[15. IH. 1947] Kurze Mitteilun~en - Brief reports 10 7

T h e B r o m i n a t i o n of s a t u r a t e d 3 - K e t o s t e r o i d s w i t h N - Brorno- I m i d e s

In r e c e n t issues of t h i s journa l , r e p o r t s h a v e a p p e a r e d on t h e r eac t ion of u n s a t u r a t e d ke tones w i t h N - b r o m o - succ in imide . B u u - H o i t r e p o r t e d t h a t in a l ipha t i c ke- tones (mesi ty l ox ide type) , t h e b r o m i n e e n t e r e d t h e a -pos i t ion , w h e r e a s ~{EYSTRE a n d WETTSTEIN 2 f o u n d t h a t in Ad-3-ke tos te ro ids (e, g. t e s t o s t e r o n e or pro- ges terone) b r o m i n a t i o n occur red p re fe ren t i a l l y in t h e al lyl pos i t ion . As far as we are aware , only two publ ic- a t i ons h a v e a p p e a r e d on t h e b r o m i n a t i o n of s a t u r a t e d ke tones w i t h N - b r o m o - i m i d e s . V~'OHL a b r o m i n a t e d ace- toace t i c e s t e r a n d S c a m p a n d KARRt~R 4 r e p o r t e d t h e successful b r o m i n a t i o n of c y c l o h e x a n o n e a n d of a ke to- pe la rgonic acid de r iva t ive .

W e were i n t e r e s t e d in s t u d y i n g t h e b r o m i n a t i o n of s a t u r a t e d 3 -ke tos t e ro ids w i t h t h e s e r e a g e n t s because (a) if successful , i t wou ld a f fo rd a m e a n s of b r o m i n a t i n g w i t h o u t t h e s i m u l t a n e o u s l ibe ra t ion of h y d r o g e n bro- mide w h i c k m a y cause s u b s e q u e n t r e a r r a n g e m e n t s , and (b) t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e c o n v e n t i o n a l ru les 5 se t f o r w a r d for t h e r eac t ion w i t h b r o m i n e ( subs t i t u t i on a t C~ in m e m b e r s of t h e allo a n d a t C4 in t h o s e of t h e normal series) wou ld ho ld also for th i s t y p e of r eagen t .

I t was found t h a t by r e f lux ing e q u i m o l a r q u a n t i t i e s of s t e ro id ke tone a n d N - b r o m o s u c c i n i m i d e or N - b r o m o - p h t h a l i m i d e in c a rbon t e t r a c h l o r i d e so lu t ion in s t r ong l ightL reac t ion was c o m p l e t e a f t e r one to t w o m i n u t e s as e v i d e n c e d b y s u d d e n deco lor iza t ion a n d q u a n t i t a t i v e r e cove ry of t h e haIogen- f ree imide . E v a p o r a t i o n of t he f i l t r a te to d r y n e s s in vacuo a n d rec rys ta l l i za t ion f rom a su i t ab l e so lven t y i e lded the c o r r e s p o n d i n g mono- b r o m i n a t e d s t e ro id ke tone , w h i c h in each case was found to be iden t i ca l w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g s amp le p r e p a r e d b y t h e c o n v e n t i o n a l b r o m i n e - a c e t i c ac id m e t h o d . T h e yie lds o b t a i n e d b y e i the r m e t h o d are com- parab le . In t he absence of l ight , t h e ref lux t ime had to be e x t e n d e d to a b o u t one -ha l f hou r to ob t a in s imi la r re- sul ts . Cho les tanone-3 , d i h y d r o t e s t o s t e r o n e h e x a h y d r o - benzoa te , a n d m e t h y l 3 -ke toa l l oe t i ocho l ana t e gave t h e c o r r e s p o n d i n g 2 -b romo d e r i v a t i v e s whe rea s eopro- s t a n o n e - 3 a n d m e t h y l 3 - k e t o - 1 2 - h y d r o x y c h o l a n a t e led to t h e r e spec t i ve 4 - b r o m o c o m p o u n d s L T h e a b o v e re- su l t s i n d i c a t e t h a t b r o m i n a t i o n of s a t u r a t e d 3-ke to s t e ro ids by th i s m e t h o d is feas ib le a n d t h a t t h e subs t i - t u t i o n t akes p lace a t t h e s a m e c a r b o n a t o m a n d in t h e s ame s t e r e o c h e m i c a l pos i t i on as f o u n d for b r o m i n a t i o n s in ace t ic ac id s

F u r t h e r m o r e , i t was of i n t e r e s t to us t o d e t e r m i n e w h e t h e r a d d i t i o n a l b r o m i n a t i o n of t h e b r o m o k e t o n e s cou ld be a c c o m p l i s h e d w i t h t h e s e r eagen t s . R e f l u x i n g

1 Buu-Ho~, Exper. 2, 310 (1946). 2 MEYS'rRE and WETTSTEIN, Exper. 2, 408 (1946). a WOHL, Ber. 52, 51 (1919). - VVoHL and JASCHINOWSKI, ib. 54,

476 (1921). 4 SCrLmD and KARRER, Helv. chim. aeta 29, 573 (1946). 5 Cf.: BUTENANDT and VV'OLFF, Ber. 6,~, 2091 (1935). s CI.: MTESCHER and co-workers, Helv. chim. acta 28, 1252,

1497 (1945); lb. 29, 33, 627 (1946). r In the latter case the crude bromination product, which was

difficult to purify, was dehydrobrominated with pyridine to give methyI Aa-3-keto-12-hydroxycholenate, m.p. 145-147,5 ° C, [c~]~ 3 -- 80-3 0 (acetone), nmx. at 242m/~ (Iog~.. ~ ~ 4.2g in

cthanol), in ca. 30% overall yield. RIEC, EL and MclsrosiL J. amer. chem. See. OO, 1099 (1944) obtained this compound in 35% yield, m. p. 144-145 ° C by the conventional bromination method followed by treatment with pyridine. BURC~HARD and REICHSTEIN, Heir.

17 chim. acta 2,5, g21 (1942) reported m.p. 150-152 o C, ]~]D =: - 80.9 o (acetone).

of 2 - b r o m o c h o l e s t a n o n e wi th a sI ight excess over t he e q u i m o l a r a m o u n t of N - b r o m o s u c c i n i m i d e in ca rbon t e t r a c h l o r i d e so lu t ion on e x p o s u r e to s t r o n g l ight for one m i n u t e gave 51% of c rude 2, 2 - d i b r o m o c h o l e s t a n o n e . T h e pur i f i ed p r o d u c t gave no dep res s ion in m . p . on a d m i x t u r e w i t h an a u t h e n t i c s a m p l e L I t is i n t e r e s t i n g to no te t h a t on ly s t a r t i n g ma t e r i a l could be r ecove red when t h e s a m e r eac t ion was ca r r i ed o u t in t h e a b s e n c e of s t r o n g l ight , n o t w i t h s t a n d i n g t h e fac t t h a t t h e reac t iou t i m e was p r o l o n g e d to one a n d o n e -h a i l hours . This is in c o n t r a s t t o t h e a b o v e - m e n t i o n e d m o n o b r o - m i n a t i o u of cho l e s t anone , wh ich was essen t i a l ly com- p le te a f t e r o n e -h a l f h o u r in t h e dark .

CARL DJERASSI and CAI':SAR R. SCHOI.Z

Res ea r ch D e p a r t m e n t , Divis ion of C h e m i s t r y , Ciba P h a r m a c e u t i c a l P r o d u c t s , Inc . , S u m m i t , New Je r sey , 1; .b .A. , J a n u a r y 6, 1947.

Z u s a m m e n / a s s u n g

Die B r o m i e r u n g yon ges~it t igten 3 - K e t o - s t e r o i d e n m i t N - B r o m - s u c c i n i m i d ode r N - B r o m - p h t h a l i m i d l iefer t die 2 - B r o m - 3 - k e t o - s t e r o i d e bei V e r b i n d u n g e n , die der aUo-Reihe angehi i ren , und die 4 - B r o m - 3 - k e t o - s t e r o i d e bei V e r t r e t e r n de r normaI-Reihe. Die we i t e r e Bromie - r u n g e ines 2 - B r o m - 3 - k e t o n s zut~'l 2 , 2 - l ) i b r o m - 3 - k e t o n ist m6gl ich.

1 2,'2-1)ibromocholestanone-3, m.p. 145 1470 C, [~]~2 = ~ lOiO (chloroform} was obtained by the recently described method (WILD~ and I)JEI~AssL J. amer. chem. So(:. 6S, 21i5, footnote 22a (1946). Its structure has been proven by conw,rsion to A l-2-bromo- cholestenone-3, m.p. 9I'5.92"50C, [~]~¢ = ] 37"4 o (ehlorofornd, nlax. a~ 255"~)lllt~ (tog2. ~ = 3"93 in ethanol). The details will appear in a sul)sequent publication fronl this laboratory.

A c t i o n d e l 'eau o x y g 6 n 6 e s u r u n ana6rob ie s t r i c t

Au cours de leurs t r a v a u x sur Fac t ion t o x i q u e de l 'oxygSnc, ISLLIOT et LIm.;TL STADIE 2, D I C K E N S a, MANN et QUASTEL 4 o n t m o n t r d que c e t t e ac t ion s ' e x p l i q u a i t p a r t ' e m p o i s o n n e m e n t de ee r t a ines d ias tases . Nous a v o n s de n o t r e c6t6 cons t a t~ que :

10 L o r s q u e l 'on a j o u t e de faibles quau t i t~ s d ' e a u oxy- g6n6e h une su spens ion de Cl. saccharobutyricum d a n s un t a m p o n de p h o s p h a t e r e n f e r m a n t du glucose, en a t m o s p h e r e d ' a zo t e , on c o n s t a t e n n a r r & de la pro- d u c t i o n d ' H 2 qui r ep rend , apr~s un t e m p s de la tence , avec une v i tesse 6gale ~ celle du t~moin.

2 0 P o u r des q u a n t i t ~ s p lus fo r t e s d ' e a u oxygdn6e , le t e m p s de l a t ence a u g m e n t e e t la repr i se de la p r o d u c t i o n d ' H z se fa i t ~ une v i tesse plus Iaible que celle du t6moin .

3 0 E n f i n ~ p a r t i r d ' u n e ce r t a ine c o n c e n t r a t i o n en eau oxyg6n6e, Fa r r6 t de la p r o d u c t i o n d ' H , es t d6fini t i I .

4 a On a done une c o n c e n t r a t i o n p r o v o q u a n t un a r rb t r~vers ib le e t une c o n c e n t r a t i o n p r o v o q u a n t un arr~t i r r6vers ible . Ceci est ~ r a p p r o c h e r des anc i enes c o n s t a t a - t ions de Q U A S T E L e t S T E P H E N S O N 5 s u r l ' a c t i on de l 'eau oxyg6nde d a n s Ia c ro i s sance de CL sporogenes.

50 Les quan t i t f i s d ' e a u oxyg6n6e n6cessaires pour pro- dui re le ph~,nom~ne s e n t f o n c t i o n du poids des bac-

1 ELL1OT et IARET, J. biol. Chem. 143, 227 (1942). 2 ST,~mE, RInGs et HANGAARD, Amer. J. reed. Sci. 207, 8 4 (1944) . a DICKENS, Bioch. J. 40, 145 et 171 (1946). 4 MANN et QUASTEL, Bioch. J. 40, 139 (1946). 5 QUASTEL et STEPIII4iNSON, Bioch. J. 20, 1125 (1926}.

108 Br~ves communications - Brevi comunicazioni [EXPERIENTIA VOL. III[3]

t6ries. Mais les r6sultats sont coh6rents. Pour 1 mg de bact6ries (poids sec) la limite de r6versibilit6 complete est a t te inte avec 6 y d 'HiOz, celle de l ' irr6versibilit6 avec 11 h 13 7 dans un volume de 2 cm 3.

6 o Ces chiffres ne correspondent pas aux quanti t6s maximum d'eau oxyg6n6e que peuvent fixer les bac- t6ries. Ces quanti t~s sont variables: 80 ~ 180y par mg (poids sec) de bact6ries vivantes, 60 ~ 140 y de bact~ries tu6es par la chaleur.

70 L 'eau oxyg~n6e semble donc agir d 'abord sur une substance x responsable du d6gagement d ' H , 5. par t i r du glucose ou de ses produits de d6gradation, suivant un m6canisme tel que la fixation d 'un ~quivalent d 'oxyg~ne donne une combinaison r*versible, celle de deux une combinaison irr6versible. Peut-~tre s 'agit-il de la diastase de LIPMANN, qui libbre aux d6pens de l 'acide pyruvique de I 'H, et du COy On constate en effet apr~s addit ion d'eau oxyg6n6e, lorsque le ph6no- m~ne est r6versible, une diminution de la vitesse de pro- duct ion de CO,, suivi au bout d 'un certain temps, d 'une reprise A une valeur ~gale A celle du t6moin.

Ceci concorde avec la suggestion de MANN et QUASTEL 1 qui pensent que dans le cerveau, la pyruva te oxydase, en t an t que thiol-enzyme est le facteur qui est empoi- sonn6 par de hautes tensions d 'oxygbne ou par l 'eau oxyg6n~e.

E. AUBEL, A . J . ROSENBERG et J. SZULMAJSTER

Ins t i tu t de biologic physico-chimique, Paris, le 15 jan- vier 1947.

Summary

A quan t i t a t ive s tudy on the action of H202 upon Cl. saccharobutyricum shows tha t the pr imary action is produced upon a first substance X, very likely an enzyme, following a mechanism such as one equivalent of oxygen gives a reversible combination, and two equivalents an irreversible combination.

1 MANN et QUASTEL, Bioch. J. 40, 139 (1946).

Hemmungswirkungen verschiedener Indophenole auf die Wasserstoff-

peroxydzersetzung durch Blutkatalase

Schon im Jahre 1928 wurde v o n ALEXEJEW und RUSSINOWA 1 gezeigt, dab verschiedene Wasserstoff- akzeptoren, z. B, Methylenblau, =-Dinitrophenol und Chinon, die Akt iv i tg t der Blutkatalase zu hemmen im- stande sind. Wir haben die Angaben dieser Autoren nachgeprtif t und konnten sie weitgehendst best~tigen. In einer fr/iheren Arbeit * haben wir dann eine Anzahl verschieden subst i tuier ter Chinone auf ihre Hemm- wirkung gegentiber der Blutkatalase untersucht und konnten dabei feststellen, dab bei sonst ~ihnlicher Kon- s t i tu t ion das Oxyda t ions -Redukt ions -Po ten t ia l dieser Stoffe einen EinfluB auf die St~rke der Hemmung be- sitzt. Allerdings konnten wir keine vSitige Propor- t ional i t~t nachweisen, es mfissen also auch andere Fak- toren bes t immend wirken.

Wir haben nunmehr eine Anzahl verschiedener Indo- phenole, die wir fiir einen anderen Zweck dargestell t hatten, auf ihre Hemmwirkung auf die Akt iv i t~ t der

I A. ALEXEJEW und K, RUSSrNOWA, Bull. Inst. Rech. biol. Perm, 6, 4'25 (19~8).

2 0 . HOFFMANN-OSTENHOF und E. BIACH, Mh. Chem. (im Druck).

Katalase untersucht . Bei der nahen Verwandtschaf t der Indophenole mit den Chinonen war ein Hemmeffek t yon vornherein zu erwarten und wir konnten einen solchen auch nachweisen. Die gefundenen Hemm- wirkungen waren in vielen F/~llen sehr betr/ichtlich und fiberstiegen bei einigen Indophenolen die st~rksten der bei den Chinonen gefundenen Hemmwer te . Eine Ab- h/ingigkeit yore Oxyda t ions -Redu kt ions-Potent ia l konn- te nicht festgestetlt werden; allerdings ist diese Gr6Be nicht bei allen untersuchten Stoffen bekannt.

Bei diesen Messungen wurde die gleiche Methodik und ein gleichartiges Blutkata lasepr~para t wie in der oben zit ierten Arbei t 1 ve rwand t ; die prozentuelIen Hemmungswer te sind mi t einer Fehlergrenze yon h6chstens =k2% reproduzierbar. In tier Tabelle geben wir die erhal tenen Wer te nur flit eine einzige Konzen- t ra t ion an; zum Vergleich ist auch der entsprechende Hemmungswer t eines der st/~rkst wirksamen Chinone (p-Benzochinon) bei derselben Konzentra t ion angeftihrt.

Tabdle I Hemmung der Aktivit/~t von Blutkatalase durch verschiedene lndo- )henole in 10-dmolarer Konzentration im Versuchsansatz (PH = 7).

Prozen- Substanz tuelle

Hemmung

Phenol-indophenol Phenol-indokresol Phenol- indothymol 2-Chlorphenol-indophenol 2, 6-Dichlorphenol-indophenol 2, 6- Dibromphenol- indophenol 2, 6-Dichlorphenol-indokresol 2, 6-Dibromphenol-indokresol 2, 6-Dichlorphenol-indoguaj akol 2, 6- Dibromphenol- indoguaj akol 2, 6-Dichlorphenol- Y-bromindophenol 2, 6-Dibromphenol- 3 ' -bromindophenol 2, 6-Dichlorphenol- indothymol 2, 6- Dibromphenol- indothymol 2, 6-Dichlorphenol- indonaphthol 2, 6- Dibromphenol- indonaphthol p-Benzochinon

25 42 19 20

3 18 12

7 22 20 25 32

0 5

12 15 24

Es scheint nicht mSglich zu sein, die durch Indo- phenole oder auch durch Chinone bewirkte H em m ung durch Zugabe yon Redukt ionsmi t te ln riickg~ngig zu machen. Hierbei mul3 allerdings bemerkt werden, dab Redukt ionsmi t te l ebenfalls imstande sind, eine betr/~cht- liche Hemmwirkung auf die Kata laseakt iv i t / i t aus- zufiben. So wurde unser BlutkatalaseprS.parat yon Natr iumhydrosulf i t in 10 -*molarer Konzentra t ion in seiner W'irkung um 20% gehemmt. Auch organische XVasserstoffdonatoren zeigen eine Hemmwirkung , so hemmte Hydrochinon in 10-dmolarer Konzentra t ion die Blutkatatase zu 31%; SEIDE 2 berichtet fiber gr613en- ordnungsm~Big entsprechende Hemmungen yon kristal- lisierter Leberkatalase durch Phenylhydroxylamin , Aminophenole und /~hnliche Substanzen. Vielleicht las- sen sich auch die in der itlteren Li tera tur beschriebenen Kata lasehemmungen dutch Ferri-, Cupro- und Mangano- salze als Oxydations- bzw. Redukt ionswirkungen deuten.

I O. HOFFMANN-OSTENHOF und E. BtACH, Mh. Chem. (ira Druck). 2 G. SEn)E, Biochem, Z. 30,% 175 (1941).