Electrophorèse sur gel d’agarose

Principe :

L’électrophorèse est l’une des principales techniques utilisées en biochimie ou biologie

moléculaire pour la séparation des protéines ou celle des acides nucléiques. Dans un milieu

donné, la séparation des particules se fait en fonction de leur charge électrique (déplacement

d’ions sous effet d’un champ électrique) et pour des charges identiques, en fonction de leur taille.

Les molécules anioniques (-) migrent vers l'anode (+) et les molécules cationiques (+) se déplacent

vers la cathode (-).

La molécule d’ADN est un polynucléotide. Chaque nucléotide est composé de 3 types de résidus :

le désoxyribose, la base azotée, le groupement phosphate H2PO4 qui peut s’ioniser en PO42-

. En

milieu basique, la molécule d’ADN se charge négativement (H2PO4 → 2 H+ + PO4

2-). Sur les acides

nucléiques, les charges sont portées par les groupements phosphate du squelette. La molécule

d’ADN placée dans le tampon (TAE 1X, pH 8) et dans le champ électrique créé dans la cuve à

électrophorèse va migrer vers l’anode (+). On va donc effectuer les dépôts coté cathode (-).

La migration de l’ADN sous l’effet du champ électrique va se réaliser dans l’épaisseur du gel

poreux d’agarose dans lequel l’ADN a été déposé. Les pores de ce gel vont se comporter comme

un tamis qui freine le déplacement des fragments d’ADN.

La vitesse de migration des fragments sera déterminée par :

- la résistance du gel à la migration des fragments proportionnelle à leur taille,

- la charge des fragments proportionnelle à leur taille,

- la concentration du gel en agarose

Les fragments d’ADN vont donc se séparer en fonction de leur taille. Si le facteur le plus important

est la résistance du gel à la migration de l’ADN, ce sont les plus petits fragments qui migreront le

plus loin.

Préparation du gel agarose 2%

L’agarose est un polymère à base d'agar purifié, il se présente sous forme de poudre. On

détermine le poids d’agarose à utiliser, et le volume de tampon nécessaire pour la formation du

gel, en fonction de la taille des fragments à séparer :

Concentration

d'agarose (% en M/V) Gamme de tailles

idéales (en kb) 0,3 5-60 0,6 1-20 0,7 0,8-10 0,9 0,5-7 1,2 0,4-6 1,5 0,2-3 2 0,1-2

√ Peser 1g d’agarose et ajouter 50 ml TAE 1X (Tris/Acétate 40mM - EDTA 1 mM - pH 8).

√ Dissoudre l’agarose au four à micro-ondes (le surveiller pour ne pas que ça déborde)

√ Ajouter 5 µµµµl de SYBRSafe DNA gel stain (Invitrogen) et mélanger

Le SYBR Safe est un agent intercalant des acides nucléiques, moins mutagène que le bromure

d’éthidium. Il émet de la fluorescence lorsqu’il est intercalé dans l’ADN double brin. Deux longueurs

d’ondes d’excitation : 280 et 502 nm. Longueur d’onde d’émission : 530 nm.

√ Monter les joints de coulage et les peignes et couler le gel :

1 g d’agarose

50 ml TAE 1X

Cuve électrophorèse

1. Placer les joints de coulage

2. Placer les 2 peignes dans les supports prévus à

cet effet. Le peigne permet de marquer

l’empreinte des puits de dépôt de l’ADN.

3. Verser le gel d’agarose entre

les 2 joints de coulage et laisser

prendre le gel.

4. Une fois le gel pris, retirer les éléments de

montage et recouvrir le gel de TAE 1X

5. Déposer les échantillons et le marqueur de

taille puis faire migrer