Electrophorèse sur gel d’agarose
Principe :
L’électrophorèse est l’une des principales techniques utilisées en biochimie ou biologie
moléculaire pour la séparation des protéines ou celle des acides nucléiques. Dans un milieu
donné, la séparation des particules se fait en fonction de leur charge électrique (déplacement
d’ions sous effet d’un champ électrique) et pour des charges identiques, en fonction de leur taille.
Les molécules anioniques (-) migrent vers l'anode (+) et les molécules cationiques (+) se déplacent
vers la cathode (-).
La molécule d’ADN est un polynucléotide. Chaque nucléotide est composé de 3 types de résidus :
le désoxyribose, la base azotée, le groupement phosphate H2PO4 qui peut s’ioniser en PO42-
. En
milieu basique, la molécule d’ADN se charge négativement (H2PO4 → 2 H+ + PO4
2-). Sur les acides
nucléiques, les charges sont portées par les groupements phosphate du squelette. La molécule
d’ADN placée dans le tampon (TAE 1X, pH 8) et dans le champ électrique créé dans la cuve à
électrophorèse va migrer vers l’anode (+). On va donc effectuer les dépôts coté cathode (-).
La migration de l’ADN sous l’effet du champ électrique va se réaliser dans l’épaisseur du gel
poreux d’agarose dans lequel l’ADN a été déposé. Les pores de ce gel vont se comporter comme
un tamis qui freine le déplacement des fragments d’ADN.
La vitesse de migration des fragments sera déterminée par :
- la résistance du gel à la migration des fragments proportionnelle à leur taille,
- la charge des fragments proportionnelle à leur taille,
- la concentration du gel en agarose
Les fragments d’ADN vont donc se séparer en fonction de leur taille. Si le facteur le plus important
est la résistance du gel à la migration de l’ADN, ce sont les plus petits fragments qui migreront le
plus loin.
Préparation du gel agarose 2%
L’agarose est un polymère à base d'agar purifié, il se présente sous forme de poudre. On
détermine le poids d’agarose à utiliser, et le volume de tampon nécessaire pour la formation du
gel, en fonction de la taille des fragments à séparer :
Concentration
d'agarose (% en M/V) Gamme de tailles
idéales (en kb) 0,3 5-60 0,6 1-20 0,7 0,8-10 0,9 0,5-7 1,2 0,4-6 1,5 0,2-3 2 0,1-2
√ Peser 1g d’agarose et ajouter 50 ml TAE 1X (Tris/Acétate 40mM - EDTA 1 mM - pH 8).
√ Dissoudre l’agarose au four à micro-ondes (le surveiller pour ne pas que ça déborde)
√ Ajouter 5 µµµµl de SYBRSafe DNA gel stain (Invitrogen) et mélanger
Le SYBR Safe est un agent intercalant des acides nucléiques, moins mutagène que le bromure
d’éthidium. Il émet de la fluorescence lorsqu’il est intercalé dans l’ADN double brin. Deux longueurs
d’ondes d’excitation : 280 et 502 nm. Longueur d’onde d’émission : 530 nm.
√ Monter les joints de coulage et les peignes et couler le gel :
1 g d’agarose
50 ml TAE 1X
Cuve électrophorèse
1. Placer les joints de coulage
2. Placer les 2 peignes dans les supports prévus à
cet effet. Le peigne permet de marquer
l’empreinte des puits de dépôt de l’ADN.
3. Verser le gel d’agarose entre
les 2 joints de coulage et laisser
prendre le gel.
4. Une fois le gel pris, retirer les éléments de
montage et recouvrir le gel de TAE 1X
5. Déposer les échantillons et le marqueur de
taille puis faire migrer