Embed Size (px)
Citation preview
V ~ R I E BERNARD
AUGMENTATION DE LA CAPACKÉ PROLIFÉRATIW DE MYOBLASTES HUMAINS DYSTROPHIQUES A L'AIDE
DE L~ANTIG~NE GRAND T ET DE LA TELOMÉRASE
Memoire présenté
B la facult6 des Ctudes supérieures de l'univexsité Laval
pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
NOVEMBRE 1999
National Library I*( of Canada Bibliothèque nationale du Canada
Acquisitions and Acquisitions et Bibliographie Services services bibliographiques
395 Wellington Street 395, nie Wellington ûtfawa ON KIA ON4 Ottawa ON K I A ON4 Canada Canada
The author has granted a non- exclusive licence aüowing the National Library of Canada to reproduce, loan, distriiute or sel1 copies of this thesis in rnicrofonn, paper or electronic fomats.
The author retains ownership of the copyright in this thesis. Neither the thesis nor substantial extracts from it may be printed or otherwise reproduced without the author's permission.
L'auteur a accordé une licence non exclusive permettant à la Bibliothèque nationale du Canada de reproduire, prêter, distriiuer ou vendre des copies de cette thèse sous la forme de microfiche/fdm, de reproduction sur papier ou sur format électronique.
L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation.
La transplantation de myoblastes est une avenue prometteuse pour le traitement de
la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) bien qu'elle soit limitée par certains aspects.
L'autotransplantation est une facette de la transplantation qui permet d'éliminer l'utilisation
d'immunosuppresseurs. Toutefois, les myoblastes de patients dystrophiques ont une
capacité proliférative limitée ce qui restreint leur utilisation en thérapie génique.
Cependant, l'emploi de l'antigène grand T eVou de la téloméme pourrait permettre
d'augmenter leur nombre de divisions.
Les myoblastes d'un patient DMD ont donc été msformés par l'antigène grand T
ethu In télomhse. Le nombre de divisions des cellules télomérase-positives n'a pas eté
augmenté mais elles ont conservé leur potentiel de différenciation. Par contre. la capacité
de prolifération des cellules DMD-Tag ttlomérase-positives a été grandement augmentée
(plus de 55 divisions). Ces myoblastes ont également conservé leur potentiel de
différenciation. Donc, ces myoblastes transformés pourraient constituer une importante
réserve de myoblastes DMD pour la transplantation autologue.
AVANT-PROPOS
Je désire remercier d'abord le Docteur Tremblay pour m'avoir si bien accueillie
dans son laboratoire. pour son encadrement et sa disponibilité et pour son
professionnalisme. Je remercie égaiement tous les membres de l'équipe du laboratoire du
Docteur Tremblay. plus particulièrement Sophie Venin et Pierre-Alain Moisset. qui m'ont
supportée par leün nombreux conseils. leurs encouragements et leur enthousiasme. Le
temps a passé bien vite avec vous.
Un merci spécial à mon partenaire de vie. Sébastien. qui me suppone et
m'encourage depuis mes débuts à l'universit~. À loi et i ma famille. merci pour votre
intérêt porté à mes travaux et à ma réussite.
TABLE DES MATIÈRES
Paoe
... AVANT-PROPOS ..................................................................... i i i
TABLE DES MATIÈRES ............................................................ iv
LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX
INTRODUCTION
I . Muscle sain et dystrophine .................................................... 1 ........................................... 1 . 1 . Composition du muscle 1
7 ....................... 1 .2 . La dystrophinr ........................ .. - .................................. . 7 La dystrophie musculaire de Duchenne 4
2.1. Historique .................................. ............... 4 .................................. 2.2. Aspect clinique de la maladie 6 .................................. 2.3. Dommages au niveau cellulaire 7
2.4. Diagnostic .................................................... 13 2.5. Prévention .................................................... 13
3 . Les thérapies ............................................................. 12 .................................. 3.1. Les thérapie pharmacologiques 12 .................................. 3.2. Les thérapies geniques directes 13 .................................. 3.2.1. LRs vecteurs viraux 13
3 .2.2. Le modèle expérimental .......................... 15 .... 3.2.3. Les résultats obtenus à l'aide des vecteurs viraux 16
...... 3.3. La thérapie cellulaire : la transplantation de myoblastes 17 3.3.1. Les principes de la transplantation de myoblastes ... 1 7 3.3.2. Les résultats obtenus suite à la transplantation
................ de myoblastes ....................... .. 17 ...... 3.3.3. Les limites de la transplantation de myoblastes 20
Page
17 4 . L'imrnortalisation ............................................................. 4.1. Le cycle cellulaire .........................................a. 22 4.2. Les oncogènes .................................................... 24
4.2.1. c-rnyc ............................. ... .... .. ........ 24 .................................................... 4.2.2. E6E7 24 .................................................... 4.2.3. EIA 25
4.2.4. L'antigène grand T .................................. 25 4.3. La télomérase .................................................... 28
5 . La problématique
6 . Le but ...................................................................... 31
METHODOLOGE ET RÉSULTATS
1 . Article 1 ...................................................................... 33
2 . Article 2 ...................................................................... 65
RÉFÉRENCES B IB LIOGRAPHIQUES ........................................... 98
LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES
INTRODUCTION
Figure 1. imrnunofluorescence montrant la présence de la dysrrophine à l'aide d'un anticorps anti-dystrophine ......................................... - 3
Figure 2. Représentation schématique de l'interaction de la dystrophine avec ............................................................................ Ia sarcolemme.. 3
Figure 3. Observation de Gowen ................................................ 6
Figure 4. Principe de régénération musculaire ................................. 8
Figure 5. Enchaînement des dommages causés aux fibres musculaires chez un ...................................................................... patient Duchenne O
Fipre 6. Microphotographie de coupes de muscles normaux et dystrophiqucs (Coloration hématoxyline-éosine) .................................................... 1 1
Figure 7. Microphotographie en fluorescence de coupes de muscles normaux et dystrophiques montrant la présence ou l'absence de dystrophine . 1 1
Figure 8. SchCma du cycle cellulaire ........................................... II 7 3
Fipre 9. Représentation des domaines de ['antigène T impliqués dans 1 ' immortdisation ...................................................................... 26
........ Figure 10. Représentation de la synthèse des télomères par la télomérase 29
................. Tableau 1. Historique de la dystrophie musculaire de Duchenne 5
........ Tableau 2. Caractéristiques des principaux vecteurs viraux et non-viraux 1-4
Page
Article 1
Figure 1. Activité de la telornérase dans les myoblastes infectés par le rétrovirus .......................................................................... 58
Figure 2. Analyse de la longueur des télomères de clones NOR et .............................................................................. NOR-hTERT 59
Figure 3. Expression de la desmine dans les myobiastes normaux et DMD télomérase-positifs ............................................................. 60
Figure 4. Expression de la dystrophine humaine après la transplantation de myoblastes normaux ............................................................. 6 1
Figure 5. Expression de la spectrine humaine après la transplaniation de myoblastes DMD ...................................................................... 62
Figure 6. Mon prématurée des myoblastes normaux. infectés avec le vecteur seul ou infectés h E R T ............................................................. 63
Table 1. Nombre de fibres dystrophine-positives après la tramplanration de de myoblastes normaux et dystrophiques .............................. .@
Article 2
Figure 1. Activité de la telornérase dans les myoblastes DMD-Tag infectés avec le rétrovirus hTERT ............................................................
Figure 2. Expression de la desmine et de l'antigène grand T dans les myoblastes DMD-Tag-hTERT et DMD-Tag ..................................
Figure 3. Courbe de croissance des myoblastes DMD-Tag et - DMD-Tag- hTERT .................................................................... 87
Figure 4. Différences de croissance et de morphologie des DMD-Tag et DMD-Tag-hTERT .................................... .... ............................. 88
Figure 5. Analyse de la longueur des télomères des DMD-Tag et DMD-Tûg-hTERT ...............~..............~....................................... 89
Figure 6. Différenciation des myoblastes DMD-TaghTERT .............. 90
INTRODUCTION
1. Muscle sain et dystrophine
1.1. Composition du muscle
Les muscles existent sous trois formes soit la forme squelettique. cardiaque ou lisse.
Ils occupent des fonctions très importantes dans la physiologie animale. Ces fonctions sont
ce!!?. di'! mouvement, du maintien de la posture. de la stabilité des aniculations et de
dégagement de chaleur. Les muscles squelettiques sont les plus abondants dans le corps
humain et sont constitués de fibres musculaires. Chaque fibre est entourée d'une fine
couche de tissu conjonctif appelée endomysium. Un ensemble de ces fibres enveloppçes
forme ensuite un faisceau qui est délimité par le pénmysium (couche de tissu conjonctif).
Le muscle est forme par l'ensemble de ces faisceaux et enveloppé par une couche de tissu
conjonc tif plus dense nommé I'épirnysium [ 1 1.
La fibre musculaire est l'élément de base du muscle squelettique. Elle est formée
par la fusion de nombreuses cellules musculaires appelées myoblastes qui forment dors
une longue cellule ayant plusieurs noyaux. la myofibre. Chaque myofibre est constituée de
plusieurs myofibrilles qui représentent les dlérnents contractiles des fibres musculaires. Ces
myofibrilles sont constituées en partie d'actine et de rnyosine. En plus de nombreuses
autres composantes, ces deux dernières sont impliquées dans la contraction et le
relâchement des muscles [ I 1.
Pour permettre aux fibres musculaires et i leurs composantes d'effectuer leurs
différentes fonctions, certaines protéines entrent en jeu pour fournir une stabilité à
l'ensemble des fibres et diminuer le risque de cassure de leur membrane lors de la
contraction musculaire. Une protéine importante impliquée dans ce processus est la
dystrophine.
1.2. La dystrophine
La dystrophine est une protéine du cytosquelette située en périphérie du sarcolemme
(membrane plasmique des fibres musculaires) [Z]. Sur la figure suivante. on peut observer
la présence de la dystrophine dans un muscle sain tout en périphérie de la fibre musculaire.
Figure 1. Microphotographie en immunofluorescence montrant la présence de la dystrophine à l'aide d'un anticorps anti-dystrophine.
La dystrophine est une protéine de 427 kiloDdtons [2]. Elle contient à son extrémité
C-terminale un domaine de liaison à la membrane via une autre protéine et à son extrémité
N-terminale un domaine de liaison il I'actine. La partie centrale de la protéine est constituée
de répétitions d'environ 100 acides aminés qui forment un motif en bâtonnet (rod domain)
et d'un domaine riche en cyst6ine [2].
Comme mentionné précédemment, la dystrophine est impliquée dans le maintien de
la stabilité des fibres musculaires en liant le cytosquelette à la matrice extracellulaire.
Plusieurs autres protéines interagissent avec la dystrophine pour remplir ce rôle. II s'agit
des DAP (protéines associées à la dystrophine), des DAG (glycoprotéines assocides a la
dystrophine) et des filaments d'actine (F-Actine). Les differentes DAG et DAP sont au
nombre de six et leur poids moléculaire est respeçtivement de 35, 43, 50, 156, 25 et 59
kiloDaltons [2]. La figure 2 présente un schéma de ces interactions avec le sarcolemme.
Figure 2. Représentation sch6matique de l'interaction de la dystrophine avec le sarco lemme.
Le gène de la dystrophine se retrouve sur le chromosome X, plus précisément sur la
bande 1 de la région 2 du petit bras du chromosome X (Xp21). Le gène de la dystrophine
est d'une longueur de 2,4 Mtgabases et contient 79 exons. Ce gène représente environ 1%
du chromosome X total [2].
La présence de la dystrophine est d'une importance majeure dans le bon
fonctionnement du système musculaire.
2. La dystrophie musculaire de Duchenne
2.1. Historique
Le terme général "dystrophie musculaire" désigne plusieurs maladies héréditaires
yi affectent différents types de muscle. Ces maladies se traduisent par une dégénérescence
et une atrophie des fibres musculaires. Par la suite. les fibres musculaires sont remplacées
par de la graisse et du tissu conjonctif, ce qui donne l'impression d'un grossissement du
muscle [ I l . La forme de dystrophie musculaire la plus répandue et la plus séviire est la
dystrophie musculaire de Duchenne. En effet, elle touche 1 garçon sur 35ûû [3].
Cette maladie est étudi6e depuis déjà plusieurs années. Le tableau suivant présente
les principales découvertes faites sur le sujet [3].
Tableau 1. Historique de la dystrophie musculaire de Duchenne
La dystrophie musculaire est reconnue comme une maladie et la dystrophie musculaire de Duchenne comme un type de dystrophie
La myopathologie microscopique est définie
Confirmation de l'hérédité liée au chromosome X
Ddtection de la créatine kinase pour le diagnostic
Introduction des statistiques de Bayesian pour l'estimation des risques de dystrophie
Localisation des dommages aux muscles et aux mernbrarnes par microscopie électronique et biochimie
Localisation du gene sur le chromosome X
La dystrophie musculaire de Duchenne est allélique
Isolation du gene responsable
identification du produit du gene (dystrophine)
Localisation de la dystrophine sous le sarcolemme, absente dans la dystrophie musculaire de Ouchenne
Transfert de myoblastes dans des souris mdx
1990 Thérapie génique dans les souris mdx
Plusieurs chercheurs ont fait des études sur la dystrophie musculaire de Duchenne et
deux d'entre eux ont marqué l'histoire de cette maladie, Edward Meryon's ( 1807-1 880) et
Duchenne de Boulogne (1806-1875) qui la maladie doit son nom [3].
6
2.2. Aspect clinique de la maladie
La dystrophie musculaire de Duchenne se traduit par des effets observables tôt dans
le développement des jeunes garçons. À la naissance, la taille et le poids sont normaux. Par
contre, la croissance est lente et sous la normale pendant la première année de la vie de
l'enfant. Les premiers symptômes observés chez l'enfants sont d'abord ;
- retard dans le développement
- difficulté pour courir et grimper les escaliers
- chutes fréquentes
- hypertrophie des mollets
Graduellement, les manifestations se multiplient et la maladie s'aggrave. Entre 3 et
6 ans la démarche devient lordotique (avec dtviation de colonne venébrale) et dandinanie
et on commence à voir l'apparition des signes de Gowers. Les signes de Gowen sont des
observations faites sur la façon dont un enfant dystrophique se relève lorsqu'il est au sol.
Figure 3. Observations de Gowers.
Vers l'âge de 5 ou 6 ans, on observe une hypertrophie des muscles suivants;
mollets, fessiers, vaste latéral de la cuisse, deltoïdes et infra-épineux. LRs muscles des
extrémités inférieures et du torse sont plus affectés que les muscles des extrémités
supérieures. Entre 6 et 11 ans, la force des membres et du torse diminue progressivement.
Vers I'âge de 12 ans, l'enfant est confiné il un fauteuil roulant. Les problèmes respiratoires
commencent souvent après que l'enfant ait perdu la capacité de marcher.
Les gersonnes aneintes de dystrophie musculaire de Duchenne succombent à la
maladie entre 10 et 29 ans pour une moyenne de 18.3 ans. Dans 40 % des cas. la mon est
due à un problème respiratoire et dans 10 à 40 46 des cas, à un problème cardiaque [Il.
La dystrophie musculaire de Duchenne peut aussi affecter les muscles cardiaques.
les muscles lisses et le système nerveux central.
2.3. Dommages au niveau cellulaire
Tous les symptômes observés au niveau clinique sont causés par un
dysfonctionnement des fibres musculaires dû à l'absence d'une dystrophine fonctionnelle.
En effet. dans le cas de la dystrophie musculaire de Duchenne. il existe différents types de
mutations au niveau du gène de la dystrophine qui empêchent Iû production d'une
dystrophine normale. Ces mutations peuvent être soit des délétions. des duplications. des
changements de base ou des rnicrod6létions [2]. Comme cette maladie est liée nu
chromosome X. elle affecte en majoritC des garçons. La dystrophie musculaire de Becker
est une autre fome de dystrophie moins sdvere car les mutations causées sur le gène de la
dystrophine n'inhibent pas complètement sa fonction. Il est également possible que des
filles soient atteintes de la maladie- Dans ces rares cas, un des deux chromosomes X
contient la mutation transmise par la mère et l'autre chromosome peut contenir une
mutation spontanée, une structure anormale ou une translocation autosomaie 121.
Dans un muscle sain, la dystrophine sert à conférer une stabilité aux fibres
musculaires lors de la contraction musculaire. Malgré tout, il arrive que des fibres soient
endommagées lors d'une activite musculaire physiologique. Ces fibres sont alors réparées
par le processus qu'on appelle la régénération. Te1 que mentionné précédemment, la
formation des fibres musculaires est due à la fusion de nombreux myoblastes. Il existe, en
périphérie des fibres, des cellules qu'on nomme cellules satellites. Ces cellules ont la
capacitk de se différencier et
endommagées. Elles sont donc
régénérition [2]. Le processus
suivante.
de hisionner pour permettre la réparation de fibres
recrutées Ion du dommage à la fibre pour permettre la
de dégénérescence-régénération est illustré à la figure
Bris de la fibre
Fibres musculiiires . ., L* a Y RigtWriiion
Rkparation de Ia fibre par la fusion de cellules satellites
Figure 4. Principe de régénération musculaire.
Dans un muscle dystrophique c'est le même principe, à l'exception que les fibres
musculaires s'endommagent plus facilement et plus fréquemment dû à l'absence de
dystrophine. Le processus de dégénérescence-régénération est conséquemment plus
fréquent et le nombre de cellules satellites est plus rapidement epuisé. On observe ainsi les
caractéristiques suivantes au niveau des fibres musculaires:
- nécrose
- régénération
- fibrose endomysiale - ramification ou séparation des fibres - variation anomale de la taille des fibres [2]
Les différents dommages causés aux fibres musculaires peuvent s'expliquer par le
processus suivant [4].
-
I Absence de dystrophine 1
- - - -
Instabilité de membrane *
Sortie de composants intracellulaires
Accumulation de tissu fibreux (fibrose)
Contraction excessive
1 Échec de la 1 revascularisation
métabolique
Accumulation de calcium dans les fibres
Rupture des myofilaments
myoblastes
des rnyofibrilles
Diminution de la réserve d 'ATP
> 1 Nécrose 1
Activation de Protéases ca2+ dépendantes
Échec de la Ischémie
Figure 5. Enchaînement des dommages causés aux fibres musculaires chez un patient Duchenne.
Les figures suivantes présentent différents marquages obtenus sur des coupes de
muscles normaux et dystrophiques (Duchenne). À la figure 6, on peut voir facilement la
présence de nécrose dans la coupe de muscle dystrophique (fibres noires), la raille variable
des différentes fibres et la présence de tissus fibreux. A la figure 7, on peut noter l'absence
de dystrophine dans le muscle dystrophique.
Normal D ysvophiq ue
Figure 6. Microphotographie de coupes de muscles normaux et dystrophiques. (Colontion hematoxy line-éosine).
D ystrophique
Fipre 7. Microphotographie en fluorescence de coupes de muscles normaux et dystrophiques montrant la présence ou l'absence de dystrophine.
2.4. Diagnostic
Le diagnostic de la maladie est basé sur trois types d'observation.:
1) variation de l'activité de certains enzymes (créatine kinase (CK) et lactate
déshydrogénase (LDH))
2) observation de mutations dans le gène de la dystrophine par PCR (polymerase
chain reaction) et à l'aide de sondes molécuIaires
3) examen histologique de biopsie musculaire (immunohistochimie) [SI
2.5. Prévention
II n'existe pas de moyen de prévention à la dystrophie musculaire de Duchenne. Par
contre. il existe des méthodes pour détecter la présence de mutations dans le gène de la
dystrophine chez les personnes porteuses et chez les fœtus. Ces techniques de détection
crin! semblables à celles présentées dans la partie diagnostic (au niveau du gène ).
3. Les thérapies
3.1. Les thérapies pharmacologiques
Avant l'arrivée de la ththpie génique, c'est-à-dire avant la découverte du gène
codant pour la dysuophine. plusieurs drogues ont été expérimentées pour raientir la
progression de la dystrophie musculaire de Duchenne entre les années 1930 et 1986. Ces
différents agents incluent les vitamines dont la vitamine E. les androgènes. les stéroïdes
anabolisants, les nucléotides et les nucléosides. I'adrénaiine, les agents vasodilatateurs. les
acides aminés et la péniciilamine [2].
Ces nombreux composés n'ont pas été testés adéquatement au cours des études
cliniques et se sont avérés inefficaces pour limiter les dommages de la dystrophie
musculaire de Duchenne. La prednisone semble par contre avoir un effet bénéfique en
permettant le ralentissement de la perte de force musculaire et l'augmentation de la masse
musculaire [2]. Toutefois. aucun de ces agents thtkapeutiques ne peut guérir la dystrophie
musculaire de Duchenne. Les chercheurs ont dû par la suite concentrer leurs efforts sur un
moyen plus efficace pour limiter les dommages faits par l'absence de dystrophine
fonc tionnetle.
3.2. Les thérapies géniques directes
3.2.1. Les vecteurs viraux
Cette technique consiste 3 injecter dans les muscles de patients dystrophiques un
cenain type de vims comme par exemple le rétrovirus. I'adénovirus. l'herpès vims. le
lentivirus ou le virus associe à l'adénovirus (AAV). Les différents virus utilisés pour cette
technique ne contiennent plus les gènes nécessaires pour leur encapsidation soit les gènes
qui codent pour la capside. I'enveloppe ou les différentes protéines impliquées dans la
formation du virus. Le tableau suivant présente les caractéristiques des principaux vecteurs
viraux et non-viraux utilisés en thérapie génique.
Tableau 2. Caractéristiques des principaux vecteurs viraux et non-viraux.
Vecteurs viraux Caractéristiques ADN qui peut Avantages Inconvdnbnts être introduit
Expression stable Infecte seulement les Rdtrovirus virus Ci AFIN de 8 kb du transgene due cellules en prolifhration
[SI PI 3.5 8 10 kb à son intégration L'integration peut dans le génome causer des mutations
hdte dans le gdnome
Herpes wrus Pl FI
Lentivi rus FI (91
virus Ci ADN double - 8.5 kb brin de 30 a 35 kb
virus à ADN de 150 kb
wrus a ARN de 9.8 kb
Virus associe a virus Z ADN simple l'adénovirus (AAV) brin de 4 a 5 kb
161
Peut infecter les Pas d'expression cellules qui ne se stable du transgene
divisent pas Peut causer des transformations
maiignes Peut causer une
reponse immunitaire contre les cellules
infectées
Peut infecter les cellules qui ne se
divisent pas Peut établir une forme de latence dans certaines
cellules du systerne nerveux
Peut infecter tes cellules qui ne se
divisent pas Peut s'intdgrer
dans le genome
Peut infecter les cellules qui ne se
divisent pas Dans certames conditions peut s'intdgrer à un
endroit spècifique du chromosome 19 Aucune pathologie
associde
L'expression du transgène est tres
courte Ptesente une
certaine tox~cite pour plusieurs
types cellulaires
L'integration peut causer des mutations
dans le génome
Quantite d'ADN qui peut dtre introduite
est tirnitde L'inlegration peut
causer des mutations dans ie genome
ADN nu liposome variable Pas de danger Transfert de gene (vecteur non-viral) bombardement de d'infections virales peu efficace
FI m particules et de tumongenicitd conjugud avec
I'ADN
L'utilisation de ces différents vecteurs est limitée pour la dystrophie musculaire de
Duchenne car I'ADNc de la dysvophine pleine longueur est de I I kb. L'ADNc de cette
dystrophine pleine Iongueur est maintenant cloné et sdquencé [IO] [ I l ] . Une alternative
peut être apportée en utilisant une forme tronquée de la dysuophine. Il existe en effet un
frabgment d'ADN de 6.3 kb qui code pour une dystrophine plus petite qu'on nomme mini-
dystrophine. Cette Mni-dystrophine a d'abord été découverte chez un patient ayant la
dystrophie musculaire de Becker. Chez ce patient. la forme de dystrophine tronquée était
localisée correctement dans les fibres musculaires et le patient avait conservé la capacité de
se mouvoir jusqu'à l'âge de 61 ans [12]. L'expression de cette mini-dystrophine a
également été testée in vivo dans un modèle expérimental 1131. I1 existe égdement une
forme de dystrophine de 3.7 kb (micro-dystrophine) qui a 6té obtenue par manipulations
génétiques et qui permet de restaurer l'activité de la dystrophine chez les souris [14].
3.2.2. Le modèle expérimental
Pour tester ces différents vecteurs viraux dans le contexte de la dystrophie. il existe
un modèle animal qui possède égaiement une mutation dans le gène de la dystrophine et qui
empeche la production d'une dystrophine fonctionnelle. Il s'agit de la souris mdx.
La maladie est égaiement liée au chromosome X. Toutefois chez la souris mdx. la
perte de l'activité motrice est beaucoup plus tardive comparativement 3 l'humain car le
processus de régénération continue des fibres musculaires diminue plus progressivement et
plus lentement. La fibrose prédomine donc seulement chez les souris plus âgées [IS]. Le
modèle mdx demeure quand même un bon modèle pour optimiser les conditions de la
thérapie @nique en tentant de restaurer l'expression d'une dystrophine fonctionnelle dans
les fibres musculaires.
3.2.3. Les résultats obtenus ai l'aide des vecteurs viraux
Certains vecteurs viraux ont éte utilisés pour tenter de restaurer l'activité d'une
certaine forme de dystrophine. En effet. dans la cas d'une injection de rétrovirus contenant
le gène de la mini-dystrophine dans les muscles de souris mdx. 2 à 6 % des fibres
exprimaient la dystrophine tronquée. Ce faible pourcentage est dû en partie au fait que le
rétrovirus n'infecte que les cellules en division. Donc, les fibres musculaires ne peuvent pas
être infectées. Par contre. les cellules satellites peuvent être infectées lorsqu'elles sont
recrutées pour la régénération des fibres endommagées car elles sont alors dans une phase
de prolifération 1161. Des études ont également montré que I'activiré de la glycoprotéine
associée à la dystrophine (DAG) de 43 kDa était aussi restaurée suite i I'injection de ce
type de rétrovirus [7].
Des résultats positifs ont aussi été obtenus dans les muscles de souris rndx à l'aide
d'un adénovirus contenant le gène de la mini-dystrophine. Par contre. dans ce cas. les
résultats Ctaient plutôt variables (5 j. 50 5% des fibres étaient dystrophine-positives 1. Ceci
i'c:ri;:ique par le problème de stabilité d'expression du transgène [16] €71. L'tidéno~inis a
égaiement été utilisé pour introduire le gène de la mini-dystrophine humaine chez un chien
dystrophique (golden retriever). 5 1 % des fibres exprimaient la dystrophine [ 171.
Dans le cas d'injections directes d'ADN. seulement 1 f/o des fibres totales &aient
dystrophine-positives suite à l'injection du gène de la dystrophine pleine longueur dans les
muscles de souris mdx (161.
Ces différents wvaux ne sont qu'un bref aperçu des résultats obtenus à l'aide de
certains vecteurs viraux. Plusieurs ttudes sont réalisées chaque année dans le but de
restaurer I'activite d'une des formes de la dysvophine ou pour exprimer tout autre gène
rapporteur dans les fibres musculaires de modèles animaux dystrophiques à l'aide des
vecteurs viraux. -
33. La thérapie cellulaire: la transplantation de myoblastes
3.3.1. Les principes de la transplantation de myoblastes
Cette technique consiste principalement à injecter des myoblastes ayant le gène de
la dystrophine dans les muscles de patients atteints de la maladie. Certaines cellules
injectées dans le muscle ont la capacité de fusionner et de former de nouvelles fibres qui
contiendront la dystrophine. Ce sont les cellules satellites mentionnées précédemment.
Pour mettre au point cette technique, il existe différentes approches possibles.
D'abord, il est possible d'utiliser des myoblastes sains soit d'humains ou de souris car ils
contiennent déjà le gène de la dystrophine. Mais. il est également possible d'utiliser des
myoblastes de souris mdx ou de patients dystrophiques en ajoutant préalablement le gène
de la dystrophine ou de la mini-dystrophine B I'aide des différents vecteurs viraux ou 1
I'aide d'agents de transfection (transplantation autologue). Ces différentes cellules sont
obtenues à partir de biopsies dans le cas des cellules humaines et à partir de cultures
primaires de nouveaux nés dans le cas des souris. Dans les deux cas. les cellules sont mises
en culture jusqu'à l'obtention du nombre adéquat. Après quoi on peut procéder h la
transplantation.
33.2. Les résultats obtenus suite à la transplantation de myoblastes
Des études chez l'humain ont dEjà été faites au début des années 90 soit un peu
après la découverte du gène de la dysuophine. En effet, chez un adolescent de 16 ans ayant
la dystrophie musculaire de Duchenne, la présence de fibres dystrophine-positives a été
montrée suite à la transplantation de myoblastes d'un donneur [18]. Une autre étude, chez
quatre patients Duchenne, a révélé 80%. 75%. 2 5 8 et 0% respectivement de fibres
exprimant la dystrophine suite à la transplantation de myoblastes provenant de donneurs
irnrnunocompatibles [19]. D'autres résultats ont été obtenus chez six jeunes patients suite B
la transplantation de myoblastes sans utiliser d'immunosuppresseurs. Six mois après la
transplantation, moins de 1 5% des fibres étaient dystrophine-posi tives [?O]. Une
transplantation de myoblastes a également kt6 faite entre deux jumelles monozygotes. Les
deux jumelles étaient porteuses de la maladie mais seulement une était symptomatique. Les
myoblastes de la jumelle non-symptomatique ont été transplantes dans le biceps de l'autre.
Un an après la transplantation, une très faible augmentation de fibres dystrophine-positives
a été observée dans le muscle greffé comparativement au muscle contrôle (présence de
fibres révenantes) [2 1 1.
Ces essais préliminaires se sont avérés peu concluants dû au faible pourcentage de
fibres dystrophine-positives obtenu après la transplantation. Maintenant. les différentes
études se font chez un modèle animal et on attend des résultats concluants et optimisés chez
les primates avmt de refaire de nouvelles transplantations chez l'humain.
Différentes études ont étC faites chez la souris pour tenter d'optimiser I'cxpression
d'un transgène suite à la transplantation de myoblastes modifiés à l'aide de vecteurs \viraux.
5;: tffet, un groupe ii introduit un @ne rapporteur d u s des myoblastes humains
dystrophiques i I'aide d'un rétrovirus. Ces myoblastes ont ensuite été injectés dans des
muscles de souris irnrnunodéficientes. Deux mois après l'injection. on pouvait obsencr la
présence du gène rapporteur dans des fibres nouvellement formées (Xi].
Des myoblastes de cultures primaires de rndx et des cellules de lignées immortelles
de mdx ont étd infectées avec un adénovirus contenant le gène de la dystrophine pleine
longueur et le gène de P- galactosidase. Ces cellules ont ensuite été transplantées dans des
souris mdx. il a été montré que I'expression de la dystrophine et des protéines associées à la
dystrophine était restaurée [23].
Des myoblastes de patient Duchenne ont été modifiés génétiquement in iitro à
I'aide d'un adénovirus contenant le gène de la mini-dystrophine. Ces myoblastes ont par la
suite été transplantés dans muscles de souris immunodéficientes (SCID). Trois semaines
après la transplantation. des fibres dystrophine-positives humaines ont été détectées dans
les muscles des souris [24].
Différentes études ont également été faites pour comprendre cenains m6canismes de
la transplantation de myoblastes. Ainsi, le processus de fusion des myoblastes du donneur
avec ceux du receveur lors de la transplantation a été étudié. Dans cette étude, un
croisement de souris b- galactosidase/mdx a été utilisé pour observer la fusion des
myoblastes avec ou sans irradiation du muscle greffé. Cette recherche a révélé que les
myoblastes injectés, provenant du donneur, pouvaient former de nouvelles fibres en
fusionnant entre eux [25].
Des recherches ont égaiement été faites chez le singe. Des myoblastes provenant de
biopsies musculaires de singes ont été infectés avec un rétrovirus défectif contenant le gène
de Iü p- gaiactosidase. Ces myoblastes ont été transplantés dans 14 singes. Six d'entre eux
étaient sous immunosuppression avec du FK506. Les singes sous irnmunosuppression ont
montré une expression plus importante et plus longue du gène de la P- galactosidase [Xi].
Une autre étude a été faite pour optimiser les conditions de transplantation chez le singe en
u i i i i w i i Jiffirentes quantités de cellules et différents nombres de sites d'injection. La
notexine a kgalement été utilisée dans certains cas pour induire un dommage et stimuler 13
régénération. Les résultats obtenus suite à ces essais sont très encourageants (271.
Jusqu'à maintenant. la transplantation de myoblastes semble une technique très
prometteuse pour permettre de restaurer la dystrophine dans les muscles de patients
dystrophiques. Bien que cette approche soit très intéressante et fort prometteuse, il reste
encore du chemin à parcourir avant d'obtenir la méthode qui donnera une transplantation
très efficace et qui permettra aux patients dystrophiques de récupérer une force musculaire
tout en réduisant la dégénérescence musculaire.
3.3.3. Les limites de la transplantation de myoblastes
Trois problèmes ont été identifiés comme étant responsables du succès limité de la
transplantation de myoblastes.
Un de ces problèmes concerne la faible capacité de migration des myoblastes. Pour
obtenir une surface de transplantation qui touchera le muscle entier. il faut effectuer
plusieurs injections très rapprochées. Ces nombreuses injections. en plus de rallonger le
temps de l'intervention. causent beaucoup de dommages aux muscles traités. Pour palier ce
problème, des études faisant appel à la concanavalin A ont été réalisées au laboratoire du
Dr Tremblay et ont montré que la migration des myoblastes était augmentée en traitant le
muscle à la concanavalin A avant la transplantion [28]. Des travaux faisant appel 5 des
enzymes de dégradation de la matrice extracellulaire (mét;illoprotéinascs) sont également
en cours pour tenter d'augmenter la migration des myoblastes suite à la transplantation.
La réponse inflammatoire est un autre problème qui limite le succes de la
tnnsplantation. En effet. la réponse immunitaire non-spécifique du patient entre en jeu en
libérant des macrophages. des neuuophiles. des cellules NK (natuml killer) et des
médiateurs de I'ioflammation (kinines. prostaglandines, protéines du complément. etc.) [ 11.
Ces différentes cellules et molécules seraient impliquées dans la mort rapide des
myoblastes suite à la transplantation [29]. Jusqu'à maintenant. une étude a montré qu'en
bloquant le récepteur LFA-1, un récepteur impliqué dans l'inflammation. le succès de
greffe était augmenté [30]. L'irradiation et I'utilisation de cytokines anti-inflammatoires
(ex. TGF-P) permettent également de diminuer l'inflammation et ainsi réduire la mon
npide des myoblastes aprés la transplantation.
Le troisième problème qui limite le succès de la transplantation implique le système
immunitaire spécifique du patient. Cette défense spécifique comprend l'immunité
humorale. c'est-à-dire les anticorps, et l'immunité cellulaire, c'est-à-dire les lymphocytes
[Il. Il a été montré qu'il y avait infiltration de lymphocytes CD4+ et de lymphocytes CD&
suite à une transplantation entre donneur et receveur compatible pour le complexe majeur
d'histocompatibilité de classe 1 (MHC- 1) [3 1 ;34. Des études ont égaiement montré la
présence d'anticorps contre les myoblastes ou les myotubes du donneur et contre la
dystrophine dans des transplantation entre donneur et receveur compatibles [33] [34]. Une
soiution au problème causé par la réponse immunitaire spécifique a été tentée par
l'utilisation d'immunosuppresseurs telles la cyclosponne [35] [36] oc la cyclophosphamide
[37]. Toutefois. ces imrnunosuppresseun se sont avéres peu satisfaisants pour ce type de
transplantation [38] [39]. Le FK506 est un autre immunosuppresseur qui s'est révélé plus
efficace dans le cas de transplantation de myoblastes [25] [26].
Cependant. I'utilisation d'immunosuppresseurs sur une longue période peut causer
des effets secondaires importants telles une neurotoxicité et une néphrotoxicité (401 et rend
le système immunitaire du patient défaillant. ce qui le rend plus susceptible aux infections.
Une alternative peut être apportée pour éliminer I'utilisation d'imrnunosuppresseun. En
effet. I'autotransplanration. qui consiste i greffer les cellules du patient. permettrait
d'éliminer les immunosuppresseurs. II s'agit de faire proliférer les myoblastes en culture et
d'y introduire le gène de la dystrophine avant la transplantation. Toutefois. les myoblasres
JC patients dystrophiques ont une capacite de prolifëration encore plus Iimitie que des
myoblastes sains [JI]. Et pour obtenir un succès de transplantation. il faut greffer un grand
nombre de myoblastes. Des calculs sommaires ont déjà été faits et on évalue ce nombre à
50 millions de rnyoblastes/cm~ Donc. pour obtenir le nombre adéquat de myoblastes pour
la transplantation, une possibilité envisagée est d'augmenter la capacité proliférative des
cellules. Plusieurs approches peuvent être utilisées et font appel 2 certains gènes impliquis
dans l'immortalisation des cellules.
4. L'immortalisation
4.1. Le cycle cellulaire
La majorité des cellules saines a la capacité de se diviser pour former d'autres
cellules et ainsi permettre leur expansion. Ce processus de division fait appel au cycle
cellulaire qui est composé principalement de cinq phases. La phase Go est l'étape OU les
cellules sont dans un état de latence. C'est à la phase Gi que le processus de division débute
par une augmentation de la synthèse des protéines et un accroissement de la taille des
cehles. À la phase S, il y a synthèse de l'ADN et les derniers enzymes et protéines sont
synthétisés à la phase Gz. Aux phases S et G2, il y a toujours accroissement de Ia taille des
cellules. Finaiement. la phase M amène à la formation de deux cellules filles. Cette Ctapc de
la mitose est divisée en quatre phases soient la prophase. la métaphase. l'anaphase et la
télophase [ 11. Les principales phases du cycle cellulaire sont présentées 3 la figure suivante.
Figure 8. Schéma du cycle cellulaire.
Plusieurs molécules sont impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire. Les deux
principales, impliquées dans le cas présent, sont p53 et pRb. Ces molécules sont des
suppresseurs de tumeur c'est-à-dire qu'elles empêchent les cellules d'entrer dans une phase
de prolifération illimitée.
Le d e principai de p53 est de répondre à un dommage causé à l'ADN et d'arrêter
le cycle cellulaire dans la phase GI pour permettre à la cellule d'effectuer les réparations
nécessaires avant de poursuivre son cycle de réplication. La protéine p53 a une durée de vie
très courte mais elle s'accumule dans les cellules où l'ADN est endommagé ou lors d'un
cycle cellulaire.
hypophosphorylé, il est sous sa forme active et bloque le cycle ce
stress important [42].
pRb agit également au niveau G i du Lorsque pRb est
llulaire en Gi . En
présence de cyclines-CDKs. il devient phosphorylé et inactif. Sous cette forme inactive. les
cellules peuvent entrer dans la phase S et poursuivre jusqu'à la phase M [43].
Le contrôle du cycle cellulaire implique plusirurs autres molécules et voies de
signalisation qui forment un système très complexe [U] (451 (461.
Les cellules ne se multiplient pas indéfiniment même si aucun dommage ou stress
nwcst causé i 1â cellule. En effet. toutes les cellules diploïdes humaines normales ont une
capacité de prolifération limitée et entrent en sénescence après un cenain nombre de
divisions [47]. Les cellules en sénescence sont toujours viables mais ne proliferent plus. Ce
phénomène de sénescence s'explique par le raccourcissement des télomères. Les télomères
sont de courtes skquences rCpétées aux extrémités des chromosomes qui permettent de
stabiliser les bouts des chromosomes et de protéger les chromosomes contre la
recombinaison entre eux. À chaque division. l'extrémité des chromosomes diminue dû à la
réplication serni-conservative de l'ADN [48]. Plusieurs études ont montré une corrélation
entre le raccourcissement des télomères et la sénescence des cellules [49-5 1 1.
4.2. Les oncogènes
Bien que plusieurs mécanismes de contrôle du cycle cellulaire existent. les cellules
peuvent devenir tumongéniques. Plusieurs gènes sont responsables du dysfonctionnement
du cycle cellulaire. Ces gènes sont nommés oncogènes. Les principaux oncogènes étudiés
jusqu'à maintenant pour I'immortalisation de cellules humaines sont c-myc. E6E7 de
papillomavirus, EIA de l'adénovirus et l'antigène grand T de SVIO. Tous ces oncogènes
ont une origine différente et la majorité proviennent de virus.
4.2.1. c-myc
Tout d'abord. le gène c-myc produit une protéine nucléaire qui est exprimée dans
plusieurs types de cellules et qui est induite par la stimulation de facteurs de croissance de
cellules quiescentes. C-myc contient un domaine de liaison E l'ADN. un domaine de
dimérisation et un domaine d'activation. La protéine c-myc est impliquée dans le contrôle
de la prolifération des cellules immatures. C-myc serait fortement exprimée dans les
cellules hématopoïétiques et gasuointestinales immatures et en prolifëration. Cette
expression diminuerait grandement lorsque les cellules entreraient en différenciation [El.
Donc. si c-myc est continuellement exprimé h un haut niveau. les cellules demeureront
indifférenciées et à un stade de prolifération. Une étude révèle égalrmrnr que la mol~cule
p53 senit liée à l'immortalisarion par c-myc [53].
E6 et E7 sont des oncogènes viraux CU ils sont retrouvés dans le papiIlomavirus
humain de type 16 (HPV-16), un type de virus à haut risque car il est impliqué dans
certaines tumeurs du cerveau. Ces deux gènes ont déjà été utilisés pour immortaliser des
fibroblastes primaires [Hl, des cellules épithdliales [55] (561, des kératinocytes [57] et des
cellules des muscles lisses [58]. E7 agit en se liani à la forme hypophosphoryié de pRb. ce
qui permet aux cellules d'entrer dans la phase S (synthèse) du cycle cellulaire. E6 agit au
niveau de p53 en favorisant sa destruction par une voie protéolytique. Des résultats récents
ont montré que l'expression simultanée de E6 et E7 permettait de prolonger ladurée de vie
des myoblastes humains [59].
ELA est également un oncogène viral. Li provient de I'adénovirus humain et existe
sous deux différentes formes soient en une protéine de 243 acides aminés ou une protéine
de 289 acides aminés. Les deux produits de E 1A peuvent immortaliser des cellules
primaires et complémenter le gène ras activé pour transformer ces cellules [52]. Des études
ont effectivement montré que le gène EIA pouvait immortaliser des cultures primaires de
cellules épithéliales [60] [6 1 1.
4.2.4. Antigène grand T
L'antigène grand T provient du virus simien 40. 11 existe deux types d'antigène T:
le .srnail t antigenm et le MI-e T antigem. C'est le *large T antigenn qui est impliqué dans
I'immortdisation des cellules. L'antigène grand T est une phosphoprotéine nucléaire
contenant 708 acides ;iminés. Cette protéine peut interagir avec plusieurs types de protéines
cellulaires soient p53, pRb. p107, DNA polymerase a. le facteur de transcription AP-2, la
protéine de choc thermique p73 et le TBP (TATA box binding protein). La figure suivante
présente un aperçu des principales régions de la protéine qui sont impliquées dans
1 ' immortalisation.
Signal de
localisation nuciéitire
Doigt de zinc
Région hydrophobe
Figure 9. Représentation des domaines de I'antigène grand T impliqués dans I'irnrnortalisation.
Les domaines A. B et D sont les trois domaines impliqués dans la tnnsformation
cellulaire. Chacun agit sur une cible particulière. Les deux principales cibles sont pRb et
p53. En se liant avec l'antigène grand T, ces deux composes deviennent inactifs et
n'interviennent plus dans la régulation du cycle cellulaire.
II a été montré que I'antigène grand T pouvait empêcher la sénescence normale et
augmenter ainsi la capacité de division de différents types cellulaires tels des myoblastes
[62], des fibroblastes et de cellules éphitkliales 1631. Des travaux identiques ont été réalisés
avec des myoblastes de patients ayant la dystrophie musculaire de Duchenne [Ml. Dans
cette étude, I'antigène grand T était thermosensible, c'est-&-dire qu'il était actif à 33°C et
inactif à 3g°C. Dans ces conditions, une augmentation de la capacité de prolifération des
cellules avec l'antigène grand T cultivées à 33°C a été observé. II a égaiement été observé
que les mêmes cellules cultivées à 3g°C retrouvaient leur capacité de fusionner. D'autres
équipes avaient également effectué les mêmes expériences mais sur des myoblastes
humains sains [65] et sur des myoblastes de souris mdx [66].
D'autres équipes ont utilisé I'antigène grand T thermosensible sous le contrôle du
promoteur du gène de la vimentine pour permettre d'éliminer l'expression de l'antigène
grand T dans les fibres musculaires de souris [67] et d'humains [68] [69]. En effet, la
protéine vimentine est expximCe dans les myoblastes en prolifération et est ensuite rtprimée
lors de la hision. Donc. la production de I'antigène grand T est réprimée par la répression
du promoteur vimentine lors de la différenciation et ensuite l'antigène grand T résiduel est
inactivé en élevant la température à 39°C [67].
Bien que ces différentes équipes aient montré que les cellules immortalisées avec
l'antigène grand T pouvaient garder leur capacité de différenciation soit par l'utilisûtion du
promoteur vimentine et/ou par la présence d'un antigène grand T thermosensible. une autre
équipe a montré que I'antigène grand T interférait avec certains Facteurs de différenciations
spécifiques aux cellules musculaires [7O].
En effet. des tnvaux réalisés au laboratoire du Dr Tremblay ont montré que des
myoblastes transformés avec l'antigène grand T thermosensible donnaient un succès de
transplantation très inférieur i une tnnsplantation contrôle [71]. Des hypothèses pour
expliquer ces mauvais résultats ont été apportées. II peut s'agir d'un mauvais
fonctionnement du processus de maturation et de fusion dû à la présence de l'antigène
grand T dans les myoblastes ou d'un problème de survie des cellules in r.h*o.
Jusqu'à maintenant. les types d'oncogènes énumérés faisaient appel à un arrêt du
cycle cellulaire par l'intermédiaire des molécules p53 et pRb. Ces différents oncogènes
permettent aux cellules d'augmenter leur nombre de divisions en réussissant à leur faire
franchir le cap de la senescence qu'on nomme aussi M 1. Comme mentionné précédemment
la sénescence est due au raccourcissement des télomères. Lorsque les cellules saines
atteignent une longueur critique de télomères, elles entrent en sénescence. Par contre. les
cellules transformées par des oncogènes ont la capacité de franchir ce point critique.
Cependant, un deuxième point critique est atteint par ces cellules car le ra~~ourcissement
des télomères continue au cours des divisions. On nomme cette étape l'état de crise ou M2
[73]. L'état de crise est atteint par les cellules transformées car les télomères sont
raccourcis au maximum ce qui provoque une sévère instabilité chromosomique [73].
4.3. La télomérase
La télomérase est une autre molécule qui est impliquée dans I'immonalisation. La
télomérase est une transcriptase inverse qui est nécessaire au maintien de la longueur des
télomères. Comme mentionné préctdemment, les télomères sont de courtes répétitions de la
séquence TTAGGG. Ces séquences sont nontodantes mais elles sont responsables du
maintien de la conformité des chromosomes.
En fait. la télomérase est une ribonucléoprotéine c'est-à-dire qu'elle possède une
partie d'ARN et une partie protéique. La partie ARN de la télomérase sen de ?abait pour
-;en!-r les séquences répétées aux extrémités des chrornosomcs en reconnaissant les
séquences riches en G [74] [75;75]. La télomérase permet donc aux cellules de se multiplier
plus longtemps en évitant d'atteindre I'Çtat de sénescence et l'état de crise causés par le
raccourcissement des télomères. La figure suivante représente le mécanisme par lequel la
télomérase permet un allongement des télornères.
I l 5 '
Sous-unité ARN de Ia télomérase
8
\ 8 #
' \ . ' \
. ' 3 5 '
Figure 10. Représentation de la synthèse des télornères par la télomérase.
La télomérase n'est pas exprimée dans les cellules somatiques normales. Par contre.
plusieurs travaux rapportent qu'il y a réexpression de la télomérase dans les cellules
cancéreuses. En effet. dans plus de 90 % des tumeurs il y a présence d'une téloménse
active [76]. Il a donc été possible de faire une condlation étroite entre la réexpression de
télomérase, la longueur des télomères et l'immortalisation des cellules cancéreuses.
Différentes études ont montré que l'introduction du gène de la télomérase dans
différents types de cellules permettait en effet d'augmenter leur nombre de divisions. La
sous-unité catalytique de la telornérase humaine (hTERT), qui est maintenant clonée
[77:78], a été introduite dans des fibroblastes humains à l'aide d'un rétrovirus[79]. Ce
eroupe de recherche a pu détecter l'activité de la télomérase. une augmentation de la C
longueur des télomères et une augmentation de la capacite de prolifération des fibroblastes
en question. Ce même type d'études a également été effectué sur d'autres types de cellules
humaines et a Çgalement montré que les cellules exprimant la télomérase avaient une
capacité de prolifération supérieure [8O].
Différents travaux ont également montré que l'introduction de certains oncogènes
dans des cellules permettait I'activation de la télornérase. En effet. E6 et E7 ont été
introduits dans des cellules épithéliales bronchiques humaines et on a pu observer une
activation de la télomérase [81]. Le même cas a été observé pour I'oncogène c-myc dans
des cellules épithéliales humaines [82]. U a également été montré que l'introduction de la
téloménse dans des cellules uansformees avec cenains oncogènes permetrail de passer au
delà de l'état de crise M2 [73] [83:83].
5. La problématique
L'un des problèmes majeurs lié à la transplantation des myoblastes est causé par la
réponse immunitaire spécifique qui implique l'utilisation d'immunosuppresseurs tel le
FK506. Une alternative pour pallier ce problème est de procéder à une auto~ansplûntation
en utilisant les myoblastes du patient préalablement modifiés génétiquement. Cependant.
cette technique est limitée par la faible capacite de proliféraion des myoblastes
dystrophiques. Cette approche deviendrait donc possible en augmentant la capacité
prolifërative des myoblastes de patients DMD. Toutefois. il faut trouver la bonne méthode
qui permettra aux myoblastes de se multipiier suffisamment mais sans causer de tumeur. II
est également important que les myoblastes ans formés puissent entrer dans la phase de
différenciation pour ainsi former des fibres musculaires et permettre une régénération
efficace du muscle.
6. Le but
Le but de ce projet de maîtrise est donc d'augmenter la capacité proliférative des
myoblastes humains de patients dystrophiques tout en conservant leur capacité de
différenciation. Dans cette perspective, nous avons choisi deux approches différentes:
1 ) avec la télomérase
2 ) avec l'antigène grand T en combinaison avec la tdomérase
Effectivement, des études antérieurs [79] [80] nous laissent croire que la téIomense
permetua de maintenir la longueur des télomères et ainsi augmenter le nombre de divisions
des cellules l'exprimant. La combinaison de l'antigène grand T et de la télornérase ont
également donnée des résultats intéressants en permenant de surpasser l'état de crise 1731
[83]. Les deux approches choisies semblent donc prometteuses pour atteindre le but fixé.
La partie suivante de ce mémoire introduit deux articles qui présentent la
méthodologie et les résultats obtenus suite à la transformation de myoblastes humains de
patients dystrophiques par la télomérase et l'antigène grand T en combinaison avec la
télomérase. Un résumé de chaque article est égaiement joint à chacun.
33
1. Article 1
Transplantation dans la souris SCID de myoblastes normaux et dystrophiques
exprimant le gène de la télomérase.
Résumé
La capacité proliférative limitée des myoblastes humains dystrophiques limite sévèrement
leur capacité à être modifiés génktiquement et utilisés pour la transplantation de
myoblastes. L'expression forcée de la sous-unité catalytique de la télomérase peut prévenir
l'érosion des télomères et immortaliser plusieurs types cellulaires. Nous avons ainsi testé la
capacité de la télomérase à immortaliser les myoblastes et ses effets sur le succès de la
transplantation de myoblastes en exprimant le gène encodant la télornérase dans des
myoblastes 5 l'aide d'un vecteur rétroviral. L'expression de la télomérase n'augmente pas
hignificativement la durée de vie des myoblastes. Les télomères se sont allonges à une
longueur qui peut eventuellement inhiber la prolifération cellulaire additionnelle. Les
myoblastes exprimant la télomérase sont néanmoins compétents pour participer à la
formation des myofibns si injectés tôt suivant l'infection avec le vecteur rétrovid. Ces
résultats démontrent que l'expression forcée de la télomérase n'empêche pas les myoblastes
normaux et dystrophiques de se différencier in vivo. La probabilité que les myoblastes
exprimant la télornérase soient fonctionnels, dès que les conditions appropriées pour
sumonter la capacité proliférative limitée seront atteintes. est également bonne â la vue de
ces résultats.
Transplantation in SCID mouse of normal and DMD myoblasts expressing the telomerase gene
Sophie seigneurin-venin1, Valéne ~ernard l , Pierre-Alain ois set l , Michel M .Ouellettez, Vincent ~ o u l ~ ~ , Woodring E. wnght2 and Jacques ~ . ~ r e r n b l a ~ l * ~
1, Laboratoire de Génétique Humaine, Université Laval and CHUQ PavillonCHUL. Québec.
Canada. 2705, boul. Laurier Ste-Foy (Qc). Canada G 1 V4G7 Tel : (4 18) 654-2 186 F a : (4 18) 654-2207
3 - Department of Ce11 Biology and Neuroscience. The University of Texas Southwestern Medicd Center, 53 23 Harry Hines Boulevard. Dallas, Texas 75235-9039.
URA CNRS 2 1 15, Université Pans 6, Faculté de médecine Pitié-Sûlpétriére. 105
Boulevard de 1' hôpital. 75634 Paris Cedex 13. France
3 Address for correspondance : Dr Jacques P. Tremblay Laboratoire de Genétique humaine CHUQ Pavillon CHUL 2705, Boul. Laurier Ste-Foy (Qc), Canada G 1 V 4G2
Tel : (418) 654-2 186
Fax : (4 18) 654-2207
h a i l : jacques-p.tremb1ay @ crchul.ulaval.ca
Running title : Transplantation of telomerase expressing myoblasts
SUMMARY
The limited proliferative capacity of dystrophic human myoblasts severely lirnits their ability
to be genetically modified and used for myoblast transplantation. The forced expression of
the catalytic subunit of telomerase can prevent telornere erosion and c m imrnortalize different
ce11 types. We thus tested the ability of telomerase to immortalize myoblasts and analyzed the
e ffect of telomerase expression on the success of myoblast transplantation. The telomerase
expression did not significantly extend myoblast iifespan because the telorneres elongated to
a size that may bave eventually inhibited further ce11 proliferation. The telomerase expressing
myoblasts were nonetheless competent to participate in myofiber formation after infection
with the retroviral vector. However, the new fibers obtained are less numerous and have a
smaller size than afier the transplantation of normal myoblasts. These results demonstrate that
the forced expression of telomerase does not block the ability of normal or dystrophic
myoblasts to differentiate in vira. The proliferation of telomerase positive myoblasts may be
increased by using a less powerful or an inducible promotor to control the telomense gene.
OVERVIEW
Ex vivo gene therapy of Duchenne Muscular Dystrophy is currently limited by an insufficient
number of DMD myoblasts that c m be expanded, genetically modified and reimplmted into
the patient' s muscle. To overcome this problem, we tested the ability of telomerase to
increase the proliferative capacity of DMD myoblasts and the transplantation success of these
genetically modified myoblasts. This fmt generation of telomerase positive myoblasts did not
have a significantiy extended life-span but formed some muscle fibers foilowing
transplantation.
Keywords: myoblast transplantation, telomerase gene expression, Duchenne Muscular
Dystrophy, SCID mouse
INTRODUCTION
Myoblast transplantation has been proposed for a potential treatment of Duchenne Muscular
Dystrophy (DMD). Many triais involving the transplantation of myoblasts from healthy
donors in muscles of dystrophic patients have been done However. the success of
myoblast transplantation in Duchenne patients has been limited to date. This has been
attributed to several major problems. One difficulty is the presence of a specific immune
response against myoblasts not originating from the host (allotransplantation or
xenotransplantation) 6. Our group and others have shown that the immune response
ioiiowing allotransplantation cm be controlled in mice and monkeys by immunosuppression
with FK506 ? v 8 . However, prolonged treatment with irnrnunosuppressants has been shown
to cause severe secondary effects including neuro- and nephrotoxicity 9. The transplantation
of ex vivo genetically corrected myoblasts isolated originally from the DMD patient would
avoid the immune response and the need of immunosuppressive treatment.
The successful transplantation of autologous engineered myoblasts requires their
proliferation in vitro afier genetic modification and an intact capacity to fuse and differentiate
to mature fibers upon transplantation. DMD myoblasts corrected ex vivo with the
rninidystrophin cDNA have dready been transplanted with success in the SCID mouse Io.
However, a much larger quantity of cells would need to be iransplanted in DMD patients in
order to correct the dystrophic defect. This would require a prolonged expansion of the
rnyoblasts in culture before transplantation. Such autologous transplantation of genetically
corrected myoblasts is faced with the problem that myoblasts (satellite cells) of even younp
(5-6 -Yeu old) DMD patients have already undergone extensive divisions in an attempt to
regenerate the damaged fibers. Because their replicative life span is almost completely
exhausted, they rapidly become senescent in culture and cannot, therefore. be expanded
enough for transplantation ' '. We and others have reported that the expression of specific oncogenes such as SV40
large-T antigen (Tag) extends the cultured life-span of mouse or human myoblasts by about
20 divisions I2, l3. However, we observed that the expression of Tag in myoblasts largely
reduced their transplantation success in mouse muscle 14,
Myoblast replicative senescence is Iikely to be a resolt of the progressive telomere
shortening that occurs at each division 15* 16. Mammalian telorneres containine TTAGGG
repeats are located at the end of chromosomes and are essential for the stability of the
genome. Telornerase is a specialized reverse transcriptase which catalizes the addition of
telomeric DNA repeats ont0 the ends of the chromosomes 1 7 . Telornerase is m i ~ r in
germiine and cancer cells. but is not expressed in most human somatic tissues. The human
telomerase reverse uanscriptase subunit (hTERT) has been cloned 19 . Restoration of
telomerase activity by transient expression of hTERT in human epithelial cells and fibroblasts
resulted in a dramaric extension of their life-span ?O. (Morales & accompanying Geron
papers). Expression of telomerase might thus increase the proliferation capacity of DMD
rnyoblasts without the negative effects seen with Tag.
The aim of our work was to venfy whether myoblasts expressing hTERT could be
transplanted with success. Therefore, we have infected normai and DMD myoblasts with a
defective retrovirus expressing hTERT and observed that the pnsence of telomerase activity
did not prevent fiber formation by these geneticdly modified rnyoblasts uanspimted in SCID
mouse.
MATERIALS AND METRODS
Animals
B d b k SCIDhg rnice were used as hosts for al1 transplantations. They were
purchased from Jackson Labontoies, Bar Harbour. Maine.
Primary DMD and normal muscle cultures
Human muscle cultures were obtained from biopsies of two 8 and 1 1 year old DMD
patients and of a normal 13 month old child. Muscles were enzyrnatically treated with
collagenase and trypsin. The resulting primary cells were cultured in MCDB 120
supplemented with 15% fetal bovin serum. 20 n g h l basic fibroblast growth factor (bFGFi.
pcnicillin G (10,00OIU/ml : Gibco BRL, Burlington. Ont. Canada) and streptomycin
( IOm@ml : Gibco BRL) until transplantation.
Normal myoblasts were cloned by Limiring dilution. Several of these clones were
pooled and expanded before retroviral infection. To enrich the two DMD muscle cultures.
myoblasts were FACS soned following immunofluorescent labeling. Following culture. 10 6
trypsinized cells were incubated with an anti-human N-CAM antibody that had be coupled to
phycoerythrin ( 1 /5O NKH 1 antiboby. Coulter electronics of Canada, Burlington. Ont.
Canada). After 15 min of incubation, the cells were rinsed twice, resuspended in PBS and
sorted in a flow cytorneter (Epics Elite ESP Coulter Co, Burlington, Ont. Canada). The
cultures were designated DMD 1 (derived from the 1 I year old DMD patient). DMD2 (derived
h m the 8 year old DMD patient and NOR (derived from the 13 month old child)
Retroviral infection
The coding sequences of the h E R T cDNA with an optimized Kozak sequence was
cloned into the retroviral plasmid pBabepuro under the control of the LTR (long terminal
repeat) viral promotor Vector-only and hTERT-containing retroviral plasmids were first
transfected into the PE501 ecotropic ce11 line. and retroviral supernatants from these were
then used to infect the amphotrophic PA3 17 cell line. The two resulting ce11 population were
then selected in 2.5 pglml puromycin. To harvest the retroviral supernatant. the PA3 17
hTERT cells were grown overnipht in a minimal amount of DMEM high glucose medium
(GIBCO BRL) supplemented with 10% donor calf semm. The next moming. the retroviral
medium was filtered through 0.45 pm filter and frozen at -80' C. The producer cells were
then ûllowed to divide twice. fresh medium was added overnight and new viral supematant
\vas collecred again.
Roughly, 2.10~ DMDI. DMD? or NOR rnyoblûsts were incubated ovemight in 35
mm dishes with 1 ml of either the hTERT or the vector-only retroviral supematant in the
presence of 4 pg/ml polybrene. The cells were rinsed and fresh medium was added. The
infected cells were grown in 15% FBS MCDB 120 medium for 48 h. then selected for two
weeks with 2 pgml puromycin . To be expanded. the cultures were trypsinized at confluent
density and reensemenced in larger flask until transplantation (one trypsinization
corresponding of one passage).
The behaviour of uninfected, vector-only and hTERT-infected myoblasts were
compued. Because we did not obtain numerous DMDI cells after the ceII-sorting, the): were
al1 infected with the telornerase retrovirus. Al1 myoblasts were tested for trlomense activity
and myogenic marken before uansplantation.
40 Telornerase assays
Roughly, 500,000 myoblasts of each population were lysed as previously described
with 200 pI of CHAPS lysis buffer (Oncor, inc., Gaithersburg, MD). The extract were
subjected to the telomeric repeat amplification protocol (TRAP assay) using the TRAP-eze
telornerase detection kit (Oncor) 22. Relative mount of telomense products were quantified
by autoradiography.
Analysis of telornere length of hTERT-infected NOR clones
Uninfected and hTERT-infected NOR rnyoblasts were cloned by limiting dilution.
One uninfected clone and two hTERT-infected clones were analysed for their telomere
Iength.
1.106 cell of each group were pelleted and resuspended in proteinase K digestion
buffer (200mM Tris, IOOrnM EDTA. 35mM SDS pH 8.5) containin; 0.4 m_o proteinase
W m l . The lysate was incubated at 50°C overnight. then extracted with
phenol/chloroform/isoamyl alcohol and chloroform. The DNA was alcohol precipitared.
rinstxi with erhanol70% dried and dissolved and stored at 4OC in the TE buffer (10 nbl Tris
and 1 mi' EDTA pH 7.5).
4pg DNA were digested with restriction enzymes Hinf I and Rsa I for 3 hr at 37OC.
These enzymes genente TRFs (telomere restriction fragments), which contain the XAGGG
tandem-repeat sequence and a subtelomeric fragment. Digested genornic DNA was resolved
by electrophoresis in 0.7% agarose gel then dried, denatured and then neutralized. The T E S
were detected by hybridization to a ~~P- (TTAGGG)~ probe as descripted 23.
Desmin irnmunocytochemistry
Al1 types of myoblasts were tested for the expression of desmin. which is a marker
for myogenicity.-Cells were fixed and permeabilized with 95% ethano1 for 15 min. Desmin
was then detected by incubation with the monoclonal mouse antibody DE-R-I 1 (If10 ;
Dako, Copenhagen Denmark), followed by incubation with a biotinylated anti-mouse
antibody (Il100 Dako) and then with a CY3 coupled streptavidin complex ( 1/70; Sigma.
Oakville, Ont, Canada).
Fusion capacity in vitro
Normal and DMD rnyoblasts were placed in differentiation medium (DMEM, 5%
horse semm). After 8 days. fusion was quantified by counting the number of nuclei included
in myotubes as a percentaee of the total number of nuclei.
Long term myoblast transplantation
The left and right hind legs of 6 week old SCID mice were irradiated (30 Gy) one
week before the transplantation to inhibit the proliferation of the host myoblasts ?? The
day before transplantation. fiber necrosis was induced in the left and right Tibialis anterior
(TA) with 7 pl of notexin (5 pg/ml), injected directly in the muscle after surgical exposure
The nrxt day. 2x 106 myoblasts were trypsinized. pelleted and resuspended in appmaimately
1U pl of HBSS and injected in roughly 10 sites. A different pair of cells (uninfected venus
hTERT or vector-only versus hTERT) were injected into the left and right TA of each SCID
mouse.
Mouse muscle preparation
The transplanted rnice were killed 4 weeks after the myoblast transplantation. They
were initidly anesthesized with 0.1 ml per 20 g mouse body weight of a solution containing
both ketamine and xylazine at 10 mg/ml. The rnice were then perfused intncardially with
saline (0.9% NaCl with 2 I U / d heparin) for 10 min. The TA muscles were dissected out.
immersed in 30% sucrose ovemighr, mounted in embedding resin, and frozen in liquid
nitrogen.
Dystrophin, spectrin and MHC dass I immunohistochemistry
The presence of dysuophin was determined in muscles transplanted with normal
myoblasts using NCL-Dys3. a specific antibody for hurnan dystrophin ( 1 / 10. Novocasva
Laboratones, Burlington, Ont, Canada) followed by a secondary biotinylated anti-mouse
antibody (111 00, Dako, Mississauga, Ont, Canada) and the streptavidin CY3 ( 1 /7OO,
Sigma). Since DMDl and DMD2 rnyoblasts do not contain a normal dystrophin gene.
muscles transplanted w ith DMD myoblasts were stained w ith the spectrin antibody NCL-
SPEC1 ( 11100. Novocasua) which was revealed with the biotinylated anti-mouse antibody
followed by the CY3 streptavidin. For each experiment. dystrophin or spectrin positive fibers
were counted on the section which presented the most positive fibers. The presence of human
cells was detected using mouse monoclonal antibody W6/33 ( 11 100. ATCC) direcied against
human MHC Class 1 antigens. The binding of this mAb was revealed with an ami-mouse
biotinylated antibody and streptavidin CY3.
Death assay for human myoblasts
The fate of the transplanted normal human myoblasts early after gnfting into SCID
mice (first 5 days) was monitored by measuring the disappeaence of human DNA in the
mouse muscle by PCR. Briefiy, muscles gnfred with 1.6 x 106 uninfected. vector-only or
hTERT infected myoblasts were snap frozen in liquid niuogen. At each time point, the whole
TA muscle was collected and used for the genomic DNA extraction by the standard
proteinase WSDS technique ? Two hundred nanograms of DNA were then used to amplify
a fragment of the glutathione peroxidase (GSHPx- 1 ) gene 28 with the following primers :
ups tream (5'-CTGTGAGCCTGGGCTCCCTGC-3') and downs t ream (5'
-ACGGGAATCCGAGCACCACCAG- 3'). These primers recognize both human and mouse
GSHPx-1 genes (Genbank accession no. Y00433 and no. X03920 respectively) and
produce a single amplicon of 130 bp. However, human and rnouse PCR products which
have k e n competitively arnpiified can be discriminated by SmaI digestion which pmduces a
130 bp fragment for the mouse and two fragments of 100 and 30 bp for the human GSHPx-
1. Relative densitometric analysis of mouse and human PCR products was used as an index
of human myoblasts presence in the mouse muscles (CherniIrnager 4000. ALPHA
INNOTECH CORP). This assay is thus a comparative measure of mouse and human nuclei
using rnouse DNA as a normalization product.
RESULTS
Telornerase activity of infected normal and DMD cells.
Myoblasts obtained from primary cultures of two DMD patients (DMDI and DMDZ) and
from a normal subject (NOR) were either infected with the hTERT retrovims. infected with
the empty retrovims (vector-only), or left as unifected controls. The infected cells were
selected for two weeks with puromycin. Al1 of the populations of myoblasts were tested for
their telomerase activity. Figure 1 shows that only cells infected with the hTERT retrovirus
have telomense activity. In al1 three cases. telomerase expressed in the myoblasts was able to
add TTAGGG repeats onto the 3' end of the substrate oligonucleotide. As expected.
uninfected and vector-only cells were negative for telomense activity (Figure 1 ah )
Proliferative capacity and telomere lenght of telornerase-expressing
myoblasts.
The cunent experiments failed to show a significant extension of lifespan of the
telomerase expressing myoblasts. Telornere lenght analysis demonstrated that a rapid
telomere elongation had occurred, from approximately 8 kb in normal myoblasts to 15-20 kb
in the infected myoblasts. An example of the telomere lenghts of one clone of normal
myoblasts (CIO) and two clones of hTERT expressing normal myoblasts (T24 and T36) are
shown in Figure 2 after 22-24 population doublings. Experiments using human foreskin
fibroblasts suggest that elongation of telorneres to 15-20 kb may be titering out essentid
telomere binding factors and leading to a checkpoint growth arrest (manuscript in
prepantion). Because the telomerase expressing myoblasts may have been approaching this
checkpoint arrest after transplantation. results indicating a compromised function (kwer
myotubes, failure to migrate) are likely to be a consequence of excessive leveis of telomerase
activity that led to a net telomere elongation instead of telomere maintenance. However,
positive transplantation results would indicate that, in spite of these very long telorneres,
telornerase-expressing myoblasts could still hinction and participate in fiber repneration.
Auman dystrophin expression after normal myoblast transplantation in
SCID mice
Populations of nonal, DMD 1 and DMDZ cells were infected with the hTERT
retrovirus or the control vector-only retrovinis, selected with purornycin, and expanded until
their transplantation. The number of ce11 divisions did not exceed 15 doublings before the
transplantation. The myogenicity of each population was tested by immunostaining confluent
cells with a desmin antibody . Results obtained with NOR-hTERT. DMD1-hTERT and
DMDZhTERT are illustrated in Figure 3. Approximately 90% of the NOR-hTERT and
DMD 1 -hTERT myoblasts were desmin positive. indicating that telomerase expression did not
interierg with their high myogenic potenrial (Figure 3 a.b). Fewer (i.e, 508) DMD2-hERT
myoblasts were desrnin positive as indicated on the phase convast picture (Figure 3 c-c').
The fusion capacities of DMD1 and normal cells before and after hTERT infection
was also measured. For DMD myoblasts. after 8 days in differentiation medium. the
maximum level of fusion reached a rnean of 76.3$12% and 74.6*11% for DMD 1 uninfected
and DMDl-hTERT myoblasts respectively. Sirnilar results were obtained with the normal
myoblasts. No differences in the fusion capacities were observed between uninfected and
telomerase positive myoblasts.
Normal myoblasts were trmsplanted in the Tibialis antenor (TA) muscle of SCID
mice. Four weeks after the transplantation, human dystrophin immunostaining revealed the
presence of many new human dystrophin positive fibers throughout the muscles injected with
unin fected normal myoblasts (Figure 4 a). Fewer human dystrophin positive fibers were
observed after the transplantation of puromycin-selected rnyoblasts infected with the
retrovirai vector-only (Figure 4 b). An even lower transplantation success was obtained wirh
the hTERT infected normal myoblasts, and the site of the fibers generated was usually
smaller than that observed following the transplantation of uninfected NOR myoblasts
(Figure 4 c). The results obtained after the transplantation of each type of myoblasts are
summarized in Table 1.
MHC class 1 labeling to identify human cells on the section adjacent to the dystrophin
section revealed the presence of many large mononuclear ce11 clusters of human origin in TA
transplanted with NOR-hTERT myoblasts (Figure 4 f). These human myoblasts seem to
have remained at the injection sites. Although. 90% of the NOR-hTERT myoblasts were
desmin positive and fuse nomidly just before transplantation, these cells lost their myogenic
markers in i+w 4 weeks after the transplantation.
Human spectrin expression after DhID myoblast transplantation in
SCID mice
DMDI and DMD2 myoblasts were also transplanted. As DMD myoblasts do nor
contain a normal dystrophin gene, fiben resulting from the fusion of transplanted myoblasts
were identified by the presence of human spectrin.
The DMDI-hERT and DMD2-hTERT cells were also transplanted at passage 6
(after approximately 15 divisions). Human spectrin labeling showed the presence of few
isolated positive fibers. Le. 224 positive fiben and 20 positive fiben with DMDI-hTERT
and DMD2-hTERT cells respectively(Figure 5 b.c). Better results were obtained with the
DMDI-hERT compared to DMD2-hTERT. reflecting the higher initial proportion of
desmin-positive cells in the DMD I-hTERT culture prior to transplantation (Figure 3 b,c). As
observed with NOR-hTERT myoblast transplantation, abundant human MHC class 1 positive
clusters of mononucleated cells were observed at the site of injection with DMD-hTERT
rnyoblasts obtained from both patients (Figure 5 e-tl.
Survival of normal myoblasts early alter the transplantation.
Uninfected, vector-only and hTERT-infected normal myoblasts were uansplanted in
the TA of SCID rnice to monitor the ceIl death in the fmt five days pst-transplantation. Ce11
survival was quantified by a PCR amplification of human and mouse GSHPx-1 gene in
muscle homogenates. No significative difference in the percentage survival of the three
populations of myoblasts was observed (Figure 6).
The toxic effects of long-term use of immunosuppressive drues such as FK506 or
cyclosporine have been well documented 9. Autologous transplantation of genetically
modified myoblasts from DMD patients has been proposed to avoid these problems. Since
DMD myoblasts have an extremely reduced prolifenting capacity in vitro. it will be necessary
to extend the life-span of these cells in vitro More their autologous transplantation following
genetic correction becornes feasible.
Viral proteins that bind and inactivate the function of p53 and pRB block the M I
rnechanisrn of cellular senescence and extend the proliferative capacity of normal human cells
29. For example. expression of SV40 large T antigen (Tag) significantly expands the cultured
lifcspan of normal and DMD human myoblasts in culture jl. However. expression of
this oncoprotein seems to impair the terminal differentiation of myoblasts 1 3 + j2. We have
found that the success of uansplantation of nomal myoblasts expressing Tag into mouse TA
was considerably reduced. We obtained very few new fibers after two successive
transplantations of 3x 106 ~ a g + myoblasts 14.
Recently, we have nported that it is possible to bypass senescence and exrend the
life-span of epithelial cells and fibroblasts by introduction and expression of the cDNA for
the catalytic subunit of telornerase (hTERT) 20. Because the expression of Tag reduced the
success of myoblast uansplantation, the present series of experiments examined whether the
expression of hTERT reduces the transplantation success of normal and DMD myoblasts in
the Tibialis anterior of SCID mice. Our results demonsuate that the transplantation of
telornerase-positive myoblasts from a normal subject can produce fibers expressing the
human dystrophin gene. Although fewer and srnaller fiben were generdly observed with the
hTERT-expressing myoblasts than with the uninfected controls, our observations show
nevertheless that telornerase expression does not block fiber formation in vivo. However. the
human dystrophin fibers seem to frequently result from the fusion of hTERT-positive
myoblasts together (as indicated by their small size). These new fiben were generaliy were
clustered near the injection site. Moreover, abundant human mononucleated celis remained at
the injection sites. as indicated by the human MHC class 1 immunostaining. We never
observed a sirnilar ce11 population with the transplantation of uninfected myoblasts. A
reduced efficiency of fiber formation was also seen in the vector-only controls. suggesting
that puromycin selection may also contribute to the reduced transplantation success.
However, there was no difference in the in vitro fusion capacity of uninfected and hTERT-
infected myoblasts which could explain the lower transplantation success with the
telornerase-expressing myoblasts.
The telornerase-expressing myoblasts did not show a significantly extended lifespan.
and showed an extreme telomere elongation similar to what has been seen in a clone of
hTERT-expressing fibroblasts. This fibrobiast clone initially showed an extended lifespan
but then stopped proliferating as its telomeres becarne 18 kb long after 130 doublings. This
contrasts with the behavior of other fibroblast clones expressing hTERT that maintained
shoner telorneres and have now accumulated up to 400 population doublings (manuscript in
preparation), although we cannot yet exclude other factors that rnay be preventing the
irnmonalization of these myoblasts. The results we observed suggesting some degree of
compromised function (fewer and smaller fiben. mononucleated ce11 clusten) are likely to be
an cosequence resulting from overexpressed levels of hTERT that led to extreme telomere
elongation rather than telomere maintenance. It may thus be useful to control the level of
expression of the telornerase gene before transplantation, cg. with an inducible promoter. in
order to obtain a more physiological regulation of telomere length in these genetically
modified cells. Moreover, it has k e n show in many previous experiments that massive ce11
death (up to 95-99%) occurs after transplantation 33-39, and that the surviving myobliists
must intensively proliferate in the hast muscle before participatina in fiber regcneration.
However, we observed no significative difference in the percentage of surviving cells
between uninfected. vectorsniy and hTERT-infected normal myoblasts which could explain
the lower success of transplantation with the telornerase expressing rnyoblasts.
While the DMD myoblasts used in these experiments were likely near the limits of
their proliferative capacity before the transplantation (approximately 15 divisions) they were
nonetheless able to form new fiben when transplanted into SCID mice. The differences in
the number of specvin positive fibers obtained with the two populations of DMD myoblasts
cenainly reflects the di fferent percentages of desmin-positive cells between these two
populations before the graft. The DMD2 myoblast population was probably contaminated by
fibroblasts at the time of retrovirai infection.
In conclusion, expression of the telomerase gene could be a new strûtegy for
autologous transplantation of DMD myoblasts. It is possible to obtain some successful
transplantation with this fint generation of telomerase positive myoblasts. We believe that the
reduction in myofiber formation seen in the hTERT-expressing cells is a consequence of the
over-elongation of their telorneres. One solution to prevent this problem may be a weaker
expression of telomerase that stabilizes and maintains the telomere lenght in the myoblasts at
each division rather than increasing it. The ability of telornerase to imrnortalize myoblasts has
not yet k e n established but is actively king persued.
Acknowledgements
The authors thanks F. Tardy. M. Goulet and B. Roy for his technicd assistance. This work
was supported by the Association Française contre les Myopathies (AFM) and the Muscular
Dystrophy Association (MDA) and The National Institut On Aging (Ago 1991)
REFERENCES
1 Gussoni E et al. Normal dystrophin transcripts detected in Duchenne muscular dystrophy
patients after myoblast transplantation. Nature 1992: 356: 435-438.
2 Karpati G er al. Myoblast vansfer in Duchenne muscular dystrophy. Ann. Nntrol . 1993:
34: 8-17.
3 Mendel1 IR er al. Myoblast uansfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy.
N.Engl. J. Med. 1995; 333: 832-838.
1 Law PK es al. Ce11 transplantation as an experimentai treatment for Duchenne muscular
dystrophy. Ce11 Transplantation 1993; 1: 485-505.
5 Tremblay JP et al. Myoblast transplantation between monozygotic twvin girl carriers of
Duchenne muscular dystrophy. Neiimusc. Disord. 1993; 3: 583-592.
6 Tremblay JP and Guérette B. Myoblast transplantation: a bief review of the problems and
of some solutions. Basic AppL M p î . 1997; 7:
7 Kinoshita 1 et al. Very efficient myoblast aIlotransplan~ation in mice under FU06
immunosuppression. Muscle Nerve 1994: 1 7: 1407- 11 15.
8 Kinoshita 1, Vilquin JT and Tremblay JP. Mechanism of incrasing dystrophin-positive
rnyofibers by myoblast transplantation: snidy using rndx.43-Gaiactosidase transgenic mice.
Acta Neuropathol. 1996; 9 1: 489-493.
9 McDiarmid SV et al. FU06 (tacrolimus) compared with cyclosporine for p n m q
irnrnunosuppression afier pediatnc liver transplantation. Trmspiantufion 1995; 59: 530-536.
10 Moisset P-A et al. Successful transplantation of genetically corrected DMD rnyoblasrs
following ex vivo transduction with the dystrophin minigene. Biociieni. Biopizp. Res.
Comm. 1998; 247: 94-99-
11 Webster C and Blau HM. Accelerated age-related decline in replicative Iife-span of
Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for ce11 and gene therapy. Somot Cell
Mol Genet 1990; 16: 557-65.
12 Simon LV. Beauchamp JR, OtHare M and Olsen 1. Establishment of long-term myogenic
cultures from patients with Duchenne Muscular Dystrophy by retroviral transduction of a
temperature-sensitive SV40 large T antigen. Erp. Cell Res. 1996; 224: 264-27 1.
13 Mouly V et al. SV40 large T antigen interferes with adult myosin heavy chah expression.
but not with differentiation of human satellite cells. Erp. Ceil Res. 1996; 225: 268-276.
14 Moisset PA el al. Transplantation of Large T Antigen-Immortalized Myoblasts. Genc
Ther. subrnitted:
15 Counter CM er al. Telomere shortening associated with chromosome insrability is
arrested in immond cells which express telomerase activity. E~nbo J 1992: 1 1 : 192 1-9.
16 Decary S er al. Replicative potential and telomere length in human skeletûl muscle:
implications for satellite cell-mediated gene therapy. Hicm Grne nier 1997: 8: 1129-38.
L T Greider CW and Blackburn EH. Telorneres. telornerase and cancer. Sci ,4111 1996; 27 4:
92-7.
18 Meyerson M et al. hEST3, the putative human telomerase catalytic subunit gene. is up-
regulated in tumor cells and during immortalization. Ceil 1997: 90: 785-95.
19 Nakamura TM el al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeasr and
human. Science 1997; 277: 955-9.
20 Bodnar AG el al. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal humm
cells. Science 19%; 279: 349-352.
21 Morgenstern JP and Land H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral
vectors with multiple dmg selection markers and a complementary helper-free packaging ce11
line. Nudeic Acidr Res IWO; 18: 3587-96.
22 Kim NW et al. Specific association of human telomerase activity with immonai cells and
cancer. Science 1994; 266: 20 1 1-5.
23 Allsopp RC et al. Telomere Iength predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc
Nat1 Acad Sci U S A 1992; 89: 101 14-8.
24 Weller B et al. Inhibition of rnyosatellite cell proliferation by gamma irradiation does not
prevent the age-related increase of the number of dystrophin- positive fibers in soleus
muscles of mdx female heterozygote mice. Am J Pathol 199 1 ; 138: 1497-502.
25 Wirtz P. Loermans H and Rutten E. Effects of irradiation on regeneration in dystrophie
mouse k g muscle. Br. J. Erp. Pathol. 1982; 63: 67 1-679.
26 Harris JB, Johnson MA and Karlsson E. Pathological responses of rat skeletal muscle to
a single subcuteneous injection of a toxin from the venom of the Australian tiger snake.
Notechis scutatus scutatus. Clin. Exp. Plrann. Physiol. 1975; 1: 383 -4W.
17 Sambrook J. Fritsch EF and Maniatis T. Molect~lar cloning: A laboraton ntriririnl. Cold-
Spring Harbor Laboratory Press. Cold-Spnng Harbor. NY. 198%
28 Sukenaga Y. Ishida K. Takeda T and Takagi K. cDNA sequencr coding for human
glutathione peroxidase. Nucleic Acids Rrs 1987: 1 5: 7 1 78.
39 Katakura Y. Alam S and Shirahata S. lmmonalization by gene transfection. rMetliods Cell
Bi01 1998; 57: 69-9 1.
30 Miranda AF, Babiss LE and Fisher PB. Transformation of human skeletal muscle ceils
by simian virus 40. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1983: 80: 6581-6585.
3 1 Iujvidin S, Fuchs O, Nudel U and Yaffe D. SV40 imrnortalizes myogenic cells: DNA
synthesis and rnitosis in differentiating myotubes. Differentiarion 1990: 43: 192-203.
32 VanDeKlundert FAJM and Bloemendal H. SV40 large T antigen-induced inhibition of
terminai differentiation of primary skeletal muscle cells is associated with a block in the
expression of MyoD and myogenin. Mol. Biol. Rep. 1995; 20: 143- 148.
33 Huard J et al. Gene transfer into skeietal muscles by isogenic myoblasts. Hum Gene Ther
1994; 5: 949-58.
34 Beauchamp JR, Morgan JE, Pagel CN and Partridge TA. Dynamics of myoblast
transplantation reveai a discrete minority of precunon with stem cell-like propenies as the
myogenic source. 3 Ce0 Bi01 1999: 144: 1 1 13-22.
35 Beauchamp JR, Pagel CN and Panrïdge TA. A dual-marker system for quantitative
studies of myoblast transplantation in the mouse. Transplanration 1997: 63: 1794-7.
36 Skuk D and Tremblay JP. Complement deposition and ce11 death after myoblast
transplantation. Cell Transplant 1998: 7 : 427-34.
37 Merly F et al. Anti-inflammatory effect of transforming growth factor-betal in myoblast
transplantation. Trmplantation 1998; 65: 793-9.
38 Guerette B et al. Conrrol of inflarnrnatory damage by anti-LFA- 1 : increase success of
rnyoblasr transplantation. C ' l Tmzspliznt 1997: 6: 10 1-7.
39 Guerette B et al. Prevention by ami-LFA-1 of acute rnyoblüst death foilowing
transplantation. J Inzmui~ol 1997: 1 59: 2517-3 1.
FIGURE LEGENDS
Figure 1 :
Figure 2:
Figure 3 :
Figure 4 :
Figure 5 :
Telomerase activity in retrovirally infected myoblasts. (a) Telornerase activity
in NOR uninfected, NOR vector-only and NOR-hTERT myoblasts. (b)
Telomerase activity in DMD2 uninf~ted, DMDî vector-only. DMD7-hERT
and DMD1-hTERT myoblasts.
Telomere length analysis of NOR uninfected clone CIO at 13.9 PDL and
NOR-hTERT clones TS4 at 22*7 PDL and T36 at 22.4 PDL.
(a-c) Desmin expression of normal and DMD telornerase positive myoblasrs
in culture ar confluent density. Desmin immunostaining on (a) NOR-hTERT
myoblasts. (b) DMD 1 -hTERT myoblasts. (c) DMDZ-hTERT myoblasts (c')
phase contrast of (c) picture (a-b original magnification x100. c-c' original
magnification x 100).
(a-c) Human dystrophin expression after normal myoblast transplantation.
Hurnan dystrophin positive fibers on cryostat TA muscle sections rifter (al
NOR uninfected. (b) NOR vector-only. (c) NOR-hTERT myoblast
transplantation. (d-f) Human MHC class 1 expression after myoblast
transplantation. Imrnunostaining obtained on sections which are serial to
sections a to c after (d) NOR uninfected, (e) NOR vector-only, (f) NOR-
hTERT myoblast transplantation (original magnification x 100).
(a-c) Human spectrin expression after DMD myoblast transplantation.
Human spectnn fibers on cryostat TA muscle sections after transplantation of
(a) DMD2 before infection with hTERT (b) DMD2-hTERT at passage 6 (c)
DMDL-hTERT at passage 6. (d-f) Human MHC Class 1 expression after
trans~lantation, Immunostainino obtained on sections which are seriai to
section a to c after myoblast transplantation of (d) DMD2 before hTERT
infection (e) DMD2-hTERT at passage 6 (£9 DMDI-hTERT passage 6
(original magnification x 100).
Figure 6 : Premature death of normal uninfected, vector-only or hTERT infected
myoblasts 1 hour. 1 day, 3 dsys and 5 days after the transplantation in SCID
mice. Each bar represents the mean + SEM of 4 transplantations.
Figure 3
Figure 4
Figure 5
Figure 6
1 hour 1 day
1 uninfected / I vector-oniy
! O hTERTinfected 1
3 days 5 days
1 (NOR) ?(NOR) 3(NOR) 4(NOR) S(N0R) 6(NOR)
Normal Myoblasrs Stained for Dystrophin
DMD Myoblasts Stained for spectrin
Table 1: Number of positive fibers after transplantation of normal or DMD myoblasts.
For normal myoblasts, number of passages since primary culture was undrrerminrd (These cells were originated from pool of clones. See Materiais and Mrthods). Howrver. al1 infected ceils were passaged 4 times between retroviral infection and transplantation.
For DMD myoblasts. number of passages were counted since primary culture:
* 2 passages ** 6 passages
65
2. Article
La t4lornérpse augmente la durée de vie des myoblastes DMD humains transformés
par l'antigène grand T sans empêcher leur fusion.
La capacité proliférative limitde des myoblastes DMD compromet sévèrement leur
capacité à être g6n6tiquement modifiés et utilisés pour la transplantation de myoblasres. La
tmsformation par l'antigène grand T de SV 40 (Tag) a permis de retarder la sénescence de
myoblastes rnurins et humains, mais ne réussit pas à immortaliser ces cellules et
ultimement. celles-ci arrêtent de proliférer et entrent en crise. D'autre part. la reconstitution
de l'activité télomérase s'est montrée suffisante pour permettre à différents types de
cellules transformées d'échapper à la crise.
Pour ce faire, des myoblastes DMD, préalablement transformés par le Tag. ont été
ensuite infectés avec un rétrovirus encodant la télomérase. L'expression de la télomérase a
ét6 suffisante pour permettre aux myoblastes DMD-Tag d'échapper à la crise. Les
myoblastes transformés positivement par la télomérase ont continué de diviser pour plus de
55 divisions dors que les myoblastes Tag ont arrêté de proliférer après 35 divisions. Ces
cellules sont capables de fusionner et de se différencier normalement. La longueur
moyenne des t6lomères de ces cellules DMD-Tag télomérase positives semble continuer à
allonger. Ainsi. les myoblastes modifiés gbnbtiquement de façon transitoire pourraient
constituer une importante dserve de myoblastes DMD pour la transplantation autologue
chez les patients DMD.
Telornerase extends the life span of Large T antigen-
Transformed human DMD myoblasts without preventing their
fusion.
Valérie Bernardi*, Sophie Seigneurin-Venini* and J.P. ~rernbla~''~
* These two authors have equdly contnbuted to this work.
l Laboratoire de Génétique Humaine. Université Laval and CHUQ Pavillon CHUL. Québec.
Canada. 2705 boul. Laurier. Ste Foy (Qc), Canada G1V4G2.
'~ddress for correspondence: Dr Jacques P. Tremblay Laboratoire de Gdn6tique humaine, CHUQ Pavillon CHUL. 2705, Boul, Laurier, Ste-Foy (Qc), Canada G 1 V4G2
Tel: (4 18) 654-2 186
Fa: (4 1 8) 654-2207
Email: [email protected]
Running titie : Teiomerase expression in Tag transfonned DMD myoblasts
67
SUMMARY
The Iunited proliferative capacity of DMD myoblasts severely limits their ability to be
genetically modified and used for myoblast transplantation. Transformation by SV 40 Large
T antigen (Tag) delay the senescence of mouse and human myoblasts. but fails to irnmonalize
these cells. The cells stopped to proliferate and entered in crisis. Reconstitution of telomerase
activity has been shown sufficient to enable different types of transformed cells to escape
crisis.
DMD rnyoblasts, previously transformed by Tag. were therefore infected with a
telomerase retrovins. The expression of relomerase was sufficient to allow DMD-Tag
myoblasts to escape crisis. The telornerase-positive transformed myoblasts continued to
divide for more than 55 doublings while Tag myoblasts stopped to proliferate after 35
doublings. These cells were still able to fuse and to differentiate normaily. The average
telomere length of these teiomerase-positive DMD-Tag myoblasts seems ro continue to
elongate. Thus, transiently genetically modified myoblasrs could constitue an important pool
of DMD myoblasts for aurologous transplantation in DMD patients.
Keywords : Telornerase gene. Large T antigen, DMD myoblasts. extension of
life span
68
INTRODUCTION
Myoblasts from muscle biopsies of Duchenne Muscular Dystrophy patients (DMD)
when cultured in vitro generaily exhibit a very limited proliferative life span and enter rapidly
in senescence '. This limited proliferative capacity severely limits rheir ability to be
genetically modified and used for myoblast transplantation.
Transformation by oncogenes such as simian virus 40 Large T antigen (Tag) was
found sufficient to delay senescence of mouse and human myoblasts by extending their life
span by about 20 divisions ?-). but failed to induce ce11 immortality. This second arrest of
proliferation is most commonly referred to as " crisis ". Crisis is characterized by severe
chromosomal structural instability ". It has been speculated that crisis occurs when telomere
erosion has progressed beyond a second critical point such that chromosomes brcomr
unstable 6. The mammalian telomeres, made of TTAGGG repeats, are located at the end of
chromosomes and are thus essential for the stability of the genome. In rare cases. a ce11 can
escape the proliferation blockade of crisis and continue to dividing indefinitely ! The in
v i m spontaneous immonaliration of cells using SV40 T antipn occurs at low frequency
(3.3 10-7) 8. Telomerase is generally reexpressed in these SV40 T antigen spontaneously
immortalized cells, allowing them to maintain their telomeres at a short but stable length '. Telomerase is a specialized reverse transcriptase which catalyzes the addition of
telorneric DNA repeats ont0 the ends of the chromosomes Io. Telomerase is active in
germline and cancer cells, but is not expressed in most human somatic tissues. Restoration of
telornerase activity by transient expression of the human telornerase reverse transcriptase
subunit (hTERT) in human epithelial cells and fibroblasts resulted in a drarnatic extension of
their life span I l . Recentiy, we have demonstrated that introduction and expression of
hTERT in nomial or DMD myoblasts pennitted to reconstitute telornerase activity. but failed t
to significantiy extend their life span. Furthemore, hTERT-expressng myoblasts could still
be succesfully transplanted into SCID mouse 1 2 . Recent results have shown that
reconstitution of telomerase activity is sufficient to enable Tag transformed HEK cells l 3 and
Tag or Ras vansformed human pancreatic cells or fibroblasts to escape crisis 15.
Because telomerase activation may be the primary means by which several ceil types
escape cnsis, and because introduction of the hTERT has been shown to reconstitute
telomense activity in human myoblasts. we have tested the hypothesis that expression of
hTERT could rescue Tag-~ansformed DMD myoblasts from crisis and immortdize of these
cells.
70
RESULTS
Telornerase activity of DMD-Tag and DMD-Tag-hTERT myoblasts
Myoblasts obtained from primary cultures of DMD patients were fint msfected with
the plasmid containhg the T- antigen and selected by hygrornycin. The transfomed cells
were then cloned and one of the clones, named DMD-Tag, was infected with the hTERT
retrovirus approximately 25 doublings after the T-antigen transfection. The infected cells
were selected for two weeks with puromycin. The resulting cells are called DMD-Tag-
hTERT. DMD-Tag and DMD-Tag-hTERT cells were tested for their telomerase activiiy ai
respectively 33 and 43 PD (population doubling). Figure I shows that only cells infected
with the hTERT retrovirus have telomerase activity. As expected. uninfected cells were
negative for telornerase activity.
Myogenicity and Tag expression of the DMD rnyoblasts
After several passages. DMD-Tag and DMD-Tap-bTERT myoblasis were tested for
their myogenicity and their Tag expression by irnmunosraining respectively with anti-desmin
or with anti-T antigen antibodies. After 16 doublings, DMD-Tag-hTERT cells were al1
positive for the desmin staining indicating their high myogenic potential (Figure Za) and al1
cells still expressed the T-antigen (Figure 2b). After 35 doublings. DMD-Tag cells had stop
proliferating (failed to exceed 50% confluency) indicating that these cells had probabiy
entered cnsis. However, these cells remained desmin positive and still expressed T-antigeen
(Figure 2 c-d).
DMD-Tag are consistently rescued from crisis by the introduction of
hTERT gene
At respectively 20 and 25 doublings, DMD-Tag and DMD-Tag-hTERT myoblasts
were seeded at the same density and their prolifentive capacity were measured. After 30 days
in culture. corresponding to 35 doublings, DMPTag culture had stopped proliferating
(figure 3). At that time, the culture contained mainly large. flattened cells with very large
cytoplasm and variable morpholo~ (Figure 4 a ; arrow-head), whereas DMD-Tag-hTERT
cells have a normal size and nomal morphology (Figure 4b). In our laboratory. DMD convol
myoblasts did not exceed 15 doublings in culture and DMD-Tag myoblasts have reached 35
doubling before crisis. The introduction of the T antigen alone was thus able to increase their
life span by roughly 20 doublings. This is consistent with published results -'.
During the same time. DMD-Tag-hTERT cells proliferated more rüpidly and reached 45
doublings (figure 3). These cells are still currently rnaintained in culture and continue to
proliferate. This result strongly suggests that expression of telornerase allow DMD-Tag
iiiy oblats to escape cnsis.
Telomere length of DMD-Tag and DMD-Tag-hTERT myoblasts
Bodnar et al. showed that hTERT gene transfer resulted in telomere elongation in
primary cellsll. In contrast, immortalized. transformed ceIl lines that have acquired
telomerase activity retain generdly short, but stable telomeres 6 . Therefore. the telomere
lengths of the DMD-Tag-hTERT myoblasts were measured and compared to those of near-
crisis or crisis stage DMD-Tag control cells. As previously descnbed 14* 15. telomeres of
DMD-Tag cells continuously shortened (Figure 5. lanes 1-3). As shown in Figure 1. these
cells had no telomerase activiq. Telomere lengths were also measured at various time points
after hTERT infection. The telomere length of the DMD-Tag-hTERT myoblasts increased
rapidly compared to pre-crisis or near crisis DMD-Tag cells. The telomere lenpth average
seems to continue to elongate even afier 35 doublings. However. at 41 and 16 doublin, =S. we
have obtained very large smears which did not allow us to estimate accurately the average
telomere length. The telomere length of our population of DMD-Tag-hTERT cells at 46
doublings was thus very heterogeneous.
Expression of telomerase in Tag transformed DMD myoblasts does not
prevent their differen tiation
It has been previously demonstrated by other authon that expression of large T
antigen in myoblasts affect their terminai differentiation in vitro. These T antigen-positive
myoblasts were, however, able to fuse normdly and still express the embryonic myosin
heavy chah (ehzHC) 3. To test whether expression of telomerase affects the differentiation
of DMD-Tag-hTERT myoblasts, ce11 fusion capability and expression of embryonic MHC
and spectrin were exrunined. At 16 doublings. DMD-Tag-hERT myoblasts were uansferred
in fusion medium. After 8 days. some myotubes were fonned (Figure 6 a-c: iurows). The
rnyotubes observed in phase contrast were positive for both spectrin and embryonic MHC
(figure 6 b-d). However. both markers were not only expressed in myotuber but also in
some mononucleated cells (Figure 6 b.d: mow-head). Consistent with previous published
results on Tag positive rnyoblasts 3. these Tag-hTERT rnononucleated cells can therefore
differentiate without fùsing.
Our results demonstrate that expression of telomerase does not prevent the fusion of Tag
transformed DMD myoblasts. Characteristics of differentiation seems to be sirnilar to those
previously described in Tag transformed rnyoblasts.
Autologous transplantation of genetically modified myoblasts from DMD patients has
been proposed for the treatment of Duchenne Muscular Dystrophy. However, the poor
proliferative capacity of the DMD myoblasts limits their ability to be genetically modified and
uansplanted. It is well known that viral proteins that bind and inactivate the functions of p53
and pRB as does SV40 large T antigeen (Tag), significantly expand the cultured life span of
normal and DMD human myoblasts2* 16* 17. But the expression of Tag fails to induce
irnmonality and thus Tag positive cells ultimately stop prolifenting and enter in crisis.
Although it has been demonstrated lhat introduction of hTERT in several ce11 types
resulted in extension of their life-span. we have recently observed that the expression of
hTERT did not extend significandy the life-span of DMD myoblasts 12.
In the present work. we have introduced the hTERT in Tag transformed DMD
myoblasts. The most important conclusion of our study is that telornerase activity is sufficient
to dlow Tag positive DMD myoblasts to escape frorn crisis. The DMD-Tag-hTERT cells
grow more rapidly than DMD-Tag cells as shown with the growth rate curve and they
continue to divide after 55 doublings.
After 55 doublings, the DMD-Tag-hTERT cells keep a normal morphology compared
to the DMD-Tag myoblasts which stopped to proliferate after 35 doublings. Moreover.
DMD-Tag-hTERT cells were able to fuse normally and expressed some differentiation
markers such as spectrin or embryonic MHC. The differentiation characteristics of DMD-
Tag-hTERT cells seems to be similar of those of DMD-Tag cells.
Previous published results indicated that the telomere length of Tag transformed cells
also expressing hTERT remained stable l 5 or continue to shonen IJ dunng ceIl division.
However, our results show that after 46 doublings, the telomere length of DMD-Tag-hTERT
myoblasts ce11 population was very heterogeneous but a large part of the cells had very long
telomeres. One possible exphnation for the heterogeneity is that the locus of integration of
the viral vector is likely different for different ceiis and that this locus rnay differentidly affect
hTERT expression. Some loci may allow a strong telomerase expression and thus
lengthening of the telomeres while others may be less favorable, causing lower levels of
hTERT expression and allowing only a maintenance of telomere length. We are currently
analyzing the telomere length of clonal populations to verify whether the proliferating clones
have elongating telomeres, stable telomeres or shoner telomeres. However. clonal
populations are not necessary for the myoblast ansp plantation in muscles. The success of
transplantation of these DMD-Tag-hTERT myoblasts is thus under investigation.
It has already been shown that Tag expression alone greatly reduced the success of
transplantation. l g Whereas myoblasts expressing telomerase alone cm fuse with host fibers
following transplantation. Thus. it may be advantageous or perhaps even necessary to
remove the T antigen-expressing cassette with the cre-lox sysrern before myoblast
transplantation. As mentioned in Materials and Methods section. the T antigen cDNA utilized
is aiready between to loxP box sequences and we will thus do this experiment.
In conclusion, as already demonstrated with several ce11 types. the introduction of the
telomerase gene in previously Tag uansformed DMD myoblasts extend considenbly their life
span. These cells seem to continuously proliferate in vitro but are still contact inhibired
because they are able to fuse in differentiation medium. At the time of submitting this
manuscript, it has been reponed that the introduction of three genes; hTERT. H-ras and T
antigen is necessary for the tumorigenic conversion. and that expression of only hTERT and
T antigen is not sufficient 19. This result is consistent with our observations. Moreover. 4
weeks after uansplaatation of the DMD-Tag-hTERT in the muscle of immunodeficienr SCID
mouse, no Nmon were observed (unpublished result).
After removal of T-antigen and introduction of the dystrophin or mini-dystrophin
gene, these genetically modified myoblasts could constitute an useful pool of DMD
myoblasts for autologous transplantation in DMD patients.
DMD muscle culture
Human myoblasts were obtained from biopsies of 8 years old DMD (Duchenne
Muscular Dystrophy) patient. Muscles were treated with collagenase and trypsin. The cells
obtained were cultured in MCDB 120 supplemented with 15% FBS (fetal bovin serum), 20
nglrnl basic fibroblast growth factor (bFGF), penicillin G (10 000 U h l ; Gibco BRL:
Burlington, Ont. Canada) and streptomycin (10 rnghl: Gibco BRL) at 37°C with 5% C 0 2 .
After expansion, the primary culture was FACS soned following immunofluorescent labelinp
with NKH 1 antibody to enrich culture in myoblasts. 106 cells were incubated with antibody - directed against human N-CAM coupled with phycoeryrhrin ( 1/50 NKHl antibody: Coulter
CO). After 15 min of incubation. the cells were rinsed twice, resuspended in PBS 1X and
soned in a Bow cytometer (Epics Elite ESP Coulter CO, Burlington. Ont, Canada).
After transformation by T antigen, myoblast culture was divided in two parts. One part was
infected with a retrovinis containing the telornerase gene, the other part was not infected and
served as the T ant ign control. The two populations of myoblasts were tested for their
capacity to fuse. For this fusion test. the cells were incubated in DMEM high glucose
medium (Gibco BRL) supplemented with 5% horse serum.
T antigen transformation
DMD culture were transfected with plasmid SSR69. provided by P. Leboulch
(Westerman 96) (Massachusetts Institute of Technology, Cambridge), containing between
two LoxP sequences the resistance gene of hygromycin, an EMCV IRES sequence
(Encephalomyocarditis virus intemal ribosome entq site) and the large T antigen gene (Tag).
These two genes were placed under the control of LTR (Long terminal repeat) promotor.
Transfection were made by the Effectene Transfection kit (Qiagen; Mississauga, Ont,
Canada). The construct will permit us to remove later the T antigen with the Cre
recombinase. Two days after transfection, the cells wen selected with 300 p g / d of
hygromycin B (CaibioChem; SanDiego, California). These celis were designated DMD-Tag.
One rnyoblast clone proliferated very well and was thus used for the retroviral telornerase
infection.
Retroviral infection
The cornpiete hTERT (human telorneme reverse transcriptase) cDNA was cloned in
puromycin resistant retroviral plasmid, named pBabepuro, under the conuol of the LTR viral
promotor 'O. The hTERT containing retroviral plasmid was first transfected into the PE50 1
ecotropic ce11 Iine, and retroviral supematant from these cells was used to infect the
amphotropic PA3 17 ce11 line. The cells were selected in 2.5 pghl puromycin. To hanest the
retroviral supematant, the PA3 17 hERT cells were grown overnight in a minimal mount of
DMEM high glucose medium (GIBCO BRL) supplemented with IO% donor calf serum. The
nexr morning, the retroviral medium was filtered through a 0.45 Pm filter and frozen at -80"
C. The producer cells were then allowed to divide twice. fresh medium was added ovemight
and new virai supematant was collected again the tomorrow morning.
Roughly, 2.105 DMD-Tag cells were incubated ovemight with 1 ml of supernatant of
hTERT retrovirus in 35 mm dishes in the presence of 4 pghl of polybrene. The next day.
the cells were washed and fresh medium was added. The infected cells were grown in 15%
FBS MCDB 120 medium for 48 h, then selected for two weeks in 2 pg/ml puromycin after
infection. These cells were designated as DMD-Tag-hTERT. For differentiation, the DMD-
Tag and DMD-tag-hTERT. populations were grown in 2% HS (hone serurn) DMEM
medium.
TRAP assay
Roughly, 500 myoblasts of each population were lysed with 2 0 pl of CHAPS lysis
buffer (Oncor, inc., Gaitherburg, MD). The extracts were subrnitted to the telomeric repeat
amplification protocol (TRAP assay) using the TRAP-eze telomerase deteciion kit (Oncor) ".
The relative activity of telomerase was evaluated by autoradiography.
Desmin, T antigene, spectrin and myosin heavy chain (MHC)
immunocytochemistry
Both types of myoblasts were iested by immunocytochemistry for the expression of
desmin. which is a marker for myogenicity and for the expression of T antigen. For each
marker, cells were first fixed with 95% ethanol for 15 min and then permeabilized with 0.5%
Triton for 5 min. To detect the desmin. the monoclonal mouse antibody DE-R- 1 1 ( 1110:
DAKO. Copenhagen. Denmark) was used and to detect T antigen. a mouse monoclonal
antibody against T antigen (1/200: PharMingen: Mississauga, Ont. Canada) was used. In
both cases, bound antibodies were detected with a biotinylated anti-mouse antibody ( 1 / 100:
Dako) which was recognized by a CY3 coupled streptavidin complex (11750: Sigma.
Odcville. Ont, Canada).
After differentiation. DMD-Tag and DMD-Tag-hTERT were iested for embryonic myosin
heavy chin (eMHC) or spectrin expression which are markers for terminal myoblast
differentiation. Cells were fixed with rnethanol 20% and incubated with eMHC antibody
(F1.652 developed by H. Blau and obtained from the Developmental Studies Hybndoma
Bank maintained by the University of Iowa, Depanment of Biologicai Sciences. Iowa City.
IA 52242) or with an anti-spectrin antibody (NCL-SPEC 1,1/100 Novocastra).
Telomere length analysis of DMD-Tag and DMD-Tag-hTERT cells
106 cells of each population were pelleted and resuspended in proteinase K digestion
buffer (200 rnM Tris, 100 rnM EDTA. 35 mM SDS pH 8.5) containing 0,4 mg protrinase
K M . The lysate was incubated ovemight at 50°C. Proteins and RNA were was extracted
with phenoYchlorofomi/isoam~l alcohol and the DNA precipitated with 7.5 M ammonium
acetate and ethanol 100%. The pellet was nnsed with ethanol70% and dissolved in TE buffer
(10 mM Tris and 1 mM EDTA pH 7,s). DNA was stocked at CC.
4 pg of DNA was digested with Hinf 1 and Rsa 1 4 hr at 37OC. These enzymes
generate TWs (telomere restriction fragments), which contain the TTAGGG tandem-repeat
sequence and a subtelomeric fragment. Digested genomic DNA was resolved by
electrophoresis in 0,78 agarose gel. The gel was dried. denatured and then neutralized. The
TRFs were detected by hybridization to 3 2 ~ - ( T T ~ ~ ~ ~ ) 4 probe as described by Allsopp ?
The telomere length of the two ce11 populations was measured after different numbers of
population doublings.
Growth rate analysis
Cells were seeded into 35 mm wells at a density of 1 0 . 0 cells/well and were
passaged in a larger flask when they reached confluency. For growth curve. cells were
counted on days 1 1. 15.20.25 and 79 after seeding. The number of population doubling
(PD) at each passage was evduated by the count/split method. PD was calculated as PD=
In(Nf/No)/inl, where Nf is the final cell number and No is the initial number of seeding
cells.
80
REFERENCES
1 Webster C and Blau HM. Accelerated age-related decline in replicative life-span of
Duchenne rnuscular dystrophy myoblasts: implications for ce11 and gene therapy. Somat Ce11
Mol Genet 1990; 16: 557-65.
2 Simon LV, Beauchamp IR. OtHare M and Olsen I. Establishment of long-term myogenic
cultures from patients with Duchenne Muscular Dystrophy by retrovirai transduction of a
temperature-sensitive SV40 large T antigen. Exp. Ceil Res. 1996; 224: 26-2-27 1.
3 Mouly V et al. SV40 large T antigen interferes with adult rnyosin heavy chain expression.
but not with differentiation of h u m m satellite cells. Erp. Cell Ra. 1996: 225: 268-276.
4 Nakamun TM cr al. TeIomense catalytic subunit homolop from fission yeast and human.
Science 1997: 377: 955-9.
5 Counter CM et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is m s t e d
in immortd cells which express telomerase activity. Embo J 1992: 1 1 : 192 1-9.
6 Counter CM et al. Stabilization of short telorneres and telomerase activity accornpany
immonalization of Epstein-Barr virus-transformed human B lymphocytes. J Viroi 19%: 68:
34 IOA.
7 Shay JW and Wright WE. Quantitation of the frequency of immortalization of normal
human diploid fibroblasts by SV40 large T-antigen. Exp Ceil Res 1989: 184: 109- 1 8.
8 Ray FA and Kraemer PM. Iterative chromosome mutation and seleetion as a mechanism of
complete transformation of human diploid fibroblasts by SV40 T antigen. Carcinogcnesir
1993; 14: 1511-6.
9 Montalto MC and Ray FA. Telornerase activation during the lineu evolution of hurnan
fibroblasts to tumorigenicity in nude mice [published erratum appears in Carcinogenesis 1997
Iun; 18(6): 128 11. Curcinogenesis 19%; 17: 263 1-4.
10 Greider CW and Blackburn EH. Telorneres. telomerase and cancer. Sci Am 1996: 274:
92-7.
11 Bodnar AG et al. Extension of Iife-span by introduction of telomerase into normal human
cells. Science 1998; 279: 349-352.
12 Sophie Seigneurin-Venin VB. Michel Ouellette, Vincent Mouly, Woodring E. Wright and
J.P. Tremblay. Transplantation in Scid mouse of normal and DMD myoblasts expressing the
telomerase gene. submined 1999;
13 Counter CM et al. Dissociation among in vitro telomerase activity. telomere maintenance.
and cellular immonalization. Proc Narf Acad Sci U S A 1998; 95: 14723-8.
14 Zhu J. Wang H, Bishop JM and Blackburn EH. Telornerasr extends the lifespan of
virus-transformed human cells without net telomere lengthening [see comrnents]. Proc Nat1
Acad Sci U S A 1999; 96: 3723-8.
15 Halvorsen TL, Leibowiu G and Levine F. Telomerase activity is sufficient to allow
transformed cells to escape from cnsis. Mol Ce11 Bi01 1999: 19: 186.1-70.
16 Miranda AF. Babiss LE and Fisher PB. Transformation of human skeletd muscle cells
by simian virus 40. Proc. Narl. Acad. Sci USA 1983: 80: 658 1-6585.
17 Iujvidin S. Fuchs O, Nudel U and Yaffe D. SV40 immonalizes myogenic cells: DNA
synthesis and mitosis in differentiating rnyonibes. Differentiation 1990; 43: 192-103.
18 Moisser PA et al. Transplantation of Large T Antigen-Imrnonalized Myoblasts. Gene
Ther. su bmitted;
19 Hahn et al. Creation of human tumour celis with defmed genetic elemenrs. Nariire 1999:
400: 464-468.
20 Morgenstern JP and Land H. Advanced rnammalian gene uansfer: high titre retroviral
vectors with multiple dnig selection markers and a complementary helper-free packaging cell
Iine. Nucleic Acids Res 1990; 18: 3587-96.
2 1 Kim NW et al. Specific association of human telomerase activity with immonal cells and
cancer. Science 1 994; 266: 20 1 1 -5.
22 Allsopp RC et al. Telomere length predicts replicative capacity of hurnan fibroblasts. Proc
N d AcadSci U S A 1992; 89: 101 14-8.[1] Webster. C. and Blau, H.M. (1990)
Somat Ce11 Mol Genet 16.557-65.
83
FIGURE LEGENDS
Figure 1: Telomerase activity in retrovirally infected DMD-Tag myoblasts.
Lane 1: Telomerase activity in DMD-Tag hTERT celis at 43PD. Lane 2:
Telomerase activity in DMD-Tag ceiis at 33PD.
Figure 2: (a-c) Desmin expression of (a) DMD-Tag-hTERT myoblasts and (c)
DMD-Tag myoblasts. (b-d) Antigen expression of (b) DMD-Tag-
hTERT (d) DMD-Tag myoblasts (original rnagnification x 100).
Figure 3: Growth curve chms the differences in prolifentive capacity between
DMD-Tüg luid DMD-Tag-hTERT myoblasts.
Figure 4: Differences in growth and morphology of DMD-Tag and DMD-Tüg-
hTERT. (a) DMD-Tag cells have failed to reached confluency at 35 PD. The
arrow points to an enlarged ce11 with a flattened appemnce.
typicûl of those seen in crisis. (b) DMD-Tag-hTERT cells were seedrd at
the same tirne as DMD-Tag but have reached 45 PD at the time that the
picnire was taken. (Original magrunification ~100).
Figure 5: Telornere length analysis of DMD-Tag and DMD-Tag-hTERT.
Lane 1-3: DMD-Tag rnyoblasts at 28.3 1,35 PD. Lane 4-7: DMD-Tag-
hTERT at 28.35.41.46 PD.
Figure 6: Differentiation of DMD-Tag-hTERT myoblasts. (a-c) Myonibe formation
of DMD-Tag-hTERT ceils in phase contnst. Arrows show multinucleated
cells. Arrow-heads show cells which remained in the rnononucleated stage.
(b) Spectrin expression on cells observed in phase contrast in (a). (d)
Embryonic MHC expression on cells observed in phase contrast in (c).
Arrow-heads show embryonic MHC expression on mononucleated DMD-
Tag-hTERT myo blasts.
Figure 2
Figure 3
Growth rate
Days in culture
Figure 4
Figure 6
DISCUSSION
La transplantation de myoblastes est une thérapie qui peut être envisagée dans le
traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne. Cette technique est toutefois limitée
par différents aspects, dont la réponse immunitaire de l'hôte [39]. Pour contrer ce problème,
l'utilisation d'immunosuppresseun tels que le FK506, permet de réduire les rejets et ainsi
augmenter le succès de la transplantation (261. Toutefois, I'utilisation constante
d'immunosuppresseurs peut causer des effets secondaires importants [40].
L'autotransplantation est une technique qui pourrait permettre d'éliminer
l'utilisation d'immunosuppresseurs. Cependant, la transplantation de myoblastes requiert
un grand nombre de cellules. ce qui est difficile à obtenir à partir d'une biopsie musculaire
de patient dystrophique. En effet, les myoblastes de patient dystrophique ont une capacité
proliférative très réduite comparativement aux myoblastes normaux ce qui limite leur
utilisation en thérapie génique [41]. La transformation des myoblastes dystrophiques par
des oncogènes tels l'antigène grand T ou par la t6lom6rase demeure une solution pour
résoudre le problème de sénescence de ces cellules et augmenter leur prolifération.
Des essais faisant appel à l'antigène grand T ont déja Cté rédists pour augmenter le
nombre de division de fibroblastes et de cellules épithéliales [63]. La capacite proliférative
de myoblastes dystrophiques a égaiement été augmentée à l'aide de l'antigène grand T [64].
Toutefois. ces differents types cellulaires transformés avec l'antigène grand T atteignent un
autre type de sénescence qu'on nomme l'état de crise. En effet, les cellules vansformées
par des oncogènes finissent par entrer en crise car leurs télomères continuent à raccourcir.
ce qui amène une instabilité chromosomique importante. La transformation de myoblastes
par l'antigène grand T permet toutefois d'augmenter d'environ 20 le nombre total de
divisions [64]. Des études ont également montré que les myoblastes transformés par
l'antigène grand T pouvaient fusionner et former des myotubes in vitro [65] [69]. Par
contre, des travaux réalisés in vitro ont montré que l'antigène grand T interférait avec des
facteurs de différenciation terminale spécifiques aux cellules musculaires [ïO]. Des essais
ont également été faits in vivo, soit en transplantant des myoblastes exprimat I'antigène
grand T dans la souris. Ces transplantations ont donné un très faible succès de greffe [7 11.
Pour le moment, aucune explication n'a été apportée pour expliquer ce faible succès, mais
certaines hypothèses telles un mauvais fonctionnement du processus de maturation et de
hision, ou un problème de survie des cellules, ont et6 amenées.
La télomérase permet également d'augmenter le nombre de divisions en permetrant
de maintenir la longueur des télomères. Une étroite corrélation a déjà été faite entre
I'immortdisation des celIules cancéreuses. In réactivation de la télomérase et la longueur
des télomères [76]. Ces faits ont effectivement été observés sur des fibroblastes [79J et des
ce! Iules épitheliales [€IO].
Le but principal de ce projet etait de trouver une méthode efficace qui permette
d'augmenter le nombre de division des myoblastes DMD tout en permettant de conserver
leur capacité de différenciation in vitro et in vivo.
Pour atteindre ces objectifs deux méthodes ont été utilisées. D'abord la sous-unité
catalytique de la télomérase humaine (hTERT) a été inuoduite dans des myoblastes
normaux et dystrophiques à l'aide d'un r6trovirus. Les différents tests effectués ont
effectivement montré que la télom6rase était active et que les télomères étaient grandement
allongés. Toutefois. la capacité prolifërative des myoblastes hTERT n'a pas été augmentée
par rapport aux myoblastes contrôles.
Des coilaborateun avaient déjà observé un phénomène semblable à partir de
fibroblastes. En effet, un clone de fibroblastes exprimant la télomérase avait atteint la
sénescence après 130 divisions alors que ses télomères etaient de 18 kb. Dans la même
études, un clone de fibroblastes hTERT ayant des télomères plus courts a dépassé les 400
divisions (manuscrit en préparation). Ceci nous laisse croire que dans le cas present. la
tdomérase etait trop fortement exprimée et qu'eue conduisait B l'allongement plutôt qu'au
maintien de la longueur des télomères. On suppose également que des télomères trop longs
nuisent à la stabilité des chromosomes, ce qui pousserait les cellules en sénescence.
Des myoblastes hTERT-positifs ont tout de même et6 evalu6s pour leur capacité de
fusionner in vivo en les transplantant dans les muscles de la souris SCID. Le succès de cette
transplantation était plus faible qu'une transplantation avec des myoblastes normaux. il a
tout de même Cté possible d'observer quelques fibres provenant de la fusion de myoblastes
exprimant hTERT. Bien que ces nouvelles fibres soient plus petites et moins nombreuses,
ces observations nous permettent d'affirmer que la télomérase n'empêche pas la formation
des fibres in vivo. Par contre. la présence d'amas de cellules mononucl6ées près du site
d'injection dans le cas des myoblastes hTERT ou des myoblastes contenant le vecteur seul,
nous laisse supposer que la sélection i la puromycine peut limiter le succès de 13
**--en1 ,,.,,,mtation. Il faut tgalement prendre en considération d'autres facteurs pour expliquer
le plus faible succès de transplantation des myoblastes hTERT et des myoblastes contenant
le vecteur seul. Ces facteun sont le pourcentage de myogénicit6. le nombre de passages
déjà effectués et les dommages causés par l'infection virale. Tous ces facteun peuvent donc
diminuer le potentiel myogénique des myoblastes in vivo.
Bien que le succès de la transplantation obtenu avec les myoblastes hTERT soit plus
faible, nous pouvons toutefois conclure que la présence de la télomérase n'empêche pas la
formation de nouvelles fibres
Pour atteindre notre but premier, soit d'augmenter la capacitd proliftrative de
myoblastes DMD, nous avons combiné l'antigène grand T et la telornérase. Des études
antérieures avaient effectivement montré que la télomérase permettait de passer l'état de
crise atteint par les cellules transformées par l'antigène grand T [72] [83].
Des myoblastes DMD préalablement transformés par I'antigène grand T (DMD-
Tag) ont donc été infectés avec le rétrovirus hTERT. Les myoblastes DMD-Tag avaient
déjà augmenté de 20 leurs nombres de divisions comparativement aux myoblastes DMD
normaux ce qui concorde avec les résultats observés dans la littdrature [64]. En introduisant
la télomérase, le nombre de divisions et la vitesse de prolifération ont augmenté de façon
significative. Les myoblastes DMD-Tag-hTERT ont ainsi effectué plus de 55 divisions et la
prolifération continue toujours en culture. Ces myoblastes ont également conservé une
morphologie normale.
Ces mêmes cellules présentent aussi un pourcentage myogénique très élevé. In vitro,
la capacité à fusionner a été confirmé en utilisant un milieu de différenciation. Des
myotubes ont pu être observés et des marqueurs de différenciation tels la spectrine et la
myosine embryonnaire ont également pu être détectes dans les myotubes. ce qui laisse
croire que les myoblastes DMD-Tag-hnRT ont conservé leur potentiel de différenciation.
Des resultats récents obtenus au laboratoire, ont montré que ces myoblastes
pouvaient être utilisés pour la transplantation dans Ia souris SCID. Les résultats sont
encourageants car plusieurs fibres ont et6 formées.
Jusqu'à maintenant, la combinaison de l'antigène grand T et de la télornérase s'est
avérée une approche fort prometteuse pour fournir une réserve de myoblastes DMD pour la
transplantation. La capacité de prolifhtion et de différenciation de ces myoblastes a été
conservée. Aucune tumeur n'a étt5 détectée suite à la transplantation de ces cellules.
PERSPECTIVES
Différentes possibilités peuvent être envisagées pour optimiser les conditions de
I'immortaiisation de myoblastes et de la transplantation de ces cellules modifiées.
Des études antérieures avaient montré que l'antigène grand T nuisait au succès de la
transplantation. La construction contenant l'antigène grand T utilisée dans le présent projet
contient des séquences loxP. Ces séquences sont excisées lonqu'elles sont en présence de
la recombinase Cre. L'antigène grand T est compris entre ces deux sdquences. 11 est donc
possible d'enlever l'antigène grand T après avoir obtenu le nombre adéquat de myoblastes
en utilisant la recombinase Cre. Cette étape d'excision permettrait probablement
d'augmenter le succès de la transplantation. On peut également envisager d'introduire la
télomérase entre ces deux sites loxP. De cette facon. il serait également possible d'éliminer
la téloménse avant de procéder à la ~splanta t ion . Des travaux sont d'ailleurs
prdsentement en cours au laboratoire pour tenter d'exciser l'antigène grand T à l'aide d'un
rétrovirus Cre ou d'un adénovirus Cre.
On peut aussi envisager d'utiliser le gène hTERT sous le contrôle d'un promoteur
inductible, pour permettre de réguler l'expression de la télomérase dans les cellules et ainsi
mieux contrôler la longueur des télomères. Dans ce cas, la tdomerase permettrait peut-être
à elle seule d'augmenter le nombre de divisions en maintenant la Longueur des télomères.
Toutes ces étapes pour obtenir une culture de myoblastes DMD ayant une capacité
de prolifération supérieure aux myoblastes normaux ne doivent pas nous faire perdre de vue
que le but ultime est de rétablir la dystrophine dans les muscles de patients dystrophiques.
Ainsi, après avoir augmenté la capacité proliférative des myoblastes DMD, il faudra
introduire dans ces myoblastes le g h e de ta dystrophine.
Une avenue alternative pour limiter les dommages causés par ces différentes
manipulations génétiques est d'utiliser des méthodes qui permettent un transfert et une
expression transitoires du gène d'intérêt pour introduire les gènes responsables de
l'imrnortalisation. On pourrait de ce fait, hiter l'utilisation d'un rétrovirus qui permet
l'intégration du tramgène. Ce dernier est cependant très utile pour introduire la dystrophine
car il permet une expression continue du transgène [6]. On pournit opter pour I'adénovims
pour introduire les gènes impliqués dans I'immonalisation, car il n'y a aucune intégration
du transgène. En effet. I'adénovims a comme avantages de ne pas s'intégrer dans le
génome de la cellule hôte et de permettre l'infection des cellules qui ne sont pas en
division. Toutefois, son utilisation peut être limitée par le fait que le transgène ne peur pas
être transmis d'une cellule à l'autre Ion de la division cellulaire et que l'expression du
transgène est d'une dur6e beaucoup plus courte comparativement au rétrovirus [7]. il reste à
vvnir si Iû durée d'expression des gènes irnmortalisants transmis par I'adénovinis est
suffisante pour permettre d'augmenter le nombre de divisions.
Ii existe également une protéine de fusion. VP23, qui permet d'introduire différents
transgènes ou protéines dans les cellules. En effet, cette protéine du virus de I'herpès
simplex de type I peut être exportée du cytoplasme de la cellule qui l'exprime et être
ensuite importée dans plusieurs auues cellules avoisinantes où elle s'accumule dans le
noyau [84]. il est possible de produire une protdine chimérique en fusionnant VP27 à une
protéine ou à un gène d'intérêt, et cette nouvelle protéine pourra éventuellement se
transmettre d'une cellule à l'autre. On peut donc envisager d'introduire l'antigène grand T.
la rélomérase ou la recombinase Cre par cette technique.
Il existe donc plusieurs approches possibles pour augmenter la capacité proliféntive
des myoblastes dystrophiques tout en leur permettant de conserver leur potentiel de
différenciation. Les différentes méthodes utilisées dans le présent projet sont prometteuses
\
et devraient éventuellement permettre de produire suffisamment de myoblastes pour
effectuer une transplantation autologue chez un patient dystrophique.
1. Marieb, E. N. and Laurendeau. G. Anatomie et physiologie humaines. - 1 O 14. 1993. Québec. Éditions du renouveau pedagogique inc.
2. Engel, A. G and Armstrong. C. F. Myology. Basic and clinicd. 1994. New York. McGraw-Hill inc.
3. Emery. A E. H and Emery. M L. H. The history of a genetic disease. Duchenne Muscular Dystrophy o r Meryon's Disease. -148. 1995. London, Royal Society of Medecine Press Limited.
4. Hoffman, E. P. La myopathie de Duchenne. La Recherche 2 1 . 3 6 4 . 1993.
5. Kakulas. B. A. and Mastagla. F. L. Pathogenesis md Thenpy of Duchenne and Becker Muscular Dystrophy. -273. 1990. New York, Raven Press.
6 . Robbins. P. D. and Ghivizzani. S. C. Viral Vector for Gene Therapy. Pharrnacol.Ther. 80(1), 35-47. 1998,
7. Morgan, J. E. Ce11 and Gene Therapy in Duchenne Muscular Dystrophy. Human Gene Therapy 5, 165-173. 1994.
8. Coins. W. F.. Kristy, D., Marconi. P.. Oligino, T., Rarnakrishnan. R.. Poliani, P. L., Fink. D. J.. and Glorioso, J. C. Herpes simplex virus vectors for gene &ansfer to the nervous system. Journal of Neurovirology 3(suppl 1 ), S80-S88. 1997.
9. Klimatcheva, E., Rosenblatt, J. D., and Planelies, V. Lentiviral vecton and gene therapy. Frontiers in Bioscience 4,48 1-496. 1999.
10. Koenig, M., Hofian, E. P., Bertelson, C. J., Monaco, A. P., Feener, C., and Kunkel, L. M. Complete cloning of the Duchenne muscuiar dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuais. Cell50,509-5 17. 1987,
1 1. Koenig, M., Monaco, A. P., and Kunkel, L. M. The complete sequence of dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein. Cell53,2 19-226. 1988.
12. England, S. B., Nicholson. L. V. B., Johnson, M. A., Forrest, S. M., Love, D. R., Zubrzycka-Gaarn, E. E., Bulman. D. E., Harris, J. B., and Davies. K. E. Very mild muscular dystrophy associated with the deletion of 46 % of dystrophin. Nature 343, 180- 182. 1990.
13. Acsadi, G.. Dickson. G, Love, D. R., lani. A., Walsh. F. S., Gurusinghe, A.. Wolff. J. A., and Davies. K. E. Human dystrophin expression in sdx after intmuscular injection of DNA consmcts. Nature 352.8 15-8 18. 199 1.
14. Y uasa, K., Miyagoe. Y., Yamamoto. K.. Nabeshima. Y.. Dickson, G, and Takeda. S. Effective restoration of dystrophin-associated proteins in vivo by adenovirus- mediated vansfer of mncated dystrophin cDNAs. FEBS Lett 425(2), 329-336. 1998.
15. Pastoret, C. and Sébille, A. Quel avenir pour la souris mdx comme modèle de dystrophie musculaire de Duchenne? Histopatholigie comparée des dystrophinopathies. Medecine Sciences 9(6-7). 737-746. 1993.
16. Pagel, C. N. and Morgan, J. E. Myoblast msfer and gene therapy in muscular dystrophies. Microscopy research and technique 30,469-479. 1995.
17. Howell, J. M. 1s there a future for gene therapy ? Neurornuscular Disorder 9, 107- 107. 1999.
18. Huard, I., Bouchard, J. P., Roy, R., Labrecque, C., Dansereau, G., Lemieux, B., and Tremblay, J. P. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fiben in 16-years-oid patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin Csi (Colch) 8 1 (Z), 287-288. 199 1.
19. Huard, J., Bouchard, I. P.. Roy, R., Malouin, F., Dansereau, G., Labrecque, C., Albert, N., Richards, C. L., Lemieux, B., and Tremblay, J. P. Human myoblast transplantation; preliminary results of 4 cases. Muscle Neme 15(5), 550-560. 1992.
20. Tremblay, I. P., malouin, F., Roy, R., Huard, J., Bouchard, J. P., Satoh. A.. and Richards, C. L. Results of triple blind clinical study of myoblast transplantation without immunosupressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant 2(2), 99- 1 12. 1993.
21. Tremblay, J. P., Bouchard, I. P.. Malouin, F., Theau, D., Cottrell, F., Colli. H., Rouche. A., Gilgenkrantz, S., Abbadi, N., and Tremblay, M. Myoblast transplantation between monozogotic twin girl carriers of Duchenne muscular dystroph y. Neuromuscular Disorder 3(5-6). 583 -592. 1993.
22. Sdvatori, G., Ferrari. G.. Mezzogiorno. A., Servidei, S., Coletta. M., Tondi. P.. Giavazzi, R., Cossu, G.. and Mavilio, F. Retrovirai vector-mediated gene transfer into human primary myogenic cells leads to expression in muscle fiben in vivo. Human Gene Therapy 4(6), 7 13-773. 1993.
23. Floyd, S. S., Jr., Clemens, P. R., Ontell, M. R., Kochanek, Y., Day. C. S.. Yang. J.. Hauschka, S. D., Balkir, L., Morgan, I., Moreland, M. S.. Feero. G. W.. Epperly. M., and Huard, J. Ex vivo gene transfer using adenovirus-mediated full-lenght dystrophin delivery to dystrophie muscles. Gene Therapy 5(1), 19-30. 1998.
24. Moisset, P. A., Skuk. D.. Asselin, I., Goulet, M., Roy, B., Karpati, G., and Tremblay. I. P. Succesfull transplantation of generically comcted DMD myoblasts following ex vivo transduction with the dystrophin minigene. Biochem Biophys Res Commun 247( I), 94-99. 1998.
25. Kinoshita, I., Vilquin, J. T., and Tremblay, J. P. Mechanism of increasing dystrophin- positive myofibers by myoblast uansplantation: study using mdxheta-galactosidase transgenic mice. Acta Neuropathol (Berl) 9 1 (5), 489493. 1996.
26. Kinoshita, I., ROY, R e T Dugre, F. J., Grave]. C., Roy, B., Goulet, M., Asselin. I., and Tremblay, J. P. Myoblast transplantation in monkeys: control of immune response by FK 506. Neuropathol Exp Neurol55(6), 687-697. 1996.
27. Skuk, DmT Roy, B., Goulet, M., and Tremblay, J. P. Successful myoblast transplantation in primates depends on appropriate ce11 delivery and induction of regeneration in the host muscle. Experimental Neurology 1 S5(l), 22-30. 1999.
28. Ito, H.. Hallauer, P. L., Hastings, K. E*, and Tremblay, J. P. Pnor culture with concanavalin A increases intrarnuscular migration of transplanted myoblast. Muscle Nerve 2 1 (3), 29 1-297. 1998.
29. Fan, Y.. Marley, M., Beilhan, M., and Grounds, M. Rapid death of injected myoblast in rnyoblast transfer therapy. Muscle Nerve 19(7), 853-860. 1996.
30. Guerette, B., Asselin, L. Skuk. D.. Entmm, M.. and Tremblay. J. P. Control of infiammatory damage by anti-LFA- 1: increase success of myoblast transplantation. Ce11 Transplant 6(2), 10 1 - 107. 1997.
3 1. Guerette, B., Asselin, L, Vilquin, J. T., Roy, R., and Tremblay, J. P. Lymphocyte infiltration following allo- and xenomyoblast transplantation in mdx mice. Muscle Nerve l8( 1 ), 39-5 1. 1995.
32. uintchev. A., Zweyer. M.. and Wemig, A. Cellular and molecular reactions in rnouse muscles after myoblast implantation. J Neurocytol24(1), 3 19-33 1. 1995.
33. ROY, R e , Tremblay, J. P.. Huard, J., Richards. C. L., Malouin, F., and Bouchard, J. P. Antibody formation after myoblast transplantation in Duchenne-dystrophie patients. donor HLA compatible. Transplant Proc 25( 1 Pt î), 995-997. 1993.
34. Huard, J., Roy, ReT Bouchard, I. P.. Malouin, F-, Richards. C. L., and Tremblay, J. P. Human rnyoblast transplantation between immunohistocompatible donors and recipients produces immune reactions. Transplant Proc 24(6), 3049-305 1. 1997.
35. Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A*, ing, W., gnore, L., ior, T. W., henk, 2.. nson. S., Andrew, P. E., and ce, R. Myoblast transfert in treatment of Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med 333( 13), 832-838. 1995.
36. Law, P. K., Goodwin, T. G., Fang, Q., Duggirala, V., Larkin, C., Florendo, J. A., Kirby, D. S., Deering, M. B.. Li, H. J., Chen, M., and al. Feasibility, safety, and efficacy of myoblast vansfer therap y on Duchenne muscular dy strophy boys. Ce11 Transplant 1 (2-3), 235-244, 1992.
37. Karpati, G., Ajdukovic, D., Amold. D.. Gledhill. R. B., Gunmann. R., HoIland, P., KochT P. A., Shoubridge, E., Spence, D., Vanasse, M., and al. Myoblast transfer in Duchenne muscular dystrophy. AM Neurol34( 1). 8- 17. 1993.
38. Vilquin. J. T., Kinoshita, L, Roy, R., and Tremblay. J. P. Cyclosphosphamide immunosuppression does not permit succesfull myoblast ailotransplantation in mouse. Neuromuscular Disorder 5(6), 5 1 1-5 17. 1995.
39. Huard. J., Roy. R., Guerette, B., Verreault. S.. Tremblay. G.. and Tremblay, J. P. Human myoblast transplantation in immunodeficient and irnmunosuppressed rnice: evidence of rejection. Muscle Neme 17(2), 224-234. 1994.
O . McDiarmid, S. V., Busuttil, R. W., Ascher, N. L., Burdick, J., D'Aiessandro. A. M., Esquivel, C., Kalayoglu, M.. Klein. A. S.. Marsh. J. W., Miller. C. M.. and al. FU06 (tacrolimus) compared with cyclosporine for primas, immunosuppression after pediauic Iiver transplantation. Transplantation 59.530-536. 1995.
JI. Webster, C. and Blau, H. M. Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for ce11 and gene therapy. Somat Ce11 Mol Genet 16,557-565. 1990.
42. Shen. C. I. Cancer ce11 cycle. Science 271, 1672-1677. 1996.
43. Mittnach. Control of pRB phosphorylation. Curr.Opin.Genet.Dev 8,- 1-27. 1998.
44. Del Sal, G. The Mammalian ceil cycle and its aberrations in cancer cells. Adv Clin Path 1(2), 123-136. 1997.
45. Bartek, J., Lukas, J., and Bartkova, I. Perspective: defecu in ce11 cycle control and cancer. J Pathol 187(1), 95-99. 1999.
46. Johnson, D. J. and Walker, C. L. Cyclins and ce11 cycle checkpoints. Annu Rev Pharmacol Toxicol ,295-3 12. 1999.
47. Martin, G. M., Sprague. C. A., and Epstein, C. 1. Replicative life-span of cultivated human cells. Eeects of donor's age, tissue, and genotype. Lab invest 23,86-92. 1970.
48. Shay, I. W.. Werbin. H., and Wright, W. E. Telomere shortening may contribute to aging and cancer: a perspective. Molecular and Cellular Differentiation 2( 1 ), 1 -2 1. 1994.
49. Decary, S., Mouly, V., and Butler-Browne, G. S. Telomere length as a tool to rnonitor satellite cell amplification for cell-mediated gene therapy. Human Gene Therapy 7. 1347-1 350. 1996.
50. Counter, C. M.. Avilion, A. A., LeFeuvre. C. E.. Stewart, N. G.. Greider, C. W.. Harley. C. B ., and Bacchetti, S. Telomere shonening associated with chromosome instability is arrested in imrnortal cells which express telornerase activity. The EMBO Journal 11(5), 1921-1929. 1992.
5 1. Greider, C. W. Telorneres and senescence: The history. the experiment. the future. Cunent Biology 8, R 178-R 18 1. 1998.
53. Tmnock. 1. F. and Hill, R. P. The basic science of oncology. 420. 1992. McGraw-Hill inc.
53. Metz, T., Harris, A. W., and Adams, J. M. Absence of p53 allows direct inmortalisation of hematopoietic cells by the myc and raf oncogenes. Ce11 82( 1). 29-36. 1995.
54. Compton, T. An immonalized human fibroblast ce11 line is penissive for human cytomegalovhs infection. Journal of virology 67,3644-3 348. 1993.
55. Halbert, C. L.. Demen, G. W., and Galloway, D. A. The E7 gene of humanpapillomavims type 16 is sufficient for immonalization of human epithelial cells. Journal of virology 65,473478. 199 1.
56. Wazer, D. E., Liu, X. L., Chu, Q., Gao. Q., and Band, V. immonalization of distinct human mammary epithelial ce11 types by papilloma virus 16 E6 or E7. Proc Nat1 Acad Sci USA 92,3687-369 1.
57. Hudson, 1. B., Bedell, M. A., McCance, D. J., and Laiminis, L. A. Immortalization and altered differentiation of human keratinocytes in vitro by €6 and E7 open reading frimes of human papillomavirus type 18. Journal of virology 64,s 19-526. 1990.
58. Perez-Reyes, N., Halben, C. L., Smith, P. P., Benditt, E. P., and McDougall, J. K. ùnmonalization of primary human smooth muscle cells. Proc Nat1 Acad Sci USA 89, 1224-1228. 1992.
59. Lochmüller, H.. Johns. T.. and Shoubridge, E. A. Expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus (HPVl6) extends the life span of human myoblasts. Experimental Cell Research 248, 186- 193. 1999.
60. Gopaiakrishnan. S., Douglas. J. L.. and Quinlan, M. P. Irnmonalization of primary epithelial celIs by E 1 A 12s requires late, second exon-encoded functions in addition to complex formation with pRB and p300. Ce11 Growth Differ 8(5 ) . 51 1-55 1. 1997.
6 1. Quinlan, M. P. Enhanced proliferation, growth factor induction and immonalization by adenovirus El A 12s in absence of El B. Oncogene 9(9), 2639-2617. 1994.
62. Morgan, J. E., Beauchamps, J. R.. Pagel, C. N., Peckharn, M.. Ataliotis. P.. Jût. P. S.. Noble. M. D., Farmer, K., and Partridge, T. A. Myogenic ce11 lines derived from transgenic mice carring a thermolabile T antigen: a mode1 for derivation of tissue- specific and mutation-specific ce11 lines. Developmental Biolopy 1 62.484498. 1994.
63. Shay, J. W., Van Der Haegen, B. A., Ying, Y., and Wright, W. E. The frenquency of immonaiization of human fibroblasts and mammary epithelial cells transfected with SV40 large T-antigen. Experimental Ce11 Research 209.45-52. 1993.
64. Simon. L. V., Beauchamps, J. R., O'Hare, M., and Olsen. 1. Establishment of long-ten myogenic cultures from patients with Duchenne muscuiar dystrophy by retroviral transduction of a tempemure-sensitive SV40 large T antigen. Experimental Cell Research 224,26427 1. 1996.
65. Iujvidin, S., Fuchs, O., Nudel, U., and Yaffe. D. SV40 immortalizes myogenic cells: DNA synthesis and mitosis in differentiating myotubes. Differentiation 43, 192- 203. 1990.
66. Yang, J., Seelig, M., Rayner, S., and Bredesen, D. E. increasing the proliferative capacity of muscular dystrophy myoblasts. Muscle Nerve 15,94 1-948. 1992.
67. Pinçon-Raymond, M., Vicart. P., Bois, P., Chassande, O., Romey, G., Varadi, G., Li, 2. L., Lazdunski, M.. Rieger, F., and Paulin, D. Conditional immortalization of normal and dysgenic mouse muscle cells by the SV40 large T mtigen under the vimentin promoter control. Developmental Biology 148,s 17-528. 199 1.
68. Vicart, P., Schwartz, B., Vandewalle, A., Bens. M., Delouis, C., Panthier. J.-J., Pournin. S., Babinet, C., and Paulin, D. Immortalization of multiple ce11 types from iransgenic rnice using a transgene containing the vimentin promoter and conditionai oncogene. Experimental Ce11 Research 2 1 4 , 3 5 4 . 1994.
69. Deschênes, I., Chahine, M., Tremblay, J. P.. Paulin, D.. and Puymirat. J. hcrease in the proliferative capacity of human myoblast by using the T antigen under the virnentin promoter control. Muscle Nerve 20,437445. 1997.
70. Mouly, V.. Edom. F., Decary, S., Vicart, P.. Barbet. J. P.. and Butler-Browne, G. S. SV40 large T antigen interferes with adult rnyosin heavy chah expression. but not with differentiation of human satellite cells. Experimental Ce11 Research 225(1), 268-276. 1996.
71. Moisset. P. A., Skuk. D., Vilquin, J. T.. Ito. H.. Asselin. I., Roy. B.. Goulet. M.. and Tremblay, J. P. TranspIantation of large T antigen-immortalized myoblasts. Gene Therapy submitted. 1999.
73. Lustig, A. J. Cnsis intervention: The role of telornerase. Proc Nat1 Acad Sci USA 96, 3339-3341, 1999.
73. Haivorsen. T. L., Leibowitz, G., and Levine, F. Telornerase activity is sufficient to allow transfonned cells to escape from cnsis. Molecular and cellular biology 19(3), 1864-1 870. 1999.
71. Blackburn, E, H. Structure and fonction of telorneres. Nature 350.569-573. 199 I.
75. Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TT.4GGG repeats. Ce11 59,521-529. 1989.
76. Kim. N. W.. Piatyszek, M. A.. Prowse, K. R.. Harley, C. B., West, M. D.. Ho, P. L. C., Coviello. G. M., Wright, W. E-, Weinrich. S. L., and Shay. J. W. Specific association of human telomerase activity with immortal ceiis and cancer. Science 266,201 1-2015. 1994.
77. Meyerson, M., Counter, C. M.. Eaton, E. N., Eilisen. L. W., Steiner, P., Caddie, S. D., Ziaugra, L., Beijersbergen, R. L.. Davidoff, M. J., Liu, Q., Baccheni, S., Haber, D. A., and Weinberg. R. A. hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-reguletad in tumor cells and dunng imrnortaiization. Cell 90. 785-795. 1997.
78. Nakamura. T. M., Morin, G. B.. Chapman. K. B., Weinrich, S. L.. Andrews. W. H.. Lingner. J.. Harley. C. B., and Cech. T. R. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science 177,955-959. 1997.
79. Vaziri. H. and Benchimol. S. Reconstitution of telornerase activity in normal human cells leads to elongation of telomeres and extended replicative life span. Cunent Biology 8.279-282. 1998.
80. Bodnar, A. G.. Ouellette. M., Frolkis, M.. Holt. S. E.. Chiu, C.-P., Morin. G. B.. Harley. C. B., Shay. J. W., Lichtsteiner. S. and Wright, W. E. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science 279.349-352. 1998,
8 1. Counen. I. D-, Bennett. W. P.. Gollahon, L.. Shay, J. W., and Haris, C. C. Genomic instability and telomerase activity in human branchial epithelial cells during immonalisation by human papillomavirus- 16 E6 and E7 genes. Experimental Ce11 Research 235,245-253. 1997.
82. Wang, J., Xie, L. Y., Ailan. S., Beach, D.. and Hannon, G. J. Myc activates telomerase. Genes & Development 12, 1769- 1774. 1998.
83. Zhu, J., Wang, H., Bishop, J. M., and Blackburn, E. H. Telomerase extends the lifespan of virus-transfonned human cells without net telomere lenthening. P m Nat1 Acad Sci USA 96,3723-3728. 1999.
84. Elliot. G. and ON=, P. Intercellular utifficking and protein delivery by a herpesvirus stntcmral protein. Ce11 88,223-233. 1997.
