UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

DOMAINE SCIENCES ET TECHNOLOGIES

MENTION BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

MEMOIRE DE RECHERCHE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE

MASTER

PARCOURS : BIOTECHNOLOGIES

Présenté par RAKOTOARISOA Mialy Tsiory

Maître ès Sciences

Soutenu publiquement le 18 décembre 2017 devant le jury composé de :

Président : Pr RAHERIMANDIMBY Marson

Encadreur : Pr ANDRIANARISOA Blandine

Co-encadreur : Dr RAHARIJAONA Tovo Robin

Examinateurs : Dr HARIMALALA ANDRIAMBELO Nirina

Dr RAMAMONJISOA Daniel

REMERCIEMENTS

Avant tout, gloire à Dieu Tout puissant car sans Lui rien n’aurait pu être réalisé

Il m’est également agréable d’exprimer mes remerciements à :

Monsieur le Docteur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina, Recteur et Chef des

unités de laboratoire de l’ASJA, de m’avoir accueillie dans ses laboratoires de recherche afin

de réaliser mon stage.

Monsieur le Professeur RAHERIMANDIMBY Marson, Doyen de la Faculté des

Sciences et Professeur titulaire à la mention Biochimie Fondamentale et Appliquée, de

m’avoir donné l’honneur, en acceptant de présider le jury de ce mémoire.

Madame le Docteur Harimalala Andriambelo Nirina et Monsieur le Docteur

RAMAMONJISOA Daniel qui ont aimablement accepté de juger mes travaux et donner leurs

aimables conseils durant les périodes de rédaction de ce mémoire et cela, malgré leurs

responsabilités innombrables.

Madame le Professeur ANDRIANARISOA Blandine, mon encadreur, enseignante à la

Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo, pour la grande disponibilité qu’elle m’a

toujours témoignée et l’intérêt qu’elle a porté à mes travaux. Je ne saurai vous remercier assez

pour vos conseils, sans lesquels j’aurai eu des difficultés dans la réalisation de mes recherches.

Monsieur le Docteur RAHARIJAONA Tovo Robin, maître de conférences, enseignant

à l’Ecole Supérieure Polytechnique d’Antananarivo, qui a accepté de m’encadrer en prodiguant

des conseils judicieux. Vos instructions m’ont été d’une grande utilité et j’en suis infiniment

reconnaissante.

Enfin et non la moindre, ma maman, mon frère et mon bien-aimé pour m’avoir toujours

soutenue et encouragée durant mes moments les plus durs, je vous serai à jamais redevable.

Bref, j’adresse toute ma gratitude à tous ceux qui ont contribué à la réalisation de ce travail, que

la Bénédiction de Dieu soit avec vous.

« J’ai compté fermement sur le Seigneur, Il s’est penché vers moi, Il a entendu mon appel. »

Psaume, 40 :1

Table des matières

TABLE DES MATIERES

GLOSSAIRE………………………………………………………………………………….i

LISTE DES TABLEAUX……………………………………………..…………………….iii

LISTE DES FIGURES…………………………………………………………………..…..iv

LISTE DES ABREVIATIONS………………………………………………………..……..v

INTRODUCTION………...………………………………….…………………………..…..1

Partie 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

I. Le sol et ses polluants ......................................................................................................... 3

1. Description ...................................................................................................................... 3

2. La biologie du sol ............................................................................................................ 3

3. Les polluants du sol ......................................................................................................... 3

3.1 Polluants radioactifs ................................................................................................. 4

3.2 Polluants inorganiques ............................................................................................. 4

3.3 Polluants organiques ................................................................................................ 4

a. Les pesticides ........................................................................................................... 4

b. Les solvants organiques ........................................................................................... 5

c. Les hydrocarbures .................................................................................................... 5

c-1 Les alcanes ........................................................................................................ 5

c-2 Les alcènes et alcynes ....................................................................................... 6

c-3 Les hydrocarbures aromatiques ........................................................................ 6

II. La bioremédiation par les bactéries .................................................................................... 7

1. Définition ........................................................................................................................ 7

2. Les technologies utilisées dans la bioremédiation .......................................................... 7

3. Dégradation des hydrocarbures ....................................................................................... 8

3.1 Facteurs influençant la dégradation des hydrocarbures ........................................... 8

3.2 Métabolisme des hydrocarbures............................................................................... 9

a. Cas des alcanes ........................................................................................................ 9

b. Cas des alcènes et des alcynes……………………....……………………………10

c. Cas des Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques ............................................. 10

III. Pseudomonas putida ......................................................................................................... 11

1. Position systématique .................................................................................................... 11

2. Description .................................................................................................................... 12

3. Facteurs de croissance ................................................................................................... 12

3.1 Besoins nutritifs ..................................................................................................... 12

a. Source de carbone .................................................................................................. 12

b. Source d’azote ........................................................................................................ 12

Table des matières

c. Autres éléments nutritifs ........................................................................................ 13

3.2 Facteurs physico-chimiques ................................................................................... 13

a. Température ........................................................................................................... 13

b. Humidité et activité de l’eau .................................................................................. 13

c. pH ........................................................................................................................... 13

Partie 2: MATERIELS ET METHODES

I. Matériels ........................................................................................................................... 14

I-1. Matériels d’expérimentation ......................................................................................... 14

I-2. Matériels de laboratoire ................................................................................................. 14

I-3. Milieux de culture ......................................................................................................... 14

II. Méthodes ........................................................................................................................... 14

II-1. Prélèvement de l’échantillon de sol ............................................................................ 14

II-2. Isolement bactérien ..................................................................................................... 15

II-2.1 Préparation de la suspension mère ......................................................................... 15

II-2.2 Ensemencement ..................................................................................................... 16

II-2.3 Caractérisation des colonies isolées ....................................................................... 16

II-3. Purification .................................................................................................................... 17

II-4. Conservation.................................................................................................................. 17

II-5. Identification ................................................................................................................. 17

II-5.1 Etude des caractères morphologiques et culturaux ................................................ 17

II-5.1.1 Examen macroscopique .................................................................................. 17

II-5.1.2 Examen microscopique ................................................................................... 18

II-5.1.3 Observation à l’état frais ................................................................................. 18

II-5.1.4 Observation après coloration Gram ................................................................ 18

II-5.2 Etude des caractères physiologiques ...................................................................... 19

II-5.2.1 Détermination du type respiratoire ................................................................. 19

II-5.2.2 Recherche de l’oxydase .................................................................................. 20

II-5.3 Etude des caractères biochimiques ........................................................................ 20

II-5.3.1 Test sur milieu HAJNA-KLIGLER ................................................................ 20

II-5.3.2 Test sur milieu CITRATE DE SIMMONS .................................................... 21

II-5.3.3 Test sur milieu MANNITOL-MOBILITE-NITRATE ................................... 21

II-5.3.4 Test sur milieu LYSINE-FER ........................................................................ 21

II-5.3.5 Auxanogramme du carbone ............................................................................ 22

II-5.3.6 Test à la gélatine ............................................................................................. 22

III. Essai de traitement biologique .......................................................................................... 23

III-1.Mise en place du dispositif expérimental ..................................................................... 23

III-1.1 La préculture .......................................................................................................... 23

Table des matières

III-1.2 La préparation du sol ............................................................................................. 24

III-1.3 L’inoculation .......................................................................................................... 24

III-2.Méthodes analytiques ................................................................................................... 24

III-2.1 Dosages des hydrocarbures résiduels dans le sol ................................................... 24

III-2.2 Suivi de l’évolution de la population bactérienne .................................................. 26

III-2.2.1 Préparation de la suspension mère ........................................................................ 26

III-2.2.2 Dilutions ................................................................................................................. 26

III-2.2.3 Culture bactérienne ................................................................................................ 26

III-2.2.4 Mode de calcul pour le cas du dénombrement bactérien .................................. 26

III-2.3 Traitement des résultats en régime discontinu ....................................................... 27

III-2.3.1 Vitesse de dégradation du substrat Rs ........................................................... 27

III-2.3.2 Vitesse spécifique de dégradation du substrat QS ........................................... 27

III-2.3.3 Vitesse de production de biomasse RX ........................................................... 27

III-2.3.4 Vitesse spécifique de croissance µx ................................................................ 28

III-2.3.5 Temps de génération G ................................................................................... 28

Partie 3: RESULTATS ET INTERPRETATIONS

1. Isolement ....................................................................................................................... 29

2. Purification et conservation ........................................................................................... 29

3. Identification des souches ............................................................................................. 29

3.1 Caractères culturaux ............................................................................................... 29

3.2 Caractères morphologiques ................................................................................... 30

3.3 Caractères physiologiques .................................................................................... 31

3.4 Caractères biochimiques ....................................................................................... 32

3.5 Classification des souches ...................................................................................... 33

4. Essai biologique ............................................................................................................ 33

4.1 Teneurs en hydrocarbures résiduels ....................................................................... 33

4.2 Evolution de la population bactérienne .................................................................. 35

4.3 Traitement des résultats obtenus ............................................................................ 35

Discussions……………………………………………………………………………………37

Conclusion et perspectives...………………………………………………………………….40

Références bibliographiques………………………………………………………………….41

Annexes

Glossaire

i

Glossaire

Aliphatique : composé organique qui ne possède pas de noyau aromatique.

Anthropique : qui est causé par l’homme.

Bioaccumulation : processus par lequel certaines substances endogènes ou exogènes, présentes

en faible quantité, voient leur concentration augmenter dans un organe, un organisme, une

chaîne alimentaire (ou trophique), un écosystème.

Biodégradation : décomposition partielle ou totale d'un produit par un agent biologique.

Biofilm : structure hétérogène constituée par des populations bactériennes englobées dans une

matrice extracellulaire, fixée sur des surfaces naturelles ou artificielles.

Biosurfactant : composé actif biologique qui favorise la solubilisation et l'émulsion de

composés organiques.

Biovar : groupe de microorganismes qui possèdent les mêmes caractères biochimiques ou

physiologiques et se différencient sur les caractères génétiques.

Cancérigène : qui peut provoquer, aggraver ou sensibiliser un cancer ou son apparition

Consortium : association de bactéries

Contaminant : composé ou substance étrangère qui affecte la qualité d’une matière.

Craquage thermique : décomposition de fractions pétrolières sous l’influence de la chaleur.

Organotrophe : microorganisme qui métabolise des composés organiques comme source de

carbone et d’énergie.

Oxygénases : enzymes qui oxydent un substrat en y transférant un atome d'oxygène.

Pédogenèse : ensemble des processus (physiques, chimiques et biologiques) qui aboutisse à la

formation d’un sol.

Glossaire

ii

Persistant : composé est qualifié de persistant quand son élimination par des voies biologiques

est impossible ou très lente.

Phytopathogène : agent biologique susceptible de provoquer une maladie chez un végétal.

Pioverdine : sidérophore (chélateur de fer) produit par des bactéries à Gram négatif.

Prototrophe : organisme vivant capable de proliférer dans un milieu de base sans nécessiter la

présence de facteurs de croissance particuliers.

Psychrotrophe : microorganisme capable de se développer à des températures très basses allant

de 0°C à +4°C.

Pyrolyse : décomposition thermique de matières organiques en l'absence d'oxygène ou en

atmosphère pauvre en oxygène.

Rizhosphère : partie du sol pénétrée par les racines des plantes et les microorganismes associés

Tellurique : qui est relatif à la terre, provient de la terre

Tératogène : qui engendre des malformations

Tumorigène : qualifie une cellule susceptible de dégénérer en tumeur

Ubiquitaire : omniprésente dans un environnement.

Liste des tableaux

iii

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Conditions environnementales assurant la bioremédiation ..................................... 8

Tableau 2 : Caractères culturaux des souches bactériennes isolées ......................................... 29

Tableau 3 : Caractères morphologiques des souches bactériennes isolées .............................. 31

Tableau 4 : Caractères physiologiques des souches bactériennes isolées ................................ 31

Tableau 5 : Caractères biochimiques des souches bactériennes isolées ................................... 32

Tableau 6 : Identités des souches pures bactériennes isolées ................................................... 33

Tableau 7 : Variation de la concentration en hydrocarbures résiduels..................................... 34

Tableau 8 : Vitesses spécifiques correspondant à la formation de biomasse et à la dégradation

du substrat ................................................................................................................................ 36

Liste des figures

iv

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Voie de dégradation des alcanes par oxydation terminale, sub- et bi-terminale…..10

Figure 2 : Voies métaboliques de la dégradation du cycle aromatique: cas du benzène ......... 11

Figure 3 : Géolocalisation du site d’échantillonnage ............................................................... 15

Figure 4 : Suspension mère avant ensemencement .................................................................. 16

Figure 5 : Colonies obtenues sur gélose au cétrimide après incubation .................................. 29

Figure 6 : Evolution du taux de dégradation durant l’expérimentation ................................... 34

Figure 7 : Evolution de la concentration en biomasse en fonction de la concentration en

hydrocarbure lors de la culture sur un sol pollué de Pseudomonas putida .............................. 35

Figure 8 : Courbes des vitesses spécifiques correspondant à la biomasse μ, au substrat QS lors

de la culture en batch sur sol pollué avec huile de vidange de Pseudomonas putida .............. 36

v

LISTE DES ABREVIATIONS

°C : degré Celsius

C : carbone

COV : Composé Organique Volatil

EPA : Environmental Protection Agency

g : gramme

h : heure

H : hydrogène

HAP : Hydrocarbure Aromatique Polycyclique

Hcr : hydrocarbure résiduel

INERIS : Institut National de l’Environnement Industriel et des Risques

INRS : Institut National de la Recherche Scientifique

j : jour

LDA : Lysine DésAminase

LDC : Lysine DéCarboxylase

min : minute

N : azote

P : phosphore

PCA : Plate Count Agar

PGPR : Plant Growth-Promoting Rhizobacteria

pH : potentiel d’hydrogène

POP : Produit Organique Persistant

Ppm : partie par million

UFC : Unité Formant Colonie

INTRODUCTION

GENERALE

Introduction

1

Depuis plusieurs décennies, les activités de l’homme ne cessent de s’accroître,

engendrant ainsi une production massive de polluants dans l’environnement. Le sol se trouve

être le plus touché par ce fléau puisque selon l’INRP (Inventaire National des Rejets de

polluants) au Canada en 1992, presque 53,3 % des rejets dus aux activités agricoles,

industrielles et urbaines sont déversés dans le sol. Ces produits de rejets peuvent contenir

différents composés tels que des solvants organiques, des pesticides, des métaux lourds et bien

d’autres encore (Robert, 1996).

Parmi les composés les plus polluants se trouvent les hydrocarbures pétroliers qui

sont des composés organiques très mobiles, ce qui signifie que ces polluants peuvent se

retrouver dans le sol, l’eau, l’atmosphère et aussi dans la chaîne alimentaire. Ces composés sont

non seulement très persistants mais aussi très nocifs aussi bien pour l’homme que pour

l’environnement. En effet, certains d’entre eux peuvent engendrer des tumeurs, des cancers et

même des mutations chez l’homme (Surridge et al., 2009). Du point de vue environnemental,

la présence de ces composés dans le sol inhibe la croissance des microorganismes telluriques,

empêchant ainsi le sol d’assurer ses fonctions et provoquant ainsi un déséquilibre dans

l’écosystème.

De ce fait, la réhabilitation des sols pollués est devenue non seulement une

nécessité mais surtout une obligation. D’ailleurs, la loi canadienne stipule d’ores et déjà la

dépollution de tous les sites contaminés issus des industries d’extraction pétrolière, de raffinage

ou de distribution.

A ce propos, plusieurs technologies de traitement, dont nombreuses d’entre elles

ont déjà fait leurs preuves, sont maintenant offertes pour traiter toute une variété de

contaminants. Parmi ces diverses techniques se trouvent les procédés physiques et les procédés

chimiques. Ces procédés ont recours à l’incinération, à l’enfouissement ou à l’utilisation de

produits chimiques pour éliminer les polluants. Cependant, ces méthodes sont susceptibles

d’engendrer encore plus d’effets néfastes sur le milieu à dépolluer. Le développement de

nouveaux procédés impliquant des organismes ou microorganismes vivants représente une

solution alternative écologique, mais également moins coûteuse que les procédés chimiques ou

physiques (Ballerini et Vandecasteele, 1999). La bioremédiation fait donc appel à l’utilisation

des bactéries afin de ramener la quantité de polluants en dessous de la valeur seuil et dans le

délai imparti pour éviter la dispersion du contaminant.

Introduction

2

Malgré l’appréciation et l’efficacité que porte la bioremédiation, cette méthode

reste encore peu maîtrisée. Les microorganismes dégradant les hydrocarbures ne sont pas

encore tous connus et les technologies de traitement biologique ont besoin d’être mises au point

pour garantir leur efficacité. Par conséquent, avancer les recherches dans ce domaine est d’une

grande utilité afin d’améliorer le système utilisé en augmentant la capacité de dégradation des

microorganismes.

C’est pourquoi cette étude s’est orientée vers la bioremédiation des sols pollués

par les hydrocarbures par Pseudomonas putida. L’objectif principal est donc de mettre au point

un système de bioremédiation efficient tout en tenant compte des différents facteurs favorisant

cette activité bactérienne. Dans cette optique, cette recherche consiste à isoler une souche de

Pseudomonas putida à partir d’un sol puis de réaliser un essai de traitement biologique au

moyen de cette souche. La capacité de dégradation de cette souche ainsi que la cinétique

bactérienne seront aussi évaluées tout au long du processus.

Pour mieux cerner cette étude, ce mémoire se divise en trois parties : en première

partie se trouve l’ensemble des recherches bibliographiques, la deuxième partie concerne les

matériels et méthodes qui vont détailler l’approche méthodologique adoptée durant les

manipulations effectuées et enfin les résultats et discussions se trouvent à la troisième partie.

SYNTHESE

BIBLIOGRAPHIQUE

Synthèse bibliographique

3

I. Le sol et ses polluants

1. Description

Le sol est défini comme la couche superficielle de la croûte terrestre. Il provient de la

pédogenèse qui est un ensemble de processus d’altération des roches mères sous l’action de

l’eau, de l’air et des êtres vivants. Les composés organiques présents dans le sol sont issus de

la dégradation des matières organiques mortes. Le sol forme ainsi un système hétérogène et

complexe constitué d’un ensemble de quatres fractions différentes : les minéraux solides,

la matière organique, la phase gazeuse, et la phase liquide (Raoul, 2003). De ce fait, le sol est

une réserve et fournisseur d’éléments indispensables à la croissance des végétaux et

microorganismes qu’il abrite. A ce titre, le sol est, par son organisation et son fonctionnement,

un véritable système écologique dynamique (Robert, 1996).

2. La biologie du sol

Le sol est un milieu vivant dans lequel se développe une multitude d’organismes variés

appartenant aux règnes animal et végétal. La qualité biologique des sols fait référence à

l'abondance, à la diversité et à l'activité des organismes hébergés dans le sol. Les

microorganismes telluriques contribuent à la mise en équilibre de l’écosystème terrestre

puisqu’ils assurent des fonctions essentielles comme la dégradation des matières organiques, la

production de nutriments pour les plantes, la fixation d’azote, la dégradation des polluants, etc.

(Lemanceau et Heulin, 1998).

Le sol, bien que pouvant être restauré et plus ou moins reconstitué, reste une ressource non

renouvelable en raison de la longue période nécessaire aux processus de sa formation. Cette

propriété le rend particulièrement sensible aux agressions anthropiques telles que les pollutions.

3. Les polluants du sol

Le sol est dit contaminé lorsqu’il contient des composés susceptibles de causer des

altérations (biologiques, physiques ou chimiques) de l’écosystème. Au-delà d’un certain seuil,

le polluant présent dans le sol induit des impacts négatifs sur tout ou partie de l’environnement

en général (Chassin et al., 1996). En fonction de la durée de dégradation, les polluants sont

classés comme suit : les polluants récalcitrants ou persistants et les polluants biodégradables.

Un contaminant est persistant lorsque son élimination biologique est très lente ou impossible.

Un polluant biodégradable par contre, est un composé qui peut être facilement décomposé par

des organismes vivants.

Synthèse bibliographique

4

Les polluants du sol sont très diversifiés. Ils peuvent être inorganiques, organiques ou

radioactifs et sont pour la plupart du temps issus des activités anthropiques.

3.1 Polluants radioactifs

Les polluants radioactifs sont les déchets nucléaires qui proviennent des centrales nucléaires,

des sites d’extraction de minerais et des hôpitaux. Les polluants radioactifs sont des polluants

persistants et durant sa désintégration, ces composés émettent des rayonnements nocifs pour

l’homme. Les éléments radioactifs présents dans le sol peuvent être absorbés par les végétaux,

ingérés ou inhalés par les animaux. Par conséquent, les polluants radioactifs s’intègrent dans la

chaîne alimentaire, entraînant ainsi malformations, mutations génétiques et cancers chez

l’homme (Jammet et al.,1968).

3.2 Polluants inorganiques

Les polluants inorganiques sont principalement les métaux lourds (plomb, mercure, zinc,

cadmium, nickel, arsenic). Ils proviennent des sites d'enfouissement, des déchets domestiques

et industriels, des sites d'extraction de minerais. Les métaux lourds sont à l’état de trace dans le

sol mais ces composés peuvent s’accumuler dans l’environnement puisqu’ils sont très

persistants. Lorsqu'ils se retrouvent en grande quantité dans la nature, ils deviennent nocifs et

peuvent modifier la fertilité des sols. Ils peuvent également contaminer les cours d'eau et des

réserves souterraines (Lemière et al., 2001).

3.3 Polluants organiques

Parmi les polluants organiques, il y a les matières organiques mortes (fumier), les hydrocarbures

(pétrole et dérivés) et les produits organiques persistants (POP) comme les solvants, les

pesticides et les insecticides. En faible quantité, ces éléments s'incorporent facilement dans

l'environnement. Toutefois, l'utilisation en grande quantité de ces contaminants amène une

saturation du sol et induit une toxicité chez les organismes telluriques et l’homme (Christian,

1996).

a. Les pesticides

Les pesticides ou produits phytosanitaires désignent l'ensemble des produits chimiques, naturels

ou de synthèse, destinés à repousser ou détruire les nuisibles (microbes, animaux ou végétaux).

Certains pesticides sont des composés solubles dans l’eau et certains se transforment en d’autres

métabolites toxiques, une utilisation excessive induit l’accumulation de ces produits toxiques

Synthèse bibliographique

5

dans le sol. Les microorganismes telluriques se trouvent donc affectés par cette accumulation,

entrainant ainsi la diminution de la productivité du sol (Hayo, 1997).

b. Les solvants organiques

Les solvants organiques sont des composés qui ont le pouvoir de former avec d’autres

substances une solution homogène. Ils sont utilisés instantanément ou en association avec

d’autres agents chimiques pour dissoudre des matières premières. Ils sont aussi utilisés comme

agents de nettoyage ou comme correcteurs de viscosité. D’une manière générale, les solvants

sont des substances potentiellement toxiques pour l’homme, il s’avère aussi que la microflore

du sol se trouve affectée par cette toxicité, ce qui contribuera à la détérioration de la qualité du

sol (Mousel et al., 1985).

c. Les hydrocarbures

Les hydrocarbures sont des molécules organiques formées uniquement d’atomes de carbone et

d’hydrogène de formule brute : CnHm où n et m sont des entiers naturels. Ces molécules

organiques peuvent être linéaires ou cycliques, présentant des ramifications ou non. D’une

manière générale, les hydrocarbures sont regroupés en deux types de molécules : les

aliphatiques et les aromatiques (Fingas et al., 2009). Selon la nature de leur liaison chimique,

les hydrocarbures peuvent être saturés ou insaturés et sont classés parmi les groupes suivants :

les alcanes, les alcènes et alcynes et les composés aromatiques.

Bien que certains hydrocarbures soient issus de formation biologique, les hydrocarbures les

plus polluants sont ceux qui sont issus d’une formation géochimique, il s’agit ici de produits

pétroliers qui sont constitués à 80% d’hydrocarbures saturés et aromatiques. Leur présence dans

le sol est liée aux industries de raffinage, de transformation, de stockage et de distribution de

pétrole. Certaines pollutions sont aussi issues des sous-produits pétroliers rejetés (notamment

les huiles moteurs usagées) (Tarayre 2012).

Par ailleurs, la structure moléculaire des hydrocarbures influe sur leurs propriétés physico-

chimiques. En d’autres termes, plus le nombre d’atomes de carbone est important, plus la

solubilité, la volatilisation et surtout la biodégradabilité diminuent (Tarayre, 2012). Les sous-

produits pétroliers obtenus en fonction du domaine d’ébullition sont annexés dans l’annexe 4.

c-1 Les alcanes

Les alcanes sont des hydrocarbures aliphatiques saturés caractérisés par la présence de liaisons

simples entre les atomes de carbone. De formule brute CnH2n+2 où n est un entier naturel, les

Synthèse bibliographique

6

alcanes forment deux grands groupes : les hydrocarbures à chaîne ouverte (linéaires ou

ramifiés) et les cyclanes à chaîne fermée.

Chez l’homme, la plupart des alcanes à chaîne linéaire n’induisent aucun effet toxique (Fiches

de toxicologie de l'INRS : Institut National de la Recherche Scientifique). Cependant, il existe

des molécules cycliques, comme l’hexane qui peut provoquer des tumeurs pulmonaires. Par

ailleurs, la volatilité des alcanes diminue avec le nombre d’atome de carbone. Il est à noter que

les dérivés pétroliers contiennent 36 à 42 % d’alcanes.

c-2 Les alcènes et alcynes

Les alcènes et les alcynes sont des hydrocarbures non saturés caractérisés respectivement par

la présence d’une double et d’une triple liaison entre deux atomes de carbone.

De formule brute CnH2n, les alcènes sont obtenus par craquage thermique des hydrocarbures

pétroliers ou aussi par hydrogénation des alcynes. L’alcène le plus courant est l’éthylène qui

est utilisé dans le domaine agroalimentaire pour la maturation des fruits ou pour éviter la

germination des tubercules (Saada et al., 2003).

D’autre part, les alcynes, de formule brute CnH2n-2 sont issus de la déshydrogénation thermique

des alcanes à haute température. L’alcyne le plus utilisé est l’acéthylène qui est un composé

inflammable utilisé en tant que combustible.

La plupart des alcènes et des alcynes sont des composés organiques volatiles (COV), ce qui

signifie que ces composés ne présentent aucun danger vis-à-vis du sol. D’ailleurs, ces composés

sont biodégradables avec une demi-vie allant de 90 à 220 jours (Saada et al., 2003).

c-3 Les hydrocarbures aromatiques

Les hydrocarbures aromatiques sont des composés organiques qui possèdent un ou plusieurs

cycles à doubles liaisons alternées. Le noyau aromatique peut être du benzène ou des dérivés

benzéniques (toluène, xylène, etc.) (Vollhardt et Schore, 2004). Les hydrocarbures aromatiques

sont produits en quantité importante dans l’activité humaine, notamment dans les processus

de pyrolyse et de combustion mis en œuvre dans l’industrie, le transport et le chauffage

(Técher, 2011). Cependant, une grande fraction des hydrocarbures aromatiques polycycliques

présents dans la nature proviennent des dérivés pétroliers.

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des molécules potentiellement

toxiques, dus au faite que ces molécules sont tumorigènes, tératogènes et cancérigènes

Synthèse bibliographique

7

(Bouchez et al., 2001). Les hydrocarbures présents dans le sol sont susceptibles de contaminer

d’autres milieux tels que les nappes phréatiques, les lacs et les rivières.

La biodégradabilité des HAP diminue avec le nombre de cycles de la molécule. En d’autres

termes, les composés ayant un faible poids moléculaire sont plus solubles et plus volatils. En

revanche, les composés de poids moléculaires élevés sont très persistants et par conséquent

bioaccumulables (Kanaly et Harayama, 2000). La demi-vie des HAP peut aller de 20 jours à 3

ans selon le nombre de cycle (INERIS, 2014)

De façon générale, la plupart des HAP sont pratiquement insolubles dans l’eau. Cependant,

leur solubilisation peut être favorisée par des biosurfactants (rhamnolipide) produits par des

bactéries ou des solvants organiques (acétone, alcool) (Cooper et al., 1980).

II. La bioremédiation par les bactéries

1. Définition

La bioremédiation est un processus biologique qui consiste à réduire le niveau de pollution

présent dans l’air, dans l’eau ou dans le sol. La biotransformation et la biodégradation font

partie de la bioremédiation. L’objectif de la biotransformation est d’augmenter l’hydrosolubilité

des substances toxiques afin d’accélérer sa dégradation. Tandis que la biodégradation consiste

surtout en la décomposition du polluant en divers éléments dépourvus d’effets néfastes sur le

milieu naturel. D’une manière générale, durant la bioremédiation, les polluants organiques sont

transformés en molécules moins polluantes (en termes de persistance et de toxicité) (Bocard,

2006). Les bactéries prennent une part importante dans cette décontamination naturelle, du fait

de leurs capacités à s’adapter à la toxicité des polluants en développant une machinerie

enzymatique permettant de dégrader et/ou d’utiliser ce polluant pour leur survie et leur

développement.

2. Les technologies utilisées dans la bioremédiation

Afin que la bioremédiation soit efficace, la bactérie utilisée doit avoir une aptitude à dégrader

les composés organiques présents dans le site à dépolluer. Il est aussi important que la bactérie

présente une tolérance face au pouvoir toxique du polluant. En outre, les bactéries utilisées

peuvent être indigènes, déjà présentes dans la zone polluée, ou d’origine exogène, ajoutées au

milieu pollué (El Fantroussi et Agatos, 2005).

Synthèse bibliographique

8

Les technologies les plus utilisées dans la bioremédiation sont les suivantes :

La bio-augmentation : les bactéries sélectionnées sont mises en culture au laboratoire

sous forme de suspension puis réintroduites dans le sol contaminé. La culture peut

comprendre une ou plusieurs espèces de microorganismes endogènes ou exogènes. La

bio-augmentation est largement utilisée pour décontaminer les sites contenant des

hydrocarbures (Lens et al., 2005).

la bio-stimulation : cette technique consiste à stimuler l’activité des populations

microbiennes endogènes par apport de nutriments et par ajustement des conditions du

milieu (potentiel d’hydrogène, humidité) (El Fantroussi et Agatos, 2005). La bio-

stimulation est surtout utilisée dans les cas des traitements in-situ.

3. Dégradation des hydrocarbures

3.1 Facteurs influençant la dégradation des hydrocarbures

Plusieurs facteurs sont mis en jeu lors de la dégradation des polluants par les bactéries. Les

conditions environnementales doivent être optimales afin d’assurer non seulement la croissance

des bactéries mais aussi l’efficacité de la bioremédiation (Rajaona, 2015). Le tableau 1 affiche

les paramètres à fixer pour une bioremédiation efficiente.

Tableau 1 : Conditions environnementales assurant la bioremédiation

Paramètres Valeur optimale de dégradation d’hydrocarbure

Humidité 25-28 % de la capacité de rétention en eau de la

matrice

pH 5,5-8,8

Contenu en oxygène Aérobie

Contenu en nutriments C :N :P=100 :5 :1

Oligo-éléments Fonction de l’espèce

Température (C°) 15-30

Concentration en hydrocarbure Inférieure à 50000 ppm

Type de sol Contenu en argile faible

Source : Vidali, 2001

Synthèse bibliographique

9

3.2 Métabolisme des hydrocarbures

Pour métaboliser les hydrocarbures, la bactérie peut suivre deux voies différentes :

le co-métabolisme : un métabolisme durant lequel le polluant dégradé n’intervient pas

dans la croissance cellulaire, c’est-à-dire qu’il ne constitue pour le microorganisme ni

une source de carbone, ni une ressource énergétique. La dégradation du polluant est

conditionnée par la présence d'un deuxième substrat (co-substrat) permettant la

croissance de la bactérie (Christian et al., 1996).

la biodégradation : elle se distingue du co-métabolisme par le fait que le micro-

organisme utilise le polluant comme source de carbone et d'énergie assurant ainsi sa

croissance (Christian et al., 1996).

Par ailleurs, les hydrocarbures sont métabolisés via une réaction d’oxydation, la bactérie utilise

donc l’oxygène comme accepteur d’électron dans un milieu aérobie et des nitrates ou du fer

ferrique dans un milieu anaérobie. Toutefois, dans la plupart des cas, la dégradation se déroule

en milieu aérobie.

a. Cas des alcanes

La première étape dans la dégradation aérobie des alcanes est catalysée par des oxygénases .Il

existe deux principales voies d’oxydation : l’oxydation terminale et l’oxydation sub-terminale.

L’oxydation terminale :

L’oxydation terminale est le principal processus utilisé par la plupart des bactéries. L’alcane est

oxydé en alcool primaire, puis en aldéhyde et finalement en acide gras correspondant (Rehm,

2008). L’acide gras formé est oxydé par β-oxydation pour former par la suite de l’acétyl-CoA

qui sera à son tour métabolisé dans le cycle de Krebs. Il est à noter que lorsque l’acide gras se

forme, une deuxième oxydation peut se produire au niveau du groupement méthyl-ω pour

donner un diacide qui sera transformé à son tour en acétyl-CoA par β-oxydation, il s’agit ici

d’une oxydation bi-terminale (Rehm, 2008).

L’oxydation sub-terminale :

Cette réaction conduit à la formation d’alcool secondaire qui sera oxydé en cétone. La

dégradation du cétone par incorporation d’un atome d’oxygène conduit à la formation d’un

ester (réaction de type Bayer-Villiger) qui sera clivé par une estérase en alcool et acide gras

(Gonçalves et al., 2004). La réaction d’oxydation de l’alcane est montrée par la figure 1.

Synthèse bibliographique

10

Figure 1 : Voie de dégradation des alcanes par oxydation terminale, sub- et bi-terminale

(source : Beilen et al., 2003)

b. Cas des alcènes et des alcynes

La dégradation des alcènes et des alcynes suit la même voie que celle des alcanes. En effet,

le composé est oxydé en position terminale pour donner un alcool primaire ω-insaturé. Ce

dernier sera oxydé à son tour pour donner un acide. L’acide correspondant obtenu est

transformé en acétyl-CoA par β-oxydation. L’acétyl-CoA s’infiltre par la suite dans le cycle de

Krebs pour fournir de l’énergie à la bactérie (Soltani, 2004).

c. Cas des Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques

La bactérie oxyde initialement l’hydrocarbure aromatique par incorporation de deux atomes

d’oxygènes moléculaires pour former un diol (Gibson et al., 1975). Cette réaction est catalysée

par une enzyme, la dioxygénase. Par la suite le diol formé est converti en catéchol par une

déshydrogénase (Gibson et al., 1968). Le catéchol à son tour est clivé par oxydation en position

para ou ortho pour former d’un côté un alcool primaire et d’un autre côté un alcool secondaire.

Toutefois, les deux voies aboutissent à la formation d’acide qui sera métabolisé par β-oxydation

pour produire de l’acétyl-CoA. La figure 2 montre la dégradation du benzène en milieu aérobie.

Synthèse bibliographique

11

Figure 2 : Voies métaboliques de la dégradation du cycle aromatique: cas du benzène

(source: Gibson et al., 1975)

III. Pseudomonas putida

1. Position systématique

La classification suivante est basée sur celle de Migula en 1894 (Nelson et al, 2002) :

Règne: BACTERIA

Embranchement: PROTEOBACTERIA

Classe: GAMMA PROTEOBACTERIA

Ordre: PSEUDOMONADALES

Famille: PSEUDOMONADACEAE

Genre: Pseudomonas

Espèce: putida

Synthèse bibliographique

12

2. Description

Pseudomonas putida est une bactérie ubiquitaire mais elle est surtout rencontrée dans la zone

rizhosphérique de Pinus radiata (Mukerji et al., 2006). La plante et la bactérie effectuent une

symbiose durant laquelle la bactérie se développe à partir des nutriments fournis par les racines

et à son tour, la bactérie induit la croissance de la plante et la protège contre les agents

phytopathogènes (Lucas et al., 1989).

Pseudomonas putida est une bactérie en forme de bacille, non sporulante et Gram négatif. Sa

mobilité est assurée par des flagelles polaires. La bactérie se distingue par la production de

pigments jaune-vert fluorescents (pyoverdine ou pseudobactine) dans des conditions de carence

en fer. Du point de vue métabolique, la bactérie est classée de chimio-organotrophe en raison

de sa capacité à métaboliser une large gamme de composé organique pour sa croissance

(Golovleva et al., 1992). Parmi ces composés organiques, il y a les hydrocarbures aromatiques

et aliphatiques qui sont des polluants potentiellement toxiques pour l’homme (Mazzeo et

al.2010).

Du point de vue environnemental, Pseudomonas putida peut non seulement métaboliser les

polluants organiques mais elle a aussi une capacité à tolérer les contraintes environnementales.

3. Facteurs de croissance

Malgré le fait que Pseudomonas putida soit une bactérie peu exigeante (prototrophe), la bactérie

ne peut se développer correctement que lorsque les conditions de croissance sont remplies.

3.1 Besoins nutritifs

a. Source de carbone

Le carbone est l'un des éléments les plus abondants chez la bactérie. Pseudomonas putida est

capable de métaboliser un grand nombre de composés carbonés afin de lui fournir du carbone

et de l’énergie (Lemanceau P. et al., 1998).

b. Source d’azote

Les bactéries ont besoin de substances azotées pour synthétiser leurs protéines et acides

nucléiques. Pseudomonas putida n’est pas capable de capter l’azote atmosphérique, par contre

la bactérie peut assimiler l’azote sous forme organique ou minéral (Mazzeo et al.2010).

Synthèse bibliographique

13

c. Autres éléments nutritifs

Pseudomonas putida est une bactérie peu exigeante. La présence d’une source de carbone et

d’azote peut suffire à sa croissance (Larpent et Sanglier, 1992).

3.2 Facteurs physico-chimiques

a. Température

La température optimale de croissance de Pseudomonas putida est située entre 25 et 30°C.

Toutefois, la bactérie peut croître à des températures très basses allant jusqu’à 4°C, la bactérie

est donc qualifiée de bactérie psychrotrophe (Weidemeier et al., 1999).

b. Humidité et activité de l’eau

La disponibilité en eau affecte considérablement la croissance des bactéries. Pour sa croissance,

Pseudomonas putida a besoin d’une activité de l’eau égale à 0,97. En outre, une humidité

supérieur à 30% inhibe le développement de la bactérie (Weidemeier et al., 1999).

c. pH

Nombreux sont les microorganismes qui croissent dans une gamme de pH variant de 6,5 à 7,5

(Bouwer et Zehnder, 1993). Pseudomonas putida a une croissance optimale à un pH entre 7 et

7,6 ; la bactérie est classée parmi les neutrophiles.

MATERIELS ET METHODES

Matériels et méthodes

14

I. Matériels

I-1. Matériels d’expérimentation

Afin de réaliser cette étude, les matériels suivants ont été utilisés :

Sol : le sol doit être homogène et exempt de contamination pour ne pas fausser les

résultats.

Sciure de bois : la sciure de bois ne doit pas contenir des composés chimiques qui

pourraient inhiber la croissance de la bactérie. La sciure utilisée dans cette étude est

issue du Pinus radiata.

Huile moteur : l’huile de vidange pour moteur diesel issue du garage d’entretien

d’automobile de l’ASJA a été utilisée.

I-2. Matériels de laboratoire

Les matériels utilisés lors des analyses physico-chimiques et microbiologiques sont les

suivants :

Verreries : ballons, Erlenmeyer, tube à essai, bécher, boîte de Pétri, pipette graduée.

Petits matériels : spatule, couteau, anse d’inoculation, bec bunsen, balance, plaque

chauffante, micropipette.

Gros matériels : autoclave, hotte à flux laminaire, étuves, réfrigérateur.

I-3. Milieux de culture

Les milieux de culture utilisés sont les suivants :

Milieu sélectif : gélose au cétrimide

Milieu électif : PCA (Plat Count Agar), Hajna-Kligler, citrate de Simmons, Mannitol

Mobilite Nitrate, lysine-fer, EPT (Eau Peptonée Tamponnée)

II. Méthodes

II-1. Prélèvement de l’échantillon de sol

a. Principe

L’échantillonnage est réalisé dans les conditions d’asepsie, loin des sources de contamination

et des activités humaines.

Matériels et méthodes

15

b. Mode opératoire

Les prélèvements ont été réalisés sur trois pieds de Pinus différents, à 15 cm de profondeur afin

d’atteindre la zone racinaire. 10 g de sol sont prélevés dans des bocaux stériles, puis ramenés

au laboratoire pour être analysés. L’échantillonnage s’est déroulé dans la région Vakinankaratra

dans la commune urbaine d’Antsirabe II dans le fokotany de Morahita, dont les coordonnées

GPS (Global Positioning System) sont : 19°93’59’’ S ; 47°569 E.

Figure 3 : Géolocalisation du site d’échantillonnage (Source : Google map)

II-2. Isolement bactérien

L’isolement consiste à séparer les différents types de souche bactérienne contenus dans les

échantillons de sol.

II-2.1 Préparation de la suspension mère

Pour réaliser la suspension mère de la figure 4, 10g d’échantillon de sol à analyser est

mélangé avec 90 ml de NaCl 9°/OO pour obtenir un volume total de 100 ml.

Matériels et méthodes

16

II-2.2 Ensemencement

La gélose au cétrimide est le milieu sélectif utilisé pour l’isolement et l’identification des

espèces de germe de Pseudomonas (Public Health England, 2015).

La gélose en surfusion est coulée dans des boîtes de Pétri. Après solidification du milieu, 1 ml

de la suspension mère est ensemencé à la surface de la gélose. Enfin, les boîtes sont renversées

et incubées à 30°C pendant 48 heures.

II-2.3 Caractérisation des colonies isolées

Les colonies isolées sont caractérisées à l’œil nu afin de déterminer le nombre de type de colonie

dans l’échantillon de sol analysé. La caractérisation de chaque colonie se base sur les

caractéristiques suivantes : forme, taille, relief, contour, consistance, chromogenèse, etc...

Toutes les colonies qui présentent les mêmes caractéristiques font partie d’un seul type de

colonie. Le nombre de type de colonie déterminé équivaut au nombre de souche isolée à partir

de chaque échantillon de sol.

Figure 4 : Suspension mère avant ensemencement (source : auteur, 2017)

Matériels et méthodes

17

II-3. Purification

La purification a pour but de ré-isoler les différents types de colonie présent à la surface d’un

milieu afin d’obtenir des cultures pures. Une culture pure contient une population homogène

formée par des colonies identiques en tout point.

Chaque type de colonies trouvé est repiqué dans une boîte de Pétri muni préalablement de la

gélose au cétrimide. La méthode d’ensemencement est celle du quadrant. L’incubation se fait

pendant 24 heures à 30°C.

Le repiquage de chaque type de colonies est répété plusieurs fois jusqu’à l’obtention d’une

souche pure.

II-4. Conservation

La conservation des souches pures se fait sur gélose pente .Chaque souche pure est ensemencée

en strie serrée partant du fond vers le haut d’un tube vissé prémuni de la gélose au cétrimide

coulé en pente. La culture est incubée durant 24 heures à 30°C avant d’être conservée au

réfrigérateur à 4°C pendant 3 mois.

II-5. Identification

L’identification microbienne doit toujours être menée sur des souches pures. Elle aboutit à la

détermination du genre et de l’espèce auxquels appartient chaque souche microbienne.

L’identification des souches bactériennes se base sur les caractères morphologiques, culturaux,

physiologiques et biochimiques.

II-5.1 Etude des caractères morphologiques et culturaux

Dans cette étude, pour chaque souche bactérienne pure, un examen macroscopique des colonies

constitutives est effectué, puis un examen microscopique des cellules formant ces colonies.

II-5.1.1 Examen macroscopique

Chaque souche pure est observée à l’œil nu afin de déterminer leurs caractères culturaux

notamment : la taille, la forme, l’aspect de la surface, la coloration, la consistance et l’opacité.

La fluorescence est aussi observée à la lumière ultra-violette à une longueur d’onde de 310nm.

Matériels et méthodes

18

II-5.1.2 Examen microscopique

Un échantillon de chaque souche pure est observé sous microscope. L’observation est réalisée

à l’état frais et après coloration Gram.

II-5.1.3 Observation à l’état frais

a. Principe

L’examen à l’état frais est une observation pour déterminer les caractéristiques des cellules

vivantes : sa morphologie, son mode de regroupement et sa mobilité.

b. Mode opératoire

Une ansée de la souche microbienne est mélangée avec une goutte d’eau distillée préalablement

déposée sur une lame stérile et dégraissée. L’ensemble est ensuite recouvert d’une lamelle

stérile en évitant de faire des bulles d’air. L’observation s’effectue au fort grossissement

(objectif x100) afin de déterminer la morphologie, le mode de regroupement et la mobilité des

cellules.

II-5.1.4 Observation après coloration Gram

a. But

La coloration de Gram permet non seulement de confirmer la forme et le mode de groupement

des cellules mais aussi de déterminer le type de la bactérie selon la structure de sa paroi.

b. Principe

La coloration est basée surtout sur la capacité des bactéries à retenir la coloration du violet de

gentiane. Les bactéries Gram + résistent à la décoloration par l’alcool et retiennent donc leur

coloration violette. Par contre, les bactéries à Gram – laissent pénétrer l’alcool qui va lessiver

le complexe violet de gentiane-lugol. Elles sont ensuite colorées en rose après coloration à la

fuschine de Ziehl.

c. Mode opératoire

La méthode commence tout d’abord par la préparation d’un frottis. Pour se faire, un

prélèvement issu d’une suspension de la souche bactérienne à étudier est étalé en couche mince

sur une lame. Après séchage à l’air libre et fixation par flambage, le frottis ainsi préparé est

coloré par une solution de violet de Gentiane pendant une minute puis rincé avec de l’eau du

robinet. Pendant une minute, le frottis est ensuite recouverte par du Lugol qui va servir de

Matériels et méthodes

19

mordant. Par la suite, pour la différenciation des germes, le frottis est décoloré par de l’alcool

à 70° puis rincer avec de l’eau du robinet. Le frottis est ensuite recoloré avec du fuschine de

Ziehl 10 % pendant une minute. Enfin, le frottis est lavé avec de l’eau du robinet et séché avec

du papier joseph avant d’être observé sous microscope à l’objectif x100 dans de l’huile

d’immerssion. Suivant leur coloration, les bactéries sont classées en :

- Bactérie à Gram + : de coloration violette

- Bactérie à Gram - : de coloration rose

II-5.2 Etude des caractères physiologiques

II-5.2.1 Détermination du type respiratoire

a. Principe

Ce test consiste à étudier le comportement de la bactérie vis-à-vis de l’oxygène de l’air. Selon

leur condition de croissance, les bactéries sont classées parmi les suivantes :

- Anaérobies strictes : qui ne croissent qu’en l’absence d’oxygène.

- Aérobies strictes : qui exigent de l’oxygène pour son développement.

- Aéro-anaérobies facultatives : qui croissent aussi bien en présence qu’en absence

d’oxygène, mais préférant l’aérobiose.

- Anaéro-aérobies facultatives : qui croissent aussi bien en présence qu’en absence

d’oxygène, mais préférant l’anaérobiose.

- Microaérophiles : les bactéries qui ont besoin d’une faible quantité d’oxygène pour se

développer.

b. Mode opératoire

Le milieu de culture utilisé pour déterminer le mode respiratoire des bactéries est le Plate Count

Agar (PCA).

Le milieu de culture préalablement préparé est coulé dans des tubes vissés, puis refroidi.

L’ensemencement se fait en profondeur par une seule piqûre centrale. Après 24 heures

d’incubation à 30°C, cinq cas peuvent se présenter :

- Développement en profondeur des bactéries caractérisé par une turbidité dans la partie

inférieure de la ligne d’ensemencement : il s’agit de bactéries anaérobies strictes.

- Prolifération des bactéries dans la zone superficielle du milieu de culture : ces bactéries

sont classées parmi les aérobies strictes.

Matériels et méthodes

20

- Développement sur toute la ligne d’ensemencement avec une abondance près de la zone

superficielle : ce sont les bactéries aéro-anaérobies facultatives.

- Croissance des bactéries sur toute la hauteur du milieu de culture avec une abondance

dans la zone plus profonde : il s’agit de bactéries anaéro-aérobies facultatives.

- Développement dans la zone intermédiaire anaérobie-aérobie : ce sont des bactéries

microaérophiles.

II-5.2.2 Recherche de l’oxydase

Le test consiste à mettre en évidence la capacité que possède la bactérie à oxyder un réactif

incolore (la N-diméthyl-paraphénylène diamine) en un dérivé violet brunâtre. Ce test est réalisé

en déposant sur une lame un petit disque de papier Whattman n°1 imprégné du réactif. Une

ansé de la souche à étudier est ensuite déposée sur le disque, une coloration violet brunâtre

apparait immédiatement si la bactérie en question possède de l’oxydase dans son système

enzymatique. Dans le cas contraire, le disque reste incolore, la bactérie ne possède donc pas de

l’oxydase (Public Health England, 2015).

II-5.3 Etude des caractères biochimiques

L’étude des caractères biochimiques consiste à déterminer le métabolisme des bactéries.

L’étude est réalisée sur des galeries biochimiques comme : le milieu Hajna-kligler, le milieu

Citrate de Simmons, le milieu Mannitol-Mobilité-Nitrate, le milieu Lysine-fer.

II-5.3.1 Test sur milieu HAJNA-KLIGLER

a. Principe

Le test sur HAJNA-KLIGLER consiste à détecter la fermentation du glucose et/ou du lactose

par la bactérie. Le milieu est de couleur rouge et est composé de deux parties : le culot formé

par le glucose et la pente par du lactose. La fermentation du glucose et du lactose provoque

l’alcalinisation du milieu qui se traduit par un virage au jaune. Si la bactérie fermente le glucose,

le culot vire au jaune. Tandis que la fermentation du lactose vire la pente au jaune. Le virage de

couleur est indiqué par un indicateur de pH qui est le rouge de phénol. Durant la fermentation,

la bactérie produit du gaz qui se traduit par l’apparition de bulles ou de poche de gaz dans le

milieu.

Par ailleurs, la présence du thiosulfate réductase dans le système enzymatique de la bactérie

est justifiée par la formation d’un précipité noir dans le milieu, ce précipité noir étant du sulfure

d’hydrogène (H2S).

Matériels et méthodes

21

b. Mode opératoire

Après coulage du milieu, l’ensemencement se fait par une piqûre centrale dans le culot suivie

d’une striation suivant la pente. L’incubation se fait à 30°C pendant 24 heures.

II-5.3.2 Test sur milieu CITRATE DE SIMMONS

a. Principe

Ce test est utilisé pour déterminer si la bactérie est capable d’utiliser le citrate comme seul

source de carbone provocant ainsi l’alcalinisation du milieu. Le milieu étant de couleur verte

vire donc au bleu, cela est dû à un indicateur de pH qui est le bleu de Bromothymol.

b. Mode opératoire

L’ensemencement se fait par une strie centrale à 1 cm du fond vers l’ouverture. La lecture est

réalisée après 24 heures d’incubation à 30°C.

II-5.3.3 Test sur milieu MANNITOL-MOBILITE-NITRATE

a. Principe

Ce test consiste tout d’abord à déterminer la fermentation du mannitol par la bactérie : si la

réaction s’avère positive, le milieu de culture étant de couleur rouge vire au jaune. Ce virage de

couleur est marqué par un indicateur de pH qui est le rouge de phénol.

La mobilité des bactéries est observée par la turbidité du milieu, les germes non mobiles restent

sur la ligne d’ensemencement.

La réduction du nitrate par le nitrate réductase est mise en évidence par la présence de nitrites

formés qui donne une coloration rose en présence du réactif de GRIESS.

b. Mode opératoire

Après coulage du milieu de culture, l’ensemencement se fait par une piqûre centrale s’arrêtant

à 1 cm du fond du tube. L’incubation se fait pendant 24 heures à 30 °C. La turbidité du milieu

et le virage de la coloration du milieu sont observés en premier. La détermination de la réduction

du nitrate s’en suit par un ajout de quelques gouttes de réactif de GREISS.

II-5.3.4 Test sur milieu LYSINE-FER

a. Principe

Le test sur LYSINE-FER consiste à détecter la présence de la lysine décarboxylase (LDC), la

lysine désaminase (LDA) et le thiosulfate réductase. Ce test permet aussi de déterminer si la

Matériels et méthodes

22

bactérie utilise le glucose comme source de carbone. La présence de la lysine décarboxylase est

marquée par une coloration violette du milieu et une pente de couleur rouge veineux indique la

présence de la lysine désaminase. Le noircissement du culot affirme la présence du thiosulfate

réductase.

b. Mode opératoire

L’ensemencement se fait par une piqûre centrale dans le culot suivie par des stries serrées

suivant la pente. L’incubation se fait toujours à 30°C pendant 24 heures. Le germe est glucose

positif si le milieu de coloration violette vire au jaune. Le noircissement du milieu est issu de

la production de sulfure d’hydrogène.

II-5.3.5 Auxanogramme du carbone

a. Principe

L’identification des souches de levure par la méthode d’auxanogramme se fait par la

vérification de la différence de métabolisme des sucres simples. Le milieu de culture utilisé

comporte l’eau distillée stérile additionnée d’un sucre précis. Les sucres utilisés sont le

tréhalose, le saccharose et le xylose (Latour et al., 1997).

b. Mode opératoire

Après coulage du milieu liquide, la souche à identifier est ensemencée à l’aide d’une anse

chargée d’inoculum. La préparation est incubée à 30°C pendant 48 à 72h avant de vérifier le

pH de chaque souche pure de Pseudomonas avec le pH-mètre. L’utilisation du sucre dans le

milieu par la souche entraîne une acidification du milieu vérifiée par la diminution du pH du

milieu.

II-5.3.6 Test à la gélatine

a. Principe

Ce test consiste à déterminer la présence de la gélatinase dans le système enzymatique de la

bactérie. Sous l’action de cette enzyme, la gélatine est hydrolysée et se liquéfie. Le milieu de

culture utilisé est composé de gélose nutritive et de gélatine d’origine bovine à 5% (Nelson,

2002).

b. Mode opératoire

Le milieu de culture est coulé dans des tubes puis refroidi dans un endroit plus froid de la

paillasse. L’ensemencement se fait par une piqûre centrale, les tubes sont ensuite incubés à

Matériels et méthodes

23

30°C pendant 48 heures. Après incubation, les tubes sont placés à 4°C avant la lecture des

résultats. En effet, la réfrigération (+4°C) permet d’avoir la consistance solide de la gélatine

(absence de gélatinase). Dans le cas contraire (présence de gélatinase) la gélatine perd sa

structure et reste liquide à 4°C.

III. Essai de traitement biologique

L’essai biologique consiste à utiliser une souche bactérienne pour dépolluer un sol contaminé

aux hydrocarbures. L’expérimentation s’étale sur 3 mois avec des analyses microbiologiques

et physico-chimiques qui s’effectuent toutes les 3 semaines.

III-1. Mise en place du dispositif expérimental

a. Principe

Cette expérience consiste à favoriser la capacité des bactéries à dégrader les hydrocarbures

présents dans le sol. Tous les paramètres favorisant cette activité bactérienne sont donc

rapportés dans le dispositif expérimental. La bactérie utilisée est préalablement mise en culture

afin d’augmenter le nombre de biomasse. En occurrence, la méthode utilisée durant cette

expérience est l’association entre la bio-stimulation et la bio-augmentation, une méthode qui

s’avère être efficace selon El Fantroussi et Agathos en 2005.

b. Mode opératoire

L’essai biologique est réalisé dans un bac en verre étanche de 15 cm de hauteur, de 30 cm de

longueur et de 10 cm de largeur recouvert d’un papier en aluminium perforé. Le verre est utilisé

pour éviter l’interaction avec le milieu extérieur et aussi pour faciliter la maîtrise des différents

paramètres. Le papier en aluminium perforé servira par contre de couvercle pour le dispositif

tout en assurant l’apport en oxygène dans le milieu. Le bac est préalablement stérilisé à 121°C

à 1,5 bar pendant 20 mn avant la réalisation de l’essai biologique.

La mise en place du dispositif expérimental se déroule en 3 étapes :

III-1.1 La préculture

Pseudomonas putida est ensemencé dans un milieu de culture liquide. Trois ansées de la souche

bactérienne sont ensemencées dans 100ml de bouillon nutritif. La préparation est incubée à

30°C pendant 24 heures. Cette préculture permet non seulement de revivifier les bactéries mais

aussi de faciliter son inoculation dans le sol.

Matériels et méthodes

24

III-1.2 La préparation du sol

La masse du sol utilisée est de 500g (poids sec). Afin qu’il n’y ait pas de compétition entre les

microorganismes déjà présents dans le sol et les bactéries à inoculer, le sol est tout d’abord

autoclavé à 121°C à 1.5 bars pendant 2 heures. Après autoclavage, le sol est séché dans une

étuve à 103°C pendant 24 h puis placé dans un dessiccateur jusqu’à refroidissement. Ce

traitement vise à réduire de façon significative la teneur en eau (humidité du sol qui doit être

comprise entre 20% à 27% de matière fraîche). Le polluant organique utilisé étant l’huile de

vidange, 9 g de cette huile sont versés dans le sol puis mélangés de façon à ce que la répartition

soit bien homogène. 2 g de levure de bière sont autoclavés puis broyés et ensuite mélangés dans

le sol, ce qui constitue la source d’azote. Enfin, pour aérer le sol et éviter qu’il s’entasse, 150 g

de sciure de bois de Pinus (représentant 30% du poids du sol) sont mélangés à l’ensemble

(RAJAONA, 2015).

III-1.3 L’inoculation

Après avoir préparé le sol, 100ml de préculture sont inoculés dans le sol préalablement préparé.

La concentration de l’inoculum doit être comprise entre 2.106 UFC/g à 2.108 UFC/g, ce qui

correspond à la concentration bactérienne de la rhizosphère. Après l’inoculation, 20 ml d’eau

distillée sont versées hebdomadairement dans le sol (Bidaud, 1998).

Le dispositif expérimental ainsi obtenu est placé à l’abri de la lumière à la température ambiante

à 23°C. Le sol est remué hebdomadairement afin d’assurer le contact du substrat avec la

biomasse ainsi que l’apport en oxygène dans le sol.

III-2. Méthodes analytiques

III-2.1 Dosages des hydrocarbures résiduels dans le sol

Extraction au Soxhlet: Méthode EPA (Environmental Protection Agency) 3540C

a. Principe

Cette étape consiste à utiliser du solvant (hexane) pour extraire l’hydrocarbure présent dans le

sol. L’extrait obtenu est ensuite concentré puis pesé, la valeur obtenue indique ainsi la masse

d’hydrocarbure résiduel présent dans l’échantillon de sol analysé.

Quelle que soit la procédure employée, l’analyse des hydrocarbures dans le sol comprend trois

étapes incontournables :

Matériels et méthodes

25

- La préparation de l'échantillon de sol qui consiste à sécher le sol à l’étuve

- L’extraction des hydrocarbures contenus dans l’échantillon, dont l’objectif est de

transférer les composés de la matrice solide vers la matrice liquide qui est le solvant.

- Le dosage de l’extrait obtenu

b. Mode opératoire

L’échantillonnage du sol à analyser suit la méthode des quartiers. 10g de sol sont alors prélevés

puis séchés dans une étuve à 103°C pendant 24 heures ; à la sortie de l’étuve, le sol est placé

dans un dessiccateur jusqu’à refroidissement. Après la préparation du sol s’enchaine

l’extraction de l’hydrocarbure.

L’extraction à reflux s’effectue dans un Soxhlet en utilisant de l’hexane comme solvant. Pour

ce faire, 5 g de sol préalablement séché sont placés dans une cartouche d’extraction puis

immergés avec 150 ml d’hexane. L’extraction dure 16 heures et le produit d’évaporation est

recueilli dans un ballon de 250 ml contenant des pierres ponce. Le ballon est ensuite placé dans

un rotavapor pour évaporer l’hexane. Les résidus de solvant et d’eau présents dans le ballon

sont enlevés par un étuvage à 103°C pendant 15 min, suivi d’un refroidissement dans un

dessiccateur. Le ballon est pesé afin d’en déduire la quantité d’hydrocarbure extrait.

La formule suivante permet d’avoir la concentration en hydrocarbure résiduel ( Hcr) :

Hcr = 𝑚1−𝑚2

𝑚3 (g/g)

m1 : masse du ballon et l’extrait (g)

m2 : masse du ballon vide (g)

m3 : masse de l’échantillon de sol (g)

Taux de dégradation (T)

Le taux de dégradation correspond à la quantité d’hydrocarbure dégradée par rapport à la

quantité d’hydrocarbure initiale. Il est donné par la formule suivante :

T = [𝐻𝑐𝑖]−[𝐻𝑐𝑓]

[𝐻𝑐𝑖] x100 (%)

[Hci] : concentration en hydrocarbure initiale (g/g)

[Hcf] : concentration en hydrocarbure finale (g/g)

Matériels et méthodes

26

III-2.2 Suivi de l’évolution de la population bactérienne

L’accroissement de la quantité de biomasse est évaluée durant toute l’expérience afin d’en

déduire sa vitesse de croissance.

III-2.2.1 Préparation de la suspension mère

Pour préparer la suspension mère, 10g d’échantillon de sol à analyser sont mélangés avec une

solution d’EPT jusqu’à un volume final de 100 ml. L’ensemble est ensuite mélangé.

III-2.2.2 Dilutions

Une dilution en cascade est effectuée à partir de la suspension mère. 1 ml de la suspension mère

est introduit dans un tube stérile, puis additionné de 9 ml d'eau distillée, il s’agit de la dilution

10-1. 1ml de ce mélange est ensuite versé dans un autre tube contenant 9 ml de diluant : cette

solution correspond à la dilution 10-2 et ainsi de suite jusqu'à la dilution finale.

III-2.2.3 Culture bactérienne

Le milieu de culture utilisé est la gélose au cétrimide. Après avoir coulé le milieu de culture

dans des boîtes de Pétri, 1ml de chaque dilution est ensemencé dans chacune des boîtes.

L’incubation se fait pendant 24 h à 30°C. Après incubation, les colonies formées sont comptées.

III-2.2.4 Mode de calcul pour le cas du dénombrement bactérien (norme ISO 7218)

Le nombre total des colonies présentes dans l’unité d’échantillonnage est donné par la formule

suivante :

∑ c 1 VSM

N = ——————— x — x ——

(n1 + 0,1 n2) x d V VPR

Légende :

∑ c= nombre total de colonies sur les boites retenues.

n1= nombre de boites retenues à la dilution la plus faible.

n2= nombre de boites utilisées à la seconde dilution retenues.

d= facteur de dilution à partir duquel les premiers comptages sont réalisés.

Matériels et méthodes

27

V = volume de prise d'essai inoculé en ml.

VSM = volume en ml de la suspension mère.

VPR = volume de produit (ml) ou masse du produit (g) ou surface du produit (cm2) ayant

constitué la suspension mère.

III-2.3 Traitement des résultats en régime discontinu

III-2.3.1 Vitesse de dégradation du substrat Rs

Rs correspond à la quantité d’hydrocarbure dégradé par la biomasse en unité de temps.

Pour un système en batch, elle est donnée par la formule suivante :

dS : variation de la concentration en substrat (g/g)

dt : variation de temps en jour (j)

III-2.3.2 Vitesse spécifique de dégradation du substrat QS

Qs correspond à la vitesse de dégradation du substrat par unité de biomasse. Partant de

l’équation de Rs, Qs s’exprime comme suit :

Qs = 1

𝑋𝑅𝑠

Qs = 1

𝑋

|𝑑𝑠|

𝑑𝑡

X : concentration en biomasse (UFC/g)

ds : concentration en substrat (g/g)

dt : variation de temps en jour (j)

III-2.3.3 Vitesse de production de biomasse RX

Rx correspond à la quantité de biomasse formée par unité de temps. Elle s’exprime comme

suit :

Rs= |𝑑𝑆|

𝑑𝑡 (g/g/j)

Matériels et méthodes

28

Rx = 𝑑𝑋

𝑑𝑡 (UFC/g/j)

dx : variation de la concentration en biomasse (UFC/g)

dt : variation du temps en jour (j)

III-2.3.4 Vitesse spécifique de croissance µx

Elle correspond à la vitesse de production de biomasse rapportée à l'unité de biomasse.

µx = 𝑅𝑥

𝑥 (h-1)

Taux de croissance

Le taux de croissance correspond à la vitesse de croissance maximale µmax.

III-2.3.5 Temps de génération G

C’est le temps de doublement de la population bactérienne :

G = 𝑙𝑛2

µ𝑚𝑎𝑥 (h)

µmax : vitesse de croissance maximale (h-1)

µx = 1

𝑋

𝑑𝑋

𝑑𝑡 (h-1)

RESULTATS ET

INTERPRETATIONS

Résultats et interprétations

29

1. Isolement

La culture de la suspension mère sur gélose au cétrimide à partir de l’échantillon de sol, a permis

d’obtenir 6 types de colonie différents. La figure 5 affiche les colonies obtenues issues de

l’échantillon de sol n°1.

Figure 5 : Colonies obtenues sur gélose au cétrimide après incubation

2. Purification et conservation

Après l’isolement des six types de souches, celles-ci sont purifiées puis conservées. Chaque

souche pure est codée comme suit : M-SO suivie du numéro de souche correspondante. M et

SO représentent respectivement l’initial du nom du manipulateur et celui de l’échantillon

étudié.

3. Identification des souches

3.1 Caractères culturaux

Après observation macroscopique, les caractères culturaux des souches bactériennes sont

résumés dans le tableau 2.

Résultats et interprétations

30

Tableau 2 : Caractères culturaux des souches bactériennes isolées

M : initial de l’auteur SO : sol Chiffre : numéro de l’échantillon Source : auteur, 2017

D’après ces résultats, 66% des souches ont une similarité entre elles. Notamment les

souches M-SO5 et M-SO2 possèdent les mêmes caractères culturaux et il en est de même pour

les souches M-SO1 et M-SO6. Selon l’aspect de la surface, seule la souche M-SO4 présente

une surface rugueuse et elle est la seule à avoir une petite taille. La souche M-SO3 possède des

points communs avec la souche M-SO2 à l’exception de sa consistance qui est crémeuse et son

contour irrégulier.

3.2 Caractères morphologiques

L’examen à l’état frais a permis d’observer sous microscope les cellules constitutives

des 6 souches pures isolées. Cette observation s’est basée sur la forme de la cellule, le mode de

regroupement et la mobilité. La coloration Gram par contre a permis de déterminer la nature de

la paroi des cellules .Le tableau 3 résume les caractères morphologiques et les résultats de la

coloration Gram des souches isolées.

Caractères M-SO1 M-SO2 M-SO3 M-SO4 M-SO5 M-SO6

Taille Grande Grande Grande Petite Grande Grande

Couleur Bleu-vert Vert

fluorescent

Vert

fluorescent Blanche

Vert

fluorescent Bleu-vert

Odeur florale Inodore Inodore Inodore Inodore florale

Aspect de

la surface Lisse Lisse Lisse Rugueuse Lisse Lisse

Aspect du

contour Régulier Régulier Irrégulier Régulier Régulier Régulier

Forme du

relief Bombée

Semi-

bombée

Semi-

bombée Plate

Semi-

bombée Bombée

Opacité Translucide Translucide Translucide Transparente Translucide Translucide

Consistance Pâteuse Pâteuse Crémeuse Crémeuse Pâteuse Pâteuse

Résultats et interprétations

31

Tableau 3 : Caractères morphologiques des souches bactériennes isolées

Souches Forme de

la cellule

Mode de

regroupement Mobilité

Mode de

déplacement Gram

M-SO1 Bacille Chaînette Mobile Frétillement Négatif

M-SO2 Bacille Amas Mobile Frétillement Négatif

M-SO3 Bacille Amas Mobile Frétillement Négatif

M-SO4 Bacille isolé Immobile Négatif

M-SO5 Bacille Amas Mobile Frétillement Négatif

M-SO6 Bacille Chaînette Mobile Frétillement Négatif

Référence Bacille Amas Mobile Frétillement Négatif

Source : auteur, 2017

D’après ces résultats, les colonies des 6 souches pures bactériennes présentent des

similarités mais aussi des différences dont :

Le mode de regroupement : 2 souches sont regroupées en chaînette, 3 souches en amas

et seule la souche M-SO4 à un regroupement isolé.

La mobilité : toutes les souches sont mobiles mise à part la souche M-SO4.

La coloration Gram : toutes les souches bactériennes sont à Gram négatif.

3.3 Caractères physiologiques

L’étude des caractères physiologiques font partie des paramètres fondamentaux pour

identifier les souches bactériennes. Cette étude consiste à déterminer le type respiratoire et les

enzymes impliquées dans la respiration de la souche. Le tableau 4 résume les caractères

physiologiques de toutes les souches isolées.

Tableau 4 : Caractères physiologiques des souches bactériennes isolées

Souches Oxydase Type respiratoire

M-SO1 Positive Aérobie stricte

M-SO2 Positive Aérobie stricte

M-SO3 Positive Aérobie stricte

Résultats et interprétations

32

Souches Oxydase Type respiratoire

M-SO4 Positive Aéro-anaérobie facultative

M-SO5 Positive Aérobie stricte

M-SO6 Positive Aérobie stricte

Référence Positive Aérobie stricte

Source : auteur, 2017

Ces résultats montrent que toutes les souches isolées possèdent de l’oxydase, ce qui va

intervenir dans les différents processus du métabolisme bactérien. Du point de vue respiratoire,

5 souches sont aérobies strictes et une seule souche (M-SO4) est aéro-anaérobie facultative.

3.4 Caractères biochimiques

Après l’étude des caractères macroscopiques, microscopiques et physiologiques s’ensuivent les

caractères biochimiques. Cette dernière étape permet de confirmer l’identité de la souche.

Plusieurs tests sont alors réalisés sur la souche afin de déterminer les voies métaboliques .Le

tableau 5 résume les caractères biochimiques de toutes les souches bactériennes isolées.

Tableau 5 : Caractères biochimiques des souches bactériennes isolées

Sou

ches

HAJNA-

KLIGLER

MANNITOL

-MOBILITE

LYSINE-

FER

CIT

RA

TE

DE

MM

ON

S

TE

ST

A L

A G

EL

AT

INE

AUXANOGRAMME

Glu

Lac

H2S

CO

2

MA

NN

ITO

L

MO

BIL

ITE

LD

C

LD

A

SA

CC

HA

RO

SE

XY

LO

SE

TR

EH

AL

OS

E

M-SO1 - - - - + + - + + + + + -

M-SO2 - - - - - + - + + - + - +

M-SO3 - - - - - + - + + + + + +

M-SO4 - - - + - - - + + + + + -

M-SO5 - - - - - + - + + - + - +

M-SO6 - - - - + + - + + + + + -

Référence - - - - - + - + + + + + +

LDC : Lysine DéCarboxylase LDA : Lysine DésAminase Source : auteur, 2017

Résultats et interprétations

33

D’après le tableau 5 :

La culture des souches bactériennes sur milieu Hajna-Kligler permet de dire que : toutes

les souches ne sont pas capables de fermenter ni le glucose ni le lactose.

La culture des souches sur le milieu Mannitol a permis de déterminer que les souches

sont capables d’utiliser le mannitol comme source de carbone. Cela a permis aussi de

confirmer que toutes les souches mise à part M-SO4 sont des souches mobiles.

Les résultats sur le milieu Lysine fer a montré que toutes les souches ne possèdent pas

de lysine décarboxylase (LDC). Par contre la lysine désaminase (LDA) est produite par

toutes les souches isolées.

Pour la culture sur Citrate de Simmons, toutes les souches utilisent le citrate comme

source de carbone.

3.5 Classification des souches

Le rapport des résultats de l’étude des caractères culturaux, morphologiques,

physiologiques et biochimiques aboutit à l’identification des 6 souches pures bactériennes

isolées. Le tableau 6 donne l’identité respective des souches bactériennes.

Tableau 6 : Identité des souches pures bactériennes isolées

SOUCHES NOM DE LA SOUCHE

M-SO1

Pseudomonas aeruginosa M-SO6

M-SO2 Pseudomonas putida

M-SO5

M-SO4 Pseudomonas fluorescens

M-SO3 Pseudomonas chlororaphis

Source : Ben et al., 1999

4. Essai biologique

La souche M-SO2, identifiée comme Pseudomonas putida a fait l’objet de l’expérimentation et

l’huile de vidange constitue la source d’hydrocarbure.

4.1 Teneurs en hydrocarbures résiduels

L’extraction au Soxhlet a permis de déterminer la quantité en hydrocarbure totale dans le sol et

d’en déduire ainsi la concentration en hydrocarbure résiduel après inoculation de la souche M-

Résultats et interprétations

34

SO2. Le tableau 7 affiche la variation de la concentration en hydrocarbure résiduel durant les 3

mois d’expérimentation.

Tableau 7 : Variation de la concentration en hydrocarbures résiduels

Jours de

prélèvement 1 21 42 63 84

Concentrations

en

hydrocarbure

(mg/kg)

18000 17000 14000 9800 4500

Source : auteur, 2017

Cette concentration varie de 18000mg/kg à 4500mg/kg, ces valeurs montrent que la

bioremédiation a bien eu lieu.

La figure 6 montre l’évolution du taux de dégradation de l’hydrocarbure par

Pseudomonas putida. L’efficacité de la bioremédiation au cours de notre étude est confirmée

par l’augmentation du pourcentage de dégradation de 0% à 30% en fin de culture.

Source : auteur, 2017

Figure 6 : Evolution du taux de dégradation durant l’expérimentation

Le taux de dégradation est faible durant les premières semaines (0 à 20 jours) car une période

d’adaptation au milieu de culture est indispensable avant la croissance. C’est seulement à partir

du 21ème jour que la dégradation devient très importante. Elle ralentie par contre à partir du

63ème jour, la variation du pH ou l’épuisement de la source d’azote pourrait être la cause.

Résultats et interprétations

35

4.2 Evolution de la population bactérienne

L’augmentation de la population bactérienne signifie une consommation du substrat qui

est l’hydrocarbure. La figure 7 démontre la proportionnalité de la croissance bactérienne par

rapport à la dégradation de l’hydrocarbure.

Source : auteur, 2017

Figure 7 : Evolution de la concentration en biomasse en fonction de la concentration en

hydrocarbure lors de la culture sur un sol pollué de Pseudomonas putida

Les premières semaines correspondent à la phase d’accélération durant laquelle une

partie de la masse microbienne se multiplie. Par la suite, la concentration en biomasse augmente

considérablement, c’est la phase exponentielle. La population bactérienne est passée de 4.107

UFC/g à 3.1013 UFC/g avec un temps de génération de 2,16h.

4.3 Traitement des résultats obtenus

L’évolution de la concentration en hydrocarbure et en biomasse permet d’en déduire la

vitesse de consommation du substrat et la vitesse de production de biomasse.

Le tableau n°8 et la figure n°8 représentent les vitesses spécifiques correspondant à la formation

de biomasse et à la dégradation du substrat.

Résultats et interprétations

36

Tableau 8 : Vitesses spécifiques correspondant à la formation de biomasse et à la

dégradation du substrat

Temps (jours) Biomasse Substrat (hydrocarbure)

RX (UFC/g/j) µX (h-1) RS (g/g/j) QS (g/UFC/j)

21 5.106 2,2.10-3 4,76.10-5 1,19.10-12

42 1,64.108 0,048 1,42.10-4 1,02.10-12

63 8,73.109 0,101 2.10-4 5,55.10-14

84 1,45.1012 0,323 2,52.10-4 1,34.10-15

Source : auteur, 2017

Source : auteur, 2017

Figure 8 : Courbes des vitesses spécifiques correspondant à la biomasse μ, au substrat QS lors

de la culture en batch de Pseudomonas putida sur sol pollué par l’huile de vidange

D’après cette courbe, la vitesse de dégradation du substrat augmente

proportionnellement avec la vitesse de production de biomasse. Ce qui signifie que pendant les

premiers jours d’expérimentation, la capacité de dégradation des bactéries n’est pas

satisfaisante puisque la quantité de biomasse est encore très faible. Cependant,

l’expérimentation s’avère être effective durant sa phase exponentielle puisque la bactérie est

capable de dégrader jusqu’à 2,52.10-4 g d’hydrocarbure par g de sol par jour.

DISCUSSIONS

Discussions

37

Discussions

Les résultats de l’isolement et de l’identification bactérienne ont permis de déduire

la présence de 4 espèces de Pseudomonas dans la zone rhizosphérique de Pinus radiata, à

savoir : Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis

et Peudomonas putida, cette dernière a fait l’objet de cette étude. L’identification

bactérienne s’est basée surtout sur les caractères culturaux et biochimiques de la souche. En

effet, la souche Pseudomonas putida se différencie des autres souches par sa capacité à

produire des pigments verts fluorescents dans un milieu gélosé. Concernant les caractères

biochimiques, la souche en question est la seule qui ne liquéfie pas la gélatine.

A travers ces résultats, la souche étudiée présente une similarité avec celle qui a été

isolée par Sutter en 1968, ce qui permettrait de confirmer l’identité de la souche. Cependant,

l’identification de la souche ne se limite pas à l’étude des caractères biochimiques et

culturaux, mais une identification moléculaire de la souche est indispensable vue la

multiplicité du nombre de biovar que possède l’espèce bactérienne (Lemanceau et al.,

2000).

Pour nos expérimentations, la souche Pseudomonas putida a été choisie en raison de sa

capacité à dégrader un large panel de composé carboné y compris les composés à forte

potentialité toxique. Selon Ferro et ses collaborateurs en 2005, la souche forme un biofilm

pour résister aux conditions environnementales les plus hostiles.

Leahy et Cowell (1991) ont démontré que les microorganismes sont les principaux

acteurs dans la dégradation des hydrocarbures pétroliers dans les écosystèmes contaminés.

Les bactéries sont capables d’utiliser le pétrole brut comme seule source de carbone et

d'énergie dans les sols contaminés (Jirasripongpun, 2002).

Nombreux sont les espèces de Pseudomonas qui sont capables de bioremédier les sols

pollués (Annexe 5). D’après les recherches effectuées par Rahman et ses collaborateurs en

2002, la présence d’une activité bioremédiatrice chez Pseudomonas putida dans un sol

pollué par les hydrocarbures a été notée. Cette observation est en accord avec celle de

Soltani en 2004, qui explique les différentes voies métaboliques de dégradation des

hydrocarbures pour fournir à la souche de l’énergie et du carbone.

Discussions

38

En ce qui concerne l’expérimentation menée sur cette souche, la bioremédiation

s’avère être efficace. Toutefois, durant les premières semaines d’expérimentation, le taux

de dégradation n’a pas été considérable (5,5%) vue que la souche a dû s’adapter à son nouvel

environnement et substrat. Il serait donc préférable d’effectuer une préculture dans un

milieu contenant de l’hydrocarbure avant l’inoculation.

C’est à partir du deuxième mois que l’activité microbienne se montre satisfaisante, la

concentration en hydrocarbure est passée de 18000 à 4500 mg/kg. D’après ces valeurs, la

souche est donc capable de dégrader jusqu’à 0,25 mg d’hydrocarbure par jour, ce qui n’est

vraiment pas négligeable comparé aux résultats obtenus par Bidaud en 1998 avec 0,3 mg

d’hydrocarbure par jour. Cette vitesse de dégradation est proportionnelle à la quantité de

biomasse présente dans le sol, cette valeur augmente donc avec l’accroissement de la

population bactérienne d’après les résultats obtenus. La seul contrainte est que les

hydrocarbures pétroliers contribuent à limiter la capacité productive des souches

bactériennes (Wyszkowskwa et al., 1987).

Les travaux effectués par Leahy et Cowell (1994) sur Pseudomonas putida, ont affiché

un taux de dégradation allant jusqu’à 85,8% en 1 mois. Pour ce qui est de notre cas, le taux

de dégradation n’a atteint que les 30% en 3 mois et la concentration en hydrocarbure vers

la fin de l’expérimentation est encore au-dessus de la valeur seuil qui est de 100 mg/kg de

matière sèche selon la norme américaine de l’EPA. Cette valeur seuil varie d’un pays à un

autre et en fonction de la nature chimique de l’hydrocarbure (annexe 3). Ce taux semble

être causé non seulement par l’adaptation de la souche à son nouveau substrat mais aussi à

la complexité de la composition chimique et le poids moléculaire élevé de l’huile moteur.

Selon Catilina et ses collaborateurs en 2002, les huiles moteurs sont des composés visqueux,

non volatiles contenant des alcanes aliphatiques et des hydrocarbures aromatiques à un ou

plusieurs cycles qui sont difficilement dégradés par les bactéries.

Selon Ghazali et ses collaborateurs, en 2004, le taux de dégradation est plus satisfaisant

avec l’utilisation d’un consortium parce que chaque microorganisme possède différentes

enzymes catabolisantes. L’association de Pseudomonas putida et Pseudomonas fluorescens

semble être plus efficace que le traitement par Pseudomonas putida seul (Ferro et al., 2005).

La combinaison de la phytoremédiation avec la bioremédiation a aussi montré son

efficacité, cependant, cette combinaison peut s’avérer être une méthode très lente (Ghazali

et al., 2004).

Discussions

39

D’autres facteurs affectent aussi la dégradation des hydrocarbures, à savoir l’humidité

du sol et l’apport en oxygène par l’intermédiaire d’un ajout de texturant (Rahman et al.,

2002). D’après les résultats obtenus par Bidaud en 1998, l’ajout de sciure de bois dans le

sol favorise l’apport en oxygène faisant office d’accepteur d’électron durant les réactions

métaboliques. La température et l’humidité jouent également un rôle dans la croissance des

microorganismes, dans les traitements in-situ, la bioremédiation semble être plus lente

durant les saisons froides (Thwaites et al., 2007).

Les sols contaminés sont généralement pauvres en éléments nutritifs dus à la diminution

considérable du nombre de bactéries fertilisant le sol. L’apport en élément azoté est donc

requis pour assurer non seulement la croissance des bactéries mais peut aussi servir

d’accepteur d’électron durant les réactions cataboliques.

L’usage de bio-surfactants dans les méthodes biologiques est assez récent. Toutefois, la

présence de ces surfactants contribue à l’augmentation de la solubilité et à la

biodisponibilité des composés organiques hydrophobes. De ce fait, la biodégradation

semble être moins lente et plus efficace. Nombreux sont les microorganismes qui sont

capables de les produire, parmi eux Pseudomonas putida.

La bioremédiation semble être une méthode bien efficace et écologique dans la

dépollution des sols contaminés par les hydrocarbures.

CONCLUSION ET

PERSPECTIVES

Conclusion et perspectives

40

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Notre étude s’est portée sur la bioremédiation des sols pollués par des hydrocarbures

par Pseudomonas putida. Ce travail nous a permis de nous familiariser avec les matériels de

laboratoire, acquérir et maîtriser les techniques de manipulations microbiologiques et physico-

chimiques notamment celles relatives à l’isolement, l’identification et les traitements

biologiques réalisés sur la souche étudiée.

L’étude a également permis de mettre en évidence la présence dans un sol, d’une souche

capable de dépolluer un sol contaminé par les hydrocarbures pétroliers. Les résultats obtenus

reflètent la capacité de Pseudomonas putida à diminuer jusqu’à 30% en une durée de 3 mois,

la concentration en hydrocarbure dans un sol pollué. En dépit de la complexité de la

composition chimique de l’huile moteur, la souche s’avère être capable de dégrader ce polluant

et résister à son pouvoir toxique.

L’efficacité de la bioremédiation dépend non seulement de l’agent biologique utilisé

mais aussi des caractères physico-chimiques du sol à traiter. L’apport en élément azoté,

l’humidité et l’aération du sol affectent considérablement cette activité bactérienne. Le système

biologique utilisé implique aussi l’efficacité du traitement, l’association bioaugmentation et

biostimulation s’est montrée satisfaisante.

Cependant, un certain nombre de contraintes sont à considérer lors de l'utilisation

de ces procédés biologiques. En premier lieu, la durée des traitements reste encore assez longue

face à la quantité de polluant déversée dans le sol. D’autre part, la bioremédiation s’arrête à une

certaine valeur seuil en raison de la non biodisponibilité du substrat par la souche. Ainsi, dans

l’avenir, nous envisageons de poursuivre l’étude par :

- La confirmation de l’identification des souches étudiées par des méthodes moléculaires,

à savoir le séquençage de l’ARNr 16S et la quantification de la taille du génome

(Weisburg et al, 1991) ;

- L’amélioration des méthodes d’extraction et de quantification des hydrocarbures dans

le sol ;

- L’amélioration de la capacité de dégradation des souches en étudiant les autres

paramètres tels que la température, l’ajout d’un agent biologique produisant du

biosurfactant (solubilisant) ;

- L’étude du mécanisme de dégradation utilisé par la bactérie ;

- L’utilisation d’un consortium dans la dépollution des sols contaminés

REFERENCES

BIBLIOGRAPHIQUES

Références bibliographiques

41

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Ballerini D., Vandecasteele J. P. La restauration par voie microbiologique des sols

contaminés par les polluants organiques. Biotechnologie : Edition Tech et Doc. 1999 ; 865p.

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hydroxylase systems in the environment. Oil Gas Sci. Technol. Rev. IFP. 2003, 58 : 427-

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ANNEXES

Annexes

i

Annexe 1 : Milieux de culture

Gélose au cétrimide :

Composition pour 1000ml :

Peptone……………………………5g

Extrait de viande…………………..1g

Chlorure de sodium………………..5g

Extrait de levure…………………...2g

Cétrimide…………………………..0.3g

Agar………………………………..13g

pH………………………………….7,2

Hajna-Kligler :

Composition pour 1000 ml:

Peptone .......................................... 15 g

Extrait de viande ............................. 3 g

Extrait de levure ..............................3 g

Peptone pepsique de viande .......... .5 g

Glucose............................................ 1 g

Lactose............................................ 10 g

Rouge de phénol........................... ..25 mg

Chlorure de sodium...................... ...5 g

Sulfate ferreux................................. 0,2 g

Thiosulfate de sodium..................... 0,3 g

Agar-agar......................................... 11 g

pH……………..…………….……..7,5

Préparation : 53.5 g par litre. Stérilisation classique et conditionnement en tubes avec une

pente et un culot.

Citrate Simmons

Composition pour 1000 ml:

Citrate de sodium………………………… 1,0 g

Bleu de bromothymol……………………. 0,08 g

Annexes

ii

Chlorure de sodium……………………… 5,0 g

Sulfate de magnésium…………………… 0,2 g

Hydrogéno-phosphate de potassium……... 1,0 g

Dihydrogéno-phosphate d’ammonium…... 1,0 g

Agar……………………………………... 15,0 g

pH ……………………………………….. 7,1

Préparation : 21 g par litre. Stérilisation classique par autoclavage. Conditionnement en tubes

inclinés.

Lysine-fer

Composition pour 1000 ml:

Peptone de gélatine……………………… 5,0 g

Extrait de levure………………………... 3,0 g

L-lysine………………………………….. 10.0 g

Glucose………………………………….. 1,0 g

Citrate de fer III ammoniacal…………… 0,5 g

Bromocrésol pourpre……………………. 20,0 mg

Thiosulfate de sodium………………….. 40,0 mg

Agar……………………………………... 13,5 g

pH ………………………………………...6,7

Préparation : 33 g par litre, stérilisation classique et conditionnement en tubes

inclinés comme dans le cas du milieu de Hajna-Kligler.

Mannitol-Mobilité-Nitrate

Composition pour 1000 ml :

Hydrolysat trypsique de caséine:..................10,0 g

Mannitol:......................................................7,5 g

Rouge de phénol:..........................................0,4 mg

Nitrate de potassium:....................................1,0 g

Agar:.............................................................3,5 g

pH ……………………………………………7,6

Annexes

iii

Préparation : 22 g par litre. Stérilisation classique et conditionnement en tubes.

Auxanogramme du carbone

Glucose à étudier………………………………………5 g

Eau distillée …………………………………………..160 ml

Annexe 2 : Produits chimiques et réactifs

Réactif : réactif de Greiss

Solvant : hexane

Annexe 3 : Valeurs seuils de la concentration en hydrocarbure selon la loi canadienne

Hydrocarbures Aromatiques

Polycycliques

Valeurs seuils

en mg/kg de sol (matière sèche)

Acénaphtène 10

Acénaphtylène 10

Anthracène 10

Benzo anthracène 1

Benzo pyrène 1

Chrysène 1

Fluoranthène 10

Fluorène 10

Méthyl-3 cholanthrène 1

Naphtalène 5

Méthyl-1 naphtalène 1

Méthyl-2 naphtalène 1

Diméthyl-1,3 naphtalène 1

Triméthyl-2,3,5 naphtalène 1

Phénanthrène 5

Pyrène 10

Annexes

iv

Annexe 4 : Constituants du pétrole selon les domaines d’ébullition (Bocard, 2006)

Annexe 5 : Espèces de Pseudomonas

Domaine d’ébullition (C°) Nombre d’atomes de carbone Produits

<30 C1-C4 Gaz naturel, méthane, éthane,

propane, butane

30-200 C4-C12 Ether de pétrole (C5-C6),

ligroïne, essence

200-300 C12-C15 Kérosène, mazout

300-400 C15-C25 Gazole, diesel, huile lubrifiante,

cires

>400 >C25 Résidu de distillation, asphalte,

goudron

Espèces Habitat Pathogénicité Utilisation Référence

P. fluorescens Sol, eau Pathogène

opportuniste

-Bioremédiation sol

-PGPR (Plant Growth-

Promoting Rhizobacteria)

Weller, 1988

P. chlororaphis Sol, eau Non pathogène Antifongique Woeng, 2000

P. aeruginosa Sol, eau Pathogène

opportuniste Bioremédiation sol Madsen, 1991

P. stutzeri Sol, eau Pathogène

opportuniste Bioremédiation sol

Ewa et al.,

2012

P. striata SOL, eau Non pathogène Biofertilisant Egde, 2008

Name : RAKOTOARISOA

First name : Mialy Tsiory

E-mail : mialytsioryrakotoarisoa@gmail.com

Title : Bioremediation of soils polluted by hydrocarbons by Pseudomonas putida

ABSTRACT

Petroleum hydrocarbons are ubiquitous compounds, potentially toxic to both humans and

the environment. Therefore, remediation of soils contaminated with these compounds has

become a necessity.

The objective of this work is to isolate from a healthy soil Pseudomonas putida and to evaluate

the degradation efficiency of the hydrocarbons of this strain.

Samples of healthy soil are analyzed microbiologically for the isolation of the strain

Pseudomonas putida. The isolated strain is then inoculated into soil contaminated with drain

oil. The kinetics of bacterial growth and the amount of degraded hydrocarbon are monitored

throughout the process.

The results showed a 30% decrease in the hydrocarbon concentration in 3 months of biological

treatment. The Pseudomonas putida strain was capable of degrading up to 0.2 mg of

hydrocarbon per gram of soil per day. The amount of degraded hydrocarbon increases

proportionally with the bacterial population. The bacterial concentration increased from 4.107

to 3.1013 CFU / g towards the end of the experiment. This increased growth of the bacterial

culture corresponds to a growth rate of 0,32h-1 and a generation time of 2,16 h.

Thus, the Pseudomonas putida strain isolated from a healthy soil is effectively capable of

depolluting soil contaminated by petroleum hydrocarbons.

Key words: petroleum hydrocarbons, bioremediation, Pseudomonas putida, soil,

motor oil

Advisors : Professor ANDRIANARISOA Blandine

Doctor RAHARIJAONA Tovo Robin

Nom : RAKOTOARISOA

Prénoms : Mialy Tsiory

E-mail : mialytsioryrakotoarisoa@gmail.com

Titre : Bioremédiation des sols pollués par des hydrocarbures par Pseudomonas putida

RESUME

Les hydrocarbures pétroliers sont des composés ubiquitaires, potentiellement toxiques

aussi bien pour l’homme que pour l‘environnement. C’est pourquoi la dépollution des sols

contaminés par ces composés est devenue une nécessité.

L’objectif de ce travail est d’isoler à partir d’un sol Pseudomonas putida et d’évaluer l’efficacité

de dégradation des hydrocarbures par cette souche.

Des échantillons de sol sont analysés microbiologiquement pour l’isolement de la souche

Pseudomonas putida. La souche isolée est ensuite inoculée dans un sol contaminé par de l’huile

de vidange. La cinétique de croissance bactérienne ainsi que la quantité d’hydrocarbure dégradé

sont suivies tout au long du processus.

Les résultats ont montré une diminution de 30% de la concentration en hydrocarbure en 3 mois

de traitement biologique. La souche Pseudomonas putida a été capable de dégrader jusqu’à 0,2

mg d’hydrocarbure par gramme de sol par jour. La quantité d’hydrocarbure dégradée augmente

proportionnellement avec la population bactérienne. La concentration bactérienne est passée de

4.107 à 3.1013 UFC /g à la fin de l’expérimentation. Cette croissance accrue de la culture

bactérienne correspond à un taux de croissance de 0,32h-1 et un temps de génération de 2,16

heures.

Ainsi, la souche Pseudomonas putida isolée à partir d’un sol sain est effectivement capable de

dépolluer un sol contaminé par les hydrocarbures pétroliers.

Mots clés : hydrocarbures pétroliers, bioremédiation, Pseudomonas putida, sol, huile

de vidange

Encadreurs : Professeur ANDRIANARISOA Blandine

Docteur RAHARIJAONA Tovo Robin