BIOCHIMIE, 1972, 54, 319,-324.

ADN polymdrases de foie de rat" groupes thiols et activitd enzymatique.

Jean-Michel ROSSIGNOL, Jan ine ABADIEDEBAT, Jeanne TILLIT et Anne-Marie de RECONDO.

Insti tut de Recherches Scienti f iques sur le Cancer, B.P. N ° 8, 94-Vil lejui[ . (23-12-1971).

Summary. - - The inhibitory effects of p-ehloromercuribenzoate and N-ethylmaleimide were studied in a purified preparation of Deoxyribonucleotide acid polymerase from regenerating rat liver. This work leads to the conclusion that at least one eyslein residue is essential for eatalytie activity.

The addition of 2-mereaptoethanol or dithiothreitiol to the enzyme increases consi- derably its activity. The pre-ineubation of templates with the enzyme seems to give a partial protection of the enzyme against any further inhibition by p-ehloromereuri- benzoate. On the other hand, deoxyribonueleotide triphosphates are ineffective to this end.

DNA polymerase from transplantable rat hepatoma is also inhibited by p-ehloromereuri- benzoate and N-ethylmaleimide.

INTI~ODUCTION.

L 'ut i l i sa t ion de 2-mercapto6thanol au cours de la pur i f ica t ion de I 'ADN polym6rase ADN d6pen- dante de fate de rat en hype r t roph ie compensa- t r ice nous ayant pe rmis d ' acc ro i t r e l 'act ivi t6 de cette enzyme, nous avons choisi d%tudier le r61e des groupes thiols dans son activit6 catalyt iqne.

La mise en 6vidence d 'un r6sidu cyst6ine n6ces- saire A l 'act ivi t6 enzymat ique serai t impor tan te pour l '6tude des propri6t6s de cette enzyme. Elle pour ra i t aussi donner un cri t~re de d is t inct ion entre les ADN polym6rases ADN d6pendantes nor- males ou tumorales d 'une part , entre les enzymes de r6para t ion ou de rep l ica t ion d 'aut re part . De plus, un tel cr i t6re pour ra i t pe rmet t re de diff6ren- cier, dans des cellules t ransform6es par les v i rus oncog6nes h ARN, les diverses &DN polym6rases : addit ive, ARN d6pendante, hyb r ide d6pendante, ou ADN d6pendante.

Pa rmi les t r avaux consacr6s aux ADN polym~- rases de bact6ries et de mammif~res , cer tains ant d6jA port6 sur la mise en 6vidence d 'un r6sidu cyst6ine dans le site cata lyt ique de ces enzymes. Ainsi, t ravai l lant sur des cellules de tumeurs d'as- cites, Keir et Shepherd [1], puts Slater [2] ant mis en 6vidence l ' inh ib i t ion de l 'act ivi t6 ADN polym6rase par les agents b loquant les groupes thiols.

Par ail leurs Jovin, Englund et Kornberg [31 ont montr6, ehez E. Colt, qu 'une mol6eule d 'ADN polym6rase I fixe un seul atome de mercu re

(203Hg), et que cette f ixation n ' inae t ive pas Fen- zyme. Ces auteurs concluent done qu ' i l n 'y a qu 'un r6sidu eyst6ine dans la mol6cule, et que ee r6sidu n'est pas impliqu6 dans le site aetif. L '6tude de la synth6se de I 'ADN ehez un mutant d'E. Colt [4] a condui t A l ' i so lement d 'une nouvel le enzyme, I 'ADN polym6rase II. Kornberg et Gefter [5] d 'une part , Moses et R ichardson [63 d 'autre part , ant montr6 qu 'au mains un r6sidu eyst6ine se t rouve dans le site catalyt ique de cette enzyme, ee qui in t rodu i t un er i t6re de d is t inct ion entre ees deux ADN polym6rases de E. Colt.

Stavr ianopoulos , Karkas et Chargaff [7] ant, quant A eux, compar6 la sensibilit6 de I 'ADN poly- m6rase hybr ide d6pendante d ' embryon de poulet vis-A-vis des agents b loquant les groupes thiols A celle des ADN polym6rases d'E. Colt et de thymus de veau. Nous pr6sentons ici les r6sultats que nous avons obtenus avec I 'ADN polym6rase ADN d6pendante de fate en h y p e r t ro p h i e eompensa- t r ice et avec une ADN polym6rase de t issu h6pa- t ique tumoral .

MATI~RIEL ET Mt~THODES.

1. ADN POLYMERASESi ADN Di~PF.NDANTES.

a) L'ADN polgm~rase ADN d~pendante de fate de rat en hypertrophie compensatrice a 6t6 par- t ie l lement purifi6e selon une t echn ique publi6e par ail leurs [8]. Les 6tapes de la pur i f ica t ion sont les suivantes :

I : surnageant 1050,0'0 g - - II : pr6cipit6 au sul- fate d ' a m m o n i u m - - III : DEAE cellulose - - IV :

22

320 J.-M. Rossignol , J. Abadiedebat , J. Till i t el A.-M. de Recondo.

hydroxyapat i te . La fract ion IV (taux de purifica- t ion : 500 fi 800 fois) a 6t6 utilis6e pour l 'essentiel de ce t ravai l ; elle avait une activit6 de 10,0 m~moles de nucl6otides ineorpor6s en 1 h par mg de prot6ines en pr6sence de poly (dAT). poly (dTA).

b) L'ADN polymdrase ADN ddpendante de tu- meur d croissance rapide [9] est aussi une enzyme d 'or igine h6patique. Cet h6patome t ransp lan tab le de rat nous est fourn i par Frayssinet . A par t i r d 'un h6patome nut r i t ionne l , ce dern ie r a obtenu des cl6nes de cellules tnmorales h croissance rapide, t ransmissibles par greffe h des rats nou- veau-n6s [10]. Nous avons utilis6 la f ract ion II (pr6cipit6 au sulfate d ' ammonium, taux de purifi- cat ion 10 ~ 15) pour comparer cette polym6rase tumorale ~ I'ADN polym~rase de foie en hyper- t rophie compensat r ice au m6iue stade de purifi- cat ion (fraction II pur i f icat ion 10 ~ 15).

2. ~[ATRICES.

Quatre matr ices diff6rentes ont 6t6 utilis6es :

- - I'ADN natif de thymus de veau (Choay) ;

- - I'ADN de thymus de veau d6natur6 par la chaleur (5 minutes h 100°C) ;

- - le copolymbre altern6 h double ehaine poly (dAT). poly (dTA) (Miles Inc.) et l 'homopolymbre

simple chalne poly (dC) (Biopolymers Inc).

3 . S U B S T R A T S .

Los d6soxyribonucl6otides t r iphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) nous ont 6t6 fournis par Schwartz. Nous avons utilis6 comme marqueurs le dTTP a[~2P 1 ( C E A - F r a n c e ) , le dTTP [aH] ou le dGTP [SH] d 'Amersham Biochemical Center.

4. AGENTS REAGISSANT AVEC LES GROUPES THIOLS.

Deux agents b loquant les groupes thiols ont 6t6 utilis6s :

- - La N-6thylmal6imide (Nt~M) (*), dont la fixa- t ion sur les thiols est i r r6vers ible [11].

- - L e p-chloromercur ibenzoate (PCMB) dont Fact ion inh ib i t r i ce peut 6tre lev6e par un r6duc- teur des groupes thiols (2-mercapto6thanol, dithio- threitol, glutathion) [12]. Ces dcux r6actifs nous sont fourni par Sigma Chemical Co.

(*) Abr~viations utiHs~es : NEM : N-~thylmaleimide. PCMB : p-ch~oromercuribenzoate. 2 ME : 2-mercapto~thanol. DTT : dithiothreitol.

Les agents r6ducteurs des groupes thiols utilis6s ont 6t6 fournis :

- - p o u r le 2 - m e r c a p t o 6 t h a n o l par Eas tman Kodak Co. Rochester N.Y. (U.S.A.).

- - p o u r le di thiothrei tol (r6actif de Cleland) par Calbiochem - - L a u s a n n e (Suisse).

5. DETERMINATION DE L'ACTIVIT~ F-~NZYMATIQUE.

Le mil ieu d ' i ncuba t ion d 'un volume final de 0,250 ml a la composi t ion suivante : Tris-HC1 50 mM (pH 7), KCA 2,4 mM, MgC12 3,4 mM, d6soxy- r ibonucl~otides t r iphosphates 200 ~M, Fun des modules suivants : A])N nat i f ou d6natur~ 200 ~M, poly (dAT) . poly (dTA) ou poly (dC) 22 ~M et 100~1 d 'enzyme.

Apr6s incuba t ion (38°C, 30 minutes) la par t ie acido-insoluble d 'une f ract ion aliquotc est pr6ci- pit6e sur filtre de verre Wha tman GF/C (aeide perchlor ique 5 p. cent, pyrophosphate de sodium 2 p. cent). Le filtre est lay6 fi l 'acide perehlor ique puis s6ch6 ; la radioactivi t6 du p rodu i t pr6eipit6 sur le filtre est d6termin6e par comptage dans un compteur A scint i l la t ion Packard, en pr6sence d 'un m6Iange Tolu6ne-dim6thyl PO,POP-PPO.

Rt~SULTATS.

1 . I N H I B I T I O N P A R L E S A G E N T S R E A G I S S A N T A V E : C

L E S G R O U P I E S T H I O L S .

L'enzyme par t ie l lement purifide de foie en hyper t rophie compensat r ice pouvan t ut i l iser plu- sieurs modules [13], nous avons employds ici ceux qui sont le mieux copi6s : ADN natif, ADN ddna- tur6, poly (dAT) . poly (dTA) et poly (dC).

2000 r [ I i i

. / \ ADN den~t ur~ <~

~o

1 ooo

0 I . r I f ~ 40 1 0 0 150 200 400

Concerltroticn en 2-mercopIoethonol (ram)

FIG. I. Influence de la concentration en 2-mercap,to~thanol

sur l'aetivit~ de I'ADN polym~rase de foie en hypertro- phic compensatrice en presence de diff~rents mod61es.

En ordonn~es : activit6s exprim~es en p. cent du contr61e.

BIOCHIM1E, 1972, 54, n ° 3.

Groupes thiols et ADN polym~rases. 321

La cop i e de ces q u a t r e m a t r i c e s est f o r t e m e n t i nh ib6e p a r le p - c h l o r o n : e r c u r i b e n z o a t e et p lus f a i b l e m e n t p a r la N-6 thy lma16imide (Tab leau D. L ' i n h i b i t i o n p r o v o q u 6 e p lus ou m o i n s t o t a l emen t , p a r le p - c h l o r o m e r c u r i b e n z o a t e peu t 6tre lev6e p a r l ' a d d i t i o n de 2 - m e r c a p t o d t h a n o l I00 raM. Cependan t , dans le cas du p o l y (dC) et de I 'ADN na t i f ce t te lev6e d ' i n h i b i t i o n n ' es t que pa r t i e l l e . La p r 6 i n c u b a t i o n de l ' e n z y m e p e n d a n t 10 m i n u t e s en p r 6 s e n c e de 2 - m e r c a p t o d t h a n o l 100 mM s ' o p p o s e

F a c t i o n u l t 6 r i eu re du PCMB.

2. EFFET DU 2-MERCAPTOt~THANOL SUR LES ACTI- VITIES ENZYMATIQUES.

La p r 6 s e n c e d ' u n agent r 6 d u c t e u r tel que le 2 - m e r c a p t o 6 t h a n o l p e r m e t aux g roupes th io l s im-

coup p lus m a r q u 6 vis-h-vis de la r 6 a c t i o n u t i l i s an t I 'ADN d6na tur6 c o n : m e m a t r i c e .

3. E F F E T D ' U N E ' P R E - I N C U B A T I O N E N Z Y M E - S U B -

S T R A T S O U E N Z Y M E - M O D E L E , S U R L ' A C T I O N U L T ~ -

nW.URE DE PCMB.

Les g roupes th io l s n6cessa i r e s 'h l ' ac t iv i t6 ca ta- l y t i que de I 'ADN p o l y m 6 r a s e p e u v e n t i n t e r v e n i r dans la f o r m a t i o n du c o m p l e x e enzyme- subs t r a t , ou dans la f o r m a t i o n du c o m p l e x e enzyme-modUle . Nous avons d o n c essay6 de d 6 t e r m i n e r dans que l le n l e su re les d 6 s o x y r i b o n u c l 6 o s i d e s t r i p h o s p h a t e s ou les d i f f6 ren t s mod61es u t i l i sds p a r I 'ADN po ly - m 6 r a s e p o u v a i e n t s ' o p p o s e r h Fac t i on i n h i b i t r i c e u l t 6 r i eu r e du PCMB (Tab leau II).

T A B L E A U I .

Effe t des agents bloquant les groupes thiols et des agents r~ducteurs de ces groupes sur I'ADN polym~rase de [oie en hyper t roph ie compen- satrice ( fract ion IV).

Addition

Ndant

NEM 2 mM

PCMB 2 mM

2 ME 40 mM

PCMB 2 m M -~ 2 ME 100 mM

2 ME 100 mM puis PCMB 2 mM

ADN nati[

100

7

19,5 5,5

20n 500

ModUle

. . . . . . . . . . . . . . . . . -

DTT 40 mM 175 ! 600

54 i 97 i I

[ 435 '

ADN p01y IdAT). d6natur6 poly (dTA)

100 100

3,5 15

1 ,5

320

345

poly dC

100

19

4 , 5

290 _ _ ! . . . . . . . .

i 113

130

295 i

Les agents bloquant les thiols et l 'enzyme sont pr6-incubds 5 minutes h 4°C avant la pdriode d' incubation.

Substrats utilis~s : dTTP, dCTP, dATP, dGTP pour les matrices ADN (natif ou d6natur6) dTTP et dATP pour la matrice poly (dAT). poly (dTA), dGTP, dans le cas de la matriee poly (dC).

Les r~sultats sont exprim6s en p. cent d'activi't6. Le contr61e (100 p. cent d'acti- vit~) ,incorpore en 1 h par ml d 'enzyme, et selon le module, les quantit~s sui- vantes de nuel6otides : ADN nat i f : 2000 pmoles de nueldotides, ADN ddnatur6 : 6000 pmoles, poly (d~AT). poly (dTA) : 30000 pmoles, poly (4C) : 12000 pmoles.

p l iqu6s dans l ' a c t iv i t6 ca t a ly t ique , en t re aut res , d '6 t re l ib res , et a c c r o l t de f acon no tab le l ' a c t iv i t6 e n z y m a t i q u e (Tab leau I).

Un o p t i m u m d ' ac t i v i t 6 est obse rv6e en p r 6 s e n c e de 2 - m e r c a p t o 6 t h a n o l 100 mM h 150 mM (fig. 1). L 'e f fe t a c t i v a t e u r du 2 - m e r c a p t o 6 t h a n o l est beau-

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 3.

Au cours de ce t r ava i l , nous avons fair les cons- t a t a t ions su ivan t e s : en absence de 2 -mercap to - 6 thanol , l ' e n z y m e s ' i n a c t i v e 16g6rement h 38 °. La p r 6 i n c u b a t i o n de l ' e n z y m e avec les d 6 s o x y r i b o - nuc l6os ides t r i p h o s p h a t e s d i m i n u e e n c o r e davan - tage sa capac i t6 h c o p i e r le m o d 6 l e qu i lui est f o u r n i u l t 6 r i e u r e m e n t . P a r con t re , p r 6 i n c u b 6 e en

322 J.-M. Rossignol, J. Abadiedebat , J. Tillit el A.-M. de Recondo.

TAB LF-.~_ U II.

Influence des substrats et des modMes sur l'inhibition de I'ADN polym~rase de foie

en hypertrophie compensatrice (fraction IV) par le PCMB.

ModUle

ADN natif

ADN d~naturd

Poly (dAT) . Poly (dTA)

I ~ pr6-incubation 15 minutes fi 380C

Enzyme q- tampon Enzyme -~- PCMB Enzyme @ Pr6eurseurs Enzyme q- ADN natif Enzyme q- Pr6curseurs Enzyme -q- ADN natif

Enzyme -q- tampon Enzyme ~ PCMB Enzyme -q- Pr6eurseurs Enzyme -~- ADN d6natur6 Enzyme -~- Pr~eurseurs Enzyme -q- ADN d6naturd

Enzyme -q- tampon Enzyme -q- PCMB Enzyme ~- Pr&urseurs Enzyme ~- (dAT) . (dTA) Enzyme -{- Pr~curseurs Enzyme ~- (dAT) . (dTA)

2 e pr6-ineubation I pmoles, par ml,

15 minutes__fi380C en 30549178minutes

PLUMB [ 234 PCMB

PCMB PCMB

PCMB PCMB

430 173 824

- - 1426 418 109

i 1515 236

2917

236 274

1500 1018 7905

Aetivit6s relatives

67 22 28 52 21

100

48,5 14

4 52

8

100

58 3 3,5

19 13

100

Le PCMB est utilis6 iei 2.10-5 M. Son effet inhibi teur est max imum dbs 5 mi- nutes et reste constant au moins jusqu 'h 30 minutes.

Lorsque rien n 'est indiqu6 dans ]a colonne ¢ deuxi6me pr6-incubation >>, aucun agent n'a 6t6 ajout6, et les tubes ont 6t6 eonserv6s h 4°C.

Pr6curseurs : les quatre d6soxyribonuc16otides tri-phosphates dans le cas de I'ADN natif et d~natur6, le dATP el le dTTP dans le eas du poly (dAT) . poly (dTA).

p r 6 s e n c e de mod6les , I 'ADN p o l y m @ a s e g a r d e route son act ivi t6 . Des e x p @ i e n c e s p e r m e t t a n t de m i e u x e o m p r e n d r e ces p h 6 n o m b n e s sont ae tue l le - m e n t en cours . Nous nous b o r n e r o n s h d i s c u t e r i e i l ' i n f l uenee des modb le s et des subs t ra t s su r l ' a e t i o n u l t 6 r i eu r e du PCMB.

L ' a c t i o n i n h i b i t r i c e des d 6 s o x y r i b o n u c l 6 o s i d e s t r i p h o s p h a t e s s ' a jou te h eel le du PCM~3 (ADN d6na- tur6) ou ne la m o d i f i e p r a t i q u e m e n t pas [ADN na t i f et p o l y (dAT) . (dTA)] . P a r con t re , dans "tous les cas, ma i s h des degr6s d ive r s , la p r 6 i n c u b a t i o n de l ' e n z y m e a v e c les modb le s d i m i n u e l ' e f fe t i nh i - b i t e u r du PCMB.

4. COMPARAISON ENTRE L ' A D N POLYMERASE DE

FOIE EN HYPE 'RTROPHIB COMPENSATRICE ]~T L ' A I ) N

POLYMERASE D E T UMEUR A CROISSANCE RAPIDE.

Nous avons c o m p a r 6 ees d e u x e n z y m e s au s tade I I (p r6e ip i t~ au su l fa te d ' a m m o n i u m ) (Ta- b l eau 111). A e e degr6 de p u r i f i c a t i o n le c o m p o r t e - m e n t des deux A D N p o l y m 6 r a s e s v is -h-vis des agents b l o q u a n t les th io l s et des agents r 6 d u e t e u r s n ' e s t pas f o n d a m e n t a l e m e n t d i f f6rent . L ' A D N po ly -

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 3.

m g r a s e de t u m e u r "~ c r o i s s a n e e r a p i d e est i nh ib6e pa r la NEM et le PCM:B e n c o r e p lus f o r t e m e n t que l ' e n z y m e de fo ie en h y p e r t r o p h i e e o m p e n s a t r i e e m a i s eet te p lus g r a n d e sens ib i l i t~ est p e u t ~tre due h la t e n e u r en p r o t 6 i n e s des f r a c t i o n s II. En effet, el le est deux fois p lus fa ib le dans le eas de la t u m e u r que dans le eas du fo ie en h y p e r t r o p h i e e o m p e n s a t r i c e .

P a r a i l leurs , p o u r l ' e n z y m e t u m o r a l e , l ' i n h i b i - t ion p a r la NEM ou le PCMB se m a n i f e s t e aussi f o r t e m e n t en p r 6 s e n e e d ' A D N na t i f q u ' e n p r 6 s e n e e d 'ADN d6natur6 ou de p o l y (dAT) . (dTA). Ce fa i t la d i s t i ngue de I '&DN p o l y m ~ r a s e de fo ie en h y p e r t r o p h i e e o m p e n s a t r i c e .

DISCUSS~ION E T CONCLUSION.

Les agen ts b l o q u a n t les t h io l s (PCM,B et NEM) i n h i b e n t l ' ac t iv i t6 de I'AD:N p o l y m 6 r a s e de fo ie en h y p e r t r o p h i c c o m p e n s a t r i c e . Cette e n z y m e con- t i en t d o n e au m o i n s une eys t6 ine i m p l i q u 6 e soi t d i r e c t e m e n t , soi t i n d i r e e t e m e n t , clans ses p r o p r i & t6s ca ta ly t iques . Le p - c h l o r o m e r c u r i b e n z o a t e est

Groupes thiols el A D N polymdrases . 323

TABLEAU III .

R61e des groupes thiols dans l'activitd des ADN polym~rases normales ou tumorales.

Source de l'enzyme

Foie en hypertrophie compensatrice

Fraction II

Addition ADN ADN poly (dAT). nati[ d6natur6 poly (dTA)

N6ant 100 100 100

NEM 2 mM 58 38 15

PCMB 2 mM 38 8,5 6

2 ME 40 mM ME 190 134 113

DTT 40 mM 144 118 121

PCMB 2 mM -4- 2 142 91 87 100 mM

N~ant 100 100 100

24

H6patome ! transplantable ! 2 ME 40 mM

Fraction II i

NEM 2 mM 28 21,5

PCMB 2 mM I 3 4,5 2,5

153 280 135

155 138

94

~ DTT 40 mM

PCMB

250

2 mM -~- 2 ME] 140 240 100 mM ]

F~act, ion II (foie en hypert rophie eompensatrice) : prot~ines 12 mg/ml . Fract ion II (h~patome transplantable) : prot~ines 6 mg/ml . Activi.t~s sp~cifique~ (pmoles de nncl~otides Incorpor~s en 1 h h 38°C par mg de

prot~ines) : pour la fraction II (hypertrophie eompensatrice), selon le mod61e ADN natif : 880, ADN d6natur~ 2660, poly (dAT) .po ly (dTA! : 5160 ; pour la fract ion II (h6patome transplantable) : A D N nat i f : 840, ADN d~natur~ : 9200, poly (dTA). poly (dTA) : 17.400.

p lus i n h i b i t e u r que la N - 6 t h y ] m a l e i m i d e ; ce la est sans dou te dfi aux d i f f6 rences de r6ac t iv i t6 des deux p rodu i t s .

La p r 6 - i n c u b a t i o n des modu le s avec l ' e n z y m e d i m i n u e F a c t i o n i n h i b i t r i c e u l t 6 r i e u r e du PCM,B. Cela s e m b l e i n d i q u e r q u ' u n e p a t t i e au m o i n s des r6s idus cys t6 ine essen t ie l s son t so i t impI iqu6s dans la f ixa t ion des modu le s s u r l ' e n z y m e , soi t masqu6s et pro t6g6s p a r le m o d u l e l o r s q u e ce lu i -c i est fix6 su r l ' e n z y m e . Cet te o b s e r v a t i o n est h r ap - p r o c h e r de l ' e f fe t p r o t e c t e u r de I 'ADN vis-h-vis de I 'ADN p o l y m 6 r a s e au cou r s de sa p u r i f i c a t i o n [14]. S u i v a n t les modu le s ut i l is6s la r 6 a c t i o n de po ly - m 6 r i s a t i o n est p lus ou m o i n s sens ib le h l ' a c t i o n du PCMB et h ce l le du 2 - m e r c a p t o 6 t h a n o l .

Nous avons v6rif i6 que la 16g~re ac t iv i t6 a d d i t i v e ( a d d i t i o n d ' u n seul d 6 s o x y r i b o n u c l 6 o t i d e t r i p h o s - p h a t e aux ex t r6mi t6s 3 'OH du m o d u l e [15]) que poss6de la f r a c t i o n IV est aussi t ouch6e p a r les agents b l o q u a n t les th io ls , mats h u n degr6 m o i n - d re que l ' a c t iv i t6 r e p l i c a t i v e ; cec i r e j o i n t l ' ob se r - r a t i o n de K e i r [5].

BIOCH1MIE, 1972, 54, n ° 3.

L ' A D N p o l y m 6 r a s e de t u m e u r h c r o i s s a n c e r a p i d e c o n t i e n t aussi un ou p l u s i e u r s r6 s idus cys- t6 ine i m p l i q u 6 s dans son ac t iv i t6 e n z y m a t i q u e . I1 en est de m ~ m e de I 'ADN p o l y m 6 r a s e h y b r i d e d 6 p e n d a n t e p r 6 s e n t e d a n s le fo ie en h y p e r t r o p h i e c o m p e n s a t r i c e ( r6sul ta ts non publ i6s) .

Les ADN p o l y m 6 r a s e s de m a m m i f ~ r e s 6 tudi6es j u squ 'h ce jou r s e m b l e n t d o n c a v o i r au m o i n s un g r o u p e th io l i m p l i q u 6 dans l e u r ac t iv i t6 ca ta ly - t ique . Les g roupes th io l s j o u e n t p e u t 6tre un r61e dans la f o r m a t i o n du c o m p l e x e enzyme-modUle . I1 est d o n c n6ces sa i r e de p r 6 c i s e r ce po in t . On 6tu- d i e r a p a r a i l l eu r s la sens ib i l i t6 des d ive r se s ADN p o l y m 6 r a s e s v i s - h - v i s des agents b l o q u a n t les th io l s en f o n c t i o n de l eur sp6cif ic i t6 h l ' 6ga rd du module .

Remerciements.

Nous remercions le Dr. Michel GOLDBERG de l 'int~r~t qu ' i l a port~ ~t ce t ravai l et des suggestions qu ' i t a bien vonlu nous faire.

324 J . -M. R o s s i g n o l , J. A b a d i e d e b a l , J. T i l l i t el A . - M . de R e c o n d o .

Ce travail a b6n6flc6 d 'une aide du Commissar ia t h l 'Energie Atomique et de la Fondat ion pour la Recher- che M6dicale Fran~aise.

R~SUM~.

Les agents b loquant l es groupes thiols tels que ]e p-chloromercur ibenzoat e ou ]a N~-6thyl~maleimide inhibent I'ADN polym6rase ADN d6pendante de foie de rat en hyper t rophie eompensatriee. Ceci indique qu'au moins un r6sidu cyst~ine est impliqu6 dans l 'aetivit~ catalyti, que de cette enzyme.

Les agents r6ducteurs des groupes thiols tels que le 2-mercapto6thanol ou le d i th iothre i to l augmentent consid6rablement l 'activlt6 de cette enzyme. La pr~in- cubation en pr6senee de mod$les protege par t ie l lemenl l ' enzyme de l ' inhibi t ion ult6rieure par le p-chloromer- eurihenzoate. Les d6soxyribonueldotides trip,hosphates sont d6pourvus d 'act ion proteetrice. Les d6soxyribonucl6otides t r iphosphates sont d6pour- vus d 'act ion proteetrice.

L'ADN polymdrase d'hc~patolne t ransplantable est 6galement inhib6e par la N-dthylmaleimide et le p- ehloromereuribenzoate.

ZUSAMMENFASSUNG.

Die Reagenzien vcie p-Chlormerkurbenzoat oder N-Athylmaleimid, welche Thiolgruppen inaktivieren, inhibieren die DNS-ahh/ingige DNS-Polymerase aus tier regener ierenden Leher der Ratte. Dies zeigt an, dass mindes tens eiu Cysteinrest in der kata lyt ischen Wi~kung des Enzyms fiitig ist.

Die reduzierenden Reagenzien der Thiolgruppe wie 2 - Merkaptoiithanol oder Dithiothrei tol aktivieren dieses Enzym betr~ichtlich. Die Pr~iinkubation in G~ge~wart yon Templates schiitzt das Ez~zym gegen die nachtr~igIiche Inhibi t ion durch p-Chlormercur- benzoat teilweise. Die Desoxynukleosidt r iphosphate weisen keine Sehutzwirkung auf.

Die DNS-Polymerase ties f iber tragbaren Hepatoms wird ebenso durch N-Athylmaleimid und p-Chlormer- curbenzoat inhibiert .

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BIOCHIMI,~, 1972, 54, n '* 3.