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NGSをはじめよう！あなたのアプリケーションに適したサンプル調製キットを探すMarch 31, 2014

崎川 真里イルミナ株式会社アソシエイト テクニカルアプリケーション サイエンティスト

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本日のOutlineイルミナの装置でシーケンス解析を行うために

ライブラリーの作製に必要なキットのご紹介

サンプル調製キット “Kit Selector” ツールのご紹介

Kit Selectorの使い方

目的のアプリケーションに合わせた弊社推奨キットの選び方

– 全ゲノム解析

– ターゲット濃縮

– 小さいゲノム/プラスミド

– アンプリコン

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1. サンプル調製： シーケンサー解析⽤のDNAサンプルを作る

2. クラスター形成： サンプルDNAを鋳型として増幅する

3. シーケンシング： 塩基配列を蛍光として読み取る

4. データ解析： データを総合して塩基配列を得る

イルミナ次世代シーケンサー解析のワークフロー

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DNA/RNA由来のサンプルをイルミナシーケンサーで

読むために、DNAライブラリーを作製する

必要なステップとは？

－DNAの断片化

・DNAの長さを200-600 bpに断片化

－アダプター配列とプライマー配列の付加

・フローセル上のオリゴと結合し

ブリッジPCRによる増幅を行うためのアダプター配列と、

シーケンスプライマーが結合するプライマー配列の付加

－インデックスの利用

・多サンプル解析を行いたい場合（複数のサンプルを同時にランする）

各サンプルを識別させるためのインデックスの付加

サンプル調製とは？

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DNAライブラリー（イルミナシーケンサー解析⽤DNAサンプル）の構造

イルミナシーケンサー専⽤オリゴヌクレオチドアダプター・DNA Insert 数百bpに断⽚化したDNA（解析する配列）・P5, P7 フローセルへの結合部位→DNA増幅・SP シーケンスプライマー結合部位→シーケンス・Index 複数サンプル解析⽤のバーコード

シーケンサー解析⽤のDNAサンプルを作る

詳細は過去のウェビナー資料をご参照ください。サポートウェビナーシリーズ 2013「イルミナ SBS (Sequencing By Synthesis) ケミストリーのご紹介」小林 孝史 イルミナ株式会社 テクニカル アプリケーション サイエンティスト

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アプリケーションごとに最適化された試薬キットの提供

DNAライブラリーの調製方法例（TruSeq Nano DNA サンプル調製キットの場合）

ゲノムDNA (1 ugから) DNAの断片化数百bp

2種類のアダプター添加→DNAライブラリー

シーケンサー解析⽤のDNAサンプルを作る

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主なサンプル調製キット（2014年3⽉現在）

TruSeq Nano DNATruSeq Nano DNA

TruSeq DNAPCR-Free

TruSeq DNAPCR-Free

Nextera XTNextera XT

Nextera Mate PairNextera Mate Pair

TruSeq カスタムアンプリコン

TruSeq カスタムアンプリコン

Nextera Rapid エクソーム

Nextera Rapid エクソーム

Nextera Rapid カスタム

Nextera Rapid カスタム

TruSight疾患パネルTruSight疾患パネル

TruSeq RNATruSeq RNA

TruSeq ストランドmRNA

TruSeq ストランドmRNA

TruSeq ストランドTotal RNA

TruSeq ストランドTotal RNA

ターゲットRNAターゲットRNA

TruSeq small RNATruSeq small RNA

TruSeq ChIPTruSeq ChIP

TruSight癌・腫瘍パネル

TruSight癌・腫瘍パネル

Nextera DNANextera DNA

TruSeq 癌アンプリコン

TruSeq 癌アンプリコン

詳しくは次回以降のウェビナーもご参照ください。

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シーケンスサンプル調製キット “Kit selector”アプリケーションに適したキットを選択しましょう

クリックして選びながら進みます

イルミナ ホームページ（http://www.illuminakk.co.jp/）

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シーケンスサンプル調製キットセレクターの使い方

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サンプル調製キット”Kit Selector”へのパスアプリケーションのページをクリック

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Selectorの使い方 – Step 1まずは使用するサンプルを選択

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Selectorの使い方 – Step 2シーケンスプロジェクトタイプを選択

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Selectorの使い方– Step 3サンプル調製のシリーズを選択

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Selectorの使い方 – Step 4サンプル調製キットのオプションを選択

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キットの詳細を確認する- Step 1サンプル調製キットのオプションを選択

各Optionをクリックすると詳細を確認できます。

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キットの詳細について- Step 2各キットの詳細情報はこちらから

技術的な情報

一般的な情報

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製品ページについて一般情報

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製品ページについて一般情報

サポートページ

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製品サポートページについて技術的な情報はこちら

ユーザーガイド

その他の情報

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選択肢の比較 – Step 1“比較”をクリック

“比較”を選択すると、詳細情報がPop upします。

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選択肢の比較 – Step 2比較情報がPop upします

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目的のアプリケーションに合わせた弊社キットの選び方

- 全ゲノム解析- ターゲット濃縮- 小さいゲノム/プラスミド- アンプリコン

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シーケンスのプロジェクトタイプに合わせて

全ゲノム解析 ターゲット濃縮小さいゲノム /プラスミド

アンプリコン

－基本的なシーケンス－ゲノムサイズの大きな生物種(>100Mb)

－エクソームまたは、特定の遺伝子領域を選択的に濃縮

－0.5-62 Mbヒトゲノム

－ゲノムサイズの小さな生物種(<20Mb)

－プラスミド

－PCR 産物－カスタムゲノムDNA

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全ゲノムシーケンスTruSeq & Nextera

TruSeq Nextera

－標準的なキット－優れたゲノムカバレッジ－物理的な断片化（超音波破砕）－TruSeq DNA , TruSeq DNA PCR-free

－微量のインプット量、アッセイ時間が短い－酵素反応による断片化（トランスポゾーム）－Nextera , Nextera XT, Nextera Mate Pair－Resequencing, de novoなど解析の目的に合わせてキットの選択が可能

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TruSeq & Nextera ワークフローの比較

TruSeq Nextera

TruSeq Nano DNA→ PCR 8 cycleTruSeq DNA PCR‐Free→ PCRなし

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全ゲノム解析

TruSeq DNA PCR-Free & TruSeq Nano DNA

Nextera DNA & Nextera Mate pair

・インデックス数（24, 96種類）・超音波破砕による断片化・ライブラリーのインサートサイズ比較－インプットDNA量

－全体の反応時間－Bisulfite処理サンプル対応

比較－目的－インデックス数－インプットDNA量－ライブラリーのインサートサイズ－全体の反応時間－DNAの断片化

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早見表: 全ゲノム 解析用キット

TruSeqDNA PCR-Free

TruSeqNano DNA

NexteraDNA Nextera XT Nextera

Mate Pair

断片化方法超音波破砕による断片化

(Covaris)酵素反応を用いた断片化

(トランスポゾーム)酵素反応、超音波破砕

アッセイ時間 ~ 5時間 ~ 6時間 1.5時間 1.5時間 1-2日

スタート量 1 ug / 2 ug 100ng / 200 ng 50 ng 1 ng 1 ug/ 4 ug

ゲルフリー Yes Yes Yes Yes 選択

インサートサイズ 350 / 550 bp 350 / 550 bp < 300 bp < 300 bp 2-15 kb

アプリケーション全ゲノム

de novo / re-seq全ゲノム

de novo / re-seq全ゲノム

de novo / re-seq

ゲノムサイズの小さい生物種/プラスミド/アンプリコン

全ゲノムde novo / re-seq

インデックス数 24 , 96 24 , 96 24 , 96 24 , 96 12

Bisulfite対応 - ロースループット - - -

詳細

-PCR由来 バイアス無し-ゲノムカバレッジ良好(読めない領域を大きく低減、GC/ATリッチな領域に対して大きく改善)

標準キット-ゲノムカバレッジ良好(読めない領域を大きく低減、GC/ATリッチな領域)

微量、迅速 超微量、微生物メイトペアシーケンス、

長断片に対応、

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ターゲット濃縮 シーケンスNextera Rapid Capture, TruSight

・ヒトゲノムのみに対応・Nexteraの技術を利用（微量スタート、断片化装置を必要としない）

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Nextera Rapidエクソーム

エクソーム/ターゲット濃縮

Nextera Rapidカスタム濃縮

TruSight

キットNextera RapidCapture Exome

Nextera RapidCapture

Expanded Exome

Nextera Rapid CaptureCustom Enrichment

TruSightOne/ Exome/ Cancer/

Autisum/ Cardiomypathy/ Inheritated Disease)

概要

－Design Studioでプローブを設計－エクソーム/疾患パネル、カスタムに追加可能

特定の疾患や症状に特化したゲノム領域や遺伝子をターゲットとする

ターゲット領域のサイズ/コンテンツ

37 Mb / エクソン62 Mb / エクソン,

UTR, miRNA0.5 Mb ～15 Mb /

エクソン20 Kb ～ 12 Mb /

疾患に関する遺伝子(エクソン)

スタート量 50 ng 50 ng

アッセイ時間 1.5日 1.5日

濃縮時のサンプルプール数

12 12

インデックス数 24 96

33Mb 29.1Mb4.1Mb

Nextera Rapid Capture Expanded Exome(62.1Mb)

Nextera Rapid Capture Exome (37.1Mb)

ターゲット濃縮 シーケンスNextera Rapid Capture, TruSight

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小さいゲノム / プラスミド / アンプリコンシーケンスNextera XT

Nextera Nextera XT

アプリケーション

サイズの大きいゲノム (>100Mb)例: ヒト, 植物, 無脊椎動物

小さいゲノム (<20Mb)、プラスミド、アンプリコン例: 細菌, 古細菌, ウイルス

アッセイ時間(ハンズオン) 90分（15分） 85分（10分）

スタート量 50 ng 1 ng

断片化後の精製 Zymo™ Purification Kitを使用 No

ライブラリー量の平均化 Qubit, Bioanalyzer キット付属のビーズを使用

インデックス数 24, 96 24, 96

サンプルのスタート量に応じて、キットをお選びください。

ゲノムサイズの小さい生物種の場合は、全ゲノム解析に対応

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アンプリコンシーケンスTSCA, TSACP, Nextera XT

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Nextera XT, TSCA, TSACP の選択方法アンプリコン シーケンス

Nextera XT TruSeq Custom Amplicon (TSCA)

TruSeq Amplicon Cancer Panel (TSACP)

概要アンプリコン/プラスミド/小さいゲノムに対応

・Design Studioでプローブを設計するモデル

・1536ターゲットまで対応可

・癌に関連する48遺伝子から、212の癌関連ホットスポット領域をシーケンス

・~35kbの癌関連遺伝子に対応・FFPEサンプルにも対応

対象生物種 全て ヒト、マウス、ラット、ウシ ヒト

コンテンツ領域範囲 - 100-500kb 35 kb

アンプリコン数 - 1536 212

所要時間 85分 ~8時間 ~7時間

特異性 - > 70 % > 85 %

スタート量 1ng 150-250 ng 150-250 ng

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早見表: DNAサンプル調製キット

DNA

全ゲノム解析> 100Mb

ターゲット濃縮500kb-62Mb ヒトゲノム

小さいゲノム/プラスミド< 20Mb

アンプリコンPCR産物&ターゲット領域

TruSeqカバレッジが良好

Nextera迅速&微量スタート

Nextera Rapid Capture Exome37Mb エクソン

Nextera Rapid Capture Expanded Exome62Mb エクソン, UTR, miRNA

Nextera Rapid Capture カスタム濃縮0.5-25Mb カスタムコンテンツ

Nextera XT迅速&微量スタート

TruSeq Custome Amplicon< 650kb カスタムコンテンツ

TruSeq Custom Amplicon Cancer Panel48癌関連遺伝子

Nextera XT> 300bp アンプリコン

TruSeq Nano DNA標準キット

TruSeq DNA PCR-FreePCR増幅によるバイアスがない

Nextera DNA迅速&微量スタート

Nextera DNAメイトペアシーケンス

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ChIP TruSeq ChIP-Seq

Poly-A付加した mRNA

全トランスクリプトーム解析

miRNA

微量スタート mRNA

TruSeq RNA v2

TruSeq Stranded mRNA LT/HT

ヒト/マウス/ラット

植物/バクテリア/その他

TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero

Human/Mouce/Rat

TruSeq Stranded Total RNAwith Ribo-Zero Gold

TruSeq Stranded Total RNAwith Ribo-Zero Globin

TruSeq Small RNA

SMARTer Ultra Low RNA

全トランスクリプトーム解析

植物/バクテリア/その他

TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero

Human/Mouce/Rat

TruSeq Stranded Total RNAwith Ribo-Zero Gold

TruSeq Stranded Total RNAwith Ribo-Zero Globin

ヒト/マウス/ラット

RNA

高品質 RIN ≧8

低品質 RIN ＜8

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参考文献

イルミナのホームページから得られる情報

– http://www.illuminakk.co.jp/applications/sequencing.ilmnシーケンスサンプル調製キットセレクター

（目的のアプリケーションに沿ったキット）

– http://www.illuminakk.co.jp/pdf_sel.ilmn日本語版 製品資料のダウンロード

– http://www.illuminakk.co.jp/support/training.ilmnウェブ上でトレーニング（英語）

– MyIllumina（弊社サイト内）からユーザーガイドのダウンロード

– サポートメールニュース、イルミナからのお知らせメール（登録が必要）

RNAキットに関して:– 次回のTS webinar, 2014/04/18 15:00-15:30,

NGSをはじめよう！RNA-Seq入門（キットの選び方、実験デザイン）

イルミナシーケンサーの原理について:– Bentley et al. (2008) Accurate whole human genome sequencing using reversible

terminator chemistry. Nature 456: 53-59

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ご清聴ありがとうございました。ご質問はtechsupport@illumina.comでも承ります。