9
INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE 36: 377-385, 2015 Abstract. I� �-�, �- I� �-�, �- �y �m� f�h�g�f �m�y �y c� ��h� (PBC), m�c �ch�gy �f u�f�m�c�qu�� ch �m�g�hy c�u� w�h qu�u�-�m�- �f- f� �gh� m�� ��c�m�y (UPLC/Q-TOF MS) w� u�c�m�m�� m�cu� m���� u� f�m � w�h PBC � h�hy c�. W�h�c��� f�-m�k�h��� u�f �h� w�h PBC. Data were processed by Bruker ProfileAnalysis metabonomic �f�w�m� SIMCA-P �f�w�, wh�ch u�z�c� c�m�y� (PCA) � c� m�f � w�h PBC � h�hy c�. I�, 18 u�y m� �k� w� f�u�h�f 11 �f �h� u�y m��k� w� ��h� w�h PBC, wh�h�f �h�m�g 7 m�k� w�w�h� PBC g�ucompared to the control group. We also identified 20 blood- �m�k�h� w�h PBC �h�f 9 �f �h� m�k� w� h�gh�h� PBC g�u�, wh�h�f �h�m�g 11 m�k� w�w�hw��h PBC c�m�h� c�. Am�g �h�m�k�, �h�f �c�c� w�h �h�g���f PBC, wh��h�f c�, �uch �y� c�u�y�y� c�, �c� w�h �h�g���f PBC. Iconclusion, the findings of the present study suggest that the c��cu�g �f �c� c�ff��y � w�h PBC. Introduction P� �m�y �y c��h� (PBC) � ch�c �-�c�f�c autoimmune disorder with an unidentified etiology. It mainly �ff�c� m���-�g� w�m� (m�-�-f�m�, 1:9) categorized by the infiltration of lymphocytes in portal tracts, �h�uc�f �m��- � m�um-�z�h�c ducts, and the progressive scarring that initially leads to fibrosis �, �u��y, � c��h�-�g� h��c f�u�f 10-20 y� w�h�u� ��m� (1,2). P�uh��c�h� PBC, �cu�y �ym�m�c PBC, ��g� c�u�g�c �m�- m��h�c�u�ch�m�c�, h�g�c�y�h�c�f �u�um (3,4). A�h�ugh h��h�g�c� ch�g� ��h� ‘g�’ f�h�g�f PBC, �y �, �fu� c�y �c�u�h���c� w�h �h���y �f �m�g ���y �. T �, �m�k� f�h�g�f PBC, �uch �-m��ch��y (AMA) h���u�. AMA, wh�ch �cw��h �h�y�u�hy�g� E2 �u�u�, � c�mm��y �cc�g�c� h��m�k f�h�g�f PBC, �c� AMA �����x�m�y 90% �f � w�h PBC (5). H�w�, �g �h���y u�, u� 15% �f � w�h PBC h��� f�u� AMA-�g� (5). Fu� �h�m�, �h�ugh �m� AMA-�g� f�uc�y (ANA) c�m� PBC, u��k� AMA, wh�ch �� u�� f�g�, PBC-���cANA c���� w�h �h�y � m�y �hu� �� m��k� f���g�f �g� (5). B�, �h�ugh �h�uc� c�m�, �c�u�g S�100, ��my�- cy��c �uk�m�w� c�m�f �h�ucc�m�x � (g�210 �uc� 62), �c� w�h ANA, Urine and serum metabolomic profiling reveals that bile acids and carnitine may be potential biomarkers of primary biliary cirrhosis YING-MEI TANG 1* , JIA-PING WANG 2* , WEI-MIN BAO 3 , JIN-HUI YANG 1 , LIN-KUN MA 2 , JING YANG 1 , HUI CHEN 1 , YING XU 1 , LI-HONG YANG 1 , WEN LI 1 , YAN-PING ZHU 1 JI-BIN CHENG 1 1 Department of Gastroenterology, The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Yu��� R�ch C� f� L� D�; 2 The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University; 3 D��m�f G� Su�g�y, Yu��� P�c� F� P�'� H�, Ku�m�g, Yu���, P.R. ChR�c�� Oc� 23, 2014; Acc�� M�y 13, 2015 DOI: 10.3892/�jmm.2015.2233 Correspondence to: D� W�-M�� B�, D�m�f GSu�g�y, Yu��� P�c� F� P�' � H�, 157 J�B� R�, Ku�m�g, Yu��� 650032, P.R. ChE-m��: yk[email protected]�m D� J�-Hu� Y �g, D�m�f G�gy, Th� S�cAff�� H�f Ku�m�g M�c� U�y, Yu��� R�ch C�� f� L� D�, 374 D�m� R�, Ku�m�g, Yu��650101, P.R. Ch�E-m��: �ym�@gm�.c�m * C��u�qu��y Key words: m��m�c �f�g, �m�y �y c��h�, �m�k�, �c�, c

Urine and serum metabolomic profiling reveals that bile

  • Upload
    others

  • View
    5

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Urine and serum metabolomic profiling reveals that bile

INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE 36: 377-385, 2015

Abstract. I� ����� �� ������� ���-��������, �������� ��� �����-I� ����� �� ������� ���-��������, �������� ��� �����-���� ���������y ����m����� f�� �h� ���g����� �f ���m��y ������y c���h���� (PBC), m�������c ��ch����gy �f u�������f��m��c� ��qu�� ch��m���g���hy c�u���� w��h qu���u����-��m�-�f-f��gh� m��� ���c���m���y (UPLC/Q-TOF MS) w�� u��� �� c�m���� �m��� m���cu�� m���������� �� ����� ��� u���� f��m �������� w��h PBC ��� h����hy c�������. W� �h�� �c������ f�� ���-m��k��� �� �h� ����� ��� u���� �f �h� �������� w��h PBC. Data were processed by Bruker ProfileAnalysis metabonomic ��f�w��� ��� �m������ �� SIMCA-P ��f�w���, wh�ch u����z�� ����c���� c�m������ ����y��� (PCA) �� c����� m����� �f �������� w��h PBC ��� h����hy c�������. I� �����, 18 u�����y m��k��� w��� f�u�� ��� �h� ������ �f 11 �f �h��� u�����y m��k��� w��� �������� �� �h� �������� w��h PBC, wh����� �h� ������ �f �h� ��m�����g 7 m��k��� w��� ��w�� �� �h� PBC g��u� compared to the control group. We also identified 20 blood-����� ���m��k��� �� �h� �������� w��h PBC ��� �h� ������ �f 9 �f �h��� m��k��� w��� h�gh�� �� �h� PBC g��u�, wh����� �h� ������ �f �h� ��m�����g 11 m��k��� w��� ��w�� �� �h� �������� w��h PBC c�m����� �� �h� c�������. Am��g �h��� ���m��k���,

�h� ������ �f ���� �c��� ��c������ w��h �h� ���g������� �f PBC, wh��� �h� ������ �f c���������, �uch �� �������y� c�������� ��� �u�y�y� c��������, ��c������ w��h �h� ���g������� �f PBC. I� conclusion, the findings of the present study suggest that the c��cu�����g ������ �f ���� �c��� ��� c�������� ��� ��ff���������y ������� �� �������� w��h PBC.

Introduction

P��m��y ������y c���h���� (PBC) �� � ch����c �����-���c�f�c autoimmune disorder with an unidentified etiology. It mainly �ff�c�� m�����-�g�� w�m�� (m���-��-f�m��� �����, 1:9) ��� �� categorized by the infiltration of lymphocytes in portal tracts, �h� �����uc���� �f �m���- ��� m���um-��z�� �����h�����c ���� ducts, and the progressive scarring that initially leads to fibrosis ���, �����u���y, �� c���h���� ��� ���-���g� h�����c f���u�� ���� � ������ �f 10-20 y���� w��h�u� �����m��� (1,2). P�����u� ���� h��� ����c���� �h�� PBC, �����cu����y ��ym���m���c PBC, �� �� ���g�� c��������� � ���� ������� �u� �� ���g�����c �m�����-m���� �h�� ��c�u�� ���ch�m�c�� �����, h������g�c�� ����y��� ��� �h� ����c���� �f �u������������ �� ���um (3,4). A��h�ugh h�������h���g�c�� ch��g�� ����� �� �h� ‘g��� ��������’ f�� �h� ���g����� �f PBC, � ����� �����y �� �� ��������, ����fu� ��� c����y ���c��u�� �h�� �� ����c����� w��h �h� ����������y �f ��m����g ����� ��� ����������y �� ��������������. T� ����, ���m��k��� f�� �h� ���g����� �f PBC, �uch �� ����-m���ch������� �������y (AMA) h��� ���� ����u����. AMA, wh�ch ���c�� w��h �h� �y�u���� ��hy���g����� E2 �u�u���, �� c�mm���y �cc����� �� � ������g�c�� h���m��k f�� �h� ���g����� �f PBC, ���c� AMA ������� �� �����x�m����y 90% �f �������� w��h PBC (5). H�w����, ��������g �� �h� ����y u���, u� �� 15% �f �������� w��h PBC h��� ���� f�u�� �� �� AMA-��g����� (5). Fu��h��m���, ���h�ugh ��m� AMA-��g����� �������� ��� �������� f�� �����uc���� �������y (ANA) c�m������� �� PBC, u���k� AMA, wh�ch �� u��� f�� ���g�����, PBC-����c����� ANA c��������� w��h �h� ������� �������y ��� m�y �hu� ����� �� � m��k�� f�� ���� ���g����� ������� �f ���g����� (5). B������, ���h�ugh �h� �uc���� c�m�������, ��c�u���g S�100, ���my���-cy��c ��uk�m�� �������� ��� �w� c�m������� �f �h� �uc���� ���� c�m���x ������� (g�210 ��� �uc�������� 62), ���c� w��h ANA,

Urine and serum metabolomic profiling reveals that bile acids and carnitine may be potential

biomarkers of primary biliary cirrhosisYING-MEI TANG1*, JIA-PING WANG2*, WEI-MIN BAO3, JIN-HUI YANG1, LIN-KUN MA2, JING YANG1,

HUI CHEN1, YING XU1, LI-HONG YANG1, WEN LI1, YAN-PING ZHU1 ��� JI-BIN CHENG1

1Department of Gastroenterology, The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Yu���� R�����ch C����� f�� L���� D�������; 2The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University;

3D�����m��� �f G������ Su�g��y, Yu���� P�����c��� F���� P�����'� H�������, Ku�m��g, Yu����, P.R. Ch���

R�c����� Oc����� 23, 2014; Acc����� M�y 13, 2015

DOI: 10.3892/�jmm.2015.2233

Correspondence to: D� W��-M�� B��, D�����m��� �f G������ Su�g��y, Yu���� P�����c��� F���� P�����'� H�������, 157 J��B� R���, Ku�m��g, Yu���� 650032, P.R. Ch���E-m���: yk�[email protected]�m

D� J��-Hu� Y��g, D�����m��� �f G�������������gy, Th� S�c��� Aff������� H������� �f Ku�m��g M���c�� U��������y, Yu���� R�����ch C����� f�� L���� D�������, 374 D���m��� R���, Ku�m��g, Yu���� 650101, P.R. Ch���E-m���: �ym������@gm���.c�m

*C������u��� �qu���y

Key words: m�������m�c ���f����g, ���m��y ������y c���h����, ���m��k���, ���� �c���, c��������

Page 2: Urine and serum metabolomic profiling reveals that bile

TANG et al: METABOLOMIC PROFILING REVEALS MARKERS OF PBC378

�� h�� ���� ������u��y ��m���������, ����-��100 �������y �� ��� � ������ ���g�����c m��k�� f�� Ch����� �������� w��h PBC c�m����� �� ����-g�210 �������y, wh�ch w�� ���y ����c��� �� 34.3% �f Ch����� �������� w��h PBC (6).

Th���f���, �� �� ����� ��c�����y �� ���c���� ��h�� ����� ���m��k��� f�� PBC. M�������m�c� �� �h� ��u�y �f � ���g� �um��� �f ��w m���cu��� w��gh� m����������, ��c�u���g �m��� �c���, h��m���� ��� �ug���, ��� h�� ������ �� � ������ ���� f�� ���c������g ����� ���m��k��� f�� P��k�����'� ������� (7), �������� c��c�� (8), �y�� 2 �������� (9), �cu�� my�c������ ��f��c���� (10) ��� ���-�c��m���� (11). M�������m�c� h�� ���� �������� ��m� �m������� ����gh� ���� �h� ���h�g������ �f hum�� ���-��c�h���c f���y ����� �������, ���-��c�h���c ������h�������� ��� PBC (12-16). I� �h�� ��u�y, w� u����z�� � m�������m�c� ��ch��qu� ����� �� u�������f��m��c� ��qu�� ch��m���g���hy c�u���� w��h qu���u����-��m�-�f-f��gh� m��� ���c���m���y (UPLC/Q-TOF MS) �� �� ��m �� ���c���� ����� m��k��� f�� PBC ��� ��uc����� �h��� ���h���g�c�� ����� �� �h� ���g������� �f PBC.

Subjects and methods

Patients. A ����� �f 32 �������� w��h � c����c�� ���/�� h����-logical diagnosis of PBC at the Second Affiliated Hospital �f Ku�m��g M���c�� U��������y, Ku�m��g, Ch��� ���w��� M�y 2010 ��� N���m��� 2011 w��� �������� �� �h�� ��u�y. Th� �x����m����� �����c�� w�� ��������h��, �cc�����g �� �h� ��h�c�� gu�������� �f �h� H�����k� D�c�������� ��� w�� �������� �y the Human Ethics Committee of the Affiliated Hospital of Ku�m��g M���c�� U��������y. W������ ��f��m�� c������ w�� �������� f��m ��ch �����c����� ����� �� ������m���. Th� ���g����� �f PBC w�� ����� �� �h� f����w��g c�������, �� ������u��y ���c����� (17): �) ��c������ ������ �f ���ch�m�c�� markers reflecting intrahepatic cholestasis for >6 months; ii) an ���m�� ������y �y���m, �� �h�w� �y u������u�� �� ch����g��g-���hy; ���) �������� w��� ���um AMA- �� AMA-M2 ��������; ��) �������� w��� ���um AMA/AMA-M2-��g�����, �u� � ����� �����y �������� m������� �� ������ ���������� �� ���������� ��f��mm�����. Th� ����������� �xc�u���� c������� ��c�u��� ��h�� ����� ��������, �uch �� ��c�h���c ����� �������, ����� h��������, ��ug-���uc�� ����� ��������, g�����c ��������, c��c��, ���g���cy, ��c�����g �u�j�c��, �� w��� �� �u�j�c�� wh��� ����� �� u���� ���c�m�� ��m���� w��� k��� �� ���m ��m�����u�� f�� >30 min. All 32 healthy control subjects (HCs) were confirmed to have normal liver function and fit the same exclusion criteria �� �h� �������� w��h PBC. I�f��m�� c������ w�� �������� f��m ��� �u�j�c��. Th� ��u�y �����c�� c��f��m�� �� �h� ��h�c�� gu���-����� �f �h� 2008 D�c�������� �f H�����k� ��� w�� �������� �y �h� ������ch ��h�c� c�mm����� �f �u� ������u����.

Sample collection and metabolomics analysis. I� ��� �u�j�c��, ����� (3 m�) w�� ���w� �f��� � 12-h f���, ���um w�� �������� by centrifugation of the blood samples at 3,000 rpm at 4˚C for 10 m��, ��� u���� ���gu���� ��m���� (2 m�) w��� c����c��� �� �h� ��m� ��y �� �h� ����� ��m����. A�� �h� ��m���� w��� ������ at -80˚C until subsequent analyses. The urine samples were �h�w�� �� ���m ��m�����u�� ��� c�����fug�� �� 10,000 x g at 4˚C for 20 min. Subsequently, 150 µl of the supernatant were diluted with purified water to 1 ml and filtered through a 0.22-µl filter. A total of 10 µl of sample was then taken. The

blood samples were thawed at room temperature, and 180 µl of the sample were then added to acetonitrile (720 µl) followed by ��g���u� �h�k��g f�� 30 ��c ��� c�����fug����� �� 15,000 x g �� 4˚C for 10 min. The supernatant was stored at 4˚C for analysis w��h�� 48 h.

Chromatography. Ch��m���g���h�c ���������� w�� ���f��m�� on a 15 cmx2.1 mm Acquity™ 1.8 µm C18 column (Agilent T�ch����g���, S���� C����, CA, USA) u���g �� Acqu��y™ u���� ���f��m��c� ��qu�� ch��m���g���hy �y���m (U���m��� 3000-Bruker mXis; Dionex, Sunnyvale, CA, USA). A 10-µl ���qu�� �f ��ch ��m��� w�� ��j�c��� ���� �h� c��um�. Th� column was maintained at 4˚C and eluted with 0.1% formic �c�� (A) ��� �c���������� (B) �� � ������ g������� (0-60 m��, 5-100% �f B). Th� f����w ���� w�� �� 0.3 m�/m��.

Mass spectrometry. M��� ���c���m���y w�� ���f��m�� �� � W����� Q-TOF m�c�� M��� S��c���m���� (W����� MS T�ch����g���, M��ch�����, UK) �� ���h �h� ESI+ ��� ESI- ��� m����. Th� f����w��g ����m����� w��� u���: ���u��z����� gas, 6 l/min at 200˚C; cone, 50 l/h; source gas temperature, 100˚C; capillary voltage, 4,500 V; cone voltage, 35 V; Q-TOF m�c�� MS �cqu������� ����, 0.5 ��c w��h � 0.1 ��c �����-�c�� ����y. Th� �c�� ���g� w�� f��m 50 �� 1,000 m/z. D��� w��� c����c��� �� c������� m���. A�� ����y��� w��� �cqu���� u���g �h� ��ck ����y �� ���u�� �ccu��cy ��� ������uc������y; ����um f��m��� w�� u��� �� �h� ��ck m��� �� � c��c��������� �f 1 mm��/� ��� � flow rate of 10 µl/min, deriving an [M + H]+ ��� �� 4,500 V �� ESI+ mode, and an [M - H]- ��� �� 3,200 V �� ESI- m���. Th� ��ck ����y f��qu��cy w�� ��� �� 20 ��c. S���um f��m��� w�� u��� �� �� �������� c������ �� �h�� ����y.

Data analysis. The raw data were analyzed using ProfileAnalysis ��f�w��� (U���m��� 3000-B�uk�� mX��; D����x) �h� �����-���� ��m� (��) ��� m/z ���� ���� f�� ��ch ���k w��� ����c��� u���g ��f�w��� f��m Um����c� AB (Um�å, Sw����). Th� ��� ����������� f�� ��ch ���k ����c��� w��� �h�� ���m���z�� w��h�� ��ch ��m��� �� �h� �um �f �h� ���k ����������� �� �h�� ��m���, �� ������u��y ���c����� (18). Th� ���u����g ���m���z�� ���k ����������� w��� �h�� mu�������� �y 10,000. Th� ���� w��� �h�� �x������ ��� ����yz�� �y ����c���� c�m������� ����y��� (PCA) ��� ������� ����� �qu����-���c��m����� ����y��� (PLS-DA) u���g SIMCA-P ��f�w��� (Um����c� AB). Th� ��������c�� ����y��� w�� ���f��m�� u���g SPSS ������� 10.0 ��f�w��� (SPSS, I�c., Ch�c�g�, IL, USA). A P-���u� <0.05 w�� c��������� �� ����c��� a statistically significant difference.

Results

Characteristics of the patients. Th� ch���c�������c� �f 32 PBC �������� ��� �h� 32 HC� w��� ����yz��. Du� �� h�m��y���, ��� ����� ��m��� f��m ��ch g��u� w�� �xc�u��� f�� fu��h�� ������-m���. Th� m��� �g�� �f �h� �������� w��h PBC ��� �h� HC� w��� 52.6±11.95 y���� (���g�, 30-76 y����) ��� 52.1±14.6 y���� (���g�, 27-76 y����), ��� �h� f�m���-m��� ������ w��� 27/5 and 25/7, respectively. There were no significant differences ���w��� �h� �������� w��h PBC ��� �h� HC� �� ���m� �f �g�, parity and gender (P>0.05). Sixteen cases from the PBC group w��� ��w�y ���g����� w��h PBC, ��� �h� m��� ��m� c�u��� �f �h� ������� w�� 25.4±45.3 m���h� (���g�, 4 ��y� �� 17 y����).

Page 3: Urine and serum metabolomic profiling reveals that bile

INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE 36: 377-385, 2015 379

Th� ����� fu�c���� Ch���-Pugh �c��� w�� g���� A �� 23 c����, g���� B �� 8 c���� ��� g���� C �� 1 c���. Th� g���u��� ��� �����-�m����� ������ ��� ��������� T���� I. Th� ����c���� ������ �f �u������������ �� �h� ���� f��m �������� w��h PBC ��� �h�w� �� F�g. 1. I� �����, 15 �������� w��� AMA-M2-��������, 8 w��� ����-g�210-��������, 7 w��� ����-��100-��������, 10 w��� AMA-M2-, ����-g�210- ��� ����-��100-��g�����, 1 w�� AMA-M2-, ����-g�210- ��� ����-��100-��������, 7 w��� AMA-M2- ��� ����-g�210-��������, 1 w�� ����-g�210- ��� ����-��100-��������, ��� 2 w��� AMA-M2- ��� ����-��100-��������.

Urine and serum profiles in patients with PBC. F����w��g UPLC/Q-TOF ����y���, �h� ��������� ��m� ��� m/z ���� ���� f�� ��ch ���k w��� ����c���. A��h�ugh PCA �� �� �xc������ ���� f�� ���� ���uc���� ��� h��c� g���h�c�� ������y, �� ���� ��� ���� �����f �� �h� �������m��� �f � ���g�����c m���� �� �����c� �h� ������c� �� �����c� �f �������. T� ������� �h�� ���u�, PLS-DA

and the co-efficient of correlation analysis were used for marker ����c���� ��� ������f�c�����, �� ������u��y ���c����� (19). F�g�. 2-4 �h�w �h� �c��� ����� �f PCA ��� PLS-DA �f �h� u���� m�������m� f��m �h� �������� w��h PBC ��� �h� HC� �c����� �y ESI+ ��� ESI-. Th� �����c���� ���� ��� �����u���� ��� ���y g��� u���� �h� u���� ESI m��� �� ������gu��h �h� PBC g��u� f��m �h� c������ g��u� u���g �h� PLS-DA m����. S��c� �������� w��h PBC w��� �h�w� �� �� �������u��� �� ��ff����� ��g����, w� ������� �h�m ���� 2 �u�g��u��.

F�g�. 5 ��� 6 �h�w �h� �c��� ����� �f PCA ��� PLS-DA �f �h� ���um m�������m� f��m �������� w��h PBC ��� �h� HC� �c����� �y ESI+ ��� ESI-. I� ���h ��� �c�����g m����, �h� m������g ����m����� ������ �� T���� II ����c��� �h�� �h� m����� �f PBC h�� ���� �ucc���fu��y ��������h�� ��� �h� �������� w��h PBC c�u�� �� �����y ������gu��h�� �h��ugh �h��� m�����. Potential biomarkers were identified in the urine (Table III) ��� ���um (T���� IV) f��m PBC ��������. Th� ������ �f 11 �f the 18 potential biomarkers identified were increased in the u���� �f �h� �������� w��h PBC, wh��� �h� ������ �f 7 �f �h��� 18 ��������� ���m��k��� w��� ��c������ �� �h� u���� �f �h� �������� w��h PBC c�m����� �� �h� HC�. S�m�����y, �h� ������ of 9 of the 20 potential biomarkers identified in the serum of �h� �������� w��h PBC w��� ��c������, wh��� �h� ������ �f 11 �f �h��� 20 ��������� ���m��k��� w��� ��c������ �� �h� ���um �f �h� �������� w��h PBC c�m����� �� �h� HC�. Am��g �h��� ���m��k���, �h� ������ �f ���� �c��� ��c������ w��h �h� ���g���-���� �f PBC, wh��� �h� ������ �f c���������, �uch �� �������y� c�������� ��� �u�y�y� c��������, ��c������ w��h �h� ���g������� �f PBC.

Sm��� m���cu�� m���������� m�y �� ������gu��h�� �ff�c-�����y u���g PCA ��� PLS-DA �� �h� ESI+ ��� ESI- m���. Th�� m��h�� �� � g��� �����c���� m��h��, ����� f��m PCA-X �f �h� u���� ESI+ m��� (R2X=0.608, Q2=0.21). A�� �h� ����-��f��� m���������� �f �h� ��������� ���m��k��� ��� ������ �� T����� III ��� IV.

Discussion

Significant hurdles to the early diagnosis of PBC still exist. Du� �� �h� �h���c�m��g� �f ����� �������� ��� �h� ��m�������� �f

F�gu�� 1. D���c���� �f �u������������ �� ���um f��m �������� w��h ���m��y ���-���y c���h���� (PBC). A ������������ V��� ���g��m f�� �h� �������� w��h PBC �������� �� ������� ��u�y �� ���������, �h�w��g �h� f��qu��cy �f AMA-M2, A���-g�210 ��� A���-��100 �������y ����c����.

T���� I. C����c�� ���� �f g���u��� ��� ������m����� ������ �� �h� �������� w��h PBC.

L���� M��. M�x.fu�c���� N�. ���u� ���u� M��� ± SD

ALT (U/�) 32 15 1176 156±225.4AST (U/�) 32 30 710 145.2±148.46ALP (U/�) 32 61 893 299±203.2GGT (U/�) 32 29 1359 346.8±280.67GLO (g/�) 32 23.6 53.5 34.9±6.56

PBC, ���m��y ������y c���h����; ALT, ������� �m��������f�����; AST, ��������� ������m�����; ALP, ��k����� �h���h�����; GGT, g�u��m-y������f�����; GLO, g���u���; M��., m���mum; M�x., m�x�mum.

T���� II. Summ��y �f �h� m������g ��f��m����� f�� PCA ��� PLS-DA ����y���.

A���y���S�m��� m��� m��� R2X R2Y Q2

U���� ESI+ PCA-X 0.608 0.21U���� ESI+ PLS-DA 0.328 0.755 0.679U���� ESI- PCA-X 0.933 0.585U���� ESI-� PLS-DA 0.944 0.9 0.682U���� ESI-�u�g��u� 1 PLS-DA 0.648 0.865 0.711U���� ESI-�u�g��u� 2 PLS-DA 0.953 0.985 0.964S��um ESI+ PCA-X 0.855 0.78S��um ESI+ PLS-DA 0.765 0.877 0.848S��um ESI- PCA-X 0.895 0.772S��um ESI- PLS-DA 0.918 0.915 0.783

�P������� w��h PBC w��� ������� ���� 2 �u�g��u��, ���c� �h�y ���-����u��� �� ��ff����� ��g����. PBC, ���m��y ������y c���h����; PCA, ����c���� c�m������ ����y���; PLS-DA, ������� ����� �qu����-���c��m-����� ����y���.

Page 4: Urine and serum metabolomic profiling reveals that bile

TANG et al: METABOLOMIC PROFILING REVEALS MARKERS OF PBC380

F�gu�� 3. P������ ����� �qu���� ���c��m����� ����y��� (PLS-DA) �c��� ���� (A ��� C) ��� ������g ����� (B) �f �h� u���� m�������m� f��m �������� w��h ���m��y ������y c���h���� (PBC) ��� h����hy c������ �u�j�c�� (HC�) �c����� �y ESI+ ��� ESI-, �����c�����y. P������� w��h PBC w��� ������� ���� 2 �u�g��u��, ���c� �h�y w��� �������u��� �� ��ff����� ��g���� (��� F�g. 4). C���� 1, PBC g��u�; c���� 2, HC g��u�.

F�gu�� 2. P���c���� c�m������ ����y��� (PCA) �c��� ���� (A ��� C) ��� ������g ����� (B ��� D) �f �h� u���� m�������m� f��m �������� w��h ���m��y ������y c���h���� (PBC) ��� h����hy c������ �u�j�c�� (HC�) �c����� �y ESI+ ��� ESI-, �����c�����y. C���� 1, PBC g��u�; c���� 2, HC g��u�.

Page 5: Urine and serum metabolomic profiling reveals that bile

INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE 36: 377-385, 2015 381

F�gu�� 4. P������ ����� �qu���� ���c��m����� ����y��� (PLS-DA) �c��� ���� (A ��� C) ��� ������g ����� (B ��� D) �f �h� u���� m�������m� f��m �������� w��h ���m��y ������y c���h���� (PBC; 2 �u�g��u��) ��� h����hy c������ �u�j�c�� (HC�) �c����� �y ESI-. C���� 1, PBC g��u�; c���� 2, HC g��u�.

T���� III. S���c��� m��k��� ����c����g � ��ff����c� ���w��� ESI+ ��� ESI- �c��� �f �h� u���� ��m���� f��m �������� w��h PBC ��� HC�.

T�±30 P������� w��h PBCN�. (��c) ��. HC� m/z P�������� m��k���

ESI+

1 390 ↑ 321.1362 Th��� �xyg�� ����c��� �� c����m�c �c�� 2 750 ↑ 414.2997 G�yc���c �m��� 3 810 ↑ 626.3537 �Sug�� g��� �� �xyg�� ch���c �c�� 3-g�uc�����, ���� �c��, g�ucu����c �c�� 4 930 ↑ 432.3118 7�-hy���xy-3-u������xych���c �c�� �x�-5� 5 930 ↑ 823.4127 UK 6 1110 ↑ 593.3328 U��������g�� 7 90 ↓ 204.9095 P������um ch������, cy��� �u�f��� ����� 8 150 ↓ 218.1390 P������y� c�������� 9 210 ↓ 232.1548 Bu�y�y� L-c��������, �u�y�y� c�������� 10 330 ↓ 268.1060 D��xygu�������, ��������� 11 390 ↓ 189.0657 H���u��c �c��, 3-�ucc��y� �y������, ����������, hy���xy���z��c �c��, hy���xy���z��c �c�� 12 570 ↓ 286.2012 UK 13 630/690 ↓ 310.2013 L-g��u� �f �mm���� ��� ��c�h��, L-c�������� z���ESI-

14 630 ↑ 288.6198 �C�w ���� �c�� ����um �u�f������ g��� �� �xyg��-7-�u�fu��c �c�� 15 810 ↑ 624.3392 �G�yc��� g��� �� ���xych���c �c�� 3-g�uc����� �c�� 16 870 ↑ 471.2423 �U�������xych���c �c��, ch������xych���c �c�� 3-�u�fu��c �c��, ���� �c�� �u�f��� g��� �� �xyg�� 17 930 ↑ 448.3072 �Amm���� ������g ���� �c�� g��� �� �xyg��, ch������xych���c �c�� g�yc��� c��jug����, DNA ���g�� g�yc��� c��jug��� 18 750 ↑ 528.2645 �G�yc��� g��� �� ���xych���c �c��-3-�u�fu��c �c��, �G�yc��� ���h�ch���c �c�� 3-�u�fu��c �c�� ������um ����

PBC, ���m��y ������y c���h����; HC�, h����hy c������ �u�j�c��. �D������ ���� �c���. U�m��k�� m��k��� ��������� c���������. UK, u�k��w�.

Page 6: Urine and serum metabolomic profiling reveals that bile

TANG et al: METABOLOMIC PROFILING REVEALS MARKERS OF PBC382

F�gu�� 5. P���c���� c�m������ ����y��� (PCA) �c��� ���� (A ��� C) ��� ������g ����� (B ��� D) �f �h� ���um m�������m� f��m �������� w��h ���m��y ������y c���h���� (PBC) ��� h����hy c������ �u�j�c�� (HC�) �c����� �y ESI- ��� ESI+, �����c�����y. C���� 1, PBC g��u�; c���� 2, HC g��u�.

F�gu�� 6. P������ ����� �qu���� ���c��m����� ����y��� (PLS-DA) �c��� ���� (A ��� C) ��� ������g ����� (B ��� D) �f �h� ���um m�������m� f��m �������� w��h ���m��y ������y c���h���� (PBC) ��� h����hy c������ �u�j�c�� (HC�) �c����� �y ESI- ��� ESI+, �����c�����y. C���� 1, PBC g��u�; c���� 2, HC g��u�.

Page 7: Urine and serum metabolomic profiling reveals that bile

INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE 36: 377-385, 2015 383

AMA ��� ANA �������y ����y�, � c���-�ff�c���� ����y ����c-���� m��h�� w��� ��qu��� � ���y �ccu���� �c������g m��h��. Th���f���, c����c���y h���fu� ���m��k��� f�� �h� ����y ����c���� �f PBC �h�u�� �� m���u����� �� �� �����y �cc������� �����y fluid, such as blood or urine. Furthermore, these biomarkers should provide predictive value with high specificity and sensi-�����y. I� �h� ������� ��u�y, w� c�m����� �h� m�������m�c� profiles of urine and serum from patients with PBC with those �f �g�- ��� g�����-m��ch�� HC� u���g ���h u��u�������� PCA ��� �u�������� PLS-DA w��h UPLC/Q-TOF.

I� �h�� ��u�y, �h� ����y��� �f �h� u���� ��� ���um m�����-lomics profiles identified important differences between the patients with PBC and the HCs. One of the most significant observations was that the levels of bile acids were significantly ��c������ �� �h� �������� w��h PBC c�m����� �� �h� HC�. I� ���� w��h �u� ���u���, �� � ������u� ��u�y, �h� c��c���������� �f ����� ���� �c���, ��u���� ��� g�yc��� c��jug���� �f ���m��y ���� �c��� w��� ��c������ �� �������� w��h PBC, c�m����� �� ���-ch��������c ������ (16). I�����, ���� �c��� ��� �h� m��� ����uc� �f ����g���u� ch��������� m��������m ��� ��� �������

�� ����� ���������� ��� ������y �xc������. B��� �c��� ���u�� � �����g ������h�����c ��c��cu������, �h��ugh wh�ch �h�y c�� �� c�������� ���� ��c�����y ���xych���c ��� ���h�ch���c �c��� �� �h� ����������. B��� �c��� ��-�������� �� �h� ���������� m�y �� fu��h�� �������� ��ck ���� �h� �����, �� ���y � �m��� f��c���� �f ���� �c��� �� f�u�� �� �h� �����h���� c��cu�����g ����� ��� u���� �� h����hy �������u���. H�w����, ����� ��ju�y c�u��� �y ����� ��������, �uch �� c���h���� ��� g���������� �������, ���u��� �� � ��c����� �� �h� h�����c c������c� �f ���� �c��� ���, �����u���y, �� �� ��c����� �� �h� ������ �f ���� �c��� �� �h� ���um. Th���f���, ���� �c��� ��� c��������� �� �� � h���m��k �f ����� ��ju�y. Du���g �h� ����y ���g�� �f ����� c���h����, ���� �c��� m�y ���uc� �h� u���gu-������ �f h�����cy��-������� m���cy�� ch�m���x�� �������-1 (MCP-1), � h�����c �������� c���-���������� ch�m�k���, ������g �� h�����c �������� c��� ��c�u��m���. I� �u��, MCP-1 m������� h�����c �������� c��� ��c�u��m���, c�u���g � fu��h�� ��c����� �� �h� h�����c c������c� �f ���� �c��� ��� fu��h�� ���m����g ����� c���h���� (20). Fu��h��m���, ���� �c��� ����c��y �c������ �h� ���-inflammatory signaling network in hepatocytes and induce the upregulation of multiple pro-inflammatory mediators, such as

T���� IV. S���c��� m��k��� ����c����g � ��ff����c� ���w��� �h� ESI+ ��� ESI- �c��� �f �h� ���um ��m���� f��m �������� w��h PBC ��� �h� HC�.

T�±30 P������� w��h PBCN�. (��c) ��. HC� m/z P�������� m��k���

ESI+

1 670/750 ↑ 414.3005 UK 2 870/930/1110/1050 ↑ 450.3213 �CDCA, g�yc��� c��jug����, ���xych���c �c�� f g�yc��� c��jug���� 3 1050 ↑ 466.316 �GCA 4 1290/1350 ↓ 520.394 S���u��m�� 5 1350/1410 ↓ 496.3394 3-β,α-hy���xy-5-7 ���� �c�� ��hy� �����, c�������� 3.24 X-hy���xy-3-��c�h�� 6 1470 ↓ 522.3556 UK 7 1590 ↓ 524.2707 UK 8 2070 ↓ 758.5705 UK

ESI-

9 570/630/690 ↑ 288.62 �C����� �u�f������ g��� �� �xyg�� ch���c �c��-7-�u�fu��c �c�� 10 690/750 ↑ 528.2632 �G�yc��� g��� �� ���xych���c �c��-3-�u�fu��c �c��, �G�yc��� ���h�ch���c �c�� 3-�u�fu��c �c�� ������um ���� 11 810 ↑ 498.2891 �CDCA, ��u��u������xych���c �c��, ��u��u�������xych���c �c�� 12 810 ↑ 514.2843 �T�u��ch���c �c�� 13 1050 ↑ 437.206 �CDCA ���xych���c �c�� 14 1110 ↑ 448.3074 �Ch������xych���c �c�� g�yc��� c��jug����, g�yc��� c��jug���� ���xych���c �c�� 15 1290 ↓ 476.2773 UK 16 1350/1410 ↓ 540.3302 UK 17 1350 ↓ 564.3304 UK 18 1470 ↓ 566.3485 UK 19 1590 ↓ 568.3623 UK 20 1770 ↓ 433.236 5,6-D�hy���xy-������g������ F1A

CDCA, ch������xych���c �c��; DCA, ���xych���c �c��; GCA, g�yc�ch���c �c��; PBC, ���m��y ������y c���h����; HC�, h����hy c������ �u�j�c��. �D������ ���� �c���. U�m��k�� m��k��� ��������� c���������. UK, u�k��w�.

Page 8: Urine and serum metabolomic profiling reveals that bile

TANG et al: METABOLOMIC PROFILING REVEALS MARKERS OF PBC384

cy��k����, ch�m�k����, ��h����� m���cu��� ��� ��h�� �������� that influence immune cell functions (21). Moreover, bile acid ��c����� GP-BAR1 (TGR5) �x�������� h�� ���� �h�w� �� �� ��c������ �� ������ m����� �f c������ ��� C��h�'� ������� (22); ��� �h� �����m��� �f � mu���� m���� �f ���-��c�h���c f���y ����� ������� w��h � �u�� ���� �c�� FXR/TGR5 ��c����� �g����� w�� shown to decrease intrahepatic inflammation and altered the �mmu�� �h����y�� �f m���cy��� (23).

Th� ���� �c�� ������ f�������� X ��c����� (FXR) �� ��qu���� f�� �h� �mmu����gu�����y �c�������� �f T���-��k� ��c�����-9 �� intestinal inflammation (24). Another intriguing difference ���w��� �������� w��h PBC ��� HC� �� �h� ���������y h�gh�� ����� �f c���������, �uch �� �������y� c�������� ��� �u�y�y� c�������� �� HC�. C�������� �� � �u�����c� ��c�����y f�� ���g-ch��� f���y �c��� �� ���� �h� m���ch������� �����m�m����� �� ���uc� β-�x������� (25). H�w����, �h� ���u��� �f ��u���� ��������g c�������� m��������m �� �������� w��h PBC h��� ���� c������������ �hu� f��. S�m� ��u���� h��� ��m��������� �h�� �h� ��ck �f c�������� ��c������ �h� ���� �f h�����c f���y �c�� �x���-���� ��� m�y �� ����c����� w��h h�����c ���������, wh�ch c�u��� ���h���g�c�� c����qu��c�� �� �h� ����� (26), wh����� �������� c�������� c��c���������� ��� ������� �� �������� w��h c���h���� �f ��ff����� c�u��� (27). I� ��������, �� ��c������ u�����y �xc��-���� �f ����� c�������� h�� ���� f�u�� �u� �� �� ��c����� �� �h� f��c������ �xc������ �f ���h f��� c�������� ��� �h���-ch��� �cy�-carnitine (28). Furthermore, severe carnitine deficiency leads to the increased apoptosis of enterocytes, villous atrophy, inflam-m����� ��� gu� ��ju�y (29); ��� L-c�������� �u����m�������� h�� ���� �h�w� �� h��� � �������� �ff�c� �� �m������g �mmu�� ��������� �� �g�� ���m��� (30).

Th� �h��� ��������� ���m��k�� f�� PBC �� �h� ���������y h�gh�� ����� �f ������g������ (PG), wh�ch �� �� �m������� ���y�� �� ��f��mm����y ���c�����. I� f�c�, �hy��h�m�gg�u-����� (PHA)-���mu�����-����ch�� m���cy��� �f �������� w��h PBC ����uc� �����x�m����y 3-f��� m��� PGE2 �h�� �h�� �f ���m�� c������ m���cy��� (31); ��� �h� PGE2 ����uc�� �� m���cy��� m�y ���y � ���m��y ���� �� �h� hy���������������� �� PHA �������� �� �������� w��h PBC (32). M�������, ����h�-���� c���� f��m �������� w��h PBC h��� ���� �h�w� �� h��� m������� ������ �f cyc���xyg�����-2 �x��������, wh�ch �� �u�� �����c������ �� �h� c��������� �f ���ch�����c �c�� ���� PG (33). PG� ���� fu�c���� �� �h� ���������� ��� m��������c� �f ch����c inflammation. One role that PGs play in such processes is the amplification of cytokine signaling, which in turn facilitates acquired immunity and induces long-lasting immune inflam-mation (34). PGs also play a part in chronic inflammation by g��������g � �������� f�����ck ���� ���/�� ���uc��g ch�m�-kines and recruiting inflammatory cells to alternate active cell ���u������� �� �ff�c��� ����u�� (35). I� ��������, PG� c������u�� �� ����u� ��m������g �� f������� �� � �����f��m��g g��w�h f�c��� β-����������� m����� (36). Thu�, PG� ��� c�mm���y known as mediators of inflammation (37-39).

Th� f�u��h ��ff����c� ���w��� �h� �������� w��h PBC ��� �h� HC� w�� �h� �������� ����� �f u���� ���xygu�������, wh�ch �� k��w� �� �� �x��������y ��m�g�� �uc������� �f DNA �xc����� ���� �h� u����. I�����, �h� �������� ����c������ �f �x������� ������ h�� ���� �ugg����� �� �� �������� �� �h� ���h�g������ �f c���u��� �����c��c� �� PBC (40). F�� �x�m���, �x������� stress and pro-inflammatory cytokines, such as interferon-β ��� �um�� ��c����� f�c���-α, ���uc� ���c���� �xyg�� ���c���

g��������� ��� �c������ �h� ATM/�53/�21WAF1/C��1 ���hw�y, f����w�� �y ������y ����h����� �����c��c� �� �h� c��� �f PBC (41).

I� c��c�u����, �h� f�����g� �f �h� ������� ��u�y �ugg��� �h�� �h� c��cu�����g ������ �f ���� �c��� ��� c�������� ��� ��ff���������y ������� �� �������� w��h PBC. H�w����, �u� �� �h� ��m�������� �f �h� ������� ����� ��u�y, �uch �� � �m��� ������� population and the absence of a stratification metabolomics profile amongst the disease stages of PBC, further studies to confirm the differential variations are warranted.

Acknowledgements

Th�� ��u�y w�� �u������� �y �h� N������� N��u��� Sc���c� F�u������� �f Ch��� (g���� ��. 81360072), �h� N��u��� Sc���c� F�u������� �f Yu���� P�����c� (g���� g�. 2013FB050) ��� �h� H����h Sc���c� ��� T�ch����gy P��j�c� �f Yu���� P�����c� (g���� ���. 2012WS0102, 2012WS0103 ��� 2014NS109). Th� �u�h��� w�u�� ��k� �� �h��k M�. W�� N� Gu�� (Q��g��� I�����u�� �f B����g�c�� E���gy ��� P��c��� R�����ch I�����u�� �f �h� Ch����� Ac���my �f Sc���c��) f�� ��������g �� �h� ����c���� ��� ���� ����y��� �f UPLC-Q-TOF-MS.

References

1. K����� MM ��� G���hw�� ME: P��m��y ������y c���h����. N E�g� J M�� 353: 1261-1273, 2005.

2. P���c� M, Ch��wy�� A, N�wm�� W, M��c��f JV ��� J�m�� OF: Su������ ��� �ym���m ���g������� �� � g��g���h�c���y ����� c�h��� �f �������� w��h ���m��y ������y c���h����: F����w-u� f�� u� �� 28 y����. G�������������gy 123: 1044-1051, 2002.

3. K�m WR, L����� KD, L�ck� GR III, Th�����u TM, H�m�u�g�� HA, B���� KP, Y�w� BP, P��z JL, M����� LJ III ��� D�ck��� ER: E����m����gy ��� ���u��� h�����y �f ���m��y ������y c���h���� �� � US c�mmu���y. G�������������gy 119: 1631-1636, 2000.

4. S��m� C, I������zz� P, Zu�� M, P���� M ��� G���hw�� ME: G�����c� ��� g�������m����gy �f ���m��y ������y c���h����: F����w��g �h� f��������� �� ������� ������gy. S�m�� L���� D�� 25: 265-280, 2005.

5. H� XS, A����� AA, R��gw�y WM, C����� RL ��� G���hw�� ME: N�w ����gh�� �� �h� �mmu�����h���gy ��� �u���mmu�� ��������� �� ���m��y ������y c���h����. C��� Immu��� 239: 1-13, 2006.

6. Hu C, D��g C, S��g G, Zh��g W, Zh��g S, L� X, L� P, Zh��g F ��� L� Y: P�������c� �f �u���mmu�� ����� ������� ������� �u����-�������� �� Ch����� �������� w��h ���m��y ������y c���h����. D�g D�� Sc� 56: 3357-3363, 2011.

7. B�g����� M, M����� WR, W��g L, M����� T, S�u�����-Pu��m�� R, B����m�� SS ��� F���� B��� M: M�������m�c profiling to develop blood biomarkers for Parkinson's disease. B���� 131: 389-396, 2008.

8. S���kum�� A, P������ LM, R�j������� TM, et al: M�������m�c profiles delineate potential role for sarcosine in prostate cancer ���g�������. N��u�� 457: 910-914, 2009.

9. W��g C, K��g H, Gu�� Y, Y��g J, Gu J, Y��g S ��� Xu G: P���m� �h���h������ m�������c ���f����g ��� ���m��k��� �f �y�� 2 �������� m�����u� ����� �� h�gh-���f��m��c� ��qu�� ch��-m���g���hy/���c�������y m��� ���c���m���y ��� mu���������� ��������c�� ����y���. A��� Ch�m 77: 4108-4116, 2005.

10. S������� MS, L�u E, M����w DA, H����� E, McC������ R, W��g��� R, B����z GF, R��h FP ��� G���z��� RE: M�������m�c ������f�c����� �f ����� ���m��k��� �f my�c������ ��ch�m��. C��cu������ 112: 3868-3875, 2005.

11. H��z��� AE, B��w� M, W����� SA ��� Du�� WB: R����w: Th� �ff�c�� �f �xyg�� �� ���m�� ��� ���-�c��m���c ���c����� ����u� - ����gh�� f��m m�������m�c�. P��c���� 32 (Su��� 2): S119-S124, 2011.

12. B��� J, C�������í� J, M���í��z-A����z I, et al: O�����y-��������� m�������c ��g���u��� ����c����� w��h �����c�h���c f���y ����� ������� ���g�������. J P�����m� R�� 11: 2521-2532, 2012.

13. K��h�� SC, Gu� L, E�m���� J, D������hy S, McCu���ugh AJ, H����� RW ��� M���u�� M: P���m� m�������m�c ���f��� �� �����c�h���c f���y ����� �������. M��������m 60: 404-413, 2011.

Page 9: Urine and serum metabolomic profiling reveals that bile

INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE 36: 377-385, 2015 385

14. Pu�� P, W���� MM, Ch�u�g O, et al: Th� ����m� ������m�c ��g���u�� �f �����c�h���c ������h��������. H�������gy 50: 1827-1838, 2009.

15. T�ku�h�g� K, H��h�m��� E, K���m� K, et al: S��um m����-olomic profile and potential biomarkers for severity of fibrosis in �����c�h���c f���y ����� �������. J G������������ 48: 1392-1400, 2013.

16. Trottier J, Białek A, Caron P, Straka RJ, Heathcote J, Milkiewicz P and Barbier O: Metabolomic profiling of 17 bile acids in serum f��m �������� w��h ���m��y ������y c���h���� ��� ���m��y �c��-�����g ch����g����: A ����� ��u�y. D�g L���� D�� 44: 303-310, 2012.

17. H���hc��� EJ: M���g�m��� �f ���m��y ������y c���h����. Th� Am���c�� A���c������ f�� �h� S�u�y �f L���� D������� ���c��c� gu��������. H�������gy 31: 1005-1013, 2000.

18. Y�� P, Zh�� X, L� Q, W��g J, L� J ��� Xu G: M�������m�c� ��u�y of intestinal fistulas based on ultraperformance liquid chroma-��g���hy c�u���� w��h Q-TOF m��� ���c���m���y (UPLC/Q-TOF MS). J P�����m� R�� 5: 2135-2143. 2006.

19. U���'� Gu��� �� SIMCA-P, SIMCA-P ������� 11.0; Um����c� AB, Um�å, Sw����, �397, 2005.

20. R�mm GA, Sh��h��� RW, H��k��� AC, et al: F����g������ �� ��������c ch��������c ����� �������: R��� �f ��u��ch����� ��� h�����cy��-������� m���cy�� ch�m���x�� �������-1 �� h�����c �������� c��� ��c�u��m���. H�������gy 49: 533-544, 2009.

21. Allen K, Jaeschke H and Copple BL: Bile acids induce inflam-matory genes in hepatocytes: A novel mechanism of inflammation �u���g �����uc���� ch���������. Am J P��h�� 178: 175-186, 2011.

22. C������� S, M��c������ A, Ch��� MG, D����u��� E, R��g� B, B�fu�c� G, B������� F, D����� A ��� F���ucc� S: Th� ���� �c�� ��c����� GPBAR-1 (TGR5) m��u����� ����g���y �f ���������� ������� ��� �mmu�� �������� �� �x����m����� c������. PL�S O�� 6: �25637, 2011.

23. McM�h�� RH, W��g XX, Ch��g LL, et al: B��� �c�� ��c����� �c�������� m��u����� h�����c m���cy�� �c�����y ��� �m������ �����c�h���c f���y ����� �������. J B��� Ch�m 288: 11761-11770, 2013.

24. R��g� B, M��c������ A, C������� S, D'Am��� C, C����� A, B�u�� A, F���c��c� D, Z�m����� A, D����u��� E ��� F���ucc� S: Th� ���� �c�� ������ FXR �� ��qu���� f�� �mmu��-��gu�����y �c�������� �f TLR-9 �� ���������� ��f��mm�����. PL�S O�� 8: �54472, 2013.

25. B��m�� J: C�������� - m��������m ��� fu�c�����. Phy���� R�� 63: 1420-1480, 1983.

26. B�wy�� BA, M���� JM, H�ym��� MW ��� F��m��g CR: L-c�������� �h����y �� h�m� ���������� �u������� �������� w��h �����m�� ����� ����� ��� ��w ����m� c�������� c��c����������. G�������������gy 94: 434-438, 1988.

27. Am���� P, A�g��� P, M��k�� C, M���� F ��� G���� A: P���m� c�������� ������ �� ����� c���h����: R��������h�� w��h �u��������� ����u� ��� ����� ��m�g�. J C��� Ch�m C��� B��ch�m 28: 619-626, 1990.

28. K�äh���üh� S ��� R��ch�� J: C�������� m��������m �� �������� w��h ch����c ����� �������. H�������gy 25: 148-153, 1997.

29. S���� S, Sh�kh�w�� PS, M����� D, G������hy V ��� Ignatowicz L: Carnitine deficiency in OCTN2-/- ��w���� m�c� ����� �� � ������ gu� ��� �mmu�� �h����y�� w��h w��������� �����hy, ��������� ��� � ���-��f��mm����y ��������. PL�S O�� 7: �47729, 2012.

30. Th��g���my T, Su���h�� M, S�����j��y S, J�y�kum�� P, J�y�� AG, M����z� E ��� Ch����kk��u P: R��� �f L-c�������� �� �h� m��u������ �f �mmu�� �������� �� �g�� ����. C��� Ch�m Ac�� 389: 19-24, 2008.

31. Ch���c��� M, L��z� M, B���ch� F, F���c��ch� C, B�������� G, O������ M, T�m��� V ��� L�c����� F: Immu�� �y�fu�c���� �� ���m��y ������y c���h����. II. I�c������ ����uc���� �f ������-g������ E. Sc��� J Immu��� 30: 363-367, 1989.

32. L�c����� F, L��z� M, Ch���c��� M, D���� LJ, C������ F, B���ch� F ��� F���c��ch� C: Immu�� �y�fu�c���� �� ���m��y ������y c���h���� (PBC): I. I�c������ ����������y �f PHA ���mu����� �ym�h�cy�� cu��u��� �� ����m��h�c��. J C��� L�� Immu��� 23: 19-23, 1987.

33. H�y��h� N, Y�m�m��� H, H����k� N, et al: D�ff�������� �x�������� �f cyc���xyg�����-2 (COX-2) �� hum�� ���� �uc� ����h����� c���� ��� ���� �uc� �������m. H�������gy 34: 638-650, 2001.

34. Y�� C, S�k��� D, E��k� Y, L� Y, M���u�k� T, Ku���w� K, Sug�m��� Y ��� N��um�y� S: P�����g������ E2-EP4 ��g�����g promotes immune inflammation through Th1 cell differentiation ��� Th17 c��� �x�������. N�� M�� 15: 633-640, 2009.

35. A�k� T, N��h�mu�� M, M���u�k� T, et al: PGE(2)-EP(2) ��g������g �� �����h���um �� �c������� �y h��m��y��m�c ������ ��� ���uc�� c������� ���u�y�m �h��ugh �� �m���fy��g ���� ��� NF-κB. B� J Ph��m�c�� 163: 1237-1249, 2011.

36. Og� T, M���u�k� T, Y�� C, et al: P�����g������ F(2���h�) ��c����� ��g�����g f�c�������� ����myc��-���uc�� �u�m����y fibrosis independently of transforming growth factor-beta. Nat M�� 15: 1426-1430, 2009.

37. R�cc����� E ��� F��zG����� GA: P�����g������� ��� ��f��m-m�����. A�������c��� Th��m� V��c B��� 31: 986-1000, 2011.

38. Fattahi MJ and Mirshafiey A: Prostaglandins and rheumatoid ���h�����. A��h����� (Egy��) 2012: 239310, 2012.

39. L�m� IV, B����� LF, L�m���ç�-F��h� M, F����ch BL ��� de Oliveira AC: Role of prostaglandins in neuroinflammatory ��� ��u����g��������� ��������. M�������� I�f��mm 2012: 946813, 2012.

40. B��� LN, Wu�ff J, C�m��f��� M, Vu������ch� R ��� Ch������� N: S��um m�������c ��g���u��� �f ���m��y ������y c���h���� ��� ���m��y �c�������g ch����g����. L���� I�� 35: 263-274, 2015.

41. Sasaki M, Ikeda H, Sato Y and Nakanuma Y: Proinflammatory cy��k���-���uc�� c���u��� �����c��c� �f ������y ����h����� c���� �� m������� ��� �x������� ������ ��� �c�������� �f ATM ���hw�y: A cu��u�� ��u�y. F��� R���c R�� 42: 625-632, 2008.