Projets de thérapie cellulaire et génique : études précliniques et
conduite de l’essai cliniqueFabian GROSS
Chef de projet BiothérapiesCIC BT/DRI CHU de Toulouse
Laboratoire de recherche et promoteur
Approches in vitro et in vivo relevant de la pathologie visée
par le protocole clinique.
Développement du « médicament expérimental »
Laboratoire de recherche
Intérêt d’une cible ou d’une
approche expérimentale (in vitro et in
vivo)
Développement d’un médicament
Etudes Pré Cliniques : le contexte
• Etudes Pharmacologiques : activité du produit
• Etudes Pharmacocinétiques : devenir et intéractions du médicament dans l’organisme (homme ou animal)
• Etudes Toxicologiques : effets adverses d’un produit• Toxicité aigüe • Toxicologie chronique• Toxicologie de la fonction de reproduction• Etudes de mutagénèse• Etudes de cancérogénèse
Déterminent la valeur thérapeutique et les investigations chez l’homme (paramètres cliniques à surveiller)
Etudes Pré cliniques : Stratégie Adoptée
Principales lignes directives : International Conference of Harmonization Nature des études selon le stade de développement du produit : ICH M3 (CPMP/ICH/286/95) Produits biotechnologiques: ICH S6 (CPMP/ICH/302/95) Application: Thérapie anticancéreuse : ICH S9 (CPMP/SWP/997/96)
Préambule : - Produit ou Médicament identique ou comparable a celui de l’essai clinique
- Méthodes et techniques validées (in vitro et in vivo)
Dossier de Pharmacologie
Etudes pharmacologiques
PharmacodynamieDonnées in vivo et in vitro de l’activité du produit liée ou non a l’effet thérapeutique attendu
Pharmacologie de sécuritéEffets sur système respiratoire, nerveux et cardiovasculaire => voir études de toxicologie
Etudes pharmacocinétiques
Données sur l’absorption, le métabolisme, la distribution, la fixation des protéines plasmatiques, l’excrétion et le bilan de radioactivité
Si étude in vitro => matériel d’origine humaine
La toxicologie conditionne la première dose à administrer à l’homme
Seuil d’efficacité MABEL (Minimal Anticipated
Biological Effect Level )
Seuil de toléranceAucun effet : pharmacologique
(NOEL : No Effect Level)Secondaire (NOAEL : No Adverse
Effect Level)
Dose Maximale ToléréeMTD
Toxicologie Générale
Objectifs : Détermination de la 1ère dose injectée à l’homme (Phase 1) Identification des effets adverses et d’organes cibles (NOEL et NOAEL) Reversibilité des effets adverses Relation effets du produit et de ses métabolites Influence du sexe, de la dose, du temps d’exposition ou d’autres facteurs
Design : Groupes : Control (véhicule seul), faible dose (NOEL), forte dose (MTD)
et dose moyenne Animaux : 2 espèces (un non rongeur), ♂ et ♀ Durée : 24h à 2 ans Voie et régime administration : IV et voie clinique envisagée
Etudes BPL (directives 2004/10/CE et guidelines applicables EMEA Guideline EMEA/CHMP/410869/2006 du 31/07/2007)
Etude de Biodistribution et de Toxicité par administration unique
• Injection :• IV puis voie clinique, suivi pendant 2 à 5 semaines• Escalade de doses selon un processus séquentiel
• Suivi : • Observations cliniques sur les 1ères 24h puis 1 à 2 fois par
semaine• Analyses biologiques et biochimiques
• Sacrifice et Autopsie :• Examens anatomo-pathologiques d’une 12aine d’organes• Etude du potentiel immunotoxique• Dosage du médicament expérimental ou des cellules dans
les organes
Exemple du CYL-02
Injection IV du CYL-02 (1er lot pré-GMP) chez la souris de 250µg/kg à 7500µg/kg
Suivi : Observations cliniques et analyses bio et bioch (sang, urine)
Autopsie : Examens anatomo-pathologiques de 12 organes + tumeurDosage du transgène (organes, sang et urines)
Définition de la NOAEL à 1500µg/kg
Gro
up
e
-
+
+
+
++
+
++
++
Limite designificativité
Détection PTG sexe/organes/doses confondus
Gro
up
e
-
+
+
+
++
+
++
++
Limite designificativité
Gro
up
e
-
+
+
+
++
+
++
++
Gro
up
e
-
+
+
+
++
+
++
++
Limite designificativité
Détection PTG sexe/organes/doses confondus
18%
10%
2%
13%
12%7%7%
5%2%
12%0%
12%
poumon
rein
intestin
cœur
muscle
cerveau
péritoine
pancréas
rate
foie
vessie
gonades
Répartition de la positivité sexe/organes/doses confondus
Biodistribution : Poumon, foie, rein, muscle et gonades
Quantification des transgènes par qPCR
Pic de détection à 6h post injection
Toxicité et biodistribution par voie « clinique »
Conduit sur un 2ème modèle animal
OBJECTIFS
Calculer la première dose à administrer à l’homme suivant le mode d’administration prévu en clinique
METHODES Modèle animal pathologie ou du modèle d’étude si non disponible Injection du ME par la voie clinique, suivi des animaux sur les jours
suivant et 1 à 2 fois par semaines (biologie et biochimie). Traitement de l’animal par les traitements concomitants de l’étude Entre 2 et 5 semaines, sacrifice des animaux et prélèvement des organes
pour anapath et dosage du médicament expérimental
Toxicité intratumorale du CYL-02
J0 queue du
pancréas par mini-
laparotomie gauche
(allogreffe orthotopique)
J7Contrôle de
l’évolution de la tumeur par laparotomie
médiane exploratrice.Injection et
suivi des animaux.
J9, 11 et 13Injections intrapéritonéales de
Gemcitabine (80 mg/kg).
J15Sacrifice des animaux et prélèvement des organes.
4 groupes :Glucosé 5% (véhicule) avec ou sans traitement GemcitabineCYL-02 (900µg/kg) avec ou sans traitement Gemcitabine
Aucune létalité dans l’ensemble des groupes ayant reçu le CYL-02 seul ou associé à la gemcitabine.
Résultats de la biodistribution après injection intra tumorale
CYL-02+ NaCl
CYL-02 + Gemcitabine
Tumeur ++ +++
Rate +/- +
Foie ++ +++
Rein et intestins - +/-
Poumons, muscles et gonades
- -
Biodistribution : Présence du transgène dans la tumeur 8 jours après une injection intra-tumorale. « CYL-02 + gemcitabine », faible positivité au niveau rénale et intestinal alors que
positif au niveau splénique
Suivi pondéral : Aucune anomalie pondérale et clinique dans le groupe CYL-02, Amaigrissement significatif (15% en moyenne) avec la gemcitabine, Aucune différence significative entre « gemcitabine seule » versus « CYL-02 +
gemcitabine».
Examen anatomopathologique macroscopique :Aucune lésion pancréatique, péritonéale, ou hépatique
Témoins gemzar PTG PTG + gemzar
1 200
1 000
800
600
400
200
0
% de progression
- 50 ± 3 %
OBJECTIFSSimulation du protocole proposé chez l’homme Accumulation Sensibilisation Cerner la Pharmacologie de Sécurité Calculer la première dose à administrer à l’homme
Etude de Toxicité à dose répétée du Cyl-02
Calcul de la 1ère dose injectable à l’hommeHED (Dose équivalente chez l’Homme) = NOAEL (Animal)/ Facteur de sécurité/ fact clearance (Homme/Animal)
Soit : 900µg/Kg/60/7,4 = 2µg/kg
Poids moyen d’un patient ACP de 63kg => 125µg
Injection de 2.106 CSM dans l’organe considéré sur le modèle animal Nude de la pathologie visée par l’étude clinique sur des 10x♂ et 10x♀: vehicule seul (CTRL –) et CSM
Surveillance des signes cliniques des animaux (poids, sociabilité) 1 à 2 x / semaine
Sacrifice à 3 semaines (toxicité aigüe) et 12 semaines (toxicité chronique), observation macroscopique sur 8 organes (ganglions, foie, cerveau, reins, rate, peau, gonades et poumons) + organe injecté
Résultat : Evolution du poids, morbidité, mortalité et signes de toxicité, anatomopathologie
Recherche de cellules humaines par qPCR (ALU)
Exemple d’étude de biodistribution
Aucune altération des organesAucune cellule humaine à 3 et 12 semaines
GénotoxicitéOBJECTIFS :
Recherche de toute modification du matériel génétique induite par le ME
Recherche d’une potentialité mutagène
MODALITE :
Etudes normalisées in vitro et in vivo, comprenant :
1. Test de mutation génique in vitro sur bactéries (test de Ames)
2. Test d’aberrations chromosomiques in vitro sur cellules de mammifères
3. Optionnel : Test d’aberration chromosomique in vivo sur cellules hématopoïétiques de rongeur (test du micro noyau)
Thérapie Génique : Mutagénèse insertionnelle des vecteurs virauxThérapie Cellulaire : Tumorigénicité des cultures cellulaires
Injection intramusculaire ou sous cutanée chez la souris Nude (5 animaux/grpe) de 10.106 CSM : HT29 (CTRL+) ; véhicule seul (CTRL –) et CSM
Surveillance des signes cliniques des animaux (poids, sociabilité) 1 à 2 x / semaine
Mesure des nodules 1 a 2 fois par semaine pendant 12 semaines
Sacrifice à 90 J et observation macroscopique sur le site d’injection et 6 organes (en général : ganglions, foie, cerveau, reins, rate et poumons)
Si apparition de tumeurs, qPCR pour recherche de cellules humaines (ALU)
Résultats : Suivi des animaux, poids, anatomopathologie et volume des tumeurs
Exemple d’étude de tumorogénicité
Résorption au point d’injection en 3 à 6 jours Pas de développement de tumeur
Aucune altération des organes à 90J
Promoteur
Protocole clinique sur des volontaires (sains ou patients)
suivant des modalités d’inclusion et de suivi prédéfinies
Développement d’un médicament
Laboratoire de recherche et promoteur
Approches in vitro et in vivo relevant de la pathologie visée
par le protocole clinique.
Développement du « médicament expérimental »
Laboratoire de recherche
Intérêt d’une cible ou d’une
approche expérimentale (in vitro et in
vivo)
Documents spécifiques à la TG
• Annexe 2 : Principes applicables a l’évaluation du risque pour l’environnement.
• Annexe 3A : Informations devant figurer dans la notification concernant la dissémination des OGM autres que les plantes supérieurs.
• Formulaire de synthèse de la notification concernant la dissémination volontaire d’OGM dans l’environnement à d’autres fins que leur mise sur la marché.
• Fiche d’information destinée au Public : date limite de réponse de 30 jours après sa publication sur le site internet de l’ANSM
1. Demande de classement initial et d’agrément CERFA 1674*02Intégrer dans la demande l’utilisation pour essai clinique (addendum demande initiale)
2. Demande d’agrément des sites hospitaliers CERFA 12536*02 Confinement doit être en adéquation avec le classement de l’OGM. Une demande d’agrément d’utilisation confinée d’OGM par site (pharmacie, chambre
hospitalière, laboratoire, local d’administration…). numéro de dossier identique à celui du classement établit initialement par le HCB.
Ponction de MO
Circuit du médicament
Prélèvement de TA
• Sérologies patient (HIV 1&2, HTLV 1&2, HBC et HCV, Syphilis)
• Autorisation du lieu de prélèvement (bloc opératoire, anesthésie et praticien)
• Cahier navetteAutorisation de site
Ponction de MO
Circuit du médicament
Congélation ou Mise en
culturePrélèvement de
TA
Autorisation de site
Société spécialisée et autorisée
• Transport avec respect des T° (ambiant, froid ou congelé) et des délais
• Règlementation transport matières vivantes (directive européenne 2004/23/CE)
Expansion cellulaire ou transfert de gène
Ponction de MO
Circuit du médicament
Congélation ou Mise en
culturePrélèvement de
TA
Cellules : SA
Autorisation de site
Société spécialisée et autorisée
Autorisation de production
• Etablissement autorisé (établissement pharmaceutique ou non, classement pour OGM)
• Contrôles in process (stérilité)• Délivrance d’un certificat de conformité
Libération, congélation de la
SA
Expansion cellulaire ou transfert de gène
Ponction de MO
Circuit du médicament
Libération, congélation de la
SA
Congélation ou Mise en
culturePrélèvement de
TA
Cellules : SA
Mise en forme SA = PF
Autorisation de site
Société spécialisée et autorisée
Autorisation de production
Préparation et dispensation
pharmaceutique
Préparation pharmaceutique, stockage, décongélation, mise en forme, dispensation +/- confinement (double ou triple emballage)
Retour et destruction des UT, pb de l’inactivation des OGM :
solides a autoclaver (20 mn à 121°C) liquides a neutraliser à la Javel (12h 2% final
extemporané)
Expansion cellulaire ou transfert de gène
Ponction de MO
Circuit du médicament
Libération, congélation de la
SA
Congélation ou Mise en
culturePrélèvement de
TA
Cellules : SA
Mise en forme SA = PF
Autorisation de site
Société spécialisée et autorisée
Autorisation de production
Préparation de type pharmaceutiqueInjection au volontaire
Conclusions
Produit grade recherche : Preuve de concept et compréhension du mode d’action (Pharmacologie) Développement et validation des techniques : caractérisation, identité,
activité et fonctionnalité Test in vivo : validation du modèle animal, efficacité et effets secondaires
(pré toxicologie)
Produit grade Pré-GMP : Pharmacologie essentiellement in vitro sinon a intégrer aux études de
toxicologie in vivo Tumorogénicité des MTI de TC et TG ex vivo, mutagénèse insertionnelle
en TG Biodistribution des vecteurs et des cellules Toxicologie des vecteurs ou du transgène
Produit grade Clinique : Circuit du médicament : confinement, délivrance, stabilité courte Circuit du patient : prélèvement, injection, hospitalisation Suivi des patients : effets adverses, confinement, fluides biologiques,
destruction