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Utilisation de la plate-forme développement UHPLC/QDA – Fusion
Application à une méthode de dosage des impuretés d’un principe actif pharmaceutique
Ateliers Waters – 17 au 19 juin 2015
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Présentation - Pharmaphysic
Nous sommes un laboratoire spécialisé dans la prestation de services d'analyse pour les industries cosmétiques et pharmaceutiques. Pour répondre rapidement aux besoins de nos clients nous nous appuyons sur:
une expérience de plus de 25 ans dans le développement analytique des travaux de recherche analytique interne un réseau d'experts une cellule de veille technologique et un plateau technique complet
Nous accompagnons également nos clients dans la formation de leurs collaborateurs aux techniques d'analyses.
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Introduction – Plateforme de développement LC
Exigences de performances (séparation, détection) Besoins de prédictions sur un domaine expérimental étendu Nouvelles recommandations du « Quality by Design » (ICH) Exigences de transférabilité des méthodes (Robustesse) Diminution de la durée du développement
Plateforme de développement
Four 4 colonnes
Pompe quaternaire dont un voie à 6 sélections de solvants
Injecteur
Empower + Fusion
Détecteur DAD
Détecteur QDA
2015
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Introduction – Plateforme: Intégration du QDA
Connection DAD-QDA : simple
Programmation QDA
Synoptique du QDA sur la console
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Un plan d’expériences permet d’obtenir la meilleure précision possible dans la modélisation de l’influence de plusieurs facteurs sur une ou plusieurs réponses en réalisant un minimum d’essais
Introduction – Plateforme: FusionAE
Fusion AE est un logiciel de développement et d’optimisation de méthodes d’analyses HPLC/UHPLC basé sur l’utilisation de plans d’expériences
Fusion AE n’utilise aucun modèle ou loi chromatographique (Van Deemter – Knox /Everett)
La zone dans laquelle peuvent varier les facteurs est l’espace ou le domaine expérimental
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Introduction – Plateforme: Interface FusionAE/Empower
Traitement des résultats dans Empower -> Importance de l’intégration
Exportation du plan vers Empower -> création des méthodes instrument correspondantes pour chaque expérience
Rapatriement des résultats dans Fusion AE
Experiment Design
Dosage des impuretés d’un PA actif : Le plan
Ce rapport fournit l’attribution des réservoirs et des colonnes. Il contient le tableau détaillant le plan, i.e. la liste de tous les essais à effectuer avec les paramètres spécifiques de chaque essai
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Dosage des impuretés d’un PA actif : transfert vers Empower
Connexion à Empower
Choisir un projet
Choisir une méthode set par défaut
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Dosage des impuretés d’un PA actif : transfert vers Empower
Donner un nom au sample set qui va être créé
Donner Prefixe commun à toutes les methods set et les methods instrument
Ecriture de toutes les méthodes et du sample set
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Dosage des impuretés d’un PA actif : transfert vers Empower
Exemple de sample set dans Empower
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Contexte - Dosage des impuretés d’un PA actif
Sujet de l’étude : Développer une méthode d’analyse des impuretés du principe actif et indicatrice de la stabilité (Antibiotique du groupe des azalides) compatible MS
Déroulement de l’étude : A partir d’une méthode d’analyse (PE) de 14 impuretés du principe actif par HPLC (colonne C18 250x4,6 mm – 5 µm, Tampon phosphate (pH=11)/MeOH/ACN – 95 min)
Il faut: Réduire le temps d’analyse Eliminer le tampon phosphate Garder ou améliorer la séparation
En étudiant: la nature de la colonne le pH et la nature du tampon la nature du solvant organique la programmation du gradient
Plan d’expériences avec le Logiciel d’aide au développement
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Dosage des impuretés d’un PA actif : Le plan
Etude constituée de 58 expériences
Echantillon : Mélange témoin d’impuretés a de très faibles teneurs dans le principe actif
Facteurs testés: - Colonnes C18 100 x 2,1 mm sub 2µm (BEH, Nucleodur gravity, ACE AR, Uptisphere Nec B) - Composition du solvant organique : % de MeOH dans le mélange ACN/MeOH - Nature du tampon : Ammoniac, carbonate d’ammonium - pH : 8, 9 et 10 - Gradient : % final de la phase organique
2 réponses étudiées: nombre de pics détectés, nombre de résolutions supérieures à 1,5
Détection UV 210 nm et QDA avec paramètres par défaut (tension cône et du capillaire)
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Essais du plan: Détection UV Les spectres UV des composés sont peu caractéristiques : Identification difficile en UV
Solvant
Principe actif
210 nm
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Essais du plan : Comparaison UV/QDA
UV 210 nm QDA Scan Réponse des impuretés QDA/UV
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Essais du plan : examen chromatographique Apport du QDA sur l’identification et le suivi des pics des chromatogrammes UV
Masse du m/z le plus intense
Temps de rétention Essai 1
Essai 8 Essai 22
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Essais du plan : examen chromatographique
Le suivi des pics Spectre UV
Spectre MS
Information sur le pic
Exemple de fenêtre Empower sur la plateforme UV/QDA
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Essais du plan : examen chromatographique
Apport du QDA sur l’interprétation des pics
Superposition des chromatogrammes au m/z de base de chaque pic
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Apport du QDA sur l’identification des pics
Essais du plan : examen chromatographique
Mise en évidence d’une isomérie
Co-élution sur ce pic
Pas de co-élution sur ce pic
Mise en évidence d’une co-élution
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Résultats du plan Proposition d’un point optimal sans utilisation du QDA
Etude de la réponse du nombre de pics détectés en UV
Résultat de l’optimum proposé
Nécessité de poursuivre avec un nouveau plan d’optimisation de la pente du gradient
Paires critiques
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Proposition d’un point optimal avec l’aide du QDA
Résultats du plan
Etude de la réponse du nombre de pics en UV identifiés par le QDA (détection des co-élutions et des isomères)
Résultat de l’optimum proposé
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Etude sur la température de la colonne
Dans cette étude nous avons souhaité mesurer l’impact de la température de la colonne sur la résolution des pics.
Un nombre important de publication relate l’importance de la
température sur la séparation en UHPLC
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Optimisation : Etude de la température
Estimations of temperature deviations in chromatographic columns using isenthalpic plots A. Tarafder et al./J. Chromatogr. A 1366 (2014) 126-135
Effect of pH additive and column temperature on kinetic performance of two different sub-2 µm stationary phases for ultrafast separation of charged
analytes S. Heinisch et al. / J. Chromatogr. A 1228 (2012) 135– 147)
Molécule : Diphenhydramine
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Optimisation : Etude de la température
Etablissement d’un plan d’expérience : la température de la colonne est le seul facteur dont la valeur est une variable discrète entre 15 et 70°C.
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Etude de la température : Plan d’expérience
15°C
26°C
37°C
48°C
59°C
70°C
15°C
26°C
37°C
48°C
59°C
70°C
UV 210 nm
Zoom
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Etude de la température UV 210 nm QDA Scan
15°C
26°C
37°C
48°C
59°C
70°C
15°C
26°C
37°C
48°C
59°C
70°C
Isomères
Coélution
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Etude de la température
Etude de trois réponses : nombre de pic, du nombre de résolution < 1,5 et du nombre de résolution < 1,0
Robustesse de l’analyse à la température de la colonne
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Conclusion
Le QDA dans la plateforme de développement :
Spécificité Sensibilité « Universalité »
Identification des pics (tracking)
Fiabilisation du traitement des essais du plan
Diminution du nombre de plans
Gain de temps de développement
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Conclusion
Autres utilisations potentielles du QDA
Elucidation de structure Quantification
Utilisation en back-up (CQ ou développement) Utilisation en détecteur de routine (sensibilité + détecteur « universel »)
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Pharmaphysic – Pharma-blog
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