Www2.Ac-lyon.fr Enseigne Biotech Microbio Milieux

5/14/2018 Www2.Ac-lyon.fr Enseigne Biotech Microbio Milieux - slidepdf.com

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(c) Copyri ght P.Y. Guillaume 2004

M erci à I sabell e D arinot et V éronique Serventon pour l eur aide.

L'utilisation des photos et documents ne peut s'effectuer que dans un cadre pédagogique et non lucratif.

- Mili eu Chapman

Le milieu de Chapman est un milieu sélectif, surtout utilisé en microbiologie médicale, permettant la croissance des germeshalophiles. Parmi ces germes figurent au premier rang les bactéries du genre Staphylococcus, mais aussi les Micrococcus, les

Enterococcus, les Bacillus, et de rares bactéries à Gram négatif.

Aspect du milieu avant

utilisation

Mode

d’ensemencement

Sélectivité /

composition

Caractères

recherchés

Résultats

L'ensemencementdoit être massif, enstries serrées ou parinondation

Ce milieu contientun inhibiteur :fortesconcentrations enchlorure de sodium

(75 g.L-1), ce qui

permet un isolementsélectif deStaphylococcus tolérant les fortesconcentrations enNaCl

On peut étudier lafermentation dumannitol par virageau jaune del’indicateur coloré,le rouge de phénol,autour des colonies.

Les colonies mannitol + sontentourées d’une auréole jaune.

Ne pas confondre la pigmentationdes colonies et le virage del’indicateur coloré.

Ainsi des colonies pigmentées enaunes et mannitol + : forte

suspicion de S. aureus Aspect du milieu aprèsutilisation

Page 1 of 54Les milieux de culture en microbiologie

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- Milieu Hektoen

La gélose Hektoen est un milieu d'isolement des Salmonelles et des Shigelles, bien que de nombreuses bactéries à Gramnégatif puissent se développer sur ce milieu. L'identification d'entérobactéries pathogènes repose sur la non utilisation des glucidesprésents dans le milieu.

Aspect du milieu avantutilisation

Moded’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractèresrecherchés Résultats

L'ensemencement sefait par lestechniqueshabituelles.

Deux indicateurssont présents dans lemilieu :

- le bleu debromothymol(indicateur de pH)

- la fuschine acide(qui se colore enprésenced'aldéhyde.

trois types deglucides : lasalicine (qui est unhétéroside), lesaccharose et lelactose.

La production

d'H2S à partir de

thiosulfate

Colonies saumon : Escherichia,

Levinea, Citrobacter diversus,

Klebsiella, Enterobacter, Serratia,

Yersinia

Colonies saumon à centre noir :Citrobacter freundii, Proteu

vulgaris,

Colonies bleu-vert à centre noir :Suspicion de Salmonella,différencier de Proteus mirabilis

Colonies bleu-vert ou vertes :Suspicion de Shigella ou deSalmonella

Aspect du milieu aprèsutilisation


































































































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- Gélose SS

Gélose Salmonella-Shigella.

Milieu sélectif permetta nt l’isolement d'en térobactéries pathogèn es.

Il est très utilisé pour la recherche de Salmonella dan s les selles et les denr ées alimentaires peu pou r les Shigella car trop

sélectif.


Mode d’ensemencement Sélectivité / composition

Caractèresrecherchés

Résultats

Isolement par la méthodedes cadrans.

Incuber 18 à 24 h à 37°C.

Le milieu contient 3inhibiteurs :

- sels biliaires,

- vert brillant

- forte concentration

en citrate de sodium.

Ceux-ci empêchent lapousse de toutes

bactéries Gram+, et

rendent difficile lacroissance des

bactéries Gram-

autres queSalmonella etShigella.

Le milieu contientdu lactose pouvantêtre fermenté.

Le milieu contientdu thiosulfatepouvant donner du

H2S.

colonies rouges : lactose+

colonies incolores :lactose –

colonies à centre noir :H2S +

Aspect du milieu après utilisation






























































































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- Milieu EMB

Milieu Eosine Bleu d e Méthylène.

Milieu d 'isolement d es bacilles Gram -.

Il est très u tilisé pou r l’isolement d es coliformes.

- Mili eu Mac Conkey

Milieu sélectif pour l'isolement des bacilles Gram- Salmonella et Shigella ainsi que des bactéries coliformes dans les eaux, les produits

alimentaires, les produits pharmaceutiques et biologiques .





Isolement par laméthode des cadrans.

Ce milieu contientdeux colorants,l’éosine et le bleude méthylène quiinhibent la majeurepartie de la flore

Gram+ (sauf

Streptocoques D).Bien que lesEntérobactéries

lactose - puissents’y développer, laculture desEntérobactérieslactose + y estfavorisée.

Le milieu contientun critère dedifférenciation, lelactose

colonies violettes : semi-bombéesde 2 à 3mm de diamètre avec éclatmétallique, centre sombre : E. col

très bombées muqueuses dediamètre 5 mm centra gris marronsans reflet Klebsiella

colonies grisâtres :- 1 à 2 mm de diamètretransparentes, grises ambrées :

Salmonella, Shigella.

- 2 mm de diamètre, grisâtres avecune pellicule autour de la colonie :Proteus morganii

punctiformes et grisâtres : Enterococcus.







Résultats

Isolement par laméthode descadrans.

Incuber 18 à 24 hà 37 °C.

Ce milieucontientdeux

inhibiteursde la flore

Gram+ :

- les selsbiliaires

- le cristalviolet

le lactose

dont

l’utilisationest révélée

par

l’indicateur

coloré du

milieu, le

rouge

neutre.

coloniesrouges entouréesd’un hâlo

opaque de lamême couleurdu à laprécipitation dessels biliaires:

lactose+

colonies jaunesou incolores :

lactose-





































































































































































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- Milieu CLED

Le milieu CLED (Cystine Lactose Electrolyte Déficient) est un milieu non sélectif , très utilisé dans l'étude des bactériescontenues dans l'urine. Etant un milieu non sélectif de nombreuses bactéries, tant Gram + que Gram -, pourront se développer.

L’absence d’électrolytes (pas de NaCl) limite le phénomène d’envahissement par les Proteus.






La lectures'effectue après 18à 24 heuresd'incubation à 37°C.

Lactose lactose +apparaissentaunes

lactose – apparaissentbleues vertes




























































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- Milieu BCP

C’est un milieu utilisé pour la détection et l’isolement des entérobacteriacées dans l’eau, les produits alimentaires, l’urine etles selles

Ce milieu facilite la différenciation des colonies par le caractère lactose. Il inhibe l’envahissement de la surface de la boitepar des nappes de Proteus car il ne contient pas d'électrolytes.

C’est un milieu non sélectif qui est utilisé pour l’isolement de nombreuses espèces n’appartenant pas aux entérobactéries.

C’est un milieu contenant une base nutritive ordinaire permettant la pousse des bactéries non exigeantes.

Il contient un critère de différenciation : la fermentation du lactose révélée par le virage en milieu acide de l ’indicateur coloré de pH, lebromocrésol pourpre.

Il est déficient en électrolytes : absence d'ions minéraux.






Résultats

Isolement

18 à 24 h à 37°C

- Non

selectif

- Dépourvuenélectrolyte

-Bromocrésolpourpre

- Espèces

n’appartenantpas auxentérobactéries

- Fermentationdu lactose

Colonies

bleues :bactérieslactose –

Coloniesaunes :

bactérieslactose +





































































































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- Milieu Bair d Parker

Recherche et dénombrement de Staphylococcus aureus

Ce milieu contient une base nutritive riche.

Il contient des accélérateurs de la croissance : le pyruvate de sodium et le glycocolle






Résultats

Isolement

18 à 24 h à 37°C

Il contient 2inhibiteurs :

le chlorurede lithium

le telluritedepotassium.

Contient 3critères dedifférenciation :

réduction dutellurite

protéolyse desprotéines duaune d'œuf

hydrolyse parune lécithinasedes lécithinesdu jaune d'œuf

− en tellurenoir

− halo clairautour de la

colonie

− liseré blancopaqueautour de lacolonie















































































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- Milieu BEA

Milieu d'isolement sélectif des Streptocoques D (entérocoques et non entérocoques).






Résultats

Le milieu présentéen boite de Pétriest destiné à unisolement.

Le milieu présentéen tube est àbeurrer avec uneculture pure car ilentre dans lagaleried’identificationdes coques gram +de culture facile.

C’

est unmilieusélectif desstreptocoquespeuexigeants.

Il contient 2inhibiteurs :

- la bile debœuf

- l’azide de

sodium

l’

esculinerévélée parle citrate deferammoniacal

Pousse depetites colonies

sur le milieu :StreptocoquesD

Coloniesentourées d'unhalo noir :esculine +





















































































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- Gélose au sang

C’est un milieu d’isolement enrichi sur lequel les Streptocoques se développent bien. Il permet, la lecture du caractèrehémolytique.

C’est un milieu riche d’autant plus par la présence de sang.





Isolement

18 à 24 h à 37°C

Hémolyse Hémolyse β : zone claired’hémolyse totale dediamètre 3-4 mmentourant les colonies.

Hémolyse α : zone floueet granuleuse, verdâtre de1 à 2 mm de diamètre





























































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- Milieu Slanet z

Milieu de dénombrement des entérocoques en microbiologie alimentaire. Son emploi est surtout réservé aux eaux, aprèsfiltration.






Résultats

Isolement

Filtration

Il contient uninhibiteur desgram -, quisélectionne lesStreptocoques :l’azide desodium.

le TTC quilors de saréductiondonne unecolorationdesbactériesen rouge.

LesEntérocoquesdonnent descolonies detaille moyenne,roses ourouges.

Les Bacillus

peuventpousser etdonner lemême aspectde colonies,

mais de tailleplusimportante.










































































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- Milieu Cétr imide

La gélose au cétrimide est un milieu sélectif , qui permet l'isolement des Pseudomonas et notamment de P.aeruginosa. Ce milieugélosé est relativement pauvre, et contient un antiseptique: le cétrimide (bromure de N-cétyl-N, N, N-triméthylammonium). Cemilieu, proche du milieu King A, favorise aussi la production de pigments par P.aeruginosa.





Ensemencer lasurface du milieu aumoyen de l'anse.

Incuber durant 24heures à 37°C, voiremême de préférenceà 42°C (l'incubationà 42°C permet unisolement spécifiquede P.aeruginosa).

Sur ce milieu de trèsnombreuses bactériessont inhibées de par laprésence del'antiseptiquecétrimide(bromure deN-cétyl-N, N, N-triméthylammonium).,ainsi que par laprésence del'antibiotique acidenalidixique (inhibiteurde nombreuses

bactéries à Gramnégatif).

-pyoverdine

-pyocyanine

Milieu bleu : pyocyanine

Milieu jaune- vert : pyoverdine






















































































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- Gélose Sabouraud

La gélose de Sabouraud constitue un milieu classique pour la culture, l'isolement et l'identification des levures et des moisissuressaprophytes ou pathogènes.

Elle est recommandée essentiellement pour l'isolement des moisissures dans les prélèvements peu chargés en bactéries, les contrôlesde stérilité des produits pharmaceutiques, cosmétiques ou alimentaires, la culture des moisissures en vue de réaliser leur identification.

Dans le cas de prélèvements fortement contaminés, il est préférable d'utiliser la gélose Sabouraud + chloramphénicol .



- Transférer l'échantillon à analyser sur le milieu.

- Etaler l'inoculum en surface à l'aide d'un étaleur en verrestérile.

- Incuber à 20 - 25°C de 3 à 5 jours.

L'ajout de triphényltétrazolium àraison de 100 mg par litre en faitun milieu de différenciationpour les Candida.












































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- Gélose Sabouraud plus chloramphénicol

Aspect du milieu avantutilisation Mode d’ensemencement Sélectivité / composition Caractères recherchés

- Transférer l'échantillon à analysersur le milieu.

- Etaler l'inoculum en surface à l'aided'un étaleur en verre stérile.

- Incuber à 20-25°C de 3 à 5 jours.

Chloramphénicol Recherche des champignons





































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- Gélose CI N

Milieu d'isolement sélectif des Streptocoques D (entérocoques et non entérocoques).





Résultats

Isolement. 2 inhibiteurs permetde sélectionner laculture desstreptocoques dugroupe D.:

- la bile de bœuf

- l’azide desodium

l’

esculine révéléepar le citrate de ferammoniacal

Pousse de petites colonies sur lemilieu : Streptocoques D

Colonies entourées d'un halo noir :esculine +



























































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- Gélose au lait





Faire une striecentrale à la surfacedu milieu.

Incuber 24H à7jours à latempérature désirée.

l ’hydrolyse de lacaséine

L’hydrolyse de la caséine se traduit parl’apparition d’une zone claire autour dela culture.



















































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- Gélose à l’amidon





Ensemencer par unestrie à la surface dumilieu.

Incuber un à huitours à la

température désirée.

l’hydrolyse del’amidon.

Hydrolyse mise en évidence par l’ajoutd’une solution iodée :

- une coloration bleu-rouge due àl’amidon, montre qu’il n’a pas étéhydrolysé

- la disparition de cette colorationmontre son hydrolyse.
































































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- Gélose à l’oeuf





Faire une strie à lasurface du milieu,ou éventuellement

des touches.

Incuber pendant 24h ou plus à 37°C.

La lécithinase l'action de la lécithinase libère de lacholine soluble et un diglycéride peusoluble qui précipite dans le milieu

provoquant un hâlo autour de la culture















































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- Gélose Dr igalski

Milieu sélectif permettant l’isolement des bactéries Gram - non exigeantes. Il est utilisé pour l’isolement des

germes urinaires et pour la coproculture





Résultats

Isolement par laméthode descadrans.

Contient deuxinhibiteurs de la

flore Gram+ :

- le désoxycholatede sodium

- le cristal violet

Fermentation dulactose

Les colonies de bactéries lactose + sontaunes.

Celles de bactéries lactose – sontbleues.

























































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- Gélose TSN

Milieu de dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs (spores de Clostridium sulfito-réducteurs et Clostridium perfringens) dansles produits alimentaires.

Aspect du milieuavant utilisation

Aspect du milieuaprès utilisation




Résultats

Isolement

L’incubation se faiten anaérobiose.

La températured’incubationpermet desélectionner lesdiférents typesbactérien.

Réduction par lefer du sulfite desodium

- les anaérobies sulfito-réducteurs : à 37°C

- Clostridium perfringens à 46°C

Colonies rouges : coloniessulfito réductrices



































































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- Gélose TCBS





Ensemencer à partirde la selle. Incuber24 heures à 37°C.

La forteconcentration enbile et en citrate,

associée à un pHélevé (pH = 8,6)permet l'éliminationde nombreusesbactéries

Recherche etl'isolement desvibrions pathogènes

présents dans lesprélèvements polymicrobiens

- Colonies jaunes (Vibrionssaccharose +)

- Colonies vertes (Vibrionssaccharose -)

- Petites colonies jaunes

- Petites colonies vertes

Colonies à centre noir : colonies

H2S +.

































































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- Gélose à l’ADN





Percer la gélose detrous.

Inoculer avecquelques gouttes d'unbouillon creur-cervelle ensemencéauparavant et bouilli10 minutes.

Incuber 4 heures à 37oC.

la DNase thermorésistante deStaphylococcus

halo rose signant la DNase autourdes trous percés sur le fond bleu dela gélose

















































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- Gélose lact osée au désoxycholat e 0. 1%

Milieu de dénombrement des coliformes en microbiologie alimentaire (analyse des eaux et des aliments).





Résultats

- Isolement 2 inhibiteurs desbactéries Gram+ à

faible concentration :

- le désoxycholate (selsbiliaires)

- le citrate de sodium.

le lactose Colonies rouges : bactéries lactose+

,coliformes

Colonies incolores : bactéries lactose-
























































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- Milieu Muller Hint on


Aspect dumilieu aprèsutilisation




Résultats

selon le cas :

- isolement

- ensemencementen nappe avecinoculum

L’amidonneutralise les

inhibiteursapportés parla gélose

Sensibilité auantibiotiques et

au composé O129

















































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- Gélose nut r it ive ordinair e

Aspect du milieu avant utilisation Mode

d’ensemencement Sélectivité / composition


Ensemencement parisolement.

Ces milieuxpermettent laculture des

bactéries peuexigeantes

- Certaines colonies peuventavoir des couleurscaractéristique.

Aspect du milieu après utilisation






































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- Milieu Todd Hewit

Ce milieu glucosé tamponné convient bien à la culture des bactéries exigeantes supportant mal les variations de pH, il est bienadapté à la culture des Streptocoques.






Résultats

Ensemencementpar isolement.

système tampon(phosphates,bicarbonates)permet d’empêcherque l’acide formépar le métabolismedu glucosen’exerce une actionnuisible sur lesbactéries



















































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- Milieu TTC t ergitol

Milieu de recherche et de dénombrement des coliformes. Il est surtout utilisé pour la colimétrie des eaux par la méthode de filtration.





Résultats

Filtration le Tergitol 7permettant desélectionner lescoliformes et inhibeaussil’envahissement parProteus

- le TTC qui montrele pouvoir réducteurdes bactéries

- le lactose dontl’utilisation estrévélée par le viragedu bleu debromothymol

- colonie rose-rouge : réduction duTTC

- colonie jaune : absence deréduction du TTC

- halo bleu-vert : lactose –

- halo jaune : lactose +

E. coli et Enterobacter aerogenes

donnent des colonies jaunes

Les autres coliformes donnent des

colonies rouges.









































































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- Gélose au sang cuit

C’est un milieu d’isolement enrichi préconisé pour l’étude des Neisseria notamment le méningocoque. Il est aussi utilisé pourla culture de Haemophilus influenza.





Résultats

- Isolement L’amidon de maïsneutralise lessubstances toxiqueslibérées par lescultures.
















































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- Gélose Mossel

Milieu utilisé en alimentaire pour l’isolement de Bacillus cereus.


Mode d’ensemencement Sélectivité / composition Caractèresrecherchés

Résultats

Etaler une goutte de produit àéudier et au rateau, avec desbilles ou par inodation

Assuré par la polymyxinequi inhibe ou retarde lacroissance d’autre espèces.

Croissance ouabsence

croissance decoloniemannitol –

lécthinase +

Si il y a croissance alorsprésence de la souche Bacillus cereus : colonie

- roses rouges(mannitol -)

- halo blanchâtre aucentre de la colonie(lécithinase +) Aspect du milieu après

utilisation






























































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- Milieu Hajna- Kligler

Le milieu de Hajna-Kligler est un milieu complexe, qui permet la recherche de plusieurs caractères biochimiques. Il est très utilisédans l'identification des Enterobacteriaceae.

Aspect dumilieuavant

utilisation

Aspect du milieuaprès utilisation Mode d’ensemencement



Ensemencer abondamment lasurface par stries serrées ou parinondation, puis le culot par simplepiqûre, à l'aide de la même pipetteboutonnée. Il est important de nepas oublier de dévisserpartiellement la capsule afin depermettre les échanges gazeux.

Mettre à l'étuve 24h à 37°C.

Utilisation duglucose

Utilisation dulactose

Production H2S

Production de gaz

Recherche de la

LDC

a) Bactérie de tyfermentatif du glucoselactose + : culot jaunepente jaune.

b) Bactérie de tyfermentatif du glucoselactose - : culot jaunepente rouge.

c) Bactérie de type oxydadu glucose ou glucose -

lactose - : culot rougepente rouge.

d) Bactérie de type oxydadu glucose et lactose +culot rouge et pente jauCes bactéries sont aérobistrictes : le culot ne doit pprésenter de culture et sedonc rouge. La pente peprésenter une culture et seaune si l'acidification

suffisante et rouge danscas contraire. Le milieu

Kligler n'est généralemepas utilisé pour de tellbactéries, qui sont souvelactose -, et des expérienccomplémentaires sont faitpour préciser le résultat.











































































































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- Milieu Lysine Fer

Ce milieu peut être utilisé en routine mais il est généralement utilisé pour l’identification des souche de Salmonella.

Aspect dumilieuavant

utilisation




Résultats

Pratiquer l’ensemencementla pente ave des stries et leculot par piqure centrale

La lysinedésaminase (LDA)

La lysinedécarboxylase(LDC)

La production

d’H2S

Pente violette, culot jaune :

bactérie LDA -, LDA -, H2S –

Pente violette, culot violet :

bactérie LDA – LDC +, H2S - ,

K. pneumoniae, K. oxytoca,

Enterobacter (sauf cloacae),

Serratia, E. coli, S. typhi.

Pente violette, culot jaune :

bactéries LDA -, LDC – H2S –

ou + Escherichia, Shigella, E.

cloacae, K. rhinoscleromatis,

Citrobacter, S. parathyphi A,

Yersinia, Levinea, E. coli (biotypeLDC -)

Pente violette, culot violet avecnoircissement : bactérie LDA –

LDC +, H2S + , Salmonella H 2S

+ y compris S. arizonae,

Edwardsiella

Pente rouge vineux, culot jaune :

bactéries LDA +, LDC – H2S –

ou + Proteus Providencia





















































































































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- Milieu cit r at e de Simmons

Ce milieu est un exemple de milieu synthétique, c'est à dire de milieu dont la composition, qui est complexe, est connueexactement tant qualitativement que quantitativement






Résultats

La pente estensemencée par unestrie longitudinale,réalisée à l'anse, àpartir d'unesuspension de laculture solide en eaudistillée stérile.

Il est important dene pas apporter desubstrats carbonés.Ainsil'ensemencement à

partir d'une souchepure fournie enbouillon nutritif ouen eau peptonée estimpossible.

Ne pasvisser le bouchon àfond, afin depermettre leséchanges gazeux (enparticulierélimination dudioxyde de carbone).

Mettre àl'étuve 24 heures à37°C.

Utilisation ducitrate commeseule source decarbone

- Virage de l'indicateur de pH aubleu : il y a eu alcalinisation dumilieu et la souche est citrate deSimmons +.

- Pas de virage de l'indicateur depH : il n'y a pas eu alcalinisationet le milieu ne présente pas deculture. La souche est citrate deSimmons -.
























































































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- Milieu phénylalanine

Milieu utilisé pour la recherche de la phénylalanine désaminase. Le phénylpyruvate donne une teinte verte en présence de ferIII.






Résultats

La pente parépuissement

La PDA :phénylalaninedésaminase

Pente verte après ajout deperchlorure de fer : PDA +

Pente inchangée après ajout deperchlorure de fer : PDA -













































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- Milieu Clark et Lubs

Ce milieu permet l’étude de la voie de fermentation du glucose.






Résultats

Ensemencerlargement.

Incuber 24 h à t°Coptimale.

* test VP :

- ajouter 10 gouttesd’alpha naphtol etle même volume desoude concentrée(ou de potasse).

- incliner le tubepour permettre unebonne oxygénation.

- attendre quelquesmin à 1 heure.

* test RM :

- ajouter 2 à 3gouttes de rouge deméthyl,

- la lecture est

immédiate.

soit de nombreuxacides par la voiedes fermentationsacides mixtes quisont mis enévidence par letest RM (au rougede méthyl),

soit d’acétoïneproduit parfermentationbutanedioliquequi est mise enévidence par le

test VP (Voges-Proskauer)

Test VP :

- rouge : VP+

- jaune : VP-

Test RM

- rouge : RM+

- jaune : RM-



































































































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- Milieu viande- f oie

L'étude du type respiratoire d'une bactérie (c'est à dire ses rapports avec l'O2) nécessite un milieu de culture riche contenant un

gradient de pression partielle en di-oxygène.

Le principal milieu utilisé à cette fin est la gélose viande-foie (gélose VF).

- Tube Yvan Hall

Aspect du milieuavant utilisation Aspect du milieu

après utilisation Moded’ensemencement Sélectivité /

composition Caractèresrecherchés Résultats

- régénérée lagélose VF parébullition au bain-marie bouillantpendant environ 30minutes.

- ensemencerlorsque le milieuest encore liquide,vers 45°C.

L'ensemencementse fait à la pipettePasteur scellée (ouboutonnée) etchargée. Onintroduit la pipettePasteur au fond dutube et on remonteen spirale.

Ne pas visser lebouchon à fond,sinon on empêchela formation dugradient de O2.

- refroidir à l’eaucourante,

- on place ensuitele tube à l'étuve (à37°C) pendant 24heures.

Type aérobie strict : cultureseulement en présence de dioxygène.

Type aéro-anaérobie : cultureen présence et en absence de dixoygène. La technique utilisée ne

ermet pas de différencier entre

les bactéries aéro-anaérobie

acultatives et les bactéries

anaérobies aéro-tolérantes. On

conclut type aéro-anaérobie.

Type anaérobie strict : cultureuniquement en l'absence de dioxygène.

Type micro-aérophile : cultureseulement dans une zone depression faible en di-oxygène.

Aspect du milieu avant utilisation Aspect du milieu après utilisation

















































































































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- Milieu Hugh et Leif son

De l'étude du métabolisme énergétique il découle que un glucide peut être catabolisé par voie respiratoire ou par voiefermentative. Le milieu de Hugh et Leifson permet de distinguer entre les deux processus.

La dégradation d'un glucide s'accompagne généralement d'une acidification du milieu :

- lors des respirations le glucide est oxydé en CO2

, par le dioxygène (ou un autre oxydant minéral);

- Lors des fermentations le glucide est oxydé en acides, alcools, qui sont libérés dans le milieu qu'ils acidifient sensiblement. Toutesles voies fermentaires ne sont cependant pas également acidifiantes.

Aspect dumilieu avant

utilisation





Résultats

- Régénérer lemilieu au bain-marie bouillant.Ramener à 45-50°C.

- Ajouteraseptiquement leglucide étudié (icile glucose) pourobtenir uneconcentrationfinale de 1%.

- Agiter(l'agitation doitêtre douce pouréviter l'entréed'air) et laisser le

milieu se solidifier(en le passant sousl'eau froide parexemple).

- Ensemencer parpiqûre centrale.

- Ne pas revisser àfond le bouchon.

- Mettre à l'étuve.

Le milieu deHugh et Leifsoncontient unindicateur de pH,le bleu de

bromothymol ,qui prend unecouleur jaune enmilieu acide.

Ce milieupermet dedéterminer lavoie d'attaquedes glucides,

comme parexemple leglucose.

Mobilité

- les bactéries fermentatives

- les bactéries oxydatives (quioxydent le glucide parrespiration aérobie)

- les bactéries inactives ouinertes













































































































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- Mannit ol- mobilité

Ce milieu permet l’étude de la dégradation du mannitol qui est un produit de dégradation du mannose.






Résultats

Ensemencer parpiqûre centrale àl’aide d’un fil droit.

Incuber 24 h à T° optimale.

R : ce milieu estutilisableuniquement pourles bactériesfermentatives.

Mannitol

Mobilité

Nitrate réductase

- Caractère mannitol

- milieu jaune : Mannitol +

- milieu rouge : Mannitol –

- La mobilité : Les bactériestrès mobiles peuvent se déplacerdans la gélose molle : étude de lamobilité.

- Nitrate réductase :








































































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- Tubes Falkow

Animation Flash






Pour les bactériesGram – AAF àmétabolisme

fermentatif (Enterobacteriaceaeet Vibrionaceae) :la lecture s'effectueaprès 4 jours à 37 ou30 ou 22°C.

Pour les bactériesGram – AS àmétabolismeoxydatif (Pseudomonas,

Flavobacterium, Xanthomonas,

Alcaligenes, Moraxella, Acinetobacter) : lalecture s'effectueaprès 24 à 48 h à 30°C.

- LDC : lysinedécarboxylase

- ADC : argininedécarboxylase

- ODC : ornithinedécarboxylase…

… selon l’acideaminé ajouté aumilieu

Virage au jaune (acide)décarboxylase –

Virage au violet (basique)décarboxylase +






















































































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- Tubes Möller






Pour les bactériesGram – AAF àmétabolisme

fermentatif (Enterobacteriaceaeet Vibrionaceae) :la lecture s'effectueaprès 4 jours à 37 ou30 ou 22°C.

Pour les bactériesGram – AS àmétabolismeoxydatif (Pseudomonas,

Flavobacterium, Xanthomonas,

Alcaligenes, Moraxella, Acinetobacter) : lalecture s'effectueaprès 24 à 48 h joursà 30 °C.

- LDC : lysinedécarboxylase

- ADC : argininedécarboxylase

- ODC : ornithinedécarboxylase…

… selon l’acideaminé ajouté aumilieu

Virage au jaune (acide)décarboxylase –

Virage au violet (basique)décarboxylase +




















































































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- Mili eu PCB

































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- Mili eu King A et King B

Les milieux de King (milieu King A et milieu King B permettent de différencier entre elles les différences espèces du genrePseudomonas, par la mise en évidence de la production de pigments spécifiques.

L'élaboration des pigments est influencée par la composition du milieu, ce qui justifie l'utilisation de deux milieux différents : King Aet King B.






- A partir d'uneculture sur gélose(faire unesuspension en eaudistillée) ou dansun bouillon,ensemencer lemilieu en faisantune strie à lasurface de la géloseavec l'anse (ou en

déposant unegoutte desuspension).

- L'incubation estréalisée enaérobiose.

la production depyocanine, duespécifiquement àPseudomonas

aeruginosa, estfavorisée par laprésence d'ionsinorganiques. Larecherche de laproduction depyocyanine est

effectuée surmilieu King A.

la production depyoverdine, estfavorisée par uneteneur élevée enphosphate. Larecherche de laproduction depyoverdine esteffectuée surmilieu King B.

- couleur bleue sur le milieuKing A (présence depyocyanine)

- couleur jaune-vert fluorescentsur le milieu King B (présencede pyoverdine) sous UV.



























































































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- Bouillon cœur- cervelle

Milieu de mise en évidence de la respiration sur nitrates, par recherche de la nitrate réductase (NR).






Résultats

Introduire quelquesgouttes de cultureliquide à la pipettePasteur, ou uneoese de culturesolide, dans lebouillon

Homogénéiser.

Incuber 24 heures à37°C.

Test nitrate-réductase Voir NR


















































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- Gélose PCA

La gélose glucosée à l'extrait de levure appelée par les Anglo-Saxons "Plate Count Agar" est utilisée en bactériologie alimentaire pourle dénombrement des bactéries aérobies dans le lait, les viandes, les produits à base de viande, les autres produits alimentaires, ainsique pour l'analyse des produits pharmaceutiques, des produits cosmétiques et de leurs matières premières.






- Faire fondre lemilieu (s'il estpréparé à l'avance).

- Refroidir etmaintenir à 48°C.

- Transférer 1 mldu produit àanalyser et de sesdilutions décimalessuccessives dansdes boîtes de Pétri

stériles.

- Couler 10 à 15 mlde milieu.

- Homogénéiserparfaitement.

- Laisser solidifiersur une surfacefroide.

- Couler 4 ml de

gélose blanchestérile

- Laisser solidifierà nouveau.

- Incuber:

Peu être additionnéadditionné de lait

La casèinase On tiendra compte des boîtes dePetri contenant un nombre decolonies compris entre 30 et 300

Les bactéries caséolytiquesforment un halo plus clair autourde chaque colonie (protéolyse dela caséine du lait)


















































































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- Gelose Esculine agar

L'esculine est un hétéroside (molécule composée d'un ose associée à une structure non osidique). L'hydrolyse de l'esculine, catalysée

par une β-glucosidase : l'esculinase, est un des critères usuels utilisé dans l'identification différerentielle au sein de nombreux genresbactériens, notamment les Pseudomonadaceae et les Streptococcaceae.






Résultats

Piqûre centraledans le culot, etincubée à 37°C.

Recherhce del'esculinase

Milieu présente une fortecoloration noire : hydrolyse del’esculine : esculine +

Le milieu ne présente pas decoloration noire : esculine -



























































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- Milieu Rappapor t

Milieu sélectif d'enrichissement pour la recherche des Salmonelles.




Ensemencer largement.

Incuber 24 h à t°C optimale.

Vert malachite, MgCl2 et pH acide =>rendent le milieu très sélectif permettant unenrichissement en Salmonella à l'exceptionde Salmonella typhi et Salmonella paratyph

A-B et C.










































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- Milieu synthét ique avec xylose

Ces milieux permettent l’étude du métabolisme glucidique pour l’identification des différentes espèces de Bacillus.






Résultats

Ensemencer lapente par desstries serrées àl’öse et le culotpar piqûre centraleau fil droit.

Incuber 1 à 15ours à la

températuredésirée.

Observer tous lesours pendant une

à deux semaines

Il ne contient pasde peptone celapermet d’évitterune possiblealcalinisation dumilieu pardégradation despeptones.

Le métabolismedes glucides qui sefait par la voieoxydative.etfermentative

L’

attaque d’

un glucide setraduit par un virage du BCPdu violet au jaune.

Soit tout le tube ou surtout leculot : espèce fermentative.

Soit de la pente seulement :espèce oxydative.


















































































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- Milieu Hypersalée

Ce sont des milieux où les conditions de vie sont très difficiles par modification de pH, de pression osmotique ou par l ’addition d’unagent inhibiteur.

Ces milieux sont utilisés dans la macro galerie d’identification des Streptococcus du groupe D.






Quelques gouttesde suspension

Incubation : 24 à48 h à 37°C.

Culture en milieuhypersalé

- tube clair : stérile négatif.

- tube trouble : positif.






















































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- Milieu Hyperbilié

Ce sont des milieux où les conditions de vie sont très difficiles par modification de pH, de pression osmotique ou par l ’addition d’unagent inhibiteur.

Ces milieux sont utilisés dans la macro galerie d’identification des Streptococcus du groupe D.






Quelques gouttesde suspension

Incubation : 24 à48 h à 37°C.

Culture en milieuhyperbilié

- tube clair : stérile négatif.

- tube trouble : positif.






















































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- EPO plus sacchar ose

Les bactéries peu exigeantes et aérobies facultatives peuvent utiliser le glucide du milieu par fermentation. Cela se traduit parune grande quantité d’acide produit dans le milieu. La fermentation peut s’accompagner de gaz qui s’accumule dans la cloche.






Résultats

Chasser tout le gazde la cloche enretournantvivement le tubeplusieurs fois.

Ensemencerlargement.

Incuber à t°Coptimale 24 h.

Utilisation duglucide du milieupar fermentation

Milieu jaune sans gaz : glucide+ sans gaz

Milieu jaune avec gaz : glucide+ avec gaz

Milieu rouge : glucide –

Attention aux résultatsfaussement positif et négatisfs.voir plus d’information.






































































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- Bouillon lact osé au BCP

































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- Bouillon BLBVB

Milieu de dénombrement des coliformes en microbiologie alimentaire (analyse des eaux et des aliments).






Résultats

la bile

le vert brillant

sont inhibiteurs desbactéries Gram +

le lactose dont lafermentation estrévélée par laprésence de gaz

Trouble du milieu et gaz sous lacloche alors fermentation lactosealors coliforme.














































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- Gélose Lowenst ein- J ensen

C’est un milieu d’enrichissement, sélectif qui permet le développement des mycobactéries




Sélectivité / composition Résultats

Un inhibiteur le vertmalachite. Dans des conditions optimales decroissance les mycobactéries semultiplient lentement, et l'on obtient descolonies après au minimum 7 jours, etusqu'à 8 semaines pour Mycobacterium

tuberculosis









































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05-03-2012http://www2.ac-lyon.fr/enseigne/biotech/microbio/milieux.html

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