaison méiotique à d’autres sites dans le génome (Pecina & al,

2002). Suite à cette initiation de la recombinaison (effectuée par Spo11) les protéines

6

Rad50, Mre11 et Xrs2 vont resecté les extrémités 5’ des coupures (Roeder, 1997 ; Heyer,

2004). Il semble que Rad50 et Mre11 soient essentielles à la formation et la maturation de

la cassure double brin (Roeder, 1997). Les extrémités 3’ protubérantes générées seraient

alors à la base de l’invasion du duplex homologue permettant l’échange d’information

génétique. Ce mécanisme d’invasion impliquerait les mêmes protéines de réparation de

l’ADN, soit Rad51 et son homologue méiotique Dmc1.

1.3 Réparation des cassures double brin Lors du cycle mitotique, la cellule utilise deux méthodes différentes pour réparer les CDBs

créées de façon accidentelles. La première, s’effectue lors d’une cassure en phase G1 par

« Non Homologous End Joining ». Cette réparation, de type « couper-coller », ne nécessite

pas une homologie de séquence, elle relie simplement les extrémités de la cassure ensemble

(West & al, 2000). La deuxième méthode s’effectue par recombinaison entre chromatides

sœurs suite à la réplication de l’ADN. La réparation des cassures induite par la protéine

Spo11 lors du cycle méiotique a lieu entre chromosomes homologues et se distingue en

deux mécanismes. L’un mène à l’échange d’information génétique par la formation de

crossing-over, l’autre non.

1.3.1 Non crossing-over vs. crossing-over Le phénomène appelé crossing-over se définit comme l’échange de matériel génétique

entre les chromatides non-sœurs de chromosomes homologues. Dans une cellule en

division méiotique, 30 à 50% des recombinaisons mènent à un échange d’information

génétique par crossing-over (Pâques & Haber, 1999). Mais comment différencier les

mécanismes de réparation menant à la formation de crossing-over de ceux dont l’échange

est avorté ?

Selon des études effectuées, des distinctions cytologiques permettraient de distinguer les

CDBs menant à l’échange par crossing-over de celle ni menant pas. En effet, lors de

l’avènement des CDBs en prophase I, il y a formation de nodules protéiques aux lieux de

cassures (Roeder, 1997). L’évolution de la cellule en pachytène (voir figure 1.2) amène la

disparition de plusieurs nodules et l’évolution de certains en nodules tardifs (late nodule).

7

Il semble que les nodules primaires disparaissant durant la phase leptotène soient

responsables de la réparation par SDSA (Synthesis-dependent strand annealing),

phénomène ne menant pas à la formation de crossing-over (Pâques & Haber, 1999 ;

Villeneuve & Hilers, 2001). Pour ce qui est des nodules tardifs, leurs pourcentages relatifs

aux nodules primaires correspondent aux pourcentages de recombinaison méiotique menant

à la formation de crossing-over. Une étude a démontré que des mutants incapables

d’effectuer le pachytène ont un nombre normal de nodules primaires et de réparations sans

crossing-over. Ces mutants sont cependant incapables de résoudre le nombre élevé de

molécules jointes formées et ont un faible taux de crossing-over. En conclusion, on en

déduit que les nodules primaires marqueraient le site d’invasion de l’ADN tandis que les

nodules tardifs procèderaient par certains intermédiaires à la résolution par crossing-over et

que la décision de réparation suit l’invasion du brin resecté et implique l’homologie des

séquences (Allers & Lichten, 2001).

1.3.2 Le non crossing-over Le SDSA est un modèle conservateur de réparation initié

suite à une homologie de séquence de 25 à 60 nucléotides

(Allers & Hitchen, 2001). Selon ce modèle, suite à la

cassure, il y a résection 5’-3’ du brin endommagé et

invasion d’un seul brin sur son homologue (voir figure

1.6). Il y a, par la suite, synthèse d’ADN et,

contrairement aux différents modèles connus, le brin

réparé retourne par annelage à la molécule endommagée.

Il y a donc réparation sans échange d’ADN avec son

homologue.

1.3.3 Le crossing-over Hunter et Kleckner ont étudié le processus menant à la

formation de crossing-over. Suite à la cassure et à la

résection, il y aurait invasion et formation d’un

Figure 1.6 : Le non crossing-over. Réparation des cassures double brin par Synthesis dependant strand anneling.

8

intermédiaire sous forme de molécule jointe

apparaissant suite à la formation d’un complexe

synaptonemal. Le crossing-over résultant s’obtient

suite à la formation et à la résolution d’une double

jonction d’Holliday (voir figure 1.7) (Hunter &

Kleckner, 2001).

Contrairement au modèle précédant, celui-ci requiert

une homologie de 150 à 200 nucléotides et est résolu

en phase pachytène de la méiose (Heyer, 2004).

1.4 Les recombinases Par définition, une recombinase est une protéine

favorisant les interactions ADN-ADN (West, 2003).

Essentielles aux mécanismes de recombinaison, les

recombinases se lient à l’ADN afin de l’apparier à

son homologue. La première recombinase étudiée fut isolée de l’organisme procaryote

Escherichia coli. Cette protéine, RecA, est le modèle utilisé pour l’étude de la

recombinaison et du mécanisme de réparation de l’ADN. Ses fonctions biochimiques et

structurales bien connues sont aujourd’hui comparées à celles des nouvelles recombinases.

1.4.1 RecA : recombinase bactérienne Isolés pour la première fois dans les années 60 dans le laboratoire de John Clark, les

mutants bactériens RecA démontraient une forte sensibilité aux rayons U.V ainsi qu’aux

rayons X et comportaient des défauts de recombinaison génétique. Ce n’est cependant

qu’une vingtaine d’années plus tard que la protéine fût isolée et qu'elle put être étudiée

(Masson & West, 2001).

Ayant une chaîne polypeptidique de 352 acides aminés, cette protéine a un poids

moléculaire de 37 842 Da. De façon basale, RecA est exprimée de sorte qu’il y ait de huit à

dix milles monomères par cellule. Lorsque soumise à des agents endommageant l’ADN, la

Figure 1.7 : Le crossing-over Réparation des cassures double brin de l’ADN suite à la résolution de double jonction d’Holliday (DJH), menant ou non à l’échange d’information génétique.

9

cellule augmente sa quantité de monomère jusqu'à 70 milles afin d’induire la réponse SOS

(Cox, 2003). Il semble que la formation de filaments nucléoprotéiques permettrait un

changement de conformation amenant l’hydrolyse du répresseur Lex A. De cette façon, il y

aurait induction d’une vingtaine de gènes impliqués dans la réponse SOS (Baumann &

West, 1998).

1.4.1.1 Sa structure La structure protéique de RecA se divise en trois parties distinctes. La première, le

domaine N-terminal, semble impliquée dans les interactions entre les monomères

protéiques. Ce domaine jouerait donc un rôle dans la formation de filaments multimériques

sur l’ADN. Le second, que l’on nomme domaine central, inclut les acides aminés 34 à 269

et comporte des sites de liaisons à l’ATP et à l’ADN. Les résidus 47 à 74 seraient

essentiels à la liaison et à l’hydrolyse de l’ATP. Cette énergie apportée par l’hydrolyse de

l’ATP est essentielle aux changements de conformations caractéristiques des recombinases.

La presque totalité des organismes bactériens possèdent une recombinase RecA et, parmi

les différentes espèces, ce domaine est généralement bien conservé. Les résidus 270 à 352

comportent environ 25 résidus chargés négativement. De séquences généralement peu

conservées, ce domaine est appelé C-terminal (Cox, 2003).

1.4.1.2 Le filament L’assemblage des monomères hexamériques de RecA

permet la formation d’un filament hélicoïdal (voir figure

1.8). Son assemblage, sur l’ADN, se fait de façon

unidirectionnelle, soit de l’extrémité 5’ allant vers

l’extrémité 3’. Le désassemblage s’effectue lui aussi

dans la même direction (Cox, 2003). La création d’un

filament nucléoprotéique de RecA a lieu sur l’ADN

simple ou double brin avec une préférence marquée pour

le simple brin (Cox, 2003). Il est possible d’augmenter

la liaison in vitro de RecA à l’ADN double brin en réduisant le pH de la réaction sous les

Figure 1.8 : RecA Filament hélicoïdal de la protéine RecA sur ADN simple brin en microscopie électronique. Figure gracieusement fournie par Jean-Yves Masson et Andrzej Stasiak.

10

6,5 (Cox, 2003). Le filament formé se compose de 6,2 monomères par tour hélicoïdal,

ayant un écartement de 95Å et un diamètre de 100Å (Kowalczykowski & Eggleston, 1994).

Ce filament augmente ainsi la taille du duplex de 1.5 fois (Masson & West, 2001).

1.4.1.3 La réaction d’échange de brin RecA d’E.coli fut la première protéine découverte capable d’effectuer la réaction d’échange

de brin. Cette activité composée essentiellement de trois phases nécessite l’apport

d’énergie par hydrolyse de l’ATP, on la nomme ATP dépendante.

Lors de la réaction, la protéine s’assemble sur l’ADN de façon à former un filament

hélicoïdal ce qui amène le relâchement de l’ADN. Une fois le filament formé, celui-ci se

met à la recherche d’une séquence homologue de 8 nucléotides ou plus. Lorsqu’il y a eu

reconnaissance, il y a alignement et appariement des homologues. Par la suite, il y a

élongation du brin endommagé de l’extrémité 5’ allant vers 3’. La copie du brin

homologue peut s’effectuer à un taux allant de deux à dix paires de bases sur une longueur

maximale de 7Kb et nécessite l’apport d’énergie par l’hydrolyse d’ATP. La présence de la

protéine SSB d’E.coli peut stimuler l’activité d’échange de brin de RecA. Lorsque bien

dosée, cette protéine défait la structure secondaire de l’ADN simple brin permettant ainsi a

RecA de s’y lier. On dit que 1 monomère de SSB par 15 nucléotides d’ADN simple brin et

que 3 nucléotides par monomère de RecA sont les conditions stœchiométriques optimales

pour la réaction d’échange de brin (Kowalczykowski & Eggleston, 1994).

1.4.1.4 La renaturation de l’ADN RecA est aussi apte à effectuer la renaturation d’ADN, réaction permettant d’apparier

ensemble les ADN complémentaires. À plus faible ratio, la réaction nécessite seulement 1

monomère protéique pour 30 nucléotides. De plus, la réaction se voit stimuler de deux à

trois fois par l’ATP mais n’en est pas dépendante (Kowalczykowski & Eggleston, 1994).

1.4.2 Rad51 Cette recombinase eucaryotique a de nombreuses ressemblances biochimiques et

structurales avec la recombinase bactérienne RecA. Comme cette dernière, Rad51 a la

11

capacité de former des filaments sur l’ADN afin de promouvoir l’appariement des

homologues et la réaction d’échange de brin. Étudiée tout d’abord chez l’organisme

Saccharomyces cerevisiae au début des années 90s, Rad51 a ensuite été découverte chez

plusieurs autres organismes dont la souris, la mouche D.melanogaster, la levure de fission

S.pombe et l’humain. Chacune d’entres elles démontrent une bonne homologie avec la

recombinase bactérienne et une bonne conservation de séquence (voir tableau 1.1).

Certaines ont même une surprenante similitude entre elles. En effet, il a été découvert que

la protéine de souris a une séquence conservée à 98,8% avec celle de la protéine humaine

(Barlow & al, 1997) et de 81% avec celle de Saccharomyces cerevisiae (Haaf & al, 1995).

L’expression de cette recombinase a été observée dans la majorité des tissus de

mammifères avec une prépondérance au thymus, à la rate, à l’intestin, aux ovaires et aux

testicules (Haaf & al, 1995). Cette expression ciblée tend à démontrer un rôle de la

protéine Rad51 en recombinaison V(D)J et méiotique (Baumann & al, 1996). D’autres

études, cette fois effectuées chez la mouche D. melanogaster, ont su confirmer

l’implication méiotique de Rad51. En effet, la recombinase n’est exprimée que dans les

tissus méiotiques femelles. Leur absence chez le mâle concorde avec l’inaptitude du mâle à

effectuer la recombinaison méiotique (Barlow & al, 1997).

D’un autre point de vue, l’augmentation de l’expression protéique et la formation de foci

ont été observées suite aux dommages infligés à l’ADN (Haff & al, 1995). Chez la souris,

Tableau 1.1: Comparaison structurale des protéines RecA et Rad51

Information tirée de Kowalczykowski & al. 1994

Acides aminés

% Conservés % Identiques

RecA E.coli 352 38

ScRad51 S.cerevisiae 400 43 33-240 59 33

SpRad51 S.pombe 365 40 33-240 53 3031-260 56 3033-240 51 281-303 55 30

33-340 51 28mRad51 Souris 339 38

Séquence

hRad51 Humain 339 38

Nombre d'acides aminés

Protéine OrganismeMasse

moléculaire (KDa)

12

>>> >> >>

l’apparition de foci de Rad51 concorde avec la production de cassures double brin en phase

leptotène. Ces agglomérations protéiques se poursuivent jusqu’en fin de pachytène lors de

la résolution des doubles jonctions d’Holliday (Barlow & al, 1997). Une légère différence

a pu être observée avec la protéine humaine, l’apparition de foci protéique semblant se faire

seulement au stade zygotène. Ce résultat serait dû à l’absence de stade leptotène chez le

mâle (Barlow & al, 1997). On peut alors conclure que Rad51 est une protéine faisant partie

des nodules primaires et secondaires impliqués dans la recombinaison méiotique.

1.4.2.1 Similitudes et différences avec RecA Comme la recombinase bactérienne, Rad51 possède une activité d’échange de brin

dépendante de l’ATP pouvant être favorisée par l’ajout d’une protéine secondaire, RPA

(Pâques & Haber, 1999 ; Baumann & al, 1996). Toujours comme RecA, Rad51 forme des

filaments sur l’ADN simple et double brin, augmentant ainsi la taille du duplex de 1,5 fois

(Pâques & Haber, 1999). Sa

iaison sur l'ADN s'effectue à

un ratio de 1 monomère

pour 3 nucléotides (voir

tableau 1.2), ce qui

correspond à la

stœchiométrie de la

recombinase classique

(Baumann & al, 1996).

Cependant, Rad51 n’a pas

une préférence aussi

marquée que RecA pour

l’ADN simple brin et a une

liaison plus efficace avec

l’ADN double brin (Cox, 2003). Il semble aussi que la formation de filament protéique sur

l’ADN se produise plutôt de l’extrémité 3’ allant vers l’extrémité 5’ plutôt que de 5’ vers

3’. De plus, d’un point de vue énergétique, il semblerait que l’hydrolyse d’ATP par Rad51

soit de 30 à 40 fois inférieure à celle effectuée par son homologue (Cox, 2003) et que la

Tableau 1.2: Comparaison de RecA d'Echerichia coli avec les protéines Rad51 de Saccharomyces cerevisiae (scRad51) et de l'humain (hRad51).

Légende: sb: Simple brin, db: Double brin, pb: Paire de bases, sec: Seconde, kb: Kilobase, SSB: Single strand DNA binding protein, Information tirée de Baumann & West, TIBS 1998

RecA scRad51 hRad51Liaison à l'ADN sb db sb db sb db

Stoechiométrie (monomère/nucléotides) 1/3 1/3 1/3

Activité ATPase (ATP/minute)

30 0,7 0,16

Appariement des homologues

efficace rapide

efficace rapide

efficace rapide

Échange de brin 2-10pb/sec 6kb

Lent 4kb Lent 1-2kb

Polarité du transfert 5' vers 3' 3' vers 5' 3' vers 5'

Activité stimulée par SSBRPA,

Rad52, Rad55

RPA, Rad52

13

protéine Rad51 soit incapable d'effectuer une réaction d'échange de brin de façon extensive.

En effet, Rad51 permet la reconnaissance d'ADN homologue, initie la réaction d'échange

de brin, mais la formation d'un hétéroduplex extensif nécessite l'aide de protéines appelées

paralogues de Rad51 (Baumann & al, 1996).

1.4.2.2 Les mutants de rad51 chez S.cerevisiae Étudiés chez la levure, les mutants rad51 démontrent une hypersensibilité aux radiations.

Toutefois, contrairement aux cellules souches rad51-/- de souris, les mutants de la levure

sont viables (Baumann & al, 1996; Sonoda & al, 1998). Les études chez la souris ont

démontré que la délétion du gène rad51 entraînait une mort embryonnaire montrant ainsi

l’importance de réparer l’ADN lors du développement. Afin d'obtenir plus de

renseignements sur les rôles de cette protéine, l’équipe de Shunichi Takeda a effectué

l'inhibition de l'expression de Rad51 par inactivation conditionnelle de son expression dans

des cellules de poulet (Sonoda & al, 1998). Cette expérience a su démontrer qu'une

absence de Rad51 amène une accumulation des cellules en phase G2/M, une augmentation

des aberrations chromosomiques et une mort cellulaire subséquente. Toutes ces

expériences démontrent le rôle de la recombinase au cours du cycle cellulaire, dans le

maintien chromosomique, dans la réparation des cassures double brin de l'ADN, ainsi que

sa présence essentielle lors du développement et de la prolifération cellulaire (Sonoda & al,

1998).

1.4.3 Dmc1 : un homologue de RecA/Rad51 C’est lors d’une expérience visant à cibler les gènes exprimés en prophase méiotique chez

S.cerevisiae que fût découvert le gène Dmc1. Essentiel à la poursuite du cycle méiotique,

cette protéine y a tirée son nom, « Disrupted Meiotic cDNA 1 ». Découverte par la suite

chez les mammifères, il semble que son expression soit propre aux tissus méiotiques

(testicules, ovaires) et qu’elle soit induite des stades leptotène à zygotène de la prophase

(Yoshida & al, 1998).

14

1.4.3.1 Sa structure La séquence protéique de Dmc1 est fortement similaire à celle de Rad51. Chez l’humain,

la séquence est à 52% identique (Masson & al, 2001), pourcentage élevé à 62% chez la

levure S.pombe. Cette grande homologie coïncide avec la similarité de structure de ces

protéines. De poids moléculaires semblables (37707 Da pour hDmc1 et 36966 Da pour

hRad51), il semble en effet que les monomères protéiques soient similaires. Cependant,

contrairement à Rad51, aucun monomère de Dmc1 n’est retrouvé en solution (Masson & al,

1999). Il semblerait plutôt que la protéine se présenterait sous la forme d’octamères. Les

monomères se joindraient en formant un anneau d’un diamètre extérieur de 11 à 12 nm et

une cavité intérieure de 2 à 4 nm de diamètre (Masson & al, 1999), juste assez pour

permettre à l’ADN d’y pénétrer lors de la liaison ADN-protéine (Passy & al, 1999).

1.4.3.2 La liaison à l’ADN et le filament Capable de lier l’ADN simple et double brin sans

apport d’énergie sous forme d’ATP, Dmc1 a

cependant une préférence pour l’ADN simple brin

(Masson & al, 1999). Sa liaison, lorsqu’elle se fait

sur l’ADN simple brin, est de nature irrégulière et se

fait par amoncellement d’anneaux octamériques. Ces

amoncellements ont tendance, à concentration

croissante de protéine, à former des agrégats

protéiques (Masson & al, 1999). Sur l’ADN double

brin par contre, il y a formation de courts filaments

protéiques. Ces filaments, loin de ressembler à ceux

de RecA ou de Rad51, sont plutôt des anneaux enfilés

l’un derrière l’autre sur l’ADN (Passy & al, 1999 ; Masson & al, 1999). Une

cristallographie récente de la protéine humaine est venue confirmer un diamètre interne de

l’anneau à 27Å et un diamètre externe de 130Å. Cette cristallisation a aussi su mettre en

évidence le résidu Glu258 (présent chez Dmc1 mais absent chez Rad51), qui serait essentiel

à la stabilisation de l’anneau par la formation de liens hydrogènes. Ces liens, absents chez

Rad51, pourraient être à la base de la différence structurale des deux homologues sur

Figure 1.9 : Structure octamérique de la protéine Dmc1 obtenue suite à la cristallographie. Photo provenant de Kinebuchi et al. Molecular cell vol.14 p.363-374.

15

l’ADN (Kinebuchi & al, 2004). Cependant, une autre découverte, tout aussi récente,

démontre la formation de filament hélicoïdal de la protéine Dmc1 humaine sur l’ADN

(Sehorn et & al, 2004). Ces filaments, de tailles inférieures à ceux de RecA et de Rad51,

sont observés en présence d’ATP. En absence de cette molécule énergétique, ou lors de

son remplacement par un analogue faiblement hydrolysable (ATP-γs, AMP-PNP ou AMP-

PCP) aucun filament n’a pu être observé (Sehorn & al, 2004). Ainsi, il semble que

l’hydrolyse d’ATP serait indispensable à la recombinaison faite par la protéine Dmc1

humaine.

1.4.3.3 La réaction d’échange de brin et la renaturation La réaction d’échange de brin effectuée par les recombinases classiques, est aussi effectuée

par Dmc1. Cette recombinase méiotique a cependant une activité moins efficace que RecA

et que Rad51 (Masson & al, 1999). Son activité est ATP dépendante et elle nécessite un

certain apport en ion magnésium (Mg++) (Masson & al, 1999 ; Sehorn & al, 2004). De

plus, il semble que la protéine RPA aiderait la réaction en éliminant la structure secondaire

de l’ADN. En effet, en présence d’ATP et de la protéine RPA, hDmc1 effectue la réaction

d’échange de brin sur 20% du substrat en 80 minutes. La présence de RPA permettrait

l’échange complet du brin tandis que seul, hDmc1 effectuerait un échange partiel du brin.

Cette réaction in vitro d’échange de brin serait optimale en présence de 1 monomère de

hDmc1 pour 1 ou 2 nucléotides et de 1 monomère de RPA pour 10 à 15 nucléotides

(Sehorn & al, 2004). En présence de cette dernière, la protéine Dmc1 augmenterait sa

capacité à effectuer la réaction d’échange de brin (Sehorn & al, 2004). Il a aussi été

démontré que la recombinase méiotique était capable de renaturer l’ADN. En fait, Dmc1 a

la capacité d’apparier les ADNs homologues alors qu’elle est incapable d’effectuer la

réaction d’échange de brin en présence d’ADNs hétérologues (Masson & al, 1999).

1.4.3.4 Les mutants

Exprimée naturellement lors de la méiose, Dmc1 est une protéine essentielle à la poursuite

du cycle cellulaire. Les mutants déficients en Dmc1, observés chez la levure, ont de

nombreux défauts de recombinaison, une augmentation des CDBs de l’ADN non résolues,

16

une formation anormale du complexe synaptonemal et leur cycle cellulaire tend à s’arrêter

en prophase (Bishop & al, 1992). Chez la souris, les mutants possèdent des organes

génitaux de taille anormalement petite (Yoshida & al, 1998 ; Pittman & al, 1998). La

double délétion du gène provoque la stérilité de la souris et un mauvais appariement des

chromosomes.

1.5 Buts du projet de maîtrise La protéine Dmc1 humaine ne se comporte pas de façon identique à une recombinase

classique telle que RecA ou Rad51. Son activité d’échange de brin est peu efficace et,

contre toute attente, cette recombinase n’est pas connue pour former des filaments

hélicoïdaux sur l’ADN. Dernièrement, l’équipe de Patrick Sung a pu observer, dans des

conditions spécifiques, une structure hélicoïdale de hDmc1 propre aux recombinases

(Sehorn & al, 2004). La question qui se pose est de savoir pourquoi cette protéine n’est pas

toujours apte à former un beau filament? Afin d’y répondre, nous tentons, par ce projet de

recherche, d’obtenir le plus d’informations fondamentales sur cette protéine. Pour y

parvenir, j’avais comme objectifs, de cloner le gène de Dmc1 de Schizosaccharomyces

pombe dans un vecteur d’expression, d’exprimer cette protéine chez E.coli, et de purifier la

protéine de fusion produite. Le modèle S.pombe a été choisi pour effectuer ces recherches

pour des raisons stratégiques. D’abord contrairement à l’humain, il est facile d’obtenir des

cellules méiotiques chez la levure, ensuite, il y a moins de compétition chez la levure

S.pombe que chez S.cerevisiae. Une fois la purification protéique complétée, je me devais

d’étudier les caractéristiques biochimiques et structurales de cette protéine, ce qui nous

permettra de les comparer avec les connaissances acquises sur la protéine humaine. Toutes

ses informations permettront éventuellement de mieux comprendre le fonctionnement de

cette protéine et de corréler ces données avec les études génétiques et biochimiques

montrant l’importance de cette protéine lors de la recombinaison méiotique.

17

2 Matériels et méthodes

2.1 Le système d’expression pET chez Escherichia coli Nous avons utilisé le système pET16b (Novagen) afin de cloner et d’exprimer les protéines

Rad51 et Dmc1 de S.pombe chez l’organisme procaryote Escherichia coli. L’avantage de

ce système est que l’expression de la protéine est induite et contrôlée par l’ajout

d’isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG) à la culture bactérienne. En effet, les gènes

sous le contrôle du T7lac promoteur sont exprimés suite à la transcription de la T7

polymérase bactérienne par l’induction à l’IPTG. Lors de l’utilisation de ce système, il est

important d’effectuer le clonage dans une souche exempte de T7 polymérase. La protéine

ne sera donc pas exprimée de façon basale, ce qui limitera l’instabilité du plasmide

d’expression et la toxicité (s’il y a lieu) pouvant être engendrée par l’expression protéique.

Une fois le clonage effectué dans la souche bactérienne DH5α, le plasmide est transféré

dans une souche d’expression. Nous avons utilisé la souche FB850 (E.coli BL21 DE3,

RecA-) comme souche d’expression. La délétion de RecA évite les risques de

contaminations par cette recombinase dans notre préparation protéique. Un autre avantage

majeur du système pET est qu’il permet d’ajouter une étiquette de type his-tag facilitant la

purification de la protéine recombinante sur une colonne de cobalt. Le vecteur pET16b

utilisé nous permet d’ajouter une étiquette d’histidine en extrémité amino-terminale de la

protéine produite. Ainsi, nous avons créé les protéines spRad51 et spDmc1 munies d’une

séquence 10-histidines.

2.2 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) L’amplification des gènes rad51(+) et dmc1(+) de Schizosaccharomyces pombe est la

première étape essentielle à la production protéique. Pour ce faire, les gènes ont été ciblés

dans une banque mitotique et méiotique d’ADN complémentaire de S.pombe à l’aide

d’amorces spécifiques. Le PCR a été effectué identiquement pour les 2 gènes .

Mélange réactionnel :

0,6 μL des amorces (voir tableau 2.1 pour concentration)

18

8 μL dNTPs (2.5mM) (Pharmacia) 1 μL S.pombe cDNA library (Clontech) 10 μL tampon Pfu 10 X (NEB) 2 μL Pfu polymérase (NEB) 100 μL volume final complété avec de l’eau, répartis en 3 réactions PCR

Programme d’amplification des gènes sprad51 et spdmc1 :

Dénaturation initiale : 95oC 30 secondes Dénaturation : 95oC 30 secondes Hybridation des amorces : 48oC 60 secondes Élongation : 68oC 3 minutes Nombre de cycles : 32

Les produits PCR sont précipités à l’acétate de sodium (Ajouter 1/10 volume de NaOAc pH

7.4 3 M et 2 volumes EtOH 100% à la solution à précipiter) et, suite à leur resuspension

dans 25 μL de TE pH 8.0, mis sur gel d’agarose 1%. La comparaison de la taille des

fragments obtenus s’effectue à l’aide du marqueur de poids moléculaire 1Kb (invitrogen).

2.3 Gel d’agarose La qualité, la taille et la concentration d’ADN sont vérifiées sur gel d’agarose. La

concentration du gel varie, généralement de 0.8 à 1.2% selon la taille de l’ADN à

visualiser. Afin de visualiser l’ADN, on ajoute du bromure d’éthidium (Sigma) au gel, de

façon à ce qu’il s’intercale entre les bases de la chaîne nucléiques. Le tampon de migration

est constitué de TAE1X, fait à partir d’une solution concentrée 50 X (242 g Tris, 57.2 mL

acide acétique et 100 mL EDTA 0.5 M pour un volume final de 1 litre). L’électrophorèse

est effectuée dans une cuve prévue à cet effet (Biorad) en s’assurant que le gel est submergé

de tampon. Les échantillons d’ADN sont déposés dans les puits à l’aide d’une solution de

Tableau 2.1 : Amorces utilisées lors de l’amplification par PCR Nom

Am orceug/uL de l'am orce

Gène am plifié

Taille du gène

NdeI

BglII StuI Stop

NdeI

Bam HI Stop

1 Kb

1 Kb

JYM1

JYM2

JYM11

JYM12 0,85

Séquence de l'am orce (5'-)

dm c1(+)

rad51(+)

TAAAGTCATATGGAAGAATTCGCAGAGGGG

AATAGAGATCT AGGCCT TTAGGAAACGTCTGCTATGCCAC

TAACAAGTTCATATGGCAGATACAGAGGTG

CTAAGGATCC TTAGACAGGTGCGATAATTTCCTTGGGATC

1,09

1,08

1,00

19

chargement 1 X (à partir de la solution 6 X: 50% glycérol, 0.25% bleu bromophénol, 0.25%

Xylène cyanol). La migration s’effectue généralement à 100 volts et la visualisation de

l’ADN se fait par autoradiographie.

2.4 Clonage des gènes rad51(+) et dmc1(+) dans les vecteurs d’expression

Lors de l’amplification par PCR, des sites de restrictions ont été ajoutés de part et d’autre

des gènes afin de faciliter le clonage. Ces sites, NdeI, BamHI et BglII sont compatibles

avec ceux des vecteurs utilisés. Cependant, le site NdeI se retrouve déjà dans la séquence

codante des deux gènes. La digestion partielle consiste à titrer une enzyme de digestion et

nous permet d’obtenir un produit partiellement digéré qui sera sélectionné, selon sa taille,

par extraction sur gel d’agarose.

Digestion de S.pombe Rad51 par NdeI et par BamHI :

SpRad51 possède un site NdeI à l’intérieur de sa séquence codante, cependant, suite à une

titration d’enzyme il semble que le site interne ne soit jamais digéré. Une double digestion

de SpRad51 peut donc être effectuée.


5 μL réaction de PCR 1 μL NdeI (20 U/μL, NEB) 0.5 μL BamHI (20 U/μL, NEB) 2 μL tampon BamHI 10 X (NEB) 20 μL volume final complété avec de l’eau Digestion à 37oC durant une heure suivi d’un extraction sur gel d’agarose 1%.

Digestion de S.pombe Dmc1 par NdeI et BglII:

SpDmc1 possède un site NdeI interne nécessitant une digestion partielle. Pour ce qui est du

site BglII, il est compatible avec le site BamHI utilisé pour les différents clonages.


5 μL réaction de PCR 1 μL NdeI des différentes dilutions* (20 U/μL, NEB) 0.5 μL BglII (10 U/μL, NEB)

20

2 μL tampon NEB2 10 X (NEB) 20 μL volume final complété avec de l’eau * Dilution de l’enzyme NdeI (20 U/μL) : non-dilué, 1 :1, 1 :3 et 1 :7 dans du tampon 1 X.

La digestion s’effectue à 37oC durant une heure et est déposée sur gel d’agarose 1% afin de

procéder à l’extraction du fragment d’approximativement 1 Kb.

2.5 Préparation du vecteur pET16b Le vecteur pET16b est utilisé pour le clonage de SpRad51 et de SpDmc1. Dans les deux

cas, le vecteur est préparé en le digérant par les enzymes NdeI et BamHI afin de permettre

l’insertion des gènes rad51(+) et dmc1(+).


10μL vecteur pET16b (390ng/μL) 6μL tampon BamHI 10 X (NEB) 1μL NdeI (20U/μL, NEB) 1μL BamHI (20U/μL, NEB) 60μL volume final complété avec de l’eau

La digestion s’effectue dans un tube eppendorf à 37oC pour une heure. Suite à quoi, 1μL

de NdeI (20 U/μL) est ajouté pour compenser la demi-vie de trente minutes de cet enzyme.

L’incubation est reprise dans les mêmes conditions pour une deuxième heure. Suite à la

digestion, 1 μL de CIP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase,10 U/μL, NEB) est ajouté et le

tout est remis pour une troisième heure à 37oC. Cette dernière étape, la déphosphorylation,

nous assure que le plasmide ne se refermera pas sur lui-même lors du clonage.

Le produit de digestion est déposé sur gel d’agarose 1% afin de pouvoir vérifier la qualité

du produit et permettre sa purification par extraction sur gel (Qiaquick Gel Extraction Kit).

2.6 Extraction sur gel d’agarose Cette technique permet d’extraire des fragments d’ADN de 70 pb à 10 Kb de longueur. Le

dépôt sur gel de l’ADN permet de purifier le matériel génétique de tout enzyme. De plus,

21

la migration du gel permet de vérifier la taille du fragment obtenu suite à une digestion

enzymatique et la sélection du fragment désiré s’il y a lieu.

L’ADN est déposé sur un gel d’agarose comme décrit précédemment en section 2.3.

L’électrophorèse s’effectue dans un tampon TAE 1X et la visualisation du gel se fait sous

les U.V. de grande longueur (320 nm) d’onde afin de minimiser l’effet mutagène de ces

derniers. La bande désirée peut ensuite être découpée à l’aide d’un scalpel et l’extraction

de l’agarose s’effectue avec la trousse QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) selon les

instructions du manufacturier.

2.7 Clonage Une fois les produits purifiés, il suffit de les précipiter ensemble par la méthode à l’acétate

de sodium mentionné précédemment (section 2.2) pour ensuite procéder à la ligation par la

ligase T4. Le tout est resuspendu dans le mélange de ligation qui comporte en plus du

vecteur et de son insert, 40 U de T4 DNA ligase (NEB), 1 μL de tampon (T4 DNA ligase

10 X, NEB) pour un volume final de 10 μL. Le tout est incubé toute la nuit à 16oC.

2.8 Transformation des cellules compétentes Afin de maintenir de façon stable la construction, il est préférable d’effectuer la

transformation dans une souche qui ne produira pas la protéine. De cette façon, la toxicité

est réduite ce qui limite les probabilités de rejet du vecteur par la bactérie. Différentes

souches bactériennes ont été utilisées lors des transformations. Le tableau qui suit dévoile

les caractéristiques spécifiques à chacune d’elles.

Tableau 2.2 : Cellules compétentes utilisées lors de diverses transformation par choc thermique.

Antibiotique ConcentrationDH5 Invitrogen Oui Oui Non Aucun

JM109 Stratagene Oui Oui Non AucunFB850 Oui Oui Oui Cam 25ug/mL

Souche recA1 endA1Résistance

Provenance T7 polymérase

22

Les cellules compétentes choisies doivent lentement être décongelées sur glace avant de

leur ajouter l’ADN à transformer. La quantité généralement utilisée est de 100 ng pour 200

μL de cellules. Une fois le produit de ligation ajouté, il suffit d’incuber les cellules trente

minutes sur glace avant d’effectuer un choc thermique de 90 secondes à une température de

42oC. Suite à quoi, les cellules sont reposées immédiatement sur glace pour une durée de

deux minutes. Finalement, on ajoute 1mL de milieu LB (1% tryptone, 0.5% extrait de

levures, 1% NaCl) aux cellules et on incube une heure à 37oC avant de centrifuger (10

minutes, 13000 rpm), de resuspendre dans 200 μL de milieu et d’étaler sur milieu de

croissance contenant les antibiotiques appropriés.

2.9 Préparation d’ADN plasmidique L’ADN plasmidique est purifié pour permettre l’obtention d’une grande quantité de

matériel nécessaire aux diverses manipulations et au séquençage. Dépendamment de la

quantité nécessaire, trois trousses peuvent être utilisées : QIAGEN plasmid mini, midi ou

maxi. Pour ce faire, il suffit d’inoculer un milieu de culture LB contenant 2% d’agar et les

antibiotiques appropriés à partir de la souche conservée dans le glycérol (50% culture

bactérienne, 25% glycérol conservé à –80oC). L’incubation d’une nuit à 37oC précède la

préculture de deux à cinq millilitres de milieu LB avec antibiotiques et une seconde

incubation, avec agitation, identique à la première. Le jour suivant, une dernière culture de

5, 100 ou 500 mL (selon que c’est une mini, midi ou maxi) est effectuée à partir d’une

dilution 1/500 de la solution de préculture. Cette dernière culture bactérienne est incubée

toute une nuit sous agitation à 37oC avant d’être centrifugée à 400 rpm durant 30 minutes à

4oC. Une fois le culot bactérien en main, il suffit de le resuspendre dans la quantité

appropriée de tampon de resuspension P1 (voir tableau 5 pour la composition des tampons

et les quantités requises). La lyse s’effectue en ajoutant le tampon de lyse P2. Il est bien

important de ne pas laisser agir ce dernier tampon plus de cinq minutes, après quoi on le

neutralise avec le tampon P3. Lors de la préparation d’ADN plasmique à l’aide de la

trousse « QIAGEN plasmid mini », on procède immédiatement à la purification sur

colonne. Pour ce qui est de la midi et de la maxi, doit d’abord laisser le mélange sur glace

pour 15 à 20 minutes avant de centrifuger le tout à 20000 g durant 30 minutes à 4oC. Le

23

surnageant peut alors être déposé sur la colonne prééquilibrée. Les lavages des colonnes

s’effectuent avec le tampon QC tandis que l’élution se fait à l’aide du tampon QF. Les

petites colonnes de mini donnent un éluat de 50 μL prêt à être utilisé tandis que les éluats

des midi et maxi doivent être précipités avec 0.7 volume d’isopropanol à 11000 rpm pour

30 minutes à 4oC. Ensuite, le culot est lavé avec de l’éthanol 70% avant d’être resuspendu

dans du TE pH 8.0.

La concentration d’ADN plasmidique a été déterminée par la densité optique de la solution.

Afin de pouvoir effectuer la lecture optique, il faut tout d’abord diluer la solution 1 :100.

La lecture de la valeur est prise sur le spectrophotomètre Spectronic Genesys2 suite à une

comparaison avec un blanc constitué de 500 μL d’eau déposé dans une cuvette de quartz

Tableau 2.3 : Composition des tampons et quantités nécessaires à la préparation d’ADN plasmidiques

Nom Fonction Composition Mini Midi Maxi50mM Tris-Cl pH8.0;

10mM EDTA;100ug/mL RNase A

200mM NaOH;1% SDS (p/v)

P3 Neutralisation du tampon de lyse

3.0M acétate de potassium pH5.5

0,35 4 10

750mM NaCl;50mM MOPS pH7.0;15% isopropanol (v/v);

0.15% Triton X-100 (v/v)

1.25M NaCl;50mM MOPS pH7.0;15% isopropanol (v/v)

1.25M NaCl;50mM Tris-Cl pH8.5;15% isopropanol (v/v)10mM Tris-Cl pH8.0;

1mM EDTA

2x30QC Lavage de la colonne

Non

PE 0,75 NonNonLavage de la colonne

Quantité utilisée (mL)Tampon

P1Resuspension de la culture bactérienne

0,25 4 10

10

QBTÉquilibration de

la colonne Non 4 10

P2 Lyse cellulaire 0,25 4

2x10

EB Élution de la colonne

TE Resuspension de l'ADN

Non Selon le culot

QF Élution de la colonne

Non

Selon le culot

0,05 Non Non

155

24

(Sigma). Afin de ne pas altérer les résultats, la lecture de l’échantillon est effectuée dans la

même cuvette de quartz nettoyée. La lecture de la densité optique s’effectue à la longueur

d’onde de 260 nm. La concentration se calcule selon la formule suivante, en n’oubliant pas

de prendre en compte le facteur de dilution :

ADN (μg/μL) = D.O.260 x facteur de dilution x 0.05 μg/μL

Amorce d’ADN (μg/μL) = D.O.260 x facteur de dilution x 0.033

(Puisque qu’il faut 0,05 μg/μL d’ADN pour obtenir une D.O.260 = 1 et 0,033 μg/μL lorsqu’il s’agit d’amorce d’ADN.)

2.10 Séquençage Le Laboratoire de Synthèse et d’Analyse d’acides nucléiques de l’Université Laval a

effectué le séquençage des divers clones construits. Les échantillons furent envoyés selon

leurs demandes sous forme

de plasmides dilués dans

l’eau à 100 ng/μL à raison de

1 μg par réaction suite à une

purification par trousse

QIAGEN. Les amorces (voir

tableau 2.4) sont quant à

elles expédiées à raison de 5

μL par réaction à une

concentration de 1.6 μM.

2.11 Mutagenèse Le « QuikChange® Site-

Directed Mutagenesis Kit » de Stratagene permet d’effectuer des mutations dirigées. Le

principe, basé sur l’amplification par PCR, utilise des amorces construites spécifiquement

pour forcer la mutation du produit PCR. Habituellement utilisé pour de courtes

insertions/délétions ou des mutations ponctuelles, nous avons utilisé ce principe afin

d’éliminer l’intron génomique que nous avions obtenu. En effet, l’utilisation d’une banque

Tableau 2.4 : Amorces utilisées lors du séquençage Nom

amorce Séquencede l'amorce (5'-) Gène cible

JYM 3 AAGGTTTCAGCGAAGCCAAA dmc1(+)JYM 4 GATACAGAAGGAACATTTCG dmc1(+)JYM 5 CTATTTCGGGTTGACTATTC dmc1(+)JYM 6 TGATGTTTGCGTCCAACGAT dmc1(+)JYM 7 AGGTGTAATCACATAACTGC dmc1(+)JYM 8 TTTGTTGCCTTTCTGATAAT dmc1(+)JYM 9 AATGCTACTTTTCCTTCGGC dmc1(+)

JYM 10 AGAAATCTCTTTGTGGACAT dmc1(+)JYM 13 GGGATTTACCACCGCCACTG rad51(+)JYM 14 GGTGGTGGTGAAGGTAAATG rad51(+)JYM 15 ATTCGGTATTGCTGTTGTCA rad51(+)JYM 16 TAGTGGTTGTGGTAGTCTTA rad51(+)JYM 17 GCATTTCAGGAGCAGAGAGC rad51(+)JYM 18 TAATGCTTCCAGTCTCAACC rad51(+)JYM 19 CATTTGTAAGGGCATAGGAC rad51(+)

25

d’ADNc partiellement mitotique a impliqué l’amplification génomique du gène méiotique

dmc1(+). Les amorces sont construites de façon à forcer la formation d’une boucle avec

l’ADN génomique à éliminer du produit PCR. Pour ce faire, nous avons conçu des

amorces composées de 42 nucléotides, 21 se situant de part et d’autre de l’intron (voir

tableau 2.5). Le protocole utilisé diffère légèrement de celui fourni par Stratagene.

Une première amplification est effectuée avec les amorces séparées. Ensuite, les produits

d’amplification de chaque amorce sont mélangés afin de procéder à l’amplification

exponentielle du gène en lui supprimant son intron. Le même programme d’amplification

est utilisé cette fois-ci effectuant 18 cycles.


125 ng une seule des deux amorces 50 ng plasmide pET16b-spdmc1génomique 5 μL tampon 10 X Reaction buffer (Stratagene) 1 μL dNTPs mix (Stratagene) 50 μL volume final complété avec de l’eau

Programme de mutagenèse :

Dénaturation initiale : 95oC 30 secondes Dénaturation : 95oC 30 secondes Hybridation des amorces : 55oC 60 secondes Élongation : 68oC 14 minutes ( 1 min / kb de plasmide) Nombre de cycles de la première amplification : 10 Nombre de cycles de la deuxième amplification : 18

Une fois la mutation effectuée, on ajoute 1 μL d’enzyme de restriction DpnI (10 U/μL,

Stratagene) afin de digérer le brin parental. Ce dernier, provenant d’une souche d’E.coli

dam+ est méthylé et, contrairement au brin nouvellement formé, il sera reconnu et digéré

spécifiquement par l’enzyme DpnI. Une fois l’enzyme ajouté, on agite la réaction et on

Tableau 2.5 : Amorces utilisées lors de la délétion dirigée de l’intron génomique

Nom de l'amorce Séquence de l'amorce (5'-)

JYM74 TGAAGACCTAACTGCTCACGGGATTGGTATGACCGATATCATJYM75 ATGATATCGGTCATACCAATCCCGTGAGCAGTTAGGTCTTCA

26

incube une heure à 37oC après s’être assuré que le milieu réactionnel reposait au fond du

tube.

Les bactéries supercompétentes XL1-Blue (Stratagene) servent à transformer les produits

de la mutagenèse une fois l’ADN non muté digéré. Le protocole utilisé a préalablement été

décrit en section 2.8, toutefois, le temps de choc thermique de ces bactéries est de 45

secondes.

2.12 Gel d’acrylamide L’extrait protéique est déposé dans un tampon d’échantillonnage 2 X (0.125 M Tris-HCl

pH 6.8, 2% SDS, 10% glycérol et 1 mg/mL bleu bromophénol) de sorte à ce que la

concentration finale soit de 1 X. L’échantillon est ensuite bouilli pour trois minutes, afin de

réduire les ponts disulfures et de permettre l’observation des monomères protéiques.

L’échantillon est généralement déposé sur gel d’acrylamide 10% (0.125 M Tris-HCl pH

6.8, 0.1% SDS, 10% acrylamide, 0.1% amonium persulfate (APS), 0.01% TEMED) avec

un gel d’empilement de 6% ( 0.375 M Tris-HCl pH 8.8, 0.1% SDS, 6% acrylamide, 0.1%

APS, 0.01% TEMED ). Le tampon de migration 1 X est généré à partir de la solution 5 X

(125 mM tris base, 950 mM glycine, 0.5% SDS).

2.13 Production protéique

Production de spRad51 :

La production de protéine spRad51 s’effectue à partir d’une culture de huit litres de milieu

LB-amp (100 μg/mL)-cam (50 μg/mL) répartis en dix erlenmeyers de 800 millilitres

chacun. La culture est inoculée suite à une dilution 1 :100 d’une préculture elle même

inoculée à partir d’un pétri ensemencé. Il est préférable de partir avec une transformation

fraîche plutôt qu’à partir de la souche conservée dans 25% de glycérol. La souche FB850

transformée avec le plasmide d’expression pET16b-spRad51 croît en milieu LB-amp (100

μg/mL)-cam (50 μg/mL) à 37oC sous agitation à 250 rpm. La production de protéine

spRad51 est induite par l’ajout de 0.1 mM IPTG lorsque la densité de la culture à atteint la

phase logarithmique soit D.O600 de 0.48-0.5. L’induction se poursuit selon les mêmes

27

conditions d’incubation pour une durée de quatre heures. Les bactéries sont ensuite

récoltées par centrifugation dans une centrifugeuse de type Sorvall RC 26 plus à 6000 rpm

à 4oC durant quinze minutes dans le rotor SLA-3000. Les culots cellulaires sont ensuite

congelés sur glace sèche avant d’être conservés à –80oC.

Production de spDmc1 :

La première étape consiste à ensemencer une gélose LB-amp (100 μg/mL)-cam (50 μg/mL)

à partir d’une transformation fraîchement effectuée ou de la souche conservée dans 25 % de

glycérol. Les colonies isolées obtenues par l’incubation à 37oC de cette culture seront alors

prélevées afin d’ensemencer une préculture de milieu LB-amp (100 μg/mL)-cam (50

μg/mL). L’induction se fait en milieu tryptone-phosphate (20 g/L Bacto-tryptone, 2 g/L

Na2HPO4, 1 g/L KH2PO4, 8 g/L NaCl, 15 g/L extrait levure, 2 g/L glucose) suite à une

dilution 1 :100 à partir de la préculture. La croissance bactérienne a lieu à 37oC sous

agitation à 250rpm jusqu’à une D.O.600 de 0.48-0.5, suite à quoi il y a induction par ajout de

0.05mM IPTG. Le milieu de culture est transféré à 30oC avec agitation à 250 rpm pour une

induction de deux heures. Une fois l’induction terminée, les cellules sont récoltées par

centrifugation et conservées à –80oC comme décrit précédemment.

2.14 Extraction de protéines Les protéines sont extraites à l’aide du tampon de lyse (0.1 M Tris-HCl pH8.0, 2 mM

EDTA, 5% glycérol, 0.5 mM DTT) ou à l’aide du tampon T (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500

mM NaCl, 10% glycérol, 0.02% Triton x-100 ) contenant 5 mM d’imidazole. La lyse est

effectuée sur glace à l’aide du sonicateur. De façon générale, une belle lyse est obtenue

suite à une série de trois traitements de 30 secondes entrecoupés de repos sur glace. Afin

de minimaliser la dégradation protéique par les protéases, certains inhibiteurs sont ajoutés

au tampon de lyse : PMSF (0.2 mg/mL), leupeptine (1 μg/mL), aprotinine (0.16 TIU/mL),

pepstatin A (1 μg/mL). Les concentrations inscrites correspondent aux concentrations

finales de chaque inhibiteur de protéase.

Un extrait total des protéines est obtenu suite à la sonication de la culture. La

centrifugation à 4oC à une vitesse de 35000 g pour une durée d’une heure permet d’obtenir,

28

par le surnageant, un extrait protéique soluble. Lors de petit échantillonnage quantitatif, la

centrifugation s’effectue à 4oC à une vitesse de 13000 rpm pour une durée de dix minutes.

2.15 Purification de la protéine Dmc1 exprimée chez E.coli Le culot bactérien du 8 litres obtenu lors de la production protéique est resuspendu sur

glace dans 180 mL de tampon de lyse comme décrit précédemment et centrifugé afin

d’éliminer la partie insoluble. Au matériel soluble récupéré, les inhibiteurs de protéases

PMSF (0.2 mg/mL), aprotinine (0.016 TIU/mL), leupeptin (1 μg/mL) sont ajoutés et une

dialyse de 8 heures (3 x 4.5 litres) est effectuée dans un tampon spermidine (20 mM tris-

acétate pH 7.5, 7 mM spermidine-NaOH pH 7.5 et 0.1 mM DTT). Le précipité blanc

obtenu est récupéré par centrifugation (T647.5, Sorvall) à 20000 rpm pour une durée de 20

minutes à 4oC et, resuspendu par la suite dans 120 mL de tampon T contenant 5 mM

imidazole et inhibiteurs de protéases; PMSF (0.2 mg/mL), aprotinine (0.016 TIU/mL) et

leupeptin (1 μg/mL).

Le surnageant est ensuite déposé sur une colonne de 20 mL Talon (Clontech) lavée dans le

tampon T contenant 30 mM et 40 mM d’imidazole pour un total de 18 volumes de colonne.

L’élution est produite par augmentation de la concentration d’imidazole de 40 mM à 0.8 M

lors d’un gradient de 8 volumes de colonne. Les fractions d’élution ont été analysées par

migration sur gel SDS-PAGE 10%, permettant ainsi de sélectionner les fractions d’élution

de la protéine de choix (Rad51 ou Dmc1 selon le cas). Les fractions d’élution

sélectionnées furent ensuite supplémentées en inhibiteurs de protéases (PMSF, aprotinine,

leupeptine) et dialysées pour 80 min (2 x 2L, en évitant les précipitations) dans du tampon

R (20 mM tris-HCl pH 8.0, 10% glycérol et 0.5 mM DTT) contenant 150 mM KCl. Les

inhibiteurs de protéases aprotinine et leupeptine sont ajoutés à la solution qui sera déposée

sur colonne Héparine de 10 mL (HiPrepTM16/10 Héparine FF, Amersham Pharmacia

Biotech). Ayant découvert que la protéine Dmc1 de S.pombe ne lie pas l’héparine mais que

certains contaminants s’y lient, nous n’avons pas effectué de lavages ni d’élution de cette

colonne. Le « flow through » contenant la protéine d’intérêt est observé sur gel SDS-

PAGE 10% et, est déposée sur colonne MonoQ de 1 mL (Mono QTM, Amersham

Pharmacia Biotech). Cette colonne est lavée à l’aide de 20 mL de tampon R contenant 150

29

mM KCl et l’élution se fait lors d’un gradient de 10mL contenant de 0.15 à 1.0 M KCl dans

le tampon R. Afin de conserver la protéine dans un tampon compatible aux essais

biochimiques, une dialyse de 10 minutes est effectuée dans un tampon de conservation

contenant 20 mM tris-acétate pH 7.5, 250 mM NaCl, 10% glycérol et 0.5 mM DTT. Le

tout fût conservé en aliquotes de 10 μL à –80oC.

2.16 Purification de la protéine Rad51 exprimée chez E.coli La purification de cette protéine s’effectue comme décrit par Baumann et al. (1997). Il

s’agit en fait d’une précipitation à la spermidine suivie de chromatographies sur colonnes

Hydroxylapatite, Héparine et MonoQ.

2.17 Filtration sur gel 30 μg d’échantillon de protéines purifiées sont déposés sur colonne Superdex 200 PC

3.2/30 (Pharmacia) à l’aide du système FPLC explorer 10. Le poids moléculaire des

protéines purifiées est alors déterminé par comparaison avec 200 μg d’un standard de poids

moléculaire (Biorad: bovine thyroglobulin (670 kDa), bovine gamma globulin (158 kDa),

chicken ovalbumin (44 kDa), horse myoglobulin (17 kDa), vitamine B-12 (1.35 kDa)).

2.18 Double-hybride Préparation des plasmides

Les vecteurs pGADT7 et pGBKT7 (Clontech) permettent d’exprimer un gène d’intérêt en

fusion avec le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 (DBD, « DNA binding domain », via le

vecteur pGBKT7) et de vérifier son interaction avec un second gène exprimé en fusion avec

le domaine d’activation Gal4 (AD, domaine d’activation, via le vecteur pGADT7).

L’interaction entre les 2 protéines favorise le rapprochement entre les deux domaines. Il

s’en suit la transcription des gènes rapporteurs.

La préparation des vecteurs de double-hybride par digestion NdeI et BamHI a permis d’y

introduire plusieurs gènes disponibles dans le laboratoire (Dmc1 humain et de la levure

S.pombe et Rad51 de l’humain et de S.pombe).

30


5 μg vecteurs pGBKT7 ou pGADT7 (Clontech) 2 μL NdeI (20 U/μL, NEB) 1 μL BamHI (20 U/μL, NEB) 5 μL tampon BamHI 10 X (NEB) 50 μL volume final complété avec de l’eau Le plasmide pGBKT7 contenant le gène Hop2 de souris a été gracieusement fourni par Dr

Dan Camerini-Otero (NIH, USA).

Transformation de levure Saccharomyces cerevisiae

Un milieu de culture YPD (1% extrait de levure, 2% Peptone, 20% Glucose) contenant 2%

agar est ensemencé à partir de S. cerevisiae AH109 (Clontech) ou de S. cerevisiae Y187

(Clontech). Cette dernière souche sera utilisée spécifiquement lorsque des tests de β-

galactosidase seront effectués. La culture est incubée à 30oC pour une durée de 3 jours. De

cette culture, seulement les colonies rouges (ADE-) seront prélevées afin d’inoculer 25 mL

de milieu YPD, lequel sera incuber durant 2 jours à 30oC. Par la suite, le nombre de

cellules présentes en solution sera déterminé d'après la règle de trois suivantes :

D.O.600= 0.1 =1 x 106 cellules/mL

Ce renseignement permet de déterminer le volume de culture nécessaire à l’obtention de 5 x

108 cellules. Une fois ce volume prélevé, on procède à sa centrifugation (3000 g ,5 min) et

on lave le culot avec 25 mL d’eau distillée stérile. On répète et on resuspend le culot

obtenu dans 3 mL d’une solution 0.1 M de lithium acétate stérile qui sera déposée 15

minutes au bain-marie (30oC) et centrifugée pour une troisième fois. Le culot sera cette

fois-ci resuspendu dans 1 mL de lithium acétate 0.1 M stérile et la culture sera répartie en

dix eppendorf de 100 μL Ces derniers seront centrifugés (13000 rpm, 1 min) afin de

conserver le culot cellulaire. Toujours en travaillant de façon stérile, l’ajout de 240 μL de

polyéthylène glycol 50%, 36 μL de lithium acétate 1 M, 25 μL « ssCarrier DNA » dénaturé

(2 mg/mL), et 2.5 μg des plasmides contenus dans un volume de 34 μL final sera effectué

en respectant l’ordre décrit. Suite à quoi, la solution sera resuspendue au vortex et incubée

successivement 30 minutes à 30oC et 30 minutes à 42oC. Lors du choc thermique,

l’inversion répétitive des eppendorfs favorise la transformation. Suite au choc thermique,

31

le culot cellulaire est récupéré (13000 rpm, 5 min) et le resuspendu dans 75 μL d’eau stérile

afin de pouvoir inoculer des milieux minimaux déficitaires en leucine et en tryptophane.

L’incubation de ces derniers se fera à 30oC pendant plusieurs jours.

Observation de l’interaction protéique

Les cellules transformées sont étalées sur un milieu minimal déficitaire en leucine,

tryptophane, adénine et histidine et complémenté de 2.5 mM aminotriazole. Les cultures

sont alors incubées à 30oC et une observation quotidienne de la croissance est effectuée.

Observation quantitative de l’interaction par β-galactosidase

Afin de quantifier les interactions entre protéines, des pétris minimaux déficitaires en

leucine et en tryptophane sont inoculés à partir des colonies Y187 transformées. Une

croissance adéquate est généralement obtenue suite à 2 jours d’incubation à 30oC. Lorsque

la taille des colonies est jugée convenable, on procède à un répliquât de celles-ci sur un

papier filtre Watman (VWR « brand filter paper qualitative »). Ce papier, une fois bien

imprégné des colonies sera déposé dans l’azote liquide. Ce traitement d’une durée de 15

secondes est effectué en s’assurant que les colonies se retrouve face vers le haut. Par la

suite, le papier filtre sera séché à température ambiante et déposé sur un deuxième papier

filtre ayant préalablement été submergé dans une solution Z-Xgal (100 mL tampon Z (16.1

g/L Na2HPO4-7H2O, 5.5 g/L NaH2PO4-H2O, 0.75 g/L KCl, 0.246 g/L MgSO4-7H2O, pH

ajusté à 7), 0.27 mL β-mercaptoéthanol et 1.67 mL X-gal (25 mg/mL)). Les papiers sont

ensuite incubés tels quel à 30oC. La coloration des colonies sera observée de façon

quotidienne.

2.19 Renaturation d’ADN simple brin par Dmc1 10 μL de réaction contenant la solution de renaturation (20 mM Hepes pH 7.5, 5 mM DTT,

100 μg/μL BSA, 5 mM Mg(OAc)2, 2 mM ATP pH 7.5, 100 mM NaCl) auquel on ajoute

400 nM de protéine Dmc1, sont conservés sur glace. Durant ce temps, la sonde pPB4.3

32

NdeI-HindIII marquée en 5’ est dénaturée 30 secondes dans l’eau bouillante. Suite à quoi,

la sonde est immédiatement déposée dans l’eau glacée afin d’éviter la renaturation

spontanée et, 450 nM sont déposés dans le mélange réactionnel. Une incubation de 5

minutes, ou du temps indiqué est effectuée à 20oC avant de procéder à l’arrêt de la

réaction. Pour ce faire, la protéine est dénaturée/dégradée par l’ajout de la solution d’arrêt

(10 % SDS, 10 mg/mL protéinase K) pour une période de 15 minutes à 20OC. L’analyse

des résultats est effectuée sur gel TBE 1X/acrylamide 4% par une migration de 2h15 à 150

volts. Le gel est ensuite séché sur papier DE81 et 3M pour ensuite permettre la

visualisation des résultats par autoradiographie. La quantification des résultats est effectuée

à l’aide du phosphorimager Storm 410.

2.20 Liaison de Dmc1 à l’ADN détectée par retardement sur gel Préparation des sondes

De l’ADN simple brin, double brin et protubérant 5’ et 3’ est préparé à partir d’un ADN

simple brin, SW136. 2.5 μg de ce simple brin est d’abord phosphorylé à l’aide de 2 μL de

T4 Polynucléotide kinase (10 U/μL, NEB), 15 μL de γATP (1 μCi/μL) dans 10 μL de

tampon PNK 10 X (NEB) dans un volume final de 100 μL. La réaction s’effectue durant

1h à 370C. Par la suite, la réaction est séparée en 5 aliquotes de 20 μL chacun auquel on

ajoute, selon la cas, 2.5 μg d’ADN (voir tableau 2.6) lequel sera soumise à un

réappariement avec le programme suivant :

Programme d’appariement des amorces:

Dénaturation initiale: 95oC 3 minutes Annelage : 65oC 10 minutes 50oC 10 minutes 37 oC 10 minutes 20 oC 10 minutes

33

Pause 4 oC

Les réactions sont déposées sur gel TBE 1X/10% acrylamide (à l’exception du numéro 5

qui est conservé pour le compte radioactif) pour une migration de 2 h à 275 volts.

L’autoradiographie permet ensuite d’aller recueillir les bandes d’ADN radioactif

correspondantes, lesquelles seront extraites du gel durant la nuit à l’aide de 250 μL de TE

0.5 X pH 8.0 sur rôtisseur. La radioactivité des échantillons est ensuite déterminée par

comptage en scintillation liquide, permettant ainsi de déterminer la concentration des

sondes. Les sondes sont conservées dans la boîte à cet effet à 4oC.

Réaction de retardement sur gel, titration protéique

La protéine est ajoutée à 10 μL d’une solution préchauffée 5 minutes à 37oC (20 mM

triethanolamine-HCl pH 7.5, 2 mM ATP, 2.5 mM Mg(OAc)2, 1 mM DTT et 100 μg/μL

BSA) contenant 50 nM d’ADN (simple brin, double brin ou protubérant). La réaction

s’effectue durant 5 minutes à 37oC, laquelle sera arrêtée par fixation de la protéine sur

l’ADN par l’ajout de 0.2% de glutaraldéhyde et une incubation se poursuivant pour 15

minutes supplémentaires. La réaction est ensuite déposée sur gel TBE 1X/6% acrylamide

pour une durée de 2h15 à 150 volts suivie d’une autoradiographie.

Aliquotes ADN forméConcentration

uM

1 AucunGGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCTCTAGACTCGAGGAATTCGGTACCCCGGGTTCGAAATCGATAAGCTTACAGTCTCCATTTAAAGGACAAG

simple brin 3,57

2 sw279CTTGTCCTTTAAATGGAGACTGTAAGCTTATCGATTTCGAACCCGGGGTACCGAATTCCTCGAGTCTAGAGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCC

double brin 3,58

3 sw148 CTTGTCCTTTAAATGGAGACTGTAAGCTTATCGATTTCGAACCCGGGGTA protubérant 5' 4,71

4 sw414 CCGAATTCCTCGAGTCTAGAGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCC protubérant 3' 3,56

5 Aucunpour le compte

ADN ajouté (5'-)

Tableau 2.6 : Séquence des amorces destinées à la création d’ADN simple brin, double brin et protubérant utilisés lors du retardement sur gel. La concentration indiquée est la concentration finale obtenue suite à la purification des amorces.

34

2.21 Activité d’échange de brin de la protéine Dmc1 Préparation de la sonde

L’ADN pPB4.3 est clivé NdeI-HindII de la façon suivante; 66.5 μg d’ADN digéré 3h à

37oC dans une réaction de 250 μL contenant 12.5 μL NdeI (20 U/μL, NEB) et 6.25 μL

HindIII (20 U/μL,NEB) dans 25 μL de NEB2 10 X. Suite à l’incubation, la

déphosphorylation des extrémités 5’ s’effectue par l’ajout de 4 U de CIP (10 U/μLNEB)

par μg d’ADN pour une durée de 1h à 37oC. Le produit de digestion est purifié par

extraction sur gel TAE1X/agarose 1%, la bande attendue est de 400pb. Le marquage de la

sonde est effectué par l’ajout de 100μCi de γATP (10 μCi/μL), de 2 μL de T4

Polynucléotide kinase (10 U/μL, NEB) dans la solution T4 PNK 10 X buffer (NEB) et un

volume final de 92 μL incubé 1h30 à 37oC. La sonde est ensuite purifiée sur colonne S400

HR (microSpin columns, Amersham Pharmacia) selon les indications du manufacturier.

Titration de la protéine Dmc1

La solution d’échange de brin (20 mM triethanolamine-HCl pH7.5, 1 mM Mg(OAc)2, 2mM

ATP, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 100 μg/μL BSA) ainsi que l’ADN simple brin pPB4.3

(15 μM) sont préchauffés 5 minutes à 37oC avant d’y ajouter la protéine selon les

concentrations indiquées. Ensuite, 0.828 μM de sonde marquée de 400 pb, complémentaire

à l’ADNsb pPB4.3, est ajoutée afin de poursuivre la réaction 1h30 à 37oC. L’arrêt de la

réaction s’effectue par l’ajout de 1/10 de volume de solution d’arrêt (0.1 mM Tris-HCl pH

7.5, 0.1 mM MgCl2, 3 % SDS, 5 μg/μL bromure d’éthidium et 10 mg/mL protéinase K) et

incubé 45 minutes à 37oC. Le tout est déposé sur gel TAE 1X/0.8% agarose contenant 1

μg/mL de bromure d’éthidium pour une migration de 2h30 à 65 volts. Le gel est séché sur

papier 3M avant d’être visualisé par autoradiographie.

Test de dépendance d’ATP et de Mg2+

Afin de déterminer si la réaction est dépendante de l’ATP ou de magnésium, la réaction

suivante a été effectuée dans les conditions similaires à celles décrites précédemment à

l’exception de la concentration de Mg2+ qui, lorsque présent dans la réaction, est de 2.5

35

mM. La réaction a été effectuée en présence ou en absence de magnésium, ainsi qu’en

présence de 20 mM final d’ATP, d’ATPγ-s ou d’AMP-PNP.

2.22 Microscopie électronique 10 μL de solution (20 mM triethanolamine-HCl pH 7.5, 1 mM DTT, 2 mM ATP pH 7.5,

2.5 mM Mg(OAc)2) contenant 3 μM d’ADN simple brin (φX174 ), de l’ADN protubérant

ou «gap circular » (pJYMAT4.2), de l’ADN double brin linéaire (pPB4.3) sont préchauffés

5 minutes à 37oC. Par la suite, la protéine Dmc1 est ajoutée avant de continuer l’incubation

pour un 10 minutes supplémentaire. La protéine est fixée sur l’ADN par l’addition de 0.2%

de glutaraldéhyde et une incubation de 15 minutes à 37oC. Par la suite, la réaction est

congelée sur glace sèche avant d’être conservée à –80oC et d’être expédiée au Dr Andrzej

et à Alicja Stasiak du Laboratoire d’Analyse Structurale de l’Université de Lausanne.

Ceux-ci ont coloré l’ADN par un traitement à l’uranyle acétate (Sogo & al, 1987) et

photographié les résultats obtenus.

3 Résultats

3.1 Clonage et mutagenèse Le gène dmc1+, amplifié

d’une banque génomique de

Schizosaccharomyces pombe

lors de l’amplification par PCR

contenait un intron. Cet intron,

de nature génomique, a été

enlevé à l’aide du protocole

modifié de mutagenèse publié

par Wang (Wang & Malcom,

1999). La séquence d’ADNc obtenue suite à cette délétion dirigée (voir figure 3.1),

comparée à celle publiée par Fukushima et al. (Fukushima & al, 2000), nous a indiqué un

gène de type sauvage.

3.2 Expression et purification de la protéine Dmc1 de S.pombe Le gène Dmc1, ainsi obtenu, a été inséré à l’intérieur du vecteur d’expression pET16b

(Novagen), permettant ainsi l’ajout d’une séquence 10-Histidine à l’extrémité N-terminale

de la protéine qui sera transcrite. La protéine recombinante formée a ensuite été exprimée

et purifiée d’une souche d’Escherichia coli RecA-. Cette dernière caractéristique a permis

d’éviter une éventuelle contamination de l’extrait protéique par la recombinase bactérienne

RecA. La fraction soluble de protéine induite a été évaluée à environ 30% de l’extrait total

de Dmc1 (voir Figure 3.2 (A); ligne 2 et 3). Ce rendement a été obtenu avec une induction

à 30oC dans un milieu Tryptone-Phosphate. Une précipitation sélective à la spermidine a

été effectuée comme première étape de purification. La protéine a ensuite été remise en

solution et déposée sur une colonne d’affinité Talon (voir figure 3.2 (A) ; ligne 4 à 17),

particulièrement efficace pour éliminer les contaminants. L’éluat sélectionné a tout de

même été déposé sur une colonne Héparine et sur une colonne MonoQ afin d’éliminer les

Figure 3.1 : Illustration de la mutagenèse effectuée sur l’ADN génomique.

37

Figure 3.2 : Expression et purification de la protéine Dmc1 de S.pombe. (A) Surexpression et purification sur Talon de la protéine exprimé chez E.coli. Ligne 1 : Marqueurs de poids moléculaire. Ligne 2 : Extrait protéique total suite à l’induction à l’IPTG. Ligne 3 : Extrait protéique soluble après centrifugation. Ligne 4 : Flow through de la colonne Talon. Lignes 5-8 : Lavages de la colonne avec tampon T contenant 30 mM imidazole. Ligne 9 : Lavage avec tampon T contenant 40 mM imidazole. Lignes 10-17 : élution de Dmc1 à l’aide du tampon T lors d’un gradient de 40-800 mM imidazole. (B) Dmc1 purifiée suite à la colonne MonoQ. Ligne 1 : marqueurs de poids moléculaire, Ligne 2 : protéine purifiée. Gel SDS-page 10% coloré au bleu de Coomassie.

nucléases et de

concentrer l’éluat.

Les résultats de

l’élution finale après

la dernière étape de

purification sont

présentés en partie (B)

de la figure 3.2

L’expression et la

purification de la

protéine Rad51 de

Schizosaccharomyces

pombe ont été

effectuées

conjointement à celles

de son homologue Dmc1. La protéine purifiée a ensuite été prise en charge par Synthia

Sauvageau, étudiante à la maîtrise. Les résultats obtenus avec cette protéine vous seront

présentés par cette collègue dans

un ouvrage subséquent.

3.3 Filtration sur gel La filtration sur gel de la protéine

Dmc1 effectuée sur une colonne

Superdex 200 a permis de

déterminer la masse moléculaire

de la protéine en solution. Le pic

d’élution de Dmc1, a eu lieu aux

fractions 21, 22 (figure 3.3 ; ligne

21-22), indiquant un poids

Figure 3.3 : Nature multimérique de la protéine Dmc1 de S.pombe. Détermination de la masse moléculaire de la protéine en solution par filtration sur colonne Superdex 200. Graphique : Chromatographe des standards de poids moléculaire. Western : Révélation western des fractions d’élution (numérotées ci-haut) avec un anti-histidine.

38

moléculaire correspondant à 310 kDa. D’un poids moléculaire de 39373 Da, il semble que

la protéine de fusion se présente sous forme octamérique en solution. Des résultats

similaires ont auparavant été obtenus lors de la découverte de la formation d’anneaux

octamériques par la protéine humaine (Masson & al, 1999 ; Passy & al, 1999). Il est

important de noter qu’aucune élution protéique n’a été observée au poids moléculaire

monomérique (figure 3.3 ; ligne 30).

3.4 Interaction homotypique de Dmc1 par double hybride Puisque la protéine est apte à interagir avec elle-même en solution, il est intéressant de

découvrir à quel domaine protéique est due cette interaction et si elle est possible avec

d’autres protéines. La protéine liée aux domaines de liaison et d’activation GAL4 a été

conjointement exprimée et mise en croissance sur un milieu minimal. Afin de déterminer

le domaine d’interaction de la protéine avec elle-même, celle-ci a été divisée en 3 domaines

distincts (voir figure 3.4 (c); domaine 1 : acides aminés 1-111, 2 : acides aminés 112-218,

3 : acides aminés 219-333). Chacun a été mis en contact avec la protéine entière exprimée

Figure 3.4 : Interaction par double hybride. (A et B) Cotransformation de la levure S.cerevisiae AH109 par les différents vecteurs d’expression. Croissance sur milieu minimal dépourvu de tryptophane, leucine, adénine, histidine et supplémenté de 2.5mM aminotriazole. (C) Diagramme des constructions utilisées et quantification de la croissance par activité β-galactosidase. AD : désigne une fusion au domaine d’activation Gal4 et DBD une fusion au « Gal4 DNA-binding domain ».

39

avec le domaine d’activation. Seul le domaine comportant les 111 premiers acides aminés à

démontrer une interaction avec la protéine entière. Ce résultat semble affirmer que la

capacité de Dmc1 d’interagir avec elle-même serait comprise dans ces 111 premiers acides

aminés. La protéine Dmc1 de S.pombe n’a démontré aucune interaction avec les protéines

Rad51 de pombe et de l’humain, ni avec la protéine Hop2 de souris (résultats non illustrés).

De plus, aucune interaction n’a été observée avec la protéine Dmc1 humaine, que ce soit en

présence de la protéine de levure pleine longueur ou de l’un de ses trois domaines distincts.

Malgré leur 57% de séquence conservée, il semble que le domaine d’auto-interaction ne se

soit pas conservé d’une espèce à une autre.

3.5 Liaison à l’ADN par Dmc1 de S.pombe Une recombinase a la

propriété de lier l’ADN.

Pour le vérifier, une

expérience de retardement sur

gel a été effectuée avec de

l’ADN simple brin, double

brin et protubérant (voir

figure 3.5). L’incubation de

la protéine Dmc1 purifiée en

présence de ces ADN a

engendré la formation d’un

réseau protéine-ADN

observable par migration sur

gel. Le réseau, caractéristique à l’assemblage de plusieurs molécules d’ADN et de

protéines liées, est observé par une migration presque nulle, soit un grand retardement sur

gel. La protéine, Dmc1, lie préférentiellement l’ADN simple brin à l’ADN double brin

(figure 3.5 lignes 2-5 ; 6-10), une liaison qui tend à être coopérative en concentration élevée

de protéine (figure 3.5 lignes 4-5 ; 14-15 ; 19-20). Lors de la quantification, il a été

démontré que seulement 6% du duplex sont liés par l’ajout de 500nM de Dmc1

Figure 3.5 : Retardement sur gel de la protéine Dmc1 de S.pombe. Liaison de la protéine sur 15μM d’ADN. Protéine fixée par ajout de 0.2% de glutaraldéhyde et déposée sur gel SDS-PAGE 8%. Titration croissante de protéine sur ADN sb (lignes 1-5), sur l’ADNsb (lignes 6-10) , sur ADN protubérant 5’ (lignes 11-15) et sur ADN protubérant 3’ (lignes 16-20).

40

comparativement à 70% de l’ADN simple brin dans les

mêmes conditions. La liaison à l’ADN protubérant est

légèrement inférieure à la liaison au simple brin et elle ne

démontre aucune préférence directionnelle. Tant les

extrémités 5’ libres que 3’ libres sont liées par la protéine.

Les conditions nécessaires à la liaison de la protéine à l’ADN

ont été déterminées lors d’expériences avec ADN simple

brin. La protéine, Dmc1, nécessite la présence d’ATP mais

non de son hydrolyse, afin de se lier à l’ADN. Cependant la

présence d’ATPγs permet une liaison beaucoup plus faible

que la présence d’AMP-PNP (figure 3.6). La présence de

magnésium, étudiée sur une large vague de concentration

(1mM à 25mM), est aussi nécessaire à la liaison de Dmc1 sur

l’ADN et est optimale à 2.5mM. La présence de sel (NaCl)

en solution, permet une liaison optimale à 50mM et est

inhibée lorsque supérieure à 200mM (résultats non illustrés).

3.6 Activité ATPase de Dmc1 de S.pombe Dmc1, membre de la famille des

recombinases, possède des sites

de liaison à l’ATP. Comme ses

confrères, la présence d’ADN

stimule l’activité ATPase de

Dmc1. Calculé en présence

d’ADN simple brin, Dmc1

hydrolyse 0.86 ATP/min, vitesse

qui diminue en présence d’ADN

double brin et en absence d’ADN

(voir figure 3.7). L’hydrolyse

Figure 3.7 : Activité ATPase de Dmc1 de S.pombe. % ATP hydrolysé en fonction du temps lorsque mise en présence et en absence d’ADN, comme indiqué dans la légende.

Figure 3.6 : Conditions favorables à la liaison à l’ADN. Liaison de Dmc1 à l’ADN simple brin en présence ou absence de différents facteurs.

41

effectuée par la protéine de pombe est similaire à celle de cerevisiae (0.7 ATP/min ; Hong

& al, 2001) et celle de l’humain (1.5 ATP/min ; Li & al, 1997).

3.7 Activité de renaturation de l’ADN par Dmc1 de S.pombe Sachant que Dmc1 lie efficacement l’ADN, on a voulu déterminer si cette protéine était

capable d’effectuer l’annelage d’ADN homologue. Effectué avec de l’ADN double brin

préalablement dénaturé, il a été possible

d’observer une renaturation spontanée

(figure 3.8 ; lignes 2-6) stimulée par l’ajout

de la recombinase méiotique (figure 3.8 ;

lignes 7-11). Cette réaction a été observée

dans le temps entre de 30 secondes et 10

minutes d’incubation, temps nécessaire au

plafonnement de la réaction (figure 3.8 ;

lignes 7-11). La renaturation, optimale en

présence de 2.5mM magnésium (figure 3.8 ;

ligne 12), est diminuée de moitié en absence

d’ATP (résultats non illustrés). Cette

dépendance de l’ATP a aussi été observée

Figure 3.8 : Renaturation de l’ADN par la protéine Dmc1 de S.pombe. Renaturation d’un duplex d’ADN de façon spontanée (sans protéine) et lors de l’ajout de Dmc1. (A) Renaturation dans le temps. (B) Renaturation en présence de diverses concentrations de magnésium lors d’une réaction de 5 minutes à 20oC. Réaction déposée sur gel SDS-PAGE 8% suite à sa déprotéinisation. En 1, duplex avant dénaturation, lignes 2-6 : Renaturation spontanée de la sonde dans le temps (A) ou en présence de concentration croissante de magnésium (B), lignes 7-11 : Renaturation stimulée par l’ajout de 400 nM de Dmc1 dans le temps (A) ou en présence de concentration croissante de magnésium (B).

Figure 3.9 : Réaction d’échange de brin par la protéine Dmc1 de S.pombe. Titration protéique sur 15μM ADN circulaire simple brin mis en présence de 828nM d’ADN double brin marqué. Ligne 1 : Réaction en absence de protéine, lignes 2-9 : augmentation croissante de protéine, selon l’indication de la figure.

42

Figure 3.10 : Microscopie électronique. (A) Filament hélicoïdal de Rad51 humain sur ADN simple brin. (B) Formation d’agrégats de Dmc1 humain sur ADN simple brin. (C) Protéine Dmc1 de S.pombe formant un filament hélicoïdal sur l’ADN protubérant (D) Filament désorganisé sur ADN simple brin. (E) Anneau octamérique de la protéine de levure en solution.

lors de la renaturation par la recombinase RecA (Bryant & Lehman, 1985).

3.8 Activité d’échange de brin Capable de stimuler l’appariement d’ADN homologue dénaturé, la réaction a été reprise

avec un ADN simple brin circulaire long de 4300 nucléotides, et un duplex de 400 paires de

bases homologues au simple brin. Malgré le fait que la protéine humaine est incapable

d’effectuer cette réaction dans ces conditions (résultats non illustrés), la protéine Dmc1 de

S.pombe a su effectuer la réaction d’échange de brin (voir figure 3.9). La réaction

d’échange de brin amenant la formation de molécules jointes est optimale à 5.25 μM de

Dmc1 (voir figure 3.9 ; ligne 8), ce qui correspond à un ratio d’un monomère pour 2.85

nucléotides. Résultat semblable au ratio 1 pour 3 de RecA et de Rad51.

3.9 Observation de filament protéique sur l’ADN par microscopie électronique

Sachant maintenant que la protéine étudiée est apte à lier l’ADN, à effectuer la renaturation

et l’échange de brin, nous avons décidé d’observer directement son interaction avec l’ADN.

En effet, lors de sa liaison à l’ADN, est-ce que cette recombinase adopte une structure

hélicoïdale propre aux recombinases ? Pour y répondre, nous avons observé, par

microscopie électronique, la protéine liée sur différents fragments d’ADN. D’après les

résultats obtenus, Dmc1 forme des filaments sur l’ADN. Cependant, deux purifications

43

distinctes ont été effectuées et, selon la préparation, la protéine ne réagit pas de façon

identique. Il semble qu’en présence d’ADN, la protéine pourrait former un filament

semblable à celui de la protéine Rad51 humaine (comparaison des figures 3.10 (A) et (C)

respectivement) tandis que certaines autres molécules ont plus tendance à former des

agrégats, un peu comme fait Dmc1 humain (figure 3.10 (B) et (D)).

4 Conclusions La recombinaison homologue a lieu lors de la méiose. Ce mécanisme découvert depuis de

nombreuses années est toutefois méconnu. Son étude, chez l’homme, n’est pas tâche facile.

Les enjeux éthiques d’un approvisionnement en tissus méiotiques humains (ovaires /

testicules) et l’inexistence de lignée cellulaire méiotique stable en sont la cause. Cette

inaccessibilité de tissus humains a amené notre équipe à étudier les différentes composantes

de la recombinaison homologue chez l’organisme eucaryote Schizosaccharomyces pombe.

Cette levure se reproduit de façon sexuée par la simple ablation de l’azote de son milieu de

culture.

La protéine Dmc1 est une recombinase d’expression uniquement méiotique. Homologue

aux protéines RecA et Rad51, on peut s’attendre à des propriétés similaires de la part de

Dmc1. Cependant, il fut démontré que la protéine humaine a, contre toute attente, une

faible activité d’échange de brin et une difficulté à former des filaments hélicoïdaux sur

l’ADN. Les premières études structurales de la protéine ont démontré la formation

d’anneaux octamériques en solution (Passy & al, 1999 ; Masson & al; 1999). Ces anneaux

en présence d’ADN, avaient tendance à s’enfiler l’un derrière l’autre afin de créer un

filament (Masson & al, 1999). Ce filament, désordonné, n’avait rien d’une structure

hélicoïdale propre aux recombinases. Des études plus récentes ont su démontrer la

présence de filament hélicoïdal en présence d’ATP. Filament qui serait stimulé par la

présence de la protéine RPA (Sehorn & al, 2004). Afin d’apporter des informations

complémentaires, nous avons étudié les caractéristiques biochimiques et structurales de la

protéine Dmc1 de Schizosaccharomyces pombe.

Interactions protéine-protéine et structure en solution

Plusieurs enzymes impliquées dans la recombinaison sont reconnues pour leur capacité à

interagir avec elles-mêmes, menant ainsi à la formation de structures de conformation

toroïdale (Hingorani & O’Donell, 1998). Afin de déterminer si la protéine de levure Dmc1

peut former des structures d’une telle conformation, nous avons tout d’abord vérifié si cette

protéine était capable d’interagir avec elle-même. Suite aux résultats positifs de

l’interaction par double hybride, nous avons déterminé le domaine protéique responsable de

45

cette interaction. Les résultats démontrent que, tout comme la protéine Rad51 de

S.cerevisiae (Chen & al, 1998), le domaine N-terminal est celui qui est essentiel aux

interactions protéines-protéines. Il semble que la protéine Dmc1 ne se retrouve pas sous

forme de monomère en solution. Les analyses de filtration sur gel démontrent une élution

protéique variant de 270 à 340 kDa avec un pic d’élution à 310 kDa. D’un poids

moléculaire de 39373 Da, il semble que la protéine de fusion produite se retrouverait sous

forme octamérique en solution. L’analyse de protéine en absence d’ADN, lors de la

microscopie électronique, vient confirmer ces résultats, corroborant ceux obtenus avec la

protéine humaine (Passy & al, 1999; Masson & al, 1999).

Propriétés conservées de la recombinase

L’hydrolyse de l’ATP permet aux recombinases de séparer les duplex d’ADN et de tester

l’homologie entre diverses molécules. Étant une recombinase, Dmc1 est apte à hydrolyser

l’ATP. Cependant, comme pour toutes les recombinases eucaryotes, son activité est

beaucoup plus faible que celle de RecA. Son activité, calculée ici à 0.86 ATP/min

ressemble beaucoup plus à celle de son homologue humain Rad51, qui s’élève à 0.16

ATP/min (Baumann & al, 1996). Leur activité respective pourrait cependant être plus

élevée lorsque étudiée in vivo. Une autre similitude avec les recombinases classiques est la

préférence marquée de Dmc1 pour l’ADN simple brin. Cette préférence est consistante

avec la liaison de la recombinase au brin resecté, étape nécessaire à l’invasion prenant lieu

lors de la recombinaison.

Activité d’appariement et d’échange de brin

L’alignement et l’annelage d’ADNs complémentaires sont des étapes essentielles à la

renaturation. Diverses protéines, telles que RecA, Rad51 de l’humain et de la levure ainsi

que Rad52 humain, sont aptes à effectuer une telle réaction. La protéine, Dmc1 de

S.pombe, est aussi apte à effectuer la renaturation d’ADN complémentaire. Cette réaction

d’annelage pourrait supporter l’idée qu’il y ait réparation de cassures double brin par

« synthesis-dependent strand annealing »(voir section 1.3.2) (Pâques & Haber, 1999).

46

Le filament hélicoïdal formé par les recombinases classiques sur l’ADN est nécessaire à

l’échange de brin. Le filament nucléoprotéique permet de maintenir à proximité deux

particules d’ADN. De cette façon, l’homologie des séquences peut être testée permettant

ainsi d’aligner l’ADN complémentaire et de procéder à l’échange de brin (West &

Connolly, 1992). À l’aide d’un ADN simple brin circulaire et d’un duplex homologue à ce

premier, il fut possible de mettre en évidence la capacité de Dmc1 à effectuer une réaction

d’échange de brin. Dans une même lancée, des données in vivo permettaient de conclure à

ce même résultat. En effet, il semblait que Dmc1 était apte à effectuer la réaction

d’échange de brin puisque des mutants DMC1 démontraient un haut taux de cassures

double brin et une hypersection des extrémités endommagées (Bishop & al, 1992).

Cependant, l’efficacité de Dmc1 à effectuer un échange d’information génétique est limitée

par rapport à celle de la recombinase procaryote.

Filament nucléoprotéique formé par Dmc1

Les recombinases RecA et Rad51 sont connues pour être actives lorsque sous forme de

filament hélicoïdal. Pour ce qui est de Dmc1 humain cependant, il semble que la protéine

soit plus ou moins apte à former un filament de type hélicoïdal. Selon plusieurs, la protéine

a une structure octamérique en solution (Passy & al, 1999; Masson & al, 1999 ; Kinebuchi

& al, 2004). La formation de filament ressemblerait à un alignement d’anneaux enfilés sur

l’ADN. Toutefois, l’équipe de Sehorn (Sehorn & al, 2004) a pu observer des filaments

hélicoïdaux formés par la protéine humaine. Cette étude vient corroborer ces faits. Nous

avons été capables de visualiser des filaments protéiques de la protéine de S.pombe sur

l’ADN. Ces filaments, parfois désorganisés, parfois hélicoïdaux sont toutefois incompris.

Pourquoi, dans des conditions identiques obtenons-nous différents résultats? Afin de

répondre à cette question, la protéine sera produite avec une étiquette de 10-histidine en

extrémité C-terminale. Des résultats (non publiés) nous font croire que le clivage partiel de

cette extrémité limite la formation d’un filament hélicoïdal attendu. Peut-être résoudrons-

nous le mystère entourant la structure filamenteuse de cette recombinase.

De plus, il faut envisager d’étudier l’action des cofacteurs dans la recombinaison. Par

exemple, on sait que les mutants hop2/mnd1 de S.cerevisiae ont de la difficulté à juxtaposer

47

les brins homologues. Ces mutants sont aussi incapables de transformer les CDBs de

l’ADN en intermédiaires ou en produits de la recombinaison homologue (Petukhova et al,

2003). Par contre, des études ont su démontrer une stimulation de la recombinase Dmc1

par l’ajout du complexe Hop2/Mnd1 de S.cerevisiae ou par l’ajout de Hop2 de la souris

(Chen et al, 2004; Enemoto et al, 2004) L’analyse plus complète de la coopération

Hop2/Mnd1 et Dmc1 peut peut-être nous aider à résoudre la problématique du filament de

la recombinase méiotique. Il ne faut pas oublier que la formation de filaments hélicoïdaux

caractéristiques aux recombinases a pu être observée en présence de la protéine RPA.

Hop2 est peut-être le cofacteur méiotique nécessaire à la formation de filaments corrects et

d’une réaction efficace d’échange de brin.

Perspectives

La recombinaison homologue est impliquée dans le réarrangement génique, la diversité

génétique et la bonne ségrégation des chromosomes. Une défectuosité dans la ségrégation

des chromosomes peut être fatale pour une cellule par l’avènement d’une aneuploïdie

(cellule comportant un nombre inexact de chromosomes). Sur le plan clinique, cette

aneuploïdie a de lourdes conséquences puisqu’elle est la cause du retard mental et de

l’altération de développement caractéristiques de la trisomie 21 (Hassold & Hunt, 2001). À

long terme, le laboratoire tentera de comprendre tous les mécanismes de recombinaison

pouvant provoquer la non-disjonction des chromosomes et, par le fait même, une

aneuploïdie. Un pas de plus sera fait vers la compréhension et le contrôle des maladies

reliées à une recombinaison défectueuse.

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Études des caractéristiques biochimiques et structurales