Instrução de Uso_XG-CVM-MB_Rv.02_DEZ.2017
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Instruções de Uso
Kit XGEN CHIKUNGUNYA IgM (XG-CVM-MB)
Kit de Sorologia para Detecção de Anticorpos IgM para vírus Chikungunya
1. USO PRETENDIDO
O kit XGEN CHIKUNGUNYA IgM é destinado para a detecção qualitativa de anticorpos IgM para o vírus
Chikungunya (CHIKV) em amostras de soro e plasma humano, através de imunoensaios - ELISA.
O kit pode ser utilizado em combinação com os seguintes equipamentos: lavadora, leitora e
incubadora de microplacas para imunoensaios - ELISA. Também pode ser utilizado em estações de trabalho
automatizadas.
PRODUTO PARA DIAGNÓSTICO DE USO IN VITRO.
2. INTRODUÇÃO
A Chikungunya (CHIKV) é uma doença viral transmitida por mosquitos infectados e foi descrita pela
primeira vez durante uma epidemia no sul da Tanzânia em 1952. É um vírus RNA pertencente ao gênero
Alphavirus, da família Togaviridae. O nome Chikungunya deriva-se de uma palavra da linguagem
Kimakonde, com o significado de “tornar-se contorcido”, descrevendo assim a aparência encurvada de
pacientes que sofrem com dores nas articulações (artralgia) quando são infectados pelo vírus.
É caracterizada pelo começo abrupto de febre, frequentemente acompanhado de dores fortes nas
articulações. Outros sinais e sintomas comuns incluem dores musculares, dor de cabeça, náuseas, fadiga e
erupções cutâneas. A dor nas articulações geralmente é muito debilitante, podendo durar poucos dias ou
prolongar-se durante meses. Assim, o vírus pode causar doença aguda, subaguda e crônica.
A maioria dos pacientes se recupera completamente, mas em alguns casos a dor nas articulações pode
prolongar-se por meses ou até anos. Alguns casos de complicações nos olhos, neurológicos,
gastrointestinais e cardíacos foram relatados. Complicações sérias não são comuns, mas em pessoas idosas
a doença pode levar a morte. Geralmente os sintomas são moderados nos indivíduos infectados e a
infecção pode passar despercebida ou ser mal diagnosticada em áreas que também possuem incidência do
vírus da Dengue.
O CHIKV foi identificado em mais de 60 países da Ásia, África, Europa e Américas. O vírus é transmitido
através das picadas de mosquitos fêmeas infectadas e o início da doença geralmente ocorre entre 4 e 8
dias, mas pode variar de 2 a 12 dias. Testes sorológicos como o ensaio de ELISA podem confirmar a
presença de anticorpos IgG e IgM anti-CHIK.
3. PRINCÍPIO DO TESTE
O kit XGEN CHIKUNGUNYA IgM se baseia em reações antígeno-anticorpo detectáveis através de
reações enzimáticas. As microplacas são revestidas com antígeno sintético imunodominante derivado da
região ENV do CHIKV. Na primeira incubação, a fase sólida é tratada com amostras diluídas diretamente nos
poços e se houver anticorpos no soro em teste ocorrerá a ligação antígeno-anticorpo. Após a lavagem,
todos os componentes presentes nos poços são descartados, mantendo apenas a ligação antígeno-
anticorpo.
Na segunda incubação, a ligação antígeno-anticorpo é detectada através da adição de anticorpos
dirigido contra imunoglobulinas da espécie (anti hIgM) marcados com peroxidase (HRP). A enzima
capturada na fase sólida, que atua sobre a mistura de substrato/cromogênio, gera um sinal óptico que é
proporcional à quantidade de anticorpos anti-CHIK IgM presentes na amostra.
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A neutralização do anti-CHIKV IgG, realizada diretamente no poço na primeira incubação é feita no ensaio com o objetivo bloquear interferências dessa classe de anticorpos na determinação de IgM.
4. COMPONENTES
O formato padrão do kit contém reagentes para 96 testes.
COMPONENTES CONTEÚDO QUANTIDADE
MICROPLACA CHIKV IgM Microplaca para Reação 12 strips x 8 poços
CONTOLE NEGATIVO CHIKV IgM Controle Negativo 1 frasco x 2,0 mL
CONTROLE POSITIVO CHIKV IgM Controle Positivo para anticorpos IgM para
vírus Chikungunya 1 frasco x 2,0 mL
TAMPÃO DE LAVAGEM CONCENTRADO 20x
Mistura de Tampão 1 frasco x 60 mL
CONJUGADO ENZIMÁTICO CHIKV IgM
Anticorpo policlonal humano IgM marcado com peroxidase (HRP)
1 frasco x 16 mL
CROMÓGENO/ SUBSTRATO Substância Cromógena 1 frasco x 16 mL
SOLUÇÃO STOP Solução de Parada de Reação 1 frasco x 15 mL
DILUENTE DE AMOSTRAS Solução para Diluição de Amostras 2 frascos x 60 mL
REAGENTE NEUTRALIZANTE Solução de Neutralização 1 frasco x 8 mL
FILME SELADOR Filme Selador Adesivo 2 unidades
5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
O kit XGEN CHIKUNGUNYA IgM deve ser armazenado e transportado em sua embalagem original em
temperatura controlada entre 2°C e 8°C e é estável até a data de vencimento indicada no rótulo.
6. MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS
✓ Micropipetas calibradas (10 μL < volume < 1.000 μL);
✓ Água grau EIA Reagente (bidestilada ou deionizada, tratada com carvão vegetal);
✓ Timer com 60 minutos ou mais;
✓ Papéis absorventes;
✓ Tubos de ensaio 12 x 75 mm ou microtubos de 1,5 mL para realizar a diluição das amostras;
✓ Incubador Termostático de Microplacas ELISA calibrado (banho seco ou banho-maria) configurado
a +37°C (± 0,5°C de tolerância);
✓ Leitor de Micropoços ELISA calibrado com filtros de 450 nm (leitura) e com 620-630 nm (branco);
✓ Lavadora calibrada de microplacas de ELISA;
✓ Agitador tipo Vortex ou similar;
✓ Ponteiras estéreis descartáveis com filtro;
✓ Luvas descartáveis sem talco.
7. AVISOS E PRECAUÇÕES
1. O kit deve ser utilizado somente por pessoal técnico qualificado e devidamente treinado.
2. Todo o pessoal envolvido na execução do teste deve utilizar equipamentos de proteção individual.
O uso de objetos perfuro-cortantes deve ser evitado. Todo o pessoal envolvido deve ser treinado em
procedimentos de biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor.
3. Os responsáveis pelo manuseio de amostras devem ser vacinados contra tétano, difteria, hepatite
B e os estabelecidos no PCMSO, de acordo com a Norma Regulamentadora 32.
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4. O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar contaminantes como poeira ou
agentes microbianos transportados pelo ar.
5. Proteger o Cromógeno/Substrato da iluminação forte e evitar vibração na superfície da bancada
onde o teste é realizado.
6. Após o recebimento, armazenar o kit entre 2°C e 8°C, em uma geladeira com temperatura
controlada.
7. Não trocar os componentes entre diferentes lotes dos kits. Recomenda-se que os componentes
entre dois kits do mesmo lote também não sejam trocados.
8. Verificar se os reagentes estão limpos e não contém partículas visíveis pesadas ou grumos. Caso
contrário, comunicar o supervisor do laboratório para iniciar os procedimentos necessários para reposição
do kit.
9. Evitar contaminação cruzada das amostras utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após
cada amostra.
10. Evitar contaminação cruzada entre os reagentes do kit utilizando ponteiras descartáveis e
trocando-as entre o uso de cada uma.
11. Não utilizar o kit após a data de validade apresentada na etiqueta externa e etiquetas internas dos
frascos.
12. Tratar todas as amostras como potencialmente infectantes. Todas as amostras de soro humano,
sangue, plasma devem ser manuseadas em Nível de Biossegurança 2, como recomendado pela legislação
em vigor.
13. O uso de plásticos descartáveis é recomendado na preparação dos componentes líquidos ou na
transferência dos componentes para sistemas automatizados, a fim de evitar contaminação cruzada.
14. Os resíduos gerados durante a utilização do kit devem ser descartados, de acordo com as diretrizes e regras de descarte de resíduos químicos e substâncias biológicas do laboratório, conforme legislação em vigor. Em particular, os resíduos líquidos gerados no processo de lavagem a partir reagentes e das amostras devem ser tratados como potencialmente infectantes e inativados antes do descarte.
15. Os respingos provocados acidentalmente durante o manuseio das amostras devem ser absorvidos
por lenços de papel umedecidos com hipoclorito, e em seguida, com água. Os lenços devem ser
descartados em recipientes específicos para resíduos laboratoriais.
16. A Solução STOP é uma substância irritante (H315, H319; P280, P302 + P352, P332 + P313, P305 +
P351 + P338, P337 + P313, P362 + P363). Em caso de respingo, lavar a superfície repetidas vezes com água.
17. Outros resíduos gerados devem ser manuseados como potencialmente infectantes e descartados,
de acordo com as diretrizes e regras relativas a resíduos laboratoriais.
8. AMOSTRAS: PREPARAÇÃO E RECOMENDAÇÕES
O ensaio é para uso com anticorpos IgM de amostras de soro e plasma humano.
1. O sangue deve ser colhido assepticamente por punção venosa. O plasma e o soro devem ser preparados utilizando as técnicas padrão de preparação de amostras para análises clínicas. Nenhuma interferência foi observada em amostras com citrato, heparina e EDTA.
2. Evitar a adição de qualquer conservante nas amostras, especialmente azida de sódio, pois este reagente pode afetar a atividade enzimática do conjugado, gerando resultados falso-negativos.
3. As amostras devem estar claramente identificadas com nomes ou códigos para evitar a interpretação errada dos resultados.
4. Amostras hemolisadas e visivelmente lipêmicas devem ser descartadas, pois podem gerar resultados errados. Amostras contendo resíduos de fibrina, partículas pesadas, corpos ou filamentos devem ser descartadas, pois podem gerar falsos resultados.
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5. As amostras de soro ou plasma podem ser armazenados entre 2°C e 8°C por até 7 dias após a coleta. Para períodos mais longos, as amostras podem ser congeladas a -20°C por vários meses. As amostras não devem ser congeladas e descongeladas mais de uma vez, pois esta prática pode gerar partículas que podem afetar os resultados.
6. Se alguma partícula estiver presente, centrifugar a 2.000 rpm por 20 minutos ou utilizar um filtro de 0,2 – 0,8 (µm) para limpar a amostra.
9. PREPARAÇÃO DOS COMPONENTES E AVISOS
MICROPLACAS CHIKV IgM
12 strips x 8 poços revestidos com antígenos sintéticos CHIK ENV. Deixar a microplaca atingir a temperatura ambiente antes de abrir o pacote por, pelo menos, 30
minutos. Verificar se o dessecante não está verde escuro, indicando um defeito de fabricação. Neste caso, contatar o Serviço de Atendimento ao Cliente.
As tiras não utilizadas devem ser guardadas novamente na embalagem de alumínio, junto com dessecante fornecido, firmemente fechada e armazenada entre 2°C a 8°C.
Após a abertura da embalagem, as tiras são estáveis até o indicador de umidade, localizado dentro da embalagem do dessecante, passar de amarelo para verde.
CONTROLE NEGATIVO CHIKV IgM
Contém 1% de proteína de soro de cabra, 10 mM de tampão citrato de sódio pH 6,0 ± 0,1, 0,5% de
Tween 20, 0,09% de azida de sódio e 0,1% de Kathon GC.
Solução pronta para uso. Homogeneizar em agitador tipo vortex.
CONTROLE POSITIVO CHIKV IgM
Contém 1% de proteína de soro de cabra, anti CHIKV IgG humano inativado, 10 mM de tampão citrato de sódio pH 6,0 ± 0,1, 0,5% de Tween 20, 0,09% de azida de sódio e 0,1% de Kathon GC.
Solução pronta para uso. Homogeneizar em agitador tipo vortex.
TAMPÃO DE LAVAGEM CONCENTRADO 20x
Contém 10 mM de tampão fosfato pH 7,0 ± 0,2, 0,05% de Tween 20 e 0,05% de Kathon GC.
Diluir o tampão de lavagem para uma solução 1x de acordo com a quantidade de amostras a ser testada (por exemplo: 60 mL da solução 20x concentrada em 1.200 mL de água grau EIA). Misturar gentilmente antes da utilização. Alguns cristais de sal podem ficar no fundo do frasco, atente-se para dissolver todo o conteúdo ao preparar a solução.
Evitar a formação de bolhas no preparo do tampão, pois podem diminuir a eficiência da solução.
Nota: Uma vez diluída, a solução de lavagem é estável durante 7 dias armazenada entre 2°C a 8°C.
CONJUGADO ENZIMÁTICO IgM CHIKV
Contém anticorpos policlonais conjugados com peroxidase de rábano para IgM humano, 5% de BSA, 10 mM tampão Tris pH 6,8 ± 0,1. 0,1% de Katon GC e 0,02% de sulfato de gentamicina.
Solução pronta para uso. Homogeneizar em agitador tipo vortex.
Cuidado para não contaminar o líquido com substâncias oxidantes, pó ou microrganismos. Se for necessária a transferência deste componente, utilizar frascos estéreis.
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CROMÓGENO/SUBSTRATO
Contém 50 mM de tampão citrato-fosfato pH 3,5 a 3,8, 4% de dimetilsulfóxido. 0,03% de tetra-metil-benzidina (TMB) e 0,02% de peróxido de hidrogênio (H2O2).
Solução pronta para uso. Homogeneizar em agitador tipo vortex.
Não expor o componente a luz forte, agentes oxidantes e superfícies metálicas. Cuidado para não contaminar o líquido com substâncias oxidantes, pó ou microrganismos. Se for necessária a transferência deste componente, utilizar frascos estéreis.
DILUENTE DE AMOSTRA
Contém 2% de caseína, 10 mM de tampão citrato de sódio pH 6,0 ± 0,1, 0,2% de Tween 20, 0,09% de azida de sódio e 0,1% de Kathon GC.
Solução pronta para uso. Homogeneizar em agitador tipo vortex.
REAGENTE NEUTRALIZANTE
Contém anti hlgG de cabra, 2% de caseína, 10 mM de tampão citrato de sódio pH 6,0 ± 0,1, 0,09% de
azida de sódio e 0,1% de Kathon GC.
Solução pronta para uso. Homogeneizar em agitador tipo vortex.
SOLUÇÃO STOP
Contém 0,3 M de solução H2SO4.
Solução pronta para uso. Homogeneizar em agitador tipo vortex.
Atenção: Irritante (H315, H319; P280, P302 + P352, P332 + P313, P305 + P351 + P338, P337 + P313,
P362 + P363).
LEGENDA:
AVISO – Declaração H
H315 – Provoca irritação cutânea.
H319 – Provoca irritação ocular grave.
PRECAUÇÃO – Declaração P
P280 – Usar luvas e vestuário de proteção e proteção ocular e facial.
P302 + P352 – Se na pele, lavar com água abundante e sabão.
P332 + P313 – Em caso de irritação cutânea, procurar assistência médica.
P305 + P351 + P338 – Se nos olhos, lavar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se estiver com lentes de contato
fáceis de retirar, removê-las e continuar a lavar com água.
P337 + P313 – Caso a irritação ocular persista, procurar assistência médica.
P362 + P363 – Retirar a roupa contaminada e lavá-la antes de reutilizar.
10. EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS USADOS EM COMBINAÇÃO COM O KIT
1. Micropipetas
Devem estar calibradas para distribuir o volume correto necessário para o teste e devem ser submetidas a regulares descontaminações das partes que podem acidentalmente entrar em contato com a amostra. As micropipetas devem ser certificadas e devem estar com seus certificados válidos a fim de mostrar precisão de 1% e exatidão de ± 5%.
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2. Incubadora para Imunoensaios - ELISA
A incubadora para Imunoensaios - ELISA deve ser configurada a +37° C (tolerância de ± 0,5°C) e ser regularmente verificada para assegurar a manutenção da temperatura correta. Tanto o banho-seco quanto o banho-maria são adequados para as incubações, desde que os equipamentos sejam validados para a incubação de testes de ELISA. O tempo de incubação possui tolerância de ± 5%.
3. Lavadora para Imunoensaios - ELISA
A lavadora de ELISA é extremamente importante para o desempenho geral do ensaio. A lavadora deve ser cuidadosamente validada e corretamente otimizada usando os controles do kit e painéis de referência. Normalmente 5 ciclos de lavagem (aspiração + dispensação de 350 µL/ poço de solução de lavagem = 1 ciclo) são suficientes para assegurar que o ensaio tenha o desempenho esperado. É sugerido um intervalo de 20 - 30 segundos entre ciclos. A fim de configurar corretamente os números, é recomendado realizar um ensaio com os controles do kit e amostras de referência negativas e positivas bem caracterizadas e verificar os resultados, de acordo com os valores reportados no Item 14. A calibração periódica dos volumes dispensados e manutenção da lavadora devem ser realizadas de acordo com as instruções do fabricante.
4. Leitora de Imunoensaios - ELISA
O leitor de microplacas imunoensaios - ELISA deve conter um filtro de leitura de 450 nm e um filtro de 620 - 630 nm para fins de supressão. O desempenho padrão deve apresentar (a) largura de banda ≤ 10 nm; (b) faixa de absorção de 0 a ≥ 2,0; (c) linearidade ≥ 2,0; (d) repetibilidade ≥ 1%. O sistema óptico do leitor deve ser calibrado regularmente para garantir que a densidade óptica seja medida corretamente. Deve ser mantido regularmente de acordo com as instruções do fabricante.
5. Estação de Trabalho Automatizada
Quando uma estação de trabalho automatizada for utilizada, todos os passos críticos (dispensação, incubação, lavagem, leitura e manuseio de dados) devem ser cuidadosamente configurados, calibrados, controlados e regularmente inspecionados para que os valores estejam conforme o reportado no Item 14. O protocolo do ensaio deve ser instalado no sistema operacional da unidade e validado para a lavagem e leitura. Além disso, a estação de trabalho que faz o manuseio de líquidos (aspiração, dispensação e lavagem) deve ser validada e configurada corretamente. Deve-se ter uma atenção particular para evitar o extravasamento de líquido (carry over) das agulhas utilizadas na dispensação e lavagem. Isso deve ser estudado e controlado para minimizar a possibilidade de contaminação de poços adjacentes. O uso das estações de trabalho automatizadas é recomendado para triagem de sangue quando o número de amostras testadas excederem 20 - 30 unidades por corrida.
Nota 1: Ao utilizar equipamentos automáticos, no caso de o suporte de frasco do instrumento não encaixar com os frascos disponibilizados no kit, transferir a solução para frascos apropriados e identificar com a mesma etiqueta do frasco original. Essa operação é importante, pois pode evitar troca de conteúdo dentro dos frascos. Quando o teste acabar, retornar os frascos com etiquetas para temperatura 2 a 8°C, firmemente fechados.
Nota 2: O Serviço de Atendimento ao Cliente oferece suporte para o usuário na configuração e checagem de
instrumentos usados concomitantemente com o kit, para assegurar que os requerimentos descritos sejam
cumpridos. O suporte também é oferecido para a instalação de novos instrumentos a serem utilizados com o kit.
11. CONTROLE PRÉ-ENSAIO E OPERAÇÕES
1. Verificar a data de validade do kit impressa na etiqueta externa da caixa do kit.
2. Verificar se os componentes líquidos não estão contaminados por partículas visíveis a olho nu ou
grumos.
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3. Checar se o Cromogênio/Substrato é incolor ou azul claro, aspirando um pequeno volume do
componente com uma pipeta de plástico transparente estéril. Observar se há ruptura na caixa de
transporte e se não há derramamento de líquido dentro da caixa.
4. Diluir o conteúdo do Tampão de Lavagem Concentrado 20x conforme descrito no Item 9.
5. Deixar os outros componentes atingirem a temperatura ambiente.
6. Configurar a incubadora ELISA a 37°C e preparar a lavadora de ELISA por meio de priming com a
solução de lavagem diluída de acordo com as instruções do fabricante. Configurar o número
certo de ciclos de lavagem.
7. Verificar se o leitor de ELISA foi ligado por, pelo menos, 20 minutos antes da leitura.
8. Ao utilizar uma estação de trabalho automatizada, ligar a estação, verificar a configuração e checar
se o protocolo de ensaio correto está sendo utilizado.
9. Verificar se as micropipetas estão configuradas para o volume necessário.
10. Verificar se todos os outros equipamentos estão prontos para uso.
11. Em caso de problemas não continuar o teste e comunicar ao supervisor do laboratório.
12. PROTOCOLO
O ensaio deve ser realizado de acordo com as instruções abaixo. Manter o mesmo tempo de incubação
para todas as amostras em teste.
1. Diluir as amostras 1:101 em um microtubo/placa de diluição (exemplo: 1.000 µL de Diluente de
Amostra + 10 µL de amostra). Os Controles já estão prontos para uso. Misturar cuidadosamente
todos os componentes líquidos no vortex.
2. Colocar o número necessário de strips no suporte de micropoços. Deixar o poço A1 vazio para o
branco.
3. Dispensar 50 µL de Reagente Neutralizante em todos os poços, exceto nos poços usados para o
branco.
Dispensar 100 µL de Controle Negativo em triplicata, 100 µL de Controle Positivo em simplicata. A seguir,
dispensar 100 µL das amostras diluídas em cada poço de acordo com o mapa de trabalho.
4. Incubar a microplaca por 60 minutos a +37°C.
Nota: as tiras devem ser seladas com o filme selador fornecido somente quando o teste for realizado
manualmente. Não selar as tiras quando forem utilizados sistemas automatizados.
5. Lavar os micropoços 4-5 vezes: aspiração + dispensação de 350 µL/ poço de solução de lavagem.
6. Pipetar 100 µL do Conjugado Enzimático em cada poço, exceto no poço A1, e selar com o filme
selador.
Nota: cuidado para não tocar a superfície interior de cada poço com a ponteira preenchida com a Enzima
Conjugada. Pode ocorrer contaminação.
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7. Incubar a microplaca por 60 minutos a +37°C.
8. Lavar os micropoços conforme o passo 6.
9. Pipetar 100 µL do Cromogênio/Substrato em cada poço, incluindo o A1. Incubar a placa em
temperatura ambiente (+18°C a +24°C) por 20 minutos no escuro.
Nota: não expor diretamente a luz forte. Pode ser gerada uma alta interferência de fundo (background).
10. Pipetar 100 µL da Solução STOP em todos os poços. A adição da solução irá mudar a cor do
controle positivo e amostras positivas de azul para amarelo.
11. Medir a intensidade da cor da solução em cada poço na leitora em filtro de 450 nm (leitura) e de
620 – 630 nm e o branco no poço A1.
Notas Gerais Importantes:
1. Se o segundo filtro não estiver disponível, assegurar que não há impressões digitais presentes na
parte inferior do micropoço antes da leitura a 450 nm. As impressões digitais podem gerar
resultados falsos positivos na leitura.
2. A leitura deve ser realizada logo após a adição da Solução STOP e de não mais do que 20 minutos
após a sua adição. Há chances de oxidação do cromógeno podendo levar a um elevado
background.
13. ESQUEMA DE ENSAIO
Método Operações
Reagente Neutralizante
Controles
Amostras diluídas 1:101
50 µL
100 µL
100 µL
1ª Incubação 60 minutos
Temperatura +37°C
Passo de lavagem 4-5 ciclos
Conjugado Enzimático 100 µL
2ª Incubação 60 minutos
Temperatura +37°C
Passo de Lavagem 4-5 ciclos
Cromógeno/Substrato 100 µL
3ª Incubação 20 minutos
Temperatura Ambiente
Solução STOP 100 µL
Leitura OD 450 nm
Um exemplo de esquema de dispensação para análise segue abaixo:
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Microplaca
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A BCO A4
B CN A5
C CN A6
D CN A7
E CP A8
F A1 A9
G A2 A10
H A3 A11
Legenda: BCO = Branco; CN = Controle Negativo; CP= Controle Positivo; A1 – A11 = Amostras.
14. CONTROLE DE QUALIDADE INTERNO
Uma verificação é realizada nos controles sempre que o kit for utilizado a fim de verificar se os valores
OD450 nm estão como esperados e informados na tabela abaixo:
Verificação Requisitos
Poço em branco < 0,100 OD450 nm
Controle Negativo (CN) < 0,200 OD450 nm após blanking
Controle Positivo (CP) OD450 nm > 0,500
15. CÁLCULO DO VALOR DE CORTE (CUT-OFF)
Se o teste for validado conforme Item 14, os resultados das amostras são calculados por meio de cut-
off determinado pela média de valor OD450 nm do controle negativo (NC), utilizando a seguinte fórmula:
O valor de cut-off encontrado para o teste é usado para a interpretação dos resultados que serão
descritos abaixo.
Nota: Quando o cálculo dos resultados for feito pelo sistema operacional de uma estação de trabalho automatizada,
tenha certeza de que a formulação adequada está sendo utilizada para calcular o valor de corte e assim gerar uma
interpretação correta de resultados.
16. INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
Os resultados dos testes são interpretados como proporção da amostra OD450 nm (S) e o valor de
corte (Co), ou S/Co, de acordo com a tabela a seguir:
S/Co Interpretação
< 0,9 Negativo
0,9 – 1,1 Indeterminado
> 1,1 Positivo
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Um resultado negativo indica que o paciente não desenvolveu anticorpos IgM para CHIKV. O resultado
positivo é indicativo de infecção em curso por CHIKV. Qualquer paciente que tiver um resultado
indeterminado deve ser testado novamente. A segunda amostra deve ser coletada do paciente cerca de 1-2
semanas depois e examinada.
17. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE
A sensibilidade e especificidade diagnóstica foram calculadas por meio de um painel de amostras
derivadas de pessoas que tiveram sinais clínicos de infecção por CHIKV. Para a sensibilidade foram avaliadas
cerca de 44 amostras positivas e a especificidade foi determinada através da análise de 400 amostras
negativas coletadas de pacientes normais e doadores de sangue. Um painel de amostras potencialmente
interferentes (RF+, hemolisadas e lipêmicas) também foram examinadas. Não foram observadas
interferências nas amostras examinadas.
Um painel de amostras positivas para anticorpos contra flavivírus (anticorpos para dengue, Zika e vírus
Nilo do Oeste) foi testado. Foi observado reações cruzadas.
Plasmas derivados de diferentes técnicas de preparação (citrato, EDTA e heparina) e soros foram
utilizados para determinar a especificidade. Não foi observada nenhuma interferência em relação ao
método de preparação das amostras.
Amostras congeladas também foram testados para verificar se o congelamento de amostras interfere
no desempenho do teste. Nenhuma interferência foi observada. A avaliação do desempenho forneceu os
seguintes valores:
SENSIBILIDADE > 98%
ESPECIFICIDADE > 98%
Reprodutibilidade:
A reprodutibilidade foi calculada em duas amostras examinadas em replicatas e em diferentes corridas. Os resultados são apresentados na tabela abaixo:
Valores Médios
N = 144 Amostras Negativas Amostras Positivas
OD450 nm 0,037 1,485
Desvio Padrão 0,006 0,068
Coeficiente de variação% 11,5 5,1
18. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS
PROBLEMA AÇÃO CORRETIVA RECOMENDADA
Poço em branco > 0,100 OD450 nm 1. Verificar se o Cromógeno/Substrato não foi
contaminado durante o ensaio.
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Controle Negativo (CN) > 0,200 OD450 nm Após Blanking
1. Verificar se as configurações do procedimento de
lavagem e enxágue foram validados no estudo de pré-
qualificação.
2. Verificar se a solução de lavagem apropriada foi
utilizada e se a lavadora foi preparada (primed) com a
solução antes do uso.
3. Verificar se nenhum erro foi cometido no procedimento
de ensaio (dispensação do controle positivo ao invés do
controle negativo);
4. Verificar se nenhuma contaminação do controle
negativo ou dos seus poços ocorreram devido a amostras
positivas, por via de respingos ou do conjugado
enzimático.
5. Verificar se as micropipetas não foram contaminadas
com amostras positivas ou com o conjugado enzimático.
6. Verificar se agulhas da lavadora não estão bloqueadas
ou parcialmente obstruídas.
Controle Positivo < 0,500 OD450 nm após Blanking
1. Verificar se o procedimento de lavagem e se as
configurações da lavadora estão validadas conforme o
estudo de pré-qualificação.
2. Verificar se a solução de lavagem apropriada foi
utilizada e se a lavadora foi preparada (primed) com a
solução antes do uso.
3. Verificar se nenhum erro foi cometido durante o
procedimento de ensaio.
4. Verificar se nenhum controle negativo foi utilizado por
engano.
5. Verificar se houve uso de microplaca com as dimensões
equivocadas.
6. Verificar se houve alguma contaminação externa no
controle positivo.
Se um ou mais dos problemas descritos na tabela acima acontecer, depois da investigação, informe
qualquer problema residual ao supervisor para futuras ações
19. LIMITAÇÕES
Devido à conhecida alta homologia genética do CHIKV com os outros flavivírus como o vírus Zika e
dengue, observaram-se reações cruzadas nas populações afetadas por essas infecções (principalmente
pacientes de regiões endêmicas). O ensaio deve, em princípio, ser utilizado apenas para testar indivíduos
que satisfaçam os critérios clínicos (por exemplo: sinais e sintomas clínicos associados à infecção pelo
CHIKV) e/ou critérios epidemiológicos (por exemplo: histórico de residência ou viagem a uma zona
geográfica com transmissão ativa do CHIKV no momento da viagem, ou outros critérios epidemiológicos).
Os resultados do ensaio são então úteis para a identificação presuntiva de anticorpos IgM para o vírus
Chikungunya. Resultados positivos e indeterminados isolados não são definitivos para diagnóstico de
infecção pelo vírus Chikungunya.
Instrução de Uso_XG-CVM-MB_Rv.02_DEZ.2017
12
Falsa positividade foi avaliada como menos de 2% da população normal. Amostras congeladas
contendo partículas de fibrina ou agregados podem geram resultados falso-positivos. Reações cruzadas
com outros vírus correlatos foram observadas em menos de 2% das amostras positivas.
Foi observado que amostras congeladas contendo partículas de fibrina e grumos, após
descongelamento, geram resultados falsos. Estas amostras devem ser testadas após filtração ou
centrifugação.
20. GARANTIA DA QUALIDADE
A Mobius Life Science fornece garantia de todos os produtos por ela revendidos dentro dos seguintes
termos:
GARANTIA
O produto KIT XGEN CHIKUNGUNYA IgM é garantido pela Mobius contra defeitos de produção pelo
período de validade do produto, salvo especificações em contrário a constar da proposta.
• A garantia abrange defeitos de produção.
EXCEÇÕES NA GARANTIA
• Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia, conservação ou armazenagem
inadequada.
EXTINÇÃO DA GARANTIA
• Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação.
21. INFORMAÇÕES DO FABRICANTE
Mobius Life Science Comércio de Produto para Laboratórios Ltda.
Rua Paraíso do Norte, 866 – Pinhais – PR - CEP: 83.324-221
Telefone: (41) 2108-5296
E-MAIL: [email protected] | WEBSITE: www.mobiuslife.com.br
CNPJ: 04.645.160/0001-49
22. REGISTRO ANVISA
80502070054
23. RESPONSÁVEL TÉCNICA
Flávia Rosenstein Schiel
CRBio-07 34.360/07-D