-En biochimie, on utilise surtout des IgG (+ affinité)
-On peut préparer des Ac polyclonaux (sérum d’un animal immunisé) ou
des Ac monoclonaux (technique des hybridomes).
-on peut être amené à devoir purifier ces préparations (Protéine G ou
Protéine A).
La spécificité (pas de reconnaissance croisée avec d’autres protéines)
Les Outils et techniques immunologiques
Rappels sur la réaction antigène-anticorps et ses applications
La réaction Ag-Ac a deux grands types d'applications : La détection et le dosage des antigènes (par des méthodes dont il faut vérifier la spécificité, la reproductibilité et la sensibilité). La détection et le titrage des anticorps (vis-à-vis d'un Ag ou d'un mélange d'Ag).
La réaction antigène - anticorps (Ag-Ac) est due à l'interaction entre les épitopes de l' antigène et les paratopes de l'anticorps.
Elle fait intervenir quatre types de liaisons non covalentes (des liaisons hydrogènes, des liaisons électrostatiques, des liaisons hydrophobes et les forces de Van der Waals).
Les Ac constituent des sondes moléculaires spécifiques vis à vis de n'importe quelle substance antigénique.
Interaction Antigène-Anticorps
Ac + Ag Ac-Ag k1=constante de vitesse d'association
k2=constante de vitesse de dissociation
ka= k1/k2 = constante d'association ou d'affinité (l/mol)
k1
k2
Affinité: force par laquelle un ligand (épitope) entre en interaction avec un site de liaison (paratope). Ex : forte affinité : 1011 l.mol-1 faible affinité : 104 l.mol-1
Valence Ag: nombre de molécule Ac qui se fixe sur Ag à saturation.
Valence Ac: nombre de site de fixation de l'Ag, 1 IgG (bivalent), 1IgM (decavalent).
Avidité: force de liaison entre l’Ag (multivalent) et l’Ac (multivalent) plus proche de la réalité. (affinité, conformation Ag, valence)
3
4
Mesure de l’ affinité: détermination de Ka
Dialyse à l’équilibre
Ac + Ag Ac-Ag
Ka
[Ac-Ag]
[Ac]x[Ag]
Ka =
Ag marqué radioactivement
Membrane semi-perméable
Valence (site de fixation)
Ac monoclonal Ac 1a plus forte affinité que 1b
2
-Ka
1a
1b
sérumpolyclonal #3 plus forte affinité que #1b
Courbes de Scatchard
Réaction de précipitation
(pour les molécules)
Précipitation
-Ag soit au moins bivalent ou multivalent
Il faut que: -Ac soit bivalent
zone d'équivalence
2 types de précipitation: *En milieu liquide (qualitatif)
*En milieu semi-solide (gélosé) (quantitatif et qualitatif):
a) Immunodiffusion radiale (Méthode de Mancini) *Méthode quantitative :mesure des diamètre
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Réaction d'Agglutination (pour des cellules)
Ac peuvent agglutiner des bactéries, cellules (hématies).
Ex: l'Hémagglutination : Globules rouges (GR) + Ac anti GR
Hémagglutination (réseau)
Dilution croissante des Ac anti Globules Rouges
ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
*Méthode très sensible pour doser (Ag ou Ac) et titrer des Ac.
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15
Le Western Blot (Immuno Blot)
Conditions dénaturantes et reductrices
Ac I+ AcII-Enz
révélation
HRP:
Horseradish
peroxidase
HRP
Ac I anti-Protéine
d’intérêt
Ac II couplé à une enzyme anti-Ac I (anti espèce)
SDS + agent réducteur de ponts dissulfures
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L’immunoprécipitation d’une ou plusieurs protéines d’intérêt recherche de partenaires de la protéine d’interêt
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Immuno-Histochimie Immuno-Fluorescence
Immuno-Electromicroscopie
Les méthodes de fixation des tissus ou des cellules vont influer sur la structure des épitopes de l’antigène, donc jouer sur la reconnaissance des anticorps.
Plusieurs méthodes de fixation et de durée devront être testés pour que l’anticorps puisse reconnaître l’épitope.
Fixations de durée variable : Glutaraldéhyde Formaldéhyde Méthanol -20°C Acétone
Immunofluorescence
Microscopie à fluorescence
Ac anti pericentrine Ac anti tubuline DAPI (marqueur ADN)
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Immuno-Electroscopie
Microscopie électronique
(Or colloïdale ou Férritine)
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Microscopie électronique à transmission
2) Activation de la voie classique du complément
1er composant du
complément
Pathogène quelconque Pore
-L’Ac se fixe sur le pathogène
-Fixation du 1er élément d’un réseau complexe de protéines sériques (“le complément”)
-Activation de la cascade du complément
-Formation d’un pore et lyse du pathogène
=aide à la phagocytose
Macrophage
Récepteurs au Fc Opsonisation
Fc
-Macrophage reconnait les parties Fc des Ac par récepteurs Fc (RFc), activation de la phagocytose.
Principalement IgG et récepteur RFc.
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3) Opsonisation