464 BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

BBA 2 5 5 0 1

V A R I A T I O N D E L ' E N C O M B R E M E N T MOLI~CULAIRE D E LA

RIBONUCLI~ASE DANS D I F F I ~ R E N T E S CO N D IT IO N S D E DI~NATURATION

P E D R O D E LA LLOSA, CO LETTE T E R T R I N ET M A R I A N JUTISZ

Laboratoire de Morphologie expdrimentale el Endocrilwlogie, Coll~ge de France, Paris (France') (Re~u le 21 juil let , 1965)

SUMMARY

Alteratio~ of the molecular size of ribom~clease u~der different condition, s of denaturatio~

Trea tmen t s which dena ture r ibonuclease (such as p H 12, performic acid oxi- dat ion, urea) affect the elut ion volume of this prote in when f rac t iona ted on Sephadex G-Ioo columns. This a l tered behav iour of r ibonuclease on Sephadex seems to be due to the effect of the above t r ea tmen t s on ei ther the secondary or the t e r t i a ry s t ruc ture and consequent ly the molecular size of r ibonuclease. The results presented in this repor t suggest t ha t the behav iour of prote ins dur ing gel f i l t rat ion can be used as a cr i ter ion of the disorganizat ion of their s t ructure .

INTRODUCTION

En ~tudiant la s t ruc ture chimique de l 'h i rudine, nous nous sommes aperq;us que l ' oxyda t ion performique de cet te protdine modif iai t compl+tement son compor te- ment au cours de sa f i l t rat ion sur colonne de Sephadex. L ' idde nous est venue alors qu 'une modif icat ion de la s t ructure ter t ia i re et peut-~tre secondaire d 'une prot~ine pour ra i t ~tre d~cel~e par cet te technique. Afin de v6rifier cet te hypoth~se, nous avons choisi la r ibonuclfase dont la s t ruc ture a 6t6 par t icul i6rement bien ~tudi6e et qui, pa r son faible poids mol6culaire, se rapproche de l 'h i rudine 1,2.

Trois types de d6natura t ion ont 6t6 effectu~s sur la ribonucl~ase, chacun d ' eux cor respondant ~ une modif icat ion d6termin6e de sa s t ruc ture secondaire ou te r t ia i re : t r a i t emen t ~ p H 12, oxyda t ion performique et t r a i t emen t pa r l 'ur6e. Cette 6rude nous a permis de cons ta te r qu 'une d~sorganisat ion de la s t ruc ture de cet te prot6ine se t r adu i sa i t pa r une modif icat ion de son encombrement mol6culaire et pa r t an t , de son compor temen t au cours d 'une f i l t rat ion sur Sephadex.

Quand ce t r ava i l dtai t en cours, nous avons eu connaissance d 'une r~cente note de KRAVCi~E~'KO et a12, dans laquelle ces au teurs s ignalent que la ca rboxym~thy la t ion du lysozyme modifie son volume d'61ution sur Sephadex.

PARTIE EXPI~RIMENTALE

Matdriel et mdthodes La ribonucl~ase est une pr6para t ion Calbiochem d 'or igine bovine, 5 fois cristal-

lis~e (A grade, lot No. 32143). L 'ac t iv i t6 sp6cifique app rox ima t ive de cet te p r @ a r a t i o n est de 39 E .U. /mg (Kunitz).

Biochim. Biophys. Acla, x T 5 (I966) 464-47 °

D1~NATURATION ET ENCOMBREMENT MOLI~CULAIRE 465

Les prot6ines de r6f6rence utilis6es dans cette 6tude sont de provenances suivantes: S6rumalbumine, Fraction V de plasma de boeuf pr6par6e par Armour et Cie. Cette pr6paration a 6t6 purifi6e par filtration sur Sephadex G-Ioo, et seule la fraction correspondant au monom~re a 6t6 employ6e. Pepsine, Worthington, 2 fois cristallis6e. Cytochrome c, pr6par6 & partir de coeur de cheval, Industrie Biologique Fran~aise, Gennevilliers (Seine). Trypsine, Worthington, 2 fois cristallis6e. Thyro- globuline, purifi6e (de mouton), pr6par6e par M. J. NuNEz (Coll~ge de France).

Le Sephadex G-Ioo, grain moyen (14o-4oo mesh, "m6dium") a 6t6 fourni par les Ets. Pharmacia.

La colonne de S6phadex G-ioo (0. 9 cm × 124 cm) a 6t6 pr6par6e suivant les indications de WHITAKER 4, et 6quilibr6e avec le tampon ac6tate de pyridine, o.i M (pH 5.0). Toutes les op6rations de filtration ont 6t6 effectu6es dans ce tampon /t 4 °. Des fractions de 0.5-0.8 ml ont 6t6 recueillies dans un collecteur de fractions ~t temps constant avec un d6bit approximatif de I goutte par 75 sec. La concentration en prot4ine dans les fractions a 6t6 recherch6e par la r6action de FOLIN-LOwRY 5. Le volume d'exclusion de cette colonne a 6t6 d6termin6 au moyen de la thyroglobuline.

La relation lin6aire entre le rapport Ve/V o et le log de poids mol6culaire d6- montr6e par WHITAKER 4 a 6td 6tablie pour les prot6ines suivantes: s6rumalbumine, pepsine, ribonucl6ase et cytochrome c (Ve, volume d'61ution; V0, volume d'exclusion). Nous n'avons pas pu v6rifier cette lin6arit6 pour notre 6chantillon de trypsine dont les coordonn6es se placent en dehors de la courbe de r6f6rence (voir Fig. I).

2.5

1.5

o

1 4

~ s e

epsine epsine

albumine

4.5 5

Log poids mol~culai re

Fig. I. Relation entre le rapport Ve/V o et le log de poids mol6culaire de quelques prot6ines.

Techniques de d~naturation de la ribonucl~ase pH ~2:4-5 mg de ribonucl6ase sont dissous dans o.5-1.o ml de NaOH o.oi N

et cette solution est ajust6e & pH 12.o au moyen de NaOH 2.0 N. Le pH de la solution

Biochim. Biophys. dcta, 115 (1966) 464-47 °

466 P. DE LA LLOSA, C. TERTRIN, M. JUTISZ

est maintenu constant, fl temperature ambiante (2o ° environ), pendant la dur~e de l'op~ration par addition de NaOH o.I N dans un pH-stat (Radiometer). La dur~e de la dfinaturation est de 5 min, 6o min et 4 h. En fin d'op6ration le pH est amen~ fl 5.o avec de l'acide ac&tique fl z % et l'~chantillon est filtr6 sur la colonne de Sephadex.

Oxydation performique: 4 mg de ribonuctfase sent dissous dans o.8 ml d'acide formique pur. o.8 nil d'acide performique* est ajoutfi et la solution est maintenue 4 h fl temp6rature ambiante. On ~vapore sous vide, fl sec, et on reprend plusieurs fois avec de l 'eau afin d'61iminer l'acide. Le r&sidu est dissous dans le tampon acetate de pyridine et filtr6 sur la colonne de Sephadex.

Traitement par l'z~r~e: des solutions 4 M e t 8 M d'ur6e dans le tampon ac4tate de pyridine o.I M (pH 5.o) sont utilisfes pour 6quilibrer la colonne de Sephadex et pour d6naturer la ribonucl6ase. 4.5 mg de cette prot6ine sont dissous dans la solution ddnaturante et, apr6s 20 min fl temp6rature ambiante, introduits sur la colonne de Sephadex.

Apr6s filtration sur Sephadex, les fractions contenant la prot6ine sont recueillies, dialys6es pendant 3 jours contre de l 'eau distill6e et lyophilis6es. Ce produit est de nouveau filtr4 sur colonne de Sephadex dans le tampon ac6tate de pyridine o.I M (pH 5.o), exempt d'ur6e, dans les conditions d6crites ci-dessus.

RI~SULTATS

La Fig. 2 repr6sente les diagrammes de f l t rat ion sur colonne de Sephadex G-ioo de la ribonucl6ase native, de la ribonucl6ase maintenue fl pH 12 pendant 5, 6o, et 24o rain et de la ribonucl6ase oxyd6e par l'acide performique.

Ribonucl6ase o o n a t i v e

. . . . o x y d 6 e

x .......... x 5min ~ phi 12

L / ~ ' \ d ' A ~ N y . . . . y 60 min • pH 12

/ ."Y~'.~ / ......... X . . . . . . . 2 4 0 r a i n a pH 12 / \ .i \.,>,...ix . . . . . . . ©

40C / ~ y/ s s .x'"" Y~.. :,~

• i S / I t t c / / o >:: \~

o / / i ... . V \ \ ' , ~ , / / ~."× , \ / s . . , \ ~ "',

20C / -..~,N?.N:.\ " \ ~ ~ -° / ~: .... . . x . \

/ ./ ..l Cr .., \ ...... 8 . / ,,./ ...,~7 .....

i ...-"? / '*-. . . ~ . .... ,~ ~ / ....... ~, . ; / "-~.~.,,. " .........

c ~- I I I I

3 2 6 - 40 55 70 a5 Volume d'61ution en ml

Fig. 2. D i a g r a m m e s de f i l t ra t ion sur colonne (0.9 cm x 124 cm) de Sephadex G-Ioo de la ribo- nucl6ase: na t ive , oxyd6e, et m a i n t e n u e ~ p H 12 p e n d a n t 5, 60 et 240 rain. T a m p o n ac6 ta te de pyr id ine o.I M (pH 5.o), f ract ions de 0. 5 & o.8 ml.

* Pr6par6 en m61angeant 9 ml d 'ac ide Iormique fl 99 }/o avec i ml d 'H202 5. 3 ° °/o (Merck). Cet te so lu t ion est m a i n t e n u e 2 h & t e m p 6 r a t u r e a m b i a n t e a v a n t son ut i l i sa t ion .

Biochim. Biophys. Acta, 115 (1966) 464-47 °

D]~NATURATION ET ENCOMBREMENT MOL]~CULAIRE 467

L'examen de la Fig. 2 montre que la ribonucl6ase native donne un pic symf- trique (Ve = 65 ml) caract6ristique d'une prot6ine homog6ne. Le maintien de la ribonucl6ase ~ pH 12 se traduit par l 'apparition, aprils 5 rain, d 'un 6paulement qui, au bout de 60 rain, se transforme progressivement en un deuxi6me pic, cette trans- formation 6tant pratiquement achevde en 4 h. Ce dernier pic, presque symdtrique, est moins retard6 (Ve = 54 ml) sur Sephadex que celui correspondant ~ la ribonucl6ase native. Apr6s l 'oxydation performique on observe un pic encore moins retard4 que le pr6cddent dont le Ve est dgal ~ 47 ml et dont l 'aspect n'est pas celui d'une prot6ine strictement homog6ne.

La Fig. 3 montre les r6sultats de la filtration de la ribonucl6ase d'une part dans le tampon habituel et d 'autre part dans ce m6me tampon mais en pr6sence d'ur6e 4 Met 8 M. Le volume d'61ution Ve de la ribonuclfase diminue ~ mesure que la concen- tration en ur6e augmente. Le pic obtenu dans l'ur6e 4 M se place entre ceux observ6s pour la ribonucldase native et pour la ribonucl6ase filtr6e dans l'ur6e 8 M.

:~-'-x R ibonuc l6ase

\ n a t i v e / i o o dar ts l ' u r~e 4M L

0 1.00C " ×. ........ x dams I ' u r6e 8M

E : ./ \ o : ~ / •

: ,/,. \

~ :. / '\ "~ ~ I x .

: I" ""x - ~ . I '.,..

x x "x "x" /

I 2 5 4 0 5 5 70 8 5

Vo lume d '61u t i on en ml

Fig. 3. D i a g r a m m e s de f i l t rat ion sur colonne (0.9 cm × 124 cm) de Sephadex G- ioo de la ribo- nucl6ase dans le t a m p o n acdta te de pyr id ine o.I M (pH 5.0) et en pr6sence d 'ur6e 4 M e t 8 M.

T A B L E A U I

VARIATIONS DU RAPPORT Ve/Vo ET DU "POIDS MOL]~CULAIRE A P P A R E N T " SUIVANT L'I~TAT DE LA

RIBONUCLEASE

Ve, v o l u m e d'61ution; V0, vo l ume d 'exc lus ion; PMA, "poids mol6culaire a p p a r e n t " (voir le texte) ; !R, r appor t PMA/PM, PM ~ tan t le poids mol6culaire r6el de la r ibonucl6ase (ou de la r ibonucl~ase oxyd6e).

I~tat de la ribonucldase Ve/V o P M A R

Prot6ine na t i ve 2.5o 13 600 i .o D 6 n a t u r a t i o n ~ p H 12 (4 h) 2.04 25 500 1.9 O x y d a t i o n pe r fo rmique 1.72 42 ooo 3.0 Prot~ine darts l 'ur6e 4 M 1.87 34 ooo 2. 5 Prot~ine dans l 'ur6e 8 M 1.48 59 ooo 4-3

Biochim. Biophys. Acta, i15 (1966) 464-47 °

46S P. DE LA LLOSA, C. TERTRIN, M. JUTISZ

Quand on repasse la prot6ine apr6s 61imination de l'u%e sur la colonne de Sephadex dans le tampon ac6tate de pyridine, la courbe de filtration reprend la m~me position que celle de la prot6ine native.

Le Tableau I donne les variations du rapport Ve /V o suivant l%tat de la ribonu- cl6ase; la protdine native pr6sente le rapport le plus 61ev6. En rapportant ces valeurs sur le diagramme de la Fig. i, nous avons calcul6 pour chaque cas un "poids molfcu- laire apparent". Les valeurs ainsi obtenues sont plus 61ev6es pour la pro%ine d6natur6e que pour la prot6ine native. Enfin, dans la derni6re colonne de ce tableau, nous avons indiqu6 les chiffres du rapport poids mol6culaire apparent/poids mol6culaire %el, de la ribonuclfase. Nous avons corrig6 la valeur de poids mol6culaire dans le cas de la ribonucldase oxydde afin de tenir compte des groupes sulfoniques cr~6s par l'oxydation.

DISCUSSION

De nombreux travaux ont 6% faits sur le m6canisme de s6paration de divers compos6s sur Sephadex (voir en particulier r6fs. 4, 6-14). I1 rdsulte de ces recherches que le facteur fondamental d6terminant le comportement d'une moldcule sur colonne de Sephadex est son encombrement mol6culaire, c'est ~ dire les dimensions spatiales de la mol6cule en solution.

\VHITAKER 4, IWATSUBO ET CURDEL 8, ANDREWS 11, et SQUIRE 1'2 ont 6tabli une relation entre le poids mol6culaire de nombreuses prot6ines et leurs volumes d'61ution. I1 existe donc, pour la plupart des prot6ines, un rapport constant entre leur poids mol6culaire et leur encombrement. Nos %sultats montrent cependant que cette re- lation n'est valable que dans certaines conditions : la moldcule pro%ique dolt p%senter une organisation compacte comme c'est le cas pour la plupart des homoprotdines /t l'6tat natif.

La d6naturation de la ribonucl4ase h pH 12 r6sulte de la rupture des liaisons hydrog6ne dans lesquelles interviennent certains r6sidus de tvrosine 1'~. I1 s'en suit une d6sorganisation limitde et irr6versible de la structure secondaire qui affecte Fen- combrement mol6culaire. Les dimensions de la mol6cule dans l'espace augmentent et on observe en consdquence une diminution de la valeur du volume d'61ution Ve. Le rapport R entre le poids mol6culaire apparent et le poids mol6culaire r6el traduit cette augmentation.

L'oxydation performique provoque la rupture des 4 ponts disulfure 1G-is, en- tralnant la destruction de la structure tertiaire de la mol6cule. La d6sorganisation de la structure 4tant plus profonde et plus importante que dans le cas pr6c6dent, l'en- combrement mol4culaire et la valeur de R sont de ce fait plus 61ev6s (R 6gal "L 3.o au lieu de 1. 9 pour la prot6ine d6naturde ~ pH 12).

Dans le cas de la d4naturation par l'ur6e, nous avons observ6 des valeurs de R particuli6rement 61evdes. Ces valeurs augmentent quand la concentration en ur6e passe de 4 M ~ 8 M. I1 est connu que l'u%e provoque la rupture des liaisons hydrog6ne, ce qui entraine un d@liement des chalnes peptidiques. A ce ph6nom6ne s'ajouterait, selon certains auteurs, un effet de "gonflement moI6culaire ''19,2°. Cet effet peut ~tre interpr6% comme la cons6quence d'une adsorption des mol6cules d'ur6e sur la prot6ine~l ~-~.

La notion d'encombrement mol6culaire peut ~tre rapproch6e de celle du "volume hydrodynamique effectif" introduite par SCHERAGA ET MANI)ELKERN 19 (voir aussi

Biochim. Biophys. dcta, 115 (1966) 464-47 °

DI~NATURATION ET ENCOMBREMENT MOLECULAIRE 469

r6f. 25). D'apr~s ces auteurs une mol6cule prot6ique peut 6tre consid6r6e comme une "ellipsoide hydrodynamique effective" dont le rapport des axes et la dimension peuvent 8tre d6termin6s ~ partir des mesures de certaines constantes physico-chimi- ques (constante de s6dimentation, viseosit6 intrins~que, poids mol6culaire, bir6- fringence d'6coulement).

Du fait que la viscosit6 intrins6que est en relation direete avec le "volume hydrodynamique effectif ''19, il est int6ressant de comparer nos r6sultats concernant les variations observ6es pour R dans diff6rentes conditions de d6naturation de la ribonucl6ase avec les variations parall61es de ce coefficient de viscosit6 intrins6que I~]l (r4f. 26). HARRI~'GTON ET SELA 26 ont obtenu les valeurs suivantes de F~]I pour la ribonucl6ase, en (g/Ioo ml)-l: native 0.033, oxyd6e o.116, dans l'ur6e 8 M 0.089. On constate que l 'oxydation entralne une augmentation de la valeur de [~]1 plus im- portante que eelle observ6e dans le cas de la d6naturation par l'ur6e, alors que c'est le contraire pour les valeurs de R (voir Tableau I). On peut en conclure que l'aug~ mentation du "volume hydrodynamique effectif" de la mol6cule dans l'ur6e 8 M est moins importante que celle que nous observons pour son encombrement mo16culaire.

Ce d6saccord pourrait s'expliquer en admet tant que l 'interaction entre les mol6cules d'ur6e et la prot6ine se fasse ~ des degr6s diff6rents d'intensit6; nous pouvons supposer qu'une pattie de ces moldcules, plus faiblement li6e ~ la prot6ine, n'intervient pas dans les ph6nom~nes hydrodynamiques alors qu'elle joue un r61e dans le ph6nom~ne de l 'encombrement mol4culaire.

Le comportement des glycoprot6ines au cours de la filtration sur Sephadex repr6sente un cas particulier d6jt~ signal6 par WHITAKER4: leur volume d'61ution est g6n6ralement plus faible que ne le laisserait pr6voir leur poids mol6culaire. Ce com- portement est dfi probablement tt des particularit6s de structure de ces mol6cules (chaines glucidiques branch6es lat6ralement, solvatation accrue due ~ la pr4sence des r4sidus glucidiques) et non /~ la nature du gel utilis6 pour la filtration. Nous avons en effet v6rifi6 que la valeur du volume d'61ution Ve de l 'ovomucoide par exemple, pr6sentait la m~me anomalie sur polyacrylamide (Bio-Gel P-Ioo, Biorad Lab. Rich- mond, Calif.) que sur Sephadex G-IOO.

En conclusion, il r6sulte de nos observations que la filtration sur Sephadex peut constituer un crit6re pour un type de d6naturation affectant les structures secondaires et tertiaires d'une prot6ine. Elle peut de ce fait ~tre utilis6e pour s6parer une prot6ine native de ses homologues ayant subi ce type de d6naturation.

La valeur du rapport R permet d'6valuer 6galement l 'augmentation de Fen- combrement mol6culaire d'une prot6ine dont les structures secondaires ou tertiaires ont 6t6 atteintes et par tant le degr6 de d6sorganisation introduit par la d6naturation. I1 faut cependant apporter une restriction ~ cette derni6re conclusion: le rapport R peut ~tre affect~ 6galement par une association entre la prot6ine et d 'autres mol6cules en solution comme c'est le cas de la d6naturation en pr6sence d'ur6e.

R~SUra~

L'influence de la d6naturation de la ribonucl6ase par divers traitements (pH 12, oxydation performique, ur6e) sur son volume d'61ution au cours de la filtration sur colonne de Sephadex G-ioo a 6t6 6tudi6e. Ces traitements affectant soit la structure secondaire soit la structure tertiaire de cette prot6ine se traduisent par une modifi-

Biochim. Biophys. Mcta, 115 (1966) 464-47 °

470 P. DE LA LLOSA, C. TERTRIN, M. JUTISZ

cation de son encombrement mol6culaire et partant de son comportement sur Sephadex. La filtration sur gel Sephadex peut de ce fait constituer un critbre de d6sorganisation de la structure d'une prot6ine.

NOTE A LA CORRECTION DES EPREUVES

Alors que ce m6moire 6tait sous presse, nous avons eu connaissance d'un travail r6cent de SAMSONOV 2v dans lequel cet auteur signale que la ribonucl6ase r6duite poss~de un volume d'61ution sur S6phadex G-5o plus faible que la prot6ine native.

(Refu le 12 janvier, 1966 )

RI~FI~RENCES

I H. A. SCHERAGA ET J. A. RUPLEY, Advan. Enzymol., 24 (1962) 161. 2 S. MOORE, Bull. Soc. Chim, Biol., 46 (1964) 1739. 3 N. A. I~RAVCHENKO, G. V. KLEOPINA ET E. D. KAVERZNEVA, Biochim. Biophys. Aeta, 92 (1964)

412. 4 J- R. WHITAKER, Anal. Chem., 35 (1963) 195o. 5 0 . H. LOWRY, ~N. J. ROSEBROUGH, A. L. FARR ]~T I~. J. t{ANDALL, J . Biol. Chem., 193 (1951) 265. 6 j . PORATH, Bioehim. Biophys. Acta, 39 (196o) 193. 7 B. GELOTTE, J. Chromatog., 3 (196o) 33 o. 8 1V[. IWATSUBO ETA. CURDEL, Compt. Rend., 256 (1963) 5224. 9 TH. ~VIELAND, P. DUESBERG ET H. DETERMANN, Biochem. Z., 337 (1963) 303 .

IO G. K. ACKERS, Biochemistry, 3 (1964) 723 . 1i P. ANDREWS, Biochem. J., 91 (1964) 222. 12 p. G. SQUIRE, Arch. Biochem. Biophys., lO 7 (1964) 471. 13 J. KILLANDER, Biochim. Biophys. Acta, 93 (1964) I. 14 T. C. LAURENT ET J. KILLANDER, J. Chromatog., 14 (1964) 317 . 15 C. B. ANFINSEN ET R. R. REDFIELD, Advan. Protein Chem., I I (1956) I. 16 C. H. W. HIRS, J. Biol. Chem., 219 (1956 ) 61i. 17 O. H. SPACKMANN, W. I-[. STEIN ET S. MOORE, J. Biol. Chem., 235 (I96O) 648. 18 W. F. HARRINOTON ET J. A. SCHELLMAN, Compt. Rend. Tray. Lab. Carlsberg, Ser. Chim., 30

(1956 ) 21. 19 H. A. SCHERAGA ET L. MANDELKERN, J. Am. Chem. Soc., 75 (1953) 179. 20 P. Dory Er S. KArz, Abslr. Meeting Am. Chem. Soc., Chicago, 195o, p. 14C. 2I J. KLOTZ, in H. NEURATH ET K. BAILEY, The Proteins, Vol. I, par t B, Academic Press, New

York, 1953, p. 727 . 2z S. E. BRESLER, Biokhimiya, 14 (1949) 18o. 23 A. G. PASYNSKII ET t{. S. CHERNYAK, Dokl. Akad. Nauk SSSR, 73 (I95 o) 771. 24 J. O. RALLS, J. Biol. Chem., 151 (1943) 529 . 25 H. A. SCHERAGA, in Protein Structure, Academic Press, New York, 1961. 26 \V. F. HARRINGTON ET M. SELA, Biochim. Biophys. Acta, 31 (1959) 427 • 27 G. V. S.~r~SONOV, Abhandl. Deut. Akad. Wiss. Berlin, tCl. 3led., 6 (1964) 158.

Biochim. Biophys. Acta, 115 (I966) 464-47 °